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KR20080027356A - 약독화된 뎅기 혈청형 1 균주 - Google Patents

약독화된 뎅기 혈청형 1 균주 Download PDF

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KR20080027356A
KR20080027356A KR1020087001412A KR20087001412A KR20080027356A KR 20080027356 A KR20080027356 A KR 20080027356A KR 1020087001412 A KR1020087001412 A KR 1020087001412A KR 20087001412 A KR20087001412 A KR 20087001412A KR 20080027356 A KR20080027356 A KR 20080027356A
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Abstract

본 발명은 PDK 세포에서 계대 배양하고 Vero 세포에서 위생처리함으로써, 야생형 뎅기-1 균주 16007로부터 유래된 약독화된 신규한 VDV1(Vero-Derived Dengue serotype 1 virus) 생균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 VDV1 균주를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

약독화된 뎅기 혈청형 1 균주{DENGUE SEROTYPE 1 ATTENUATED STRAIN}
본 발명은 PDK 및 Vero 세포에서 계대 배양하고 위생처리한, 야생형 뎅기-1 균주 16007 유래의 약독화된 신규한 VDV1(Vero-Derived Dengue serotype 1 virus) 생균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 VDV1 균주를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.
뎅기병은, 플라비바이러스(flavivirus) 속(Gubler, 1988)에 속하는, 항원성으로 구별되지만 매우 밀접하게 관련되어 있는 4가지 타입의 바이러스 혈청형에 의해 야기된다(Gubler, 1988; Kautner et al., 1997; Rigau-Perez et al., 1998; Vaughn et al., 1997). 뎅기 바이러스 혈청형에 감염되면, 비특이적인 바이러스성 증후군에서부터 치명적인 중증 출혈성 질환에 이르는 넓은 범위의 임상 질환이 발생할 수 있다. 뎅기열(DF)의 잠복기는 모기에 물린 후 평균적으로 4일(3-14일)이다. DF는 2상성 열(biphasic fever), 두통, 다양한 신체 부위의 통증, 쇠약, 발진, 림프절 병증(lymphadenopathy) 및 백혈구 감소증을 특징으로 한다(Kautner et al., 1997; Rigau-Perez et al., 1998). 바이러스 혈증의 기간(viremic period)은 열성 질환과 동일하다(Vaughn et al., 1997). DF로부터 완전히 회복되는데에는 통상 7 내지 10일이 소요되지만, 무력증이 장기간 계속되는 것이 일반적이다. 백혈 구와 혈소판의 수 감소도 흔하게 나타난다.
출혈성 뎅기열(Dengue haemorrhagic fever, DHF)은 항상성의 이상과, 종종 심각한 내출혈을 동반한 저혈량증 및 저혈압(뎅기 쇼크 증후군, DSS)을 유도할 수 있는 혈관 투과성 증가를 특징으로 하는 중증 열성 질환이다. DHF의 치사율은 무치료시 10%로 높으며, 치료를 받는 경우에는 대부분 1% 미만일 수 있다(WHO Technical Guide, 1986).
뎅기 감염에 대한 일반적인 실험적 진단은 바이러스 분리 및/또는 뎅기 바이러스 특이적인 항체의 검출을 근거로 한다.
뎅기병은 말라리아 다음으로 두번째로 가장 중요한 열대성 감염 질환으로, 전세계 인구의 1/2 이상(25억)이 유행성 확산 위험성이 있는 지역에 살고 있다. 매년 뎅기병의 사례는 50,000,000 내지 100,000,000 건으로 추산되고 있으며, 이중 500,000건은 DHF로 입원하며, 25,000건은 사망한다. 뎅기는 아시아, 태평양, 아프리카, 라틴 아메리카 및 카리브해에 만연되어 있다. 100개국 이상의 열대 국가에는 풍토성의 뎅기 바이러스 감염증이 있으며, 이들 국가중 60개국 이상에서 DHF가 보고되었다(Gubler, 2002; Monath, 1994). 다음과 같은 특징적인 다수개의 인자들이 뎅기 감염증에 관여하는 것으로 보인다: 인구 증식(population growth), 특히 빈곤과 관련하여 무계획 및 무통제성 도시화, 비행기 이용 증가, 효과적인 모기 방제 부족, 및 위생 및 공공 건강 기반 시설의 퇴보(Gubler, 2002). 여행자 및 국외 거주자들 사이에서 뎅기에 대한 인식이 증가하고 있다(Shirtcliffe et al., 1998). 뎅기-유행성 열대지역에서 유행하는 기간동안에 미국 부대에서 발생되는 열병의 주 된 원인이 뎅기인 것으로 입증되었다(DeFraites et al., 1994).
뎅기열 바이러스는 낮에 활동하는 인간 흡혈에 선호적인 가주성 모기인 이집트 숲 모기(Aedes aegypti) 및 인간과 연관된 사이클로 유지된다. 인간 감염은, 먼저 감염된 이집트 숲 모기가 흡혈하는 동안에 바이러스가 주입되어 개시된다. 타액의 바이러스는 혈관외 조직에 주로 머무른다. 주입된 후 감염되는 일차 세포 서브세트는 수지상 세포이며, 이후 유출성 림프절로 이동한다(Wu et al., 2000). 바이러스는 피부와 유출성 림프절에서 일차 복제된 후, 일반적으로 3 내지 5일간 급성 발열기 동안에 혈액에 출현한다.
단핵구 및 대식세포는 뎅기 바이러스의 일차 표적물 중에서도 수지상 세포와 함께 한다. 상동 기관의 재감염에 대한 방어는 완전하며 아마 평생 지속되지만, 뎅기 타입들 간의 교차 방어는 12주 미만으로 지속된다(Sabin, 1952). 그 결과, 개체는 다른 혈청형으로 이차 감염을 겪을 수 있다. 이차 뎅기 감염은 중증 뎅기병으로 발병할 수 있는 이론적인 위험 인자이다. 그러나, DHF는, 연루된 바이러스 균주 뿐만 아니라 환자의 연령, 면역 상태 및 유전적 소인을 포함하는, 다인자성 질환이다. 다음의 2가지 인자가 DHF 발생에 주된 역할을 한다: 높은 바이러스 혈증을 보이는 바이러스의 빠른 복제(질병의 심각성은 바이러스 혈증 정도와 관련있음)(Vaughn et al., 2000) 및 염증 매개체를 높은 수준으로 방출하는 중요한 염증 반응(Rothman and Ennis, 1999).
뎅기병에 대한 특이 치료제는 없는 실정이다. DF 처치는 침상 휴식, 해열제와 진통제에 의한 열 및 통증 통제, 및 적절한 수액 섭취로 이루어진다. DHF의 치 료에는 체액 손실 보정, 응혈 인자의 대체 및 헤파린 주입이 요구된다.
현재 예방 조치들은 병원균 매개 동물의 방제와 개인적인 보호 조치에 의지하고 있지만, 이는 수행하기 어려우며 비용이 많이 든다. 현재, 승인된 뎅기 백신은 없다. 4가지 뎅기 혈청형이 전세계적으로 순환되고 있으며 DHF에 관여되는 것으로 보고되고 있기 때문에, 백신 접종은 이상적으로는 4가지 뎅기 바이러스 혈청형 모두에 대한 방어를 부여할 수 있어야 한다.
약독화된 생백신(Live attenuated vaccine, LAV)은 선천적인 면역성을 재생시키는 것으로, 뎅기와 동일한 종에 속하는 일부 바이러스를 포함하여, 수많은 질환에 대한 백신 개발에 사용되고 있다(예, 상업적으로 구입가능한 플라비바이러스 약독화된 생백신으로는 황열 및 일본 뇌염 백신이 있음). 약독화된 생바이러스 백신의 이점은 그것의 복제 능력과 체액성 및 세포성 면역 반응 둘다를 유도할 수 있는 능력이 있다는 것이다. 아울러, 전체 비리온 백신에 의해 유도된 바이러스의 여러가지 성분(구조 및 비구조 단백질)들에 대한 면역 반응은 자연적인 감염에 의해 유발되는 면역 반응을 재현한다는 것이다.
뎅기 백신 계획은 태국에 소재한 마히돌 대학의 과학기술 개발 기구인 백신 개발 센터에서 시작되었다. 약독화된 생백신에 대한 후보 백신이, PDK(primary dog kidney) 세포에서 뎅기 혈청형 1(균주 16007, 계대 13 = LAV1), 혈청형 2(균주 16681, 계대 53) 및 혈청형 4(균주 1036, 계대 48) 바이러스에 대해, 그리고, PGMK(Primary Green Monkey Kidney) 세포(계대 30) 및 FRhL(Fetal Rhesus Lung) 세포(계대 3)에서 혈청형 3(균주 16562)에 대해, 실험실 규모로 성공적으로 개발되었 다. 이들 백신들은 태국의 지원자를 대상으로 1가(단일 혈청형), 2가(2종의 혈청형), 3가(3종의 혈청형) 및 4가(4종 모두의 혈청형) 백신으로서 테스트 되었다. 이들 백신들은 어린이 및 성인에서 안전하며 면역원성이 있는 것으로 확인되었다(Gubler, 1997). 이들 LAV 1-4 균주들은 마히돌 대학의 EP 1159968에 언급되어 있으며, 그 이전에 CNCM(CNCM I-2480; CNCM I-2481; CNCM I-2482 및 CNCM I-2483 각각)에 기탁되었다.
약독화된 뎅기 1 바이러스 생균주(LAV1)의 전체 서열은 R. Kinney 등(CDC, Fort Collins)에 의해 확립되었다. 모균주 DEN-1 16007(서열번호 2)와 LAV1(서열번호 3) 균주들 간의 서열 차이를 표 1에 나타낸다. 이에, 야생형 바이러스 균주인 16007과 LAV1 균주의 유전자를 비교한 결과, LAV1의 약독화와 연결지을 수 있는 14개의 점 돌연변이 세트가 확인되었다.
표 1: DEN-1 16007 및 DEN-1 16007/PDK13(LAV1)의 서열 차이
등위 LAV1 (DEN-1 16007/PDK13) 16007
유전자-아미노산 위치 Nt aa nt aa
E-130 Nt-1323 C Ala T Val
E-203 Nt-1541 A Lys G Glu
Nt-1543 G A
E-204 Nt-1545 A Lys G Arg
E-211 Nt-1567 G Gln A Gln
E-225 Nt-1608 T Leu C Ser
E-477 Nt-2363 G Val A Met
NS1-92 Nt-2695 C Asp T Asp
NS1-121 Nt-2782 T Ala C Ala
NS3-182 Nt-5063 A Lys G Glu
NS3-510 Nt-6048 T Phe A Tyr
NS4A-144 Nt-6806 G Val A Met
NS4B-168 Nt-7330 G Gln A Gln
NS5-624 Nt-9445 T Ser C Ser
해당 코돈을 변형시키는 뉴클레오티드 변화는 볼드체로 나타낸다.
1983년에 최초로 확립된 LAV1 균주는, 또한 가능성 있는 백신 후보로 신속하게 확정되었다(Bhamarapravati and Yoksan, 1997).
그러나, 그 당시에 포유류 배양물을 통한 해면상 뇌염(Spongiform Encephalitis)의 인간 전파가 위험한 것으로 인지되지 않았으며, 바이러스는 통상 PDK(Primary Dog Kidney) 세포에서 유지되었다. 더욱이, 이 LAV1 균주는 혼성(heterogeneous) 개체이다. 이러한 혼성(heterogeneity)은 조성물에 존재하는 하나의 균주의 시험관내 또는 생체내 선별 가능성이 있어, 추가적인 위험이 있음을 의미한다.
이러한 우려가 증가되어, 출원인은 이러한 위험으로부터 벗어나기 위한 위생 공정을 확립하기로 결심하였다. LAV1 백신 균주를 PDK에서 Vero 세포로 먼저 이동시킨 다음 LAV1의 정제된 게놈 RNA를 Vero 세포에 형질감염시키고, 2번의 연속적인 바이러스의 플라그 정제 단계를 실시하여, 출원인은 신규한 Vero-유래 혈청형 1 바이러스(VDV1)를 만들었다.
Vero 세포로 전이되어 생물학적으로 클로닝됨으로써 파생된 신규한 VDV1 균주는, 서열, 동질적인 플라그 크기 및 온도 민감성이 LAV1 균주와 다르지만, 예컨대 감퇴 스팟(attenuation spot), 작은 플라그 표현형, 고온에서의 증식 제한과 같은 LAV1의 일부 표현형 및 유전자형 특징들이 보존되어 있으며, LAV1 균주의 면역원 특징들도 보존되어 있다는 점에서 중요하다. 이러한 특징들로 인하여, 상기 신규 균주는 예방 측면에서 인간을 면역화시키는데 유용한 백신 후보물이 될 수 있 다.
정의
"뎅기 바이러스"는 플라비리다에(flaviridae) 과의 플라비바이러스 속에 속하는, (+) 단일가닥 RNA이다. 뎅기 혈청형1(DEN-1) 균주 16007의 경우, 전체 서열은 10735개의 뉴클레오티드(서열번호 2)로 이루어져 있다. RNA 게놈에는 5'말단에 타입 1 캡(cap)이 있지만, 3'-말단 폴리(A)-테일(tail)은 없다. 유전자 구성은 5'-비코딩부(NCR), 구조 단백질(캡시드(C), 프리멤브레인/멤브레인(prM/M), 엔벨로프(E)), 비구조 단백질(NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5), 및 3' NCR이다. 바이러스 RNA 게놈은 C 단백질과 조합되어 뉴클레오캡시드(20면체 대칭)를 형성하고 있다. 다른 플라비바이러스와 같이, DEN 바이러스 게놈은 하나의 폴리단백질로 번역되는, 연속적인 오픈 리딩 프래임(ORF)을 코딩하고 있다.
뎅기-1의 병원성(질병을 유발하는) 균주를 수회 계대 배양하면, "살아있는 약독화"된, 즉 감염성은 있지만 질병은 유발하지 못하는, 변형된 바이러스 분리물이 생긴다. 이렇게 변형된 바이러스는 일반적으로 원숭이에서 테스트하여, 이들의 약독성을 평가한다. 그러나, 인간은 임상 질환의 증후를 나타내는 유일한 영장류이다. 테스트한 인간 대부분에서 (즉, 긍정적인 효과/위험 비로 표시되는, 규제하기 위한 측면에서 허용가능한) 중간 내지 낮은 효과를 유발하거나, 또는 부차적인 효과(즉, 전신 현상 및/또는 생물학적인 비정상성 및/또는 국부 반응)를 유발하지 않지만, 여전히 감염성을 보이며 면역 반응을 유도하는 바이러스를 "약독화된 생" 바이러스라고 한다.
"용어 "LAV"는 약독화된 뎅기 생바이러스 균주를 나타낸다. 본 발명에서, "LAV"는 PDK 세포에서의 계대 배양, 예컨대 10, 11, 12 또는 13회 계대 배양에 의해 뎅기 혈청형 1(DEN-1) 균주 16007로부터 최초로 파생된 약독화된 생균주이다. 예컨대, "LAV1/PDK13"은 PDK 세포에서 균주 16007을 13회 계대 배양한 후 확립한 약독화된 균주이다(또한, DEN-1 16007/PDK13이라 명명됨). LAV1/PDK13의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 3에 나타낸다.
"VDV1"은 본 발명에 개시된 위생 공정에 의해 수득가능한 LAV를 의미한다. 따라서, VDV1은 영장류, 특히 인간에서 중화 항체를 포함하여, 특이적인 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는, 생물학적 클론(동질적인) Vero-순응된 혈청형1의 뎅기 바이러스이다. 본 발명의 VDV1 균주는 개시된 VDV1 서열로부터 출발하여 직접 쉽게 재구축할 수 있다. 특이적인 체액성 면역 반응의 유도는 ELISA 분석에 의해 용이하게 측정할 수 있다. 백신을 접종받은 개체의 혈청내 중화 항체의 존재는 섹션 4.1.2.2.에 언급된 바와 같이 플라그 감소 중화 테스트(plaque reduction neutralization test)로 평가한다. 그 결과 결정된 중화 항체의 역가가 1:10 보다 높거나 또는 1:10이면, 혈청은 중화 항체의 존재에 대해 양성인 것으로 간주된다.
용어 "돌연변이"는 유전적 물질, 예컨대 DNA, RNA, cDNA 또는 모든 과정, 기작의 검출가능한 모든 변화 또는 그러한 변화의 결과를 의미하다. 돌연변이는 한개 이상의 뉴클레오티드의 치환을 포함한다. 본 발명에서, 뎅기-1 바이러스 게놈 서열 또는 폴리단백질에서 확인된 돌연변이는 Dunnen 및 Antonarakis(2000)의 명명법에 준하여 명명된다. Dunnen 및 Antonarakis에 의해 정의된 바와 같이, 핵산 수준에서 치환은 ">"로 표시되며, 예로, "31A>G"는 기준 서열의 31번 뉴클레오티드가 A에서 G로 변경됨을 나타낸다.
단백질에서의 변이는 돌연변이의 결과를 나타내며, 하기와 같이 기재된다. 정지 코돈은 X로 명기된다(예, R97X는 Agr96의 종결 코돈으로의 변경을 나타냄). 아미노산 치환은 예컨대, 9번 Ser이 Gly으로 치환됨을 의미하는 "S9G"로 표시된다.
Vero 유래 혈청형1의 뎅기 바이러스( VDV1 )
기존에 개발된 뎅기-1 백신 후보체 LAV1 조성물은 위생 처리 공정에 의해 개량하였다.
본원에 개시된 Vero-유래 혈청형1의 뎅기 바이러스(VDV1)는 PDK 세포에서의 연속적인 계대 배양에 의해 약독화된 DEN-1 16007 바이러스를 이용한다. VDV1은 약독화된 DEN-1 생바이러스의 전체 게놈 서열을 포함하고 있으며, 인간을 대상으로 테스트한 LAV1 원균주와 같이 약독화로 연결되는 동일한 스팟을 가지고 있다.
LAV1 백신 후보체의 위생 처리는 단백질 제거 단계 및 정제된 바이러스 게놈 물질만 Vero 세포에 도입하는 단계에 의해 수행되었다. 보다 상세하게는, 균주의 위생 처리는 2단계로 수행되었다:
1) 32℃에서 DEN16007/PDK11(LAV1/PDK11)을 Vero 세포에서 증폭시키는 단계.
2) 바이러스 RNA를 정제하여 Vero 세포에 형질감염시키는 단계.
단계 1은 Vero 세포에서 LAV1/PDK11의 1회 계대 배양에 의해 수행된다. 이를 위해, Vero 세포에 LAV1/PDK11을 0.01 moi로 감염시키고, 32℃에서 5일간 배양한다.
단계 2에서, 바이러스 게놈은, 세포에 도입되었을 때 완전한 감염성 바이러스를 재구성할 수 있음을 의미하는, 감염성 RNA라는 점이 이점이다. 단계 2의 정제 및 형질감염 단계는 하기 단계를 포함한다:
a) 플라그-정제한 바이러스에서 바이러스 RNA를 추출 및 정제하는 단계;
b) 정제한 RNA를 양이온성 지질과 효과적으로 조합시키는 단계;
c) Vero 세포, 특히 Vero 세포 LS10에 형질감염시키는 단계;
d) 신규-합성된 바이러스를 회수하는 단계; 및
e) 플라그 정제의 의해 VDV 균주를 정제하고, 선택적으로 숙주 세포, 특히 Vero 세포에서 이를 증폭시키는 단계.
Vero 세포 기법은 여러가지 상업적인 제품(주사용 및 경구 폴리오 백신, 광견병 백신)에 사용되는 잘 알려져 있는 기법이다. 본 발명에서 이롭게는 외래 물질(adventitious agent)이 존재할 어떠한 위험도 없음을 보장하기 위해, 검증된(qualified) Vero 세포를 사용하였다. 본 발명에서, "검증된 Vero 세포"는, 배양 조건이 알려져 있는 세포 또는 세포주를 의미하며, 상기 세포는 임의 외래 물질이 없는 것이다. 이것으로는, 예컨대 Sanofi Pasteur의 Vero 세포 LS10이 있다.
그에 따라 분리된 VDV 균주는 동결 조성물 또는 동결건조 산물 형태 중 어느 한가지 형태로 관행에 따라 보관된다. 이를 위해, VDV는 희석제, 통상적으로 당 알코올 및 안정화제와 같은 동결보존성 화합물을 포함하는 완충화된 수용액과 혼합될 수 있다. 동결 또는 동결건조하기 전 pH는, 실온에서 pH 측정기로 측정시, 6 내지 9, 예컨대 pH 7.5 + 0.2와 같이 약 7로 설정하는 것이 좋다. 사용하기 전에, 동결건조된 산물은, 멸균 NaCl 4‰ 용액과 같은 약리학적인 희석제 또는 부형제와 혼합되어, 면역원성 액체 조성물 또는 백신으로 재구성된다.
형질감염한 후 회수된 바이러스의 약독화-특이 부위를 서열분석하였으나, LAV1/PDK13 균주와 비교하여 어떠한 돌연변이도 확인되지 않았다. 생물학적으로 클로닝된 VDV1 바이러스는, 특히 약독화 표현형의 보존으로부터 유출할 수 있는 것처럼, 이의 LAV1 모균주와 상동한 플라그 표현형과 상당한 유전적 안정성을 갖는다.
VDV1 균주를 서열 분석하였고, 혈청형 1 뎅기의 약독화된 생바이러스(LAV1/PDK13) 균주의 서열(서열번호 3)과 비교하였다. LAV1 기준 서열과 3개의 뉴클레오티드가 달랐다. 이것 중 하나는 아미노산의 침묵이다(2719 위치). 그외 2개(5962 및 7947 위치)는 비구조 펩티드의 코딩 서열(NS3-481 및 NS5-125, 각각)에 위치되어 있다. 이러한 차이는 LAV1의 약독화 위치 어디에도 있지 않았다.
따라서, 본 발명은 PDK 세포에서 연속 계대 배양하고, 이후 Vero 세포에서 계대 배양 및 위생처리함으로써, 약독화된 야생형 DEN-1 16007 바이러스로부터 수득한, 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주를 제공한다. 특히, 본 발명의 약독화된 균주는 야생형 DEN-1 16007 및 LAV1/PDK13 균주의 뉴클레오티드 서열 또는 폴리단백질 서열을 기준으로, 확인된 하나 이상의 서열 돌연변이(무-침묵 및 선택적으로 침묵)를 포함한다.
따라서, 본 발명은 LAV1/PDK13 균주(서열번호 3)의 서열을 포함하는, 또는 상기 서열로 구성된, 분리된 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주에 관한 것으로, 상기 서열에서 5967 및 7947번, 그리고 선택적으로 2719번의, 뉴클레오티드 중 한개 이상은 돌연변이되어 있으며, 단, 1323, 1541, 1543, 1545, 1567, 1608, 2363, 2695, 2782, 5063, 6048, 6806, 7330 및 9445번의 뉴클레오티드는 돌연변이 되어 있지 않다. 바람직하기로는, 돌연변이는 치환이다. 바람직하기로는, 5962번의 뉴클레오티드는 A이고, 7947번의 뉴클레오티드는 G이다. 더 바람직하기로는, 본 발명에 따라 분리된 균주는 돌연변이 2719 G>A, 5962 C>A 및 7947 A>G를 포함하는, 서열번호 3의 서열을 포함한다.
이에, 본 발명에 따른 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주는, 1323 T>C, 1541 G>A, 1543 A>G, 1545 G>A, 1567 A>G, 1608 C>T, 2363 A>G, 2695 T>C, 2782 C>T, 5063 G>A　, 5962 C>A, 6048 A>T, 6806 A>G, 7330 A>G, 7947 A>G 및 9445 C>T 중 한가지 이상의 돌연변이를 포함하는, 야생형 뎅기-1 균주 16007(서열번호 2)의 서열을 포함한다. 바람직하기로는, 본 발명에 따른 약독화된 생균주는 야생형 균주 16007의 뉴클레오티드 서열(서열번호 2)을 기준으로 2719 G>A 돌연변이를 더 포함한다.
본 발명에 따른 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주는, 전술한 바와 같이, 5962 및 7947번이 돌연변이된 서열번호 3의 서열을 포함하고 있으며 해당 코돈 위치에서 코딩하고 있는 아미노산을 변이시키지 않고서 그 코돈 위치에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 더 포함하고 있는 변이체 균주이다.
이롭게는, 본 발명에 따른 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주는 서열번호 1에서 한정된 수의 돌연변이, 예컨대 5개 이하, 바람직하기로는 2개 이하의 돌연변이가 있는, 서열을 포함한다.
바람직하기로는, 본 발명에 따른 뎅기-1 바이러스의 게놈 서열은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
또한, 본 발명은 세포, 특히 Vero 세포에서의 추가적인 계대 배양에 의해 서열번호 1의 서열을 가진 VDV1 균주로부터 파생될 수 있는, 약독화된 뎅기-1 생균주에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 DNA 서열 또는 이의 등가 RNA 서열을 포함하거나, 또는 서열로 구성되는 분리된 핵산에 관한 것이다.
"핵산 분자"는, 단일가닥 형태 또는 이중가닥 나선형의, 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또한 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 폴리머형, 또는 포스포로티오에이트 및 티오에스테르와 같은 이의 모든 포스포에스테르 유사체이다.
본원에서, 서열번호 1의 RNA 서열 "등가체"는 서열번호 1에서 데옥시티미딘이 우리딘으로 치환된 것을 의미한다. 서열번호 1은 VDV1 cDNA 서열을 구성하므로, 따라서 이의 RNA 등가 서열은 VDV1의 (+) RNA 가닥에 해당된다.
본 발명은 또한 서열번호 41의 서열을 포함하는 폴리단백질 및 이의 단편에 관한 것이다. 서열번호 41은 서열번호 1에 의해 엔코딩된 폴리단백질 서열이다.
기준 단백질의 "단편"은 기준 단백질의 보존적인 아미노산 체인을 포함하는 서열의 폴리펩티드이다. 단편의 아미노산 길이는 8개 이상, 12개 이상 또는 20개 이상일 수 있다.
서열번호 41의 폴리단백질의 단편은 적어도 NS3 단백질의 481번 위치(서열번호 41의 1956번 위치)에 라이신, 및/또는 NS5 단백질의 125번 위치(서열번호 41의 2618번 위치)에 아르기닌을 포함한다.
예로, 서열번호 1에 의해 엔코딩되는 폴리단백질의 단편은 NS3 단백질 및/또는 NS5 단백질을 포함한다.
면역성 및 백신 조성물
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 VDV1 균주를 포함하는, 백신으로서 사용하기 적합한, 면역성 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 면역성 조성물은 중화 항체를 포함하여 뎅기 바이러스에 대해 특이적인 체액성 면역 반응을 도출한다.
바람직하기로는, 면역성 조성물은 백신이다.
예로, 면역성 조성물은 일가 조성물이며, 즉, 이 조성물은 뎅기-1 바이러스에 대해서만 특이적인 면역 반응을 나타내거나/나타내고, 방어를 부여한다.
다른 예로, 본 발명은 다가 뎅기 면역성 조성물에 관한 것이다. 이러한 다가 면역성 조성물 또는 백신은 개별적인 일가 뎅기 백신들을 조합함으로써 수득할 수도 있다. 면역성 조성물 또는 백신 조성물은 다른 혈청형의 약독화된 뎅기 생바이러스 하나 이상을 추가적으로 포함할 수 있다. 특히, 면역성 조성물 또는 백신 조성물은, 본 발명에 따른 VDV1을, 혈청형 2, 3 및 4로 이루어진 군으로부터 선택된 한가지 이상의 약독화된 뎅기 생바이러스와 조합하여, 포함할 수 있다.
바람직하기로는, 면역성 조성물 또는 백신 조성물은, 4가 뎅기 백신 조성물, 즉 본 발명에 따른 VDV1을 약독화된 뎅기-2 바이러스 생균주, 약독화된 뎅기-3 바이러스 생균주 및 약독화된 뎅기-4 바이러스 생균주와 조합하여 포함하는 백신 조성물일 수 있다.
약독화된 뎅기-2, 뎅기-3 및 뎅기-4 바이러스 생균주는 이미 개시되어 있다. 뎅기 혈청형2(16681 균주 53회 계대 배양; LAV2) 및 혈청형 4(1036 균주, 48회 계대 배양, LAV4) 바이러스를 PDK(Primary Dog Kidney) 세포에서, 혈청형 3(16562 균주)을 PGMK(Primary Green Monkey Kidney) 세포(30회 계대 배양) 및 FRhL(Fetal Rhesus Lung) 세포(3회 계대 배양)(LAV3)에서, 계대 배양하여 얻어진, 마히돌 대학에서 개발한 약독화된 생 백신을 참조할 수 있다. LAV2(서열번호 42), LAV3(서열번호 43) 및 LAV4(서열번호 44)의 뉴클레오티드 서열들은 첨부한 서열목록에 나타나있다.
이롭게는, 약독화된 뎅기-2 생균주는 마히돌 대학에서 개발된 LAV2 균주를 Vero 세포에서의 위생 처리 공정에 의해 수득한 VDV2 균주일 수 있다. 특히, 약독화된 뎅기-2 생균주(VDV2)는 서열번호 40의 서열을 포함할 수 있으며, 이롭게는 상기 서열로 구성될 수 있다.
백신을 포함한 면역성 조성물은 액체 용액, 현탁액 또는 유제일 수 있는 주사제로서 제조할 수 있다. 활성 면역성 성분을 이와 혼용가능한 약제학적으로 허용가능한 부형제와 혼합할 수 있다.
본 발명에 따른 면역성 조성물 또는 백신은 당업자에게 공지된 모든 통상적인 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 통상적으로, 본 발명에 따른 항원을 물 또는 포스페이트 인산화된 염수 용액, 습윤제, 충진제, 유화제, 안정화제와 같은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 부형제와 혼합한다. 부형제 또는 희석제는 투여 방법과 경로, 그리고 약학 실무에 따라 선택되는 약학 형태에 따라, 선택될 것이다. 적합한 부형제 또는 희석제, 그리고 약학 제형의 요건은 약학 분야의 참고 도서인 Remington's Pharmaceutical Sciences에 기재되어 있다.
바람직하기로는, 면역성 조성물 또는 백신은 예컨대 pH(실온에서 pH 측정기로 측정하는) 6 내지 9를 유지하도록 완충화된 수용액을 포함하는, 주사 조성물이다.
본 발명에 따른 조성물은 보강제, 즉 VDV1 균주에 의해 도출되는 면역 반응을 개선 또는 강화하는 물질을 더 포함할 수 있다. 인간 백신에 일반적으로 사용되는 약제학적으로 허용가능한 보강제 또는 보강제 혼합물을 상기한 목적으로 사용할 수도 있다.
본 발명에 따른 면역성 조성물 또는 백신은, 본 발명에서 비경구(예, 진피내, 피하, 근육내) 경로와 같이, 인간 백신 분야에서 일반적으로 사용되는 통상적인 경로로 투여할 수 있으며, 면역성 조성물 또는 백신은 바람직하기로는 어깨 삼각근에 피하 투여되는 주사 조성물이다.
면역화 방법
본 발명은 본 발명에 따른 면역성 조성물 또는 백신을 면역유효량으로 숙주에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역화를 필요로 하는 숙주에 뎅기 감염을 면역화시키는 방법을 제공한다.
"면역화를 필요로 하는 숙주"는 뎅기 감염 위험이 있는 사람, 즉 뎅기 바이러스 감염이 유행중인 지역으로 여행하는 사람과 그 지역의 거주자이다.
투여 경로는 백신 분야에서 통상적으로 사용되는 모든 경로이다. 투여 경로의 선택은 선택되는 제형에 따라 결정된다. 바람직하기로는, 면역성 조성물 또는 백신은 이롭게는 삼각근에 피하 경로를 통해 투여되는 주사용 조성물이다.
면역성 조성물 또는 백신내 LAV 또는 VDV, 특히 VDV1의 양은 바이러스 플라그 형성 단위(PFU) 또는 세포 배양 감염량 50%(Cell Culture Infectious Dose 50%, CCID50)의 투여량 형태로 일반적으로 표현할 수 있으며, 통례적인 약학 기법을 이용하여 측정할 수 있다. 예로, 본 발명에 따른 조성물은 10 내지 106 CCID50, 또는 103 내지 105 CCID50의 LAV 또는 VDV를 포함하는 투약 형태로 제조할 수 있으며, 예로, 일가 조성물의 경우 VDV1 균주 4 + 0.5 log10의 CCID50을 포함할 수 있다. 조성물이 다가 조성물일 경우, 바이러스 간섭 가능성을 낮추고 그에 따라 안정된 면역 반응(즉, 조성물에 포함된 모든 혈청형에 대한 면역 반응)을 달성하기 위하여, 투여된 백신에 존재되는 여러가지 뎅기 혈청형 각각의 양은 동등하지 않을 수 있다.
"면역유효량"은 섹션 4.1.2.2에 개시한 바와 같이 플라그 감소 중화 테스트 평가에 따라, 백신 접종자의 혈청내 중화 항체를 포함하여 특이적인 체액성 면역 반응을 유도할 수 있는 함량이며; 그에 따라 측정된 중화 항체 역가가 1:10 이상이거나 또는 1:10일 경우에 혈청에는 중화 항체가 존재하는 것으로 간주된다.
투여 부피는 투여 경로에 따라 변경될 수 있다. 피하 주사제의 부피는 약 0.1 ml 내지 1.0 ml, 바람직하기로는 0.5 ml일 수 있다.
조성물의 최적 투여 시간은 뎅기 바이러스에 최초 노출되기 전 약 1달 내지 3달이다. 본 발명의 백신은 뎅기 감염 위험성이 있는 성인이나 어린이를 대상으로 예방제로서 투여될 수 있다. 따라서, 표적이 되는 집단은 뎅기 바이러스에 노출된적 없는 사람 및 노출된 사람을 포함한다. 본 발명의 백신은 단회 투여로 투여될 수 있으며, 또는 선택적으로, 투여는 당업자가 적합하게 결정한 바에 따라 일차 접종한 다음 예컨대 2-6달 후 추가(booster) 접종으로 이루어질 수 있다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예를 들어 보다 상세히 설명된다.
도 1은 VDV1 프리-마스터(pre-master) 종균의 역사를 종합한 것이다.
도 2는 FILLED Product(일가) "즉시 사용가능한(ready to use)" 투약제를 만드는 개발 제조 경로를 요약한 플로우 차트이다.
도 3은 VDV1 게놈 맵을 개략적으로 표시한 것이다. 상위 화살 표시는 폴리단백질의 코딩 서열이다. 하위 화살 표시는 성숙형 펩티드의 코딩 서열이다. 수직 바는 야생형 뎅기 1 균주 16007과 LAV1 균주 사이의 뉴클레오티드 차이를 나타낸 것이다. 별 표시는 LAV1과 VDV1 사이의 뉴클레오티드 차이를 나타낸다.
도 4는 뎅기-1 바이러스 LAV1, VDV1, 및 균주 16007을 37 ℃에서 7일간 배양 한 후 플라그 크기를 분석한 것이다.
도 5는 뎅기-1 바이러스 LAV1, VDV1 및 균주 16007에 대한 플라그 크기 분포를 나타낸 그래프 분석도이다.
도 6은 플라비바이러스를 경험하지 않은 건강한 성인을 대상으로 VDV1 일가의 안전성을 평가하기 위한 실험 설계를 요약한 것이다.
실시예 1: 위생 처리
1.1 바이러스 RNA 정제
먼저, 백신 균주 DEN-16007/PDK10 또는 DEN-16007/PDK11(Sanofi Pasteur. Titer: 4.60 logTCID50/ml)의 초기 종균으로부터 직접 추출한 바이러스 RNA를 정제 및 형질감염시켜, LAV1의 위생 처리를 수행하고자 하였다. RNA 양을 103 내지 107 카피로 변경시키면서 상기한 방법으로 8번의 분석을 수행하였으나 실패하였다. 이에, RNA 추출 및 형질감염을 수행하기 전에 Vero 세포에서 1번의 순응 계대 배양을 수행하기로 하였다.
Vero 세포(Vero LS10 p142 내지 145)에, 마스터 종균 DEN-1/PDK11을 m.o.i 0.01로 감염시키고, 5일간 32℃에서 배양하였다. 배양 배지는 감염 배지(10mM MgSO4 함유)로 교체하였다. 투명한 세포 변성 효과가 그 다음날 관찰되었으며, 배양 상층물내 바이러스 RNA의 존재를 RT-PCR로 확인하였다. 배양 배지를 감염 8일째에 모으고, 동량의 냉동보호제를 포함하는 완충화된 수용액(pH= 7.5)으로 희석한 다음, 사용하기 전까지 -70℃에 냉동 보관하였다. 이 Vero-증폭된 바이러스를 DEN-1/V100라고 명하였다. 이의 감염 역가는 Vero 세포에서 결정하였으며, 그 결과 6.9 logTCID50/ml이었다.
RNA 정제 및 형질감염 과정은 하기와 같이 수행하였다. DEN-1 V100 현탁액을 ml 당 바이러스가 적어도 3 x 104 에서 최대 3 x 107 TCID50 또는 PFU로 함유되도록 희석하였다. DNA 또는 RNA 분자를 세포성 물질에서 분해시키기 위해, 윌리암 배지 0.01 ml에 희석시킨 벤조나제 1 unit를 바이러스 0.5 ml에 첨가하고, 이 용액을 교반기에서 2 시간동안 4℃에서 배양하였다. 배양 단계 후, 구아니듐 클로라이드, 용제(SDS) 및 베타-머캅토에탄올(RTL-bmercaptoethanol buffer, RNeasy Mini kit내 제공, Qiagen Ref. 74104)을 포함하는 변성 완충액 0.65 ml을 첨가하고, 페놀/클로로포름(1/1) (v/v)로 1번, 클로로포름(v/v)으로 1번 단백질을 추출한 다음, 실온에서 5분간 14,000 rpm으로 원심분리하였다. 각 추출 후, 경계면의 물질(백색 침전물)을 취하지 않도록 조심스럽게 수상을 모아, 깨끗한 1 ml 에펜도르프(eppendorf) 튜브로 이동시켰다. 이후, 잔류 용매를 제거하기 위해 제조사의 권고안에 따라 RNA 용액을 QIAgen 컬럼(RNeasy minikit, QIAgen)에 적용한 다음 0.06 ml의 뉴클레오티드 결핍성 물로 용출시켰다. 바이러스 RNA의 존재는 함량을 알고 있는 바이러스로 확립한 기준 곡선을 이용하여 정량적인 RT-PCR로 TCID50/ml로 확인하였다.
1.2 정제한 RNA 의 Vero 세포에 형질감염
형질감염은, 전하 상호작용을 통해 RNA에 조합하고, 세포 막 융합에 의해 복합체를 세포질내로 전이시키는 양이온성 지질들의 혼합물인 리포펙타민(LF2000 Reagent, Life Technologies)을 이용하여 수행하였다. LF2000 시약의 최적량은, 리포펙타민의 양을 증가시키면서(5 내지 20 ㎕), 16 내지 24시간 전에 접종한 Vero 세포의 배양(0.3- 0.5 x 106 세포/웰, 6웰 플레이트)에 의한 예비 실험으로 결정하였다. 이후, 세포를 4 - 5 시간동안 32℃ 및 5% CO2에서 배양하고, 배지를 FCS 무첨가한 새로운 배양 배지로 교체한 다음, 32℃에서 계속하여 철야 배양하였다. 독성(둥근 세포, 굴절성 세포 또는 부유성 세포, 세포 단일층의 동질성)을 도립 현미경으로 48시간동안 규칙적으로 체크하였다. 이러한 조건에서 무독한 리포펩타민의 최대량은 10 ㎕이었으며, 이를 RNA 형질감염에 사용 수치로 선택하였다.
정제된 RNA 조제물의 1/10(약 4 x 105 TCID50에 해당됨)을 사용하여 4세트의 형질전환을 동시에 수행하였다. 바이러스 RNA 용액 12 ㎕을 10 ㎕의 LF2000 시약(전하 상호작용을 통해 RNA에 조합하여, 세포 막 융합에 의해 복합체를 세포질내로 전이시키는 양이온성 지질들의 혼합물)을 포함하는 500 ㎕의 OptiMEM 배지(GIBCO)로 희석하였다. 효소 tRNA 200 ng을 4개의 반응물중 2개에 담체로서 첨가하였다.
4개의 형질감염 혼합물을 10분간 실온에서 침강되게 둔 다음 컨플루언트(confluent) Vero 세포가 있는 6웰 플레이트에 첨가하였다. 32℃에서 4시간 배양한 다음, 형질감염 혼합물은 버리고 세포를 PBS로 한번 헹구었다. 형질감염 후 배지(Williams, GIBCO) 3 ml을 첨가하여, 32℃에서 5일간 연속 배양하였다. 배양 배지는 뎅기 감염 배지(10 mM MgSO4이 첨가된 Williams) 3 ml로 교체하였다.
중간 정도의 독성 효과가 형질감염 24시간 후에 관찰되었고, 3일째에 사라졌다. 전형적인 세포 변성 효과(둥근, 굴절성 세포)는 모든 형질감염 분석에서 형질감염 6 내지 8일 후에 검출되었다. 이들 세포의 상층액내 바이러스 분비는 qRT-PCR로 확인하였다. 배양 유액(3 ml)을 형질감염 후 6일 및 8일째에 취하여, 모았다. 바이러스는 냉동보호제가 포함된 완충화된 수용액(pH=7.5) 6 ml로 희석한 다음 추가적으로 증폭시키기 전에 냉동시켰다.
형질감염으로 수득된 4개의 바이러스 용액은 (Vero 세포에 형질감염의 의미로)TV100, TV200, TV300 및 TV400로 명명하였으며, 이들은 유사한 감염 역가(하기)를 나타내었다:
TV100: 6.95 log TCID50
TV200: 6.80 log TCID50
TV300: 6.80 log TCID50
TV400: 6.85 log TCID50
참조로, 감염 효율은 tRNA의 존재하에 감염시킨 샘플에서 현저하게 증가되지는 않았다(TV300 및 TV400).
1.3 형질감염 후 회수한 바이러스의 특정화
DEN1-V100와 TV100 내지 400의 플라그 크기를 결정하였다. 간략하게, Vero 세포를 FBS가 4% 포함된 배양 배지중에 밀도 1,000,000 cells/cm2로 접종하였다. 철야 배양한 후, 배지를 제거하고, 세포에 바이러스 2배 또는 5배 연속 희석물을 감염시켰다. 1.5시간동안 37℃, 5% CO2에서 배양한 후, 접종원을 제거하고, 세포를 1.26% 메틸셀룰로스 및 10% FBS가 포함된 최소 이글 배지(MEM)에서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 11일간 배양한 후, 플레이트는 -20℃의 차가온 아세톤내에 20분간 방치하여, 2.5 ㎍/ml으로 희석시킨 플라비바이러스 특이 mAb를 이용하여 면역발색시켰다. 바이러스 플라그는 이미지 분석 소프트웨어(Saisam/Microvision)를 이용하여 측정하였다.
대조군으로서, DEN-1 16007 및 LAV1을 동시에 접종하였다. 데이타는 표 1에 나타낸다.
표 1: DEN-1 16007, LAV1, V100(형질감염 전) 및 TVX00(형질감염 후)의 플라그 크기
단계 바이러스 표현형
큰 플라그 작은 플라그
DEN1 16007(wt) Master Seed / PDK11 MS-16007/PDK11 Working Seed / PDK12 WS LST-22 BULK Seed /PDK13 D1-0010R1 42 0 0 91 0 84 0 188
Vero 증폭 V100 0 90
형질감염된 바이러스 TV100 TV200 TV300 TV400 0 115 1 90 0 92 0 107
Vero 세포에서 증폭시킨 V100 바이러스는 동질적인 소형 플라그(SP) 표현형을 나타낸다. 플라그는 여러가지 LVA1(<2 mm이 아닌 2-3 mm 직경) 샘플에서 관찰되는 것보다 약간 더 크다. 이러한 SP 표현형은 형질감염 후 회수한 바이러스들에서도 유지된다. 접종된 90개의 바이러스들 중 하나의 큰 플라그(LP)가 TV200 샘플에서 검출되었다. 그러나, 그 비율은 Vero 세포에서 단지 1회 증폭 계대 배양한 후 접종한 82개의 SP에서 10개가 LP로 바뀌었는데, 이는 LP 집단이 우성임을 시사한다.
참조로, 동시에 수행한 약독화에 중요한 위치의 서열 분석으로는 LAV1에 비해 형질감염된 바이러스에서 어떠한 돌연변이도 발견되지 않았다.
1.4 플라그 -정제
동질적인 SP 표현형을 보이는 DEN-1/TV100 바이러스 샘플을 플라그-정제용으로 선택하였다. 간략하게는, Vero 세포를 6웰 플레이트에 접종하고, 플레이트에 1 내지 20개의 플라그를 얻기 위해 바이러스 연속 희석물로 감염시켰다. 37℃, 5% CO2에서 1.5 시간 후에, 접종원을 제거하고 세포를 42℃에서 미리 열처리된 MEM-10% FCS로 이루어진 고형 배지를 42℃의 용해된 2% 아가와 즉시 혼합한 배지 3 ml하에서 배양하였다. 배지는 실온에서 플로우 후드 하에서 30분간 굳게 두었고, 플레이트는 뒤집은 상태로 10일간 32℃- 5% CO2에서 배양하였다. 0.01% 중성 레드가 보충된 동일 배지의 두번째 층을 적층한 다음, 플레이트를 32℃에서 하룻밤 더 배양하였다. 잘 고립되어 있는 작은 플라그 4개를 0.1 ml 팁이 장착된 마이크로파이펫을 이용하여 멸균 조건하에서 취하여, 0.2 ml의 MEM-4% FCS가 있는 멸균 튜브로 옮겼다. 이를 동일 배지로 연속 희석하여 혼합함으로써 현탁액을 균질하게 한 다음, 이를 바로 Vero 세포의 6-웰 플레이트 감염에 사용하였다. 프로토콜을 반복하여, 6개의 SP를 이차로 취하였다. 취한 각각의 플라그는 배지 1 ml에 희석하고, T25 cm2 플라스크에서 Vero 세포 증폭을 수행하였다. 감염 6일째에 배양 배지를 취하여, 동량의 냉동보호제가 함유된 완충화된 수용액(pH 7.5)으로 희석하고, -70℃로 냉동시켰다. 상기 단계 모두 32℃에서 수행하였다.
플라그-정제된 바이러스는 각각 DEN-1/TV111, DEN-1/TV112, DEN-1/TV121, DEN-1/TV131, DNE-1/TV132 및 DEN-1/TV141로 명명하였다. 감염 역가는 Vero 세포에서 결정하였다(하기 참조):
TV111 = 6.85 LogCCID50/ml TV112 = 6.80 LogCCID50/ml
TV121 = 6.80 LogCCID50/ml TV131 = 6.70 LogCCID50/ml
TV132 = 6.45 LogCCID50/ml TV141 = 5.70 LogCCID50/ml
Vero 세포에서의 이차 증폭을 3개의 클론 TV111, TV112 및 TV121로 수행하였다.
1.5 클로닝된 바이러스의 특정화
DEN-1/TV111, DEN-1/TV112, DEN-1/TV121, DEN-1/TV131, DEN-1/TV132 및 DEN-1/TV141 후보물질의 플라그 크기를 결정하였다. 특정 약독화 부위에 대한 점-서열분석을 수행하였으나, 돌연변이는 발견되지 않았다(표 2).
표 2: DEN-1 바이러스의 약독화 특이 위치의 서열분석
E NS1 NS3 NS4A NS4B NS5
단계/세포 바이러스 1323 1541 1543 1545 1567 1608 2363 2695 2782 5063 6048 6806 7330 9445
약독화 무/PGMK DEN-1 16007 T G A G A C A T C G A A A C
백신/PDK DEN-1 16007 /PDK-13 C A G A G T G C T A T G G T
이차 플라그 정제/Vero TV111 C A G A G T G C T A T G G T
TV112 C A G A G T G C T A T G G T
TV121 C A G A G T G C T A T G G T
TV131 C A G A G T G C T A T G G T
TV132 C A G A G T G C T A T G G T
TV141 C A G A G T G C T A T G G T
Pre-master seed/Vero VDV1 (Vero-6) C A G A G T G C T A T G G T
뉴클레오티드 위치는 각 유전자 하기에 나타내며, 서열번호 2의 DEN-1 16007 균주를 참조한다.
이들 클론들을 구별할 수 있는 어떠한 다른 기준이 없어, TV121을 VDV1에 대한 프리-마스터로 임의로 선정하였다.
결론적으로, Vero 세포에서 총 6번의 계대 배양을 수행하여 최초 DEN-1 16007/PDK11 약독화된 균주를 순응 및 클로닝하였다. 바이러스 RNA를 정제하여 산업 적용에 맞는 조건으로(환경 조절, 원재료(raw material) 및 실험의 추적가능성, 동물 유래 산물에 대한 분석 증명) Vero 세포에 형질감염시켰다. Vero-순응된 균주를 플라그 정제에 의해 클로닝하여, Vero 계대 배양 횟수 6번만에 VDV1 백신 후보물질의 프리-마스터 종균을 제조하였다.
LAV1과는 달리, VDV1은 동질적인 소형 플라그 크기의 표현형을 나타낸다. 게다가, 약독화 특이 위치에서는 돌연변이가 확인되지 않았다. 또한, 벌크 VDV1 완전 서열 및 표현형 테스트를 수행하여, 특정화를 수행하였다.
실시예 2: 서열분석
하기 전략에 따라 바이러스의 전체 서열을 제조하였다. VDV1-함유 샘플을 출발물질로, 게놈 RNA을 추출 및 정제하고 cDNA로 역-전사하였다. 이후, cDNA로부터 각 PCR 산물의 양 말단에 서열분석 테그를 첨가하여, 중첩성 PCR 증폭을 수행하였다. 각각 모든 서열을 자동 장치에서 제조한 다음, 분석하였다. 다음 단계로, 개별 서열 모두를 다중 정렬하여 게놈의 재구축을 수행하였다. 이때, 기준 서열 대비 각각의 예상하지 못했던 뉴클레오티드 변화는, 초기 데이타(raw data)로 다시 되돌려, 조심스럽게 재 분석하였다. 이러한 변화는 새로운 PCR 산물로 수행한 다른 서열에 의해 시스템적으로 검증하였다. 애매한 부분이 모두 해결되면, 바이러스의 게놈 서열분석을 완료하고, 새로운 분자는 Vector NTi 데이타베이스에 등록하였다. 이는, 다중 서열 정렬에 의한 게놈간 분석에 사용할 수 있다.
2.1 재료
2.1.1 바이러스
본원에서 참조되는 바이러스는 DEN-1 16007; LAV-1/PDK13; VDV1이며, 이들의 서열은 첨부된 서열 목록에 기재되어 있다. 이들 바이러스의 전체 게놈 서열은 10735개의 뉴클레오티드로 이루어져 있다.
2.1.2 프라이머
모든 프라이머는 프라이머 디자인 모듈인 Seqweb bioinformatics package (Accelrys)로 설계하였다(표 3)
표 3: RT-PCR 및 프라이머 서열 리스트
명칭 프라이머 서열(서열번호) NtStart NtEnd 프라이머 길이 RT - PCR 길이 중첩
D1 01 + GTTTTCCCAGTCACGACtacgtggaccgacaagaacag (4) 12 32 38 897 -32
D1 01 - AACAGCTATGACCATGggatggagttaccagcatcag (5) 928 908 37 201
D1 02 + GTTTTCCCAGTCACGACtgaacaccgacgagacaaac (6) 688 707 37 892
D1 02 - AACAGCTATGACCATGaggtccaaggcagtggtaag (7) 1598 1579 36 173
D1 03 + GTTTTCCCAGTCACGACttggaaatgagaccacagaac (8) 1386 1406 38 885
D1 03 - AACAGCTATGACCATGgaaacaccgctgaacaaaac (9) 2289 2270 36 146
D1 04 + GTTTTCCCAGTCACGACggttcaagaagggaagcag (10) 2106 2124 36 903
D1 04 - AACAGCTATGACCATGttctatccagtaccccatgtc (11) 3028 3008 37 183
D1 05 + GTTTTCCCAGTCACGACcagaataccaccttcatcatcg (12) 2804 2825 39 868
D1 05 - AACAGCTATGACCATGttcccatccccatcttgtc (13) 3689 3671 35 232
D1 06 + GTTTTCCCAGTCACGACggaaatcagaccagtcaaggag (14) 3418 3439 39 913
D1 06 - AACAGCTATGACCATGtgttgtgtgaggcaccagag (15) 4349 4330 36 233
D1 07 + GTTTTCCCAGTCACGACgcaaaccactaaccatgtttc (16) 4077 4097 38 901
D1 07 - AACAGCTATGACCATGccacttgttgtcaccactc (17) 4995 4977 35 259
D1 08 + GTTTTCCCAGTCACGACccaagggaagagactggaac (18) 4699 4718 37 908
D1 08 - AACAGCTATGACCATGtcctgatttgatgcttggaac (19) 5626 5606 37 210
D1 09 + GTTTTCCCAGTCACGACaagcacattttaccgatccag (20) 5376 5396 38 900
D1 09 - AACAGCTATGACCATGgtcgtagtttctttctttctccttc (21) 6299 6275 41 182
D1 10 + GTTTTCCCAGTCACGACgcaatagacggggaatacag (22) 6074 6093 37 809
D1 10 - AACAGCTATGACCATGatgatggtggttttcagcag (23) 6901 6882 36 138
D1 11 + GTTTTCCCAGTCACGACgtgttgcttattccagagcc (24) 6725 6744 37 877
D1 11 - AACAGCTATGACCATGgctgtcttttccatttttctcc (25) 7622 7601 38 228
D1 12 + GTTTTCCCAGTCACGACactttgcacatcacagatcc (26) 7354 7373 37 821
D1 12 - AACAGCTATGACCATGttcgcactagcattcctcc (27) 8192 8174 35 175
D1 13 + GTTTTCCCAGTCACGACcacctgagaaatgtgacacc (28) 7980 7999 37 907
D1 13 - AACAGCTATGACCATGtttccttgtttatgaagctccc (29) 8907 8886 38 207
D1 14 + GTTTTCCCAGTCACGACcaaaagcgaaacgaggcac (30) 8661 8679 36 894
D1 14 - AACAGCTATGACCATGgtttcaccacacagtcatctcc (31) 9575 9554 38 221
D1 15 + GTTTTCCCAGTCACGACagaccagcgaaaaatggaac (32) 9314 9333 37 865
D1 15 - AACAGCTATGACCATGtcccaatgagccttctcac (33) 10196 10178 35 262
D1 16 + GTTTTCCCAGTCACGACgctaatgctatctgttcagcc (34) 9896 9916 38 812
D1 16 - AACAGCTATGACCATGtgattcaacagcaccattcc (35) 10726 10707 36 -28
D1 16i + ccatggaagctgtacgc (36) 10480 10496 17
D1 16i - gagacagcaggatctctgg (37) 10671 10652 19
2.2 방법
2.2.1 바이러스 RNA 정제
이전의 실험에서, 다음 단계에서 RT-PCR 양성 반응을 얻는데에는 최소 1000 DICC50이 필요하였다. 이는, 바이러스 최소 역가 104 DICC50/mL이 필요하다는 것을 의미한다. 바이러스 게놈 RNA를 제조사의 권고안에 따라 QIAamp 바이러스 RNA 미니 키트(Qiagen)로 정제하였다. 간략하게는, 바이러스 조 샘플 중 140 ㎕을 라이시스 용액 존재하에 배양하여, 키트 컬럼에 주입하였다. 세정한 다음, RNAse 저해제(RNAse Out, Sigma) 1 ㎕ (40 units)가 함유된, 뉴클레아제 결핍성 멸균수 60 ㎕로, 정제된 바이러스 RNA를 용리시켰다.
2.2.2 역전사
바이러스 RNA를 ABGene사의 역전사효소(reverse iT)를 사용하여 cDNA로 역 전사하였다. 즉, 10 ㎕의 정제된 RNA를 최종 반응 부피 20 ㎕로 표준 조작 조건을 적용하였다. 반응은 (-) 가닥 프라이머의 혼성화로 개시하였다. PCR 당 한번의 RT 반응을 수행하였다(표 1). cDNA 합성은, 47℃에서 45분간 인큐베이션하여 수득하였다.
2.2.3 PCR
모든 PCR은 표 1의 16쌍의 프라이머 (+) 및 (-)를 이용하여 연장된 고정확성 PCR 시스템(Expand High Fidelity PCR system, Roche diagnostics)으로 수행하였다:
RT 2㎕
10x 완충액 2.5㎕
dNTP mix (10mM) 2㎕
프라이머 각 0.8㎕
물 16.4㎕
효소 0.5㎕
PCR 프로그램
변성: 94℃, 2 분 -> (변성: 94℃, 15 초 -> 혼성화: 55℃, 30 초 -> 연장: 68℃, 1 분): 40회 -> 연장: 68℃, 5 분
모든 PCR 산물은 아가로즈 젤상에서의 전기영동으로 관리되었다.
2.2.4 서열분석
서열분석 반응 대부분은 Genome Express 사에서 실시하였다. 게놈 양극단, 모호한 부분, 일부 인터-PCR 정션 및 기술적인 이유로 Genome Express에서 분석되지 않는 영역은 사내에서 수행하였다.
- Genome Express에서의 서열분석: PCR 산물은 +4℃에서 취급하였고, 서열분석 결과는 서열 정보 파일로 수득하였다. 텍스트 파일, 정성 파일 및 크로마토그램을 각 개별 서열에 대해 이용가능하다. 서열 정렬을 수행한 후, 크로마토그램상에서 일치되지 않는 부분을 모두 체크하고, 서열 알고리즘 에러로 파악되는 것은 보정하였다.
- 사내 서열분석: 서열 반응은 Sequitherm Excell II LC kit (Epicentre)를 이용하여 써모사이클러 PTC-200(MJ Research)으로 수행하였다. 각 PCR 산물은 단일 반응으로 독립적으로 양쪽 가닥을 서열분석하였다. 반응물은 서열 전기영동 젤에 로딩하였다. 전개 및 서열 분석은 자동 서열분석기인 Gene ReadIR 4200 (Li-Cor)에서 수행하였다.
- 서열분석 반응물
DNA 최대 200/250 ng
반응 완충액 7.2㎕
프라이머(1-2 pM) 각 1.5㎕
효소 1㎕
물 최종 부피 20㎕으로 잔량 첨가
PCR 프로그램
변성: 92℃, 2분 -> (변성: 92℃, 15 초 -> 혼성화: 50℃, 30 초 -> 연장: 70℃, 1 분): 30회 -> 연장: 70℃, 10 초
변성/로딩 완충액 3 ㎕을 첨가한다.
샘플의 변성은 95℃에서 3분간 수행하고 샘플 로딩 전까지 얼음에서 냉각시킨다.
-서열분석을 위한 전기영동
전기영동 파라미터:
전압 1500 V
전류 35 mA
전력 40 W
수행 시간 9시간
젤 파라미터:
젤의 길이 41 cm
젤의 두께 0.2 mm
온도 45℃
스캔 속도 3
2.3 결과
모든 PCR 단편은 테일이 부가된 일반 PCR, 즉 모든 프라이머의 5' 말단에 부가된 특이적인 모티프를 이용하여 양 말단으로부터 서열분석하였다.
5' 프라이머: M13SEQ-GTTTTCCCAGTCACGAC (서열번호 38)
3' 프라이머: M13REV-AACAGCTATGACCATG (서열번호 39)
M13-SEQ 및 -REV 서열은 보편적인 M13 프라이머 모티프(New England Biolabs references)에 상응한다.
마지막 단편 조립(contig assembly)을 위해, ContigExpress module (Informax)의 Vector NTi에서 신속한 분석을 수행하였다. LAV1 기준 서열을 각 서열분석 결과 모두와 비교하였다. 그 결과, 일부 영역에 단편 조립이 여전히 없을 경우에도 모든 결과는 전체 게놈에서 우측으로 정렬되었으며, 이는 전체 게놈 정렬을 신속하게 보여준다.
2.3.1 완전한 VDV1 서열 조립
최종 서열 정렬을 Vector NTi, AlignX module (Informax)에서 수행하였다. 고전적인 다중 서열 정력 알고리즘 ClustalW(Thompson et al., 1994)을 소프트웨어로 구동하여, 전체를 정렬하였다. 모든 서열 결과를 LAV1 기준 서열과 함께 정렬하였고, 그 결과 게놈을 보다 잘 재구축할 수 있었다. 기준 서열에 대해 나타나는 모든 서열 차이는 다른 독립적인 서열 반응으로 검증하여야 한다. VDV1의 전체 서열은 서열번호 1로 나타낸다.
일부 모호한 부분이 단일 서열, 특히 양 말단 근처 서열에서 나타났다. 이는 PCR 단편의 양 말단에서의 일부 반응 불량이 본래 있는 곳이다. 이러한 정성적으로 불량한 서열은, 다른 2가지 서열 반응을 다른 PCR 산물로부터 입수가능할때까지, 정렬에서 제외시켰다. 적어도 2개 이상의 독립적인 다른 PCR 서열에서 일치되는 것으로 확인되지 않는 경우에는, 기준 서열과의 차이나는 부분은 최종 정렬에 참작하지 않았다. 역으로, 2개의 독립 서열에서 확인된 모든 차이는 최종 서열에 나타내었다.
표 4는 각 개별 서열 반응의 특징을 총괄한 것으로, 개시부, 종결부 및 길이를 표시하고 있다. 인접한 PCR 산물간의 중첩과 기준 서열과의 차이를 마지막 열에 나타낸다.
표 4: 뎅기 VDV1의 개별 서열 특징
명칭 개시 종결 크기 중첩 코멘트
D1 01 + 35 921 886 0
D1 01 - 899 33 866 209
D1 02 + 712 1596 884
D1 02 - 1569 713 856 196
D1 03 + 1415 2277 862
D1 03 - 2253 1400 853 160
D1 04 + 2133 3027 894 2719 G>A (NS1-100 s)
D1 04 - 3000 2117 883 212 2719 G>A (NS1-100 s)
D1 05 + 2834 3681 847
D1 05 - 3654 2815 839 247
D1 06 + 3451 4332 881
D1 06 - 4325 3434 891 243
D1 07 + 4113 4987 874
D1 07 - 4961 4089 872 245
D1 08 + 4742 5564 822
D1 08 - 5583 4742 841 183
D1 09 + 5400 5916 516
D1 09 - 6274 5758 516 197 5962 C>A ( NS3 -481 N>K); 2개의 서열
D1 10 + 6114 6868 754
D1 10 - 6883 6077 786 135
D1 11 + 6761 7504 743
D1 11 - 7597 6733 864 217
D1 12 + 7381 8034 653 7947 A>G (NS5-125 K>R)
D1 12 - 8143 7380 763 141 7947 A>G (NS5-125 K>R)
D1 13 + 8003 9730 727
D1 13 - 8857 8002 855 182
D1 14 + 8687 9472 785
D1 14 - 9544 8675 869 200
D1 15 + 9344 10170 826
D1 15 - 10162 9399 763 253
D1 16 + 9917 10261 344 2개의 서열
D1 16 - 10706 10394 312 0
D1 16i + 10500 10706 206
D1 16i - 10649 10204 455
cDNA 합성 및 PCR DNA 반응에 게놈 말단에 상보적인 올리고뉴클레오티드가 필요하기 때문에, 게놈의 양 말단은 PCR 증폭으로 서열분석할 수 없었다. 증폭 단계 동안에, 이들 올리고뉴클레오티드를 PCR 단편으로 병합하였다. 서열 결과는 합성 올리고뉴클레오티드의 결과이며, 바이러스 그 자체의 서열 결과는 아니다. 바이러스 게놈의 양 말단으로부터의 PCR은 적절하게 수행되었는데, 이는, 바이러스 서열이 올리고뉴클레오티드 서열과 크게 다르지 않음을 시사한다(크게 다를 경우, PCR 증폭은 실패하거나 적어도 불량하게 수행된다). 게놈의 양 말단은 다른 PCR 증폭산물들에서 구별할 수 없었다. 그래서, 재구축한 게놈(서열번호 1)에서, 게놈의 양쪽 말단을 올리고뉴클레오티드 서열과 동일한 것으로 간주하였다(그리고, 기준 서열과 동일한 것으로 간주함). 5' 말단의 서열은 뉴클레오티드 1 - 34이다. 3' 말단의 서열은 뉴클레오티드 10707-10735이다.
2.3.2 서열 비교
VDV1 균주와 LAV1 기준 균주 사이의 직접적인 서열 비교로, 3개의 뉴클레오티드 차이가 나타났다. 표 5는 이들 위치를 모두 나타낸다.
표 5: LAV1와 VDV1 균주간의 서열 비교
뉴클레오티드 아미노산
Nt 위치 LAV1 VDV1 영역 AA 위치 LAV1 VDV1 주석
2719 G A NS1 100 G G 침묵
5962 C A NS3 481 N K
7947 A G NS5 125 K R
2719번의 뉴클레오티드 변동은 아미노산 수준에서 침묵으로 나타난다. 5962번의 두번째 차이는 NS3-481에서의 아미노산 변동(아스파라긴에서 라이신으로)을 촉발시킨다. 이들 둘다 친수성이지만, 라이신은 양으로 하전되어 있지만, 아스파라진은 그렇지 않다. 마지막 차이는 NS5 펩티드에 위치되어 있는데, NS5-125에서 라이신이 아르기닌으로 치환되어 있다. 이러한 아미노산 치환은 화학 측면에서는 비교적 온건한 것으로, 아르기닌과 라이신 모두 친수성이며, 양으로 하전되어 있다.
표 6: 그외 뎅기 1 균주에서의 불일치 검색
VDV1 균주에서의 뉴클레오티드 위치 동일한 뉴클레오티드를 공유하는 균주의 수
2719 24/40
5962 6/40
7947 1/40
이용가능한 모든 Genbank 혈청형 1 뎅기 게놈 서열들간에 서열 정렬을 수행한 경우, 확인된 차이 대부분은 다른 균주에도 존재하는 것으로 나타났다(표 6 참조). 한 곳(위치 7947; NS5-125)은 VDV1 균주에 특이적이었다,
따라서, 뎅기 바이러스의 VDV1 균주의 전체 게놈 서열을 확립하였다.
모균주인 LAV1의 게놈 서열과 차이나는 3개의 뉴클레오티드를 검출하였다. VDV1 백신 균주는 바이러스 "위생처리" 및 개에서 원숭이 세포로의 계대 배양을 통해, LAV1으로부터 파생된 것이다.
LAV1과 VDV1 간의 차이 발생에는 여러가지 원인이 있을 수 있다. 첫째, 클로닝 단계에서, LAV1에서 이미 검출된 다수의 서열과 100% 동일하지 않는 바이러스 하위집단이 선정될 수 있다. 둘째로, LAV1은 PDK 세포에서 생산되지만, VDV1은 Vero 세포에서 만들어진다. 이러한 개에서 원숭이 세포로의 계대 배양은 새로운 세포주에 순응하도록 바이러스 변화를 선호적으로 유도한다. 세번째로, 모든 RNA 바이러스의 경우, 정확성(fidelity)이 보다 낮은 바이러스의 RNA 중합효소는 DNA 중합효소에 비해 게놈에 돌연변이를 일으킬 확률이 더 높다.
단지 아미노산 2개의 치환에 해당되는, LAV1와 VDV1 간의 서열 3개만 다른 것으로 관찰되었다. LAV1 바이러스 약독화와 연계되는 14개의 뉴클레오티드 위치 모두 VDV1에 보존되어 있었다. 또한, 마스터와 벌크 VDV1의 서열을 비교하였다(표 7).
표 7: 야생형 3 16007 균주와 약독화된 LAV1/PDK13 및 VDV1 균주간의 뎅기1 뉴클레오티드 차이
바이러스 1323/E-130 1541-3/E-203 1545/E-204 1567/E-211 1608/E-225 2363/E-477 2695/NS1-92 2719/NS1-100 2782/NS1-121 5063/NS3-182 5962/NS3-481 6048/NS3-510 6806/NS4a-144 7330/NS4b-168 7947/NS5-125 9445/NS5-624
DEN-1 16007 T GaA G A C A T G C G C A A A A C
Val Glu Arg Gln Ser Met Asp Gly Ala Glu Asn Tyr Met Gln Lys Ser
LAV1/ PDK13 C AaG A G T G C G T A C T G G A T
Ala Lys Lys Gln Leu Val Asp Gly Ala Lys Asn Tyr Val Gln Lys Ser
VDV1 Master C AaG A G T G C A T A A T G G G T
Ala Lys Lys Gln Leu Val Asp Gly Ala Lys Lys Tyr Val Gln Arg Ser
VDV1 Bulk C AaG A G T G C A T A A T G G G T
Ala Lys Lys Gln Leu Val Asp Gly Ala Lys Lys Tyr Val Gln Arg Ser
전체 VDV1 마스터 종균의 서열을 벌크 서열과 정렬하였다. 두 서열간의 차이는 관찰되지 않았는데, 이는 계대 배양에서의 유전자 안정성을 시사한다.
VDV1은 이의 모균주 LAV1에 대해 상당한 유전자 안정성을 보인다.
실시예 3: 특정화
본 연구의 목적은 계대 배양을 통해 약독화 마커 변화가 발생되는지를 분석하기 위한 것이었다.
도 2에 나타낸 플로우 차트는 Filled Product(일가), "즉시 사용가능한" 투약제를 만드는 개발된 제조 공정을 요약한 것이다.
간략하게, 연구부서에서 전달받은 바이러스 프리-마스터 종균의 Vero 세포에 서 2회 연속 계대 배양한 후, 해당 작업 종균을 수득하였다. 최종 바이러스 배양은, Vero 세포 현탁물의 감염에 의해 수행되었다. 생산된 바이러스를 회수하였다. 데옥시리보뉴클레산(DNA)를 효소 처리로 분해하였다. 불순물은 초여과로 제거하였다. 감염 역가는 농축 단계에 의해 증가되었다. 냉동보호제를 포함하는 완충화된 수용액(pH= 7.5)을 첨가하고, 이 0.22 ㎛ 여과한 혼합물을 동일 용액내 표적 투여량으로 희석하였다. 이후, 활성 물질은 유리 바이얼에 넣고, 냉동 건조하여, 사용전까지 보관하였다.
3.1 표현형 마커
그 결과는 표 8에 나타낸다. 검증된 테스트를 마스터 종균과 벌크를 대상으로 수행하였다:
플라그 크기: 분석은 7일간 배양한 후 Vero 세포에서 37℃에서 실시하였다. 플라그의 사이즈 측정은, 비디오 카메라로 이미지를 포착한 후 Saisam v.5.2.0 (Microvision Instruments) 전용 소프트웨어로 수행하였다. 대부분의 집단은 매우 작았다. Vero 세포에서 순응시키고 생물학적으로 클로닝한 후, VDV1 플라그의 크기 분포는 동질적인 것으로 나타나, 집단의 98% 이상이 직경 0.8 mm로 집중되는 하나의 피크를 나타내었다. 이들 플라그는 DEN-1 16007 바이러스로 수득한 플라그와 확연하게 차이가 난다(도 4및 5 참조).
온도 민감성: 일가 1은 온도 둔감성(Ts) 야생형(WT) D1-16007에 비해, 39℃에서 명확한 제한적인 성장을 보인다. 이는, 감염 역가 분석 및 바이러스 RNA 정량 둘다에 의해 입증되었다. 일가 1 종균의 마스터, 벌크 및 계대 배양 18(벌크 계대 후 18회 계대 배양)은 39℃에서 37℃에 비해 역가의 90% 또는 그 이상의 감소를 보인다.
표 8: DEN-1 바이러스의 표현형 요약
　 온도 민감성 (39℃에서의 역가 감소율%)Fold - reduction 신생 Swiss Webster 마우스에 대한 신경독성
바이러스 스코어 3일 4일 5일 6일 사망율n * AST (S.D.)
D1-16007 - 62.12.6 59.32.5 56.32.3 (-28.5-1.4) 6.25%16 19.0 (0.0)
D1-PDK13 + 87.17.8 91.3 11.5 95.5 22.2 96.5 28.6 0.00%16 n.a.
VDV1 MS + 97.2 35.7 97.7 43.5 98.8 83.3 99.5 200.0 0.00%16 n.a.
*n: 동물의 수
3.2 유전자형 마커
VDV1 백신 균주는 게놈 수준에서 모 균주와 구별할 수 있다. 약독화-특이 위치가 동정되었다. 이러한 위치는 마스터 및 벌크 종균에 보존되어 있다.
실시예 4: 원숭이에서의 면역성, 바이러스 혈증 및 독성
원숭이에게서 수득할 수 있는 대부분의 실제 수많은 데이타는 면역성 및 바이러스 혈증에 대한 것이다. 특히, 바이러스 혈증은 인간에서의 유독성 및 질환 중증도과 관련있는 인자들중 하나로서 식별되고 있으며, 고려할 중요 파라미터이다. 명확하게는, 면역성은 백신 테스트시 중요한 파라미터이다.
본 발명자들은 바이러스 혈증 및 면역성에 대한 최저/최대값을 확립하였다.
표 9: 플라그 분석에 의해 Vero 또는 LLC-MK2 세포에서 측정된 바에 따른, 원숭이에서 뎅기 백신 후보물질에 의해 유도된 반응에 대한 최소 요건(이들 세포는 이러한 분석에서 등가로 간주됨)
바이러스 혈증의 평균 지속 기간 (일) (모든 혈청형을 고려함) 바이러스 혈증의 평균 최고 역가 (log 10 pfu) (모든 혈청형을 고려함) 평균 중화 역가 30 일 (각 혈청형에 대해) PRNT 50
≤ 3 일 ≤ 1.5-2 ≥ 80
pfu: 플라그 형성 단위
PRNT 50: 플라그 감소 중화 역가 50(플라그의 수를 50% 감소시키는 역가)
4.1 재료 및 방법
4.1.1 원숭이 실험
원숭이 실험을 유럽의 동물 실험 가이드라인에 따라 수행하였다.
면역화는 Mauritius (CRP Le Vallon)에서 기원된 시노몰러스 원숭이(Macaca fascicularis)를 대상으로 수행하였다. 원숭이는 면역화하기 전에 Sanofi Pasteur의 동물 실험실에서 6주간 격리시켰다.
원숭이의 팔에 백신 0.5 ml을 피하(SC) 경로로 백신 접종하였다(해당 섹션 참조). 케타민(Imalgene, Merial)으로 간단하게 마취시킨 후, 서혜부 및 복재 정맥의 천공에 의해 채혈하였다. 0일 및 28일째에, 혈액 5 ml을 항체 반응 평가를 위해 샘플링하였고, 2일 내지 10일 사이에 혈액 1 ml을 바이러스 혈증 평가를 위해 샘플링하였다. 혈액을 얼음 위에서 모은 다음 혈청이 분리될때까지 얼음 위에 두었다. 혈청 분리를 위해, 혈액을 20분간 4℃에서 원심분리하고, 혈청을 채집하여 Rich Kinney's laboratory에서 테스트할 때까지 -80℃에 보관하였다. 미국으로 이송시 드라이아이스에서 유지시켰다.
4.1.2 바이러스 혈증 및 중화 항체 반응( 플라그 감소 중화 테스트, PRNT )
모든 분석은 미국의 포트 콜린스 CDC의 R. Kinney 실험실에서 수행하였다. 혈청 샘플을 -80℃로 유지하여 이송시키고 테스트할 때까지 상기 온도로 저장하였다. 일차 해동시, 샘플은 바이러스 혈증에 대해 테스트하였고, 혈청을 1:5로 희석시켰다. 1:5 혈청 희석물은 중화 항체 테스트하기 전에 56℃에서 30분간 불활화하였다.
4.1.2.1 바이러스 혈증
0.125 ml의 혈청을 96웰 플레이트의 첫번째 웰내 희석물 0.125 ml(RPMI medium)에 넣고, 각 희석으로 0.025 ml을 0.225 ml로 이동시켜 10배 연속 희석을 수행하였다. 0.2 ml의 100.3-105.3 연속 희석물을 6웰 플레이트의 Vero 세포에 넣었다(바이러스는 37℃에서 1.5시간동안 흡착시키고, 아가로스가 무첨가된 중성 레드 4 ml을 적층한 다음 중성 레드가 함유된 아가로스 2 ml을 6-7일 후에 적층하여, 플라그의 수를 측정함). 바이러스의 검출 한계는 10 PFU/ml이었다. 대조군으로, 스톡 DEN-16007 PDK-13 (LAV1) 백신을 접종하였다.
4.1.2.2 PRNT ( 플라그 감소 중화 테스트)
중화 항체를 Huang et al.(2000)에 개시된 바에 따라 정량하였다. 간략하게는, 0.2 ml의 열에 의해 불활화한 1:5 혈청 희석물을 96웰 플레이트의 첫번째 웰에 넣고, 각 희석으로 0.1 ml을 희석물(RPMI 배지) 0.1 ml에 이동시켜 2배 연속 희석을 수행하였다. 그 결과 1:10 - 1:320의 혈청 연속 희석물이 제조되었다. 0.1 ml의 DEN 바이러스(60-160 PFU; 모균주 DEN1 16007 바이러스)를 혈청-바이러스 혼합 물의 최종 부피 0.2 ml로 각 혈청 희석물이 있는 웰에 첨가하였다. 96웰 플레이트는 4℃에서 철야 배양하였다. 0.1 ml의 혈청-바이러스 혼합물(첨가한 바이러스가 30-80 PFU로 포함됨)을 6웰의 Vero 플레이트에 접종하고(바이러스 혈증 섹션에 기재된 내용 참조), 중성 레드로 염색하여 플라그 수를 측정하였다. 2배, 1배 및 0.5배 테스트 농도로 첨가한 바이러스의 여러가지 백 역가 확인(multiple back titration)으로, 50% (PRNT50) 및 70% (PRNT70) 종말점 항체 역가를 결정하는 기준인, 주입 PFU의 직접적인 실험치를 결정하였다. 네거티브 혈청 결과는 중화 항체 역가가 < 1: 10이어야 한다. 중화 역가 320을 보이는 혈청은 종말점 역가 결정을 위해 1:80 - 1:2560 희석물에서 재분석하였다.
4.2 VDV 후보물질의 평가
4.2.1 VDV 1/ 프리 -마스터
D1 후보물질의 정제/선정은 실시예 1에 기재된 바에 따라 수행하였다. (표현형 마커 및 서열을 토대로) 선정된 클론을 재료 및 방법(Marcy lI'Etoile animal facility, I15)에 개시된 바와 같이, sanofi pasteur에서 CRP Le Vallon, Mauritius 기원의 시노몰구스 마카크 수컷(Macaca fascicularis , 평균 체중 3.1 kg)을 대상으로 테스트하였다.
D0에 면역화한 다음, D2 내지 D10 동안 바이러스 혈청을 조사하였고, D0 및 D28에 면역성을 측정하였다. 바이러스 및 백신은 액체 형태로 사용하는 경우 모두 -70℃에서 유지시켰다.
LAV1 : 역가　: 103,9 DICC50 / ml; 동결건조하고, 0.5 ml의 PBS(Ca2 + 및 Mg2 +; CaCl2.2H2O 0.133 g/l; MgCl2.6H2O, 0.1g/l 함유)에 재현탁한 다음 모두 투여함.
프리 -마스터 VDV1 DEN1-TV111 : 역가　: 105,9 DICC50 /ml; 액체, PBS(Ca2 + 및 Mg2+; CaCl2.2H2O 0,133 g/l; MgCl2.6H20, 0,1g/l 함유)에 105,3 pfu/ml로 희석하고, 0.5 ml 투여함.
23G1 바늘로 VDV1을 105 DICC50 투여량으로 팔에 피하 주사하였다.
결과는 표 10에 나타낸다. 28일째의 역가 확인은 3배수(PRNT 70) 또는 이배수(PRNT 50)로 수행하였다.
표 10: VDV1 프리-마스터의 면역성
AvP 일가 VDV1 (Exp A) DEN 원숭이 실험(F. Mi.DEN003.Si) : PRNT와 바이러스 혈증 결과
중화 항체 역가 바이러스 혈증(PFU/ml, Vero 세포)
혈청 그룹 (-15)일 28 일 -15일 2일 3일 4일 5일 6일 7일 8일 9일 10일
PRNT70 PRNT50 PRNT70 PRNT50
AD 333 LAV DEN-1 <10/<10 <10 320/160/160 160/320 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AC 763 <10/<10 <10 640/640/640 1280/1280 0 0 0 0 0 0 0 0 50 150
AD 209 <10/<10 <10 320/160/160 160/320 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AC 755 <10/<10 <10 160/80/160 160/160 0 0 0 0 0 0 50 0 0 0
AC 775 VDV DEN-1 <10/<10 <10 160/80/80 160/160 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AC 881 TV111 <10/<10 <10 20/10/10 20/20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AD 145 <10/<10 <10 320/80/80 160/80 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AD 113 <10/<10 <10 20/10/10 20/20 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
바이러스 Exp#1 Exp#2 Exp#3
DEN-1 112PFU 45PFU 101PFU
간략하게는, 반응들은 각 그룹에서 다소 동질적이었으며, 각 구조체에서 일부 명백한 경향을 파악할 수 있었다. VDV1와 LAV1 간에 현저한 차이는 발견되지 않았다: 일부 LAV1 원숭이에서 낮은 및 후기 바이러스 혈증이 관찰되었다. VDV1에서는 만족스러웠으며, 특히 바이러스 혈증이 없었다.
4.2.2 VDV 1 벌크
백신의 면역성을 프리-마스터 단계에서 테스트하였기에, 벌크 단계에서 각 일가를 테스트하기 위한 추가적인 실험을 설계하였다.
C.R.P. Le Vallon, Ile Maurice 기원의 마카카 파시큘라리스(Macaca fascicularis) 원숭이 수컷을 상기와 같이 사용하였다(24마리의 원숭이, 평균 체중 3.4 kg).
VDV1; 배치: 역가　: 8.37 log10 DICC50 /ml
위약: Ca2 + 및 Mg2 +이 포함된 PBS
백신을 (Ca2 + 및 Mg2 +; CaCl2.2H2O 0.133 g/l; MgCl2.6H2O, 0.1g/l 포함된) PBS에 105.3 DICC50 /ml로 희석하고, 23G1 바늘로 팔에 투여량 105 DICC50에 해당되는 0.5 ml을 투여하였다.
바이러스 혈증 및 면역성을 R Kinney에 의해 CDC에서 측정하였다. 그 결과는 표 11에 나타낸다.
VDV1 일가 백신은 현저한 면역 반응을 유도하지만 바이러스 혈증은 없었다. 따라서, 이 일가 VDV1은 원숭이에게서 최초로 규정된 성공 기준을 만족시켰다.
표 11: VDV 벌크 VDV1 면역성 및 바이러스 혈증
원숭이 실험(F.MI.DEN004.Mk) : 일가 및 4가 VDV1
중화 항체 역가 바이러스 혈증(PFU/ml, Vero 세포)
원숭이 그룹 (-14)일 28일 -14일 2일 3일 4일 5일 6일 7일 8일 9일
PRNT50 PRNT70 PRNT50 PRNT50
AE 484 VDV DEN-1 - - 14 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AE 627 - - 8122 4558 0 0 0 0 5 0 0 0 0
AF 115 - - 359 202 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AF 227 - - 557 367 0 5 0 5 0 0 0 0 0
Geo Mean 동질 반응 - - 388 203
AE 538 위약 -/-/-/- -/-/-/- 2.5/-/2/2 -/-/-/- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AE 548 -/-/-/- -/-/-/- -/-/1/2 -/-/-/- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AE 556 -/-/1.5/2 -/-/-/- 1/-/-/- -/-/-/- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
AE 572 -/-/1.5/5 -/-/1.5/2 5/-/-/2 -/-/-/- 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Geo Mean 4가지 혈청형에 대한 반응 -/-/1.2/3 -/-/1/1 2/-/1.2/1.6 -/-/-/-
D1/D2/D3/D4 D1/D2/D3/D4 D1/D2/D3/D4 D1/D2/D3/D4
4.3 원숭이의 신경독성 테스트
각 바이러스 타입에 대해, Mauritius 유래 시노몰구스 원숭이 10마리에 VDV1 마스터 종균을 뇌내 경로로 접종하였다(107.23 CCID50/mL, 각 뇌 반구의 시상에). 테스트 종료시, 원숭이를 죽이고 포르말린 용액을 주입하였다. 각 원숭이의 뇌에서 조직 샘플을 취하였다(연수, 뇌교, 소뇌, 중뇌, 좌우 파트를 포함한 시상, 대뇌 피질의 좌 및 우). 조직 단편은 8 ㎛의 두께로 잘라 에오신과 갈로시아닌으로 염색하였다.
VDV1 종균을 주입한 원숭이의 뇌에서는 어떠한 병원성을 보이는 조직병리학적 신호는 관찰되지 않았다.
실시예 5: 18 내지 40세의 플라비바이러스에 노출된적 없는 건강한 성인에서의 일가 VDV1 의 안전성
1상 실험의 목적은 플라비바이러스에 노출된적 없는 성인에서 Stamaril®(대조군)와 비교하여 104 CCID50의 바이러스 농도에서 1가 VDV1에 대한 안전성, 바이러스 혈증 및 면역성 프로파일을 확인하기 위한 것이다. 1회 주사한 다음 6개월 및 12개월간 추적하였다. 안전 예방책으로, 순차적 통합(sequential inclusion)을 수행하였다.
이에, 등록 및 백신 접종은 엇갈리게 수행하였다: 1차 코호트(그룹 당 n=4, 총 n=12)에 백신 접종하였다. 최대 28일째까지 수집한 안전성 데이타는, 나머지 개체(그룹 당 n=8, 총 n=16)에 대한 백신 접종 진행을 결정하기 전에 IDMC(Independent Data Monitoring Committee) 및 왕립 애덜레이드 병원의 IDSC(Investigational Drugs Subcommittee)에서 논의하였다. 실험 설계의 개략적인 사항은 도 6에 나타낸다.
백신을 투여한 후, 환자를 다양한 임상 실험 및 테스트로 정기적으로 진찰하였다. 그 결과는 하기 표 12에 나타낸다.
등록된 집단은 플라비바이로스에 노출된 적 없는 사람 [플라비바이러스 질환(예, 황열, 일본 뇌염, 뎅기열)에 대해 백신 접종을 받은 개체; 또는 플라비바이 러스 감염 병력이 있는 개체(임상적으로, 혈청학적으로 또는 미생물학적으로 확인됨), 또는 이전에 뎅기 감염 풍토성이 높은 지역에서 (얼마 동안이라도) 거주 또는 여행한 적이 있는 개체, 또는 2주 이상동안 노스 퀸슬랜드에 거주 또는 여행한 적 있는 사람은 제외됨]을 포함하며, 18 내지 40세(즉, 18번째 생일인 날에서 41번째 생일이 되기 전날)의 성인으로 구성된다.
표 12: 조사한 플로우 차트
진찰 횟수 V01 V02 V03 V04 V05 V06 V07 V08 V09 V10 V11 V12
실험 시간표 # D0 D2 D4 D6 D8 D10 D12 D14 D16 D28 D180 D365
시간 윈도우 ±1d ±1d ±4d ±15d ±30d
임상 검사 v v v v v v v v v v v v
바이탈 사인(BP, 맥박수) v
구강 온도 v v v v v v v v v v
혈액 샘플링: -혈청 HBV/HCV/HIV -생물학적 안전성 -바이러스 혈증 -면역성 -혈청내 사이토카인 -T 세포(서브세트)에 대한 PBMC -국소 및 전신 현상의 직접 감시 v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v v
V: 진찰 - D: 일(day)
# 진찰 시간 간격은 진찰한 날과는 다른 백신 접종 실험한 날로부터 계산된다(예, 임시 배제 기준에 해당되는 경우). V06 및 V07은 적어도 1일 이상의 간격으로 행해져야 한다.
테스트한 제품은 다음과 같다:
조사된 백신은 별개로 제공된 희석제를 사용하여 즉석에서 재구성되는, 바이얼에 담기 동결건조된 제품;
활성 성분: 투여량 0.5 ml 당 각 1가 Vero 뎅기 바이러스 혈청형 1(VDV1) 4　+ 0.5　log10 CCID50;
희석제: 백신 재구성을 위한 멸균 NaCl 4‰ 용액.
재구성된 백신, 즉 1가 VDV1의 NaCl 4‰ 용액 0.5 mL은 즉시 사용하거나 사용하기 전까지 +2℃ 내지 +8℃에서 유지시켜야 한다.
백신 투여량 0.5　mL은 삼각근에 피하 투여된다.
대조군 백신인 Stamaril®은 Aventis Pasteur 사에서 생산되는 황열 백신이다. Stamaril®은 동결건조된 형태로, 조류-로이코시스-결핍성, 안정화된 제품으로, 사용하기 바로 전에 희석제를 이용하여 재구성된다. (활성 성분: 약독화된 황열 생바이러스(17D 균주): >1,000 마우스 치사량 50% (LD50)/희석제: 멸균된 NaCl 4‰ 용액).
대조군 백신은 삼각근에 피하 투여된다.
실험의 예비 결과는 하기 표 13에 나타낸다.
표 13: 예비 안전 데이타
　 0일 1일 2일 3일 4일 5일 6일 7일 8일 9일 10일 11일 12일 13일
국소 　
통증 1 　
홍반 　
경화 1 　
부종 　
비국소 　
타박상 1 1 　
소양증 　
그외 　
온도 > 37.5 C 1 1 　
오한 1 1 1 　
불쾌감 2 1 1 1 1 1 1 1 2 1 2
무력증 1 2 1 1 2 1 1 2 1 1
식욕부진 1 1 1 1 1 1
메스꺼움 1 2 1 1 1 1 1 1 2
구토 1 1 1 1 1 1 　
위통 1 1 2 2 1 1 1 1 1 1 1
두통 2 1 2 2 1 1 1 2 1 1 1 1
근육통 1 1 1 1 1 2
관절통 1 1 1 1 1 1 1
빛 기피증 1 1 1 　
결막염 　
눈의 통증 1 1 　
발진 　
반점 1 (1%) 　
구진 1 (1%) 　
반구진성 1 (90%) 1 (90%)
그외 원하지 않는 증상 　
WCC 감소 2 1 　
호중구감소증 2 1 　
aPPT 증가 1 1 　
CK 상승 1 　
이상한 꿈 1 　
하복부 통증 (신장/간) 1 1 1
설사 1 1 1 1 1 1 1 1 1
인후염 1 1
기침 1
이른 월경 1 　
피곤 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 1 　 　 　
표 13은 생물학적 이상(WCC 감소, 혈소판 수 감소)이 모두 중간 정도임을 나 타낸다. 증상은 주로 불쾌감, 메스꺼움, 설사 및 간헐적인 구토이다. 이는 중간 정도의 중증도를 보인다. 현저한 발진 - 전형적인 "바이러스성" 반구진성 발신이 12일째에 발생되었으며, 90%는 치료되었다.
2차 코호트의 안전성 데이타 역시 생물학적 이상 현상이 나타나지 않는 것으로 만족스러운 결과를 보였다. 모든 개체는 뎅기1에 대한 백신 접종 후 28일 경과시에 항체 반응성을 보였다(역가 1315 - 13150).
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gaaaatggaa tggtgctgtt gaatcaacag gttct 10735 <210> 3 <211> 10735 <212> DNA <213> Dengue virus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(10735) <223> LAV-1 Dengue virus type 1 strain 16007 (PDK-13) polyprotein precursor, complete cds <400> 3 agttgttagt ctacgtggac cgacaagaac agtttcgaat cggaagcttg cttaacgtag 60 ttctaacagt tttttattag agagcagatc tctgatgatc aaccaacgaa aaaagacggg 120 tcgaccgtct ttcaatatgc tgaaacgcgc gagaaaccgc gtgtcaactg tttcacagtt 180 ggcgaagaga ttctcaaaag gattgctctc aggccaagga cccatgaaat tggtgatggc 240 tttcatagca ttcttaagat ttctagccat acccccaaca gcaggaattt tggctagatg 300 gggctcattc aagaagaatg gagcgattaa agtgttacgg ggtttcaaga gagaaatctc 360 aaacatgcta aacataatga acaggaggaa aagatccgtg accatgctcc ttatgctgct 420 gcccacagcc ctggcgttcc atctgacgac acgaggggga gagccgcata tgatagttag 480 caagcaggaa agaggaaagt cacttttgtt caagacctct gcaggtgtca acatgtgcac 540 cctcattgcg atggatttgg gagagttgtg tgaggacacg atgacctaca aatgcccccg 600 gatcactgag gcggaaccag atgacgttga ctgttggtgc aatgccacgg acacatgggt 660 gacctatgga acgtgctctc aaactggcga acaccgacga gacaaacgtt ccgtcgcatt 720 ggccccacac gtggggcttg gcctagaaac aagagccgaa acgtggatgt cctctgaagg 780 tgcttggaaa cagatacaaa aagtagagac ttgggctctg agacatccag gattcacggt 840 gatagccctt tttctagcac atgccatagg aacatccatc acccagaaag ggatcatttt 900 cattttgctg atgctggtaa caccatctat ggccatgcga tgcgtgggaa taggcaacag 960 agacttcgtg gaaggactgt caggagcaac atgggtggat gtggtactgg agcatggaag 1020 ttgcgtcacc accatggcaa aaaacaaacc aacactggac attgaactct tgaagacgga 1080 ggtcacaaac cctgcagttc tgcgtaaatt gtgcattgaa gctaaaatat caaacaccac 1140 caccgattcg agatgtccaa cacaaggaga agccacactg gtggaagaac aagacgcgaa 1200 ctttgtgtgc cgacgaacgt tcgtggacag aggctggggc aatggctgtg ggctattcgg 1260 aaaaggtagt ctaataacgt gtgccaagtt taagtgtgtg acaaaactag aaggaaagat 1320 agctcaatat gaaaacctaa aatattcagt gatagtcacc gtccacactg gagatcagca 1380 ccaggtggga aatgagacta cagaacatgg aacaactgca accataacac ctcaagctcc 1440 tacgtcggaa atacagctga ccgactacgg aacccttaca ttagattgtt cacctaggac 1500 agggctagat tttaacgaga tggtgttgct gacaatgaaa aagaaatcat ggcttgtcca 1560 caaacagtgg tttctagact taccactgcc ttggacctct ggggctttaa catcccaaga 1620 gacttggaac agacaagatt tactggtcac atttaagaca gctcatgcaa agaagcagga 1680 agtagtcgta ctaggatcac aagaaggagc aatgcacact gcgctgactg gagcgacaga 1740 aatccaaacg tcaggaacga caacaatttt cgcaggacac ctaaaatgca gactaaaaat 1800 ggacaaacta actttaaaag ggatgtcata tgtgatgtgc acaggctcat tcaagttaga 1860 gaaagaagtg gctgagaccc agcatggaac tgttctggtg caggttaaat atgaaggaac 1920 agacgcacca tgcaagattc ccttttcgac ccaagatgag aaaggagcaa cccagaatgg 1980 gagattaata acagccaacc ccatagtcac tgacaaagaa aaaccagtca atattgaggc 2040 agaaccaccc tttggtgaga gctacatcgt ggtaggagca ggtgaaaaag ctttgaaact 2100 aagctggttc aagaaaggaa gcagcatagg gaaaatgttt gaagcaactg cccgaggagc 2160 acgaaggatg gccattctgg gagacaccgc atgggacttc ggttctatag gaggagtgtt 2220 cacgtctatg ggaaaactgg tacaccaggt ttttggaact gcatatggag ttttgtttag 2280 cggagtttct tggaccatga aaataggaat agggattctg ctgacatggc taggattaaa 2340 ttcaaggaac acgtcccttt cggtgatgtg catcgcagtt ggcatggtca cactgtacct 2400 aggagtcatg gttcaggcag attcgggatg tgtaatcaac tggaaaggca gagaacttaa 2460 atgtggaagc ggcatttttg tcactaatga agttcacact tggacagagc aatacaaatt 2520 ccaggctgac tcccccaaga gactatcagc agccattggg aaggcatggg aggagggtgt 2580 gtgtggaatc cgatcagcca ctcgtctcga gaacatcatg tggaaacaaa tatcaaatga 2640 attgaaccac atcctacttg aaaatgacat gaaatttaca gtggtcgtgg gagacgttag 2700 tggaatcttg gcccaaggga aaaaaatgat taggccacaa cccatggaac acaaatactc 2760 gtggaaaagc tggggaaaag ctaaaatcat aggagcggat gtacagaaca ccaccttcat 2820 catcgacggc ccaaacaccc cagaatgccc tgacaatcaa agagcatgga atatttggga 2880 agtagaggac tatggatttg ggattttcac gacaaacata tggttgaaat tgcgtgactc 2940 ctacacccaa gtatgtgacc accggctgat gtcagctgcc attaaggaca gcaaggcagt 3000 ccatgctgac atggggtact ggatagaaag tgaaaagaac gagacatgga agttggcgag 3060 agcctccttt atagaagtta agacatgcat ctggccaaaa tcccacactc tatggagcaa 3120 tggagttctg gaaagtgaaa tgataattcc aaagatatat ggaggaccaa tatctcagca 3180 caactacaga ccaggatatt tcacacaaac agcagggccg tggcacctag gcaagttgga 3240 actagatttc gatttttgtg aaggtaccac agttgttgtg gatgaacatt gtggaaatcg 3300 aggaccatct ctcagaacca caacagtcac aggaaagata atccatgaat ggtgctgcag 3360 atcttgtacg ctaccccccc tacgtttcaa aggggaagac gggtgttggt acggcatgga 3420 aatcagacca gtgaaggaca aggaagagaa cctggtcaag tcaatggtct ctgcagggtc 3480 aggagaagtg gacagctttt cactaggact gctatgcata tcaataatga ttgaagaagt 3540 gatgagatcc agatggagca aaaaaatgct gatgactgga acactggctg tgttcctcct 3600 tcttataatg ggacaattga catggagtga tctgatcagg ttatgtatta tggttggagc 3660 caacgcttca gacaagatgg ggatgggaac aacgtaccta gctttaatgg ccactttcaa 3720 aatgagacca atgttcgccg tcgggctatt atttcgcaga ctaacatcta gagaagttct 3780 tcttcttaca attggcttga gcctggtggc atccgtggag ctaccaagtt ccctagagga 3840 gctgggggat ggacttgcaa taggcatcat gatgttgaaa ttattgactg attttcagtc 3900 acaccagcta tgggctactc tgctatcctt gacatttatt aaaacaactt tttcattgca 3960 ctatgcatgg aagacaatgg ctatggtact gtcaattgta tctctcttcc ctttatgcct 4020 gtccacgacc tctcaaaaaa caacatggct tccggtgctg ttgggatctc ttggatgcaa 4080 accactaccc atgtttctta taacagaaaa caaaatctgg ggaaggaaga gttggcccct 4140 caatgaagga attatggctg ttggaatagt tagtattcta ctaagttcac ttttaaaaaa 4200 tgatgtgccg ctagccggcc cattaatagc tggaggcatg ctaatagcat gttatgtcat 4260 atccggaagc tcagctgatt tatcactgga gaaagcggct gaggtctcct gggaggaaga 4320 agcagaacac tcaggcgcct cacacaacat actagtagag gttcaagatg atggaaccat 4380 gaagataaaa gatgaagaga gagatgacac gctcaccatt ctccttaaag caactctgct 4440 ggcagtctca ggggtgtacc caatgtcaat accagcgacc ctttttgtgt ggtatttttg 4500 gcagaaaaag aaacagagat caggagtgct atgggacaca cccagccccc cagaagtgga 4560 aagagcagtt cttgatgatg gcatctatag aattttgcaa agaggactgt tgggcaggtc 4620 ccaagtagga gtaggagttt tccaagaagg cgtgttccac acaatgtggc acgtcactag 4680 gggagctgtc ctcatgtatc aaggaaaaag gctggaacca agctgggcca gtgtcaaaaa 4740 agacttgatc tcatatggag gaggttggag gtttcaagga tcctggaaca cgggagaaga 4800 agtacaggtg attgctgttg aaccgggaaa aaaccccaaa aatgtacaaa caacgccggg 4860 taccttcaag acccctgaag gcgaagttgg agccatagcc ttagacttta aacctggcac 4920 atctggatct cccatcgtaa acagagaggg aaaaatagta ggtctttatg gaaatggagt 4980 ggtgacaaca agcggaactt acgttagtgc catagctcaa gctaaggcat cacaagaagg 5040 gcctctacca gagattgagg acaaggtgtt taggaaaaga aacttaacaa taatggacct 5100 acatccagga tcgggaaaaa caagaagata ccttccagcc atagtccgtg aggccataaa 5160 aaggaagctg cgcacgctaa tcctagctcc cacaagagtt gtcgcttctg aaatggcaga 5220 ggcactcaag ggagtgccaa taaggtatca gacaacagca gtgaagagtg aacacacagg 5280 aaaggagata gttgacctta tgtgccacgc cactttcacc atgcgcctcc tgtctcccgt 5340 gagagttccc aattataaca tgattatcat ggatgaagca cacttcaccg atccagccag 5400 catagcagcc agagggtaca tctcaacccg agtgggtatg ggtgaagcag ctgcgatctt 5460 tatgacagcc actcccccag gatcggtgga ggcctttcca cagagcaatg caattatcca 5520 agatgaggaa agagacattc ctgagagatc atggaactca ggctatgact ggatcactga 5580 ttttccaggt aaaacagtct ggtttgttcc aagcatcaaa tcaggaaatg acattgccaa 5640 ctgtttaaga aaaaacggga aacgggtgat ccaattgagc agaaaaacct ttgacactga 5700 gtaccagaaa acaaaaaaca acgactggga ctatgtcgtc acaacagaca tttccgaaat 5760 gggagcaaat ttccgggccg acagggtaat agacccaagg cggtgtctga aaccggtaat 5820 actaaaagat ggtccagagc gcgtcattct agccggaccg atgccagtga ctgtggccag 5880 tgccgcccag aggagaggaa gaattggaag gaaccaaaac aaggaaggtg atcagtatat 5940 ttacatggga cagcctttaa acaatgatga ggaccacgct cattggacag aagcaaagat 6000 gctccttgac aatataaaca caccagaagg gattatccca gccctctttg agccggagag 6060 agaaaagagt gcagctatag acggggaata cagactgcgg ggtgaagcaa ggaaaacgtt 6120 cgtggagctc atgagaagag gggatctacc agtctggcta tcctacaaag ttgcctcaga 6180 aggcttccag tactccgaca gaaggtggtg cttcgatggg gaaaggaaca accaggtgtt 6240 ggaggagaac atggacgtgg agatctggac aaaagaagga gaaagaaaga aactacgacc 6300 tcgctggttg gacgccagaa catactctga cccactggct ctgcgcgagt ttaaagagtt 6360 tgcagcagga agaagaagcg tctcaggtga cctaatatta gaaataggga aacttccaca 6420 acatttgacg caaagggccc agaatgcttt ggacaacttg gtcatgttgc acaattccga 6480 acaaggagga aaagcctata gacatgctat ggaagaactg ccagacacaa tagaaacgtt 6540 gatgctccta gccttgatag ctgtgttgac tggtggagtg acgctgttct tcctatcagg 6600 aagaggtcta ggaaaaacat ctatcggctt actctgcgtg atggcctcaa gcgcactgtt 6660 atggatggcc agtgtggagc cccattggat agcggcctcc atcatactgg agttctttct 6720 gatggtactg cttattccag agccagacag acagcgcact ccacaggaca accagctagc 6780 atatgtggtg ataggtctgt tattcgtgat attgacagtg gcagccaatg agatgggatt 6840 attggaaacc acaaagaaag acctggggat tggccatgta gctgctgaaa accaccacca 6900 tgctacaatg ctggacgtag acctacatcc agcttcagcc tggaccctct atgcagtggc 6960 cacaacaatc atcactccta tgatgagaca cacaattgaa aacacaacgg caaatatttc 7020 cctgacagcc atcgcaaacc aagcagctat attgatggga cttgacaagg gatggccaat 7080 atcgaagatg gacataggag ttccacttct cgccttgggg tgctattccc aagtgaatcc 7140 gctgacactg atagcggcag tattgatgct agtagctcat tacgccataa ttggacctgg 7200 actgcaagca aaagctacta gagaagctca aaaaagaaca gcggctggaa taatgaaaaa 7260 tccaactgtc gacgggattg ttgcaataga cttagatccc gtggtttacg atgcaaaatt 7320 tgaaaaacag ctaggccaaa taatgttgtt gatactttgc acatcacaga ttcttttgat 7380 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aatgtactgg gtttcatgtg gaacaggaaa cattgtgtca gcagtaaaca tgacatctag 8280 aatgttgcta aatcggttca caatggctca caggaagcca acatatgaaa gagacgtgga 8340 cttaggcgct ggaacaagac atgtggcagt agaaccagag gtagccaacc tagatatcat 8400 tggccagagg atagagaata taaaaaatga acataagtca acatggcatt atgatgagga 8460 caatccatac aaaacatggg cctatcatgg atcatatgag gttaagccat caggatcggc 8520 ctcatccatg gtcaatggcg tggtgagatt gctcaccaaa ccatgggatg ttatccccat 8580 ggtcacacaa atagccatga ctgataccac accctttgga caacagaggg tgtttaaaga 8640 gaaagttgac acgcgcacac caaaagcaaa acgtggcaca gcacaaatta tggaagtgac 8700 agccaggtgg ttatggggtt tcctttctag aaacaaaaaa cccagaattt gcacaagaga 8760 ggagtttaca agaaaagtta ggtcaaacgc agctattgga gcagtgttcg ttgatgaaaa 8820 tcaatggaac tcggcaaaag aagcagtgga agacgaacgg ttctgggaac ttgtccacag 8880 agagagggag cttcataaac aggggaaatg tgccacgtgt gtctacaata tgatggggaa 8940 gagagagaaa aaattaggag agttcggaaa ggcaaaagga agtcgtgcaa tatggtacat 9000 gtggttggga gcacgcttcc tagagtttga agcccttggt ttcatgaatg aagatcactg 9060 gttcagtaga gagaattcac tcagtggagt ggaaggagaa ggactccaca aacttggata 9120 catactcaga gacatatcaa ggattccagg ggggaacatg tatgcagatg acacagccgg 9180 atgggacaca agaataacag aggatgatct ccagaatgag gctaaaatca ctgacatcat 9240 ggagcccgaa catgccctgc tggctacgtc aatctttaag ctgacctacc aaaataaggt 9300 ggtaagggtg cagagaccag caaaaaatgg aaccgtgatg gatgttatat ccagacgtga 9360 ccagagaggc agtggacagg ttggaactta tggcttaaac actttcacca acatggaggc 9420 ccaactgata agacaaatgg agtctgaggg aatcttttta cccagcgaat tggaaacccc 9480 aaatctagcc ggaagagttc tcgactggtt ggaaaaatat ggtgtcgaaa ggctgaaaag 9540 aatggcaatc agcggagatg actgtgtggt gaaaccaatt gatgacaggt tcgcaacagc 9600 cttaacagct ttgaatgaca tgggaaaagt aagaaaagac ataccacaat gggaaccttc 9660 aaaaggatgg aatgattggc aacaagtgcc tttctgttca caccacttcc accagctaat 9720 tatgaaggat gggagggaga tagtggtgcc atgccgcaac caagatgaac ttgtggggag 9780 ggccagagta tcacaaggcg ccggatggag cctgagagaa accgcatgcc taggcaagtc 9840 atatgcacaa atgtggcagc tgatgtattt ccacaggaga gacctgagac tggcggctaa 9900 cgctatttgt tcagccgttc cagttgattg ggtcccaacc agccgcacca cctggtcgat 9960 ccatgcccat caccaatgga tgacaacaga agacatgtta tcagtatgga atagggtctg 10020 gatagaggaa aacccatgga tggaggataa gactcatgtg tccagttggg aagaagttcc 10080 atacctagga aagagggaag atcagtggtg tggatccctg ataggcttaa cagcaagggc 10140 cacctgggcc actaatatac aagtggccat aaaccaagtg agaaggctca ttgggaatga 10200 gaattatcta gattacatga catcaatgaa gagattcaag aatgagagtg atcccgaagg 10260 ggcactctgg taagtcaaca cattcacaaa ataaaggaaa ataaaaaatc aaatgaggca 10320 agaagtcagg ccagattaag ccatagtacg gtaagagcta tgctgcctgt gagccccgtc 10380 caaggacgta aaatgaagtc aggccgaaag ccacggtttg agcaagccgt gctgcctgtg 10440 gctccatcgt ggggatgtaa aaacccggga ggctgcaacc catggaagct gtacgcatgg 10500 ggtagcagac tagtggttag aggagacccc tcccaagaca caacgcagca gcggggccca 10560 acaccagggg aagctgtacc ctggtggtaa ggactagagg ttagaggaga ccccccgcgt 10620 aacaataaac agcatattga cgctgggaga gaccagagat cctgctgtct ctacagcatc 10680 attccaggca cagaacgcca gaaaatggaa tggtgctgtt gaatcaacag gttct 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Claims (14)

  1. 서열번호 3에서 5962번 및 7947번 위치에서 하나 이상의 뉴클레오티드가 돌연변이되고, 1323, 1541, 1543, 1545, 1567, 1608, 2363, 2695, 2782, 5063, 6048, 6806, 7330 및 9445번 위치의 뉴클레오티드는 돌연변이되지 않은, 서열을 포함하는 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주(live attenuated dengue-1 virus strain).
  2. 제 1항에 있어서, 2719번 위치의 뉴클레오티드가 추가적으로 돌연변이된 것을 특징으로 하는 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 서열번호 3은 돌연변이 2719 G>A, 5962 C>A 및 7947 A>G를 포함하는 것을 특징으로 하는 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주.
  4. 제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 있어서, 해당 코돈 위치에서 코딩하고 있는 아미노산을 변이시키지 않고 상기 코돈 위치에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한항에 있어서, 서열번호 1을 포함하는 것을 특징으로 하는 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주.
  6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한항에 따른 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주를 약제학적으로 허용가능한 담체내에 포함하는 면역성 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한항에 따른 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주를 약제학적으로 허용가능한 담체내에 포함하는 백신 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 1가(monovalent) 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 제 7항에 있어서, 다가(multivalent) 백신 조성물인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 서열번호 40을 포함하는 약독화된 뎅기-2 바이러스 생균주를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  11. 제 7항 내지 10항 중 어느 한항에 있어서, 제 1항 내지 제 4항중 어느 한항에 따른 약독화된 뎅기-1 바이러스 생균주를 103 내지 106 CCID50로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  12. 서열번호 1의 DNA 서열 또는 이의 등가 RNA 서열을 포함하는 분리된 핵산.
  13. NS3 단백질의 481번 위치에 라이신, 및/또는 NS5 단백질의 125번 위치에 아르기닌을 적어도 포함하는, 서열번호 1에 의해 엔코딩되는 분리된 폴리단백질 또는 이의 단편.
  14. NS3 단백질 및/또는 NS5 단백질을 포함하는 제 13항에 따른 폴리단백질의 단편.
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