KR20080080093A

KR20080080093A - Ｐｆ４와 ｒａｎｔｅｓ 간의 상호작용에 대한 길항제

Info

Publication number: KR20080080093A
Application number: KR1020087011438A
Authority: KR
Inventors: 크리스챤 웨버; 필립 폰 헌델샤유젠; 로리 쾬넨
Original assignee: 알더블유티에이치 아헨
Priority date: 2005-10-14
Filing date: 2006-10-11
Publication date: 2008-09-02
Also published as: HK1127069A1; ES2546094T3; JP5385611B2; EP2363412A1; DE102005049637A1; CN101356190B; NO20082127L; IL190820A0; EA013508B1; CA2648649A1; CN102911260A; EA200801077A1; US8501680B2; AU2006301494A1; US20080287652A1; AU2006301494B2; WO2007042263A1; CN101356190A; EP2363412B1; KR101477767B1

Abstract

본 발명은 식 (1)에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드, 약제 제조용의 그의 용도 및 단핵세포 보충과 관련된 질환의 치료용 약제에 관한 것이다.

Description

ＰＦ４와 ＲＡＮＴＥＳ 간의 상호작용에 대한 길항제{ANTAGONISTS AGAINST INTERACTION OF PF4 AND RANTES}

본 발명은 폴리펩타이드, 그들의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트, 약제학적 약물의 제조용의 그들의 용도 및 상기 약제학적 약물에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드는 단핵세포(또는 단핵구)의 보충(recruitment)과 관련된 질환의 치료에 적합하다.

동맥 혈관의 동맥경화증은 심혈관 질환의 형태학적 배경을 형성한다. 단핵세포의 초기 보충은 여기서 초기의 동맥경화성 병변의 발생을 위해 결정적으로 중요하다. 내피에 대한 단핵세포의 유착, 소위 단핵세포 정지(monocyte arrest)는 예컨대 동맥경화증, 협착증 및 혈전증 등의 심혈관 질환의 발단을 의미한다. RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted) 등의 케모카인이 신호 분자로서 이들 프로세스와 연관되는 것은 공지되어 있다.

당해 기술에 있어서 공지된 1차적 및 2차적 예방은 주로 아스피린 또는 클로피도그렐 등의 약물에 의해 혈소판 응집 및 활성화의 억제와 지질 저하 치료를 포함한다. 이들 약물에 의한 치료의 단점으로는 우선 이들이 단지 낮은 특이성을 가지는 점과, 두번째로 이들 약물이 예컨대 근육병증 및 출혈의 증가 위험 등의 심각한 부작용을 수반하는 점을 들 수 있다.

또한, RANTES 펩타이드 길항제의 이용은 당해 기술에 있어서 공지되어 있다. 예를 들어, 독일 특허 공개 제DE 100 14 516 A1호 공보에는 RANTES 수용체 CCR1에 대한 길항제로서의 metRANTES의 이용을 개시하고 있다. 이들 길항제의 이용시의 단점은 많은 생리적인 과정에 있어서 단일 분자로서 내포되므로, 예측할 수 없는 많은 생리적인 과정이 이러한 길항제의 사용에 의해 영향받고 다수의 부작용 및 후유증 등이 발생할 수 있다는 점이다.

따라서, 본 발명의 목적은 당해 기술의 단점들 중 적어도 하나를 극복할 수 있는 유용한 제제를 제조하는 데 있다. 특히, 본 발명의 목적은 향상된 특이성을 가지는 유용한 제제를 제조하는 데 있다.

이 목적은 이하의 식 (1)에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트에 의해 달성된다:

C-X₁-X₂-YFYTS-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-C (1) (서열번호 1)

식 중,

X₁은 리신, 글루타민, 아르기닌, 히스티딘 및/또는 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 아미노산 결손이고;

X₂는 글루탐산, 아스파르트산 및/또는 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 아미노산 결손이며;

X₃는 글라이신, 세린 및/또는 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₄는 리신, 류신 및/또는 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₅는 세린, 시스테인, 글라이신 및/또는 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₆는 세린, 글라이신 및/또는 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₇은 아스파라긴 및/또는 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₈은 프롤린, 티로신 및/또는 글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₉은 글라이신, 알라닌 및/또는 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₁₀은 아이소류신, 발린 및/또는 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₁₁은 발린, 아이소류신 및/또는 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₁₂는 페닐알라닌, 티로신, 아이소류신, 발린, 류신 및/또는 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₁₃은 아이소류신, 발린, 류신, 메티오닌 및/또는 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₁₄은 트레오닌, 글라이신, 알라닌, 세린 및/또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₁₅은 아르기닌, 리신, 글루타민, 히스티딘 및/또는 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 아미노산 결손이다.

본 발명의 폴리펩타이드는 유리하게는 RANTES와 혈소판 인자 4 간의 상호작용에 대한 길항제로서 적합하다.

"RANTES와 혈소판 인자 4 간의 상호작용에 대한 길항제"란 용어는, 본 발명의 의미에 있어서, 케모카인류인 RANTES와 혈소판 인자 4 간의 상호작용에 대한 길항제로서 기능할 수 있는 펩타이드, 단백질 또는 기타 화합물을 포함하는 것으로 이해된다.

놀랍게도, 본 발명의 폴리펩타이드는 케모카인류인 RANTES와 혈소판 인자 4(PF4: platelet factor 4) 간의 상호작용에 의해 매개되는 단핵세포의 보충에 특정 효과를 가질 수 있는 것으로 판명되었다. 여기서 특유의 이점은 본 발명의 폴리펩타이드가 케모카인의 다수의 기능에 대해 영향이 적거나 없다는 점이다. 특히, 단핵세포의 보충의 선택적인 차단은 특히 내피에 대해 효과를 가질 수 있는 점에서 유리하다.

"단핵세포의 보충"이란 용어는, 본 발명의 의미에 있어서, 예컨대, 내피 갭에서 단핵세포의 내피 속으로, 내피를 통한 그리고 내피로부터의 이동, 그들의 유착 및 전파를 의미한다. 단핵세포의 유착은 또한 해당 유착이 생리학적 조건하에, 예컨대, 모세혈관, 미세혈관 또는 동맥 순환에서처럼 전단 흐름에 있어서 일어날 경우 단핵세포 유착 및/또는 단핵세포 정지라고도 칭해진다.

본 발명의 폴리펩타이드가 높은 특이성을 제공할 수 있고 또한 케모카인류 RANTES 및 PF4, 예컨대, 면역계 또는 응고계에 의해 매개된 다수의 대사 과정에 대한 부작용이 적거나 없다는 점에서 매우 유리하다. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드를 투여함으로써, 심혈관 질환에서의 전통적인 약물 치료와 함께 출혈 위험이 예방될 수 있다.

본 명세서에서, 아미노산의 통상의 1문자 코드를 이용함에 있어서, "C"는 시스테인을 의미하고, 따라서, "Y"는 티로신을, "F"는 페닐알라닌을, "T"는 트레오닌을, "S"는 세린을 의미한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 하나의 시스테인 라디칼이 아미노-말단 단부 상에 있고 다른 하나의 시스테인은 카복시-말단 단부에 있으며, 따라서, 이것은 폴리펩타이드의 가능한 고리화를 행할 수 있다. 고리화된 폴리펩타이드는 향상된 안정성을 가지는 것이 특히 유리하다. 본 발명의 폴리펩타이드는 보다 긴 지속 효과를 가질 수 있고, 따라서, 소량을 사용할 수 있다.

본 발명의 의미에 있어서 "폴리펩타이드"란 용어는 천연 단백질의 정제 및 변성 단편, 천연 형태 혹은 재조합 펩타이드 또는 단백질뿐만 아니라 합성 또는 비합성 펩타이드 화합물을 의미하는 것을 알 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 의미에 있어서 "폴리펩타이드"란 용어는 대응하는 폴리펩타이드의 약학적으로 허용가능한 염, 약학적으로 허용가능한 유도체 및/또는 컨쥬게이트를 포함한다.

바람직한 약학적으로 허용가능한 유도체는 예를 들어 에스터류, 아마이드류, N-아실 및/또는 O-아실 유도체, 카복실화, 아세틸화, 인산화 및/또는 글리코실화 폴리펩타이드류를 포함한다. 바람직한 컨쥬게이트는 예를 들어 당 또는 폴리에틸렌 글라이콜 컨쥬게이트, 바이오티닐화된 방사능 혹은 형광표지화 폴리펩타이드를 포함한다.

폴리펩타이드는 바람직하게는 최대 25개의 아미노산의 길이를 가진다. 상기 폴리펩타이드의 아미노산의 개수는 바람직하게는 ≥15 내지 ≤25개의 아미노산 범위, 바람직하게는 ≥15 내지 ≤22개의 아미노산 범위를 가지는 것이 바람직하다. 본 발명의 연구의 일부로서 폴리펩타이드의 길이는 그의 효능에 영향을 가질 수 있음을 발견하였다. 특히, 이 길이의 아미노산 서열이 단핵세포 정지의 억제를 유발할 수 있는 것은 놀랍다.

바람직한 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드의 아미노산의 개수는 ≥18 내지 ≤23개의 아미노산 범위, 더욱 바람직하게는 ≥18 내지 ≤22개의 아미노산 범위를 가지고; 특히 바람직한 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드는 ≥19 내지 ≤22개의 아미노산 범위를 가지며, 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드는 ≥20 내지 ≤21개의 아미노산 범위를 가진다. 가장 바람직하게는, 폴리펩타이드는 22개의 아미노산을 가진다. 본 발명의 의미에 있어서 "아미노산의 개수"란 용어는 물론 폴리펩타이드의 아미노산 서열의 길이를 의미하는 것도 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드의 바람직한 실시형태에 있어서, X₁은 리신에 상당하거나 또는 아미노산 서열의 X₁ 위치에 결손이 있고, 특히 바람직하게는 X₁은 아미노산 리신에 상당한다. 또한, X₂는 폴리펩타이드의 바람직한 실시형태에 있어서 아미노산 글루탐산에 상당하거나 또는 아미노산 결손이다. X₂는 특히 바람직하게는 아미노산 글루탐산에 상당한다. X₁ 및/또는 X₂ 위치에서 결손을 가진 폴리펩타이드는 놀랍게도 길항 효과를 나타낼 수 있다. 또, X₁ 및 X₂가 아미노산 결손에 해당하는 것을 제공하는 것도 가능하다.

X₃는 바람직하게는 작은 천연의 유연성 아미노산에 상당한다. 폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, X₃는 글라이신 및/또는 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되고; X₃는 특히 바람직하게는 아미노산 글라이신에 상당한다. 이들 아미노산이 폴리펩타이드의 구조의 안정성에 긍정적인 영향을 가지는 것으로 판명되었다. 이러한 안정성의 증가는, 폴리펩타이드의 증가된 안정성에 의해 폴리펩타이드의 케모카인 PF4와의 상호작용을 연장시키는 것이 가능하기 때문에 특히 유리하다. 따라서, 펩타이드의 향상된 안정화는 폴리펩타이드의 길항 특성을 증대시킬 수 있다.

폴리펩타이드의 바람직한 실시형태에 있어서, X₄는 아미노산 리신에 상당한다.

X₅는 바람직하게는 세린, 글라이신 및/또는 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, X₅는 세린에 상당한다. 폴리펩타이드의 이 실시형태는 유리하게는 폴리펩타이드의 가용성의 향상을 가져올 수 있다. 폴리펩타이드의 가용성의 증가는 특히 수중 폴리펩타이드의 적용성을 증가시킬 수 있다. 이것은 통상의 수계 투여 방법에 있어서 폴리펩타이드의 투여의 간단화를 가능하게 한다. 또한, 체내의 수계, 특히 혈액에 있어서 폴리펩타이드의 향상된 분산성은 폴리펩타이드의 이 향상된 가용성을 통해 이용할 수 있게 된다.

X₆는 바람직하게는 아미노산 세린에 상당한다. 폴리펩타이드의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, X₇은 아미노산 아스파라긴에 상당한다.

X₈은 바람직하게는 프롤린 및/또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산에 상당한다. X₈은 특히 바람직하게는 아미노산 프롤린에 상당한다.

폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, X₉은 글라이신에 상당한다. 아미노산 서열에 있어서의 이 위치에서의 아미노산 글라이신이 놀랍게도 안정한 폴리펩타이드 화합물을 초래하는 것으로 판명되었다.

X₁₀ 및 X₁₃은 서로 독립적으로 바람직하게는 발린 및/또는 아이소류신으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 폴리펩타이드의 바람직한 실시형태에 있어서, X₁₀은 아이소류신에 상당한다. 폴리펩타이드의 추가의 바람직한 실시형태에 있어서, X₁₃은 아이소류신에 상당한다. 폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, X₁₀ 및 X₁₃은 아이소류신에 상당한다. 폴리펩타이드의 X₁₀ 및 X₁₃ 위치에서의 아이소류신은 폴리펩타이드의 입체 형태의 증가된 안정성을 향하여 기여할 수 있는 것으로 판명되었다.

X₁₁은 바람직하게는 아미노산 발린에 상당한다. X₁₂는 바람직하게는 페닐알라닌 및/또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 특히 바람직하게는 X₁₂는 아미노산 페닐알라닌에 상당한다. X₁₄은 바람직하게는 아미노산 트레오닌에 상당한다.

X₁₅는 바람직하게는 아르기닌에 상당하고; 또한, 아미노산 결손은 아미노산 서열의 X₁₅ 위치에 있어도 된다. 아미노산 결손은 바람직하게는 X₁, X₂ 및/또는 X₁₅을 포함한다. 아미노산 X₁, X₂ 또는 X₁₅ 중의 하나는 바람직하게는 결손되어 있을 수 있지만, X₁ 및 X₂ 위치에 아미노산 결손이 있는 것도 가능하다. 다른 실시형태에 있어서, 결손은 X₁, X₂ 및 X₁₅ 위치에 있을 수 있다. 폴리펩타이드의 바람직한 실시형태에 있어서, 아미노산 X₃ 내지 X₁₄의 영역에는 어떠한 결손도 없다.

폴리펩타이드의 바람직한 실시형태에 있어서, X₅는 아미노산 세린에 상당하고, X₉은 글라이신에 상당하며, X₁₀은 류신에 상당하고/하거나, X₁₃은 아이소류신에 상당한다. 폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, X₅는 아미노산 세린에 상당하고, X₉은 글라이신에 상당하며, X₁₀은 아이소류신에 상당하고, X₁₃은 아이소류신에 상당한다. X₅가 아미노산 세린에 상당하고, X₉이 글라이신에 상당하며, X₁₀이 아이소류신에 상당하고, X₁₃이 아이소류신에 상당하는 폴리펩타이드는 특히 양호한 길항 잠재력(potential)을 가지는 것으로 판명되었다.

폴리펩타이드의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, X₅는 아미노산 세린에 상당하고, X₉은 글라이신에 상당하며, X₁₀은 아이소류신에 상당하고, X₁₃은 아이소류신에 상당하며, X₁은 아미노산 결손에 상당하고/하거나 X₁₅은 아미노산 결손에 상당한다. 폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, X₅는 아미노산 세린에 상당하고, X₉은 글라이신에 상당하며, X₁₀은 아이소류신에 상당하고, X₁₃은 아이소류신에 상당하며, X₁은 아미노산 결손에 상당하고, X₁₅은 아미노산 결손에 상당한다. 이 폴리펩타이드는 또한 특히 양호한 길항 잠재력을 가질 수 있다.

폴리펩타이드의 더욱 바람직한 실시형태에 있어서, X₅는 아미노산 세린에 상당하고, X₈은 티로신에 상당하며, X₉은 글라이신에 상당하고, X₁₀은 아이소류신에 상당하며, X₁₃은 아이소류신에 상당하고, X₁은 아미노산 결손에 상당하고/하거나, X₁₅은 아미노산 결손에 상당한다. 폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, X₅는 아미노산 세린에 상당하고, X₈은 티로신에 상당하며, X₉은 글라이신에 상당하고, X₁₀은 아이소류신에 상당하며, X₁₃은 아이소류신에 상당하고, X₁은 아미노산 결손에 상당하며, X₁₅은 아미노산 결손에 상당한다.

폴리펩타이드의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, X₃는 아미노산 세린에 상당하고, X₅는 세린에 상당하며, X₈은 티로신에 상당하고, X₉은 글라이신에 상당하며, X₁₀은 아이소류신에 상당하고, X₁₃은 아이소류신에 상당하며, X₁은 아미노산 결손에 상당하고/하거나, X₁₅은 아미노산 결손에 상당한다. 폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, X₃는 아미노산 세린에 상당하고, X₅는 세린에 상당하며, X₈은 티로신에 상당하고, X₉은 글라이신에 상당하며, X₁₀은 아이소류신에 상당하고, X₁₃은 아이소류신에 상당하며, X₁은 아미노산 결손에 상당하고/하거나, X₁₅은 아미노산 결손에 상당한다.

폴리펩타이드의 또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, X₃은 아미노산 세린에 상당하고, X₅은 세린에 상당하며, X₈은 프롤린에 상당하고, X₉은 글라이신에 상당하며, X₁₀은 아이소류신에 상당하고, X₁₃은 아이소류신에 상당하며, X₁은 아미노산 결손에 상당하고, X₂는 아미노산 결손에 상당하고/하거나, X₁₅에 아미노산 결손에 상당한다. 폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, X₃은 아미노산 세린에 상당하고, X₅는 세린에 상당하며, X₈은 프롤린에 상당하고, X₉은 글라이신에 상당하며, X₁₀은 아이소류신에 상당하고, X₁₃은 아이소류신에 상당하며, X₁은 아미노산 결손에 상당하고, X₂는 아미노산 결손에 상당하며, X₁₅은 아미노산 결손에 상당한다.

폴리펩타이드의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, X₃는 아미노산 세린에 상당하고, X₅는 세린에 상당하며, X₈은 티로신에 상당하고, X₉은 글라이신에 상당하며, X₁₀은 아이소류신에 상당하고, X₁₂는 티로신에 상당하며, X₁₃은 아이소류신에 상당하고, X₁은 아미노산 결손에 상당하고, X₂는 아미노산 결손에 상당하고/하거나, X₁₅은 아미노산 결손에 상당한다. 폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태에 있어서, X₃는 아미노산 세린에 상당하고, X₅는 세린에 상당하며, X₈은 티로신에 상당하고, X₉은 글라이신에 상당하며, X₁₀은 아이소류신에 상당하고, X₁₂는 티로신에 상당하며, X₁₃은 아이소류신에 상당하고, X₁은 아미노산 결손에 상당하며, X₂는 아미노산 결손에 상당하고, X₁₅은 아미노산 결손에 상당한다.

폴리펩타이드의 추가의 바람직한 실시형태에 있어서, 폴리펩타이드는 하기 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 것이 가능하고/하거나, 식 (2)에 따른 서열번호 2의 상기 폴리펩타이드는 상기 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해서 적어도 1개 이상의 아미노산 결손, 아미노산 치환 및/또는 아미노산 삽입을 가질 수 있다:

CKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRC (2) (서열번호 2).

아미노산 치환은 바람직하게는 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열의 제9 내지 제12번째 아미노산의 서열 범위, 해당 아미노산 서열의 9번 위치의 글라이신 내지 20번 위치의 트레오닌의 아미노산 범위에 관한 것이다. 바람직하게는, 1개 이상의 아미노산은 세린, 티로신, 아이소류신 및/또는 글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로 치환된 글라이신, 시스테인, 프롤린, 발린, 페닐알라닌 및/또는 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이들 아미노산 치환의 하나의 이점은 이들이 폴리펩타이드에서 안정성을 증강시킬 수 있고/있거나 폴리펩타이드의 길항 효과를 향상시킬 수 있는 점이다.

이들 아미노산 치환은 바람직하게는 글라이신의 세린으로의 치환, 비말단의 시스테인의 세린으로의 치환, 프롤린의 티로신으로의 치환, 발린의 아이소류신으로의 치환, 페닐알라닌의 티로신으로의 치환 및/또는 알라닌의 글라이신으로의 치환으로부터 선택된다. 이들 아미노산 치환은 임의의 소정의 방법으로 서로 배합될 수도 있다.

특히 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열의 11번 위치에서의 적어도 비말단 시스테인이 세린으로 치환되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 치환은 유리하게는 펩타이드의 가용성, 특히 그의 수중 가용성의 향상을 가져올 수 있다.

식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드의 실시형태에 있어서, 아미노산 치환은 바람직하게는 글라이신의 세린으로의 치환, 시스테인의 세린으로의 치환 및/또는 프롤린의 티로신으로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 이것은 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열의 9번째 내지 14번째 서열, 즉, 글라이신에서 프롤린까지의 서열 범위를 포함하는 것이 특히 바람직하다. 이 범위는 바람직하게는 이들 치환의 적어도 하나를 가지며; 바람직하게는 적어도 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열의 11번 위치의 시스테인이 세린으로 치환되어 있다. 추가의 바람직한 실시형태에 있어서, 프롤린이 또한 티로신으로 치환되고/되거나, 글라이신이 세린으로 치환되어 있다. 아미노산 서열의 11번 위치에서의 시스테인의 치환은 임의의 다른 치환, 특히 프롤린의 티로신으로의 치환 및/또는 글라이신의 세린으로의 치환과 병용될 수 있다.

이들 실시형태에 있어서, 아미노산 치환은 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열의 폴리펩타이드의 15번째 내지 20번째 아미노산, 즉, 알라닌 내지 트레오닌의 범위를 포함하는 것도 바람직하다. 이 범위의 아미노산의 바람직한 아미노산 치환체는 알라닌의 글라이신으로의 치환, 발린의 아이소류신으로의 치환 및/또는 페닐알라닌의 티로신으로의 치환으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 알라닌이 글라이신으로 치환되는 것이 특히 바람직하다. 또, 적어도 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열의 16번 위치의 발린이 아이소류신으로 치환되는 것이 바람직하고; 바람직하게는 적어도 2개의 발린이 아이소류신으로 치환되고; 16번 및 19번 위치의 발린이 바람직하게는 아이소류신으로 치환된다. 식 (2)에 따른 서열번호　2의 아미노산 서열의 각 발린이 아이소류신으로 치환되는 것도 바람직할 수 있다. 폴리펩타이드의 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 페닐알라닌은 티로신으로 치환될 수 있다.

또, 이들 실시형태에 있어서, 식 (2)에 따른 서열번호　2의 서열의 15번 위치에서의 알라닌이 글라이신으로 치환되고, 16번 위치의 발린이 아이소류신으로 치환되고, 19번 위치의 발린이 아이소류신으로 치환되는 것도 바람직하다. 이들 치환은 놀랍게도 안정한 폴리펩타이드 화합물로 되는 것으로 판명되었다.

상기 치환들 및/또는 아미노산 결손은 임의의 바람직한 방식으로 병용될 수 있고, 특히 상기 치환들은 임의의 방식으로 서로 병용될 수 있다.

또한, 폴리펩타이드는 이들 실시형태에 있어서 아미노산의 결손을 가질 수 있다. 바람직한 아미노산 결손은 아미노산인 리신, 글루타민 및/또는 아르기닌의 결손을 포함한다. 이들 결손은 바람직하게는 식 (2)에 따른 서열번호　2의 서열의 2번 위치의 아미노산 리신, 3번 위치의 아미노산 글루타민 및/또는 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열의 21번 위치에 아미노산 아르기닌을 포함한다. 이들 결손은 임의의 방식으로 병용될 수 있다. 하나의 아미노산이 바람직하게는 결손되지만, 2번 위치의 리신뿐만 아니라 21번 위치의 아르기닌도 결손되는 것이 가능하다. 추가의 실시형태에 있어서, 2번 위치의 리신, 3번 위치의 글루타민 및 21번 위치의 아르기닌이 결손될 수도 있다.

바람직하게는 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열의 4번째 내지 20번째 아미노산의 영역에는 어떠한 결손도 위치되어 있지 않다. 특히 바람직한 실시형태에 있어서, 4번째 내지 8번째 아미노산의 영역의 아미노산은 아미노산 결손 또는 아미노산 치환에 의해 영향받지 않는다. 이들 연구의 일부로서, 식 (2)에 따른 서열번호 2의 서열의 9번째 내지 20번째 아미노산의 영역에 적어도 2개의 아미노산 치환, 바람직하게는 이 영역에 3개의 아미노산 치환, 더욱 바람직하게는 4개의 아미노산 치환, 더욱더 바람직하게는 5개의 아미노산 치환을 가진 아미노산 서열이 양호한 길항 특성을 가지는 것으로 판명되었다.

본 실시형태의 폴리펩타이드의 아미노산의 개수는 바람직하게는 ≥15 내지 ≤25개의 아미노산 범위, ≥18 내지 ≤23개의 아미노산 범위, 특히 바람직하게는 ≥19 내지 ≤22개의 아미노산 범위, 더욱 바람직하게는 ≥20 내지 ≤21개의 아미노산 범위, 가장 바람직하게는 22개의 아미노산이다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트의 특히 바람직한 실시형태는 하기 식 (3)에 따른 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진다:

CKEYFYTSGKSSNPGIVFITRC (3) (서열번호 3).

이들 연구의 일부로서, 식 (3)으로 표시되는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드는 특히 높은 길항 잠재력을 가지는 것으로 판명되었다. 상기 폴리펩타이드는 특히 양호한 길항 효과를 가질 수 있는 것으로 판명되었다. 특히, 식 (3)으로 표시되는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드는 RANTES와 PF4의 상호작용을 유의하게 또한 재현가능하게 억제할 수 있고, 이것은 단핵세포 정지의 상승작용을 유발하는 것으로 판명되었다.

식 (3)으로 표시되는 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드는 RANTES와 PF4의 상호작용에 대해서 특이적으로 작용할 수 있는 점은 특히 유리하다. 나아가서는, 케모카인의 작용기에 의한 간섭은 따라서 저감되거나 더욱 방지될 수 있다. 이것에 의해 단핵세포의 보충 또는 예컨대 호산구 등의 기타 백혈구 모집단의 RANTES-의존 보충과 관련된 질환, 특히 심혈관 질환의 치료에 있어서 폴리펩타이드의 사용을 목표로 할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트의 다른 바람직한 실시형태는 하기 식 (4)에 따른 서열번호 4의 아미노산 서열을 가진다:

CEYFYTSGKSSNPGIVFITC (4) (서열번호 4).

본 발명의 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트의 다른 바람직한 실시형태는 하기 식 (5)에 따른 서열번호 5의 아미노산 서열을 가진다:

CEYFYTSGKSSNYGIVFITC (5) (서열번호 5).

본 발명의 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트의 또 다른 바람직한 실시형태는 하기 식 (6)에 따른 서열번호 6의 아미노산 서열을 가진다:

CEYFYTSSKSSNYGIVFITC (6) (서열번호 6).

본 발명의 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트의 더욱 바람직한 실시형태는 하기 식 (7)에 따른 서열번호 6의 아미노산 서열을 가진다:

CYFYTSSKSSNPGIVFITC (7) (서열번호 7).

바람직한 실시형태에서의 이 폴리펩타이드의 하나의 이점은 이들 폴리펩타이드가 바람직하게는 향상된 안정성을 가진다는 사실로 구성된다. 이것에 의해 폴리펩타이드가 그들의 작용 부위에 보다 큰 정도로 도달하고 또한 단백질 또는 펩타이드 화합물과의 안정한 상호 작용에 진입하는 것이 가능해진다. 특히, 폴리펩타이드의 증가된 안정성으로 인해 생체내 및 시험관내에서 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서의 폴리펩타이드의 다른 이점은 폴리펩타이드가 수중에서 향상된 가용성을 가진다는 사실에 있다. 증가된 가용성은 특히 폴리펩타이드를 보다 용이하고 간단하게 투여할 수 있게 한다.

또, 각각의 L-아미노산은 D-아미노산으로 치환되는 것도 가능하다. 이것에 의해 안정성의 더한층의 증가를 실현할 수 있다.

폴리펩타이드는 펩타이드 합성의 통상의 방법에 의해 생성될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 유리하게는 RANTES와 혈소판 인자 4 간의 상호작용에 대한 길항제로서 적합하다. 특히, 본 발명의 폴리펩타이드는 RANTES와 혈소판 인자 4 간의 상호작용의 억제를 유발할 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드, 그들의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트는 RANTES와 혈소판 인자 4 간의 상호작용에 대한 길항제로서 이용될 수 있다.

그들의 유리한 특성으로 인해, 본 발명의 폴리펩타이드는 약제학적 약물로서 사용하기에 적합하다.

본 발명의 다른 주제는 본 발명의 폴리펩타이드의 용도에 관한 것이고, 특히 바람직한 실시형태는 약제학적 약물의 제조에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩타이드는 통상의 방법, 그러나, 경구 투여, 예컨대 경구 복용[원문 그대로], 진피 투여, 피하 투여 및/또는 정맥내 투여에 따라 투여될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩타이드는 생체밖 투여, 예컨대, 혈관 내삽의 이식 전 또는 혈관내 투여에 의해, 예컨대, 카테터 개재 혹은 스텐트 이식의 전후에 투여될 수 있다. 폴리펩타이드의 수중 양호한 가용성은 이러한 적용을 위해 크게 유리하다.

급성 치료 또는 제한된 시간 주기 동안의 치료에 부가해서, 본 발명의 폴리펩타이드는 장기간에 걸쳐 투여되는 것도 바람직할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 데포 주사 혹은 삼투압 펌프의 형태로 서방성 혹은 지연된 방출의 형태로 투여될 수도 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 각각의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 형태로 투여될 수도 있다. 여기서 핵산 분자는 통상의 벡터로 존재할 수 있다. 각각의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열이 바람직하게는 투여된다. 또, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA가 투여되는 것도 가능하다.

본 발명의 또 다른 주제는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산, 바람직하게는 식 (1)에 따른 서열번호 1, 식 (2)에 따른 서열번호　2, 식 (3)에 따른 서열번호 3, 식 (4)에 따른 서열번호 4, 식 (5)에 따른 서열번호 5, 식 (6)에 따른 서열번호 6, 식 (7)에 따른 서열번호 7의 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산이다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는 핵산은 바람직하게는 DNA 또는 RNA이다. 당업자는 상기 식들, 즉, 상기 부여된 서열에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열과 친숙하다.

식 (3)에 따른 서열번호 3의 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 일례는 이하의 식 (8)에 따른 서열번호 8의 DNA 서열을 가진다:

5'-TGCAAGGAATATTTCTACACTTCCGGGAAATCCTCCAATCCTGGAATTGTGTTCATCACTAGATGT-3' (8) (서열번호 8).

당업자는 식 (3)에 따른 서열번호 3의 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 다른 서열과 친숙하다. 또한, 예컨대 유전자 암호의 변성으로 인해 상기 핵산의 서열을 변화시킬 수 있는 것이 공지되어 있다.

식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 일례는 이하의 식 (9)에 따른 서열번호 9의 DNA 서열을 가진다:

5'-TGCAAGGAATATTTCTACACTTCCGGGAAATGTTCCAATCCTGCCGTGGTGTTCGTCACTAGATGT-3' (9) (서열번호 9).

식 (4)에 따른 서열번호 4의 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 일례는 이하의 식 (10)에 따른 서열번호 10의 DNA 서열을 가진다:

5'-TGCGAATATTTCTACACTTCCGGGAAATCCTCCAATCCTGGAATTGTGTTCATCACTTGT-3' (10) (서열번호 10).

식 (5)에 따른 서열번호 5의 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 일례는 이하의 식 (11)에 따른 서열번호 11의 DNA 서열을 가진다:

5'-TGCGAATATTTCTACACTTCCGGGAAATCCTCCAATTACGGAATTGTGTTCATCACTTGT-3' (11) (서열번호 11).

식 (6)에 따른 서열번호 6의 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 일례는 이하의 식 (12)에 따른 서열번호 12의 DNA 서열을 가진다:

5'-TGCGAATATTTCTACACTTCCTCTAAATCCTCCAATTACGGAATTGTGTTCATCACTTGT-3' (12) (서열번호 12).

식 (7)에 따른 서열번호 7의 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 일례는 이하의 식 (13)에 따른 서열번호 13의 DNA 서열을 가진다:

5'-TGCTATTTCTACACTTCCTCTAAATCCTCCAATCCTGGAATTGTGTTCAT CACTTGT-3' (13) (서열번호 13).

당업자는 식 (1)에 따른 서열번호 1, 식 (2)에 따른 서열번호 2, 식 (3)에 따른 서열번호 3, 식 (4)에 따른 서열번호 4, 식 (5)에 따른 서열번호 5, 식 (6)에 따른 서열번호 6 및 식 (7)에 따른 서열번호 7의 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 기타 DNA 서열과 친숙하다. 마찬가지로, 당업자는 식 (1)에 따른 서열번호 1, 식 (2)에 따른 서열번호 2, 식 (3)에 따른 서열번호 3, 식 (4)에 따른 서열번호 4, 식 (5)에 따른 서열번호 5, 식 (6)에 따른 서열번호 6 및 식 (7)에 따른 서열번호 7의 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 암호화하는 RNA 서열과 친숙하다.

인간에게 투여하기 위한 본 발명의 폴리펩타이드의 바람직한 용량은 ≥10㎎(1일)/75㎏(체중) 내지 ≤1000㎎(1일)/75㎏(체중)의 범위, 바람직하게는 ≥50㎎(1일)/75㎏(체중) 내지 ≤200㎎(1일)/75㎏(체중)의 범위, 바람직하게는 150㎎(1일)/75㎏(체중)의 범위이다.

본 발명의 폴리펩타이드, 그들의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트 및/또는 핵산은 단핵세포의 보충과 관련된 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치, 진단 및/또는 치료에 특히 이용될 수 있다. 이들 질환으로는 예를 들어 심혈관 및/또는 염증성 질환, 특히 동맥경화증, 협착증, 고혈압 및/또는 이식 거부 반응을 들 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 핵산은 포유동물, 특히 인간의 치료에 특히 적합하다.

본 발명의 폴리펩타이드는 단핵세포의 내피에의 유착에 대한 긍정적인 영향을 가질 수 있다. 특히, 놀랍게도 본 발명의 폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태는 RANTES와 PF4의 이호성(heterophilic) 상호작용에 의해 매개된 이러한 단핵세포 정지의 상승작용을 억제할 수 있는 것으로 판명되었다. 본 발명의 폴리펩타이드의 특히 바람직한 실시형태는 이미 공지된 단백질 또는 펩타이드 화합물에 의해 달성될 수 있었떤 것에 비해서 실험상 RANTES와 PF4의 이호성 상호작용에 의해 매개된 단핵세포 정지의 상승작용의 향상된 억제를 유리하게 얻을 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드의 특별한 이점은, 예컨대, 풍선 확장술, 죽종절제술(atherectomy) 또는 우회로 조성술 후의 수술후 또는 중재후 재협착증 또는 동맥경화증이 이들 폴리펩타이드의 투여에 의해 감소 혹은 예방될 수 있다는 사실에 의해 달성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드가 진행성 및/또는 임상 질환 및/또는 형태학적 동맥경화성 변화에서도 활성화된 내피에 대한 추가의 단핵세포의 보충을 예방 또는 저감할 수 있는 것은 특히 유리하다.

본 발명의 폴리펩타이드는 예컨대, 고혈압의 위험이 있는 환자에서의 예방적 치료에 특히 이용될 수 있다는 점이 특히 유리하다. 이러한 예방적 용도는 본 발명의 폴리펩타이드가 일반적인 케모카인-매개 프로세스에서 약간 영향을 미치거나 혹은 전혀 영향을 미치지 않는다는 사실에 의해 특히 유리하게 가능해진다.

본 발명의 다른 목적은

- 심혈관 및/또는 염증성 질환, 특히 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 불안정한 경화반(unstable plaque), 협착증, 재협착증, 고혈압, 관절염, 심근염, 뇌척수염을 비롯한 자가면역질환, 염증성 장질환, 경색 후의 재관류 손상, 예를 들어 심근 경색 혹은 뇌 경색, 이식 거부 및/또는 건선 등의 피부 질환과 같은 단핵세포의 보충과 관련된 질환; 및/또는

- 호산구증가증, 특히 천식과 같은 알레르기 질환 또는 폐렴과 같은 기타 백혈구 모집단의 RANTES-의존 보충과 관련된 질환

으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 약제학적 약물의 제조용의 본 발명의 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트의 용도에 관한 것이다.

특히 인간의 죽상경화성 변화의 치료에 있어서, 질환의 과정에 대한 유리한 효과는 본 발명의 폴리펩타이드를 이용함으로써 달성될 수 있다. 특히, 단핵세포 정지로 인한 동맥경화성 변화의 상승작용이 감소될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 다른 이점은 기관 및/또는 조직의 이식 후의 이들 거부 반응이 감소 혹은 심지어 예방될 수 있다는 사실로부터 얻어질 수 있다.

여기서 본 발명의 폴리펩타이드는 바람직하게는 부작용을 약간 일으키거나 혹은 전혀 일으키지 않는 것이 특히 유리하다. 이것에 의해 본 발명의 폴리펩타이드는 예방적으로 투여되는 것이 가능해진다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 특이성으로 인해, 다른 대사 과정에 대한 영향을 피할 수 있어, 예컨대, 고혈압의 위험이 있는 환자에 있어서 또는 동맥경화성 변화의 예방에 있어서 예방적 투여가 가능한 점이 특히 유리하다.

본 발명의 또 다른 주제는 본 발명의 폴리펩타이드, 바람직하게는 식 (1)에 따른 서열번호　1의 서열의 폴리펩타이드, 그들의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 약물에 관한 것이다. 식 (3)에 따른 서열번호 3, 식 (4)에 따른 서열번호 4, 식 (5)에 따른 서열번호 5, 식 (6)에 따른 서열번호 6 및/또는 식 (7)에 따른 서열번호　7의 아미노산 서열의 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 약물이 바람직하다. 식 (3)에 따른 서열번호 3의 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 약물이 특히 바람직하다. 약제학적 약물은 바람직하게는 전술한 식들 또는 서열번호들 중 하나에 따른 폴리펩타이드를 함유하고, 이 약제학적 약물은 수개의 식 또는 서열번호에 따른 폴리펩타이드를 포함하는 것도 가능하다.

본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 약물은 특히 예를 들어 인간에서의 생체내 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 약물의 바람직한 용도는 심혈관 또는 염증성 질환, 특히 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 불안정한 경화반, 협착증, 재협착증, 고혈압, 관절염, 심근염, 뇌척수염을 비롯한 자가면역질환, 염증성 장질환, 경색 후의 재관류 손상, 예컨대 심근경색증 또는 뇌경색, 이식 거부 및/또는 건선 등의 피부 질환과 같은 단핵 세포의 보충과 관련된 질환 및/또는 호산구 증가증, 특히 폐렴 또는 천식 등의 알레르기 질환과 같은 다른 백혈구 모집단의 RANTES-의존 보충과 관련된 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 것이다.

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 약제학적 약물도 본 발명의 주제이다. 핵산 분자는 통상의 벡터로 존재할 수 있다.

본 발명의 다른 주제는 본 발명의 폴리펩타이드, 그들의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트, 바람직하게는 식 (3)에 따른 서열번호 3의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드를 포함하는 단핵세포 정지를 방지하기 위한 제제에 관한 것이다.

본 발명의 의미에 있어서 "단핵세포 정지를 방지하기 위한 제제"란 용어는 제제가 단핵세포 정지와 관련된 질환, 예컨대 단핵세포의 내피에의 유착에 긍정적인 영향을 가질 수 있는 것을 의미한다. 특히, 동맥경화성 플라크의 발달이 감소 또는 심지어 예방될 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드의 용도는 바람직하게는 단핵세포의 보충 및/또는 그들의 활성화된 내피, 특히 동맥경화성 플라크 및/또는 신생혈관내막에의 유착의 감소 및/또는 완전한 혹은 거의 완전한 예방을 가져올 수 있다.

이하, 본 발명을 예시하는 실시예에 대해 설명한다.

재료 및 방법

세포 배양

인간 탯줄로부터의 내피세포(HUVEC(human umbilical vein endothelial cells), PromoCell, Heidelberg)는 내피세포 성장 배지(PromoCell, Heidelberg)에서 배양되었고, 2 내지 4 계대접종 후에 사용되었다.

단핵구성 모노 맥(Mono Mac) 6 세포(MM6, DSMZ)는 10% 소태아 혈청, 2 mM L-글루타민(Biowhittaker), 1　mM 피루브산 나트륨, 50 ㎍/㎖ 겐타마이신 및 9 ㎍/㎖ 인슐린(MM6 배지)을 첨가한 RPMI 1640 배지(PAA Laboratories, Pasching, Austria)에서 배양되었다. 상기 세포는 24-웰 플레이트에서 2 ㎖ MM6 배지 중 2×10⁵/㎖의 밀도로 표시되고, 실험에 사용하기 전에 3 내지 4일 동안 5% CO₂의 습윤 분위기 중 37℃에서 배양하였다.

폴리펩타이드

식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 폴리펩타이드, 식 (15)에 따른 서열번호 15의 서열에 따른 마우스 정형 유전자(ortholog) 및 식 (14)에 따른 서열번호 14의 서열의 대조군 펩타이드는 4-메틸벤즈하이드릴아민 수지를 이용해서 t-Boc-계 고상 펩타이드 합성에 의해서 화학적으로 합성하고 나서, 역상 HPLC에 의해 정제하고, 6M 구아니딘 HCl/Tris pH 8 중에서 임의로 고리화하였다. 분자량은 전기분무 질량 분광분석법에 의해 구하였다(Dawson, P. E., Kent, S. B. (2000), Annu. Rev. Biochem. 69:923-960; Hackeng, T.　M., Griffin, J. H., Dawson, P. E. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 96, pp.　10068-10073).

실시예 1

RANTES 와 PF4 의 이종응집체( heteroaggregate )의 형성에 관한 식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 폴리펩타이드의 저해 효과의 분석에 대한 플라스몬 공명 연구

플라스몬 공명 연구는 HBS-EP 완충액(10 mM HEPES, 150　mM　NaCl, 0.005% Tween 20, pH 7.4)을 이용해서 수행하였다.

C1 칩(Biacore AB, Uppsala, Sweden)의 두 유동 세포는 50　㎕ 에틸(다이메틸아미노프로필)카보다이이미드/N-하이드록시숙신이미드(0.2M/0.05M, Pierce)의 주입에 의해 활성화시키고, 이어서, 그 활성화된 표면상에 20　㎕ 스트렙트아비딘(0.2　㎎/㎖ Sigma-Aldrich)을 살포하였다. 그 후, 상기 표면은 20　㎕ 에틸렌다이아민(1M, pH 8, Sigma-Aldrich)의 4회의 연속 주입에 의해 불활성화시켰다.

N-말단에서의 바이오틴화된 인간 PF4(bPF4)는 t-Boc-계 고상 펩타이드 합성 및 PF4의 천연 화학적 결찰에 의해 화학적으로 합성하였다(Dawson, P. E., Kent, S. B. (2000), Annu. Rev. Biochem. 69:923-960, Hackeng, T. M., Griffin, J. H., Dawson, P.　E. (1999), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 96, pp. 10068-10073). bPF4는 유동실 중 하나를 통해 HBS-EP 속에 200　㎍/㎖ bPF4를 주입함으로써 C1 센서 칩의 덱스트란 표면상에 고정화시키고, 240 공명 유닛(RU: resonance unit)을 기록하였다. 두번째 유동실은 bPF4로 처리하지 않고 기준으로서 제공하였다.

실온에서 하룻밤 HBS-EP 완충액 중에서 식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 폴리펩타이드의 각종 농도(0　μM, 10　μM 및 100　μM)로 예비배양된 RANTES(0.5　μM, 재결합 인간 RANTES, Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) 또는 RANTES(0.5　μM)의 bPF4에 대한 결합은 각각의 펩타이드/RANTES 혼합물의 15 ㎕의 주입과 1801초 동안 그 결합의 관찰에 의해 결정되었다. 5　㎕/min의 유량에서 비아코아(Biacore) 2000 장치(Biacore AB)에서 커플링을 결정하고 그 측정을 행하였다. RANTES 결합의 센서 그램을 BIAevaluation 3.0 소프트웨어(Biacore AB)를 이용해서 보정하여, 비특이 배경 신호에 대해 보정하고, 평형 공명 유닛은 각 주입에 대해서 구하였다.

식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 폴리펩타이드는 RANTES와 PF4의 상호작용의 농도 의존 저해를 유발할 수 있었고, 이에 따라 PF4를 고정화하는 RANTES의 결합은 100　μM의 농도에서 식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 펩타이드의 존재에서 35%까지 감소된 것으로 판명되었다.

실시예 2

RANTES 와 PF4 의 이종응집체의 결합에 관한 식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 폴리펩타이드 , 식 (2)에 따른 서열번호 2의 서열의 폴리펩타이드 및 대조군 펩타이드의 저해 효과의 분석에 대한 플라스몬 공명 연구

실시예 1에 기재된 것과 마찬가지 조건 하의 다른 실험에 있어서, RANTES(0.5　μM) 또는 식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 폴리펩타이드, 식 (2)에 따른 서열번호 2의 서열의 폴리펩타이드, 또는 이하의 식 (14)에 따른 서열번호 14의 서열의 대조군 펩타이드 0　μM, 10　μM, 50　μM 및 100　μM에서 예비 배양한 RANTES(0.5　μM)의 결합을 조사하였다:

KEYFYTSGK (14) (서열번호 14).

이들 실험에 있어서, 10　μM, 50　μM 및 100　μM의 농도에서, 식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 폴리펩타이드는 식 (2)에 따른 서열번호 2의 서열의 폴리펩타이드보다 명백하게 더욱 효과적으로 RANTES와 PF4의 상호작용을 저해할 수 있는 것으로 판명되었다. 식 (14)에 따른 서열번호 14의 서열의 대조군 펩타이드는 100　μM의 농도에서 어떠한 검출가능한 저해도 발현되지 않았다.

실시예 3

활성화된 내피에 대한 단핵세포 정지의 저해

활성화된 내피세포에 대한 단핵구성 모노 맥 6 세포의 상호작용을 조사하였다.

IL-1β(Interleukin 1β, Peprotech, 10　ng/㎖, 12 시간)로 활성화된 융합성(confluent) HUVEC 세포층을 가진 페트리 접시를 유동실에 놓았다. 모노 맥 6 세포(0.5×10⁶　세포/㎖)를 밸런스 행크 용액(10　mM　HEPES(Gibco BRL), pH　7.3, 0.5% 소혈청 알부민(Serva)을 가진 HBSS) 중에 재현탁시키고, 얼음 위에서 유지시켰다. 실험 5분 전에, Ca² ⁺ 및 Mg² ⁺를 단핵구성 MM6 세포에 첨가하여, 케모카인 RANTES(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) 및 PF4(ChromaTec, Greifswald)의 각각의 최종 농도 1　mM 및 60　nM, 그리고, 식 (2)에 따른 서열번호 2의 서열의 폴리펩타이드, 식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 폴리펩타이드 또는 식 (14)에 따른 서열번호 14의 서열의 대조군 펩타이드 6　μM을 수득하였고, 이어서, 37℃까지 가열하였다. 다음에, 이와 같이 해서 전처리된 세포를 올림푸스사로부터의 모델 IX 50의 현미경 상에서 1.5　dyn/㎠에서 내피세포 위에 살포하였다. 내피세포와의 상호작용에 연유해서 유착된 단핵세포의 수는 비데오 카메라(3CCD, JVC) 및 레코더에 의한 사진의 화상 분석에 의해 다양한 시계에서 4분 후에 구하였다. 데이터는 대조군과 비교해서 평균(n = 5) 표준 편차(p < 0.02)로서 분석하였다.

RANTES와 PF4의 이종친화성(heterophilic) 상호작용에 연유한 단핵세포 정지의 상승작용은 유의하게, 예컨대, 식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 폴리펩타이드에 의해 80%까지 억제된 반면, 식 (2)에 따른 서열번호 2의 서열의 폴리펩타이드에 의한 저해는 보다 약한 것으로 판명되었다. 그러나 식 (14)에 따른 서열번호 14의 서열의 대조군 펩타이드는 유의한 저해를 갖지 않았다.

실시예 4

동맥 경화증[원문 그대로; 죽상동맥경화증 ]의 마우스 모델에서의 생체내 실험

동맥 경화증[원문 그대로; 죽상동맥경화증]의 모델은 9주령 내지 12주령의 암컷 ApoE 한배 새끼 마우스들(The Jackson Lab, Bar Harbor, Maine, USA)이었다. 이 마우스들에게는 12주 동안 고지방식이(지방 21%, Altromin® C1061)를 공급하였다. 이 기간 동안, 두 군의 마우스에 이하에 표시된 바와 같은 식 (15)에 따른 서열번호 15의 서열의 폴리펩타이드 50 μg을 1주에 3회 투여하는 복강내 주사하거나(n = 12 마리 마우스), 또는 식염수 용액 중 이하의 식 (14)에 따른 서열번호 14의 서열의 대조군 펩타이드를 마찬가지로 주사하였다(n = 7 마리 마우스). 미처리군의 마우스(n = 12)는 추가의 대조군으로서 사용하였다:

CKEYFYTSSKSSNLAVVFVTRC (15) (서열번호 15)

KEYFYTSGK (14) (서열번호 14).

조직 검사를 위해 마우스들을 희생시켰다. 실험기간 동안, 마우스들은 건강하였고, 어떠한 질병의 징후도 보이지 않았다. 실험적 영양 섭취 기간의 초기 및 말기에 혈액 샘플을 채취하였다. 백혈구 세포수는 혈구 계측에 의해 구하였고, 혈청을 수거하고, 인피니티 콜레스테롤 키트(Infinity cholesterol kit)(Thermo Electron, Melbourne, Australia)를 이용해서 콜레스테롤을 회수하였다.

죽상동맥경화증의 정도는 오일 레드 O 염색(N. R. Veillard, B. Kwak, G. Pelli, F.　Mulhaupt, R. W. James, A. E. Proudfoot, F. Mach, Antagonism of RANTES receptors reduces atherosclerotic plaque formation in mice. Circ. Res. 2004; 94:253-61)을 이용해서 지질 침착물을 염색하여 대동맥 경로 및 흉복부 대동맥에서 구하였고, 컴퓨터 화상 분석(Diskus software, Hilgers, Aachen)에 의해 정량화하였다. 죽상경화성 병변의 면적은 심장 및 대동맥 뿌리를 통한 5 ㎜ 횡단면에서 결정하였다. 그 결정은 50 ㎜ 떨어진 거리에서 6 구역의 지질 염색 영역에 의거해서 각 대동맥 뿌리에 대해 수행하였다. 죽상경화성 병변의 면적은 각 구역의 판막의 전체 표면에 의해 분할되었다. 흉복부 대동맥을 복벽 중간선을 따라 개방하고, 병변의 영역은 오일 레드-O 염색을 이용해서 정면 조직 표본에 염색하였다. 지질 침착물의 비례량은 상기 염색된 면적을 전체 흉복부 표면적으로 나눔으로써 산출하였다.

식 (15)에 따른 서열번호 15의 서열의 폴리펩타이드로 처치된 마우스, 식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 폴리펩타이드의 마우스 정형 유전자는 대조군 펩타이드를 입수한 마우스에 비해서 죽상경화성 병변의 발달에 있어서 유의한 감소를 보인 것으로 판명되었다. 또한, 플라크를 보이는 대동맥 뿌리의 면적은 상기 처리된 마우스에서의 전체 판막 표면적과 관련해서 유의하게 감소된 것으로 판명되었다. 또, 병변 중의 대식 세포 함량도 유의하게 감소된 것으로 판명되었다.

이와 같이 해서, 생체내 죽상동맥경화증의 발달은 식 (3)에 따른 서열번호 3의 서열의 폴리펩타이드의 마우스 정형 유전자에 의해 지연될 수 있는 것으로 입증되었고, 따라서, 본 발명의 폴리펩타이드는 치료적 용도에 적합하다.

<110> RWTH AACHEN <120> ANTAGONISTS AGAINST INTERACTION OF PF4 AND RANTES <130> RAP08143KR <150> DE10 2005 049 637.7 <151> 2005-10-14 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antagonist <220> <221> SITE <222> (2)..(3) <223> misc_feature; Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> SITE <222> (9)..(21) <223> misc_feature; Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Cys Xaa Xaa Tyr Phe Tyr Thr Ser Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antagonist <400> 2 Cys Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Cys Ser Asn Pro Ala Val 1 5 10 15 Val Phe Val Thr Arg Cys 20 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antagonist <400> 3 Cys Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Ser Ser Asn Pro Gly Ile 1 5 10 15 Val Phe Ile Thr Arg Cys 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antagonist <400> 4 Cys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Ser Ser Asn Pro Gly Ile Val 1 5 10 15 Phe Ile Thr Cys 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antagonist <400> 5 Cys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys Ser Ser Asn Tyr Gly Ile Val 1 5 10 15 Phe Ile Thr Cys 20 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antagonist <400> 6 Cys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Ser Lys Ser Ser Asn Tyr Gly Ile Val 1 5 10 15 Phe Ile Thr Cys 20 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antagonist <400> 7 Cys Tyr Phe Tyr Thr Ser Ser Lys Ser Ser Asn Pro Gly Ile Val Phe 1 5 10 15 Ile Thr Cys <210> 8 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding for Antagonist <400> 8 tgcaaggaat atttctacac ttccgggaaa tcctccaatc ctggaattgt gttcatcact 60 agatgt 66 <210> 9 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding for Antagonist <400> 9 tgcaaggaat atttctacac ttccgggaaa tgttccaatc ctgccgtggt gttcgtcact 60 agatgt 66 <210> 10 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding for Antagonist <400> 10 tgcgaatatt tctacacttc cgggaaatcc tccaatcctg gaattgtgtt catcacttgt 60 60 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding for Antagonist <400> 11 tgcgaatatt tctacacttc cgggaaatcc tccaattacg gaattgtgtt catcacttgt 60 60 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding for Antagonist <400> 12 tgcgaatatt tctacacttc ctctaaatcc tccaattacg gaattgtgtt catcacttgt 60 60 <210> 13 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence coding for Antagonist <400> 13 tgctatttct acacttcctc taaatcctcc aatcctggaa ttgtgttcat cacttgt 57 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Control peptide <400> 14 Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Ser Gly Lys 1 5

Claims

이하의 식 (1)에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열을 가진 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트:

C-X₁-X₂-YFYTS-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-X₁₄-X₁₅-C (1) (서열번호 1)

식 중,

X₁은 리신, 글루타민, 아르기닌, 히스티딘 및/또는 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 아미노산 결손이고;

X₂는 글루탐산, 아스파르트산 및/또는 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 아미노산 결손이며;

X₃는 글라이신, 세린 및/또는 알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₄는 리신, 류신 및/또는 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₅는 세린, 시스테인, 글라이신 및/또는 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₆는 세린, 글라이신 및/또는 트레오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₇은 아스파라긴 및/또는 글루타민으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₈은 프롤린, 티로신 및/또는 글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₉은 글라이신, 알라닌 및/또는 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₁₀은 아이소류신, 발린 및/또는 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₁₁은 발린, 아이소류신 및/또는 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₁₂는 페닐알라닌, 티로신, 아이소류신, 발린, 류신 및/또는 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₁₃은 아이소류신, 발린, 류신, 메티오닌 및/또는 페닐알라닌으로 이루어진 군으로부터 선택되고;

X₁₄은 트레오닌, 글라이신, 알라닌, 세린 및/또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되며;

X₁₅은 아르기닌, 리신, 글루타민, 히스티딘 및/또는 아스파라긴으로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 아미노산 결손이다.
제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산의 개수가 ≥19 내지 22≤의 범위인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트.
제1항 또는 제2항에 있어서, X₁은 리신 또는 결손인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, X₂는 글루탐산 또는 결손인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, X₃는 글라이신 및/또는 세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, X₅는 세린인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, X₈은 프롤린 및/또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, X₉은 글라이신인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₀은 아이소류신인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₂는 페닐알라닌 및/또는 티로신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₃은 아이소류신인 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, X₁₅은 아르기닌 또는 결손으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지거나, 식 (2)에 따른 서열번호 2의 상기 폴리펩타이드는 상기 식 (2)에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열에 대해서 적어도 1개 이상의 아미노산 결손, 아미노산 치환 및/또는 아미노산 삽입을 가진 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트:

CKEYFYTSGKCSNPAVVFVTRC (2) (서열번호 2).
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기 식 (3)에 따른 서열번호 3의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트:

CKEYFYTSGKSSNPGIVFITRC (3) (서열번호 3).
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기 식 (4)에 따른 서열번호 4의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트:

CEYFYTSGKSSNPGIVFITC (4) (서열번호 4).
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기 식 (5)에 따른 서열번호 5의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트:

CEYFYTSGKSSNYGIVFITC (5) (서열번호 5).
제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기 식 (6)에 따른 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트:

CEYFYTSSKSSNYGIVFITC (6) (서열번호 6).
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 하기 식 (7)에 따른 서열번호 7의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트:

CYFYTSSKSSNPGIVFITC (7) (서열번호 7).
RANTES와 혈소판 인자 4 간의 상호 작용에 대한 길항제로서의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트의 용도.
약제학적 약물의 제조용의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트의 용도.
- 심혈관 및/또는 염증성 질환, 특히 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 불안정한 경화반(unstable plaque), 협착증, 재협착증, 고혈압, 관절염, 심근염, 뇌척수염을 비롯한 자가면역질환, 염증성 장질환, 경색 후의 재관류 손상, 이식 거부 및/또는 피부 질환과 같은 단핵세포의 보충과 관련된 질환; 및/또는

- 호산구증가증, 특히 폐렴 또는 천식과 같은 알레르기 질환과 같은 기타 백혈구 모집단의 RANTES-의존 보충과 관련된 질환

으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료적 및/또는 예방적 처치를 위한 약제학적 약물의 제조용의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트의 용도.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드, 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트를 포함하는 약제학적 약물.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드(들), 그의 약학적으로 허용가능한 염, 유도체 및/또는 컨쥬게이트를 포함하는, 단핵세포 정지(monocyte arrest)를 방지하기 위한 제제.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 핵산.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(들)을 포함하는 약제학적 약물.