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KR20070067136A - 혈관작용성 장내 폴리펩티드 제약 - Google Patents

혈관작용성 장내 폴리펩티드 제약 Download PDF

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Publication number
KR20070067136A
KR20070067136A KR1020077008327A KR20077008327A KR20070067136A KR 20070067136 A KR20070067136 A KR 20070067136A KR 1020077008327 A KR1020077008327 A KR 1020077008327A KR 20077008327 A KR20077008327 A KR 20077008327A KR 20070067136 A KR20070067136 A KR 20070067136A
Authority
KR
South Korea
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lys
polypeptide
ala
arg
acyl
Prior art date
Application number
KR1020077008327A
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English (en)
Inventor
존 네스터
Original Assignee
포베스 메디-테크 (리서치) 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 포베스 메디-테크 (리서치) 인코포레이티드 filed Critical 포베스 메디-테크 (리서치) 인코포레이티드
Publication of KR20070067136A publication Critical patent/KR20070067136A/ko

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Abstract

본 발명에서는 혈관작용성 장내 폴리펩티드에 관련된 약제학적 조성물 및 대사성 장애, 이를테면 당뇨, 인슐린 내성, 대사성 산 과다증 및 비만을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 또한 혈관작용성 장내 폴리펩티드 조성물의 사용 방법이 개시된다.
혈관작용성 장내 폴리펩티드, 대사성 장애, 당뇨, 비만 치료, 양친매성 알파 나선.

Description

혈관작용성 장내 폴리펩티드 제약{VASOACTIVE INTESTINAL POLYPEPTIDE PHARMACEUTICALS}
본 발명은 폴리펩티드 유사체 및 그것들의 합성 및 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 혈관에 작용하는 장내 폴리펩티드와 관련된 합성 폴리펩티드 유사체, 및 그것의 약제학적 조성물에 관한 것이다.
식품이 소화관에 있을 때, 장내 세포는 호르몬 신호 ("인크레틴"(incretin))를 분비하고, 그것은 췌장이 글루코스의 존재에 대해 민감하게 하여, 그 결과 더 강력해진 글루코스-의존성 인슐린 분비 반응을 초래한다. 글루코스-의존성 인슐린 방출을 제공하는 그런 상승적 반응 (Kieffer TJ and Habener, JR (1999) Endocr. Rev. 20, 876-913)은 인크레틴 신호, 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP1) 및 글루코스-의존성 인슐리노트로픽 펩티드 (GIP)에 대해 볼 수 있다. 이들 인크레틴 신호는 전형적으로 신체 내에서 짧은 작용기간을 나타내는데, GLP1은 대략 1-2분의 t1/2를 나타낸다 (Knudsen, LB 2004, J. Med. Chem. 47, 4128-34). GLP1과 GIP는 아미노 펩티다제, 디펩티딜 펩티다제 IV(DPPIV)에 의해 절단되고, 그러므로 자연 발생 천연 호르몬은 일반적으로 의약 제형에 사용되지 않는다. 독 있는 큰 도마뱀의 침에서 발견된 펩티드 (exendin 4, Exenatide; Amylin Pharmaceuticals, San Diego, California)는 GLP1 수용체에 결합하여 강력한 효능 활성을 나타내고, 그로써 바람직한 글루코스-의존성 인슐린 분비 반응을 부여하는 것으로 밝혀졌다 (Nielsen LL, Young AA, Parkes, DG (2004) Regul. Peptides, 117, 77-88). 엑세나티드 (exenatide)와 GLP1의 유사체는 제2형 당뇨병의 치료를 필요로 하는 환자들에게 투여되었다.
뇌하수체 아데닐레이트 사이클라제-활성화 펩티드 (PACAP)는 PAC1, VPAC1, 및 VPAC2 수용체를 자극하는 신경조절 펩티드이고, 췌장의 신경 말단으로부터 방출된다. 이 일반적인 부류의 수용체는 췌장을 포함하여 신체의 여러 조직에 존재한다. 췌장에서, VPAC2 수용체의 자극은 GLP1 또는 엑세나티드의 그것과 유사한, 상승된 혈당 수준에 대한 반응으로 더 강력해진, 글루코스-의존성 인슐린 방출을 제공하는 것으로 밝혀졌다 (Tsutsumi, M., et al. (2002) Diabetes 51, 1453-60). 그러므로 그러한 자극 (PACAP 또는 VPAC 아고니스트성 유사체로부터의)은 글루코스-의존성 인슐린 방출을 자극하는 데 인크레틴-유사 신호에 대해 상승적이거나 또는 대체적인데, 왜냐하면 강력해진 인슐린 분비의 유사한 프로필이 수용체의 이차 부류의 활성화로부터 유발되기 때문이다. 그러한 효과는 대사 장애, 이를테면 제2형 당뇨병 (T2DM), 대사성 산 과다증, 인슐린 내성 및 비만의 치료에 유익할 것이다. 그러나 PACAP 및 그것의 유사체의 자연 발생 천연 서열은 또한 전형적으로 체내에서는 수명이 짧다.
합성 엑센딘-4는 비교적 짧게 작용하는 펩티드이고, 글루코스-의존성 인슐린 분비를 조절할 수 있는, 더 길게 작용하는 펩티드에 대한 의학적 필요성이 존재한 다.
본 발명은 C-말단이 양친매성 α-나선을 형성하는 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 잔기는 다음과 같은 서열 순서의 친수성 아미노산 (Haa) 및 친유성 아미노산 (Laa)으로부터 선택되는, PACAP 및 혈관작용성 장내 폴리펩티드 (VIP)의 합성 폴리펩티드 유사체, 및 그것들의 염을 제공한다:
Haa (Laa Laa Haa Haa)n Laa
상기 식에서, n은 1 내지 5이다. 한 실시예에서 n은 1 또는 2이다.
본 발명의 PACAP 및 VIP의 폴리펩티드 유사체에 도입된 변형은 PACAP 및 VIP 수용체 패밀리, 바람직하게는 VPAC2 수용체를 활성화하는 치료제의 작용기간을 증가시키는 데 촉진작용을 한다. 어떠한 특정 이론에 구속되지는 않지만, 작용기간의 증가는 C-말단에 있는 양친매성 나선의 체내의 세포막의 인지질과 상호작용하는 능력에 기인할 것이고, 따라서 "저장" 효과를 가질 것이라고 여겨진다. 그러므로, 본 발명의 펩티드 유사체는 세포막에 결합하여 원형질에 서서히 재방출되어 그것의 효과를 말단까지 보낸다. 대조적으로 만약 PACAP, VIP 또는 GLP1과 같은 펩티드가 원형질에 방출되면 그것은 프로테아제에 의해 신속하게 작용하든지 사구체 여과에 의해 제거된다.
그러므로 본 발명의 한 측면은 PACAP에 대한 유사체, VIP, 및 그것의 생리적으로 활성인 절단 유사체 및 동족체, 또는 그것들의 염을 제공하는 것으로서, 그것들의 C-말단은 양친매성 α-나선을 형성하는 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 잔기들의 서열은 천연 아미노산으로부터 선택되거나 상기 α-나선을 안정화시키는 능력을 가지고 있는 선택된 비천연 아미노산으로부터 선택된다.
또한 본원에는 효과적인 글루코스-의존성 인슐린 방출량의 PACAP의 폴리펩티드 유사체, VIP, 및 그것의 생리적으로 활성인 절단 유사체 및 동족체, 또는 그것들의 염을 전달하기 위한 약제학적 조성물이 제공되는데, 이때 폴리펩티드들의 C-말단은 양친매성 α-나선을 형성하는 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 잔기는 다음의 서열 순서를 가지는 친수성 아미노산 (Haa) 및 친유성 아미노산 (Laa)로부터 선택된다:
Haa (Laa Laa Haa Haa)n Laa
상기 식에서 n은 1 내지 5이다.
본 발명은 또한 고혈당을 특징으로 하는 포유류 질환을 치료하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 효과적인 글루코스-의존성 인슐린 방출량의 PACAP의 폴리펩티드 유사체, VIP, 및 그것의 생리적으로 활성인 절단 유사체 및 동족체, 또는 그것들의 염을, 치료를 필요로 하는 포유류에게 투여하는 것으로 이루어지며, 그때 폴리펩티드들의 C-말단은 양친매성 α-나선을 형성하는 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 잔기는 다음의 서열 순서를 가지는 친수성 아미노산 (Haa) 및 친유성 아미노산 (Laa)로부터 선택된다:
Haa (Laa Laa Haa Haa)n Laa
상기 식에서 n은 1 내지 5이다.
본 발명은 또한 PACAP의 폴리펩티드 유사체, VIP, 및 그것의 생리적으로 활성인 절단 유사체 및 동족체, 또는 그것들의 염의 고체상 합성 방법을 포함하는데, 이때 폴리펩티드들의 C-말단은 양친매성 α-나선을 형성하는 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 잔기는 다음의 서열 순서를 가지는 친수성 아미노산 (Haa) 및 친유성 아미노산 (Laa)로부터 선택된다:
Haa (Laa Laa Haa Haa)n Laa
상기 식에서 n은 1 내지 5이다.
폴리펩티드 유사체를 제조하기 위해 본원에 제시된 방법은 순차적으로 보호된 아미노산을 적당한 수지 지지체에 결합시키고, 측쇄 및 Nα-보호기를 제거한 후, 수지로부터 폴리펩티드를 절단하는 것으로 이루어진다.
본 발명은 또한 PACAP의 폴리펩티드 유사체, VIP, 및 그것의 생리적으로 활성인 절단 유사체 및 동족체, 또는 그것들의 염의 재조합 합성을 위한 DNA 서열, 벡터, 및 플라스미드를 제공하는데, 그때 폴리펩티드들의 C-말단은 양친매성 α-나선을 형성하는 아미노산 잔기를 포함하고, 상기 잔기는 다음의 서열 순서를 가지는 친수성 아미노산 (Haa) 및 친유성 아미노산 (Laa)로부터 선택된다:
Haa (Laa Laa Haa Haa)n Laa
상기 식에서 n은 1 내지 5이다.
또한 본 발명은 다양한 대사 장애, 이를테면 상승된 혈당 수준을 특징으로 하는 당뇨, 인슐린 내성, 고혈당증, 대사성 산 과다증 및 비만을 방지 및 치료하기 위한 유효량의 본 발명의 폴리펩티드(들), 또는 그것의 염, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 측면에 따르면, 치료적으로 유효한 양의 대사 장애 화합물, 이를테면 인슐린, 인슐린 유사체, 인크레틴, 인크레틴 유사체, 글루카곤-유사 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 유사체, 엑센딘, 엑센딘 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, α-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온, 페록시솜 증식제 활성화된 수용체 (PPAR) 아고니스트, PPAR 길항체 및 PPAR 부분 아고니스트가 본 발명의 폴리펩티드와 함께 투여될 수 있다.
도 1A, 도 1B, 및 도 1C는 본 발명에 따른 예시적인 폴리펩티드 유사체의 목록을 도시한다. 아미노산에 대한 단일 문자 약어를 사용한 표준 명명법이 사용된다. 문자 "X"는 C10-C3000 사슬을 가지는 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 나타낸다. 용어 "아실"은 C2-C16 아실 사슬을 나타낸다. 문자 "Z"는 엡실론 위치에서 긴 아실 사슬을 가지는 라이신을 나타낸다. 용어 "hex"는 헥사노일을 나타낸다. 용어 "pen"은 펜타노일을 나타낸다. 용어 "lau"는 라우로일을 나타낸다. 용어 "myr"은 미리스토일을 나타낸다. 용어 "ste"는 스테아로일을 나타낸다. 용어 "pr"은 프로피오닐을 나타낸다.
도 2는 다른 폴리펩티드 및 폴리펩티드 유사체의 목록을 도시한다.
약어 및 정의
다양한 공통적인 뉴클레오티드 염기 및 아미노산에 대한 한-문자 및 세-문자 약어는 문헌에 기재된 것을 참고하여 (Pure Appl. Chem. 31, 639-645 (1972) and 40, 277-290 (1974) 37 CFR.sctn.1.822 (55FR 18245, May 1, 1990))에 따른다. 약어는 다른 언급이 없는 한 D- 또는 L-로서 나타낸다. 특정 아미노산은, 그것이 천연이든 비-천연이든, 예컨대 글리신과 같이 아키랄(achiral)이다. 모든 펩티드 서열은 좌측에는 N-말단 아미노산이, 우측에는 C-말단 아미노산이 표시되어 있다.
"친수성 아미노산 (Haa)"은 펩티드 결합 형성에 필요한 것들 외에 적어도 하나의 친수성 기능성 기를 가지는 아미노산, 예컨대 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 글루타민, 히스티딘, 라이신, 세린, 트레오닌, 및 그것들의 동족체를 말한다.
"친유성 아미노산 (Laa)"은 하전되지 않은 지방족 또는 방향족 아미노산, 예컨대 이소로이신, 로이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 발린 및 그것들의 동족체를 말한다.
본 발명에서 알라닌은 "양친매성", 즉 친수성으로서 또는 친유성으로서 작용할 수 있는 것으로 분류된다.
"PACAP 또는 VIP의 동족체"는 PACAP 또는 VIP의 천연 서열과 실질적으로 유사한 서열의 아미노산을 포함하는, 예컨대 최소한 50, 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99% 아미노산 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 말한다. 본원에 제시되는 동족체는 PACAP 또는 VIP의 천연 서열과 관련하여 아미노산 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 예시적인 동족체는 PACAP 또 는 VIP의 천연 서열에 동일한 또는 실질적으로 유사한 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 35개의 연속 아미노산을 적어도 포함한다.
"PACAP 또는 VIP의 유사체"는 (i) PACAP, VIP, 및/또는 PACAP 또는 VIP의 동족체; 및 (ii) 자연적으로 발생하는 천연 PACAP 및/또는 VIP에 존재하지 않는 적어도 하나의 기능성을 포함하는 폴리펩티드를 나타낸다. 예를 들어 유사체는 임의로 아미노산의 측쇄 내에 기능성을 포함하거나 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단에 기능성을 포함한다. 예시적인 기능성으로는 알킬-, 아릴-, 아실-, 케토-, 아지도-, 히드록실-, 히드라진, 시아노-, 할로-, 히드라지드, 알케닐, 알키닐, 에테르, 티올, 셀레노-, 술포닐-, 보레이트, 보로네이트, 포스포, 포스포노, 포스핀, 헤테로시클릭, 에논, 이민, 알데하이드, 에스테르, 티오산, 히드록실아민, 아미노기 등 또는 그것들의 어떠한 조합이 있다. 도입될 수 있는 다른 예시적인 기능성으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 광 활성화가능한 교차 결합제를 포함하는 아미노산, 스핀-표지된 아미노산, 형광 아미노산, 금속 결합 아미노산, 금속-함유 아미노산, 방사성 아미노산, 신규한 기능성 기를 가지는 아미노산, 공유적으로 또는 비공유적으로 다른 분자와 상호작용하는 아미노산, 빛에 의해 구속되거나 (photocaged) 및/또는 빛에 의해 이성질화될 수 있는 아미노산, 비오틴 또는 비오틴 유사체를 포함하는 아미노산, 글리코실화된 아미노산, 예컨대 당 치환된 세린, 다른 탄수화물 변형된 아미노산, 케토 함유 아미노산, 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에테르를 포함하는 아미노산, 무거운 원자 치환된 아미노산, 화학적으로 절단될 수 있고 및/또는 빛에 의해 절단될 수 있는 아미노산, 천연 아미노산과 비교하여 연장된 측쇄를 가지는 아미노산, 예컨대 폴리에테르 또는 긴 사슬 탄화수소, 예컨대 약 5 이상 또는 약 10 이상의 탄소, 탄소-결합된 당-함유 아미노산, 산화환원-활성 아미노산, 아미노 티오산 함유 아미노산, 및 하나 또는 그 이상의 독성 부분을 포함하는 아미노산이 있다.
본원에서 제시되는 유사체는 천연 아미노산을 토대로 한 비-천연 아미노산을 포함할 수 있는데, 예컨대 티로신 유사체는 파라-치환된 티로신, 오르토-치환된 티로신, 및 메타 치환된 티로신을 포함하며, 이때 치환된 티로신은 아세틸기, 벤조일기, 아미노기, 히드라진, 히드록시아민, 티올기, 카르복시기, 이소프로필기, 메틸기, C6-C20 직쇄 또는 분지된 탄화수소, 포화 또는 불포화 탄화수소, O-메틸기, 폴리에테르기, 니트로기 등을 포함한다. 글루타민 유사체는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, α-히드록시 유도체, β-치환된 유도체, 시클릭 유도체, 및 아미드 치환된 글루타민 유도체를 포함한다. 페닐알라닌 유사체의 실례로는 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 메타-치환된 페닐알라닌이 있고, 이때 치환기는 히드록실시, 메톡시기, 메틸기, 알릴기, 아세틸기, 등이다. 구체적인 실례로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 O-메틸-L-티로신, L-3-(2-나프틸)알라닌, 3-메틸-페닐알라닌, O-4-알릴-L-티로신, 4-프로필-L-티로신, 트리-O-아세틸-GlcNAc.베타.-세린, L-도파, 플루오르화된 페닐알라닌, 이소프로필-L-페닐알라닌, p-아지도-L-페닐알라닌, 포스포노세린, 포스포노티로신, p-요오도-페닐알라닌, p-브로모페닐알라닌, p-아미노-L-페닐알라닌, 및 이소프로필-L-페닐알라닌 등이 있다.
일반적으로 유사체는 임의로 폴리펩티드의 생물학적 성질을 변형시키기 위하여, 예컨대 독성, 생체 내 분포, 용해도, 안정성, 예를 들면 효소적 분해에 대한 열적, 가수분해적, 산화적 내성 등, 정제 및 가공처리의 용이성, 구조적 특성, 분광학적 특성, 화학적 및/또는 광화학적 특성, 촉매적 활성, 산화환원 가능성, 반감기, 다른 분자와, 예컨대 공유적으로 또는 비공유적으로 반응하는 능력 등을 조절하기 위하여 디자인되거나 선택될 수 있다.
"생리적으로 활성인 PACAP 또는 VIP의 절단된 동족체 또는 유사체"는 PACAP 또는 VIP에서 발견된 아미노산의 전체 보충물보다 짧은 길이의 서열을 가지지만, 유사한 생리학적 반응을 유도해내는 폴리펩티드를 말한다. 본원에 표시된 대표적인 절단된 동족체 및/또는 유사체는 PACAP 또는 VIP의 천연 서열에서 발견된 최소한 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 35개의 연속적인 아미노산을 포함한다. 절단된 PACAP 또는 VIP는 유사한 생리학적 반응을 유도하기 위하여 PACAP 또는 VIP와 완전히 상동적일 필요는 없다. PACAP 또는 VIP는 이런 그룹을 대표하기에 배타적인 것이 아니라 바람직하다.
"PEG"는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌을 나타낸다. 실시예에서 PEG는 C10-C3000 사슬을 포함한다. 다른 실시예에서 PEG는 40kD 이상의 분자량을 갖는다. PEG는 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 미국 특허 4,640,835호; 4,496,689호; 4,301,144호; 4,670,417호; 4,791,192호; 및 4,179,337호에 설명되어 있다.
"양친매성 α-나선"은 아미노산이 나선의 장축을 따라 배향된 반대쪽 극성과 비극성 면을 가지는 α-나선 형태를 모방하는 특정 폴리펩티드에 의해 표시되는 이차 구조를 말한다. 관심의 폴리펩티드에서 α-나선 구조의 가능성은 적절한 피치(pitch)의 "쉬퍼-에드먼슨 휠(Schiffer-Edmundson wheel)" (M. Schiffer and A. B. Edmundson, Biophys. J. 7, 121 (1967))의 구성에 의해 및 나선 주위를 둘러싼 실린더의 반대쪽 면에 친수성 및 친유성 잔기들이 분리된 것을 주지함으로써 어느 정도는 탐구할 수 있다. 또는 달리 실험적 증거, 예컨대 원편광 이색성 또는 x-선 회절 데이터를 주어진 폴리펩티드의 α-나선 영역의 존재를 가리키는 것으로 활용할 수 있다. 이상적인 α-나선은 1회전당 3.6 아미노산 잔기를 가지며 인접한 측쇄와는 100°의 각만큼 떨어져 있다.
폴리펩티드
실시예에서, 본원에 제시되는 폴리펩티드는 PACAP 또는 VIP의 천연 서열의 최소한 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 35개의 연속 아미노산을 가지는 PACAP 및/또는 VIP의 절단된 부분을 포함한다. 다른 실시예에서 본 발명의 폴리펩티드는 PACAP 또는 VIP의 천연 서열에 대해 최소한 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 또는 99%의 아미노산 서열 동일성을 공유한다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 폴리펩티드는 PACAP 또는 VIP의 천연 서열에 대해 최소한 50, 60, 70, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100% 아미노산 서열 동일성을 가지는 PACAP 및/또는 VIP의 최소한 5, 10, 15, 20, 25, 30, 또는 35개의 연속 아미노산의 스팬(span)을 포함한다.
본원에 제시되는 폴리펩티드는 VPAC2 선택성을 조절하는 변형, 기능성, 및/또는 아미노산 치환을 임의로 포함한다. 예시적인 변형, 기능성, 및/또는 치환으로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 문헌에 소개된 C-말단 양이온성 연장 및/또는 돌연변이가 있다 (Gourlet et al. Peptides 18, 403-8; Xia M, et al. (1997) and J. Pharmacol. Exp. Ther. 281:629-33 (1997)).
아미노 또는 카르복시 말단에서의 변형은 임의로 본 발명의 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드, 예컨대 VIP의 유사체는 N-말단상에서 긴 사슬의 지방산에 의해 아실화되어 저효능, 부분 아고니스트 및 길항체 활성을 나타내는 폴리펩티드가 형성될 수 있다 (Gourlet et al., Eur. J. Pharmacol. 354:105-111 (1998)). 본 발명의 폴리펩티드, 예컨대 VIP의 유사체에 대한 다른 예시적인 변형으로는, 헥산산을 사용하는 아실화로 VPAC2에 대한 선택성이 증가되는 것으로 보이는 폴리펩티드가 형성되는 것이다 (Langer et al., Peptides 25: 275-8 (2004)). 그러므로 그러한 아실화의 길이 및 위치는 효능을 변경시킬 수 있으며, 그 결과 효능 (길항체성) 또는 아고니스트 유사체의 손실을 초래할 수 있다. 이런 돌발적인 상황과는 대조적으로, 본 발명에서 제시되는 폴리펩티드는 원하는 효능과 활성을 얻기 위해 디자인되고 시험될 수 있다.
변형은 임의로 본 발명의 폴리펩티드 내에 있는 적어도 하나의 아미노산의 측쇄 내에 선택적으로 도입되어 작용 기간 및/또는 효능을 증가시킬 수 있다. 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드는 임의로 측쇄 (즉 R 그룹)의 기능성에 대해 아실화된 적어도 하나의 아미노산을 포함할 수 있다. 대표적인 변형으로는 폴리펩티드 내에 있는 다양한 위치에서 반응성 측쇄 (예컨대 Lys)의 지방산 아실화를 들 수 있다. 유사한 변형이 문헌에 보고되었는데, 거기에서 LysB29상에서의 인슐린의 아실화는 인슐린 디터미(insulin detemir)를 초래하였다 (Kurtzhals et al., Biochem. J. 312, 725-31 (1995); Kurtzhals, P., Int. J. Obesity 28: Suppl 2, S23-8 (2004)). 유사하게, 링커 분자를 통하여 긴 사슬의 지방산을 이용한 아실화는 강력하고 작용기간이 긴 GLP1의 유사체를 초래하였지만 (Knudsen LB, et al. (2000), J. Med. Chem. 43, 1664-69), 아실화는 아실 사슬(들)의 길이 및 위치에 따라 활성 또는 강력한 아고니스트의 손실을 초래할 수도 있다. 긴 사슬 지방산의 도입에 따른 예상할 수 없었던 효과와는 대조적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 가장 적당한 수, 길이 및 위치의 아실 사슬을 통합하기 위해 고안됨으로써 원하는 활성을 얻을 수 있다.
작용 기간을 연장하기 위하여 임의로 본 발명의 폴리펩티드에 도입될 수 있는 (예컨대 폴리펩티드 사슬 내에 또는 N- 또는 C-말단의 어느 한 쪽에) 다른 유형의 변형으로는 페길화(PEGylation) 또는 긴 사슬 폴리에틸렌 글리콜 중합체 (PEG)의 통합이 있다. PEG 또는 긴 사를 PEG 중합체의 도입은 본 발명의 폴리펩티드의 유효 분자량을 증가시켜서 소변으로의 신속한 여과를 방해한다. PEG 또는 PEG의 긴 사슬 중합체의 통합 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌에도 소개되어 있다 (Greenwald et al., Adv. Drug Del. Rev. 55: 217-250 (2003)).
보다 최근에 보고된, 비-천연 아미노산의 통합을 통하여 PEG 또는 PEG 중합체를 통합시키는 대체 접근법은 본 발명의 폴리펩티드로 수행될 수 있다. 이 접근 법은 보다 발전된 tRNA/tRNA 합성효소 쌍을 사용하고 호박의(amber) 억제제 코돈에 의해 발현 플라스미드에 코드화된다 (Deiters, A, et al., (2004), Bio-org. Med. Chem. Lett. 14, 5743-5). 예를 들어 p-아지도페닐알라닌은 본 발명의 폴리펩티드에 통합된 후 아세틸렌 부분을 가지는 PEG 중합체와 환원제 및 구리 이온의 존재하에 반응하여 소위 "Huisgen [3+2] 고리형 첨가"로 알려져 있는 유기 반응을 촉진할 수 있다.
양친매성 나선
본 발명의 폴리펩티드는 다음 식에 상응하는 양친매성 α-나선을 포함한다:
Haa (Laa Laa Haa Haa)n Laa
상기 식에서 n, Haa 및 Laa는 상기에서 규정된 바와 같이 친수성 아미노산 그룹으로부터 선택되고 Laa는 친유성 아미노산 그룹으로부터 선택된다. 어떠한 특정 이론에 구속되지는 않지만, C-말단 영역에 있는 양친매성 나선이 신체의 세포막의 인지질과 상호작용하여 "저장" 효과를 나타냄으로써 본 발명의 폴리펩티드의 작용 기간을 증가시키는 것으로 여겨진다. 본 발명의 폴리펩티드는 단순히 최적화된 알파 나선이 아니라 양친매성 알파 나선인 펩티드 영역을 포함한다. 어떠한 특정 이론에 구속되지는 않지만, 양친매성 알파 나선은 세포막과의 상호작용을 증가시키는 데 촉진적인 역할을 하고 막 상호작용에 대해 C-말단 지방 아실 변형의 위치를 적절하게 위치시키는 것을 보조하는 것으로 여겨진다.
아이젠버그 등의 연구는 소수성의 규모를 와선 (helical wheel)과 조합하여 양친매성 나선의 개념을 정량화하였다 (Eisenberg et al., Nature 299: 371-374 (1982); Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81:140-144 (1984)). 평균적인 소수성 모멘트는 나선을 구성하는 요소인 아미노산의 소수성의 벡터 합으로서 규정된다. 아미노산에 대한 다음의 소수성은 아이젠버그 등에 의해 "일치" 규모로서 기록된 것들이다: Ile 0.73; Phe 0.61; Val 0.54; Leu 0.53; Trp 0.37; Met 0.26; Ala 0.25; Gly 0.16; Cys 0.04; Ty 0.02; Pro -0.07; Thr -0.18; Ser -0.26; His -0.40; Glu -0.62; Asn -0.64; Gln -0.69; Asp -0.72; Lys -1.10; Ag -1.76.
1회 회전당 3.6개의 잔기를 가지는 이상적인 α-나선에 대한 소수성 모멘트 μH (또는 측쇄 사슬 사이의 100°각 (=360°/3.6))는 다음 식으로부터 계산될 수 있다:
μH=[(∑HN sine δ(N-1)2+(∑HN cos δ(n-1)) 2 ]1/2
상기 식에서, HN은 Nth 아미노산의 소수성 값이고 합은 주기성 δ=100°인 서열의 N 아미노산에 걸쳐 취해진다. 소수성 모멘트는 μH를 N으로 나누어 <μH>를 구함으로써 잔기당 평균 소수성 모멘트로서 표시될 수 있다. 100°+-20°에서 약 0.20 또는 그 이상의 <μH>의 값은 양친매성 나선이 형성되었음을 시사한다.
코어넷 등의 연구는 나아가 양친매성의 예표로서 "양친매성 지수"를 도입하는 것에 의해 양친매성 α-나선에 대한 연구를 확장시켰다 (Cornett et al., J. Mol. Biol. 195:659-685 (1987)). 그들은 공지되어 있는 모든 α-나선 중 대략 절반이 양친매성이고, 우세한 주파수는 100°이기보다는 97.5°이며, 1회 회전당 잔 기의 수는 3.6보다는 3.7에 가깝다고 결론지었다. 아이젠버그 등의 기본적인 접근법은, 특히 양친매성 α-나선을 형성하기 위해 서열을 처음부터 디자인할 때 주어진 서열을 양친매성으로 분류하기에 충분하다.
대체 양친매성 α-나선 아미노산 서열은 자연 발생 폴리펩티드의 주어진 절편의 서열과의 상동성이 부족할 수 있지만, 생리적 환경에서 유사한 이차 구조, 즉 반대 극성과 비극성 면을 가지는 α-나선을 유도한다. 자연 발생 아미노산 서열을 대체 서열로 바꾸는 것은 변경된 원래 폴리펩티드의 생리적 활성, 안정성, 또는 다른 특성에 유익한 영향을 미칠 수 있다. 그것의 예로서 그러한 서열의 디자인 및 선택을 설명하는 문헌이 있다 (J. L. Krstenansky et al., FEBS Letters 242:2, 409-413 (1989); J. P. Segrest, et al., Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:103-117 (1990)).
본 발명의 폴리펩티드는 다음 식에 상응하는 양친매성 α-나선을 포함한다:
Haa (Laa Laa Haa Haa)n Laa
상기 식에서 Haa는 상기에서 규정된 바와 같이 친수성 아미노산 그룹으로부터 선택되고 Laa는 친유성 아미노산 그룹으로부터 선택된다. n은 2, 잔기 1, 4, 5, 8 및 9가 나선의 한 면 (A)을 따라 상호 간에 약 140°각 내에서 분포되어 있는 한편, 잔기 2, 3, 6, 7 및 10은 나선의 다른 면 (B)에서 반대쪽으로 140°를 차지하는 실시예가 이상적인 α-나선이라고 가정할 수 있다. 실시예에서 한 면에 있는 모든 잔기는 동일한 극성인 반면, 다른 면에 있는 모든 잔기는 반대 극성, 즉 면 A는 모두 친수성이고, 면 B는 모두 친유성이거나, 혹은 그 반대이다. 숙련된 당업자는 본 발명의 나선이 Haa (Laa Laa Haa Haa)n Laa로 표시되고, 그 역서열은 Laa (Haa Haa Laa Laa)n Haa로 표시되며, 또한 그것은 잔기 분포 기준을 만족하고 본 발명의 나선과 동등한 설명이 적용된다는 것을 인지할 것이다.
알라닌은 Ala가 Ala-10이 양친매성 α-나선을 형성하지 못함에도 불구하고, 양친매성 α-나선의 어느 면에서든지 쉽게 존재할 수 있기 때문에, 친수성 또는 친유성 아미노산으로 치환될 수 있다. 일반적으로 프롤린, 시스테인, 및 티로신은 사용되지 않는다. 그러나 서열에서 이것들의 존재 및 다른 무작위 실수는 허용될 수 있는데, 예컨대 친유성 면에 있는 친수성 잔기는 그 절편에 있는 나머지 아미노산이 실질적으로 친수성 면--친유성 면 분할을 따르고 있기만 하면 허용될 수 있다. 서열이 본 발명의 서열이 되도록 충분히 양친매성인지를 측정하는 편리한 방법은 상기에서 규정된 바와 같이 평균 소수성 모멘트를 계산하는 것이다. 만약 100°+-20°에서 잔기당 피크 평균 모멘트가 약 0.20을 초과하면, 그때에는 서열은 양친매성 나선을 형성할 것이고 본 발명의 서열이다.
이 개념을 PACAP 및 VIP에 적용하면, 어느 하나 또는 두 영역 모두 (N-말단 또는 C-말단), 바람직하게는 C-말단은 α-나선 이차 구조를 나타낼 수 있고, 생물학적 활성을 잃어버리거나 면역반응이 유도되는 일 없이 유사한 구조 경향을 가지는 비-상동성 서열로 대체될 수 있다고 가정할 수 있다.
약제학적 제형
본 발명의 폴리펩티드는 유익한 치료적 효과를 부여하기 위하여 어떠한 양으로든지 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에서 본 발명의 화합물은 상승된 혈당 수 준, 혈당 과다증, 당뇨, 이를테면 제2형 당뇨병, 인슐린 내성, 대사성 산 과다증 및 비만의 치료에 유용하다. 실시예에서 본 발명의 화합물은 인슐린 및/또는 글루코스 수준의 조절에 유익한 활성을 부여한다. 한 실시예에서 본 발명의 폴리펩티드는 환자에게 인슐린 및/또는 글루코스 분비를 조절하는 다른 형태의 치료보다 높거나 낮은 수준 농도로 투여된다. 또 다른 실시예에서 본 발명의 폴리펩티드는 상승적 치료 효과를 유발하기 위하여 다른 화합물과 함께 투여된다. 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드는 엑센딘 또는 엑센딘 유사체와 함께 투여될 수 있다.
실시예 1: 합성 유사체
도 1에 도시된 예시적인 합성 폴리펩티드 유사체들은 VPAC2 sel UldB로부터 유도된다 (도 1 참조). 도 1에 도시된 다른 예시적인 합성 폴리펩티드들은 VIP의 절단된 동족체이다 (도 1).
한 측면으로 본 발명의 VIP의 생리적 활성 절단 동족체의 폴리펩티드 유사체, 예컨대 도 1에 TP 1 내지 TP 6으로 도시된 것들이다. 유사체 TP 1 내지 TP 6은 C12-C24, 바람직하게는 C16-C24를 포함하는 긴 아실 잔기이다. 도 1에 도시되어 있는 유사체 TP 7 내지 TP 12는 N-말단에 C2-C16, 바람직하게는 C6을 포함하는 아실 잔기를 가진다. 도 2에 도시된 유사체 SQNM 10-12 (SEQ ID NO:40-42에 상응한다)는 C 나 N-말단에 아실화를 함유하지 않는다.
본원에 제시된 다른 대표적인 폴리펩티드 유사체는 다음 일반식 (I)에 상응하는 아미노산 서열을 가진다:
아실-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7-Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-Lys(ε-긴 아실)-X
식 (I)
상기 식에서,
n은 1 내지 3이고;
Haa는 친수성 아미노산이며;
Laa는 친유성 아미노산이고;
아실은 C2 -16 아실 사슬이며;
긴 아실은 C12 -24 아실 사슬이고;
X는 OH 또는 NHR1이고 이때에 R1은 H 또는 저급 알킬, 할로알킬, 또는 PEG이며;
aa1은 Gly 또는 Ala이고;
aa2는 Val, Ile, 또는 Leu이며;
aa3은 Asp 또는 Arg이고;
aa4는 Ser 또는 Asn이며;
aa5는 Ser 또는 Thr이고;
aa6은 Leu 또는 Tyr이며;
aa7은 Met, Leu 또는 Val이고;
aa8은 Ala 또는 Val이며;
aa9는 Asn, Gln, 또는 Ala이고;
aa10은 Trp, Ala, 또는 Ser이며;
aa11은 Ile 또는 Val이고;
aa12는 Leu 또는 Lys이며;
aa13은 Lys, Arg, Asn, 또는 Gly이고;
aa14는 Ala 또는 Gly이며;
aa15는 Lys 또는 Arg이고;
aa16은 Lys 또는 Arg이다.
바람직한 실시예에서 아실은 C2 - 8아실 사슬이고, 긴 아실은 C12 -24 아실 사슬이다.
본원에 제시된 다른 대표적인 폴리펩티드 유사체는 다음 일반식 (II)에 상응하는 아미노산 서열을 가진다:
아실-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7- Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-aa17-Pro-Pro-Pro-Lys(ε-긴 아실)-X
식 (II)
상기 식에서,
n은 1 내지 3이고;
Haa는 친수성 아미노산이며;
Laa는 친유성 아미노산이고;
아실은 C2 -16 아실 사슬이며;
긴 아실은 C12 -24 아실 사슬이고;
X는 OH 또는 NHR1이고 이때에 R1은 H 또는 저급 알킬, 할로알킬, 또는 PEG이며;
aa1은 Gly 또는 Ala이고;
aa2는 Val, Ile, 또는 Leu이며;
aa3은 Asp 또는 Arg이고;
aa4는 Ser 또는 Asn이며;
aa5는 Ser 또는 Thr이고;
aa6은 Leu 또는 Tyr이며;
aa7은 Met, Leu 또는 Val이고;
aa8은 Ala 또는 Val이며;
aa9는 Asn, Gln, 또는 Ala이고;
aa10은 Trp, Ala, 또는 Ser이며;
aa11은 Ile 또는 Val이고;
aa12는 Leu 또는 Lys이며;
aa13은 Lys, Arg, Asn, 또는 Gly이고;
aa14는 Ala 또는 Gly이며;
aa15는 Lys 또는 Arg이고;
aa16은 Lys 또는 Arg이며;
aa17은 없거나 Gln이다.
바람직한 실시예에서 아실은 C2 - 8아실 사슬이고, 긴 아실은 C12 -24 아실 사슬이다.
본원에 제시된 다른 대표적인 폴리펩티드 유사체는 다음 일반식 (III)에 상응하는 아미노산 서열을 가진다:
아실-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7- Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-Lys(ε-긴 아실)-PEG
식 (III)
상기 식에서,
n은 1 내지 3이고;
Haa는 친수성 아미노산이며;
Laa는 친유성 아미노산이고;
아실은 C2 -16 아실 사슬이며;
긴 아실은 C12 -24 아실 사슬이고;
aa1은 Gly 또는 Ala이고;
aa2는 Val, Ile, 또는 Leu이며;
aa3은 Asp 또는 Arg이고;
aa4는 Ser 또는 Asn이며;
aa5는 Ser 또는 Thr이고;
aa6은 Leu 또는 Tyr이며;
aa7은 Met, Leu 또는 Val이고;
aa8은 Ala 또는 Val이며;
aa9는 Asn, Gln, 또는 Ala이고;
aa10은 Trp, Ala, 또는 Ser이며;
aa11은 Ile 또는 Val이고;
aa12는 Leu 또는 Lys이며;
aa13은 Lys, Arg, Asn, 또는 Gly이고;
aa14는 Ala 또는 Gly이며;
aa15는 Lys 또는 Arg이고;
aa16은 Lys 또는 Arg이다.
바람직한 실시예에서 아실은 C2 - 8아실 사슬이고, 긴 아실은 C12 -24 아실 사슬이다.
당업자는 본원에서 설명되는 것들의 바람직한 특성을 보유할, 폴리펩티드의 유사체의 많은 치환물들이 합성될수 있고, 단 100°+-20°에서 잔기당 평균 소수성 모멘트가 약 0.20 이상인 아미노산 서열이 C-말단 영역에 있는 위치에 삽입되어야 한다는 것을 인지할 것이다.
실시예 2: 폴리펩티드를 합성하기 위한 일반적인 방법
본 발명의 폴리펩티드는 문헌에 설명된 것과 같은 방법들에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어 고체상 합성법에 대한 것 (J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., Rockford, Ill. (1984); J. Meienhofer, Hormonal Proteins and Peptides, Vol.2, Academic Press, New York, (1973))과 액체 합성 방법에 대한 것들 (E. Schroder and K. Lubke, The Peptides, Vol.1, Academic Press, New York (1965), 그리고 일반적인 방법들이 문헌에 기재되어 있다 (Houben-Weyl, Synthesis of Peptides and Peptidomimetics . 4th ed. Vol E22; M. Goodman, A. Felix, L. Moroder, C. Toniolo, Eds., Thieme: New York, 2004).
일반적으로 이들 방법은 보호된 아미노산을 점점 길어지는 펩티드 사슬에 순차적으로 첨가하는 것을 포함한다. 정상적으로 첫 번째 아미노산과 어떠한 반응성 측쇄기의 아미노 또는 카르복실기가 보호된다. 이 보호된 아미노산은 그런 다음에 비활성 고체 지지체에 부착되거나, 또는 용액에서 활용되고, 서열의 다음 순서이고 적당하게 보호된 아미노산이 아미드 연쇄의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 첨가된다. 원하는 모든 아미노산이 적절한 순서로 연결된 후에는 보호기와 어떠한 고체 지지체가 제거되어 미정제 폴리펩티드가 얻어진다. 폴리펩티드는 탈염되고, 바람직하게는 크로마토그래피 방법에 의해 정제되어 최종 생성물이 얻어진다.
약 40 이하의 아미노산을 가지는, 생리적으로 활성의 절단된 폴리펩티드의 유사체를 제조하는 바람직한 방법은 고체상 펩티드 합성을 포함한다. 이 방법에서 α-아미노 (Nα) 및 어떠한 반응성 측쇄는 산- 또는 염기-민감성 기에 의해 보호된다. 보호기는 펩티드 연쇄 형성의 조건에 대해 안정해야 하는 한편, 현재 존재하는 폴리펩티드 사슬에 영향을 주지 않으면서 쉽게 제거될 수 있어야 한다. 적당한 α- 아미노 보호기로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만, t-부톡시카르보닐 (Boc), 벤질옥시카르보닐 (Cbz), o-클로로벤질옥시카르보닐, 비페닐이소프로필옥시카르보닐, t-아밀옥시카르보닐 (Amoc), 이소보르닐옥시카르보닐, α,α-디메틸-3,5-디메톡시벤질옥시카르보닐, o-니트로페닐술페닐, 2-시아노-t-부톡시카르보닐, 9-플루오레닐메톡시카르보닐 (Fmoc), 등이 있으며, 바람직한 것은 t-부톡시카르보닐 (Boc)이다. 적당한 측쇄 보호기로는, 그것들에 한정되는 것은 아니지만 아세틸, 벤질(Bzl), 벤질옥시메틸 (Bom), o-브로모벤질옥시카르보닐, t-부틸, t-부틸디메틸실릴, 2-클로로벤질 (Cl-z), 2,6-디클로로벤질, 시클로헥실, 시클로펜틸, 이소프로필, 피발릴, 테트라히드로피란-2-일, 토실 (Tos), 트리메틸실릴, 및 트리틸이 있다.
고체상 합성법에서, C-말단 아미노산이 먼저 적당한 수지 지지체에 부착된다. 적당한 수지 지지체는 시약 및 단계식 축합 반응과 탈보호 반응의 반응조건에 대해 비활성일 뿐만 아니라 사용되는 매질에 불용성인 물질이다. 시판되는 수지의 실례로는, 반응성기로 변형된 스티렌/디비닐/벤젠 수지, 예컨대 클로로메틸화된 코-폴리-(스티렌-디비닐벤젠), 히드록시메틸화된 코-폴리-(스티렌-디비닐벤젠) 등이 있다. 벤질화되고, 히드록시메틸화된 페닐아세트아미도메틸 (PAM) 수지가 바람직하다. 화합물의 C-말단이 아미드인 경우 바람직한 수지는 p-메틸벤즈히드릴아미노-코-폴리(스티렌-디비닐-벤진) 수지이다.
PAM 수지에 대한 부착은 Nα 보호된 아미노산, 바람직하게는 Boc-아미노산, 그것의 암모늄, 세슘, 트리에틸암모늄, 1,5-디아자비시클로-[5.4.0]운데스-5-엔, 테트라메틸암모늄, 또는 에탄올, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드 (DMF) 등 중의 유사한 염, 바람직하게는 DMF 중의 세슘 염과 수지와의, 고온, 예컨대 약 40 내지 60℃, 바람직하게는 약 50℃에서 약 12 내지 72시간, 바람직하게는 약 48시간 동안 반응시킴으로써 이루어질 수 있다.
Nα-Boc-아미노산은 벤즈히드릴아민 수지에, 예를 들면 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)/1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 중재된 결합반응에 의해 약 2 내지 약 24시간 동안, 바람직하게는 약 2시간 동안 약 10 내지 50℃, 바람직하게는 25℃에서, 디클로로메탄 또는 디메틸포름아미드, 바람직하게는 디클로로메탄과 같은 용매 중에서 부착될 수 있다.
보호된 아미노산의 계속되는 결합반응은 당해 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의해, 전형적으로 자동 펩티드 합성기에서 수행될 수 있다. 트리에틸아민 또는 유사한 염기로 중화된 후에 각각의 보호된 아미노산은 바람직하게는 약 1.5 내지 2.5배 몰 과잉으로 도입되고, 결합반응이 비활성, 비수성, 극성 용매, 예컨대 디클로로메탄, DMF, 또는 그것들의 혼합물, 바람직하게는 디클로로메탄에서 주변 온도에서 수행된다. 대표적인 결합반응제는 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC), N,N'-디이소프로필-카르보디이미드 (DIC) 또는 다른 카르보디이미드이고, 단독으로 또는 1-히드록시벤조트리아졸 (HOBt), O-아실 우레아, 벤조트리아졸-1-일-옥시트리스(피롤리디노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBop), N-히드록시숙신이미드, 다른 N-히드록시이미드, 또는 옥심의 존재하에 사용된다. 또는 달리 보호된 아미노산 활성 에스테르 (예컨대 p-니트로페닐, 펜타플루오로페닐 등) 또는 대칭적인 무수물이 사용될 수 있다.
고체상 합성법이 완료될 때 전체 보호된 펩티드는 수지로부터 제거된다. 수지 지지체에 대한 연쇄가 벤질 에스테르 유형의 것이면, 절단은 알킬아미드 C-말단을 가지는 펩티드의 경우 알킬아민 또는 플루오로알킬아민을 사용한 아미노분해(aminolysis)에 의해, 또는 비치환 아미드 C-말단을 가지는 펩티드의 경우 예컨대 암모니아/메탄올 또는 암모니아/에탄올을 사용한 아미노분해에 의해, 약 -10 내지 50℃, 바람직하게는 약 25℃의 온도에서 약 12 내지 24시간, 바람직하게는 약 18시간 동안 수행될 수 있다. 히드록시 C-말단을 가지는 펩티드는 HF 또는 다른 강력한 산성 탈보호 요법에 의해 또는 비누화에 의해 절단될 수 있다. 또는 달리 펩티드는 수지로부터 예컨대 메탄올을 사용한 트랜스에스테르화와, 이어서 아미노분해 또는 비누화에 의해 제거될 수 있다. 보호된 펩티드는 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다.
측쇄 보호기는 예를 들면 무수 액체 플루오르화 수소를 사용하여 아니솔 또는 다른 카보늄 이온 스캐빈저의 존재하에 아미노분해된 생성물을 처리하거나, 플루오르화 수소/피리딘 복합체로 처리하거나, 트리스(트리플루오로아세틸)보론 및 트리플루오로아세트산으로 처리하거나, 수소와 팔라듐으로 탄소 또는 폴리비닐피롤리돈상에서 환원함으로써, 또는 액체 암모니아 중의 나트륨으로 환원함으로써, 바람직하게는 액체 플루오르화 수소 및 아니솔을 사용하여 약 -10℃ 내지 +10℃ 사이의 온도에서, 바람직하게는 약 0℃에서, 약 15분 내지 2시간 동안, 바람직하게는 약 1.5시간 동안 아미노분해 생성물을 처리함으로써 펩티드로부터 제거될 수 있다.
벤즈히드릴아민 수지 상의 펩티드에 대하여 수지 절단 및 탈보호 단계는 상기에서 설명된 것처럼 액체 플루오르화 수소 및 아니솔을 사용하는 단일 단계와 조힙될 수 있다.
용액은 탈염될 수 있고 (예컨대 BioRad AG-3.RTM. 음이온 교환 수지를 사용하여) 펩티드는 다음 단계들 중 하나 또는 전부를 사용하는 크로마토그래피 단계들의 순서에 의해 정제된다: 아세테이트 형태의 약한 염기성 수지상에서의 이온 교환; 유도되지 않은 코-폴리(스티렌-디비닐벤젠)상에서의 소수성 흡착 크로마토그래피, 예컨대 Amberlite.RTM.XAD; 실리카 겔 흡착 크로마토그래피; 카르복시메틸셀룰로스 상에서의 이온 교환 크로마토그래피; 분할 크로마토그래피, 예컨대 세파덱스.RTM. G-25상에서의 분할 크로마토그래피; 역-전류 분배; 또는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 특히 옥틸- 또는 옥타데실실릴실리카 (ODS) 결합된 상 칼럼 팩킹상에서의 역상 HPLC.
그러므로 본 발명의 다른 측면은 폴리펩티드 및 약제학적으로 허용되는 그것의 염의 제조 방법에 관한 것이고, 그 방법은 순차적으로 보호된 아미노산을 적당한 수지 지지체에 축합시키는 단계, 보호기 및 수지 지지체를 제거하는 단계, 그리고 생성물을 정제함으로써 PACAP와 VIP의 생리적으로 활성인 절단된 동족체 및 유사체, 바람직하게는 C-말단에 있는 아미노산이 상기에서 규정된 바와 같은 양친매성 α-나선 펩티드 서열을 형성하는 PACAP 및 VIP의 유사체를 얻는 단계로 이루어진다.
실시예 3: 대표적인 폴리펩티드 유사체에 대한 예시적인 합성 및 정제 프로 토콜
SEQ ID NO:1에 상응하는 대표적인 폴리펩티드 유사체를 아래에서 설명될 합성 및 정제 방법을 사용하여 제조하였다.
펜타노일-His-Ser-Asp-Ala-Val-Phe-Thr-Asp-Asn-Tyr-Thr-Arg-Leu-Arg-Lys-Gln-Val-Ala-Ala-Lys-Lys-Tyr-Leu-Asn-Trp-Ile-Lys-Lys-Ala-Lys-Arg-Glu-Leu-Leu-Glu-Lys-Leu-Lys(엡실론 스테아로일)-NH2 (SEQ ID NO:1)
일반적으로 펩티드는 Fmoc-Rink-아미드-PEG 수지상에서 Fmoc 화학을 경유하여 합성하였다. 아미노산 측쇄 기능성 기에 대해 사용한 보호기는 다음과 같다: Glu, Tyr, Thr, Asp 및 Ser에 대해서는 t-부틸기; Lys 및 Trp에 대해서는 Boc기; Arg에 대해서는 Pbf기; Asn 및 His에 대해서는 Trt기. N-알파 Fmoc 보호된 아미노산을 EMD Biosciences사 (San Diego, CA)로부터 구입하였다. 결합반응 및 절단을 위한 시약은 Aldrich사 (St. Louis, MO)로부터 구입하였다. 용매는 Fisher Scientific사 (Fairlawn, NJ)으로부터 구입하였다.
일반적으로, 합성 프로토콜은 수지상에서 반복적인 Fmoc 보호기의 제거와 보호된 아미노산의 결합반응에 의한 펩티드 사슬의 어셈블리를 포함하였다. 합성을 위해서 Dde-Lys(Fmoc)-OH를 링크 아미드 수지에 먼저 결합시켰다. 그런 다음 Fmoc 보호기를 DMF중의 20% 피페리딘에 의해 제거하였다. 스테아르산을 Lys의 측쇄에 HBTU, HOBt 및 NMM을 사용하여 결합시켰다. Dde 기를 DMF 중의 2% 히드라진에 의해 제거하고 다음 Fmoc 보호된 아미노산을 결합시켰다. HBTU와 HOBt를 결합 시약으로 서 사용하였고, NMM을 염기로서 사용하였다. 최종 Fmoc 보호기를 제거한 후에 발레르산 (4당량)을 DIC (4당량) 및 HOBt (4당량)을 사용하여 아미노 말단에 결합시켰다. 펩티드 수지를 절단과 측쇄 보호기의 제거를 위해 칵테일 1로 처리하였다. 미정제 펩티드를 저온 에테르로부터 침전시켜서 여과에 의해 수집하였다.
미정제 펩티드의 정제는 RP-HPLC를 통하여 Waters사 (Milford, MA) 제품의 20mm×250mm 칼럼을 사용하여 수행하였다. 펩티드를 TFA 완충액을 사용하여 정제하였다. 60분 동안 35%에서 55%의 아세토니트릴 선형 구배를 사용하였다. 모아진 분획들을 동결건조하였다. 펩티드 동일성을 질량 분광학 분석과 아미노산 분석에 의하여 증명하였다. 펩티드 순도를 분석 HPLC 칼럼 (C18 칼럼, 4.6×250mm, Supelco사 (St. Louis, MO) 제품) 크로마토그래피에 의해 측정하였다.
상기 과정을 다음과 같이 단계식 프로토콜로 요약할 수 있다:
단계 1. 수지 팽윤: Fmoc-링크-아미드-PEG 수지를 DCM에 30분 동안 팽윤시킨다 (10ml/g 수지).
단계 2. 탈보호:
a. 20% 피페리딘/DMF 용액 (10ml/g 수지)을 수지에 첨가하였다;
b. 용액을 30분 동안 교반하고 (교반시간은 모든 수지가 반응 용기 중에서 자유롭게 부유할 때 시작하였다);
c. 용액을 버렸다.
단계 3. 세척: 수지를 DMF (10ml/g 수지)로 5회 세척하였다. 닌히드린 시험을 수행하였고, 그 결과 포지티브로 나타났다.
단계 4. 결합반응:
a. Fmoc-AA-OH (수지 부하와 관련하여 계산한 3당량)와 HOBt (수지 부하와 관련하여 3당량)를 플라스틱병에 무게를 달아 넣었다.
b. 고체를 DMF (5ml/g 수지)로 녹였다.
c. HBTU (수지 부하와 관련하여 3당량)를 혼합물에 첨가한 후, NMM (수지 부하와 관련하여 6당량)을 첨가하였다.
d. 혼합물을 수지에 첨가하였다.
e. 혼합물을 수지의 작은 샘플에 대하여 네거티브 닌히드린 반응이 얻어질 때까지 10 내지 60분 동안 부드럽게 거품을 일으킨다 (또는 교반한다).
단계 5. 세척: 수지를 DMF로 3회 세척하였다.
단계 6. 단계 2에서 5를 펩티드가 어셈블리를 형성할 때까지 반복하였다.
단계 7. N-말단 Fmoc 탈보호: 단계 2를 반복하였다.
단계 8. 세척 및 건조:
a. 최종 결합반응 후에 수지를 DMF로 3회 세척하고, MeOH로 1회 세척, DCM으로 3회 세척, 그리고 MeOH로 3회 세척하였다.
b. 수지를 진공하에 2시간 동안 건조하고 (예컨대 물 증발기) 고진공 (오일 펌프)에서 최소한 12시간 동안 건조하였다.
단계 9. 절단:
a. 건조된 수지를 플라스틱병에 넣고 절단 칵테일을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2.5시간 동안 흔들어주었다.
b. 수지를 감압하에 여과에 의하여 제거하였다. 수지를 TFA로 2회 세척하였다. 여과물을 조합하고 8-10배 부피의 저온 에테르를 첨가하여 침전을 형성하였다.
c. 미정제 펩티드를 여과에 의해 분리한 후, 저온 에테르로 2회 세척하였다.
다음의 화학물질 및 용매를 상기에서 설명된 합성 프로토콜에 사용하였다: NMM (N-메틸모르폴린); HBTU (2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트); HOBt (1-히드록시벤조트리아졸); DMF (디메틸포름아미드); DCM (디클로로메탄); 메탄올; 디에틸에테르; 피페리딘; Tis (트리이소프로필실란); 티오아니솔; 페놀; EDT (1,2-에탄디티올); 트리플루오로아세트산 칵테일 1: TFA/티오아니솔/페놀/H2O/EDT (87.5/5/2.5/2.5/2.5 v/v); TFA 완충액 A (물 중의 0.1% TFA); 및 TFA 완충액 B (아세토니트릴 중의 0.1% TFA).
다른 대표적인 폴리펩티드 유사체를 상기에서 설명된 것과 유사한 방식으로 제조하였다. 하기 표 1에 열거된 것들은 본 발명의 예시적인 폴리펩티드 유사체의 화학적 특성을 나타낸 것이다.
표 1. 예시적인 폴리펩티드 유사체의 특성
유사체 이름 아미노산 서열 RP-HPLC 크로마토그램을 토대로 한 순도 전자분부 질량 분광학을 토대로 한 분자량
TP-103 SEQ ID NO:2 96.9% 5267.2 a.m.u.
TP-104 SEQ ID NO:3 95.5% 4756.7 a.m.u.
TP-105 SEQ ID NO:4 96.1% 5183.3 a.m.u.
TP-106 SEQ ID NO:5 95.2% 4784.8 a.m.u.
TP-107 SEQ ID NO:6 99.6% 4955.1 a.m.u.
TP-108 SEQ ID NO:7 91.5% 5172.4 a.m.u.
실시예 4: 폴리펩티드의 재조합 합성
달리 본 발명의 폴리펩티드를 원하는 폴리펩티드를 코드화하는 유전자의 클 로닝 및 발현에 의해 제조할 수 있다. 이 과정에서는 원하는 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 제조하고, 그것들 적절한 숙주 미생물, 전형적으로는 박테리아, 예컨대 대장균, 또는 효모, 예컨대 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae), 및 플라스미들, 및 본 발명의 폴리펩티드 유사체를 코드화하는 cDNA의 그러한 것들의 복사물을 다수 생성하기 위한 숙주 미생물에 삽입한다.
먼저, 선택된 PACAP 또는 VIP 유사체를 코딩하는 합성 유전자를 편리한 제한 효소 절단 부위로 디자인하여 후속되는 변경을 용이하게 하였다. 문헌에 교시된 바와 같은 (Mullis, 미국 특허 4,683,195호 및 4,683,202호) 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 사용하여 서열을 증폭하였다.
증폭된 합성 유전자를 분리하여 적당한 플라스미드, 예컨대 유전자의 4개의 복사물이 앞뒤로 나란히 삽입될 수 있는 Trp LE 플라스미드에 결찰하였다. Trp LE 플라스미드의 제조에 대해서는 미국 특허 4,738,921호 및 유럽 특허 공보 0212532호에 기재되어 있다. Trp LE 플라스미드는 일반적으로 Trp E 플라스미드보다 8-10배 더 많은 단백질을 생성한다. 그런 다음 다중-복사물 유전자는 적절한 숙주, 예컨대 대장균 또는 사카로마이세스 세레비시아에에서 발현될 수 있다.
본 발명에서는 Trp LE 18 Prot (Ile3, Pro5)를 발현 벡터로서 사용하였다. Trp LE 18 Prot (Ile3, Pro5)는 다음의 요소들을 함유하고 있다: 암피실린 내성 유전자와 플라스미드 복제 기원을 함유하고 있는 pBR322 단편 (EcoRI-BamHI); trp 프로모터와 trpE 유전자를 함유하고 있는 EcoRI-SacII 단편; HIV 프로테아제 (Ile3, Pro5) 유전자 단편 (SacII-HindIII); bGRF 유전자 단편 (HindIII-BamHI); 및 대장균 rpoc 유전자로부터의 전사 터미네이터. HIV 프로테아제와 bGRF 유전자 단편은 중요하지 않으며, 필요에 따라 다른 코딩 서열로 대체될 수도 있다.
그러면 발현된 다량체 융합 단백질은 세포 내에서 안정한 봉입체로 축적되고 그것은 세포 단백질의 휴지기로부터 원심분리에 의해 분리할 수 있다. 분리된 융합 단백질을 단량체의 PACAP 또는 VIP 유사체로 전환하고 양이온 교환 및/또는 역상 HPLC에 의해 정제할 수 있다.
클로닝, 증폭, 발현, 및 정제에 대한 대체 방법은 당업자에게 명백할 것이다. 대표적인 방법은 문헌에 개시되어 있다 (Maniatis, et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory (2001)).
실시예 5: 샘 세포 휴지기 배양물을 사용한 시험관내 생물학적 정량
다음의 예시적인 시험관 내 생물학적 정량을 수행하여 대표적인 폴리펩티드 유사체가 인슐린 분비를 조절하는 능력을 평가하였다.
샘(islet) 분리. 쥐의 샘을 체중이 약 250g인 수컷의 피셔 쥐로부터 수득하고 (Sweet IR et al., (2004) Biochem. Biophys. Res. Commun. 314, 976-983), 쥐를 펜토바르비탈 나트륨 (35mg/230g 쥐)의 복강 내 주사에 의해 마취시켰다. 일반적으로, 샘을 콜라게나제 (10mL의 0.23mg/ml 리버라제, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)를 부분적으로 절개된 췌장의 췌장 관에 주사하고, 그것을 수술로 꺼냄으로써 준비하였다. 모든 과정은 워싱턴 대학의 동물 보호 및 이용 위원회 (Instotutional Animal Care and Use Committee at the University of Washington)의 승인을 받았다.
췌장을 5mL의 0.23mg/mL의 리버라제가 들어있는 15mL의 원추형 튜브에 넣고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 소화물을 400-마이크로미터 스테인레스 강 스크린을 통하여 여과하고, 행크 완충 염 용액으로 세정한 다음, Optiprep의 구배 용액 (Nycomed, Oslo, Norway)으로 정제하였다. 샘을 18-24시간 동안 배양한 후, 10% (v/v)의 열 비활성화 우 태아 혈청 (FBS), 항생물질-안티미코틱 (100U/mL 페니실린, 100 lg/mL 스트렙토마이신, 및 0.25 lg/mL의 암포테리신 B), 2mM 글루타민 (모두 Gibco-BRL 제품, Grand Island, NY) 및 1mM의 베타 머캅토에탄올이 들어있는 RPMI 배지 1640에서 분석을 수행하였다.
생물학적 정량. 샘을 현미경하에서 취하여서 10ml의 3mM 크렙스 링거 완충 (KRB) 용액에 넣어 세척하였다. 샘을 3mM의 글루코스 KRB에서 60분 동안 인큐베이션한 후, 웰당 10개의 샘의 그룹을 96-웰 플레이트의 200㎕의 배지에 넣었다. 샘을 120분 동안 조절 또는 처리조건 하에서 인큐베이션하고, 그 상층액을 수집하였다. 전형적인 시험조건 세트는 3mM 글루코스 (휴지기 대조표준), 16mM 글루코스 (시험 대조표준), 16mM 글루코스 + 10nm GLP1, 16mM 글루코스 + 10nM 엑센딘-4, 16mM 글루코스 + 50nM 시험 펩티드였다. 완충조건은 0.1% BSA, 20mM HEPES가 첨가된 KRB를 사용하였고, 4개를 한 벌로 정하여 수행하였다. 상층액을 인슐린 함량에 대하여 시판중인 인슐린 효소-결합 면역흡착제 (ELISA) 분석법을 제조업체의 지시를 따라 사용하여 평가하였다.
생물학적 정량의 결과. 하기 표 2는 200nM의 농도에서 상기 분석에서 최대 활성을 나타낸 유사체 TP-106에 대한 상기 분석에서 얻어진 인슐린 분비를 예시한다. 비교를 위해, 엑센딘 4를 같은 분석에서 시험하였고, 그 결과 10nM에서 최대 활성을 나타냈다. TP-106은 매우 소수성인 유사체로, sc 주사 부위에 저장하기 위해 디자인되었고, 따라서 효과적인 TP-106의 농도는 정상적인 농도 (200nM)보다 훨씬 더 낮을 것으로 예상된다.
표 2. TP-106을 사용한 섬 세포 휴지기 배양물의 생물학적 정량의 결과
분비된 인슐린 (ng/100 샘/분) 표준 편차
3mM 글루코스 0.01 0.00
16mM 글루코스 1.38 0.17
엑센딘 4 + 16mM 글루코스 4.82 0.20
50nM TP-106 + 16mM 글루코스 2.72 0.60
200nM TP-106 + 16mM 글루코스 5.20 0.50
16mM 글루코스 + 16mM 글루코스 1.58 0.05
상기에서 설명된 샘 세포 휴지기 배양물 분석을 추가의 예시적인 폴리펩티드 유사체에 대해서도 수행하였다. TP-107은 이 분석에서 100nM의 농도에서 최대 활성을 나타냈다. 비교를 위해, 엑센딘 4를 이 분석으로 시험하였고, 10nM에서 최대 활성을 나타냈다. 제시된 펩티드는 혈청 알부민에 결합하기 위해 디자인된 것으로, 따라서 인슐린 활성을 부여하기 위한 유리 펩티드의 농도는 훨씬 더 낮은 것으로 예상되고, 그러므로 이 시험관 내 분석에서 나타난 것보다 더 강력한 유사체이다.
표 3. TP-107 및 TP-108을 사용한 샘 세포 휴지기 배양물의 생물학적 정량의 결과
분비된 인슐린 (ng/100 샘/분) 표준 편차
3mM 글루코스 0.14 0.00
16mM 글루코스 3.65 0.80
10nM 엑센딘 4 + 16mM 글루코스 6.75 1.15
10nM PACAP + 16mM 글루코스 6.07 1.67
10nM TP-107 + 16mM 글루코스 2.89 0.21
100nM TP-107 + 16mM 글루코스 6.10 1.55
1μM TP-107 + 16mM 글루코스 6.07 0.90
100nM TP-108 + 16mM 글루코스 4.10 1.21
1μM TP-108 + 16mM 글루코스 5.65 0.13
실시예 6: 생체 내 생물학적 정량
다음의 예시적인 생체 내 분석을 수행하여 대표적인 폴리펩티드 유사체가 인슐린 분비를 조절하는 능력을 평가하였다.
시험한 연구 그룹. 생후 8주 된 암컷 네이브(Naive) db/db 마우스들을 일주일 동안 새 환경에 순응시키고, 그동안에 동물들을 주기적으로 실험 과정에 순응하도록 훈련하였다. 연구 그룹은 그룹당 6마리씩을 포함하고, 복강 내 주사에 의하여 다음 중 하나를 투여하였다:
(1) 비히클 대조표준;
(2) 포지티브 대조표준 (엑센딘-4 또는 다른 표준 처리);
(3) 고용량의 폴리펩티드 유사체; 또는
(4) 저용량의 폴리펩티드 유사체.
소량의 혈액을 꼬리 끝을 잘라 취하여서 혈액을 샘플화하였다. 혈당 수준을 시판중인 수-작업 글루코스 계측기로 측정하였다. 제1일째에 동물들에게 폴리펩티드 유사체와 대조표준을 아침에 주사하였다. 주사 직전과 주사 후 2, 4, 8, 14, 및 24시간 후에 혈액 샘플을 취하여 즉시 분석하였다. 동물들에게 분석기간 내내 임의대로 먹이를 주었다 (Tsutsumi et al., Diabetes 51:1453-60 (2002)).
하기 표 4는 상기에서 설명한 생체 내 분석으로부터 얻어진 데이터를 표준 샘플화한 것을 열거한 것이다. 하기에서 알 수 있는 바와 같이, TP-106은 주사 후 2시간 후에 고용량에서 통계학적으로 유의할만한 활성 (예컨대 감소된 혈장 글루코스)을 나타냈고 투여 후 4시간째에도 활성을 유지하였다.
표 4. TP-103 및 TP-106을 사용한 생체 내 분석의 결과
평균 혈당 수준 (mmol/L)
0시간 2시간 4시간 8시간 14시간 24시간
비히클 23.9 s.d.*=1.33 21.9 s.d.=1.22 18.3 s.d.=1.01 27.3 s.d.=1.52 22.5 s.d.=1.25 23.5 s.d.=1.31
TP-103 저용량 22.9 s.d.=1.27 20.5 s.d.=1.14 17.6 s.d.=0.98 26.4 s.d.=1.47 24.6 s.d.=1.37 21.4 s.d.=1.19
TP-103 고용량 20.7 s.d.=1.15 17.3 s.d.=0.96 16.9 s.d.=0.94 23.4 s.d.=1.30 23.7 s.d.=1.31 25.0 s.d.=1.39
TP-106 저용량 23.9 s.d.=1.33 20.5 s.d.=1.14 16.1 s.d.=0.89 24.0 s.d.=1.33 28.2 s.d.=1.57 23.2 s.d.=1.29
TP-106 고용량 21.8 s.d.=1.21 13.4 s.d.=0.75 14.7 s.d.=0.82 25.1 s.d.=1.39 26.3 s.d.=1.46 21.2 s.d.=1.18
실시예 7: 본 발명의 용도
본 발명의 폴리펩티드는 다양한 대사성 장애의 방지 및 치료에 유용하다. 특히, 본 발명의 화합물은 상승된 혈당 수준, 혈당 과다증, 당뇨, 이를테면 유형 2 당뇨병, 인슐린 내성, 대사성 산 과다증 및 비만의 예방 및 치료적 처치에 대해 효과를 나타낸다.
일반적으로 본 발명의 폴리펩티드, 또는 그것의 염은 하루에 약 0.01 내지 1㎍/kg 체중의 양으로, 바람직하게는 하루에 약 0.07 내지 약 0.2㎍/kg 체중의 양으로 투여된다. 체중이 50kg인 여성의 경우, 매일 활성 성분의 용량은 약 0.5 내지 약 50㎍, 바람직하게는 약 3.5 내지 약 10㎍이다. 다른 포유류, 예컨대 말, 개, 및 소의 경우에는, 더 높은 용량이 필요할 것이다. 이런 단위용량은 종래의 약제학적 조성물로 단일 투여에 의해, 다중 적용에 의해, 도는 조절된 방출을 통해, 가장 효과적인 결과를 이루기 위해 필요한 대로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 하루에 1회 또는 수회 주사에 의해 이루어진다.
다른 실시예에서 본 발명의 폴리펩티드는 대사성 장애의 치료에 유용한 다른 화합물과 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드는 대사성 장애의 치료에 사용된 다음 화합물들 중 하나 또는 둘 이상과 함께 투여될 수 있다: 그것들에 한정되는 것은 아니지만, 인슐린, 인슐린 유사체, 인크레틴, 인크레틴 유사체, 글루카곤-유사 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 유사체, 엑센딘, 엑센딘 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, α-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온, 페록시솜 증식제 활성화된 수용체 (PPAR, PPAR 수용체의 α, β, 또는 γ 하위유형에 대해 작용하는 제제 및/또는 PPAR 수용체의 다중 하위유형에 작용하는 제제 포함) 아고니스트, PPAR 길항체 및 PPAR 부분 아고니스트는 본 발명의 폴리펩티드와 함께 투여될 수 있다.
정확한 용량 및 조성물 및 가장 적합한 전달 계획의 선택은 무엇보다도 선택되는 폴리펩티드의 약리학적 특성, 치료될 질환의 성질 및 심각성, 및 수용체의 물리적 조건 및 정신적 예민성에 의해 영향을 받을 것이다.
대표적인 전달 계획은 경구, 비경구 (이를테면 피하, 근육내 및 정맥내), 직장, 구강 (이를테면 혀밑), 경피, 및 비강내 투여를 포함한다.
약제학적으로 허용되는 염은 독성 부작용 없이 원래의 폴리펩티드의 원하는 생물학적 활성을 보유한다. 그러한 염의 실례로는 (a) 무기 산과 형성된 산 부가 염, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등과 형성된 산 부가 염; 및 유기산, 예컨대 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄닌산, 팜모산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 나프탈렌 디술폰산, 폴리갈락투론산 등과 형성된 산 부가 염; (b) 다가의 금속 양이온, 예컨대 아연, 칼슘, 비스무트, 바륨, 마그네슘, 알루미늄, 구리, 코발트, 니켈, 카드뮴 등과 형성된 염기 부가염; 또는 N,N'-디벤질에틸렌디아민 또는 에틸렌디아민으로부터 형성된 유기 양이온과 형성된 염기 부가염; 또는 (c) (a)와 (b)의 조합, 예컨대 아연 탄네이트 염 등이 있다.
본 발명의 추가의 측면은 활성 성분으로서 본 발명의 폴리펩티드, 또는 그것의 약제학적으로 허용되는 염을, 약제학적으로 허용되는 비-독성 담체와 혼합 형태로 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 상기에서 언급된 바와 같이, 그러한 조성물은 비경구 (피하, 근육내 또는 정맥내) 투여를 위해, 특히 액체 용액 또는 현탁액의 형태로; 경구 또는 구강 투여를 위해, 특히 정제 또는 캡슐의 형태로; 비강내 투여를 위해, 특히 분말, 비강용 액적 또는 에어로졸의 형태로; 및 직장 또는 경피 투여를 위해 제조될 수 있다.
조성물은 편리하게 단위 용량 형태로 투여될 수 있고, 약제 분야에서 잘 알려져 있는 방법들 중 어느 하나에 의해, 예컨대 문헌에 설명되어 있는 것과 같이 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985)) 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제형은 부형제로서 멸균수 또는 식염수, 알킬렌 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜, 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기원의 오일, 수소화된 나프탈렌 등을 함유할 수 있다. 경구 투여를 위해서는, 제형은 담즙산염 또는 아크릴카르니틴의 첨가에 의해 증대될 수 있다. 비강 투여를 위한 제형은 고체일 수 있으며, 부형제, 예컨대 락토스 또는 덱스트란을 함유하거나, 비강 액적 또는 계량형 분무 형태로 사용하기 위해 수성 또는 유성 용액일 수 있다. 구강내 투여를 위한 전형적인 부형제는 당, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘, 예비젤라틴화된 전분 등을 포함한다.
비강 투여를 위해 제형될 때 비강 점막을 가로지르는 흡착은 약 0.2 내지 15중량%, 바람직하게는 약 0.5 내지 4중량%, 가장 바람직하게는 약 2중량%의 양으로 사용되는 계면활성 산, 예컨대 글리코콜산, 콜산, 타우로콜산, 에토콜산, 데옥시콜산, 케노데옥시콜산, 데히드로콜산, 글리코데옥시콜산, 시클로덱스트린 등에 의해 증대될 수 있다. 자극은 감소시키면서 더 큰 효능을 나타내는 추가 부류의 흡착 증강제는 알킬 말토시드 부류, 예컨대 테트라데실말토시드이다 (Arnold, JJ, et al. (2004), J. Pharm. Sci. 93:2205-13).
연장된 기간 동안, 예컨대 1주일에서 1년 동안 대상에게 본 발명의 화합물을 전달하는 것은, 원하는 방출 기간 동안 충분한 활성 성분을 함유하는 방출이 조절된 시스템을 1회 투여함으로써 이루어질 수 있다. 다양한 방출 조절 시스템, 예컨대 모놀리식 또는 저장소-형 마이크로캡슐, 저장 이식물, 삼투성 펌프, 액포, 미셸, 리포솜, 경피 패치, 전리 요법 장치 및 대체성 주사 단위용량 형태가 이 목적에 대해 사용될 수 있다. 활성 성분의 전달이 요구되는 부위에서의 위치 지정은 일부 방출 조절 장치의 추가 특징이며, 그것은 어떤 질병의 치료에는 유익하게 작용 할 수 있다.
방출 조절 제형의 한 형태는 켄트 등에 의해 선구자적 연구에서 설명된 바와 같이 폴리펩티드 또는 그것의 염을 서서히 분해하는 비-독성, 비-항원성 중합체, 예컨대 코폴리(락트산/글리콜산)에 분산되거나 캡슐화되어 있는 상태로 함유한다 (Kent, Lewis, Sanders, and Tice, 미국 특허 4,675,189호). 화합물, 또는 바람직하게는 그것들의 상대적으로 불용성 염은 또한 콜레스테롤 또는 다른 지질 매트릭스 펠릿에 제형되거나 실라스토머(silastomer) 매트릭스 이식물에 제형될 수 있다. 추가의 느린 방출성 저장 이식물 또는 주사가능한 제형도 당업자들에게 명백하게 될 것이다 (Sustained and Contolled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978, and R. W. Baker, Controlled Release of Biologically Active Agents, John Wiley & Sons, New York, 1987).
본 명세서 및 본원에서 언급된 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 공보 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조로 삽입된 것과 동일한 정도로 참조로 삽입된 것이다.
본 발명의 대표적인 화합물의 합성 및 시험을 예시하기 위하여 실시예 및 논의가 상기에서 설명되었지만, 추가의 변형이 있을 수 있으며, 첨부되는 청구범위의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것은 물론이다.
참고문헌
Figure 112007028085734-PCT00001
Figure 112007028085734-PCT00002
본 발명의 폴리펩티드는 다양한 대사성 장애의 방지 및 치료에 유용하다.

Claims (19)

  1. 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 혈관작용성 장내 폴리펩티드:
    (a) 다음 식 (I)에 상응하는 폴리펩티드:
    아실-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7-Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-Lys(ε-긴 아실)-X
    식 (I)
    상기 식에서,
    n은 1 내지 3이고;
    Haa는 친수성 아미노산이며;
    Laa는 친유성 아미노산이고;
    아실은 C2 -16 아실 사슬이며;
    긴 아실은 C12 -24 아실 사슬이고;
    X는 OH 또는 NHR1이고 이때에 R1은 H 또는 저급 알킬, 할로알킬, 또는 PEG이며;
    aa1은 Gly 또는 Ala이고;
    aa2는 Val, Ile, 또는 Leu이며;
    aa3은 Asp 또는 Arg이고;
    aa4는 Ser 또는 Asn이며;
    aa5는 Ser 또는 Thr이고;
    aa6은 Leu 또는 Tyr이며;
    aa7은 Met, Leu 또는 Val이고;
    aa8은 Ala 또는 Val이며;
    aa9는 Asn, Gln, 또는 Ala이고;
    aa10은 Trp, Ala, 또는 Ser이며;
    aa11은 Ile 또는 Val이고;
    aa12는 Leu 또는 Lys이며;
    aa13은 Lys, Arg, Asn, 또는 Gly이고;
    aa14는 Ala 또는 Gly이며;
    aa15는 Lys 또는 Arg이고;
    aa16은 Lys 또는 Arg이다;
    (b) 다음 식 (II)에 상응하는 아미노산 서열:
    아실-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7- Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-aa17-Pro-Pro-Pro-Lys(ε-긴 아실)-X
    식 (II)
    상기 식에서,
    n은 1 내지 3이고;
    Haa는 친수성 아미노산이며;
    Laa는 친유성 아미노산이고;
    아실은 C2 -16 아실 사슬이며;
    긴 아실은 C12 -24 아실 사슬이고;
    X는 OH 또는 NHR1이고 이때에 R1은 H 또는 저급 알킬, 할로알킬, 또는 PEG이며;
    aa1은 Gly 또는 Ala이고;
    aa2는 Val, Ile, 또는 Leu이며;
    aa3은 Asp 또는 Arg이고;
    aa4는 Ser 또는 Asn이며;
    aa5는 Ser 또는 Thr이고;
    aa6은 Leu 또는 Tyr이며;
    aa7은 Met, Leu 또는 Val이고;
    aa8은 Ala 또는 Val이며;
    aa9는 Asn, Gln, 또는 Ala이고;
    aa10은 Trp, Ala, 또는 Ser이며;
    aa11은 Ile 또는 Val이고;
    aa12는 Leu 또는 Lys이며;
    aa13은 Lys, Arg, Asn, 또는 Gly이고;
    aa14는 Ala 또는 Gly이며;
    aa15는 Lys 또는 Arg이고;
    aa16은 Lys 또는 Arg이며;
    aa17은 없거나 Gln이다;
    (c) 다음 식 (III)에 상응하는 아미노산 서열:
    아실-His-Ser-Asp-aa1-aa2-Phe-Thr-aa3-aa4-Tyr-aa5-Arg-aa6-Arg-Lys-Gln-aa7-Ala-aa8-Lys-Lys-Tyr-Leu-aa9-aa10-aa11-aa12-aa13-aa14-aa15-aa16-Haa-(Laa-Laa-Haa-Haa)n-Laa-Lys(ε-긴 아실)-PEG
    식 (III)
    상기 식에서,
    n은 1 내지 3이고;
    Haa는 친수성 아미노산이며;
    Laa는 친유성 아미노산이고;
    아실은 C2 -16 아실 사슬이며;
    긴 아실은 C12 -24 아실 사슬이고;
    aa1은 Gly 또는 Ala이고;
    aa2는 Val, Ile, 또는 Leu이며;
    aa3은 Asp 또는 Arg이고;
    aa4는 Ser 또는 Asn이며;
    aa5는 Ser 또는 Thr이고;
    aa6은 Leu 또는 Tyr이며;
    aa7은 Met, Leu 또는 Val이고;
    aa8은 Ala 또는 Val이며;
    aa9는 Asn, Gln, 또는 Ala이고;
    aa10은 Trp, Ala, 또는 Ser이며;
    aa11은 Ile 또는 Val이고;
    aa12는 Leu 또는 Lys이며;
    aa13은 Lys, Arg, Asn, 또는 Gly이고;
    aa14는 Ala 또는 Gly이며;
    aa15는 Lys 또는 Arg이고;
    aa16은 Lys 또는 Arg이다; 및
    (d) SEQ ID NO:1 내지 SEQ ID NO:38로부터 선택된 폴리펩티드.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 아실이 C4-C8 아실 사슬이고; 긴 아실이 C6-C14 아실 사슬이며; PEG가 C2-C20 사슬의 폴리에틸렌 글리콜 사슬인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  3. 제 1 항에서 청구되는 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
    상기 방법이 보호된 아미노산을 펩티드 사슬에 순차적으로 첨가하는 단계, 보호기를 제거하는 단계, 폴리펩티드를 탈염 및 정제하는 단계에 의해 폴리펩티드를 합성하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항의 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
    상기 방법이 상기 폴리펩티드를 코드화하는 유전자를 발현시키고, 발현된 폴리펩티드를 정제하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항의 폴리펩티드를 코드화하는 발현 벡터.
  6. 제 5 항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
  7. 제 1 항의 폴리펩티드, 또는 그것의 허용되는 염의 유효량, 및 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    인슐린, 인슐린 유사체, 인크레틴, 인크레틴 유사체, 글루카곤-유사 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 유사체, 엑센딘, 엑센딘 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, α-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온, 페록시솜 증식제 활성화된 수용체 (PPAR) 아고니스트, PPAR 길항체 및 PPAR 부분 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물의 유효량을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  9. 상승된 혈당 수준을 치료하는 방법으로서,
    상기 방법이 제 1 항의 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 이루 어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    인슐린, 인슐린 유사체, 인크레틴, 인크레틴 유사체, 글루카곤-유사 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 유사체, 엑센딘, 엑센딘 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, α-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온, PPAR 아고니스트, PPAR 길항체 및 PPAR 부분 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 당뇨의 치료 방법으로서, 상기 방법이 제 1 항의 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 당뇨가 제2형 당뇨병인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서,
    인슐린, 인슐린 유사체, 인크레틴, 인크레틴 유사체, 글루카곤-유사 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 유사체, 엑센딘, 엑센딘 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, α-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온, PPAR 아고니스트, PPAR 길항체 및 PPAR 부분 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물의 치료 적 유효량을 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 인슐린 내성을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제 1 항의 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    인슐린, 인슐린 유사체, 인크레틴, 인크레틴 유사체, 글루카곤-유사 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 유사체, 엑센딘, 엑센딘 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, α-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온, PPAR 아고니스트, PPAR 길항체 및 PPAR 부분 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 대사성 산 과다증을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제 1 항의 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    인슐린, 인슐린 유사체, 인크레틴, 인크레틴 유사체, 글루카곤-유사 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 유사체, 엑센딘, 엑센딘 유사체, 술포닐우레아, α-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온, PPAR 아고니스트, PPAR 길항체 및 PPAR 부분 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 비만을 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 제 1 항의 폴리펩티드의 치료적 유효량을 투여하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    인슐린, 인슐린 유사체, 인크레틴, 인크레틴 유사체, 글루카곤-유사 펩티드, 글루카곤-유사 펩티드 유사체, 엑센딘, 엑센딘 유사체, 술포닐우레아, 비구아니드, α-글루코시다제 억제제, 티아졸리딘디온, PPAR 아고니스트, PPAR 길항체 및 PPAR 부분 아고니스트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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