본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 복분자 추출물을 유효성분으로 포함하는 시력보호용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 시력 보호, 특히 수정체의 질환 또는 이상(disorders)을 치료 또는 예방할 수 있는 물질을 개발하고자 노력하였고, 이러한 물질을 가능한 천연물에서 얻으려 하였다. 그 결과, 본 발명자들은 복분자 추출물이 산화적 스트레스를 효과적으로 방어하고, 당뇨병에 의한 백내장 유발을 효과적으로 억제한다는 것을 발견하였다.
본 발명에서 유효성분으로 이용되는 복분자 추출물은 복분자(즉, 복분자딸기)로부터 수득한다. 복분자딸기는 장미과의 낙엽 관목으로서, 본 명세서 용어 “복분자”는 복분자딸기 나무의 열매를 의미한다.
본 발명의 복분자 추출물은 당업계에 공지된 통상적인 추출용매, 바람직하게는, (a) 물, (b) 탄소수 1-4의 무수 또는 함수 저급 알코올 (예: 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 및 노말-부탄올 등), (c) 상기 저급 알코올과 물과의 혼합용매, (d) 아세톤, (e) 에틸 아세테이트, (f) 클로로포름, (g) 1,3-부틸렌글리콜, (h) 헥산, (i) 디에틸에테르, 또는 (j) 부틸아세테이트를 이용하여 얻을 수 있다.
본 발명의 복분자 추출물은 상술한 용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 둥굴레 추출물에 포함되는 것이다.
본 발명의 복분자 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 빌베리 추출물 및 비타민 A를 추가적으로 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 비타민 B6염산염, 타우린, 아연, 대두 레시틴, 토코페롤, 결명자, 마리골드, 좁쌀풀 추 출물, 포도씨유, 팜유, 황납 및 그의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 성분을 추가적으로 포함한다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 조성물은 복분자 추출물, 빌베리 추출물, 비타민 A, 비타민 B6염산염, 타우린, 아연, 대두 레시틴, 토코페롤, 결명자, 마리골드, 좁쌀풀 추출물, 포도씨유, 팜유 및 황납 모두를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물, 화장료 조성물 또는 식품 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물로 제조되는 경우, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등]) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 식품 조성물이 드링크제로 제조되는 경우에는 상술한 유효성분 이외에, 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 두충 추출액, 대추 추출액, 감초 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 백내장의 예방 또는 치료 효능을 갖는다. 상기 백내장은 바람직하게는 당뇨병성 백내장이다. 따라서, 본 발명은 “시력보호용 조성물” 이외에, “백내장 예방 또는 치료용 조성물”로 표현될 수 있다.
본 발명의 조성물은 산화적 스트레스를 효과적으로 방어하여, 시력 보호에 매우 우수한 효능을 발휘한다. 특히, 백내장(예컨대, 당뇨병성 백내장)의 치료 또는 예방에 매우 우수한 효능을 발휘하며, 자연물-유래 물질을 유효성분으로 이용하기 때문에 인체에 안전하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예
1:
빌베리
및 복분자 추출물의 제조
구입한 빌베리를 -10℃에서 급속냉동시켜 저장한 후, 냉동된 빌베리를 30℃의 온수에서 해동시키면서 마쇄하였다. 이어, 마쇄액에 펙틴분해효소를 400 ppm 첨가하여 90분 동안 처리하고, 추출용매로 에탄올을 50%(v/v) 첨가하여 120분 동안 추출하였다. 추출액을 여과하여 빌베리 추출물을 분무건조하여 빌베리 추출분말을 수득하였다.
또한, 복분자 추출물은 다음과 같이 제조하였다: 구입한 복분자딸기를 -10℃에서 급속냉동시켜 저장한 후, 냉동된 복분자를 30℃의 온수에서 해동시키면서 마쇄하였다. 이어, 마쇄액에 펙틴분해효소를 400 ppm 첨가하여 90분 동안 처리하고, 추출용매로 에탄올을 50%(v/v) 첨가하여 120분 동안 추출하였다. 추출액을 여과하여 복분자 추출물을 분무건조하여 복분자 추출분말을 수득하였다.
실시예
2: 조성물 I의 제조
실시예 1에서 얻은 빌베리 추출물 17 %(w/v), 복분자 추출물 17 %(w/v), 비타민 A 0.01 %(w/v) 및 잔량의 물을 포함하는 본 발명의 시력 보호용 조성물을 제조하였다.
실시예
3: 조성물 Ⅱ의 제조
실시예 1에서 얻은 빌베리 추출물 17 %(w/v), 복분자 추출물 17 %(w/v), 비타민 A 0.01 %(w/w), 결명자 5 %(w/w), 마리골드 1 %(w/w), 좁쌀풀 9 %(w/w), 황납 1.5 %(w/w), 토코페롤 5 %(w/w), 포도씨유 56.29 %(w/v), 타우린 0.2 %(w/w), 비타 민B6염산염 0.2%(w/w), 산화아연 0.3 %(w/w), 대두레시틴 3%(w/w) 및 정제팜 경화유 1.5 %(w/w), 황납 1.5 %(w/w) 및 잔량의 물을 믹서에 넣고 혼합한 후, 연질캡슐에 충진하여 시력보호용 건강 기능식품을 제조하였다.
실시예
4:
인 비보
실험
본 발명의 복분자 추출물을 유효성분으로 하는 조성물을 대상으로 시력보호 효과를 알아보기 위하여 당뇨병성 백내장 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 백내장은 수정체가 혼탁해져서 투명성을 잃는 질병으로 시력 감퇴를 초래할 뿐만 아니라 실명의 가장 높은 빈도를 차지하는 원인이다. 산화성 스트레스, 자외선 노출, 노화 등 백내장을 유발하는 여러 위발인자가 알려져 있으며, 그 중 당뇨병 역시 중요한 위험 인자로 알려져 있다. 또 다른 요인으로는 기계적인 변화, 생화학적인 변화 및 생물학적인 변화 등이 있다. 이러한 백내장 생성 과정에서 자유 라디칼이며 매우 불안정하고 반응성이 강한 화학물질인 NO가 관여할 것으로 생각되는데 NO가 생성시 함께 발생한 수퍼옥사이드와 반응하여 퍼옥시니트레이트가 형성되면서 수정체 단백질의 지질 과산화가 발생하여 백내장 형성에 중요한 역할을 하였을 것으로 보인다.
백내장 발생 빈도는 당뇨병의 유병기간과 그 정도에 비례하여 증가하게 된다고 보고 되어 있다. 본 연구에서는 복분자 추출물의 조성물을 투여한 당뇨병성 백내장 유발 쥐에서 백내장의 발생 및 진행이 억제되는지를 다음과 같은 방법으로 실험하였다.
1. 당뇨병성 백내장 유도 및 실험식이
생후 6주된 Sprague-Daweley 종 래트를 일반 고형사료와 물을 주면서, 온도 20-25℃, 습도는 55± 1%가 유지되도록 사육환경을 맞추고 2주간 사육하며 환경에 적응시켰다. 스트렙토조토신(STZ)은 선택적으로 췌장의 베타세포를 파괴하여 인슐린 결핍을 유도하여 당뇨병을 유발시키는 화학물질로 본 실험에서는 이를 이용하여 당뇨를 유도하였다.
STZ을 투여하기 전 16시간 동안 실험동물을 금식시킨 후, 50 mM 시트레이트 완충액(pH 4.5)에 STZ(Sigma, chemical CO. USA)을 60 mg/kg이 되도록 녹인 뒤 10분 이내에 복강에 1회 주사하여 당뇨를 유도하였다. 당뇨가 유도되었다는 것을 STZ 주사 3일 후, 꼬리에서 정맥혈을 채취하여 비공복시 혈당이 250± 10mg/dl 이상임을 통해 확인하였다.
실험식이는 경구투여 하였고, 당뇨가 유도된 쥐들에 표 1과 같이 A군(아무런 처치를 하지 않은 군), B군(STZ로 당뇨를 유도한 군), C군(STZ로 당뇨를 유도한 후 복분자 추출물을 투여한 군), D군(STZ로 당뇨를 유도한 후 실시예 2의 조성물을 투여한 군) 및 E군(STZ로 당뇨를 유도한 후 실시예 3의 조성물을 투여한 군)으로 분류하였으며 각 군은 쥐 20마리로 실시하였다. 경구 투여량은 5 mg/kg 이었다.
2. 실험동물의 가검물 채취 및 생화학적 분석
본 발명의 조성물 투여 후 2, 4 및 12주에 각 군에 포함된 실험동물을 5마리 씩 희생시켜 안구를 적출하고 수정체를 분리한 후, 생화학적인 분석을 시행하였다. GSH의 함량은 GSH assay kit(Cayman chemical. Catalog No. 703002)를 이용하여 측정하였고, MDA 함량은 지질 하이드로퍼옥사이드 assay kit(Cayman chemical. Catalog No.705002)를 이용하여 측정하였다. 총 단백질의 정량은 브래드포드 방법에 따라 실시하였고, 이 때 표준물질로는 BSA(Bovine Serum Albumin)를 이용하였다.
3. 수정체의 투명도 및 변화양상을 관찰하기 위한 photodocumentation
각각의 대조군과 실험군에서 백내장 발생과 진행 양상을 조사하기 위해, 각각 3일, 1주, 2주, 4주, 8주 및 12주에 세극등 현미경(Takagi, SM-50F)으로 관찰하고 30배의 배율로 사진촬영을 시행하였다. 이때 관찰된 수정체의 백내장의 정도는 다음 표 1의 점수 시스템을 이용하여 분류하였다.
수정체 불투명도
등급 |
수정체 불투명도 |
0 |
수정체 불투명도 없음 |
1 |
희미한 가시적 Y 봉합선(suture) |
2 |
명백한 가시적 Y 봉합선 |
3 |
주위의 전면 캡슐 불투명도를 가지는 명백한 가시적 Y 봉합선 |
4 |
심각한 전면 캡슐 불투명도 비가시적 Y 봉합선 |
4. 백내장 발생 및 변화 양상
백내장이 3등급 이상으로 진행한 경우는 B군에서는 총 20안(100%), C군에서는 총 8안(40%), D군에서 총 5안(25%), 그리고 E군에서 총 3안(15%)으로, 복분자 추출물을 단독 투여한 경우에도 백내장의 발생이 통계적으로 유의하게 억제되었고, 다른 시력보호 유효성분을 더 추가한 D군 및 E에서도 백내장의 발생이 통계적으로 유의하게 억제되었다. STZ로 당뇨를 유도한 군(B군)에서는 3일째부터 수정체 불투명화도 등급이 평균 1.6이상의 Y-봉합선 모양의 수정체 혼탁이 발생하였으며, 1주 이후에는 불투명도 등급이 평균 2.8 이상으로 증가하는 양상이 관찰되었다. 반면, 복분자 추출물을 투여한 군(C군)에서는 평균 7주 이후에야 등급 2 이상으로 증가하였다. D군 및 E군에서는, 각각 평균 9주 및 11주 이후에야 등급 2 이상으로 불투명도가 증가하였다. 당뇨를 유도하지 않은 대조군(A군)에서는 실험기간 동안, 어떠한 수정체 불투명도가 관찰되지 않았다.
5. 생화학적 분석
(1) 글루타티온 함량 측정 (GSH 함량, μM)
GSH는 체내의 비효소적 항산화 방어계로 산화성 스트레스에 의한 세포손상을 억제에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 과다한 산화성 스트레스는 GSH함량 감소와 GSH의 산화를 유발함으로써 GSH에 의한 산화성 손상으로부터의 방어 기전이 손상을 받는다고 알려져 있다. 당뇨병에서 역시 산화성 손상이 유도되며 조직내의 GSH에 의한 산화성 손상의 방어기전의 손상이 발생한다고 보고되어 있다. 본 실험에서 12주 후의 GSH 함량 측정 결과는 다음 표 2에 기재되어 있다.
구분 |
A군 |
B군 |
C군 |
D군 |
E군 |
GSH 함량(μM) |
252.7 |
158.2 |
196.9 |
231.2 |
242.5 |
표 2에서 확인할 수 있듯이, 아무런 처리를 하지 않은 군과 비교할 때, STZ를 처리한 수정체에서는 GSH 함량이 크게 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 STZ를 처리 후 복분자 추출물을 투여한 수정체의 GSH 함량은, 12주 후 196.9 μM의 크게 증가된 GSH 함량을 나타내었고, 투여 기간이 증가 할수록 GSH 함량도 증가하였다. 또한, 다른 시력보호 유효성분을 더 추가한 D군 및 E에서도 GSH 함량이 크게 증가하였다.
상기 수정체 불투명도의 결과와 종합하여 보면, 복분자 추출물은 당뇨병에 의해 손상된 GSH 같은 항산화 시스템의 활성을 높여서 산화적 스트레스로부터 수정체를 보호하여 수정체의 불투명도의 증가를 막는 것으로 판단된다.
(2) MDA(Malondialdehyde) 측정(하이드로퍼옥사이드 함량, μM)
산화성 세포 손상은 단백질, 핵산, 지질등과 같은 거대분자들의 변형을 유도하여 그 효과를 나타낸다. 특히 산화성 손상에서의 지질의 산화는 세포막의 변형을 가져오며 이로 인해 다시 ROS를 생성하는 증폭과정을 유발한다. 따라서 산화성 세포손상의 중요지표로 세포막의 지질 과산화를 측정한다. MDA의 측정치는 지질 과산화도의 측정치와 동일함으로, MDA는 체내에서 산화적 손상의 지표로 사용되고 있다. 본 실험에서 12주 후의 MDA 함량 측정 결과는 다음 표 3에 기재되어 있다.
구분 |
A군 |
B군 |
C군 |
D군 |
E군 |
MDA 함량(μM) |
82.1 |
154.2 |
110.8 |
106.2 |
90.3 |
표 3에서 확인할 수 있듯이, 당뇨군인 B군에 비해 복분자 추출물을 투여한 C군에서 상대적으로 정상에 가까운 MDA 측정치를 나타내었다. 또한, 다른 시력보호 유효성분을 더 추가한 D군 및 E에서도 MDA 함량이 크게 감소하였다. 이 실험 결과는 복분자 추출물이 산화적 시트레스에 의해 유발되는 지질 과산화를 효과적으로 억제함으로써, 수정체를 보호한다는 것을 나타낸다.