KR20090005052A

KR20090005052A - 2-히드록시-2-메틸 카르복실산의 효소적 제조 방법

Info

Publication number: KR20090005052A
Application number: KR1020087025994A
Authority: KR
Inventors: 로란드 에이치. 뮐러; 토레 뢰베르더
Original assignee: 에보니크 룀 게엠베하
Priority date: 2006-03-24
Filing date: 2007-03-23
Publication date: 2009-01-12
Also published as: JP2009538118A; US20100035314A1; AU2007229522A1; MX2008012233A; BRPI0709142A2; WO2007110394A2; BRPI0709142B1; US20110165640A1; WO2007110394A3; EP1999264A2; RU2008142188A; EP1999264B1; CA2653028C; CA2653028A1; DE502007003734D1; ATE467684T1; US8349596B2; NO20084416L; DE102006017760A1; US7923225B2

Abstract

본 발명은 수성 반응 용액에서 제조되고/제조되거나 상기 반응 용액에 첨가되어 인큐베이션된 3-히드록시 카르복실산으로부터 2-히드록시-2-메틸 카르복실산을 효소에 의해 제조하는 방법에 관한 것이다. 수성 반응 용액은 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-생산 및 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-이성질체화 활성을 모두 가지는 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성 유닛을 포함하며, 3-히드록시 카르복실산을 산 또는 그의 염의 형태로 단리되는 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로 전환한다. 바람직한 실시태양에서, 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성 유닛은 단리된 코발라민-의존성 뮤타제 및, 경우에 따라 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-생산 효소 또는 효소 계 또는 그들을 포함하는 미생물을 포함하는 유닛이다. 본 발명은 바람직하게는 목적하는 활성을 가지는 미생물이 간단한 천연물을 이용하여 수성 계에서 배양되고, 세포 내에서 형성된 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르가 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로 전환되는, 2-히드록시-2-메틸 카르복실산을 생명공학적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 얻어진 2-히드록시-2-메틸 카르복실산이 탈수 반응에 의해 상응하는 불포화된 2-메틸 카르복실산 (메타크릴산 및 고급 동족체)으로 전환되는, 불포화 2-메틸 카르복실산의 제조를 포함한다.

효소적 전환, 3-히드록시 카르복실산, 2-히드록시-2-메틸 카르복실산, 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제, 코발라민-의존성 뮤타제, HCM-10, DSM 18028, C2-C3-불포화 이소알켄산, 메타크릴산 제조 방법, 이종이량성 효소

Description

2-히드록시-2-메틸 카르복실산의 효소적 제조 방법{METHOD FOR THE ENZYMATIC PRODUCTION OF 2-HYDROXY-2-METHYL CARBOXYLIC ACIDS}

본 발명은 수성 반응 용액에서 제조되고/제조되거나 상기 반응 용액에 첨가되어 인큐베이션된 3-히드록시 카르복실산으로부터 2-히드록시-2-메틸 카르복실산을 효소에 의해 제조하는 방법에 관한 것이다. 수성 반응 용액은 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-생산 및 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-이성질체화 활성을 모두 가지는 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성 유닛을 포함하며, 3-히드록시 카르복실산을 산 또는 그의 염의 형태로 단리되는 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로 전환한다. 바람직한 실시태양에서, 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성 유닛은 단리된 코발라민-의존성 뮤타제 및 경우에 따라 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-생산 효소 또는 효소계를 포함하거나 또는 그들을 포함하는 미생물이다. 본 발명은 바람직하게는 목적하는 뮤타제 활성을 가지는 미생물이 간단한 천연물을 이용하여 수성 계에서 배양되고, 세포 내에서 형성된 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르가 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로 전환되는, 2-히드록시-2-메틸 카르복실산을 생명공학적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 얻어진 2-히드록시-2-메틸 카르복실산이 탈수 반응에 의해 상응하는 불포화된 2-메틸 카르복실산 (메타크릴산 및 고급 동족체)으로 전환되는, 불포화 2-메틸 카르복실산의 제조를 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 사용되는 3-히드록시-카르보닐-CoA 티오에스테르-생산 및 3-히드록시-카르보닐-CoA 티오에스테르-이성질체화 미생물은 균주 HCM-10 (DSM 18028)이다.

메타크릴산 및 동족의 불포화 2-메틸 카르복실산은 아크릴 유리 시트, 사출-성형품, 코팅물 및 다수의 다른 제품의 생산에 널리 사용되고 있다.

다수의 메타크릴산 및 그의 동족체 제조 방법이 개시되어 있다. 그러나, 전세계적으로 상업적인 제조의 대다수는 메타크릴산 및 그의 동족체의 아미드 술페이트를 가수분해하는 방법에 기초하고 있으며, 이들은 상응하는 2-히드록시 니트릴로부터 제조된다 (문헌[W. Bauer, "Metharylic acid and derivatives", in: Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th edition, editors: B. Elvers, S. Hawkins, G. Schulz, VCH, New York, 1990, Vol. A16, pp. 441-452; A. W. Gross, J. C. Dobson, "Methacrylic acid and derivatives", in Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology, 4th edition, editors: J. I. Kroschwitz, M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, New York, 1995, Vol. 16, pp. 474-506]). 이러한 방법은 예를 들어, 1　kg의 메타크릴산 제조를 위해 약 1.6　kg의 황산을 필요로 한다. 상기와 같은 이유로, 황산의 회수 (및 이와 관련된 고 에너지 비용)가 요구되지 않는 메타크릴산의 다른 상업적 제조 방법이 유리하다.

US　3,666,805 및 US　5,225,594에는 2-히드록시 이소부티르산의 메타크릴산으 로의 화학적 전환이 개시되어 있다. 이는 금속 산화물, 금속 수산화물, 이온 교환 수지, 알루미나, 이산화규소, 아민, 포스핀, 알칼리 금속 알콕시드 및 알칼리 금속 카르복실레이트를 사용한 2-히드록시 이소부티르산의 탈수 반응을 포함한다. 통상적인 반응 온도는 160 ℃ 내지 250 ℃이다. 이 방법은 최대 96%의 메타크릴산 수율을 가능하게 한다.

메타크릴산 및 그의 동족체의 다른 제조 방법은 2-히드록시 니트릴의 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로의 가수분해 반응에 기초하고 있으며, 니트릴-가수분해 효소를 사용한다. 후자는 니트릴라제 또는 니트릴 히드라타제 및 아미다제의 조합이다 (문헌[A. Banerjee, R. Sharma, U. C. Banerjee, 2002, "The nitrile-degrading enzymes: current status and future prospects", Appl. Microbiol. Biotechnol., 60:33-44]). 상기 방법은 다수의 특허로 보호되고 있다 (US　6,582,943　B1). 이 방법의 중대한 단점은 효율적인 니트릴-가수분해 효소 활성을 위해 요구되는 중성 pH 범위에서의 니트릴의 불안정성이다. 반응 혼합물 중 니트릴의 분해는 케톤 및 시아나이드의 축적을 초래하며, 이들 양자는 모두 니트릴-가수분해 효소 활성을 억제한다.

2가지 방법, 즉 아미드 술페이트에 기초한 현재 우세한 방법 및 효소적 니트릴-가수분해 방법의 일반적인 문제점은 2-히드록시 니트릴의 필요성이다. 후자는 먼저 환경적으로 유해한 반응물, 즉 케톤 및 시아나이드로부터 제조되어야만 한다.

이러한 이유로, 간단한, 환경에 양호한 반응물에 기초한 메타크릴산 및 그의 동족체의 제조 방법이 유리하다.

따라서, 본 발명의 목적은 2-히드록시-2-메틸 카르복실산 제조의 대안 가능성을 검색하고, 가능하다면 거의 에너지를 소비하지 않고 폐기물을 생성시키지 않는 간단한, 환경에 양호한 반응물의 사용에 기초하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적은 3-히드록시 카르복실산으로부터 2-히드록시-2-메틸 카르복실산의 효소에 의한 제조 방법에 의해 달성된다. 본 발명에 따르면, 상기 3-히드록시 카르복실산은 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성 유닛이 있는 수성 반응 용액에서 제조되고/제조되거나 첨가된다. 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성 유닛은 본 발명의 목적상 코발라민-의존성 뮤타제 및, 경우에 따라, 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-생산 효소 또는 효소계 또는 그들을 포함하거나 생산하는 생물학적 계를 포함하는 유닛을 의미하며, 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성을 갖고 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-생산 및 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-이성질체화 활성을 모두 나타낸다. 인큐베이션 이후 상응하게 전환된 2-히드록시-2-메틸 카르복실산은 이어서 산 또는 그의 염의 형태로 단리된다.

본 발명은 바람직하게는 미생물을 사용하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산의 생명공학적 제조 방법에 관한 것이다. 상기 미생물은 통상 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-합성 활성을 가지며, 상기 코발라민-의존성 뮤타제를 포함하거나 생산할 수 있으며, 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성으로 인해, 간단한 천연물로부터 (반응물, 예컨대 당 및/또는 알콜 및/또는 유기산 및 그들의 유도체로부터) 형성된 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르를 세포 내에서 상응하는 2-히드록시-2-메틸-카르보닐 CoA 에스테르로 전환할 수 있다.

본 발명의 방법은 구체적으로 코발라민-의존성 뮤타제를 생산하거나 포함하고, 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성을 가지는 미생물이 3-히드록시 카르복실산의 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로의 전환을 위한 수성 계 내에 사용되는 것을 특징으로 한다.

바람직한 변형 방법에서는, 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성을 포함하고, 3-히드록시-카르보닐-CoA 티오에스테르-생산 및 3-히드록시-카르보닐-CoA 티오에스테르-이성질체화 활성을 모두 가지는 미생물이 탄소 및 에너지 공급원으로서의 재생 가능한 원료 또는 재생 가능한 원료의 소비로부터 유래되는 폐기물과 함께 수성 계 내에서 배양된다. 본 방법에서, 세포 내에서 형성되는 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 티오에스테르는 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로 전환된다. 상기 반응은 바람직하게는 외부 3-히드록시 카르복실산을 첨가하면서 수행된다. 그후 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산은 산 또는 그의 염의 형태로 단리된다.

간단한 천연물로부터 3-히드록시 카르복실산의 생산 및 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로의 그들의 이성질체화를 이용하는 상기 신규 생명공학 방법은 전술된 문제점들을 해결할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 본 방법은 하기 단계를 포함한다.

(a) 간단한 천연물로부터 3-히드록시 카르복실산이 생산된 후 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-합성 활성 및 뮤타제 활성을 가지는 적절한 생물학적 계 내에서 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로 전환되는 단계, 및

(b) 상기 2-히드록시-2-메틸 카르복실산이 유리 산 또는 그들의 상응하는 염으로 단리되는 단계.

본 방법으로 얻어지는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산은 가능하다면 (a) 및 (b)에서 제조된 산 또는 그들의 상응하는 염의 탈수 반응에 의해 C2-C3-불포화된 이소-알켄산 (메타크릴산 및 그의 동족체)의 제조에 유리하게 사용될 수 있다. 본 반응을 이하 설명한다:

- 간단한 천연물 (예, 재생 가능한 원료 또는 재생 가능한 원료의 소비로부터 유래되는 폐기물, 예컨대 당, 유기산 또는 알콜 등) → 3-히드록시 카르복실산 → 2-히드록시-2-메틸 카르복실산 (예, 균주 HCM-10에 의함)

- 2-히드록시-2-메틸 카르복실산 → 메타크릴산 및 동족체 (예, NaOH 존재 하 및 185 ℃의 온도).

상기 반응 조건 (pH, 이온 농도, 산소/이산화탄소 요구조건, 미량 원소, 온도 등)은 당연히 본원에서 미생물이 최적으로 3-히드록시 카르복실산을 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로 전환할 수 있도록 선택된다. 상기 제조 조건 하에서, 코발라민-의존성 뮤타제는 단리된 효소보다 자연 미소 환경 (micro environment)에서, 즉 세포 내에서 보다 높은 안정성 및 효능을 가질 수 있다. 또한, 세포 증식 및 그에 따른 뮤타제 농도의 증가가 적절한 조건 하에서 가능할 수 있다. 따라서, 미생물을 이용한 효소적 전환은 경우에 따라 신뢰성, 자동화 및 간이성뿐만 아니라 그 방법의 최종 생성물의 품질 및 수율과 관련하여 중요한 이점을 준다.

본 발명에 따른 3-히드록시 카르복실산의 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로의 효소적 전환에 있어서, 또한 정제되고, 농축되고/농축되거나 단리된 형태의 바람직하게는 CoA 에스테르-합성 활성과 조합된, 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성, 즉 코발라민-의존성 뮤타제를 가지는 유닛을 반응 용액 내에 도입하는 것이 가능하며, 효소는 예컨대 천연 유래된 것일 수 있다. 효소는 당연히 유전자 변형 생물로부터 재조합으로 제조된 효소일 수 있다.

본 발명의 목적을 위해, 상기 효소는 무상(intact) 미생물 세포 및 투과가능하게된(permeabilized) 미생물 세포의 양 형태로 본 발명 방법 중 촉매로서 사용된다. 추가의 가능한 사용은 미생물 세포 추출물로부터의 성분 (1 이상) 형태뿐만 아니라, 부분적으로 정제되거나 정제된 형태의 것들이다. 경우에 따라, 다른 CoA 에스테르-합성 효소, 예컨대 CoA 트랜스페라제 또는 CoA 신테타제가 본 발명에 따라 사용된다. 효소적 촉매는 용해되거나 비용해된 지지체에 고정화되거나 부착될 수 있다.

바람직한 변형 실시태양에서, 긍정적으로 또는 부정적으로 뮤타제 활성 유닛에 영향을 미칠 수 있는, 서로로부터 분리되거나 조합된 특정 세포 구획 또는 그들의 부분, 즉 탄수화물 구조, 지방 또는 단백질 및/또는 펩티드 및 또한 핵산이 조합되거나 분리될 수 있다. 상기 영향을 의식적으로 이용하기 위해, 미생물로부터 조추출물 등을 예를 들어, 추출물을 원심분리하여 경우에 따라, 침강 또는 상등액을 이용하여 본 발명의 반응을 수행할 수 있는 숙련된 방식으로 제조한다.

3-히드록시 카르복실산 (예, 3-히드록시 부티르산) 또는 보다 구체적으로는 그들의 세포내 CoA 티오에스테르 3-히드록시-카르보닐-CoA는 간단한 천연물로부터 다량의 박테리아 균주에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 상기 산은 통상의 박테리아 탄소 및 에너지 저장 물질, 폴리-3-히드록시알카노에이트를 위한 기초 빌딩 블록/단량체이다. 또한, 카르복실산 골격 내 탄소의 재배열은 박테리아뿐만 아니라 다른 생물학적 계 내에서도 일반적이다. 그러나, 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르를 상응하는 2-히드록시-2-메틸-카르보닐-CoA 에스테르로 전환하는 생물학적 계는 지금까지 확인된 바 없다. 본 발명은 코발라민-의존성 뮤타제 활성이 있는 계가 양 특성을 모두 가진다는 놀라운 발견에 기초하고 있다.

코발라민-의존성 뮤타제를 포함하는 미생물로는 메틸리비움 페트롤레이필럼 피엠1 (Methylibium petroleiphilum PM1), 메틸리비움 종 알8 (Methylibium sp. R8, 스트레인 콜렉션 UFZ (strain collection UFZ, Leipzig, Germany)에서 입수 가능), 베타-프로테오박테리아 균주 (β-proteobacterial strain) HCM-10, 잔토박터 오토트로피쿠스 피와이2 (Xanthobacter autotrophicus Py2), 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides, ATCC17029) 또는 노카르디오이데스 종 제이에스614 (Nocardioides sp. JS614)를 들 수 있다.

바람직하게 적절한 생물학적 계가 균주 HCM-10에서 발견되었다. 상기 균주는 특허 절차상 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 2006년 3월 13일에 독일 기탁기관 (Deutschen Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH [German collection of microorganisms and cell cultures], Brunswick, Germany)에 기탁번호 DSM 18028으로 기탁되어 있다.

상기 바람직한 생물학적 계를 이용하여, 2-히드록시-2-메틸 카르복실산, 구체적으로는 2-히드록시 이소부티르산을 특히 높은 수율로 획득하는 것이 가능하였다. 그러나, 미생물에 의한 효소적 전환은 상기 균주에 전혀 국한되지 않는다. 3-히드록시 카르복실산을 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로 전환할 수 있는 임의의 생물은 본 발명에 따라 사용될 수 있다.

그들은 첫째로 동일한 유전자 또는 유전자 산물을 보유하거나, 둘째로 같은 종류의 또는 유사한 활성을 가지는 유전자 산물을 발생시키는 유사한 유전자를 가지는 미생물일 수 있다. 즉, 다른 기원의 3-히드록시-카르보닐-CoA 뮤타제 활성 또한 본 발명에 의해 포함된다. 또한, 본 발명은 균주 HCM-10 또는 다른 기원의 그것으로서 유사한 3-히드록시-카르보닐-CoA 뮤타제 활성을 가지는 형질전환된(transformed) 계를 포함한다.

이로는 돌연변이, 미생물의 유전적으로 조작되고 독립된 변형, 예컨대 뮤타제-코딩 뉴클레오티드 서열의 도입으로 인해 목적하는 코발라민-의존성 뮤타제 활성을 가지는 생물을 들 수 있다.

바람직하게 사용되는 생물학적 계 (균주 HCM-10 - DSM 18028)는 간단한 천연물, 예컨대 당 및/또는 유기산 및/또는 알콜 및 그들의 유도체로부터 티오에스테르로서의 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르를 생산한다. 본원에서 사용되는 바람직한 계에서, 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르는 예를 들어 반응식 1의 (R)-3-히드록시-부티릴 CoA의 경우에 대해 도시된 바와 같이, 코발라민-의존성 탄소 골격-재배열 뮤타제에 의해 2-히드록시-2-메틸-카르보닐-CoA 에스테르로 전환된다. CoA 티오에스테르는 계 내에서 가수분해되고, 산이 배지 내로 분비된다.

본 발명 방법에 있어서 효소 촉매로서는 코발라민-의존성 뮤타제를 포함하는 미생물 균주, HCM-10 (DSM 18028), 잔토박터 오토트로피쿠스 피와이2 (Xanthobacter autotrophicus Py2), 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides, ATCC17029) 또는 노카르디오이데스 종 제이에스614 (Nocardioides sp. JS614), 그들의 조추출물 또는 일부를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 균주는 바람직하게는 서열: 2 및/또는 서열: 4의 서열을 가지는 단백질을 생산하거나 서열: 1 및/또는 서열: 3의 핵산 서열을 포함하고 (HCM-10), 서열: 5 및/또는 서열: 6의 서열을 가지는 단백질을 생산하거나, 서열: 7 및/또는 서열: 8의 핵산 서열을 포함하고 (잔토박터 오토트로피쿠스 피와이2 (Xanthobacter autotrophicus Py2)), 서열: 9 및/또는 서열: 10의 서열을 가지는 단백질을 생산하거나, 서열: 11 및/또는 서열: 12의 핵산 서열을 포함하고 (로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029)), 또는 서열: 13 및/또는 서열: 14의 서 열을 가지는 단백질을 생산하거나, 서열: 15 및/또는 서열: 16의 핵산 서열을 포함한다 (노카르디오이데스 종 제이에스614 (Nocardioides sp. JS614)). 본 발명의 목적을 위해, 상기 단백질은 또한 농축, 단리되거나 합성에 의해 제조된 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 변형 실시태양에서, 효소 촉매, 구체적으로는 미생물, 조추출물, 그들의 일부 및/또는 농축되거나 단리된 효소는 고정화된 형태로 사용된다. 고정화로 인해 효소, 세포 소기관 및 세포는 불용성으로 되어 반응 공간 내에 제한된다. 예를 들어, 그들은 중합체 매트릭스 (예, 알기네이트, 폴리비닐 알콜 또는 폴리아크릴아미드 겔) 내에 고정화될 수 있다. 또한, 그들은 용해되거나 비용해된 지지체 물질 (예, 셀라이트)에 고정화되어 촉매 회수 및 재사용을 촉진시킬 수 있다. 중합체 매트릭스 내 또는 용해되거나 비용해된 지지체 상의 세포 고정화 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 이전에 상세하게 기술된 바 있다. 마찬가지로, 효소 활성 물질은 미생물 세포로부터 분리될 수 있다. 그후 그들은 그대로 또는 중합체 매트릭스 내에서 또는 용해되거나 비용해된 지지체 상에 고정화된 형태로 촉매로서 이용될 수 있다. 이를 위해 필요한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Methods in Biotechnology, Vol. 1: Immobilization of enzymes and cells, editor: G. F. Bickerstaff, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997]에 기술되어 있다.

3-히드록시 카르복실산은 바람직하게는 미생물 성장 및 그에 따른 생성물 형성이 일어나는 흐름 반응기(flow reactor) 내에서 수행될 수 있는 연속 공정의 체 계 내에서 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로 전환된다. 그러나, 연속 공정은 또한 세포를 성장시키고 효소에 촉매작용을 미치는 임의의 계를 의미하며, 이에는 영양액이 공급되고 효소에 의해 형성되는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산을 포함하는 배양 용액이 이로부터 제거된다. 본 발명에 따르면, 공정은 또한 반연속(semicontinuous) 또는 회분(batch) 공정으로 수행될 수 있다.

전술된 바와 같이, 2-히드록시-2-메틸 카르복실산에 대한 출발 물질인 3-히드록시 카르복실산은 바람직하게는 탄수화물 및/또는 유기산 및/또는 알콜 또는 그들의 유도체의 효소적 전환에 의해 제조된다. 발명과 관련하여, 코발라민-의존성 뮤타제 이외에도, 경우에 따라 추가로 미생물 중 존재하거나 미생물에 첨가되는 CoA 에스테르-합성 효소가 사용된다. 이는 단일 공정 단계에서의 탄화수소 및/또는 탄수화물 및/또는 유기산 및/또는 알콜 또는 그들의 유도체의 3-히드록시 카르복실산으로의 전환 및 3-히드록시 카르복실산의 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로의 전환과 관련되며, 즉 3-히드록시 카르복실산이 될 수 있는 출발 기질의 전환 및 3-히드록시 카르복실산의 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로의 효소적 전환 반응은 하나의 동일한 반응 용액에서 동시에 또는 미세한 시간차를 두고 수행된다.

본 발명의 매우 특별한 실시태양에서는, 탄소 공급원 및 에너지 공급원으로서 tert-부틸 라디칼을 갖는 기질이 배양을 위해 사용되며, tert-부틸 알콜이 기초 배지 내 유일한 탄소 및 에너지 공급원인 것이 바람직하다.

본 발명의 방법은 바람직하게는 2-히드록시-2-메틸 프로판산 (2-히드록시 이 소부티르산)의 제조에 유용하다. 또한, 2-히드록시 이소부티르산의 바람직한 제조는 3-히드록시 부티르산이 외부에서 첨가되는 것을 특징으로 한다.

상기 방법은 호기성 조건 하에서 (aerobically), 바람직하게는 무상 세포를 사용하여, 또는 다르게는 혐기성 조건 하에서 (unaerobically), 예를 들어 질소 가스 처리하면서, 바람직하게는 추출물 또는 정제된 효소가 이용되는 경우 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 a) , b)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 코발라민-의존성 뮤타제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

a) 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코팅하는 핵산 분자;

b) 서열 번호 1 및/또는 서열 번호　3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.

본 발명의 효소는 바람직하게는 서열 번호 2 및 서열 번호 4로 기재된 서브유닛을 포함하는 이종이량성(heterodimeric) 단백질로 확인되었으며, 따라서 우수한 효소 활성을 가진다.

핵산 분자는 DNA 분자, 바람직하게는 cDNA 또는 게놈 DNA 및/또는 RNA 분자일 수 있다. 핵산 및 단백질 양자 모두 천연 공급원, 바람직하게는 DSM 18028 뿐만 아니라 메틸리비움 페트롤레이필럼 피엠1 (Methylibium petroleiphilum PM1), 메틸리비움 종 알8 (Methylibium sp. R8 (strain collection UFZ Leipzig, Germany)), 잔토박터 오토트로피쿠스 피와이2 (Xanthobacter autotrophicus Py2), 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides, ATCC17029) 또는 노카르디오이데스 종 제이에스614 (Nocardioides sp. JS614) 등으로부터 단리될 수 있거나 또는 공지된 방법에 의해 합성될 수 있다.

돌연변이는 본 발명에 따라 사용된 핵산 분자 중 그 자체로 공지된 분자생물학적 기술에 의해 생성될 수 있으며, 이에 따라 또한 본 발명의 방법에 사용되는, 유사한 또는 같은 종류의 특성을 가지는 추가의 효소를 합성하는 것이 가능하다. 돌연변이는 말단절단형 효소를 야기하는 결실 돌연변이일 수 있다. 같은 종류의 또는 유사한 특성을 가지는 변형된 효소는 또한 다른 분자 메커니즘, 예컨대 삽입, 복사(duplication), 전좌(transposition), 유전자 융합, 뉴클레오티드 교환 또는 그밖의 상이한 미생물 균주 간의 유전자 전달(transfer)에 의해 생성될 수 있다.

상기 핵산 분자는 핵산 분자 또는 그들의 일부를 사용하여 동정 및 단리될 수 있다. 핵산 분자로 하이브리드된 분자는 또한 전술된 핵산 분자의 단편, 유도체 및 대립 변이체를 포함하며, 이들은 본 발명에 따라 사용가능한 효소를 코딩한다. 단편은 본원에서 핵산 분자의 일부를 의미하며, 이는 기재된 효소를 코딩하기에 충분히 길다. 유도체는 상기 분자의 서열을 의미하며, 이는 전술된 핵산 분자의 서열과 1 이상의 위치에서 상이하지만, 상기 서열과 높은 상동성을 가진다. 본원에서 상동성은 핵산 수준에서 40% 이상의 서열 동일성, 구체적으로는 60% 이상의 동일성, 바람직하게는 80% 초과, 특히 바람직하게는 90%, 95%, 97% 또는 99% 초과의 동일성을 의미한다. 본원에서 코딩된 효소는 상술된 아미노산 서열과 아미노산 수준에서 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 매우 특 히 바람직하게는 99% 이상의 서열 동일성을 가진다. 본원에서의 편차는 결실, 치환, 삽입 또는 재조합의 결과일 수 있다. 그들은 자연적으로 발생하는 변이 (예, 다른 생물로부터의 서열)일 수 있고, 또는 다르게는 자연적으로 또는 특정 돌연변이 유발법 (UV 선, X 선, 화학 물질 또는 기타)에 의해 발생가능한 돌연변이일 수 있다. 변이는 또한 합성에 의해 제조된 서열일 수 있다. 상기 변이는 특정한 공통의 특징, 예컨대 효소 활성, 활성 효소 농도, 서브유닛, 관능기, 면역 반응성, 입체형태(conformation) 및/또는 겔 전기영동법에서의 이동 거동, 크로마토그래피 거동, 용해도, 침강 계수, pH 최적 조건, 최적 온도, 분광학적 특성, 안정성 및/또는 기타와 같은 물리적 특성을 가진다.

추가로 본 발명은 또한 서열: 2 및 서열: 4를 가지는 신규 단백질 및 서열: 2 및 서열: 4 및 그들의 99% 이상의 상동체를 포함하는 이종이량성 단백질에 관한 것이다.

서열: 1은 DSM 18028으로부터의 코발라민-의존성 뮤타제의 거대 서브유닛에 대한 1644 bp의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열: 2는 DSM 18028으로부터의 코발라민-의존성 뮤타제의 거대 서브유닛의 548 aa의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열: 3은 DSM 18028으로부터의 코발라민-의존성 뮤타제의 소형 서브유닛에 대한 369 bp의 부분적인 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열: 4는 DSM　18028으로부터의 코발라민-의존성 뮤타제 서브유닛의 123 aa의 부분적인 서열을 나타낸다.

서열: 5 및 6은 잔토박터 오토트로피쿠스 피와이2 (Xanthobacter autotrophicus Py2)로부터의 코발라민-의존성 뮤타제의 각각 562 및 135 aa의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열: 7 및 8은 잔토박터 오토트로피쿠스 피와이2 (Xanthobacter autotrophicus Py2)로부터의 코발라민-의존성 뮤타제의 각각 1689 및 408 bp의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열: 9 및 10은 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029)로부터의 코발라민-의존성 뮤타제의 각각 563 및 135 aa의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열: 11 및 12는 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029)로부터의 코발라민-의존성 뮤타제에 대한 각각 1692 및 408 bp의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

서열: 13 및 14는 노카르디오이데스 종 제이에스614 (Nocardoides sp. JS614)로부터의 코발라민-의존성 뮤타제의 각각 569 및 164 aa의 아미노산 서열을 나타낸다.

서열: 15 및 16은 노카르디오이데스 종 제이에스614 (Nocardoides sp. JS614)로부터의 코발라민-의존성 뮤타제에 대한 각각 1710 및 495 bp의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.

본 발명에 따라 제조된 2-히드록시-2-메틸 카르복실산은 전술된 방법에 의해 배지 (비용해된 성분, 예컨대 미생물 세포의 제거 이후)를 처리하여 단리할 수 있 다. 상기 방법의 예로는, 그 중에서도 특히, 농축, 이온 교환, 증류, 전기 투석, 추출 및 재결정화를 들 수 있다. 생성물은 염 또는 (산성화 이후) 양성자화된 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로서 단리될 수 있다.

2-히드록시-2-메틸 카르복실산 (또는 그들의 상응하는 염)은 다수의 방법으로 탈수 반응하여 상응하는 불포화된 2-메틸 카르복실산을 제공할 수 있다. C2-C3-불포화된 이소알켄산은 선행 기술에 공지된 방법을 이용하여, 제조된 2-히드록시-2-메틸 카르복실산의 탈수 반응에 의해 제조된다. 2-히드록시-2-메틸 카르복실산은 금속 산화물, 금속 수산화물, 이온 교환 수지, 알루미나, 이산화규소, 아민, 포스핀, 알칼리 금속 알콕시드 및 알칼리 금속 카르복실레이트를 사용하여 탈수될 수 있다. 반응 온도는 일반적으로 160 ℃ 내지 250 ℃이다. 따라서, 예를 들면, 메타크릴산은 NaOH의 존재 하 대략 185 ℃의 온도에서 2-히드록시 이소부티르산의 탈수 반응에 의해 제조된다.

본 방법으로 제조된 메타크릴산 및 그의 동족체는 적절하게 다수의 산업 분야, 예를 들어 첨가제로서 및 코팅제에 적용된다. 이전의 공지된 방법과 대조적으로, 본 방법은 저온 공정, 환경에 양호한 반응물의 사용 및 더 낮은 폐기물 생산의 바람직한 이점을 겸비한다.

본 발명을 이하 예가 되는 실시태양을 통해 자세히 기술할 것이나, 본 발명이 이에 국한되는 것은 아니다.

재료 및 방법

미생물 효소 촉매

3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-생산 및 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-이성질체화 활성을 특징으로 하는 균주 HCM-10 (DSM 18028)의 미생물 세포, 또는 그로부터 단리된 서열 번호 2 및 서열 번호 4를 가지는 단백질 서브유닛.

미생물 효소 촉매의 성장

2-히드록시-2-메틸 카르복실산의 제조를 위해 사용된 미생물 균주를 이하 기술된 바와 같이 단리하였다. 보존 배양물을 액체 질소 중 20% 농도 글리세롤 용액 중 저장하였다.

유일한 탄소 및 에너지 공급원으로서 tert-부틸 알콜을 함유하는 기초 배지 (표 1)에서 균주 HCM-10을 지하수로부터 농축하였다.

상기 균주는 계통발생적으로 루브리비박스-렙토트릭스 (Rubrivivax-Leptothrix) 군에 속한다.

균주 HCM-10을 하기(표 2)의 호기성 조건 하에서 3-히드록시-카르보닐-CoA 뮤타제 활성을 평가하기 위해 배양하였다.

상기 세포를 회수 후 즉시 사용하였다. 무상 세포는 추가의 전처리, 예컨대 투과가능화(permeabilization) 등 없이 사용할 수 있다. 또한, 세포는 세포 내외의 물질 확산 속도를 향상시키기 위해 투과가능하게 된 형태 (예, 톨루엔, 세정제로 처리 또는 동결-해동 주기에 의함)로 사용될 수 있다.

배양액 또는 반응 혼합물 중 2-히드록시 이소부티르산 및 3-히드록시 부티르산의 농도는 산성 메탄올 분해반응 이후, FFAP 및 FID 검출기를 사용하여 기체 크로마토그래피로 측정하였다.

실시예 1:

균주 HCM-10에 의한 3-히드록시 부티르산의 2-히드록시 이소부티르산으로의 전환

100　ml 기초 배지 중 균주 HCM-10 세포 현탁액 1　g (건조 질량)을 120　ml 세럼 보틀(serum bottles)에 주입하였다. 상기 현탁액을 3-히드록시 부티르산 50　mg과 부가혼합하고, 현탁액을 30 ℃에서 회전식 진탕기 중에 인큐베이션하였다. 호기성 인큐베이션 0.3　시간 이후, 현탁액에 질소 가스 처리를 하고 30 ℃에서 추가로 4.4　시간동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 다양한 시점에서, 샘플을 취하고, 현탁액을 원심분리한 후, 무세포의 상등액 내 2-히드록시 이소부티르산 함량 및 3-히드록시 부티르산 함량을 측정하였다. 2-히드록시 이소부티르산은 혐기성 상태에서 방출된 유일한 생성물인 것을 확인하였다. 대조적으로, 3-히드록시 부티르산은 호기성 초기 상태에서 명백하게 완전히 분해되었다 (도 1). 2-히드록시 이소부티르산의 수율은 이 경우 5.1%였으며, 반응액 중 잔존 3-히드록시 부티르산은 대략 80%였다.

실시예 2:

균주 HCM-10의 조추출물에 의한 3-히드록시 부티르산의 2-히드록시 이소부티르산으로의 전환

균주 HCM-10의 무세포 조추출물을 볼 밀(ball mill) 중 세포 분쇄에 의해 제조하고, 이어서 세포 잔해를 원심분리로 제거하였다. 50　mM 칼륨 포스페이트 완충액 (pH 7.2에서 1　mM MgCl₂ 함유) 5　ml 중 단백질 10　mg의 농도를 가지는 무세포 조추출물을 밀봉가능한 10　ml 유리 용기에 도입하였다. 이어서 상기 추출물에 0.01　mM 코엔자임 B12, 1　mM 코엔자임A, 1　mM ATP 및 4.25　mg 3-히드록시 부티르산을 첨가하였다. 반응액에 질소 가스 처리를 하고, 반응 용기를 단단하게 밀봉하고 30 ℃에서 2　시간 동안 진탕하면서 인큐베이션하였다. 반응 생성물을 전술한 바와 같이 분석하였다. 2-히드록시 이소부티르산의 수율은 이 경우 9%였으며, 반응액 중 잔존 3-히드록시 부티르산은 대략 88%였다 (도 2).

실시예 3:

2-히드록시 이소부티르산에서 메타크릴레이트로의 탈수 반응

실시예 2에서 수행된 절차에 따라서 제조된 2-히드록시 이소부티르산 용액 (1　mg/5　ml)을 NaOH (0.06　mg)와 교반하면서 부가혼합하였다. 용액을 진탕하면서 인큐베이션하고 185 내지 195 ℃에서 감압 (300　torr) 하에 환류 냉각시켰다. 5　ml 당 2-히드록시 이소부티르산 0.5　mg의 추가 분취액을 5시간에 걸쳐 매시간 첨가하였고, 상기 분취액에는 메타크릴레이트의 중합 반응을 방지하기 위해 p-메톡시페놀 0.4 중량%을 추가로 함유시켰다. 인큐베이션 24 시간 이후 반응을 종결시켰다. 2-히드록시 이소부티르산에서 메타크릴레이트로의 전환은 97%였다. 메타크릴산을 반응 혼합물로부터 증류하여 제거하였다.

<110> UFZ <120> Verfahren zur enzymatischen Herstellung von 2-Hydroxy-2-methylcarbonsaeren <130> P396906PC <140> <141> <150> DE10 2006 017 760.6 <151> 2006-04-12 <150> DE 10 2006 014 167.9 <151> 2006-03-21 <160> 16 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1644 <212> DNA <213> β-proteobakterieller Stamm HCM-10 (DSM18028) <400> 1 aagtcccaac tccaatcgga gcgcaaggac tgggaagcga acgaagtcgg cgccttcttg 60 aagaaggccc ccgagcgcaa ggagcagttc cacacgatcg gggacttccc ggtccagcgc 120 acctacaccg ctgccgacat cgccgacacg ccgctggagg acatcggtct tccggggcgc 180 tacccgttca cgcgcgggcc ctacccgacg atgtaccgca gccgcacctg gacgatgcgc 240 cagatcgccg gcttcggcac cggcgaggac accaacaagc gcttcaagta tctgatcgcg 300 cagggccaga ccggcatctc caccgacttc gacatgccca cgctgatggg ctacgactcc 360 gaccacccga tgagcgacgg cgaggtcggc cgcgagggcg tggcgatcga cacgctggcc 420 gacatggagg cgctgctggc cgacatcgac ctcgagaaga tctcggtctc gttcacgatc 480 aacccgagcg cctggatcct gctcgcgatg tacgtggcgc tcggcgagaa gcgcggctac 540 gacctgaaca agctgtcggg cacggtgcag gccgacatcc 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Asn Pro Ser Ala Trp Ile Leu Leu 165 170 175 Ala Met Tyr Ile Val Leu Ala Gln Lys Arg Gly Tyr Asp Leu Asp Lys 180 185 190 Leu Ser Gly Thr Val Gln Ala Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Met Ala Gln 195 200 205 Lys Glu Tyr Ile Tyr Pro Ile Ala Pro Ser Val Arg Ile Val Arg Asp 210 215 220 Cys Ile Thr Tyr Cys Ala Lys Asn Met Lys Arg Tyr Asn Pro Ile Asn 225 230 235 240 Ile Ser Gly Tyr His Ile Ser Glu Ala Gly Ser Ser Pro Val Asp Glu 245 250 255 Val Ala Phe Thr Leu Ala Asn Leu Ile Val Tyr Val Glu Glu Val Leu 260 265 270 Lys Thr Gly Met Lys Val Asp Asp Phe Ala Pro Arg Leu Ala Phe Phe 275 280 285 Phe Val Cys Gln Ala Asp Phe Phe Glu Glu Ile Ala Lys Phe Arg Ala 290 295 300 Val Arg Arg Cys Tyr Ala Lys Ile Met Lys Glu Arg Phe Gly Ala Arg 305 310 315 320 Asn Pro Glu Ser Met Arg Leu Arg Phe His Cys Gln Thr Ala Ala Ala 325 330 335 Ser Leu Thr Lys Pro Gln Phe Met Val Asn Val Val Arg Thr Thr Leu 340 345 350 Gln Ala Leu Ala Ala Val Leu Gly Gly Cys Gln Ser Leu His Thr Asn 355 360 365 Gly Phe Asp Glu Ala Phe Ala Ile Pro 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Leu Ala Lys Val Gly Leu Asp Gly 1 5 10 15 His Asp Arg Gly Val Lys Val Val Ala Arg Thr Leu Arg Asp Ala Gly 20 25 30 Met Asp Val Ile Tyr Ser Gly Leu His Arg Thr Pro Glu Glu Val Val 35 40 45 Thr Ala Ala Val Gln Glu Asp Val Asp Ile Leu Gly Val Ser Leu Leu 50 55 60 Ser Gly Val Gln Leu Thr Val Phe Pro Lys Ile Phe Lys Leu Leu Ala 65 70 75 80 Glu Arg Gly Ala Asp Asp Leu Ile Val Ile Ala Gly Gly Val Met Pro 85 90 95 Asp Glu Asp Val Val Ala Leu Lys Glu Leu Gly Val Lys Glu Val Met 100 105 110 Leu Gln Asp Thr Pro Pro Lys Ala Ile Val Glu Thr Leu Glu Arg Leu 115 120 125 Val Ala Glu Arg Gly Pro Arg 130 135 <210> 7 <211> 1689 <212> DNA <213> Xanthobacter autotrophicus Py2 <400> 7 tcagaacacc ggtgtttcgc gatacacgcc ccacaccgtc ttcagccgct ccacgatgtc 60 gcccatggtc gcgccttcac gcacgagctc gatggtgaca ggcatgatgt tctgggtctc 120 gtccttcgcc acctccacca ggcggtcgag cagcgcgctg accttcacat tgtcgcgctc 180 acggcggacc cgctgggtgc gggcgatctg gcggtcggcg gtggtgtggt cataagggtg 240 caattcgatc tcatgcacct cgctttcgtc caccatggtg tttacgccga tcaccggctt 300 ttcgcccgac tgcttgcgca gcgccgtctc gtaggcgaag tcggcgacgc tcttctggaa 360 ccagccttct tgaatcagct tgatggtgcc accgcgcgcg tccacctcgg agatgatgtc 420 catgatgcgc ttttcatact cggtggtgag cgtctccaca taataggagc cccccacggg 480 atcgatcacc tgggtgacgt tgctttcttc ggcgatcacc tgctgggtgc gcagggcaag 540 gcgcatggcc tcctcggtgg ggatggcgaa cgcctcgtcg aagccgttgg tatgcagcga 600 ctggcagccg cccagcaccg ccgccagcgc ctgcagcgtc gtgcgcacca cgttcaccat 660 gaattgcggc ttggtgagcg aggcggcggc ggtctggcag tggaagcgca ggcgcatgga 720 ttccgggttc ctggccccga agcgctcctt catgatcttg gcgtagcagc gccgcacggc 780 gcggaacttg gcgatctcct cgaagaagtc ggcctggcag acgaagaaga aggcgaggcg 840 cggggcgaag tcatccactt tcatgccggt cttcaacacc tcctccacat agacgatgag 900 gttcgccagg gtgaaggcca cctcgtccac cggagaggag ccggcttcgg agatatggta 960 gccggaaatg ttgatggggt tgtagcgctt catgttcttg gcgcagtacg tgatgcagtc 1020 gcgcacgatg cgcacggaag gcgcgatggg atagatatat tccttctgcg ccatgtactc 1080 cttcaggatg tccgcttgga cggtgccgga caatttgtcg aggtcgtagc cgcgcttctg 1140 cgccagcacg atatacatgg cgagcaggat ccacgcggac ggattgatgg tcatcgagac 1200 cgagatcttc tcgagatcga tcccgtcgaa cagcgcctcc atgtcggcga gcgtgtcgat 1260 ggccacgccc tcgcggccca cctcgccgtc gctcatcgga tggtcgctgt cgtaacccat 1320 gagggtcggc atgtcgaagt cggtggagat gccggtctgc ccctgttcga tcaggtattt 1380 gaagcgcttg ttcgtgtcct cgccggtccc gaagccggcg atctggcgca tggtccagtt 1440 ccggctgcgg tacatggtgg gataggggcc gcgggtgaag gggtagcggc cgggcagccc 1500 gatgtcctcg atcggcgtcg ccgccgcgtc ggcggcggtg tagacgcgct tcaccgggaa 1560 gtcgccgagg gtgaagaact gctccttgcg ctccttctgc ttcttcagga aggcggcgac 1620 ctcggtctcc tcccagtgac gcacgtcgtc gtcgagattg gcgagggtca tgatctcaga 1680 catgctcat 1689 <210> 8 <211> 408 <212> DNA <213> Xanthobacter autotrophicus Py2 <400> 8 tcaacgaggt ccgcgctcgg cgaccaggcg ctcgagcgtt tccacgatgg ccttgggcgg 60 ggtgtcctgg agcatcacct ccttcacacc cagttccttc agagcgacca cgtcctcgtc 120 cggcatcacg ccgccggcga tcacgatgag gtcgtccgcg ccccgctcgg cgagcagctt 180 gaagatcttg ggaaagaccg tgagctggac tccggagagg agggagacgc cgaggatgtc 240 cacgtcctcc tgcaccgccg cggtcacaac ttcctcgggc gtgcggtgga ggccggaata 300 aatcacgtcc atgccggcgt cgcgcagggt gcgcgccacc accttcacgc cgcgatcgtg 360 accgtcgagc ccgactttgg cgagcagcac cctgatcggc tgagccat 408 <210> 9 <211> 563 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 <400> 9 Met Ser Asp Thr Phe Ser His Ala Arg Thr Asp Glu Ile Ala Gln Ala 1 5 10 15 Val Glu Asp Trp Glu Arg Thr Glu Val Ala Asp Phe Ile Ala Arg Ala 20 25 30 Pro Glu Arg Lys Glu Gln Phe Tyr Thr Leu Gly Asp Phe Pro Val Lys 35 40 45 Arg Thr Tyr Thr Ala Ala Asp Ile Ala Asp Thr Pro Leu Glu Asp Ile 50 55 60 Gly Leu Pro Gly Lys Tyr Pro Phe Thr Arg Gly Pro Tyr Pro Thr Met 65 70 75 80 Tyr Arg Gly Arg Asn Trp Thr Met Arg Gln Ile Ala Gly Phe Gly Thr 85 90 95 Gly Glu Asp Thr Asn Lys Arg Phe Lys Phe Leu Ile Glu Gln Gly Gln 100 105 110 Thr Gly Ile Ser Thr Asp Phe Asp Met Pro Thr Leu Met Gly Tyr Asp 115 120 125 Ser Asp His Pro Met Ser Asp Gly Glu Val Gly Arg Glu Gly Val Ala 130 135 140 Ile Asp Thr Leu Ala Asp Met Arg Ala Leu Leu Asp Gly Ile Asp Leu 145 150 155 160 Glu Lys Ile Ser Val Ser Leu Thr Ile Asn Pro Thr Ala Trp Ile Leu 165 170 175 Leu Ala Met Tyr Ile Ala Leu Cys Glu Glu Arg Gly Tyr Asp Leu Asn 180 185 190 Lys Val Ser Gly Thr Val Gln Ala Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Met Ala 195 200 205 Gln Lys Glu Tyr Ile Phe Pro Ile Ala Pro Ser Val Arg Ile Val Arg 210 215 220 Asp Ile Ile Ser His Ser Thr Arg Thr Met Lys Arg Tyr Asn Pro Ile 225 230 235 240 Asn Ile Ser Gly Tyr His Ile Ser Glu Ala Gly Ser Ser Pro Leu His 245 250 255 Glu Ala Ala Phe Thr Leu Ala Asn Leu Ile Val Tyr Val Glu Glu Val 260 265 270 Leu Lys Thr Gly Val Glu Val Asp Asp Phe Ala Pro Arg Leu Ala Phe 275 280 285 Phe Phe Val Cys Gln Ala Asp Phe Phe Glu Glu Ile Ala Lys Phe Arg 290 295 300 Ala Leu Arg Arg Cys Tyr Ala Lys Ile Met Lys Glu Arg Phe Gly Ala 305 310 315 320 Lys Lys Pro Glu Ser Met Arg Leu Arg Phe His Cys Gln Thr Ala Ala 325 330 335 Ala Ser Leu Thr Lys Pro Gln Tyr Met Val Asn Val Met Arg Thr Thr 340 345 350 Thr Gln Ala Leu Ala Ala Val Leu Gly Gly Ala Gln Ser Leu His Thr 355 360 365 Asn Gly Tyr Asp Glu Ala Phe Ala Ile Pro Thr Glu His Ala Met Gln 370 375 380 Leu Ala Leu Arg Thr Gln Gln Val Ile Ala Asp Glu Thr Gly Val Thr 385 390 395 400 Gln Val Val Asp Pro Leu Gly Gly Ser Tyr Phe Val Glu Ser Leu Thr 405 410 415 Asn Asp Tyr Glu Lys Lys Ile Phe Glu Ile Leu Asp Glu Val Glu Glu 420 425 430 Arg Gly Gly Ala Ile Lys Leu Ile Glu Glu Gly Trp Phe Gln Lys His 435 440 445 Ile Ala Asp Phe Ala Tyr Glu Thr Ala Leu Arg Lys Gln Ser Gly Glu 450 455 460 Lys Pro Val Ile Gly Val Asn Arg Tyr Val Met Asp Glu Ser His Val 465 470 475 480 Lys Ile Glu Val His Pro Tyr Asp Glu Thr Thr Ala Lys Arg Gln Ile 485 490 495 Asp Arg Thr Arg Ser Val Arg Ala Gly Arg Asp Glu Ala Lys Val Gln 500 505 510 Ala Leu Leu Asp Glu Leu Val Ala Val Ala Arg Asp Glu Ser Ala Asn 515 520 525 Val Met Pro Val Thr Ile Gln Leu Val Lys Glu Gly Ala Thr Met Gly 530 535 540 Asp Ile Val Glu Lys Leu Lys Thr Ile Trp Gly Val Tyr Arg Glu Thr 545 550 555 560 Pro Val Phe <210> 10 <211> 135 <212> PRT <213> Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 <400> 10 Met Ser Thr Gln Ile Arg Val Leu Leu Ala Lys Val Gly Leu Asp Gly 1 5 10 15 His Asp Arg Gly Val Lys Val Val Ala Arg Thr Leu Arg Asp Ala Gly 20 25 30 Met Asp Val Val Tyr Ser Gly Leu His Arg Thr Pro Glu Glu Val Val 35 40 45 Thr Ala Ala Val Gln Glu Asp Val Asp Ile Leu Gly Val Ser Leu Leu 50 55 60 Ser Gly Val Gln Met Thr Val Phe Pro Lys Ile Phe Ala Leu Leu Lys 65 70 75 80 Glu His Lys Val Glu Asp Met Ile Val Val Ala Gly Gly Val Met Pro 85 90 95 Asp Glu Asp Val Ile Glu Leu Lys Lys Met Gly Val Ala Glu Val Leu 100 105 110 Leu Gln Asp Thr Pro Pro Gln His Ile Ile Asp Thr Leu Thr Gly Leu 115 120 125 Val Lys Ala Arg Gly Asp Arg 130 135 <210> 11 <211> 1692 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 <400> 11 tcagaacacc ggcgtttcgc ggtagacgcc ccagatcgtc ttcagcttct cgacgatgtc 60 gcccatggtc gccccctcct tcacgagctg gatggtcacg ggcatcacgt tggcgctctc 120 gtccctggcg accgcaacga gttcgtcgag gagcgcctga accttggcct cgtcgcggcc 180 cgcgcgcacc gagcgcgtgc ggtcgatctg ccgcttggcg gtcgtctcgt cgtagggatg 240 gacctcgatc ttcacatggc tctcgtccat cacatagcgg ttcacgccga tcaccggctt 300 ctcgcccgac tgcttgcgca gcgccgtctc gtaggcgaag tcggcgatgt gcttctggaa 360 ccagccttcc tcgatcagct tgatcgcccc gccacgctct tccacctcgt cgaggatctc 420 gaagatcttc ttctcgtagt cgttggtcag gctctcgacg aaataggacc cgccaagggg 480 atcgaccacc tgcgtcaccc cggtctcgtc ggcgatcacc tgctgggtgc gcagcgcgag 540 ctgcatcgca tgttcggtcg ggatggcgaa ggcctcgtca tagccgttcg tatggagcga 600 ctgcgcgccc cccagcaccg ccgccagcgc ctgggtcgtc gtgcgcatga cattgaccat 660 gtactgcggc ttggtgagcg aggccgccgc ggtctggcag tgaaagcgca ggcgcatcga 720 ctcgggtttc ttcgcgccga accgctcctt catgatcttg gcatagcagc ggcggagcgc 780 ccggaacttc gcgatctcct cgaagaagtc ggcctgacag acgaagaaga aggcgagccg 840 cggggcgaag tcgtcgacct cgacgccggt cttcagcacc tcctcgacat agacgatcag 900 gttggccagc gtgaaggcgg cctcgtgtag cggcgacgag cccgcttccg agatgtggta 960 gcccgagatg ttgatcgggt tgtagcgctt catcgtccgg gtcgagtggg agatgatgtc 1020 gcgcacgatg cggaccgagg gcgcgatcgg gaagatatat tccttctgcg ccatatattc 1080 cttgaggatg tcggcctgca ccgtgccgga caccttgttc aggtcgtagc cccgctcctc 1140 gcagagcgcg atatacatcg cgagcaggat ccaggcggtg ggattgatgg tcagcgagac 1200 cgagatcttc tcgagatcga tcccgtcgag cagcgcgcgc atgtcggcca gcgtgtcgat 1260 ggccacgccc tcgcggccca cctcgccgtc cgacatcgga tggtcgctgt cgtagcccat 1320 cagcgtcggc atgtcgaaat cggtcgagat gccggtctgg ccctgctcga tcaggaactt 1380 gaaccgcttg ttggtgtcct cgccggtgcc gaagcccgcg atctggcgca tggtccagtt 1440 gcggccgcga tacatggtcg gatagggccc gcgcgtgaag ggatatttgc ccggcaggcc 1500 gatatcctcg agcggcgtgt cggcgatgtc ggcggccgtg taggtccgct tcaccgggaa 1560 gtcgcccagc gtgtagaact gctccttgcg ctcgggcgcg cgggcgatga agtcggcgac 1620 ctcggtgcgt tcccagtcct cgaccgcttg tgcgatctcg tcggtgcggg cgtgcgagaa 1680 ggtgtcagac at 1692 <210> 12 <211> 408 <212> DNA <213> Rhodobacter sphaeroides ATCC 17029 <400> 12 tcagcggtct ccccgcgcct tcaccagacc cgtgagggtg tcgatgatgt gctggggcgg 60 cgtgtcctgc agcagcacct cggccacgcc catcttcttc agctcgatca catcctcgtc 120 gggcatgacg ccccccgcga ccacgatcat gtcctcgacc ttgtgctcct tcagcagcgc 180 gaagatcttc ggaaagaccg tcatctgcac gcccgacagg aggctgacgc cgaggatgtc 240 cacatcctcc tgcaccgcgg ccgtcaccac ctcctccggg gtgcggtgga gaccggaata 300 gacgacatcc atcccggcat cgcgcagggt gcgggccacc accttcacac cgcggtcgtg 360 gccatcgagg ccaaccttcg cgagcagcac acggatctgg gtcgacat 408 <210> 13 <211> 569 <212> PRT <213> Nocardioides sp. JS614 <400> 13 Met Ser Thr His Glu Ala Asp Ala Ile Lys Ile Thr Asn Glu Ala Ala 1 5 10 15 Val Lys Ala Ile Glu Glu Arg Leu Ala Gly Trp Glu Ser His Glu Leu 20 25 30 Glu Ala Phe Leu Gln Arg Thr Pro Glu Ser Lys Gly Val Phe Arg Thr 35 40 45 Gly Ser Gly Ala Pro Val Lys Arg Val Tyr Thr Pro Ala Asp Leu Pro 50 55 60 Glu Asp Trp Asn Asp Ile Gly Leu Pro Gly Gln Phe Pro Phe Thr Arg 65 70 75 80 Gly Pro Tyr Pro Thr Met Tyr Arg Gly Arg His Trp Thr Met Arg Gln 85 90 95 Ile Ala Gly Phe Gly Gln Ala Glu Glu Thr Asn Lys Arg Phe Gln Tyr 100 105 110 Leu Ile Asn Gln Gly Gln Thr Gly Leu Ser Val Asp Phe Asp Met Pro 115 120 125 Thr Leu Met Gly Leu Asp Ser Asp Asp Pro Met Ser Leu Gly Glu Val 130 135 140 Gly Arg Glu Gly Val Ala Val Asp Val Leu Ser Asp Met Glu Ala Leu 145 150 155 160 Phe Asp Gly Ile Asp Leu Glu Asn Ile Ser Val Ser Met Thr Ile Asn 165 170 175 Pro Ser Ala Trp Ile Leu Leu Ala Met Tyr Ile Ala Val Ala Glu Asp 180 185 190 Lys Gly Tyr Asp Leu Asn Arg Leu Ser Gly Thr Ile Gln Asn Asp Ile 195 200 205 Leu Lys Glu Tyr Val Ala Gln Lys Glu Trp Ile Phe Pro Val Arg Pro 210 215 220 Ser Met Arg Ile Val Arg Asp Cys Ile Ala Tyr Cys Ala Glu Asn Met 225 230 235 240 Ala Arg Tyr Asn Pro Val Asn Ile Ser Gly Tyr His Ile Ser Glu Ala 245 250 255 Gly Ala Asn Ala Val Gln Glu Val Ala Phe Thr Met Ala Ile Thr Arg 260 265 270 Ala Tyr Val Ser Asp Val Ile Ala Ala Gly Val Asp Val Asp Thr Phe 275 280 285 Ala Pro Arg Leu Ser Phe Phe Phe Val Ser Gln Ala Asp Phe Phe Glu 290 295 300 Glu Ala Ala Lys Phe Arg Ala Val Arg Arg Phe Tyr Ala Lys Met Met 305 310 315 320 Arg Asp Glu Phe Gly Ala Glu Asn Glu Gln Ser Met Arg Leu Arg Phe 325 330 335 His Ala Gln Thr Ala Ala Ala Thr Leu Thr Lys Pro Gln Pro Met Asn 340 345 350 Asn Ile Ile Arg Thr Thr Leu Gln Ala Leu Ser Ala Ile Leu Gly Gly 355 360 365 Ala Gln Ser Leu His Thr Asn Gly Leu Asp Glu Ala Tyr Thr Ile Pro 370 375 380 Ser Glu Thr Ala Met Lys Ile Ala Leu Arg Thr Gln Gln Val Ile Ala 385 390 395 400 His Glu Thr Gly Val Pro Ser Ile Val Asp Pro Leu Gly Gly Ser Tyr 405 410 415 Tyr Val Glu Ala Leu Thr Asp Glu Ile Glu Thr Gly Ile His Asp Tyr 420 425 430 Leu Ala Lys Ile Glu Ser Leu Gly Gly Val Val Ala Ala Ile Glu Asn 435 440 445 Gly Phe Met Gln Arg Glu Ile Ser Asp Thr Ala Tyr Gln Tyr Ala Leu 450 455 460 Arg Lys Glu Ser Gly Asp Arg Pro Val Leu Gly Val Asn Met Tyr Ile 465 470 475 480 Asp Glu Asn Ser Thr Glu Glu Ile Glu Thr His Gln Leu Asp Pro Glu 485 490 495 Ser Glu Gln Arg Gln Ile Arg Arg Val Gln Gln Val Arg Ala Glu Arg 500 505 510 Asn Ala Glu Thr Ala Gln Ala Ala Leu Ala Thr Leu Val Glu Thr Ala 515 520 525 Arg Asp Asn Asp Ala Asn Leu Met Pro Ala Thr Ile Ala Ala Val Arg 530 535 540 Ala Gly Leu Ser Met Gly Glu Ile Thr Gly Ala Leu Arg Asp Val Phe 545 550 555 560 Gly Thr Tyr Val Glu Thr Pro Val Tyr 565 <210> 14 <211> 164 <212> PRT <213> Nocardioides sp. JS614 <400> 14 Met Trp His Thr Pro Gln Ala Asn Leu Gly Ala Pro Met Pro Leu Ser 1 5 10 15 Ala His Ser Asp Ile Asp Ala Gly Asp Thr Ala Pro Ile Arg Ile Met 20 25 30 Leu Ala Lys Ile Gly Leu Asp Gly His Asp Arg Gly Val Lys Val Val 35 40 45 Ala Arg Thr Leu Arg Asp Ala Gly Met Glu Val Val Tyr Thr Gly Leu 50 55 60 His Arg Ser Pro Glu Gln Val Leu Glu Ala Ala Val Gln Glu Asp Val 65 70 75 80 Asp Val Leu Gly Ile Ser Leu Leu Ser Gly Ala His Leu Thr Ile Phe 85 90 95 Gly Arg Leu Phe Thr Leu Ile Ala Asp Leu Pro Tyr Thr Pro Arg Phe 100 105 110 Ala Val Val Ala Gly Gly Val Met Pro Asp Glu Asp Glu Arg Thr Leu 115 120 125 Ile Glu Leu Gly Val Ala Ala Val Leu Gly Gln Asp Thr Ala Pro Arg 130 135 140 His Ile Val Glu Val Val Thr Asp Ala Ala Asn Gln Ala Arg Asn Gln 145 150 155 160 Val Glu Ala Ser <210> 15 <211> 1710 <212> DNA <213> Nocardioides sp. JS614 <400> 15 tcagtacaca ggtgtctcga cgtaggttcc gaacacgtcg cgtagtgcac cggtgatctc 60 gcccatcgac agaccggctc ggacagcggc gatggttgcc ggcatgagat tggcgtcgtt 120 gtcgcgagct gtttcgacca gggttgcgag agctgcctgt gcggtctcgg cgttgcgctc 180 cgcacgtacc tgctgcacgc ggcggatctg gcgctgctcg gactcggggt cgagctggtg 240 tgtctcgatc tcttccgtcg agttctcatc gatgtacata ttgaccccaa gcacagggcg 300 gtcgccgctc tccttgcgga gcgcgtactg gtaggccgtg tctgagatct cgcgctgcat 360 aaagccgttc tcgatcgctg ctacgactcc accaaggctt tcgatcttgg ctagatagtc 420 gtgaattccc gtttcgatct catcggtaag tgcctcgacg tagtacgagc cgccgagggg 480 gtcgacaatg ctaggaacgc cagtctcatg tgcgatgacc tgctgggtgc gaagcgcgat 540 cttcatggcg gtttcgctcg ggatcgtgta cgcctcgtcg agaccgttgg tgtggagcga 600 ctgtgccccg cccaggattg ctgagagggc ttggagcgtc gtgcggatga tgttgttcat 660 gggttgtggc ttggtcagcg ttgccgctgc agtctgagcg tggaaccgga gccgcatgga 720 ctgttcgttc tcggctccga actcgtcgcg catcatcttg gcgtagaagc gccggacagc 780 cctgaacttt gcggcttcct cgaagaagtc agcctggctc acgaagaaga acgacagtcg 840 cggagcgaac gtgtcgacgt cgacgccggc cgcaatgacg tcactcacgt aggcgcgcgt 900 gatcgccatg gtgaaggcga cctcctgcac ggcgttcgcg ccggcttcgc tgatgtggta 960 cccgctgatg ttgaccgggt tataacgggc catattctca gcgcaataag cgatgcagtc 1020 tcggacaatg cgcatactcg gacgaaccgg gaagatccat tccttttggg cgacgtactc 1080 cttgaggatg tcgttctgaa tcgttccgct cagtcggttc aggtcgtagc ccttgtcttc 1140 ggctacagcg atgtacatgg ccagcaggat ccaggcagac gggttgatgg tcatcgacac 1200 ggagatgttc tccaggtcga ttccgtcgaa gagtgcctcc atgtcggaga gcacgtcgac 1260 ggcgactcct tcgcggccga cctctcccag actcatgggg tcgtcgctgt cgagacccat 1320 cagtgtgggc atgtcgaagt cgacggagag gcccgtctgt ccctggttga tgaggtactg 1380 gaagcgcttg ttggtctctt cggcttgacc gaatccggcg atctggcgca tcgtccagtg 1440 gcggccccgg tacatggtcg ggtaaggccc tcgcgtgaac gggaattgac ccggaagtcc 1500 gatatcgttc cagtcctcgg gaaggtcagc cggcgtgtag accctcttga cgggggcgcc 1560 gctgccagtg cggaacactc ccttcgactc tggcgtccgt tgcaagaatg cctcgagctc 1620 gtggctctcc caccctgcga gtcgttcctc gatggccttg acggcggcct cgttggtgat 1680 cttgatggcg tcggcctcgt gggtgctcat 1710 <210> 16 <211> 495 <212> DNA <213> Nocardioides sp. JS614 <400> 16 tcacgaggcc tctacctggt tccgggcctg gttcgcggcg tcggtgacga cctcgacgat 60 gtggcgcggc gcggtgtcct ggccgaggac agcggcgaca cccagttcga tcagggtcct 120 ctcgtcctcg tcgggcatga cgccgccagc gacgacggca aatcgtggcg tgtagggaag 180 atctgcgatg agcgtgaaga gtcgaccgaa aatggtcagg tgtgctccgg agagcaggct 240 gatgccgagc acgtcgacgt cttcttgcac ggcggcttcg aggacctgct ctgggctgcg 300 gtgaaggccg gtgtagacga cctccatgcc ggcgtcacgc agtgtgcggg cgacgacctt 360 gacgcctcga tcgtgcccgt cgagaccgat cttagcgagc atgatgcgga tcggagcggt 420 gtcgcctgcg tcgatgtcgg agtgtgcgga cagcggcatg ggggctccta ggttggcctg 480 tggcgtgtgc cacat 495

Claims

3-히드록시 카르복실산이 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-생산 및 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-이성질체화 활성을 모두 가지는 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성 유닛을 포함하는 수성 반응 용액에서 제조되고/제조되거나 첨가되고, 인큐베이션 이후, 상응하게 전환된 2-히드록시-2-메틸 카르복실산이 산 또는 그의 염의 형태로 단리되는 것을 특징으로 하는, 3-히드록시 카르복실산으로부터 2-히드록시-2-메틸 카르복실산의 효소적 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성 유닛이 단리된 코발라민-의존성 뮤타제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성 유닛이 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-생산 효소 또는 효소 계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성 유닛이 미생물 또는 그들의 조추출물인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성을 가지고, 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-생산 및 3-히드록시-카르보닐-CoA 에스테르-이성질체화 활성을 모두 가지는 코발라민-의존성 뮤타제를 생산하거나 포함하는 미생물이 3-히드록시 카르복실산의 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로의 전환을 위한 수성 계 내에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

a) 3-히드록시-카르보닐-CoA 티오에스테르-생산 활성 및 3-히드록시-카르보닐-CoA 티오에스테르-이성질체화 활성을 모두 가지는 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 뮤타제 활성이 있는 미생물을 탄소 및 에너지 공급원로서의 재생 가능한 원료 또는 재생 가능한 원료의 소비로부터 유래되는 폐기물과 함께 수성 계에서 배양하고, 이에 의해 세포 내 3-히드록시-카르복실레이트-CoA 티오에스테르가 합성되어 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로 전환되고,

b) 상기 상응하는 2-히드록시-2-메틸 카르복실산이 산 또는 그들의 염의 형태로 단리되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응이 외부 3-히드록시 카르복실산을 첨가하면서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물이 박테리아 균주 HCM-10 DSM 18028, 잔토박터 오토트로피쿠스 피와이2 (Xanthobacter autotrophicus Py2), 로도박터 스파에로이데스 (Rhodobacter sphaeroides, ATCC17029) 또는 노카르디오이데스 종 제이에스614 (Nocardioides sp. JS614)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물의 무상 세포가 변화없이, 투과가능하게(permeabilized) 되어 또는 지지체에 고정되어 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 추출물 및/또는 코발라민-의존성 뮤타제 및, 경우에 따라 다른 효소 (CoA 에스테르-합성 효소 등)가 미생물로부터 부분적인 또는 완전한 단리 이후, 경우에 따라 정제된 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 미생물의 무세포 조추출물이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 서열: 2 및/또는 서열: 4의 서열을 가지는 단백질, 서열: 5 및/또는 서열: 6의 서열을 가지는 단백질, 서열: 9 및/또는 서열: 10의 서열을 가지는 단백질, 또는 서열: 13 및/또는 서열: 14의 서 열을 가지는 단백질 및 그들의 60% 이상의 상동체가 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 당 및/또는 알콜 및/또는 유기산 및/또는 탄화수소 또는 그들의 유도체가 배양 중 효소적 전환을 위한 탄소 및 에너지 공급원으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, tert-부틸 라디칼을 가지는 기질이 배양을 위한 탄소 공급원 및 에너지 공급원으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, tert-부틸 알콜이 배양을 위한 기초 배지 내에서 유일한 탄소 공급원 및 에너지 공급원으로서 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 당 및/또는 알콜 및/또는 유기산 및/또는 탄화수소 또는 그들의 유도체의 3-히드록시 카르복실산으로의 효소적 전환 및 3-히드록시 카르복실산의 2-히드록시-2-메틸 카르복실산으로의 효소적 전환이 단일 공정 단계에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 외부 3-히드록시 부티르산을 첨가하여 2-히드록시 이소부티르산이 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같이 제조된 2-히드록시-2-메틸 카르복실산이 탈수 반응되는 것을 특징으로 하는 C2-C3-불포화된 이소알켄산의 제조 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 바와 같이 제조된 2-히드록시 이소부티르산이 탈수 반응되는 것을 특징으로 하는 메타크릴산의 제조 방법.
미생물 균주 HCM-10 - DSM 18028.
a) 서열 번호 2 및/또는 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 핵산 분자;

b) 서열 번호 1 및/또는 서열 번호　3으로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자

로 이루어지는 군으로부터 선택되는 코발라민-의존성 뮤타제 활성을 가지는 효소를 코딩하는 핵산 분자.
제21항에 있어서, 2개의 상이한 서브유닛으로 구성된 올리고머(oligomeric) 효소로서, 서열 번호 2 및 서열 번호　4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 코딩하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
제21항 또는 제22항에 있어서, DNA 분자인 핵산 분자.
제23항에 있어서, cDNA 또는 게놈 DNA인 핵산 분자.
제21항 또는 제22항에 있어서, RNA 분자인 핵산 분자.
제21항 및 제22항의 핵산 분자에 의해 코딩된 코발라민-의존성 뮤타제 활성을 가지는 단백질.
서열 번호 2 및 그의 99% 이상 상동체를 가지는 단백질.
서열 번호 4 및 그의 99% 이상 상동체를 가지는 단백질.
서열 번호 2 및 서열 번호 4를 포함하는 이종이량성(heterodimeric) 효소로서의 단백질.