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KR101391308B1 - 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 망막질환 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 망막질환 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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KR101391308B1
KR101391308B1 KR1020110014802A KR20110014802A KR101391308B1 KR 101391308 B1 KR101391308 B1 KR 101391308B1 KR 1020110014802 A KR1020110014802 A KR 1020110014802A KR 20110014802 A KR20110014802 A KR 20110014802A KR 101391308 B1 KR101391308 B1 KR 101391308B1
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cells
retinal
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정상훈
김경아
이은하
안홍렬
노주원
조형
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한국과학기술연구원
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Abstract

본 발명은 국화과 식물인 벌개미취(Gymnaster koraiensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 조성물, 또는 건강식품에 관한 것이다.
본 발명의 벌개미취(Gymnaster koraiensis) 추출물 또는 이의 분획물은 산화스트레스로부터 유도한 망막 신경 세포의 퇴화를 막을 수 있어, 천연물의 안전한 특성을 이용하여 노인성 황반 변성, 녹내장 등 망막질환 예방 및 치료용 조성물 또는 기능성 식·의약품 소재로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 망막질환 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising the extracts and fractions of Gymnaster koraiensis for prevention or treatment of retinal diseases}
본 발명은 국화과 식물인 벌개미취(Gymnaster koraiensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 조성물, 또는 건강식품에 관한 것이다.
세포 자살(apoptosis)이란, 세포괴사(necrosis)와는 구별되는 세포 내의 자발적이고 계획된 세포사(programmed cell death)이고, 세포 자살을 유발하는 다양한 기전들이 제시되어 왔다. 대표적인 유발인자로는 산화 스트레스(oxidative stress), 질소산화물 합성효소(nitric oxide synthase), 미토콘드리아(mitochondria)를 매개로 하는 케스페이즈 의존적(caspase-dependent) 또는 비의존적(caspase-independent) 기전 등이 있다. 특히 많은 안질환들이 특정 세포의 세포 자살로 인해 발생하는 것으로 알려져 있으며, 그 대표적인 안질환으로는 연령 관련 황반 변성(age related macular degeneration) 및 녹내장(glaucoma)이 있다. 이러한 안질환의 억제 및 치료를 위하여 세포 자살을 억제하거나 그 진행을 늦출 수 있는 약제에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있는 실정이다.
눈의 각막, 수정체(렌즈) 및 유리체 등은 혈관이 없는 부위이기 때문에, 여기에 영양분을 공급하고 노폐물을 운반하는 방수라고 하는 물이 존재하고 있다. 그런데 방수는 정상으로 나오는데 반해, 빠져나가는 부분이 망가지게 되면, 방수는 계속 나오기 때문에 눈의 압력은 올라가게 된다. 이렇듯 눈의 압력이 높아지게 되면, 많은 혈액을 공급받아야 하는 눈 속에 혈액이 들어오지 못하게 되며, 약한 부위인 시신경에 지속적인 압력이 가하게 되고, 지속적인 압력을 받은 시신경은 치명적인 손상을 입게 되어 시력 및 시야의 결손을 초래하게 된다. 녹내장(glaucoma)은 이러한 안압의 상승으로 인해 시신경이 눌리거나 혈액 공급에 장애가 생겨 시신경의 기능에 이상을 초래하게 되는 질환으로, 말기에는 시력을 상실하게 되는 심각한 질환이다. 이러한 녹내장은 40세 이상의 성인 가운데 0.5 내지 2%의 빈도로 일어나게 되는데, 안압의 정상값이 15 내지 20 mmHg인데 반해, 녹내장이 진행되면 안압이 상승하면서, 동공 안쪽이 녹색으로 보이게 된다.
현재 녹내장에 대한 치료는 녹내장의 가장 중요한 위험요소인 안압 상승을 약물이나 수술적인 방법을 이용하여 막는 것이 대부분으로, 녹내장은 완치될 수 없고 평생 약물, 레이져 치료, 수술 등의 방법으로 안압을 조절하여 시신경의 장애를 최소화하는 방법밖에 없다.
또한, 녹내장은 망막 신경 세포의 세포 사멸로 인한 시신경의 손상을 통해서 일어나게 되는데, 이러한 시신경의 손상은 특징적인 녹내장성 시야 손상을 동반한다. 녹내장에서 나타나는 망막 신경 세포의 세포 사멸은 세포 자살(apoptosis)로 알려져 있으며, 안압을 상승시킨 동물 모델뿐만 아니라 녹내장 환자의 사후 부검을 통해서도 녹내장 환자에서 망막 신경 세포의 세포 자살이 관찰되었다(Quigley HA et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 36, 774-786, 1995; Garcia-Valenzuela E et al., Exp Eye Res., 61, 33-44, 1995). 세포 내에 세포 사멸을 유도하는 기전과 억제하는 기전의 균형에 의하여 세포의 운명이 결정되는데, 녹내장에 있어서는 글루타메이트(glutamate), 사이토크롬 C(cytochrome c), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 및 Bad(BCL2-antagonist of cell death) 단백질의 증가 또는 발현이 망막 신경 세포를 세포 자살에 이르게 하는 것으로 알려져 있으며, 세포 내의 산화 스트레스(oxidative stress)도 녹내장의 중요한 원인으로 알려져 있다. 녹내장에서는 망막 신경 세포가 산화 스트레스를 받아 직접적으로 시신경을 손상에 이르게 할 뿐만 아니라, 방수 유출로를 구성하고 있는 섬유주 세포(trabecular meshwork cell)가 산화 스트레스를 받음으로써, 그 결과 섬유주 세포의 기능저하가 일어나게 되고, 궁극에는 세포 자살이 일어나게 되어 안압이 상승하게 된다(Sacca' SC et al, Arch Ophthalmol., 123, 458-463, 2005; Zhou L et al., J Cell Physiol., 180, 182-189, 1999).
섬유주 세포의 기능저하는 세포가 고유하게 가지고 있는 방수를 흡수하는 음세포작용(pinocytosis)에 영향을 주게 되어 안압의 상승을 유발하는데, 특히 섬유주 세포의 기능저하가 안압상승의 주원인으로 알려져 있는 원발성 폐쇄 각 녹내장(primary open angle glaucoma) 환자들의 섬유주 세포가 산화 스트레스에 더 취약한 것으로 알려져 있다(Izzotti A et al., Am J Med., 114, 638-646, 2003). 상기 환자의 방수를 분석한 결과, 총항산화역량(total antioxidant potential)이 유의하게 정상인에 비하여 낮은 것으로 나타났고(Ferreira SM at al., Am J Ophthalmol. 137, 62-69, 2004), 혈장에 산화 스트레스를 조절하는 글루타치온-S- 전이효소(Glutachione-S-Transferase)가 증가되어 있음이 관찰되었다(Yang J et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 42, 1273-1276, 2001). 또한 최근에는 원발성 개방 각 녹내장 환자들에 있어서 나타나는 섬유주 세포의 손상이 항산화제에 의하여 억제됨이 알려져 있다(Yuan He et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 49, 1447-1458, 2008). 이처럼 망막 신경 세포와 섬유주 세포의 세포 자살을 억제하고 상기 세포의 산화 스트레스를 억제하는 것이 새로운 접근방법으로 대두되고 있다.
한편, 벌개미취(Gymnaster koraiensis)는 우리나라의 특산 다년초로서 속명으로 고려쑥부쟁이라고 불리며 국화과에 속한다. 햇볕이 잘 들고 습기가 충분한 곳에서 자라며, 특히 제주도 경기도 이남에서 재배된다. 높이는 50 ~ 60cm이며, 너비는 1.5 ~ 3cm이다. 잎은 끝이 뾰족하고 길이가 12 ~ 19cm가 되며, 너비 1.5 ~ 3cm로 밑 부분이 점차 좁아지며 딱딱하고 양면에 털이 거의 없으며 가장자리에 잔톱니가 있다. 여러해살이 식물로 꽃은 10월에 피고 지름 4 ~ 5cm로 연한 자주색이며 가지 끝과 원줄기 끝에 달리고 총포는 반구형이며 길이는 약 13mm, 지름은 약 8mm이다. 포편은 4줄로 배열되고 외편은 길이는 4 ~ 5mm, 너비는 약 1.5mm로 긴 타원형이며, 가장자리에 털이 있다.
그러나 망막 신경 세포를 보호함으로써 망막질환을 예방 또는 치료할 수 있는 벌개미취 추출물의 효능에 관한 연구는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 한국의 자생 식물을 대상으로 망막 신경 세포 보호 효과를 연구한 결과, 벌개미취 추출물 및 이의 분획물이 산화스트레스를 유도한 망막 신경 세포를 보호하고 세포 사멸을 저해하여 망막 신경 세포의 퇴화로 인한 망막 질환의 예방 및 치료제로 사용될 수 있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 산화 스트레스에 의한 망막 신경 세포의 퇴화를 저해하는 벌개미취(Gymnaster koraiensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 망막질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.
또한 본 발명의 다른 목적은 상기 벌개미취(Gymnaster koraiensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 망막질환의 예방 및 개선용 건강식품을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 벌개미취의 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 망막질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 벌개미취(Gymnaster koraiensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 망막질환의 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 벌개미취(Gymnaster koraiensis) 추출물 또는 이의 분획물은 산화스트레스로부터 유도한 망막 신경 세포의 퇴화를 막을 수 있어, 천연물의 안전한 특성을 이용하여 노인성 황반 변성, 녹내장 등 망막질환 예방 및 치료용 조성물 또는 기능성 식·의약품 소재로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 산화스트레스에 의한 세포 사멸에 대하여 벌개미취 추출물의 망막 신경절 세포의 보호 효과를 나타낸 그래프이다. 상기 도 1에서 GKEA는 벌개미취 추출물, EGCG는 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate)를 나타낸다.
도 2는 망막 신경 세포 RGC-5에 벌개미취 추출물을 전처리하고, 산화스트레스를 유도한 다음, Hoechst 33342 및 프로피디움 요오드화물을 이중 염색하여 이를 형광 현미경을 통해 확인한 사진이다. 상기 도 2에서 A는 아무것도 처리하지 않은 정상세포, B는 과산화수소만 처리한 세포, C는 과산화수소와 10μg/ml 농도의 벌개미취 추출물을 처리한 세포, D는 과산화수소와 1μg/ml 농도의 벌개미취 추출물을 처리한 세포를 나타내다.
도 3은 망막 신경 세포 RGC-5에 벌개미취 추출물의 전처리에 따른 산화 라디칼에 의한 세포의 활성산소의 생성변화를 나타낸 그래프로서 도 3a는 과산화수소, 도 3b는 O2 -· 라디칼, 도 3c는 OH-· 라디칼의 생성 변화를 나타낸 것이다.
도 4는 망막 신경 세포 RGC-5에 벌개미취 추출물의 전처리에 따른 산화 라디칼에 의한 세포의 글루타티온 함량의 비를 나타낸 그래프이다. 이 때, NAC는 N-아세틸 시스테인 (N-acetyl cysteine) 을 나타내며, 도 4a는 과산화수소, 도 4b는 O2 -· 라디칼, 도 4c는 OH-· 라디칼을 처리한 경우를 나타낸다.
도 5는 망막 신경 세포 RGC-5에 벌개미취 추출물의 전처리에 따른 세포 사멸과 항산화 관련 단백질 발현을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 사진이다.
도 6은 N-메틸-D-아스파테이트(N-methyl-D-aspartate, NMDA)로 유도한 흰쥐의 망막세포 사멸을 저해하는 벌개미취 추출물의 효과를 헤마톡실린과 에오신 염색을 통하여 확인한 사진이다.
도 7은 N-메틸-D-아스파테이트(N-methyl-D-aspartate, NMDA)로 유도한 흰쥐의 망막세포 사멸을 저해하는 벌개미취 추출물의 효과를 TUNEL로 염색한 망막의 단면으로 확인한 사진이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 벌개미취(Gymnaster koraiensis) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 벌개미취 추출물은 하기와 같은 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다;
1) 건조한 벌개미취(Gymnaster koraiensis)을 추출 용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압농축하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 벌개미취는 재배한 것, 채취한 것 또는 시판되는 것 등이 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 벌개미취는 식물 전체를 이용할 수 있고, 잎, 줄기 또는 뿌리를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 추출 용매는 물, C1 ~ C4의 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합 용매, 바람직하게는 C1 ~ C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매를 사용하는 것이 좋으며, 메탄올 또는 에탄올 수용액으로 추출하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 용매의 양은 벌개미취 건조 중량의 1 내지 20 배로 함이 바람직하고, 5 내지 15 배로 하는 것이 더 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 방법은 열수추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 초음파 추출방법으로 1회 내지 5회 추출될 수 있다. 추출시 온도는 10℃ 내지 100℃ 인 것이 바람직하며, 상온인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출 시간은 1일 내지 10일인 것이 바람직하고, 3일 내지 7일인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 추출물을 제조하는 방법은 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있으며, 가온하며 환류 추출 또는 상온에서 추출하는 것이 바람직하나, 이에 한정하는 것은 아니다. 상기 추출 회수는 1회 내지 5회인 것이 바람직하며, 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조, 상온건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
한편 벌개미취 추출물의 분획물은 상기 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 얻을 수 있으며, 이때 유기용매는 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트 또는 노르말-부탄올인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 벌개미취 추출물을 물에 현탁시킨 후 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트, 노르말-부탄올 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 노르말-헥산 분획물, 염화 메틸렌 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며, 에틸아세테이트 분획물임이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 상기 벌개미취 추출물로부터 분획 과정을 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 건조된 벌개미취를 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 에탄올 수용액을 가하여 실온에서 방치한 후, 거름종이로 여과한 휘, 여과액을 농출 및 동결건조하여 추출물을 얻었고, 상기 벌개미취 추출물을 분별깔때기를 이용하여, 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트, 노르말-부탄올 및 물 분획물로 순차적으로 계통분석하여 벌개미취 추출물 및 이의 분획물을 제조하였다.
상기 제조된 벌개미취 추출물의 망막 신경 세포(RGC-5)의 보호 효과를 측정하기 위하여, 세포 배양 후, 벌개미취추출물을 농도별로 전 처리한 후, 산화스트레스를 유도하는 과산화수소(H2O2)를 처리하고, 세포의 생존율을 확인하기 위해 MTT 방법을 수행하였으며, 그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에서 과산화수소에 의해 산화스트레스가 유도되었을 때, 상기 벌개미취 추출물을 전 처리한 경우 과산화수소만 처리한 군에 비해, 높은 세포 생존율을 나타내었다(도 1 참조).
따라서, 벌개미취 추출물은 산화스트레스에 대한 망막 신경 세포의 보호 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 벌개미취 추출물이 망막 신경 세포(RGC-5)의 세포 사멸을 억제하는지 확인하기 위하여, 막투과성이 있어 살아있는 세포나 죽어있는 세포를 파란색으로 염색시키는 Hoechst 33342와 막투과성이 없어 죽어 있는 세포에만 염색이 되는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)을 사용하여 산화스트레스에 의한 세포 사멸을 분석하였다. 그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에 과산화수소 처리에 의하여 세포 사멸을 유도할 때, 벌개미취 추출물을 전 처리한 경우 과산화수소만 처리한 군에 비하여, 세포 사멸에 의해 염색되는 프로피디움 요오드화물에 의한 형광 적색 표지가 농도의존적으로 감소함을 확인하였다(도 2 참조).
따라서, 벌개미취 추출물은, 산화스트레스에 의한 망막 신경 세포의 세포 사멸을 억제하는 효과를 가지고 있음을 확인하였다.
또한, 벌개미취추출물의 망막 신경 세포(RGC-5)에서 활성산소(Reactive Oxygen Species)발생을 억제시키는지 확인하기 위해, 활성산소에 해당하는 H2O2 라디칼, OH-. 라디칼 및 O2 -. 라디칼을 유도하였고, 그 결과 벌개미취추출물은 유의적으로 활성산소 발생을 억제하는 것을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 벌개미취추출물의 망막 신경 세포(RGC-5)에서 글루타티온(Glutathione; GSH) 회복 효과를 확인하기 위하여, 전체 글루타티온(GSH) 함량을 Rahman et al(2006)의 방법을 변형하여 측정하였다. 그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에서 H2O2 라디칼, OH-. 라디칼 및 O2 -. 라디칼에 의해 유도된 산화 라디칼에 의한 글루타티온 함량의 감소에 있어서, 벌개미취 출물을 전 처리한 경우 H2O2 라디칼, OH-. 라디칼 및 O2 -. 라디칼만 처리한 경우와 비교할 때, RGC-5의 전체 글루타티온 함량의 감소를 유의적으로 회복시킴을 확인하였다(도 4 참조).
따라서, 벌개미취 추출물은 산화 라디칼에 의한 망막 신경 세포의 글루타티온의 감소를 회복하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
또한, 벌개미취추출물의 지질과산화 저해효과를 측정하기 위하여, SNP (sodium nitropurrusid)로 유도한 흰쥐 뇌의 지질과산화양을 TBARS Assay (thiobarbituric acid reactive substances assay)법으로 측정하였다. 그 결과 벌개미취 추출물로 전처리한 경우, 지질과산화를 농도 의존적으로 감소시켰다(표 1 참조).
따라서, 벌개미취추출물은 지질과산화를 억제함을 확인하였다.
또한, 산화스트레스로부터 유도한 사멸(apoptotic) 단백질, 항산화 단백질의 발현을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯팅 어세이를 수행하였으며, 벌개미취 추출물을 전처리한 경우, 사멸 단백질의 발현을 억제시키고, 항산화 단백질의 발현을 증가 시키는 것을 확인하였다(도 5, 표 2 참조).
또한, 조직학적으로 NMDA로 유도한 흰쥐의 망막의 두께변화를 확인하기 위해 헤타톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)로 염색하여 망막의 단면을 관찰하였으며, 벌개미취 추출물을 전처리한 경우, 망막의 신경절 세포층(Ganglion Cell Layer, GL)과 속핵층(Inner Nuclear Layer, INL)의 얇아짐을 억제하는 것을 확인하였다(도 6 참조).
또한, NMDA로 유도한 흰쥐의 망막세포 사멸을 TUNEL 염색법을 사용하여 측정하였으며, 벌개미취 추출물을 전처리한 경우, TUNEL 반응 세포가 유의적으로 감소하여 세포 사멸을 억제하는 것을 확인하였다(도 7 참조).
상기 본 발명의 벌개미취 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 벌개미취 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질환의 중증도, 약물형태, 투여시간, 투여방법, 투여경로 및 투여기간 등에 따라 그 범위가 다양하다. 1일 투여량은 본 발명에 따른 추출물, 분획물 또는 화합물을 동결건조하였을 때의 양으로 0.0001㎎/㎏ 내지 500㎎/㎏, 바람직하게는 0.001㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏ 이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 건강 식품을 소재로 제공한다.
본 발명의 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물은 산화스트레스를 유도한 망막 신경 세포를 보호하고 세포 사멸을 저해하여, 망막 신경 세포의 퇴화로 인한 망막 질환의 예방 및 치료용 건강 식품으로 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다.
단 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 제조예에 의해 한정되지 않는다.
제조예 1 : 벌개미취 추출물의 제조
벌개미취는 4월 중순(어린순)과 8월 중순(성체)에 강원도 평창 등지에서 채집하였다. 건조된 벌개미취를 세절한 후 180 g에 2 L의 에탄올을 가하고 3시간동안 가온 환류 추출한 후 추출액을 여과하였다. 추출액을 여과한 후 남은 잔사에 다시 2 L의 에탄올을 가하고 3시간동안 가온 환류 추출하는 방법을 추가로 2회 반복하여 총 추출액 6 L를 수득하였다. 상기 추출액 6 L를 35 ℃에서 감압 농축하여 에탄올 추출물 8.5 g을 수득하였다. 상기 벌개미취 추출물을 분별깔때기를 이용하여 n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 순차적으로 분획하였으며, 그 결과 n-헥산 분획물(0.94g), 에틸아세테이트 분획물(1.74g), n-부탄올 분획물(1.86g) 및 물 분획물(2.2g)을 얻을 수 있었다. 상기 추출물과 분획물은 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide, DMSO)에 녹인 후, 하기 실험에 이용되었다.
실시예 1 : 벌개미취 추출물의 망막 신경 세포(RGC-5) 보호 효과 측정
망막신경절세포 (RGC-5)는 Alcon Research, Ltd 에서 무상으로 제공받았으며, 10% 우태아 혈청(FBS)과 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin)을 포함한 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지(DMEM, Hyclone, USA)를 사용하여 75-T 조직배양 플라스크에 37℃에서 5% CO2, 95%공기 및 포화 습도하의 항온기에서 배양하였다. 2일 내지 3일 후 포화 상태로 자란 세포는 트립신(Trypsin-EDTA) 용액을 사용하여 플라스크로 부터 떼어낸 후 계대 배양하였다. 세포를 96웰 배양접시에 분주한 후 24시간 동안 항온기에 넣어 세포를 부착시킨 후 배지를 제거하고, 1%의 저농도 우태아 혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지로 교환하였다. 추출물은 산화스트레스를 가하기 1시간 전에 최종농도가 10, 1, 0.1 μg/ml 되게 전처리하였다. 300 μM 과산화수소(H2O2)를 37℃에서 24시간 동안 처리 후, MTT 방법을 수행하여 세포 독성을 측정하였다.
MTT 방법은 세포 생존율을 확인할 수 있는 간단한 방법으로, 세포의 미토콘드리아 탈수소효소(mitochondrial dehydrogenase)에 의해 테트라졸리움 염(tetrazolium salt)인 MTT가 불용성 포마잔(formazan crystal)으로 변화되는 것을 DMSO를 처리하여 용해한 후, 변화된 정도를 발색 반응으로 확인하여 세포 독성의 정도를 측정하느 방법이다.
구체적으로, MTT 방법을 수행하기 위하여, 상기 RGC-5 세포에 처리한 배지를 제거하고 각 웰당 최종농도가 0.5 mg/ml가 되게 MTT 용액을 가한 후 1시간 동안 항온기에 넣어 반응 시켰다. 이후, 각 웰당 디메틸술폭시드(dimethylsulfoxide)를 100 ul씩 처리하고 15분간 흔든 후, 시너지 HT 마이크로플레이트 분석기[Synergy HT Multi-microplate reader(Bio-Tek instruments, Winooski, VT, U.S.A)]로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
한편, 기존에 망막 신경절 세포 보호효과가 있음이 알려져 있는 물질인 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG)를 양성 대조군 (positive-control)으로 사용하였다.
그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에서 망막 신경 세포 RGC-5에서 과산화수소 처리에 의해 산화스트레스가 유도된 경우, 벌개미취 추출물을 처리한 군은 과산화수소만 처리한 군에 비하여 세포 생존율이 유의적으로 상승하였다(도 1).
따라서, 벌개미취 추출물은 산화스트레스에 대한 망막 신경 세포 보호 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 2 : 벌개미취 추출물의 망막 신경 세포(RGC-5)의 세포 사멸 저해 효과 측정
상기 실시예 1에서 추출한 추출물이 망막 신경 세포(RGC-5)의 세포 사멸을 저해하는지 확인하기 위하여, 살아있거나 죽은 세포, 즉 전체 세포를 파란색으로 염색하는 Hoechst 33342와 죽은 세포를 빨간색으로 염색하는 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, PI)을 이용하여 이중으로 염색한 후 세포분석을 수행하였다.
구체적으로, 세포를 96 웰 배양 접시에 분주하여 부착시킨 후 배지를 저농도의 1% 우태아혈청(FBS)으로 교환하고 벌개미취 추출물을 그 최종농도가 10, 1, 0.1 μg/ml 이 되게 1시간 동안 전 처리하였다. 이후, 300 μM 과산화수소(H2O2)를 37℃에서 24시간 동안 처리 후, 세포를 차가운 D-PBS로 세척하고, 최종농도가 8 uM의 Hoechst 33342와 1.5 uM의 PI를 세포에 첨가하여 15분간 37℃에서 염색시킨 후, 형광 현미경(fluorescence microscope)을 사용하여 가시화하였다.
그 결과, 아무것도 처리하지 않은 정상세포에서는 세포 사멸을 나타내는 프로피디움 요오드화물-양성으로 표지된 세포들이 거의 발견되지 않았으나, 과산화수소(H2O2)로 산화 스트레스를 유도한 세포에서는 붉은색으로 염색된 프로피디움 요오드화물-양성 세포들이 많이 발견되었다. 그러나 벌개미취 추출물을 전 처리 한 경우, 과산화수소(H2O2)만 처리한 경우와 비교하였을 때, 프로피디움 요오드화물에 의한 형광 적색 표지가 감소함을 확인하였다(도 2).
따라서, 벌개미취 추출물은 산화스트레스에 의한 망막 신경 세포의 세포 사멸을 저해하는 효과를 나타냄을 확인하였다.
실시예 3 : 벌개미취 추출물의 망막 신경 세포(RGC-5)에서 활성산소(Reactive Oxygen Species) 억제 효과 측정
상기 실시예 1에서 추출한 추출물이 망막 신경 세포(RGC-5)에서 활성산소 저해 효과를 나타내는지 여부를 측정하였다. 활성산소종의 생성은 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(2',7'-dichlorofluorescin diacetate, DCFH-DA, Sigma, USA)가 세포 내로 들어가 활성산소종에 의하여 형광물질인 디클로로플루오레신(dichlorofluorescin, DCF)으로 산화되는 것을 이용한 디클로로플루오레신 디아세테이트 어세이(dichlorofluorescin diacetate assay)로 조사하였다. 96 웰 배양접시에서 5.0 × 103 cells/well의 농도로 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 1% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지로 교환하여 1시간동안 약물을 처리 한 후 10 μM의 DCFH-DA를 15분간 처리하였다. 배지를 제거하고 각각의 활성 산소종인 과산화수소(H2O2), 하이드록시 라디칼(OH-·), 수퍼옥사이드(O2 -·)를 유도하기 위하여 1mM H2O2 (H2O2 라디칼), 1mM H2O2 와 100μM 철(II) 퍼클로레이트 염화물(iron(II) perchlorate hexahydrate; OH-· 라디칼), 1mM KO2 (O2 -· 라디칼)를 세포에 30분 간 노출시켜 산화된 디틀로로플루오레신(DCF)을 여기(excitation) 485 nm, 방출(emission) 535 nm의 파장에서 형광도를 측정하였다.
한편, 기존에 망막 신경절 세포 보호효과가 있음이 알려져 있는 물질인 에피갈로카테킨 갈레이트(Epigallocatechin gallate, EGCG)를 양성 대조군 (positive-control)으로 사용하였다.
그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에 H2O2 라디칼, OH-· 라디칼 및 O2 -· 라디칼 등의 산화 라디칼에 의한 활성산소를 증가시킴에 있어서, 벌개미취 추출물을 전처리한 경우, H2O2 라디칼, OH-· 라디칼 및 O2 -· 라디칼만 처리한 경우와 비교하였을 때, 최대 30% 미만으로 활성산소의 양을 감소시킬 수 있음을 확인하였다(도 3).
실시예 4 : 벌개미취 추출물의 망막 신경 세포(RGC-5)에서 글루타티온(Glutathione) 회복 효과 측정
상기 실시예 1에서 추출한 추출물이 망막 신경 세포(RGC-5)에서 글루타티온(Glutathione; GSH) 회복 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, 전체 글루타티온(GSH) 함량을 Rahman et al (2006)의 방법을 변형하여 측정하였다.
구체적으로, 세포를 96 웰 배양 접시에 분주한 후, 24시간 동안 배양기에 넣어 세포를 부착시키고, 배지를 1% 우태아혈청(FBS)로 교환한 후, 벌개미취 추출물을 그 최종농도가 10, 1, 0.1 μg/ml이 되게 1시간 동안 전처리하였다. 이후, 배지를 제거하고 1mM 과산화수소(H2O2 라디칼), 1mM 과산화수소 및 100 uM 철(II) 퍼클로레이트 염화물(iron(II) perchlorate hexahydrate; OH-· 라디칼), 1mM KO2 (O2 -. 라디칼)을 1시간 동안 세포에 노출시켜 산화적 손상에 의한 총 글루타티온의 감소를 측정한 후, 전체 글루타티온(GSH) 함량은 표준곡선에 의해서 산출하였으며, nmol/ mg 단백질로 계산하여 대조군의 GSH 함량에 대한 시료를 처리한 GSH 함량의 비로 나타내었다.
한편, 글루타티온을 상승시키는 물질인 N-아세틸 시스테인(N-acetyl cysteine, NAC)을 양성 대조군(positive-control)으로 사용하였다.
그 결과, 망막 신경 세포 RGC-5에 H2O2 라디칼, OH-· 라디칼 및 O2 -· 라디칼에 의한 산화 라디칼에 의한 글루타티온 함량을 감소시킴에 있어서, 벌개미취 추출물을 전처리한 경우, H2O2 라디칼, OH-· 라디칼 및 O2 -· 라디칼만 처리한 경우와 비교하였을 때, RGC-5의 전체 글루타티온 함량을 약 2배 가량 회복시킬 수 있음을 확인하였다(도 4).
실시예 5 : 벌개미취 추출물의 SNP로 유도한 흰쥐 뇌의 지질과산화 저해효과
상기 실시예 1에서 추출한 추출물이 SNP로 유도한 흰쥐 뇌의 지질과산화 저해 효과를 나타내는지 확인하기 위하여, MDA(malondialdehyde)를 지표로 하는 Thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) assay를 사용하여 측정하였다. 적출한 뇌를 뇌 부피의 10배의 차가운 식염수(pH 7.0)에 분쇄하고, 4 ℃, 1000 g에서 원심분리한 상층액을 깨끗한 시험관에 옮겨 담은 후, Bio-Rad Protein 분석방법을 사용하여 단백질의 농도를 정량하였다. 상층액을 시험관에 0.5 ml씩 옮겨 담고 농도별로 조제한 각 벌개미취 시료(0.13, 0.25, 0.50, 1.00 μg/ml)를 넣어주고 37℃ 항온조에서 5분간 인큐베이션을 한 후 20 μM SNP (sodium nitroprusside)를 최종 부피 1 ml가 되게 넣어 37℃ 항온조에서 30분간 인큐베이션 하였다.
위의 산화 반응물에 8.1% w/v SDS, 0.8% TBA와 20% v/v 아세트산(pH 3.5)를 가하고 잘 혼합한 후, 90 ~ 95℃ 의 수조에서 30분간 가열한 후 실온까지 식혔다. 혼탁도를 줄이기 위해 n-부탄올 : 피리딘 혼합액(15:1 v/v)을 넣고 혼합하여 원심분리한 후 상층액의 흡광도를 532 nm에서 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
Figure 112011011962881-pat00001
상기 표 1에서 보는 바와 같이 벌개미취 추출물을 전처리한 경우, SNP로 유도한 지질과산화의 저해 정도가 벌개미취 추출물의 처리 농도에 따라 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있는 바, 벌개미취 추출물이 지질과산화 저해에 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 6 : 벌개미취 추출물의 세포 사멸과 항산화 관련 단백질 발현 활성 영향 측정
상기 실시예 1에서 추출한 추출물의 항산화에 관련된 단백질 발현에 미치는 영향을 측정하기 위하여 망막 신경세포 (RGC-5)를 대상으로 웨스턴블라팅 어세이를 수행하였다. 먼저, DMEM/10% FBS 용액을 망막 신경세포 배양액과 혼합하여 세포의 수를 4 × 104 cells/ml로 조제한 후에 60 mm 접시에 5 ml씩 처리하여 5% CO2/37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 된 후에 상기 실시예 1에서 추출한 추출물을 0.1, 1, 10 μg/ml 의 농도로 처리하고 24시간 동안 5% CO2/37℃의 조건에서 배양하였다. 배양 종료 후 세포 용해물로부터 단백질을 추출하여 세포 사멸과 항산화 항원을 붙여 웨스턴 블롯팅 어세이를 수행하였다(도 5).
또한, 단백질 발현량은 LAS-4000 image reader와 Multi Gauge 3.1 software (Fuji Photo Film, Japan)을 사용하여 정량하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

 Protein expression level
Control 300 μM H2O2 GKEA
10 μg/ml		 GKEA
1 μg/ml		 GKEA
0.1 μg/ml
cleaved PARP/ β-actin 100 131.26±7.20 114.10±22.05 114.55±11.75 135.41±28.36
AIF/β-actin 100 255.60±21.80 207.35±28.50 217.62±29.68 247.83±32.67
p53/β-actin 100 314.52±23.44 134.35±16.04 171.35±15.33 322.94±9.00
cleaved caspase-3/β-actin 100 625.74±33.97 170.57±15.11 218.24±23.80 515.23±19.76
Catalase/β-actin 100 32.81±25.01 95.74±27.22 93.67±21.90 54.55±21.99
Bcl-2/β-actin 100 98.96±8.10 107.87±20.24 104.87±23.99 100.51±25.28
GPx-1/β-actin 100 55.43±7.48 90.57±17.72 89.03±19.09 51.99±17.40
상기 표 2 및 도 5에서 보는 바와 같이, 아무것도 처리하지 않는 정상세포의 단백질 발현과 과산화수소만 처리한 세포의 단백질 발현을 비교할 때, 과산화수소를 처리한 세포는 세포사멸을 일으키는 단백질의 발현이 증가하고 항산화 단백질의 발현이 감소하였다. 그러나 벌개미취 추출물을 함께 처리한 경우, 농도 의존적으로 세포 사멸 단백질의 발현을 억제시키며, 항산화 단백질의 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다.
결국, 산화스트레스를 유도 하였을 때, 본 발명의 벌개미취 추출물이 세포사멸 단백질의 활성을 감소시키고, 항산화 단백질의 발현을 증가시켜 세포 사멸을 억제할 수 있음을 확인하였다.
실험예 7 : 벌개미취 추출물의 NMDA로 유도한 흰 쥐의 망막 퇴화 보호 효과
상기 실시예 1에서 추출한 추출물이 N-메틸-D-아스파테이트(N-methyl-D-aspartate, NMDA)로 유도한 흰쥐의 망막퇴화를 보호하는 효과를 나타내는지 여부를 측정하였다. 먼저 2% 럼푼 주사액과 졸레틸을 혼합하여 1 ml/kg 근육 주사 하여 마취시킨 후, NMDA(5 nmol/eye)를 멸균한 해밀턴(Hamilton) 주사기에 33-G 주사침을 사용하여 상비측 평면부를 통해 안구에 2μl씩 유리체내로 주입하였다. 주입 후에 감염을 예방하기 위해 0.5% 비가목스 점안액 (ALcon Laboratoriss, Inc.)을 한 방울 점안 하였다. 대조군에서는 같은 용량의 0.01 M PBS를 주입하였다. 좌안은 NMDA를 주사하였고 우안은 대조군으로 하여 동량의 PBS를 유리체내에 주사하였다. 조직학적으로 망막의 두께변화 관찰을 위해 NMDA를 주입 후 7일째 안구를 적출하였다. 적출한 안구는 안구부피의 10배가 되는 10% 포르말린에 넣어 상온에서 하루 동안 고정시켰다. 망막 절편을 만든 후, 슬라이드 위의 조직을 아세트산을 이용하여 고정하고, 헤마톡실린으로 핵을 염색한 후 에오신으로 세포질을 염색하였다. 광학 현미경을 사용하여 100배로 망막의 두께변화를 관찰하였다.
또한 TUNEL에 반응하는 지를 측정하기 위하여, 24시간 후에 각각 안구적출을 시행하였다. 안구 적출 후 안구의 약 2/3 되는 부위에서 절개 후 수정체와 유리체를 제거하고 망막을 분리하였다. 분리한 망막조직은 절편을 만들어 4% 파라포름알데하이드(pH 7.4)에 20분동안 고정한 후 PBS로 세척했다. In situ cell death detection kit인 POD(Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 세포내 뉴클레오솜간에 나뉘어진 DNA(internucleosomally cleaved DNA)의 노출된 3'-OH 기에 결합하여 표지되는 TdTmediated dUTP nick end labeling(TUNEL)로 염색하여 직접적으로 세포 자살이 일어나는 세포의 발현 위치와 정도를 관찰하였다.
그 결과, 망막퇴화를 NMDA로 유도하였을 때 망막의 신경절 세포층(Ganglion Cell Layer, GL)과 속핵층 (Inner Nuclear Layer, INL)이 얇아짐을 확인하였으며, 벌개미취 추출물을 전처리한 경우 망막 층의 얇아짐이 억제되는 것을 확인하였다 (도 6). 또한 세포 자살에 의한 세포 사멸을 확인하기 위해 NMDA로 유도하였을 때, TUNEL에 양성으로 반응하는 세포가 늘어났으나, 벌개미취 추출물을 전처리한 경우 TUNEL 양성세포가 유의적으로 감소한 바, 세포 자살에 의한 세포 사멸을 억제함을 확인하였다(도 7).
결국, 이와 같은 동물실험을 바탕으로, 벌개미취 추출물은 망막 보호 효과가 있음을 확인하였다.
하기에 본 발명의 망막질환 예방 및 치료제 또는 개선제를 위한 제제예를 예시한다.
제제예 1: 약학적 제제의 제조
1-1. 산제의 제조
벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
1-2. 정제의 제조
벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
1-3. 캡슐제의 제조
벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
1-4. 주사제의 제조
벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 100 ㎎
만니톨 180 ㎎
Na2HPO4ㆍ2H2O 26 ㎎
증류수 2974 ㎎
통상적인 주사제의 제조방법에 따라, 상기 성분들을 제시된 함량으로 함유시켜 주사제를 제조하였다.
제제예 2: 건강기능 식품의 제조
2-1. 음료의 제조
꿀 522 ㎎
치옥토산아미 5 ㎎
니코틴산아미드 10 ㎎
염산리보플라빈나트륨 3 ㎎
염산피리독신 2 ㎎
이노시톨 30 ㎎
오르트산 50 ㎎
벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 0.48 ~ 1.28 ㎎
물 200 ㎖
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.
2-2. 츄잉껌의 제조
껌베이스 20 중량%
설탕 76.36 ~ 76.76 중량%
벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 0.24 ~ 0.64 중량%
후르츠향 1 중량%
물 2 중량%
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.
2-3. 캔디의 제조
설탕 50 ~ 60 중량%
물엿 39.26 ~ 49.66 중량%
벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 0.24 ~ 0.64 중량%
오렌지향 0.1 중량%
상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.
2-4. 밀가루 식품의 제조
본 발명에 따른 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 0.5 내지 5 중량부를 밀가루 100 중량부에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
2-5. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명에 따른 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 5 내지 10 중량부를 우유 100 중량부에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
2-6. 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입고 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검은콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
상기에서 제조한 곡물류 및 종실류와 본 발명에 따른 벌개미취 추출물 또는 이의 분획물을 다음과 같은 비율로 배합하여 제조하였다.
현미 30 중량%
율무 15 중량%
보리 20 중량%
들깨 7 중량%
검정콩 7 중량%
검은깨 7 중량%
벌개미취 추출물 또는 이의 분획물 3 중량%
영지 0.5 중량%
지황 0.5 중량%

Claims (14)

  1. 벌개미취(Gymnaster koraiensis)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 시신경의 손상을 원인으로 하는 망막 내 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 질환은 연령 관련 황반 변성 또는 녹내장인 것을 특징으로 하는 망막 내 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 추출물은 벌개미취를 물, C1 ~ C4의 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 망막 내 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기의 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 망막 내 신경질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 벌개미취(Gymnaster koraiensis)의 추출물을 유효성분으로 함유하는 시신경의 손상을 원인으로 하는 망막 내 신경질환의 예방 및 개선용 건강식품.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 질환은 연령 관련 황반 변성 또는 녹내장인 것을 특징으로 하는 망막 내 신경질환의 예방 및 개선용 건강식품.
  10. 삭제
  11. 제 8 항에 있어서, 상기 추출물은 벌개미취를 물, C1 ~ C4의 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 망막 내 신경질환의 예방 및 개선용 건강식품.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기의 알코올은 메탄올 또는 에탄올인 것을 특징으로 하는 망막 내 신경질환의 예방 및 개선용 건강식품.
  13. 삭제
  14. 삭제
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