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KR20070062973A - 미세전이암의 진단을 위한 항체와 접합된 시아닌 염료 - Google Patents

미세전이암의 진단을 위한 항체와 접합된 시아닌 염료 Download PDF

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KR20070062973A
KR20070062973A KR1020077004081A KR20077004081A KR20070062973A KR 20070062973 A KR20070062973 A KR 20070062973A KR 1020077004081 A KR1020077004081 A KR 1020077004081A KR 20077004081 A KR20077004081 A KR 20077004081A KR 20070062973 A KR20070062973 A KR 20070062973A
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dysplasia
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KR1020077004081A
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English (en)
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미하엘 쉬르너
카이 리차
페터 하우프
크리스틴 펄리츠
Original Assignee
바이엘 쉐링 파마 악티엔게젤샤프트
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Publication date
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Abstract

본 발명은 혈관형성과 관련된 미세전이암 및 소증식성 병변, 특히 원발 종양, 전암 증상, 이형성증, 화생, 염증성 병변, 예컨대 건선, 건선성 관절염 및/또는 류마티스성 관절염, 자궁내막증 병변 및 안 질환의 진단을 위한, 혈관생성 특이성 결합 성분, 바람직하게는 EB-D 피브로넥틴 특이성 결합 성분과 시아닌 염료의 접합체의 용도에 관한 것이다.
시아닌 염료, EB-D 피브로넥틴, 미세전이암.

Description

미세전이암의 진단을 위한 항체와 접합된 시아닌 염료{CYANINE DYES CONJUGATED WITH ANTIBODIES FOR THE DIAGNOSIS OF MICROMETASTASIS}
본 발명은 미세전이암 및 소증식성 병변, 특히 혈관형성과 관련된 원발 종양, 전암 증상, 이형성증, 화생, 염증성 병변, 예컨대 건선, 건선성 관절염 및/또는 류마티스성 관절염, 자궁내막증 병변 및 안 질환의 진단을 위한, 혈관생성 특이성 결합 성분, 바람직하게는 EB-D 피브로넥틴 특이성 결합 성분과 시아닌 염료의 접합체의 용도에 관한 것이다.
의료 진단에서의 광의 사용은 최근에 그 중요성이 부각되고 있다. [예컨대, Biomedical Photonics Handbook (Editor: T. Vo-Dinh), CRC Press]. 광범위한 진단 과정은 다양한 의료 분야, 예컨대 내시경술, 유방조영술, 수술 또는 부인과학에서의 적용예에 대하여 테스트하는 실험이 진행되고 있다. 이를 위하여, 염료는 형광 진단 및 조영을 위한 외인성 조영제로서 조직에 공급되며, 특히 700 내지 900 ㎚의 스펙트럼 범위(조직의 진단 윈도우)에서 흡광 및 형광 최대치를 갖는 형광 염료가 생체내 조영에 사용되어 왔다. 이러한 파장을 갖는 광자는 조직에 의하여 비교적 거의 흡수되지 않으며, 흡수 과정(주로 옥시헤모글로빈 및 데옥시헤모글로빈에 의한)이 광 전달을 종료하기 이전에 조직에 수 센티미터 투과할 수 있다. 또 한, 흡수는 조직으로 투입되나, 흡수된 에너지를 더 긴 파장의 형광 방사 형태로 방출하는 형광 염료에 의하여 발생될 수 있다. 이러한 형광 방사는 분광학적으로 분리된 상태로 검출될 수 있으며, 염료의 국소화 및 염료가 결합된 분자 구조와의 상관 관계를 가능케 한다. 이와 관련하여 문헌[Licha, K. (2002) Contrast Agents for Optical Imaging (Review). In: Topics in Current Chemistry-Contrast Agents II (Editor: W. Krause), Volume 222, Springer Heidelberg, pp. 1-31.[을 참조한다.
시아닌 염료 유형으로부터의 형광 염료는 유망한 대표군의 카테고리에 속하며, 다수의 상이한 구조 폭으로 합성된다. 특히, 인도카르보시아닌, 인도디카르보시아닌 및 인도트리카르보시아닌 골격을 갖는 카르보시아닌은 흡광 계수가 높으며, 형광 양자 수율이 우수하다. [Licha, K. (2002) 상동 및 본 명세서에서 참고로 인용함].
질환을 가진 구조와 건강한 조직 사이의 진단적 유의성 분화를 달성하기 위하여, 투여되는 염료는 가능한 한 두 조직 유형 사이의 농도차가 높게 되어야만 한다. 이는 종양-생리적 또는 형태학적 성질(혈액 공급, 분포 역학, 지연된 제거, 혈관 구조)뿐 아니라, 종양 및 혈관 세포 또는 이웃한 조직의 분자 성질에 기초하여 실시될 수 있다. 질환-특이성 구조의 분자 표지의 경우, 표적-친화성(affine) 분자, 예컨대 단백질, 펩티드 또는 항체를 갖는 형광 염료로 이루어진 접합체를 사용할 수 있다. 주사후, 이들 접합체의 특정 부분은 분자 표적 구조, 예컨대 수용체, 세포 표면 구조 또는 기질 단백질에 결합되며, 결합되지 않은 부분은 체액중에 서 희석 또는 대사된 채로 잔존하거나 또는 신체로부터 배설된다. 이러한 방법에서, 더 높은 농도차 및 이에 의한 형광 진단에서의 더 큰 영상 대조가 초래될 수 있다(높은 시그날 대 노이즈 비율).
예를 들면, 종양[Folkman J. (1974). Symp. Soc. Dev. Biol. 30:43-52], 관절염[Colville-Nash P R, Scott D L (1992) Ann. Rheum. Dis. 51:919-25], 건선[Folkman J. (1972) J. Invest. Dermatol. 59:40-43], 안 질환[Adamis A P, et al. (1999) Angiogenesis, 3:9-14]과 같은 다수의 질환은 혈관형성과 관련된 것으로 기재되어 있다. 혈관형성과 관련된 각종 질환은 예를 들면 [Longo R, et al. (2002) Angiogenesis 5:237-56]에 보고되어 있다. 반대로, 새로운 혈관의 형성은 상처 치유 및, 월경 주기 또는 임신중에 자궁내막 조직에서의 변화를 비롯한 약간의 것을 제외하고 건강한 조직에서는 거의 발생하지 않는다. 그래서, 신생혈관형성은 중요한 치료뿐 아니라, 진단 표적이 된다.
혈관 내피 성장 인자 수용체(VEGF-R)와 같은 내피 세포 및 도메인외 B (ED-B) 피브로넥틴과 같은 기질 단백질상에서의 수용체를 비롯한 성장중인, 혈관 세포에 존재하거나 또는 이웃하게 선별적으로 또는 배타적으로 존재하는 다수의 분자 구조는 문헌[예를 들면, Alessi P, et al. (2004) Biochim. Biophys. Acta. 1654:39-49 및 Nanda A and St. Croix B (2004) Curr. Opin. Oncol. 16:44-49]에 기재되어 있다. 피브로넥틴 분자로 교호 스플라이싱되어 삽입되는 마우스, 래트 및 사람에서 동일한 91 개의 아미노산의 서열은 신생 혈관 구조 주위에 특이적으로 축적되는 것으로 나타났다. [Castellani et al. (1994). Int. J. Cancer 59:612- 618].
미세전이암은 악성 세포 >0.2 ㎜의 응집성 무리이며, 악성 세포 <0.2 ㎜의 무리는 하부-미세전이암으로 지칭된다 [Van der Westhuizen N. (2002) Laboratory Report; Rampaul R S, et al. (2001) Breast Cancer Res. 3:113-116; Bitterman A., et al. (2002) IMAJ 4:803-809]. 현재, 현미경을 사용하여 시험관내에서만 검출될 수 있는 미세전이암은 혈관형성 또는 비-혈관형성일 수 있다. 원발 종양 및 전이를 비롯한 대부분의 사람 종양은 혈관형성 활성 없이 발생하며, 수개월 내지 수년간 직경이 0.2 내지 <2 ㎜인 현미경적 병변으로서 그 자리에서 존재하며, 그후 소비율이 혈관형성 표현형으로 전환될 수 있다. [Folkman J and Becker K (2000) Acad. Radiol. 7:783-785; Folkman J (2001) Angiogenesis. In Braunwald E, et al., Harrison's Textbook of Internal Medicine, 15th Edition, McGraw-Hill, 517-530]. 세포 수준에서, 혈관형성 전환의 4 개 이상의 기전은 사람 및 마우스 종양에서 확인되었다: (1) 무혈관 내암종은 이웃하는 숙주 혈관층에서의 -사람 종양에서 가장 흔한 과정인- 신생혈관화를 자극하여 이들 자체의 혈액 공급을 보충할 수 있으며, (2) 골수로부터의 순환중인 전구체 내피 세포가 혈관형성 병터로 혼입될 수 있으며, (3) 종양은 종양층에서의 숙조 섬유모세포 및/또는 포식세포를 유발하여 혈관형성 인자 (예컨대 혈관 내피 성장 인자 (VEGF))를 과발현시키며; 및 (4) 이미 존재하는 혈관은 종양 세포에 의하여 흡수될 수 있다. 또한, 혈관형성 전환은 이러한 기전의 조합을 포함할 수 있다. [Folkman J (2001) Angiogenesis. In Braunwald E, et al., Harrison's Textbook of Internal Medicine, 15th Edition, McGraw-Hill, 517-530]. 전-혈관형성 분자의 효과가 항-혈관형성 분자의 효과와 균형을 이룰 경우 "혈관형성 전환"은 "오프" 상태가 되지만, 총 균형이 혈관형성을 위하여 균형이 깨질 경우 "온" 상태가 되는 것으로 널리 용인되었다. 이러한 전환을 유발하는 각종 시그날이 발견되었었다. 혈관형성 활성인자는 예컨대, VEGF 구성원, VEGFR, NRP-1, Ang1, Thie2, PDGF-BB 및 수용체, TGF-β1, 엔도글린, TGF-β 수용체, FGF, HGF, MCP-1, 인테그린 (αvβ3, αvβ5, α5β1), VE-카드헤린, PECAM (CD31), 에프린, 플라스미노겐 활성인자, MMP, PAI-1, NOS, COX-2, AC133, 케모킨 또는 Id1/Id3과 같은 분자 구조이다. 혈관형성 억제제는 예컨대, VEGFR-1, Ang2, TSP-1, -2, 안지오스타틴 및 관련 플라스미노겐 크링글, 엔도스타틴 (콜라겐 XVII 분절), 바소스타틴, 혈소판 인자 4, TIMP, MMP 억제제, PEX, Meth-1, Meth-2, IFN-α, -β, -γ, IP-10, IL-4, IL-12, IL-18, 프롤락틴 (M, 16K), VEGI, SPARC의 분절, 오스테오폰틴 분절 또는 마스핀과 같은 분자 구조이다. [Carmeliet P and Jain R K. (2000) Nature 407:249-257; Yancopoulos G D et al. (2000) Nature 407:242-248; Bergers G. and Benjamin L E (2002) Nature Reviews Cancer 3:401-410; Hendrix M J C et al. (2002) Nature Reviews Cancer 3:411-421].
문헌[Ntziachristos V, et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97:2767-2772]에는 인도시아닌 그린 개선을 갖는 섬유선종의 확산 광학 단층촬영술이 기재되어 있다. 분해된 종양은 크기가 1 ㎝ 초과인 원발 종양이다.
WO01/23005 A1에는 ED-B 특이성 항체 및 각종 염료의 접합체 및 종양 주변의 윤곽에서의 이의 용도가 기재되어 있다. 이러한 접합체를 사용하여 얻을 수 있는 부분 분해에 대하여서는 개시되어 있지 않다.
문헌[McDonald D. M 및 Choyke P. L (2003) Nat. Med. 9: 713-25]에는 혈관형성의 조영화에서의 개선이 기재되어 있다. 이 문헌에는 자기 공명 조영술(MRI), 컴퓨터 단층촬영술(CT), 양전자 방출 단층촬영술(PET), 초음파검사법 및 광학 영상화가 비침습성 방법을 제공하여 동물 및 사람의 혈관형성의 영상을 얻는 방법에 대하여 기재되어 있다. 이 문헌에는 이들 방법이 보존된 조직 검체에 대하여 가장 높은 분해를 제공하는 반면, 임상적 방법은 훨씬 더 낮은 분해율 및 특이성에서 생조직의 화상을 제공하며, 미세순환의 혈관을 분해할 수 없는 것으로 기재되어 있다. 미래의 시도는 이와 같은 분해 차를 중개할 수 있으며 혈관형성 혈관을 특이적으로 확인하는 신규한 조영화 방법을 개발하는 것을 포함한다.
미세전이암 및 새로이 혈관화되거나 또는 혈관화되고 있는 구조, 즉 주로 미소혈관을 포함하거나 또는 미소혈관을 발생시키는 과정중인 구조를 조영화하는데 있어서 종래 기술에서의 곤란성을 고려하면, 놀랍게도 이러한 구조가 혈관생성 특이성 결합 성분의 접합체, 특히 ED-B 피브로넥틴 특이성 결합 성분 및 시아닌 염료(들)를 사용한 광에 기초한 진단에 의하여 구별될 수 있다는 것이 본 발명자들에 의하여 발견되었다. 이러한 고찰은 작은 질환을 갖는 구조를 검출하는 것을 필요로 하는 새로운 분야의 진단에 근적외선 형광 조영의 사용을 가능케 하였다. 그러므로, 제1의 구체예에서, 본 발명은 미세전이암 또는 소증식성 병변의 진단을 위한 진단제의 제조를 위한 하기 화학식 I의 접합체의 용도에 관한 것이다:
B-(D)n
상기 식에서,
B는 혈관생성 특이성 결합 성분을 나타내며,
D는 시아닌 염료를 나타내며,
n은 1 내지 5이다.
혈관형성 특이성 결합 성분은 새로이 형성된 미소혈관에 또는 미소혈관 부근에서 미세전이암에 선별적으로 또는 배타적으로 존재하거나 또는, 미소혈관 구조의 성장 이전에 또는 도중에 존재하는 구조에 결합된다. 이러한 분자 구조는 예를 들면 문헌[WO96/01653, Alessi P, et al. (2004) 및 Nanda A and St Croix B. (2004)]에 보고되어 있다. 상기에서 지적한 바와 같이, 미세전이암을 형성하는 세포 및 소증식성 병변의 유사한 세포는, 혈관형성 억제제가 길항작용을 하는 한, 혈관형성 인자의 효과는 혈관형성의 억제를 초래하는, 혈관형성 및 항혈관형성 요소 모두를 발현시킨다. 혈관형성 인자의 효과가 우세할 경우, 이들은 혈관형성의 개시를 초래하게 된다. 그래서, 즉, 혈관형성의 조절에 관여하는 혈관형성 활성인자 및 억제제의 구조 모두는 본 발명의 범위 내에서 혈관생성 특이성 결합 성분이 될 수 있다. 혈관형성 활성인자의 예로는 예컨대 ED-B 피브로넥틴 (ED-BF), 엔도글린 (CD105)[Burrows F J et al. (1995) Clin. Cancer Res. 1: 1623-1634], VEGF 구성원, 혈관 내피 성장 인자 (VEGFR), NRP-1, Ang1, Thie2, PDGF-BB 및 수용체, TGF-β1, TGF-β 수용체, FGF, HGF, MCP-1, 인테그린 (αvβ3, αvβ5, α5β1), VE-카드헤린, PECAM (CD31), 에프린, 플라스미노겐 활성인자, MMP, PAI-1, NOS, COX-2, AC133, 케모킨 또는 Id1/Id3과 같은 분자 구조 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 혈관형성 억제제의 예로는 예컨대 VEGFR-1, Ang2, TSP-1, -2, 안지오스타틴 및 관련 플라스미노겐 크링글, 엔도스타틴 (콜라겐 XVII 분절), 바소스타틴, 혈소판 인자 4, TIMP, MMP 억제제, PEX, Meth-1, Meth-2, IFN-α, -β, -γ, IP-10, IL-4, IL-12, IL-18, 프롤락틴 (M, 16K), VEGI, SPARC의 분절, 오스테오폰틴 분절 또는 마스핀 등과 같은 분자 구조 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다. [Carmeliet P and Jain R K (2000) Nature 407:249-257; Yancopoulos G D et al. (2000) Nature 407:242-248; Bergers G and Benjamin L E (2002) Nature Reviews Cancer 3:401-410; Hendrix M J C et al. (2002) Nature Reviews Cancer 3:411-421]. 바람직한 구체예에서, 혈관형성 특이성 결합 성분은 ED-BF, VEGFR 또는 엔도글린을 포함한다. 이들 중에서, ED-BF는 특히 바람직한 표적 구조가 된다. ED-BF는 또한 종양태아(oncofoetal) 피브로넥틴으로 지칭되는 피브로넥틴의 스플라이스 변이체가 되며, 이는 혈관형성 중에 새로이 성장한 미소혈관 구조에서 특이적으로 형성된다.
이러한 구조에 결합된 성분은 펩티드 (2 내지 50 개의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 쇄), 단백질 (50 개 초과의 아미노산 잔기를 갖는 아미노산 쇄), 핵산, 소분자 또는 당인 것이 바람직하다.
바람직한 단백질 또는 펩티드는 미세전이암 및/또는 거의 혈관화되거나 또는 혈관화중인 구조, 특히 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 및 항체, 예컨대 사람, 사람화 및 키메라 항체; 분절, 예컨대 Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Facb를 포함하는 항체 결합 도메인; 단일쇄 항체, 예컨대 단일쇄 Fvs (scFvs); 및 다이아바디(diabody)에서 선별적으로 또는 배타적으로 발현되는 수용체의 리간드이다.
이와 같은 매우 다양한 항체는 문헌에 기재되어 있으며, ED-BF L19 및 E8 [Viti F. et al. (1999) Cancer Res. 59:347-352]의 경우, EP 0 344 134 B1에 기재되고 영국 살리스버리 포톤 다운에 소재하는 유러피안 컬렉션 오브 애니멀 셀 컬쳐에 번호 88042101로 기탁된 하이브리도마로부터 얻을 수 있는 BC-1 모노클로날 항체, 이의 키메라 또는 사람화 변형체, WO97/45544 A1에 개시된 특이성 VL 및 VH 서열을 갖는 ED-BF에 대한 항체, WO99/5857 A2에 개시된 특이성 VL 및 VH 서열을 갖는 ED-BF에 대한 항체, WO01/62800 A1에 개시된 특이성 VL 및 VH 서열을 갖는 ED-BF에 대한 항체 및 AP38 및 AP39 (Marty C, et al. (2001) Protein Expr. Purif. 21:156-64) 등이 있다. ED-BF에 대한 항체 특이성은 문헌[Ebbinghaus C, et al. (2004) Curr Pharm Des. 10:1537-49]에 보고되어 있다. 모든 이들 항체 또는 이의 항체 결합 분절은 본 발명의 바람직한 용도에서의 혈관형성 특이성 결합 성분으로서 사용될 수 있다. 특히 바람직한 항체로는 L19, E8, AP 38 및 AP 39 또는, 이의 분절을 포함하는 결합 도메인이다.
VEGF-R에 대한 항체의 예로는 베니시주마브(Bevacizumab) (AvastinTM, 진테크 앤 로쉬에 의하여 개발된 rhumAb-VEGF), 항-VEGFR-1 항체 mAb 6.12, 완전 사람 항-VEGFR-2 항체 IMC-2C6 및 IMC-1121, 완전 사람 항-VEGFR-3 mAb HF4-3C5 (모두 임클론 시스템즈 인코포레이티드) 및 KM-2550 (교와 하코 고교 가부시키가이샤), 항-VEGFR-1 항체 [Salgaller M L (2003) Current Opinion in Molecular Therapeutics 5(6):657-667] 등이 있다. 엔도글린에 대한 항체의 예로는 SN6h, SN6, SN6a, SN6j, P3D1, P4A4, 44G4, GRE, E-9, CLE-4, RMAC8, PN-E2, MAEND3, TEC4, TEC11, A11, 8E11 등이 있다. 클론 SN6h는 면역조직화학에 의한 각종 종양 실체에서의 엔도글린의 발현을 광범위하게 연구하는데 사용된다. [Wikstrom P. et al. (2002) The Prostate 51:268-275; Li C. et al. (2003) Br. J. Cancer 88:1424-1431; Saad R. S. et al. (2004) Modern Pathol. 17: 197-203]. 마찬가지로, SN6계 항체 SN6, SN6a 및 SN6j도 기재되어 있다. [She X. et al. (2004) Int. J. Cancer 108:251-257]. 항체 클론 P3D1, P4A4, 44G4, GRE, E-9, CLE-4, RMAC8, PN-E2, MAEND3, TEC4, TEC11의 경우, 엔도글린의 결합 에피토프를 측정하였다. [Pichuantes S. et al. (1997) Tissue antigens 50:265-276]. 일부의 이들 항체 및 항체 클론 A11의 경우, 엔도글린의 분별 발현은 사람 기원의 정상 및 종양 조직에 대하여 연구되어 왔다. [Duff S. E. et al. (2003) FASEB J. 17:984-992]. WO02/02614에는 엔도글린 특이성 항체, 예컨대 scFv C4를 추가로 개시하였다. CD105에 대한 항체에 관한 최근의 문헌 중 하나에서, 클론 8E11는 면역조직화학에 의한 유방암 환자에서의 전이 위험성의 예견에 대하여 조사하였다. [Dales J. P. et al. (2004) Br. J. Cancer 90:1216-1221]. 이러한 모든 항체 또는 이의 항체 결합 분절을 본 발명의 바람직한 용도에서의 혈관형성 특이성 결합 성분으로서 사용할 수 있다.
핵산은 특이성 결합 성질을 지닐 수 있으며, 혈관형성 특이성 결합 성분은 또한 핵산을 지닐 수 있는 것으로 당업계에서는 주지되어 있다. 이러한 핵산의 예로는 DNA, RNA, 앱타머 및 PNA 등이 바람직하며, 여기서 앱타머가 특히 바람직하다. 결합 앱타머를 특이적으로 동정하기 위한 방법은 당업계에서 주지되어 있으며, 예를 들면 WO93/24508 A1, WO94/08050 A1, WO95/07364 A1, WO96/27605 A1 및 WO96/34875 A1에 개시되어 있다. 이들 문헌에 개시된 방법은 본 명세서에서 특별히 인용하며, 본 발명에 사용 가능한 혈관형성 특이성 결합 앱타머의 동정에 사용할 수 있다. 본 발명의 용도에 사용된 바람직한 앱타머는 ED-BF, 엔도글린 또는 VEGFR을 특이적으로 인지한다.
분자량이 1,000 g/몰 미만, 바람직하게는 500 g/몰 미만인 소 분자, 즉 비-펩티드, 비-핵산 화합물의 고 처리 스크리닝의 도래로 인하여, 특정의 결합 특성을 갖는 소 분자를 확인하는 것이 가능케 되었다. 이러한 소 분자는 본 발명에 의하여 사용 가능한 접합체의 한 성분으로서 동등하게 사용될 수 있다. 바람직한 소 분자는 2,2-디페닐에틸아민이며, 이는 ED-BF에 특이적으로 결합하는 것으로 확인되었다. [Scheuermann J. (2002) Isolation of binding molecules to the EDB domain of fibronectin, a marker of angiogenesis. 스위스 취리히에 소재하는 스위스 페더럴 Inst. 오브 테크놀로지에 제출된 학술 논문].
본 발명의 바람직한 용도에서, 시아닌 염료는 카르보시아닌, 디카르보시아닌 및 트리카르보시아닌으로 구성된 군에서 선택된다. 본 발명에 의하여 사용 가능한 시아닌 염료의 합성은 당업계에 공지되고 그리고 예를 들면 문헌[Hamer F. M. The Cyanine Dyes and Related Compounds, John Wiley and Sons, New York 1964; Ernst L A, et al. (1989) Cytometry 10:3-10; Southwick P L, et al., (1990) Cytometry 11:418-430; Lansdorp P M et al., (1991) Cytometry 12:723-730; Mujumdor R B et al., (1993) Bioconjugate Chem. 4:105-11; Mujumdor S R et al., (1996) Bioconjugate Chem. 7:356-62; Flanagan J H et al., (1997) Bioconjugate Chem. 8:751-56; Keil D et al., (1991) Dyes and Pigments 17:19-27; Terpetschnig E 및 Lakowicz J R (1993) Dyes and Pigments 21:227-34; Terpetschnig E et al., (1994) Anal. Biochem. 217: 197-204; Lindsey J S et al. (1989) Tetrahedron 45:4845-66; Gorecki T et al., (1996) J. Heterocycl. Chem. 33, 1871-6; Narayanan N and Patonay G (1995) J. Org. Chem. 60:2391-5, 1995; 및 Terpetschnig E et al. (1993) J. Fluoresc. 3:153-155]에 예시되어 있는 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 추가의 방법은 미국 특허 제4,981,977호, 미국 특허 제5,688,966호, 미국 특허 제5,808,044호, EP 0 591 820 A1; WO97/42976; WO97/42978; WO98/22146; WO98/26077; 및 EP 0 800 831호에 개시되어 있다.
또한, 변형된 치환체를 갖는 인도트리카르보시아닌을 합성하고, 생분자에 결 합시켰다. 예컨대, 문헌[Becker A et al., Photochem. Photobiol. 72, 234, 2000; Licha K et al. Bioconjugate Chem. 12, 44, 2001; Becker A et al. Nature Biotechnol. 19, 327, 2001; Bugaj J E et al. J. Biomed. Optics 6, 122, 2001; Achilefu S et al. J. Med. Chem. 45, 2003, 2002]에 기재되어 있다. 기타의 예는 특히 공보 WO00/61194 ("광학 진단학을 위한 조영제로서 단쇄 펩티드 염료 접합체"), WO00/71162, WO01/52746, WO01/52743 및 WO01/62156에 기재되어 있다. 인도트리카르보시아닌 염료의 또다른 제조 방법은 4-치환된 피리딘을 사용한 단순한 방법이다. 다양한 4-치환된 피리딘은 Zincke 반응[Zincke-Konig 반응, Rompps Chemie Lexikon [Rompps Chemical Dictionary], 10th Edition, page 5067 참조]에 의하여 시아닌 염료에 대한 전구체인 메소-치환된 글루타콘알데히드-디아닐리드로 높은 수율로 전환시킬 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 시아닌 염료는 하기 화학식 II의 구조를 갖는 화합물, 상기 화합물의 약학적 허용 염 및 용매화물을 포함한다:
Figure 112007015393024-PCT00001
상기 식에서,
C는 하기 화학식 III 또는 화학식 IV의 라디칼을 나타내며,
Figure 112007015393024-PCT00002
Figure 112007015393024-PCT00003
여기서, 별표로 표시한 위치는 라디칼 A와의 결합 지점을 나타내며, 하기 화학식 V, 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII 또는 화학식 IX의 기를 나타낼 수 있으며,
Figure 112007015393024-PCT00004
Figure 112007015393024-PCT00005
Figure 112007015393024-PCT00006
Figure 112007015393024-PCT00007
Figure 112007015393024-PCT00008
여기서 R1 및 R2는 서로 독립적으로 C1-C4-설포알킬쇄, 예컨대 설포메틸, 설포에틸, n-설포프로필, 이소-설포프로필, 설포부틸, 이소-설포부틸, sec-설포부틸, t-이소부틸; 또는 포화 또는 불포화, 분지쇄형 또는 직쇄형 C1-C50-알킬쇄, 예컨대 CH3, C2H5, C3H7, C4H9, C5H11, C6H13, C7H15, C8H17, C9H19, C10H21, C11H23, C12H23, C13H27, C14H19, C15H31, C16H33, C17H35, C18H37, C19H39, C20H41, C21H43, C22H45, C23H47, C24H49, C25H51, C26H53, C27H55, C28H57, C29H59, C30H61, C31H63를 나타내며, 이는 임의로 0 내지 15 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개의 카르보닐기, 예컨대 1, 2 또는 3 개 및/또는 0 내지 5 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 개의 히드록실기로 치환되거나 또는, 0 내지 15 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개, 예컨대 1, 2 또는 3 개의 카르보닐기로 임의로 차단되거나 및/또는 0 내지 5 개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 히드록실기로 치환될 수 있으며;
R3는 B 또는, B에 결합된 링커를 나타내며, 여기서 링커는 1 이상의 -OH, -COOH, -SO3 기로 치환되거나 및/또는 -O-, -S-, -CO-, -CS-, -CONH, -NHCO-, NHCSNH-, -SO2-, -PO4 --, -아릴- 및/또는 -NH-기로 1 회 이상 (바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 6 회) 임의로 차단된, 20 개 이하의 탄소 잔기를 갖는 분지쇄형 또는 직쇄형 탄수화물쇄, 특히 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 부틸, 이소-부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실, 펜틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 헥사데실, 헵타데실, 옥타데실, 노나데실, 에이코실이며;
R4는 -COOE1, -CONE1E2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NE1E2, -OE1, -OSO3E1, -SO3E1, -SO2NHE1 또는 -E1의 기를 나타내며, 여기서
E1 및 E2는 서로 독립적으로 0 내지 15 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개, 예컨대 1, 2 또는 3 개의 카르보닐기에 의하여 임의로 차단되거나 및/또는 0 내지 5 개, 예컨대 1, 2, 3, 4 또는 5 개의 히드록실기로 치환된, 포화 또는 불포화, 분지쇄형 또는 직쇄형 C1-C50-알킬쇄, 예컨대 CH3, C2H5, C3H7, C4H9, C5H11, C6H13, C7H15, C8H17, C9H19, C10H21, C11H23, C12H23, C13H27, C14H19, C15H31, C16H33, C17H35, C18H37, C19H39, C20H41, C21H43, C22H45, C23H47, C24H49, C25H51, C26H53, C27H55, C25H57, C29H59, C30H61, C31H63; C1-C4-설포알킬쇄, 예컨대 설포메틸, 설포에틸, n-설포프로필, 이소-설포프로필, 설포부틸, 이소-설포부틸, sec-설포부틸, t-이소부틸, 수소 원자를 나타내며;
R5는 수소 원자, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자, 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소-프로필을 나타내거나;
b는 2 또는 3의 수를 의미하고; 및
X 및 Y는 서로 독립적으로 O, S, =C(CH3)2 또는 -(CH=CH)-를 나타낸다.
추가의 바람직한 구체예 (i)에서, 본 발명에 의하여 사용 가능한 시아닌 염료는 하기 화학식 X를 갖는 화합물, 상기 화합물의 약학적 허용 염 또는 용매화물이다:
Figure 112007015393024-PCT00009
상기 식에서, C'은 하기 화학식 XI 또는 화학식 XII의 라디칼을 나타내며,
Figure 112007015393024-PCT00010
Figure 112007015393024-PCT00011
여기서 별표로 표시한 위치는 라디칼 A'와의 결합 지점을 나타내고, 하기 화학식 XIII, 화학식 XIV, 화학식 XV, 화학식 XVI 또는 화학식 XVII의 기를 나타낼 수 있으며,
Figure 112007015393024-PCT00012
Figure 112007015393024-PCT00013
Figure 112007015393024-PCT00014
Figure 112007015393024-PCT00015
Figure 112007015393024-PCT00016
여기서, 화학식 XV 또는 화학식 XVII의 라디칼은 임의로 C1 내지 C4-알킬 라디칼, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 부틸, 이소-부틸, sec-부틸, t-부틸로 치환될 수 있으며, 여기서
R1'은 C1-C4-설포알킬쇄, 예컨대 설포메틸, 설포에틸, n-설포프로필, 이소-설포프로필, 설포부틸, 이소-설포부틸, sec-설포부틸, t-이소부틸; 임의로 0 내지 15 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개, 예컨대 1, 2 또는 3 개의 카르보닐기로 치환되거나 및/또는 0 내지 5 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 개의 히드록실기로 치환될 수 있거나 또는, 0 내지 15 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개, 예컨대 1, 2 또는 3개의 카르보닐기로 임의로 차단되거나 및/또는 0 내지 5 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 개의 히드록실기로 치환될 수 있는 포화 또는 불포화, 분지쇄형 또는 직쇄형 C1-C50-알킬쇄, 예컨대 CH3, C2H5, C3H7, C4H9, C5H11, C6H13, C7H15, C8H17, C9H19, C10H21, C11H23, C12H23, C13H27, C14H19, C15H31, C16H33, C17H35, C18H37, C19H39, C20H41, C21H43, C22H45, C23H47, C24H49, C25H51, C26H53, C27H55, C28H57, C29H59, C30H61, C31H63; 또는 M'-R6'을 나타내며;
R2'는 C1-C4-설포알킬쇄, 예컨대 설포메틸, 설포에틸, 이소-설포프로필, 설포부틸, 이소-설포부틸, sec-설포부틸, t-이소부틸; 임의로 0 내지 15 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개, 예컨대 1, 2 또는 3 개의 카르보닐기로 치환되거나 및/또는 0 내지 5 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 개의 히드록실기로 치환될 수 있거나 또는, 0 내지 15 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개, 예컨대 1, 2 또는 3 개의 카르보닐기로 임의로 차단되거나 및/또는 0 내지 5 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 개의 히드록실기로 치환될 수 있는 포화 또는 불포화, 분지쇄형 또는 직쇄형 C1-C50-알킬쇄, 예컨대 CH3, C2H5, C3H7, C4H9, C5H11, C6H13, C7H15, C8H17, C9H19, C10H21, C11H23, C12H23, C13H27, C14H19, C15H31, C16H33, C17H35, C18H37, C19H39, C20H41, C21H43, C22H45, C23H47, C24H49, C25H51, C26H53, C27H55, C28H57, C29H59, C30H61, C31H63; 또는 M'-R7'을 나타내며;
R3', R4', R6' 및 R7'은 서로 독립적으로 -COOE1', -CONE1'E2', -NHCOE1', -NHCONHE1', -NE1'E2', -OE1', -OSO3E1', -SO3E1', -SO2NHE1' 또는 -E1'의 기를 나타내며, 여기서
E1' 및 E2'은 서로 독립적으로 임의로 0 내지 15 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개, 예컨대 1, 2, 3 개의 카르보닐기로 차단되거나 및/또는 0 내지 5 개, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5 개의 히드록실기로 치환된 포화 또는 불포화, 분지쇄형 또는 직쇄형 C1-C50-알킬쇄, 예컨대 CH3, C2H5, C3H7, C4H9, C5H11, C6H13, C7H15, C8H17, C9H19, C10H21, C11H23, C12H23, C13H27, C14H19, C15H31, C16H33, C17H35, C18H37, C19H39, C20H41, C21H43, C22H45, C23H47, C24H49, C25H51, C26H53, C27H55, C28H57, C29H59, C30H61, C31H63, C1-C4-설포알킬쇄, 예컨대 설포메틸, 설포에틸, 이소-설포프로필, 설포부틸, 이소-설포부틸, sec-설포부틸, t-이소부틸, 수소 원자를 나타내며,
M'은 CH2-CH2 또는 CH2-CH2-CH2를 나타내며;
R5'은 -Q'-CH2-R8'을 나타내며;
Q'는 C1-C5 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, 부틸, 이소-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 1-디메틸프로필, 네오펜틸을 나타내며, C 원자는 O 또는 S로 임의로 치환되거나 또는
Figure 112007015393024-PCT00017
를 나타내며,
R8'은 -CO-NH-R9'-R10', -NH-CS-NH-R9'-R10' 또는 -NH-CO-R9'-R10'을 나타내며, 여기서
R9'은 비분지된 C2-C13 알킬, 예컨대 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실 및 트리데실로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 1 개 이상, 예컨대 1, 2, 3, 4 개의 C 원자는 O 또는 S로 임의로 치환되고,
R10'은 B 또는, B에 결합된 커플링 부분의 나머지 부분이고,
b'은 2 또는 3의 수를 의미하며,
X' 및 Y'은 서로 독립적으로 O, S, =C(CH3)2, =C(C2H5)2, =C(C3H7)2, =C(이소C3H7)2, =C(C4H9)2 또는 -(CH=CH)-를 나타낸다.
본 발명에 의하여 사용 가능한 시아닌 염료의 보다 바람직한 구체예 (ii)에서, R5', R8', R9', R10', E1', E2', M' 및 Q'은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니며,
A'은 화학식 XVI 또는 화학식 XVII의 라디칼을 나타내며, 여기서 화학식 XVII의 라디칼은 임의로 파라-위치에서 C1 내지 C4-알킬 라디칼, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 이소-부틸, sec-부틸 또는 t-부틸로 치환될 수 있으며;
C'은 화학식 XII의 라디칼을 나타내며,
R1'은 M-R6'을 나타내며;
R2'은 M-R7'을 나타내며;
R3', R4', R6' 및 R7'은 서로 독립적으로 SO3H 또는 H를 나타내지만, 단, R3', R4', R6' 및 R7' 중 3 개 이상은 SO3H이고,
X' 및 Y'은 서로 독립적으로 O, S, =C(CH3)2, =C(C2H5)2, =C(C3H7)2, =C(이소C3H7)2 또는 =C(C4H9)2를 나타내며,
b'은 3이다.
본 발명에 의하여 사용 가능한 시아닌 염료의 더욱 바람직한 구체예 (iii)에서, C' R1', R2', R3', R4', R5', R6', R7', R8', R9', R10', E1', E2', X', Y' 및 b'은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고; 또는 R5', R8', R9', R10', E1' 및 E2'는 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니며, C', R1', R2', R3', R4', R6', R7', X', Y' 및 b'은 상기 구체예 (ii)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니며,
A'은 화학식 XVI를 갖는 라디칼을 나타내며,
M'은 CH2-CH2를 나타내며;
Q'은 C1 내지 C5 알킬을 나타내어 C 원자가 O 또는 S로 임의로 치환된다.
본 발명에 의하여 사용 가능한 시아닌 염료의 더욱 바람직한 구체예 (iv)에서, A', C', R1', R2', R3', R4', R5', R6', R7' R8', R9', R10', E1', E2', M', X', Y' 및 b'은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, R5', R8', R9', R10', E1', E2' 및 M'은 은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, A', C', R1', R2', R3', R4', R6', R7' X', Y' 및 b'은 상기 구체예 (ii)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, C' R1', R2', R3', R4', R5', R6', R7', R8', R9', R10', E1', E2', X', Y' 및 b'은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, A' 및 M'은 상기 구체예 (iii)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고; 또는 R5', R8', R9', R10', E1' 및 E2'은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, C', R1', R2', R3', R4', R6', R7', X', Y' 및 b'은 상기 구체예 (ii)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, A 및 M'은 상기 구체예 (iii)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, Q'는 C1-C5 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 부틸, 이소-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, 1-디메틸프로필, 네오펜틸을 나타낸다.
본 발명에 의하여 사용 가능한 시아닌 염료의 더욱 바람직한 구체예 (v)에 서, C' R1', R2', R3', R4', R5', R6', R7', R8', R9', R10', E1', E2', M', X', Y'은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, R5', R8', R9', R10', E1', E2' 및 M'은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, C', R1', R2', R3', R4', R6' R7', X' 및 Y'은 상기 구체예 (ii)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, A'은 화학식 XVII의 라디칼을 나타내며, b'은 3이고, Q'은
Figure 112007015393024-PCT00018
를 나타낸다.
본 발명에 의하여 사용 가능한 시아닌 염료의 더욱 바람직한 구체예 (vi)에서, A', C', R1', R2', R3', R4', R5', R6', R7', R9', R10', E1', E2', M', Q', X', Y'은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, R5', R9', R10', E1', E2', M' 및 Q'은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, A', C', R1', R2', R3', R4', R6', R7', X', Y' 및 b은 상기 구체예 (ii)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, C', R1', R2', R3', R4', R5', R6' R7', R9', R10', E1', E2', X', Y' 및 b'은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, A', M' 및 Q'은 상기 구체예 (iii)에 대하여 상기 에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, 또는 R5', R9', R10', E1' 및 E2'은 상기 구체예 (i)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, C', R1', R2', R3', R4' R6', R7', X', Y' 및 b'은 상기 구체예 (ii)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, A', M', Q'은 상기 구체예 (iii)에 대하여 상기에서 설명한 바와 같은 의미를 지니고, R8'은 CO-B 또는 NH-B를 나타낸다.
본 발명에 의하여 사용할 수 있는 특히 바람직한 인도트리카르보시아닌 염료는 하기 표 1에 제시된 화학식 XVIII 내지 화학식 XXXVI을 갖는 염료로부터 선택되며, 이들 화학식은 B에 커플링되기 이전의 염료의 구조를 나타내며, 이는 티올기 함유 혈관형성 특이성 결합 성분으로의 커플링을 촉진시키는 말레인이미드(말레이미드) 또는 브로모아세틸 커플링 부분을 포함한다는 것을 나타낸다. 생성된 접합체에서, 상기 부분이 이탈기인 경우 각각의 커플링 부분이 특정의 구체예에서는 더 이상 존재하지 않거나 또는, 이의 일부분만이 커플링 부분의 나머지 부분으로 지칭되는 접합체내에서 잔존할 것이다. 당업자에게는, 하기에 제시된 말레인이미드(말레이미드) 또는 브로모아세틸 커플링 부분 대신에 기타의 부분이 하기 구조에서 예를 들면 클로로아세틸, 요오도아세틸, 클로로아세트아미도, 브로모아세트아미도, 요오도아세트아미도, 클로로알킬, 브로모알킬, 요오도알킬, 피리딜 디설피드 및 비닐 설폰아미드 등으로 치환되어 B로의 커플링 반응을 실시할 수 있다는 것이 자명할 것이다.
혈관생성 특이성 결합 성분으로의 커플링에 사용할 수 있는 바람직한 염료는 하기 표 1에 제시되어 있다.
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Figure 112007015393024-PCT00021
Figure 112007015393024-PCT00022
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시아닌 염료의 중간에 R5'를 통하여 B에 결합된 시아닌 염료는 양자 수율이 특히 우수하며, 혈관생성 특이성 결합 성분에 커플링될 경우 놀랍게도 양자 수율이 낮거나 심지어는 감소가 발생하지 않는 것으로 나타났다. 그러므로, 구체예 (i) 내지 (vi)에 의한 시아닌 염료 및 화학식 XVIII 내지 XXXVI에 의한 특이성 시아닌 염료의 사용은 본 발명에서 특히 바람직하다.
각각의 시아닌 염료 및 각각의 혈관형성 특이성 결합 성분을 결합시키기에 적절한 방법은 주로 혈관생성 특이성 결합 성분의 화학적 성질에 의존한다. 천연으로 존재하거나 또는 각종 혈관형성 특이성 결합 성분에 도입될 수 있는 각종의 잔기 또는 기, 예컨대 -NH2, -COOH, -SH, -OH 등이 당분야에 공지되어 있다. 그후, 이들 기는 기타의 기에 대한 반응도가 우수한 시아닌 염료에 결합된 기와의 공유 결합을 형성하여 2 가지의 성분이 커플링을 산출할 수 있다. 물론, 순서를 역전시킬 수 있는데, 즉 반응 가능한 기를 시아닌 염료에 결합시키고, 반응성 기를 혈관형성 특이성 결합 성분에 결합시킬 수 있다. 이러한 교시에 기초하여, 당업자는 시아닌 염료 및 혈관생성 특이성 결합 성분의 각각의 쌍에 대한 적절한 반응성 기 및 반응 가능한 기를 선택할 수 있다.
다수의 단백질 또는 펩티드는 예컨대 시스테인 잔기의 티올기를 포함하거나 또는 개질시켜 티올기를 포함하도록 할 수 있다. 그러므로, 본 발명에서 사용한 접합체가 펩티드 또는 단백질 및 (a) 시아닌 염료(들)을 포함할 경우, 전술한 시아닌 염료는 단백질 또는 펩티드에 커플링되기 이전에 티올기 반응성 커플링 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 티올기 반응성 작용기는 당업계에 주지되어 있으며, 예컨대 말레인이미드 (말레이미드), 클로로아세틸, 브로모아세틸, 요오도아세틸, 클로로아세트아미도, 브로모아세트아미도, 요오도아세트아미도, 클로로알킬, 브로모알킬, 요오도알킬, 피리딜 디설피드 및 비닐 설폰아미드를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 구체예의 R3 또는 R10'은 B에 결합되기 이전에 커플링 부분을 나타낸다. R3가 B에 결합된 링커인 경우, 링커는 커플링 이전에 상기 커플링 부분을 포함한다.
커플링 반응중에 완전히 치환되지 않는 특정의 커플링 부분, 예컨대 커플링 반응중의 이탈기가 아닌 경우, 커플링 부분의 일부는 R3, 링커 또는 R10'에 결합된 상태로 잔존할 수 있다. 시아닌 염료 및 혈관형성 특이성 결합 성분의 결합에 잔존할 수 있는 이와 같은 부분을 "커플링 부분의 나머지 부분"으로서 지칭한다.
약학적 허용 염은 전술한 시아닌 화합물과의 비독성 염을 형성하는 한, 임의의 것이 될 수 있다. 이의 예로는 알칼리 금속 염, 예컨대 나트륨 염, 칼륨 염; 알칼리 토금속의 염, 예컨대 마그네슘 염, 칼슘 염 등, 유기 암모늄 염, 예컨대 트리에틸 암모늄 염, 트리부틸 암모늄 염, 피리디늄염 등, 아미노산, 예컨대 리신, 아르기닌의 염 등이 있다. 염으로는 나트륨 염인 것이 바람직하다.
바람직한 구체예에서, 소증식성 병변의 예로는 원발 종양; 전암 증상; 이형성증; 화생; 예컨대 자가면역 질환, 예컨대 건선, 건선성 관절염, 류마티스성 관절염 또는 감염으로 인한 염증성 병변; 자궁내막증; 미소병변, 바람직하게는 혈관형성과 관련된 피부 및/또는 안 질환 등이 있다. 본 발명의 바람직한 용도에서, 접합체(들)는 상기에 기재한 질환 및/또는 미세전이암의 생체내 진단에 사용된다.
본 발명의 용도는 통상의 진단, 즉 개별적으로 나타낸 질환에 대한 스크리닝을 위한 것이 될 수 있다. 그러나, 바람직한 구체예에서, 예를 들면, 표준의 X선 시술, 예컨대 유방조영술, 전신 스캔 또는 MRI을 이용하여 질환을 진단할 경우 접합체를 사용한다. 그후, 환자를 추가의 미세전이암 및/또는 소 (추가의) 원발성 종양(들)에 대하여 검사한다. 이러한 검사는 처치 시술 (예컨대 약물, 방사선 또는 수술) 이전에, 도중에 및/또는 이후에 및/또는 최적의 처치 방법을 결정하기 위하여 경중도, 예컨대 질환의 단계를 보다 우수하게 평가하기 위하여 실시한다. 처치 시술 이전에 실시할 경우, 본 발명의 진단의 용도는 예컨대 미소전이가 원발성 종양의 부근에 이미 형성되었는지의 여부, 그에 의하여 종괴절제술 또는 차라리 유방절제술이 유방암에서의 예로서 나타나는지의 여부를 결정하도록 한다. 처치후, 본 발명의 진단의 용도가 처치 시술의 성공 여부를 평가하고, 후속 처치 섭생, 예컨대 방사선 또는 화학요법을 결정하도록 한다. 수술 시술 도중에 사용할 경우, 조직, 예컨대 원발성 종양을 둘러싼 림프절에서의 미세전이암을 검출할 수 있다. 이러한 구체예에서, 본 발명의 용도는 시술 도중에 종양 또는 미세전이암의 완전 제거가 가능케 된다.
본 발명에 의한 용도는 매우 작은 조직 구조에서 발생할 경우조차 혈관형성의 개시 이전의 상태, 혈관형성의 개시 또는 혈관형성, 즉 이미 형성된 미소혈관의 검출을 가능케 한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명에 의하여 검출되는, 미세전이암 및/또는 소증식성 병변, 특히 미세전이암, 전암 증상, 이형성증, 화생, 자궁내막증 및/또는 원발성 종양(들)은 직경이 10 ㎜ 미만, 바람직하게는 8 ㎜ 미만, 더욱 바람직하게는 6 ㎜ 미만, 더욱 바람직하게는 5 ㎜ 미만, 더욱 바람직하게는 4 ㎜ 미만, 더욱 바람직하게는 3 ㎜ 미만, 더욱 바람직하게는 2 ㎜ 미만, 가장 바람직하게는 1 ㎜ 미만이다. 본 발명의 용도에 의하여 검출 가능한 특히 바람직한 범위의 미세전이암 및/또는 소증식성 병변, 특히 미세전이암, 전암 증상, 이형성증, 화생, 염증성 병변, 자궁내막증 및/또는 원발성 종양(들)은 약 10 ㎜ 내지 약 0.1 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 10 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 8 ㎜ 내지 약 0.1 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 8 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 6 ㎜ 내지 약 0.1 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 6 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 5 ㎜ 내지 0.1 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 5 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 4 ㎜ 내지 0.1 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 4 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 3 ㎜ 내지 0.1 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 3 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 가장 바람직하게는 약 2 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜이다.
본 발명의 용도에 의하여 검출되는 미세전이암에는 의인성 미세전이암, 혈행성 미세전이암, 강내 미세전이암, 관내 미세전이암, 림프 미세전이암, 국소 미세전이암 및/또는 부위 미세전이암 등이 바람직하다.
진단된 미세전이암은 위장 또는 결장직장관, 간, 췌장, 신장, 방광, 전립선, 자궁내막, 난소, 고환의 악성 종양 (예컨대, 암종, 육종), 흑색종, 이형성증성 구강 점막, 침습성 구강 암, 소세포 및 비-소세포 폐 암종; 유방 종양, 예컨대 호르몬 의존성 유방 암, 호르몬 독립성 유방 암; 이행 및 편평 세포 암; 신경모세포종, 신경아교종, 성상세포종, 골육종을 비롯한 신경계 암; 연조직 육종; 혈관종 및 내분비성 종양을 비롯한 원발성 종양으로부터 유래하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 용도에 의하여 검출 가능한 소 원발성 종양은 상기에 기재된 종양 중 하나인 것이 바람직하다. 특히 바람직한 구체예에서, 소 원발성 종양 또는 미세전이암은 유방 종양, 특히 호르몬 의존성 유방암 또는 호르몬 독립성 유방암이다.
본 발명의 용도에 의하여 검출 가능한 전암 증상은 피부의 전암 증상, 특히 광선 각화증, 피부 각질, 광선 구순염, 타르 각화증, 비소 각화증, X선 각화증, 보웬(Bowen's) 질환, 보웬양 구진증, 악성 흑점, 경화성 태선 및 태선 고무 점막; 소화관의 전암 증상, 특히 홍색판, 백반, 바레트 식도, 플러머-빈슨(Plummer-Vinson) 증후군, 다리 궤양, 거대 비후성 위질환, 경계 암종, 종양 장 폴립, 직장 폴립, 석회화 담낭; 부인과적 전암 증상, 특히 유관상피내암종 (CDIS), 경부 상피내 종양 (CIN), 백반, 자궁내막 증식증 (III급), 외음부 이상증, 외음부 상피내 종양 (VIN), 포상기태; 비뇨기과 전암 증상, 특히 방광 유두종증, 퀴이라 홍색비후증, 고환 상피내 종양 (TIN), 백반; 상피내암종(CIS); 만성 염증에 의하여 야기된 전암 증상, 특히 화농피부증, 골수염, 응괴성 여드름, 심상 루푸스 및 누공으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
이형성증은 흔히 암의 전조 증상이며, 주로 상피조직에서 발견되며, 개개의 세포 균일성 및 세포의 구조적 배향의 손실을 비롯한 비-종양 세포 성장의 가장 무질서한 형태이다. 이형성증 세포는 종종 비정상적으로 크고 깊게 염색된 핵을 포함하며 다형성을 나타낸다. 이형성증은 만성 자극 또는 염증이 존재하는 부위에서 발생하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 의하여 진단될 수 있는 이형성증 질환의 예로는 발한결핍성 외배엽 이형성증, 전후안면두개골(anterofacial) 이형성증, 질식 흉 이형성증, 심장사지(atriodigital) 이형성증, 기관지폐 이형성증, 대뇌 이형성증, 경부 이형성증, 연골외배엽 이형성증, 쇄골두개골 이형성증, 선천성 외배엽 이형성증, 두골간 이형성증, 머리 손목 발목 이형성증, 두개골-골간단 이형성증, 상아질 이형성증, 골간 이형성증, 외배엽 이형성증, 에나멜 이형성증, 뇌-눈 이형성증, 편지(heminelia) 골단 이형성증, 다발성 골단 이형성증, 점상 골단 이형성증, 상피 이형성증, 안면지생식기 이형성증, 턱의 가족성 섬유 이형성증, 가족성 백색 굴곡 이형성증, 섬유근성 이형성증, 골의 섬유 이형성증, 개화성 골 이형성증, 유전 신장-망막 이형성증, 발한성 외배엽 이형성증, 발한저하성 외배엽 이형성증, 림프구 감소성 가슴샘 이형성증, 유방 이형성증, 하악안면 이형성증, 정신 이형성증, 몬디니(Mondini) 이형성증, 단일골 섬유 이형성증, 점막 상피 이형성증, 다발성 골단 이형성증, 안이척추 이형성증, 안이지 이형성증, 안척추 이형성증, 치원 이형성증, 안구하악사지 이형성증, 근단주위 시멘트질 이형성증, 다골성 섬유 이형성증, 가성연골발육부전 척추골단 이형성증, 망막 이형성증, 중격-시신경 이형성증, 척추골단 이형성증 및 뇌실요골 이형성증 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
화생은 한 유형의 성체 또는 완전 분화된 세포를 또다른 유형의 성체 세포 대신에 대체하는 제어된 세포 성장의 형태이다. 본 발명의 용도에 의하여 검출 가능한 후형질 질환은 원인불명 골수 화생, 아포크린 화생, 비정형 화생, 자가실질 화생, 결합 조직 화생, 상피 화생, 장 화생, 후형질 빈혈, 후형질 골화, 후형질 폴립, 골수양 화생, 원발성 골수양 화생, 2차 골수양 화생, 편평 화생, 양막의 편평 화생, 대증 골수양 화생 및 재생성 화생으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 용도에 의하여 검출 가능한 안 질환은 트라코마, 미숙아 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 신생혈관 녹내장 및 노년기 황반 변성으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
염증성 병변은 면역 세포, 특히 T 세포 및 비만 세포의 침윤, 시토킨의 방출 및 세포의 증식을 비롯한 다수의 병리 과정을 특징으로 한다. 예를 들면, 건선에서는 면역 세포에 의한 파괴를 회피하고자 하는 각질세포가 증식을 개시하며, 이 과정은 신생혈관형성을 수반하는 것으로 나타났다. 특별한 이론에 국한시키고자 하는 의도는 아니나, 본 발명자들은 이러한 신생혈관형성이 본 발명에 의하여 작은 병변의 검출을 가능케 하는 것으로 생각한다. 본 발명에 의하여 검출 가능한 염증성 병변은 종종 염증성 병변, 감염, 기계적 자극 등의 형성을 특징으로 하는 자가면역 질환을 비롯한 다수의 질환 또는 자극에 반응할 수 있다. 이와 같은 작은 염증성 병변을 검출하는 능력은 한편으로는 명백한 염증이 검출 가능한 경우 감염된 부위를 더욱 정확하게 윤곽을 그리는데 사용될 수 있으며, 또다른 한편으로는 각각의 질환의 통상적인 징후, 예컨대 건선에 대한 적화 및 스케일링 또는 관절염에 대한 사지의 변형 및/또는 관절통이 아직 검출되지 않은 시기에서의 염증성 질환의 전개의 초기 진단이 가능케 하도록 사용될 수 있다. 본 발명의 용도를 사용하여 진단할 수 있는 작은 염증성 병변은 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 패혈성 쇽 골다공증, 골관절염, 신경병변성 동통, 바이러스성 감염, 예컨대 바이러스성 심근염, 세균성 감염 인슐린 의존성 당뇨병, 비-인슐린 의존성 당뇨병, 치주 질환, 재협착, 원형 탈모증, 건선, 건선성 관절염, 급성 췌장염, 동종이식 거부, 알러지, 폐에서의 알러지성 염증, 죽상동맥경화증, 다발성 경화증, 악액질, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 크론 질환, 염증성 장 질환, 허혈, 울혈성 심부전증, 폐섬유증, 간염, 아교모세포종, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군 및 전신성 홍반 루푸스로 구성된 군에서 선택된 질환 또는 상태에서 발생하는 것이 바람직하다.
자궁내막증은 자궁강 외부의 자궁내막 조직의 증식에 의하여 정의되는 부인과 질환이다. 자궁내막 세포를 증식시키는 것은 전신에 분포될 수 있으며, 자궁내막 병변은 폐 및 기타의 기관에서 이미 발견되며, 이러한 점에서 자궁내막 병변의 분포는 미세전이암의 분포와 유사하다. 본 발명의 용도의 바람직한 구체예에서, 검출되는 자궁내막 병변, 예컨대 자궁내막 세포 무리에는 혈행성 세포 무리, 강내 세포 무리, 관내 세포 무리, 림프 세포 무리, 국소 세포 무리 및/또는 부위 세포 무리 등이 있다. 본 발명의 방법의 민감도로 인하여, 종래에 검출되었던 것보다 훨씬 더 작은 자궁내막 병변을 검출할 수 있다. 본 발명으로 검출되는 자궁내막 병변은 직경이 10 ㎜ 미만, 바람직하게는 8 ㎜ 미만, 더욱 바람직하게는 6 ㎜ 미만, 더욱 바람직하게는 5 ㎜ 미만, 더욱 바람직하게는 4 ㎜ 미만, 더욱 바람직하게는 3 ㎜ 미만, 더욱 바람직하게는 2 ㎜ 미만, 가장 바람직하게는 1 ㎜ 미만이다. 본 발명의 용도에 의하여 검출 가능한 자궁내막 병변의 특히 바람직한 범위는 약 10 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 8 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 6 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 5 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 4 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 더욱 바람직하게는 약 3 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜, 가장 바람직하게는 약 2 ㎜ 내지 약 0.2 ㎜이다.
투여량으로 부위의 검출이 궁극적으로 검출될 수 있도록 하는 한, 접합체의 투여량은 특별하게 제한되지는 않는다. 투여량은 사용하고자 하는 화합물의 유형, 연령, 체중 및 표적 기관 또는 조직 등에 따라 적절하게 조절한다. 통상적으로 투여량은 0.002 내지 100 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.005 내지 10 ㎎/㎏ 체중, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 2 ㎎/㎏ 체중, 가장 바람직하게는 0.02 내지 1 ㎎/㎏ 체중이다.
본 발명의 형광 조영 방법은 하기와 같은 공지의 방법으로 실시되며, 각각의 변수, 예컨대 검출하고자 하는 여기 파장 및 형광 파장은 투여하고자 하는 각각의 접합체에 대하여 측정하여 최적의 조영 및 분해를 달성할 수 있다. 형광 조영 방법에 의한 측정에 접합체 투여로부터 소요된 시간은 접합체 및 투여 표적에 따라 달라진다. 예를 들면 접합체가 종양 조영에 사용되는 경우, 소요 시간은 통상적으로 투여후 약 2 내지 120 시간, 바람직하게는 투여후 약 2 내지 약 10 시간이 될 수 있다. 소요 시간이 너무 짧을 경우, 형광은 너무 강해서 혈관형성 및 비-혈관형성 조직이 명백하게 구별될 수가 없게 된다(시그날-대-노이즈 비율이 낮음). 형광 조영 방법에 대한 장치는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 EP 0 868 143, EP 1 146 811 A1, EP 1 408 824 A2, EP 1 409 995 A1 및 EP 1 410 330 A2에 기재되어 있다.
상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 수술 시술과 함께 사용될 수 있으며, 형광의 검출은 수술 현미경, 현미경, 확대경 등을 사용하여 실시할 수 있다. 이러한 장치는 개방 및 내시경 수술을 비롯한 다양한 수술 시술에 모두 사용될 수 있다. 또한, 암에 대한 통상의 스크리닝에 통상적으로 사용되는 장치 및 시술, 예컨대 결장내시경술 및 위내시경검사와 함께 본 발명을 사용할 수 있다.
도 1: 물질 투여후 6 시간에서 장간막 Capan-1 미세전이암에서의 염료 접합체의 효능. 상부 패널 A는 초기 화상을 도시하며, 하부 패널 B는 역전된 화상을 도시한다. 백색 및 흑색 점 및 면적은 각각 미세전이암을 나타낸다. 두 화상은 ㎝ 크기 단위를 나타내는 자를 포함한다.
도 2: 물질 투여후 24 시간에서 실험 자궁내막증 병변의 생체외 화상의 예. 패널 A는 초기 화상을 도시하며, 패널 B는 역전된 화상을 도시한다. 두 화상은 ㎝ 크기 단위를 나타내는 자를 포함한다.
도 3: 물질 투여후 6 시간에서 피부의 자발 미소병변의 생체내 화상의 예. 패널 A는 초기 화상을 도시하며, 패널 B는 역전된 화상을 도시한다. 두 화상은 ㎝ 크기 단위를 나타내는 자를 포함한다.
실시예 1-16: 말레이미드기를 갖는 인도트리카르보시아닌 염료의 합성
실시예 1
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카르바모일}-에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XVIII)
Figure 112007015393024-PCT00025
a) 1-(2-설포나토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-설폰산, 내부 염
10 g (0.04 mol)의 2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-설폰산 [Bioconjugate Chem 1993, 4, 105], 6.8 g (0.04 mol)의 염화2-클로로에탄설폰산 및 4.2 g (0.04 mol)의 트리에틸아민을 200 ㎖의 아세토니트릴중에서 6 시간 동안 환류시켰다. 침전물을 흡인으로 제거하고, 건조시켰다. 수율: 5.0 g (이론치의 35％). [Anal Biochem 1994, 217, 197].
b) 3-피리딘-4-일-프로피온산-t-부틸 에스테르
50 ㎖의 THF 중의 20 g (89 mmol)의 t-부틸-P,P-디메틸포스포노아세테이트를 250 ㎖의 THF 중의 3.9 g (98 mmol)의 수소화나트륨 (광유중의 60％)의 현탁액에 0℃에서 적가하였다. 0℃에서 1 시간 교반한 후, 50 ㎖의 테트라히드로푸란 중의 10 g (93 mmol)의 피리딘-4-카르브알데히드의 용액을 적가하고, 반응 혼합물을 1 시간 동안 0℃에서 및 18 시간 동안 실온에서 교반하였다. 침전된 고형물을 여과로 제거하고, 용액을 증발로 농축시켰다. 잔류물을 가열하면서 이소프로판올에 용해시키고, 불용성 부분을 여과로 제거하고, 결정화를 위하여 용액을 0℃로 냉각하였다. 생성된 고형물을 여과로 제거하고, 헥산으로 교반하고, 여과 및 건조시켰 다. 중간체 생성물 (15.3 g)을 0.15 g의 10％ 팔라듐/활성탄과 함께 6 시간 동안 150 ㎖의 에탄올 중에서 수소화시켰다. 촉매를 여과로 제거하고, 용액을 증발로 농축시키고, 잔류물을 실리카 겔 (이동 용매 디에틸 에테르)상에서 여과하였다. 13.0 g의 담황색 오일 (이론치의 71％)을 얻었다.
c) 3-[2-(t-부틸옥시카르보닐)에틸]글루타콘알데히드-디아닐리드-브롬화수소산염
150 ㎖의 디에틸 에테르 중의 10 g (48 mmol)의 3-피리딘-4-일-프로피온산-t-부틸 에스테르의 용액을 8.9 g (96 mmol)의 아닐린과 함께 혼합한 후, 0℃에서 2 ㎖의 디에틸 에테르중의 5.4 g (48 mmol)의 브로모시아노겐의 용액과 함께 혼합하였다. 0℃에서 3 시간 교반한 후, 생성된 적색 고형물을 여과로 제거하고, 에테르로 세정하고, 진공 건조시켰다. 수율: 20.3 g (이론치의 92％)
d) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(2-카르복시에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
20 ㎖의 아세트산 무수물 및 5 ㎖의 아세트산 중의 1.0 g (2.2 mmol)의 3-[2-(t-부틸옥시카르보닐)에틸]-글루타콘알데히드-디아닐리드-브롬화수소산염 (실시예 1c)) 및 1.5 g (4.4 mmol)의 1-(2-설포나토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-설폰산 (실시예 1a))의 현탁액을 0.75 g (9.1 mmol)의 아세트산나트륨과 함께 혼합하고, 1 시간 동안 120℃에서 교반하였다. 냉각후, 이를 디에틸 에테르와 함께 혼합하고, 침전된 고형물을 여과로 제거하고, 크로마토그래피 (RP-C18-실리카 겔, 이동 용매 물/메탄올)로 정제하고, 생성물을 냉동건조시켰다(0.5 g). 보호기의 분해는 중간체 생성물을 4 ㎖의 디클로로메탄/1 ㎖의 트리플루오로아세트산 중에서 1 시간 동안 교반하여 실시하였다. 증발에 의한 농축 및 크로마토그래피 정제 (RP-C18-실리카 겔, 이동 용매 물/메탄올)후, 0.45 g (이론치의 23％)의 청색 동결건조물을 얻었다.
e) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카르바모일}에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
0.4 g (0.45 mmol)의 실시예 1d)의 표제 화합물 및 45 ㎎ (0.45 mmol)의 트리에틸아민을 10 ㎖의 디메틸포름아미드에 용해시키고, 0℃에서 0.15 g (0.45 mmol)의 TBTU와 혼합하고, 10 분간 교반하였다. 그후, 0.5 ㎖의 디메틸포름아미드중의 0.17 g (0.68 mmol)의 N-(2-아미노에틸)말레이미드-트리플루오로아세테이트[Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445] 및 68 ㎎ (0.68 mmol)의 트리에틸아민의 용액을 첨가하고, 이를 1 시간 동안 실온에서 교반하였다. 10 ㎖의 디에틸 에테르를 첨가한 후, 고형물을 원심분리로 제거하고, 건조시키고, 크로마토그래피 (RP C-18 실리카 겔, 구배 메탄올/물)로 정제하였다. 수율: 0.30 g의 청색 동결건조물 (이론치의 65％).
원소 분석:
이론치: C, 47.24; H, 4.26; N, 5.51; S, 12.61; Na, 6.78.
실측치: C, 47.74; H, 4.47; N, 5.40; S, 11.99; Na, 7.02.
실시예 2
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(2-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥실]카르바모일}에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XIX)
Figure 112007015393024-PCT00026
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.4 g (0.45 mmol)의 실시예 1d)의 표제 화합물 및 0.21 g (0.68 mmol)의 N-(6-아미노헥실)말레이미드-트리플루오로아세테이트 [Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445]로부터 실시하였다. 수율: 0.38 g의 청색 동결건조물 (이론치의 81％).
원소 분석:
이론치: C, 49.25; H, 4.79; N, 5.22; S, 11.95; Na, 6.43.
실측치: C, 48.96; H, 4.92; N, 5.32; S, 11.88; Na, 6.56.
실시예 3
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)- 3H-인돌륨-2-일]-4-(2-{[13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,7,10-트리옥사트리데실]카르바모일}에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XX)
Figure 112007015393024-PCT00027
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.4 g (0.45 mmol)의 실시예 1d)의 표제 화합물 및 0.28 g (0.68 mmol)의 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오로아세테이트[Int J Pept Protein Res 1992, 40, 445]로부터 실시하였다. 수율: 0.27 g의 청색 동결건조물 (이론치의 51％).
원소 분석:
이론치: C, 48.97; H, 5.05; N, 4.76; S, 10.89; Na, 5.86.
실측치: C, 49.22; H, 5.16; N, 4.62; S, 10.67; Na, 5.66.
실시예 4
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(4-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카르바모일}-부틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXI)
Figure 112007015393024-PCT00028
a) 브롬화(3-t-부톡시카르보닐-프로필)-트리페닐-포스포늄
50 g (0.30 mol)의 4-브로모부티르산을 400 ㎖의 THF에 -40℃에서 187 g (0.89 mol)의 트리플루오로아세트산 무수물과 함께 적가하면서 혼합하였다. -40℃에서 30 분간 교반한 후, 400 ㎖의 t-부탄올/30 ㎖의 THF를 1 시간 동안 적가하였다. 실온에서 16 시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 얼음 냉각된 탄산나트륨 용액에 붓고, 수성상을 디에틸 에테르로 3회 추출하고, 유기상을 황산나트륨상에서 건조시키고, 증발에 의하여 농축시켰다. 잔류물을 진공하에서 증류시켰다(비점 72℃/0.9 mbar; 수율: 41 g). 포스포늄 염을 형성하는 반응은 250 ㎖의 아세토니트릴 중의 41 g (0.18 mol)의 중간 생성물, 44.6 g (0.17 mol)의 트리페닐포스핀 및 32.5 g (0.36 mol)의 중탄산나트륨을 20 시간 동안 환류 가열하여 실시하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 증발로 농축시키고, 잔류물을 디에틸 에테르와 함께 교반하여 재결정화시켰다. 수율: 58.5 g (이론치의 40％, 4-브로모부티르산에 대하여)의 백색 고형물.
b) 5-피리딘-4-일-펜타노산-t-부틸 에스테르
100 ㎖의 무수 THF 중의 14 g (28 mmol)의 브롬화(3-t-부톡시카르보닐-프로 필)-트리페닐-포스포늄(실시예 4a))의 용액을 -40℃에서 공기가 없는 환경에서 20 분간 17.5 ㎖ (28 mmol)의 부틸리튬 (헥산중의 1.6 M)과 함께 혼합하고, 1 시간 동안 -40℃에서 교반하였다. 20 ㎖의 THF중의 2.78 g (26 mmol)의 4-피리딘카르브알데히드의 용액을 적가하고, 16 시간 동안 실온에서 교반한 후, 얼음물에 붓고, 수성상을 디에틸 에테르로 3회 추출하고, 유기상을 황산나트륨상에서 건조시키고, 증발에 의하여 농축시켰다. 크로마토그래피 정제 (실리카 겔, 이동 용매 헥산/에틸 아세테이트)후, 생성물을 E,Z-혼합물 (1H-NMR 후 4:1; 5.0 g)로서 얻었다. 이중 결합을 수소화하기 위하여, 중간체 생성물을 200 ㎖의 메탄올에 용해시키고, 100 ㎎의 PtO2 촉매와 함께 실온에서 수소하에 교반하였다. 여과 및 증발로 농축시킨 후, 황색 오일을 얻었다. 수율: 4.9 g (이론치의 74％).
c) 3-[4-(t-부틸옥시카르보닐)부틸]글루타콘알데히드-디아닐리드-브롬화수소산염
35 ㎖의 디에틸 에테르 중의 4.0 g (17 mmol)의 5-피리딘-4-일-펜타노산-t-부틸에스테르의 용액을 3.2 g (34 mmol)의 아닐린과 함께 혼합한 후, 0℃에서 8 ㎖의 디에틸 에테르중의 1.9 g (17 mmol)의 브로모시아노겐 용액과 혼합하였다. 0℃에서 3 시간 교반한 후, 생성된 적색 고형물을 여과로 제거하고, 에테르로 세정하고, 진공 건조시켰다. 수율: 7.8 g (이론치의 95％).
d) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(4-카르복시부틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토 에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
합성을 실시예 1d)와 유사하게 실시예 4c)의 표제 화합물 (2.5 ㎜ol) 및 1-(2-설포나토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-설폰산 (5 ㎜ol)으로부터 실시하였다. 수율: 0.85 g (이론치의 37％)의 청색 동결건조물.
e) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(4-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카르바모일}-부틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.4 g (0.43 mmol)의 실시예 4d)의 표제 화합물로부터 실시하였다. 수율: 0.31 g (이론치의 69％)의 청색 동결건조물.
원소 분석:
이론치: C, 48.27; H, 4.53; N, 5.36; S, 12.27; Na, 6.60.
실측치: C, 48.01; H, 4.44; N, 5.56; S, 12.10; Na, 6.81.
실시예 5
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(4-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥실]카르바모일}부틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXII)
Figure 112007015393024-PCT00029
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.4 g (0.43 mmol)의 실시예 4d)의 표제 화합물 및 0.20 g (0.66 mmol)의 N-(6-아미노헥실)말레이미드-트리플루오로아세테이트로부터 실시하였다. 수율: 0.35 g의 청색 동결건조물 (이론치의 74％).
원소 분석:
이론치: C, 50.17; H, 5.03; N, 5.09; S, 11.65; Na, 6.26.
실측치: C, 49.83; H, 4.89; N, 5.34; S, 12.05; Na, 6.42.
실시예 6
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(4-{[13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,7,10-트리옥사트리데실]카르바모일}부틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXIII)
Figure 112007015393024-PCT00030
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.4 g (0.43 mmol)의 실시예 1d)의 표제 화합물 및 0.30 g (0.72 mmol)의 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오로아세테이트로부터 실시하였다. 수율: 0.27 g의 청색 동결건조물 (이론치의 52％).
원소 분석:
이론치: C, 49.83; H, 5.27; N, 4.65; S, 10.64; Na, 5.72.
실측치: C, 49.45; H, 5.19; N, 4.66; S, 10.85; Na, 5.80.
실시예 7
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카르바모일}헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXIV)
Figure 112007015393024-PCT00031
a) 브롬화(3-t-부톡시카르보닐-펜틸)-트리페닐-포스포늄
제조는 실시예 4a)에 기재된 바와 같이 실시하고, 중간 생성물 6-브로모헥산 산-t-부틸 에스테르를 미정제 생성물로서 반응시켰다. 79 g의 생성물 (이론치의 69％)을 점성, 무색 오일로서 50 g의 6-브로모헥산산으로부터 얻었다.
b) 7-피리딘-4-일-헵탄산-t-부틸 에스테르
생성은 실시예 4b)에 기재된 바와 같이 실시하였다. 7.5 g의 7-피리딘-4-일-헵탄산-t-부틸 에스테르 (이론치의 65％)를 황색 오일로서 25 g (48.7 mmol)의 브롬화(3-t-부톡시카르보닐-펜틸)-트리페닐-포스포늄 (실시예 7a)으로부터 얻었다.
c) 3-[6-(t-부틸옥시카르보닐)헥실]글루타콘알데히드-디아닐리드-브롬화수소산염
30 ㎖의 디에틸 에테르중의 5.0 g (19 mmol)의 7-피리딘-4-일-헵탄산-t-부틸 에스테르의 용액을 3.6 g (38 mmol)의 아닐린과 함께 혼합한 후, 0℃에서 5 ㎖의 디에틸 에테르중의 2.1 g (19 mmol)의 브로모시아노겐의 용액과 혼합하였다. 2.5 시간 동안 0℃에서 교반한 후, 생성된 적색 고형물을 여과로 제거하고, 에테르로 세정하고, 진공 건조시켰다. 수율: 8.9 g (이론치의 91％).
d) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-카르복시헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
합성을 실시예 1d)와 유사하게 실시예 7c)의 표제 화합물 (3 ㎜ol) 및 1-(2-설포나토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-설폰산 (6 ㎜ol)으로부터 실시하였다. 수율: 1.5 g (이론치의 54％)의 청색 동결건조물.
e) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸 )-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카르바모일}헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.4 g (0.43 mmol)의 실시예 7d)의 표제 화합물로부터 실시하였다. 수율: 0.31 g (이론치의 69％)의 청색 동결건조물.
원소 분석:
이론치: C, 49.25; H, 4.79; N, 5.22; S, 11.95; Na, 6.43.
실측치: C, 48.98; H, 4.86; N, 5.12; S, 11.76; Na, 6.77.
실시예 8
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥실]카르바모일}헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXV)
Figure 112007015393024-PCT00032
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.5 g (0.53 mmol)의 실시예 7d)의 표제 화합 물 및 0.23 g (0.75 mmol)의 N-(6-아미노헥실)말레이미드-트리플루오로아세테이트로부터 실시하였다. 수율: 0.42 g의 청색 동결건조물 (이론치의 70％).
원소 분석:
이론치: C, 51.05; H, 5.27; N, 4.96; S, 11.36; Na, 6.11.
실측치: C, 50.74; H, 5.55; N, 4.76; S, 11.38; Na, 6.35.
실시예 9
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-{[13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,7,10-트리옥사트리데실]카르바모일}헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXVI)
Figure 112007015393024-PCT00033
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.5 g (0.53 mmol)의 실시예 7d)의 표제 화합물 및 0.44 g (1.06 mmol)의 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오로아세테이트로부터 실시하였다. 수율: 0.24 g의 청색 동결건조물 (이론치의 37％).
원소 분석:
이론치: C, 50.64; H, 5.48; N, 4.54; S, 10.40; Na, 5.59.
실측치: C, 50.30; H, 5.56; N, 4.34; S, 10.15; Na, 5.73.
실시예 10
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카르바모일}-3-옥사-펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXVII)
Figure 112007015393024-PCT00034
a) 3-옥사-6-(4-피리디닐)헥산산-t-부틸 에스테르
400 ㎖의 톨루엔/50 ㎖의 THF 중의 75 g (0.4 mol)의 3-(4-피리디닐)-1-프로판올의 용액을 10 g의 황산테트라부틸암모늄 및 350 ㎖의 32％ 수산화나트륨 용액과 혼합하였다. 그후, 123 g (0.68 mol)의 브로모아세트산-t-부틸 에스테르를 적가하고, 18 시간 동안 실온에서 교반하였다. 유기상을 분리하고, 수성상을 디에틸 에테르로 3회 추출하였다. 합한 유기상을 NaCl 용액으로 세정하고, 황산나트륨상에서 건조시키고, 증발에 의하여 농축시켰다. 크로마토그래피 정제 (실리카 겔: 이동 용매 헥산:에틸 아세테이트) 후, 56 g의 생성물 (이론치의 41％)을 갈색 오일 로서 얻었다.
b) 3-[4-옥사-5-(t-부틸옥시카르보닐)펜틸]글루타콘알데히드-디아닐리드-브롬화수소산염
60 ㎖의 디에틸 에테르중의 5.0 g (20 mmol)의 3-옥사-6-(4-피리디닐)헥산산-t-부틸 에스테르의 용액을 3.7 g (40 mmol)의 아닐린과 혼합한 후, 0℃에서 8 ㎖의 디에틸 에테르중의 2.2 g (20 mmol)의 브로모시아노겐의 용액과 혼합하였다. 0℃에서 1 시간 교반한 후, 50 ㎖의 디에틸 에테르를 혼합하고, 생성된 적색 고형물을 여과로 제거하고, 에테르로 세정하고, 진공 건조시켰다. 수율: 8.5 g (이론치의 85％)의 자주색 고형물.
c) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-카르복시-4-옥사헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
50 ㎖의 아세트산 무수물 및 10 ㎖의 아세트산 중의 3.0 g (6 mmol)의 3-[2-(t-부틸옥시카르보닐)에틸]-글루타콘알데히드-디아닐리드-브롬화수소산염 (실시예 10b)) 및 4.2 g (12 mmol)의 1-(2-설포나토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-설폰산 (실시예 1a))의 현탁액을 2.5 g (30 mmol)의 아세트산나트륨와 혼합하고, 50 분간 120℃에서 교반하였다. 냉각후, 이를 디에틸 에테르와 혼합하고, 침전된 고형물을 여과로 제거하고, 아세톤에 흡착 침전시키고, 진공하에서 건조시켰다. 크로마토그래피 정제 (RP-C18-실리카 겔, 이동 용매 물/메탄올) 후, 진공하에서 메탄올을 제거하고, 동결 건조시켜 표제 화합물을 즉시 얻었다. 수율: 2.3 g (이론치 의 41％)의 청색 동결건조물.
d) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카르바모일}-3-옥사펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
합성을 실시예 1c)와 유사하게 1.0 g (1.1 mmol)의 실시예 10c)의 표제 화합물로부터 실시하였다. 수율: 0.85 g (이론치의 73％)의 청색 동결건조물.
원소 분석:
이론치: C, 47.54; H, 4.46; N, 5.28; S, 12.09; Na, 6.50.
실측치: C, 47.97; H, 4.65; N, 5.10; S, 12.02; Na, 6.68.
실시예 11
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥실]카르바모일}-3-옥사-펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXVIII)
Figure 112007015393024-PCT00035
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.5 g (0.55 mmol)의 실시예 10c)의 표제 화합물 및 0.23 g (0.75 mmol)의 N-(6-아미노헥실)말레이미드-트리플루오로아세테이트로부터 실시하였다. 수율: 0.42 g의 청색 동결건조물 (이론치의 68％).
원소 분석:
이론치: C, 49.46; H, 4.96; N, 5.01; S, 11.48; Na, 6.17.
실측치: C, 48.95; H, 5.21; N, 5.22; S, 11.23; Na, 6.60.
실시예 12
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,7,10-트리옥사트리데실]카르바모일}-4-옥사펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXIX)
Figure 112007015393024-PCT00036
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.5 g (0.55 mmol)의 실시예 10c)의 표제 화합물 및 0.46 g (1.06 mmol)의 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오로아세테이트로부터 실시하였다. 수율: 0.34 g의 청색 동결건조물 (이론치의 56％).
원소 분석:
이론치: C, 49.17; H, 5.20; N, 4.59; S, 10.50, Na, 5.65.
실측치: C, 49.34; H, 5.32; N, 4.45; S, 10.28; Na, 5.56.
실시예 13
트리나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카르바모일}에틸)-펜옥시]시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXX)
Figure 112007015393024-PCT00037
a) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-클로로-시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
5.0 g (14.4 mmol)의 1-(2-설포나토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-설폰산 (실시예 1a)) 및 2.6 g (7.2 mmol)의 N-[(3-(아닐리노메틸렌)-2-클로로-1-시클로헥센-1-일)메틸렌]아닐린 염화수소 (알드리치 컴파니)를 100 ㎖의 메탄올중의 2.5 g (30 mmol)의 무수 아세트산나트륨와 함께 1 시간 동안 환류하고, 냉각하고, 150 ㎖의 디에틸 에테르와 혼합하고, 밤새 교반하였다. 침전물을 흡입으로 제거하 고, 건조시키고, 크로마토그래피 (실리카 겔, 구배: 디클로로메탄/메탄올)로 정제하였다. 수율: 3.8 g (이론치의 58％)의 청색 고형물.
b) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-카르복시에틸)펜옥시]시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
30 ㎖의 디메틸포름아미드중의 0.37 g (2.2 mmol)의 3-(4-히드록시페닐)프로피온산을 0.18 g (4.5 mmol)의 수소화나트륨 (60％ 광유 분산액)과 혼합하였다. 실온에서 30 분간 교반후, 0℃로 냉각시키고, 100 ㎖의 디메틸포름아미드중의 2.0 g (2.2 mmol)의 실시예 12a)의 표제 화합물의 용액을 적가하고, 2 시간 동안 실온에서 교반하였다. 혼합물을 드라이 아이스로 급냉시키고, 용매를 진공하에 제거하였다. 잔류물을 메탄올에 용해시키고, 200 ㎖의 에테르와 함께 교반하고, 침전된 고형물을 여과로 제거하였다. 크로마토그래피 정제 (실리카 겔, 구배: 에틸 아세테이트/메탄올)를 실시하였다. 수율: 1.9 g의 청색 고형물 (이론치의 83％).
c) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카르바모일}에틸)-펜옥시]시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
0.1 ㎎ (0.10 mmol)의 실시예 12b)의 표제 화합물을 실시예 1e)에 기재된 바와 같이 트리에틸아민의 존재하에 TBTU 및 N-(2-아미노에틸)말레이미드-트리플루오로아세테이트와 반응시키고, 얻은 생성물을 크로마토그래피로 정제시켰다. 수율: 93 ㎎의 청색 동결건조물 (이론치의 81％).
원소 분석:
이론치: C, 51.21; H, 4.47; N, 4.88; S, 11.16; Na, 6.00.
실측치: C, 51.50; H, 4.55; N, 4.95; S, 10.93; Na, 6.15.
실시예 14
트리나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥실]카르바모일}에틸)-펜옥시]시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXI)
Figure 112007015393024-PCT00038
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.7 g (0.68 mmol)의 실시예 14a)의 표제 화합물 및 0.53 g (1.22 mmol)의 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오로아세테이트로부터 실시하였다. 수율: 0.56 g의 청색 동결건조물 (이론치의 68％).
원소 분석:
이론치: C, 48.27; H, 4.53; N, 5.36; S, 12.27; Na, 6.60.
실측치: C, 48.01; H, 4.44; N, 5.56; S, 12.10; Na, 6.81.
실시예 15
트리나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[13-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-4,7,10-트리옥사트리데실]카르바모일}에틸)펜옥시]시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXXII)
Figure 112007015393024-PCT00039
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.7 g (0.68 mmol)의 실시예 14a)의 표제 화합물 및 0.59 g (1.36 mmol)의 N-(13-아미노-4,7,10-트리옥사트리데실)말레이미드-트리플루오로아세테이트로부터 실시하였다. 2 개의 크로마토그래피 정제를 실시하였다. 수율: 0.67 g의 청색 동결건조물 (이론치의 75％)
원소 분석:
이론치: C, 52.29; H, 5.16; N, 4.28; S, 9.79; Na, 5.27.
실측치: C, 51.88; H, 5.40; N, 4.34; S, 9.53; Na, 5.68.
실시예 16
트리나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]카르바모일}에틸)-펜옥시]-5-t-부틸-시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXXIII)
Figure 112007015393024-PCT00040
a) N-[(3-(아닐리노메틸렌)-2-클로로-5-t-부틸-1-시클로헥센-1-일)메틸렌]아닐린 염화수소염
6.7 ㎖ (73.4 mmol)의 옥시염화인을 0℃에서 8 ㎖의 디메틸포름아미드에 적가하였다. 그후, 30 ㎖의 디클로로메탄 중의 5.0 g (32.4 mmol)의 4-t-부틸시클로헥사논의 용액을 적가하고, 반응 혼합물을 3 시간 동안 환류 교반하였다. 0℃로 냉각한 후, 5.5 ㎖의 에탄올 중의 6 g (64.8 mmol)의 아닐린을 서서히 적가하고, 혼합물을 200 g의 얼음에 붓고, 5 ㎖의 진한 염산을 교반하면서 첨가하였다. 침전된 고형물을 여과로 제거하고, 에테르로 세정하고, 건조시켰다. 수율: 6.8 g (이론치의 50％)의 적색 고형물.
b) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-클로로-5-t-부틸시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리 덴]-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
5.0 g (14.4 mmol)의 1-(2-설포나토에틸)-2,3,3-트리메틸-3H-인돌레닌-5-설폰산 (실시예 1a)) 및 3.0 g (7.2 mmol)의 N-[(3-(아닐리노메틸렌)-2-클로로-5-t-부틸-1-시클로헥센-1-일)메틸리덴]아닐린 염화수소염 (실시예 16a))을 2.5 g (30 mmol)의 무수 아세트산나트륨와 함께 100 ㎖의 메탄올중에서 1.5 시간 동안 환류하고, 냉각시키고, 200 ㎖의 디에틸 에테르와 혼합하고, 밤새 교반하였다. 침전물을 흡입으로 제거하고, 건조시키고, 크로마토그래피 (실리카 겔, 구배: 디클로로메탄/메탄올)로 정제하였다. 수율: 4.7 g (이론치의 68％)의 청색 고형물.
c) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-카르복시에틸)펜옥시]-5-t-부틸시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
반응은 2.0 g (2.1 mmol)의 실시예 16b)의 표제 화합물로부터 실시예 13b)에 기재된 바와 같이 실시하였다. 수율: 1.5 g (이론치의 66％).
d) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[2-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)에틸]-카르바모일}에틸)-펜옥시]-5-t-부틸-시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
반응은 1.0 g (0.92 mmol)의 실시예 16c)의 표제 화합물로부터 실시예 13c)에 기재된 바와 같이 실시하였다. 크로마토그래피에 의한 정제는 RP C-18 실리카 겔 (이동 용매: 아세토니트릴/물)로 2회 실시하였다. 수율: 0.24 g (이론치의 22％).
원소 분석:
이론치: C, 52.82; H, 4.93; N, 4.65; S, 10.64; Na, 5.72.
실측치: C, 52.23; H, 5.20; N, 4.31; S, 10.30; Na, 6.15.
실시예 17-19
브로모아세틸아미드기를 갖는 인도트리카르보시아닌 염료의 합성
실시예 17
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[6-(브로모아세틸아미노)헥실]카르바모일}-4-옥사펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXXIV)
Figure 112007015393024-PCT00041
a) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{(6-아미노헥실)카르바모일}-4-옥사펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
합성을 실시예 1e)와 유사하게 0.5 g (0.55 mmol)의 실시예 10c)의 표제 화 합물 및 0.15 g (0.70 mmol)의 N-boc-헥산디아민 (Fluka)으로부터 실시하였다. 반응 생성물을 크로마토그래피 (RP C18-크로마토그래피, 구배: 메탄올/물)로 정제하고, 동결 건조후, 2 ㎖의 트리플루오로아세트산/8 ㎖의 디클로로메탄중에서 15 분간 얼음 냉각하면서 교반하였다. 진공하에서 스피닝 처리한 후, 잔류물을 메탄올에 용해시키고, 디에틸 에테르로 침전시키고, 분리하였다. 수율: 0.26 g의 청색 고형물 (이론치의 41％).
b) 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(5-{[6-(브로모아세틸아미노)헥실]카르바모일}-4-옥사펜틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염
0.26 g (0.23 mmol)의 실시예 18a)의 표제 화합물을 5 ㎖의 디메틸포름아미드중에서 -20℃로 냉각하고, 28 ㎎ (0.28 mmol)의 트리에틸아민 및 0.2 ㎖의 디메틸포름아미드중의 0.10 g (0.46 mmol)의 브롬화브로모아세틸 용액과 혼합하였다 . 최대 0℃에서 5 시간 동안 교반한 후, 디에틸 에테르를 첨가하여 생성물을 침전시키고, 디메틸포름아미드/디에틸 에테르로부터 재침전에 이어서 건조를 반복하여 얻었다. 수율: 0.23 g (이론치의 86％)의 청색 고형물.
원소 분석:
이론치: C, 45.63; H, 4.87; N, 4.84; S, 11.07; Na, 5.96.
실측치: C, 45.13; H, 4.66; N, 4.67; S, 10.83; Na, 측정되지 않음.
실시예 18
트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(3-{[3-(브로모아세틸아미노)프로필]카르바모일}-에틸)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXXV)
Figure 112007015393024-PCT00042
합성은 실시예 17과 유사하게 실시예 1d)의 표제 화합물 (0.5 g; 0.56 ㎜ol) 및 N-boc-프로필렌디아민을 출발 물질로 하여 실시하였다. 수율: 전 단계에 대하여: 0.22 g (이론치의 37％).
원소 분석:
이론치: C, 43.70; H, 4.33; N, 5.23; S, 11.96; Na, 6.43.
실측치: C, 43.21; H, 4.14; N, 5.53; S, 10.89; Na, 측정되지 않음.
실시예 19
트리나트륨 3,3-디메틸-2-[2-(1-{[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]비닐렌}-2-[4-(2-{[3-(브로모아세틸아미노)프로필]카르바모일}에틸)-펜옥시]시클로헥스-1-엔-3-일리덴)에틸리덴]-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (화학식 XXXVI)
Figure 112007015393024-PCT00043
합성은 실시예 17과 유사하게 실시예 13b)의 표제 화합물 (0.5 g; 0.49 ㎜ol) 및 N-boc-프로필렌디아민을 출발 물질로 하여 실시하였다. 수율: 전 단계에 대하여: 0.31 g (이론치의 53％).
원소 분석:
이론치: C, 47.88; H, 4.52; N, 4.65; S, 10.65; Na, 5.73.
실측치: C, 48.04; H, 4.43; N, 4.69; S, 10.72; Na, 5.84.
실시예 20-23
생체분자를 사용한 접합체의 합성 및 접합체의 광물리학적 특성
실시예 20
실시예 1-16의 표제 화합물을 사용한 BSA (소 혈청 알부민)의 표지화
일반적인 지시 사항: 5 ㎖의 인산염 완충액(0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4, pH 6.8)중의 5 ㎎ (0.074 μmol)의 BSA (시그마 컴파니)의 용액을 각각의 경우에서 0.74 μmol의 실시예 1-16의 표제 화합물 (PBS중의 0.5 ㎎/㎖의 스톡 용액)과 함께 혼합하고, 30 분간 25℃에서 배양하였다. 접합체의 정제는 겔 크로마토그래피 (컬럼: Sephadex G50, 직경 1.5 ㎝, 파마시아, 용출액: PBS)로 실시하였다.
실시예 21
실시예 17-19의 표제 화합물을 사용한 BSA의 표지화
일반적인 지시 사항: 5 ㎖의 인산염 완충액(0.1 M 붕산염 완충액, pH 8.5)중의 5 ㎎ (0.074 μmol)의 BSA (시그마 컴파니)의 용액을 각각의 경우에서 1.10 μmol의 실시예 17-19의 표제 화합물 (PBS중의 0.5 ㎎/㎖의 스톡 용액)과 함께 혼합하고, 5 시간 동안 25℃에서 배양하였다. 접합체의 정제는 겔 크로마토그래피 (컬럼: Sephadex G50, 직경 1.5 ㎝, 파마시아, 용출액: PBS)로 실시하였다.
실시예 22
실시예 1-16의 표제 화합물을 사용한 항-ED-B-피브로넥틴 scFv 항체 AP39 (단일쇄 분절)의 표지화
AP39는 C-말단 시스테인을 갖는 scFv이고, 분자량이 약 56,000 g/몰인 공유 S-S-이량체로서 존재한다. [Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2002 March; 5(2): 204-13]. 디설피드 가교의 감소로 인하여, 접근 가능한 SH기를 갖는 2 개의 단량체를 생성하였다(분자량 28,000 g/몰).
일반적인 지시사항: 0.3 ㎖의 PBS중의 AP39 용액 (진한 0.93 ㎎의 이량체/㎖)을 PBS (2.8 ㎎/㎖)중의 60 ㎕의 트리스(카르복시에틸)포스핀 (TCEP)의 용액과 혼합하고, 질소하에서 1 시간 동안 25℃에서 배양하였다. 과량의 TCEP를 NAP-5 컬럼 (용출액: PBS)상에서의 겔 여과에 의하여 분리하였다. 광도 측정에 의하여 측정한 얻은 AP39-단량체(OD280 ㎚=1.4)의 함량은 230-250 ㎍ (부피 0.5-0.6 ㎖)이다. 용액을 0.03 μmol의 실시예 1-16의 표제 화합물(PBS중의 0.5 ㎎/㎖의 스톡 용액)과 혼합하고, 30 분간 25℃에서 배양하였다. 접합체를 NAP-5 컬럼상에서의 겔 크로마토그래피 (용출액: PBS/10％ 글리세롤)에 의하여 정제하였다. 접합체 용액의 면역 반응도는 친화도 크로마토그래피 (ED-B-피브로넥틴 수지)[J. Immunol. Meth. 1999, 231, 239]에 의하여 측정하였다. 얻은 접합체의 면역 반응도는 >80％ (접합 이전의 AP39 >95％)이었다.
실시예 23
실시예 17-19의 표제 화합물을 사용한 항-ED-B-피브로넥틴 scFv 항체 AP39 (단일쇄 분절)의 표지화
일반적인 지시사항: 0.3 ㎖의 PBS중의 AP39 용액(진한 0.93 ㎎의 이량체/㎖)을 PBS (2.8 ㎎/㎖)중의 트리스(카르복시에틸)포스핀 (TCEP)의 용액 60 ㎕와 혼합하고, 질소하에서 1 시간 동안 25℃에서 배양하였다. 과량의 TCEP는 NAP-5 컬럼 (용출액: 50 ㎜ol의 붕산염 완충액 pH 8.5)상에서의 겔 여과에 의하여 분리하였다. 광도 측정에 의하여 측정한 AP39-단량체(OD280 ㎚=1.4)의 함량은 230-250 ㎍ (부피 0.5-0.6 ㎖)이다. 용액을 0.06 μmol의 실시예 17-19의 표제 화합물(PBS중의 0.5 ㎎/㎖의 스톡 용액)과 혼합하고, 4 시간 동안 25℃에서 배양하였다. 접합체를 NAP-5 컬럼상에서의 겔 크로마토그래피 (용출액: PBS/10％ 글리세롤)에 의하여 정제하였다. 접합체 용액의 면역 반응도는 친화도 크로마토그래피 (ED-B-피브로넥틴 수지)[J. Immunol. Meth. 1999, 231, 239]에 의하여 측정하였다. 얻은 접합체의 면역 반응도는 >75％ (접합 이전의 AP39 >95％)이었다.
실시예 24
각종 염료 구조물 및 AP39 에 대한 표적-특이성 접합체의 광물리학적 성질 및 면역반응도( ELISA )
생체분자 부하의 정도(염료-대-생체분자 몰비)는 광도 측정에 의하여 그리고 단파 흡광 숄더(약 690-710 ㎚)에서 75,000 L mol-1·㎝-1의 흡광 계수에 기초하여 측정하며; OD280 ㎚=1.4의 항체 흡수 (항-CD105 IgG)를 계산에 사용하였다. 형광 광자 수율은 인도시아닌 그린(DMSO중의 Q=0.13, J. Chem. Eng. Data 1977, 22, 379, Bioconjugate Chem. 2001, 12, 44)에 대한 SPEX 플루오로로그 (파장 의존성 민감도에 대하여 보정한 램프 및 검출기)를 사용하여 측정하였다.
면역반응도는 ELISA에 의하여 측정하며, 이는 실시예 1-19의 샘플 염료를 사용한 접합 이전에 비-표지된 생체분자 AP39에 대한 표적 (ED-B-피브로넥틴)으로의 생체분자 결합 백분율(％)을 나타낸다. 결과를 하기 표 2에 요약한다.
물질(생체분자/샘플 화합물) 염료-대- 생체분자 비율 최대 흡수 (㎚) 최대 형광 (㎚) 형광 광자 수율 면역반응도 (ELISA) (％)
AP39 및 실시예 1의 표제 화합물의 접합체 1.1 768 794 0.14 >75
AP39 및 실시예 2의 표제 화합물의 접합체 1.0 767 793 0.12 >80
AP39 및 실시예 4의 표제 화합물의 접합체 0.8 767 792 0.12 >80
AP39 및 실시예 5의 표제 화합물의 접합체 0.9 768 794 0.14 >80
AP39 및 실시예 6의 표제 화합물의 접합체 1.1 769 792 0.10 >80
AP39 및 실시예 7의 표제 화합물의 접합체 1.0 769 792 n.d. >85
AP39 및 실시예 10의 표제 화합물의 접합체 1.1 767 790 0.13 >85
AP39 및 실시예 11의 표제 화합물의 접합체 1.1 767 789 0.15 >90
AP39 및 실시예 12의 표제 화합물의 접합체 0.9 766 790 0.11 >75
AP39 및 실시예 13의 표제 화합물의 접합체 1.2 771 795 0.10 >80
AP39 및 실시예 14의 표제 화합물의 접합체 1.1 772 796 0.09 >85
AP39 및 실시예 17의 표제 화합물의 접합체 0.7 767 790 0.18 >90
AP39 및 실시예 19의 표제 화합물의 접합체 0.8 773 794 0.13 >85
실시예 25
염료를 사용한 항-CD105-항체 (항-엔도글린 IgG)의 표지화 및 광물리학적 성질의 측정
본 실시예는 표적 CD105 (엔도글린)에 대한 각종 생체분자 유형(전장 IgG 항체)을 설명한다.
염료 합성: 항체로의 접합에 사용한 염료는 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3H-인돌륨-2-일]-4-(6-카르복시-4-옥사헥실)헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1-H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (실시예 10c)이다. 디메틸포름아미드를 5 당량의 N-히드록시숙신이미드, 4 당량의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드와 5 시간 동안 실온에서 반응시켜 상기 염료를 해당 N-히드록시숙신이미딜 에스테르로 전환시켰다. 디에틸에테르를사용한 침전후, 미정제 염료를 항-CD 105-항체를 사용한 접합에 직접 사용하였다.
표지화 반응: 인산염 완충 염수중의 1 ㎖의 항체 항-CD105 IgG 용액 (농도 1 ㎎/㎖)(pH 7.4)을 상기에서 설명한 0.17 μmol의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르(증류수중의 스톡 용액 0.2 ㎎/㎖)로 처리하고, 5 시간 동안 25℃에서 배양하였다. 겔 크로마토그래피 (NAP10 즉석 탈염화 컬럼, 용출액: PBS)로 정제를 실시하여 10 μmol/ℓ 염료 농도/1.4 μmol/ℓ 항체 농도의 용액을 얻었다.
상기에서 설명한 바와 같이 물리화학적 성질을 측정하고, 이를 하기 표 3에 기재하였다.
물질(생체분자/샘플 화합물) 염료-대- 생체분자 비율 최대 흡수 (㎚) 최대 형광 (㎚) 형광 광자 수율 면역반응도 (ELISA) (％)
항-CD105 IgG 및 실시예 10c 화합물의 N-히드록시숙신이미딜 에스테르로부터의 접합체 7.1 769 795 0.08 n.d.
실시예 26
Capan-1 종양을 갖는 누드 마우스에서의 미세전이암의 조영
배양액중에서 서브-융합 성장된 Capan-1 종양 세포를 트립신으로 처리하고, 원심분리하고, PBS중에 재현탁시킨다. 트립탄 블루로 염색시키고, 세포 농도를 계산한 후, 세포 현탁액을 3×107/㎖의 농도로 설정하였다. 세포가 사용될 때까지 세포를 얼음에서 냉각시켰다. 누드 마우스 암컷 (NMRI-누드, 24-25 g 체중) 3 마리를 마취시키고, 30 ㎕ (1×106 세포/동물)의 세포 현탁액을 복강 절개후 각각의 동물에서 췌장을 피막하에 접종하였다. 각각의 동물은 실시예 10에 의한, 즉 화학식 XXVII로 나타낸 구조를 갖는 시아닌 염료를 포함하고, 실시예 22의 방법에 의하여 EB-DF 항체 AP39에 접합된 물질 0.05 μmol/㎏ 체중 (1.3 ㎎/㎏ 체중)을 투여한다. 이 물질은 뚜렷한 종양 성장이 감지될 수 있는 시점에서 정맥내 투여한다(종양 세포 이식후 약 12 내지 14 주). 물질 투여후 6 시간에서 동물을 죽이고, 강화된 CCD 카메라를 사용한 형광 시그날에 대하여 미세전이암을 포함하는 창자간막을 생체외 조영하였다. 레이저 다이오드(0.5 W 출력)로 생성된 740 ㎚ 파장의 근적외선광을 사용한 창자간막 조사에 의하여 물질의 형광을 여기시켰다. 형광 화상을 디지탈로 저장하였다. 그후, 미세전이암의 크기를 저 배율 현미경(Stemi 2000-C, Fa. Carl Zeis)을 사용하여 측정하였다. 직경이 0.5 내지 2.0 ㎜ 범위내인 미세전이암 및 더 큰 장간막 전이로부터 형광 시그날을 얻었으며, 현미경 평가를 실시하였다. 염료 접합체의 효능은 예로서 도 1에 도시하였다.
실시예 27
누드 마우스에서의 작은 자궁내막증 병변의 생체외 조영
4 마리의 NMRI 누드 마우스에게서 수술로 자궁내막증을 유발시켰다. 실라진/케타아민 (부피 할당 2:10, 1 ㎖/kg 체중)의 복강내 주사로 마우스를 마취시켰다. 2 ㎝ 중앙선 절개로 복부를 개방시키고, 사람 자궁내막증 조직 샘플 (샘플 크기 약 1 ㎣) 2 개를 복강의 각면상의 복막에 고정시켰다. 자궁내막증 발병후 9일째에 모든 마우스에게 조영술을 실시하였다. 조영술의 경우, 2 마리의 마우스에게 0.05 μmol/kg 체중 (1.3 ㎎/kg b.w.)의 실시예 20에 의한 접합체(AP39+화학식 XXVII으로 도시한 바와 같은 구조를 갖는 실시예 10의 표제 화합물)를 정맥내 투여하였다. 나머지 2 마리 마우스에게 BSA 및 트리나트륨 3,3-디메틸-2-{7-[3,3-디메틸-5-설포나토-1-(2-설포나토에틸)-3-H-인돌륨-2-일]-4-(6-카르복시-4-옥사헥실)-헵타-2,4,6-트리엔-1-일리덴}-1-(2-설포나토에틸)-2,3-디히드로-1H-인돌-5-설포네이트, 내부 염 (실시예 10c)으로부터 합성된 대조용 접합체를 투여하였다. 물질 투여후 24 시간에서 모든 동물을 죽이고, 자궁내막증 병변을 포함하는 복막을 강화된 CCD 카메라를 사용한 형광 시그날에 대하여 생체외 조영시켰다. 물질의 형광은, 레이저 다이오드(0.5 W 출력)로 생성된, 740 ㎚ 파장을 갖는 근적외선을 사용한 자궁내막증 병변을 포함하는 복막 조사에 의하여 여기되었다. 형광 화상을 디지탈로 저장하였다. 실시예 20 (AP39+화학식 XXVII에 도시한 바와 같은 구조를 갖는 실시예 10의 표제 화합물)에 의한 접합체로 처치한 2 마리 마우스 모두의 자궁내막증 병변에서 뚜렷한 형광 시그날 증강이 관찰되었다. 병변을 포함하는 형광의 크기는 2 ㎜보다 작았다. 염료 접합체의 효능은 대표예로서 도 2에 도시하였다.
실시예 28
누드 마우스에서의 피부의 자발 미소병변의 생체내 조영
피부의 자발 다발성 미소병변이 NMRI-누드 마우스 2 마리에게서 관찰되었다. 각각의 마우스에게 실시예 20에 의한 접합체 (AP39+화학식 XXVII에 도시한 구조를 갖는 실시예 10의 표제 화합물) 0.05 μmol/㎏ 체중 (1.3 ㎎/kg b.w.)을 정맥내 투여하였다. 약물 투여후 6 시간에서 마취된 마우스에게 조영술을 실시하였다. 마취제 이소풀루란(이소플루란 쿠라메드, 독일 칼스류헤에 소재하는 큐라메드 파마 게엠베하)을 사용하여 단시간 마취를 유발시켰다. 물질의 형광은 다이오드-레이저(742 ㎚의 여기 파장)로 여기시키고, 강화된 CCD-카메라를 사용하여 검출하였다. 형광 화상을 디지탈로 저장하였다. 그후, 미소병변의 크기를 저 배율 현미경(Stemi 2000-C, Fa. Carl Zeis)을 사용하여 측정하였다. 형광 시그날은 <1 ㎜ 보다 작은 미소병변으로부터 얻었다. 염료 접합체의 효능은 대표예로서 도 3에 도시하였다.
추가로 설명하지 않더라도, 당업자들은 상기의 설명을 이용하여 본 발명을 최대 한도로 이용할 수 있을 것으로 생각된다. 그러므로, 하기의 바람직한 특이적 구체예는 단지 예로서 제시한 것이며, 어떠한 방법으로도 본 명세서의 나머지 개시 내용을 제한하지 않는 것으로 이해하여야 한다.
하기의 실시예에서, 특별한 언급이 없는 한, 모든 온도는 섭씨 단위로, 보정하지 않았으며, 모든 부 및 ％는 중량을 기준으로 한 것이다.
모든 출원, 특허 및 공보의 전체 개시는 본 명세서에서 참고로 인용한다.
상기의 실시예는 본 발명의 일반적으로 또는 특이적으로 설명한 반응물 및/또는 작동 조건을 상기 실시예에서 사용한 것으로 대체하여 유사하게 성공적으로 재현할 수 있다.
상기의 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 필수 구성을 용이하게 확인할 수 있을 것이며, 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어남이 없이 각종 용도 및 조건으로 본 발명의 각종 수정 및 변형을 가할 수 있을 것이다.

Claims (29)

  1. 미세전이암 또는 소증식성 병변의 진단을 위한 진단제의 제조에서의 하기 화학식 I의 접합체의 용도:
    <화학식 I>
    B-(D)n
    상기 식에서,
    B는 혈관생성 특이성 결합 성분을 나타내며,
    D는 시아닌 염료를 나타내며,
    n은 1 내지 5이다.
  2. 제1항에 있어서, 혈관형성 특이성 결합 성분은 피브로넥틴의 ED-B 도메인 (ED-BF), 엔도글린, 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), VEGF 구성원, NRP-1, Ang1, Thie2, PDGF-BB 및 수용체, TGF-β1, 엔도글린, TGF-β 수용체, FGF, HGF, MCP-1, 인테그린 (αvβ3, αvβ5, α5β1), VE-카드헤린, PECAM (CD31), 에프린, 플라스미노겐 활성인자, MMP, PAI-1, NOS, COX-2, AC133, 케모킨, Id1/Id3, VEGFR-1, Ang2, TSP-1, -2, 안지오스타틴 및 관련 플라스미노겐 크링글, 엔도스타틴 (콜라겐 XVII 분절), 바소스타틴, 혈소판 인자 4, TIMP, MMP 억제제, PEX, Meth-1, Meth-2, IFN-α, -β, -γ, IP-10, IL-4, IL-12, IL-18, 프롤락틴 (M, 16K), VEGI, SPARC의 분절, 오스테오폰틴(Osteopontin) 분절 또는 마스핀(Maspin)에 대하여 작용하는 것인 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 혈관형성 특이성 결합 성분은 펩티드, 단백질, 핵산, 소분자 및 당으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질은 항체, 항체 분절 및 단일쇄 항체로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 L19, E8, AP38 및 AP39로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 DNA, RNA, 앱타머 및 PNA로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소분자는 2,2-디페닐에틸아민인 것인 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시아닌 염료는 카르보시아닌, 디카르보시아닌 및 트리카르보시아닌으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시아닌 염료는 하기 화학식 II를 갖는 화합물, 이 화합물의 염 및 용매화물인 것인 용도:
    <화학식 II>
    Figure 112007015393024-PCT00044
    상기 식에서,
    C는 하기 화학식 III 또는 화학식 IV의 라디칼을 나타내며,
    <화학식 III>
    Figure 112007015393024-PCT00045
    <화학식 IV>
    Figure 112007015393024-PCT00046
    여기서 별표로 표시한 위치는 라디칼 A와의 결합 지점을 나타내며, 하기 화학식 V, 화학식 VI, 화학식 VII, 화학식 VIII 또는 화학식 IX의 기를 나타낼 수 있으며,
    <화학식 V>
    Figure 112007015393024-PCT00047
    <화학식 VI>
    Figure 112007015393024-PCT00048
    <화학식 VII>
    Figure 112007015393024-PCT00049
    <화학식 VIII>
    Figure 112007015393024-PCT00050
    <화학식 IX>
    Figure 112007015393024-PCT00051
    여기서 R1 및 R2는 서로 독립적으로 C1-C4-설포알킬쇄 또는 포화 또는 불포화 분지쇄형 또는 직쇄형 C1-C50-알킬쇄를 나타내며, 이는 임의로 0 내지 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개의 카르보닐기 및/또는 0 내지 5 개의 히드록실기로 치환되거나 또는, 0 내지 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개의 카르보닐기로 임의 로 차단되거나 및/또는 0 내지 5 개의 히드록실기로 치환될 수 있으며;
    R3는 B 또는, B에 결합된 링커를 나타내며, 여기서 링커는 1 이상의 -OH, -COOH, -SO3 기로 치환되거나 및/또는 -O-, -S-, -CO-, -CS-, -CONH, -NHCO-, NHCSNH-, -SO2-, -PO4 --, -아릴- 및/또는 -NH-기로 1 회 이상 임의로 차단된, 20 개 이하의 탄소 잔기를 갖는 분지쇄형 또는 직쇄형 탄수화물쇄이며;
    R4는 -COOE1, -CONE1E2, -NHCOE1, -NHCONHE1, -NE1E2, -OE1, -OSO3E1, -SO3E1, -SO2NHE1 또는 -E1의 기를 나타내며, 여기서
    E1 및 E2는 서로 독립적으로 0 내지 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개의 카르보닐기에 의하여 임의로 차단되거나 및/또는 0 내지 5 개의 히드록실기로 치환된, 포화 또는 불포화, 분지쇄형 또는 직쇄형 C1-C50-알킬쇄, C1-C4-설포알킬쇄, 수소 원자를 나타내며;
    R5는 수소 원자, 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자, 메틸, 에틸, 프로필 또는 이소-프로필을 나타내거나;
    b는 2 또는 3의 수를 의미하고;
    X 및 Y는 서로 독립적으로 O, S, =C(CH3)2 또는 -(CH=CH)-를 나타낸다.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 시아닌 염료는 하기 화학식 X를 갖는 화합물, 이 화합물의 염 또는 용매화물인 것인 용도:
    <화학식 X>
    Figure 112007015393024-PCT00052
    상기 식에서, C'은 하기 화학식 XI 또는 화학식 XII의 라디칼을 나타내며,
    <화학식 XI>
    Figure 112007015393024-PCT00053
    <화학식 XII>
    Figure 112007015393024-PCT00054
    여기서 별표로 표시한 위치는 라디칼 A'와의 결합 지점을 나타내며, 하기 화학식 XIII, 화학식 XIV, 화학식 XV, 화학식 XVI 또는 화학식 XVII의 기를 나타낼 수 있으며,
    <화학식 XIII>
    Figure 112007015393024-PCT00055
    <화학식 XIV>
    Figure 112007015393024-PCT00056
    <화학식 XV>
    Figure 112007015393024-PCT00057
    <화학식 XVI>
    Figure 112007015393024-PCT00058
    <화학식 XVII>
    Figure 112007015393024-PCT00059
    여기서, 화학식 XV 또는 화학식 XVII의 라디칼은 C1 내지 C4-알킬 라디칼로 임의로 치환될 수 있으며, 여기서
    R1'은 C1-C4-설포알킬쇄; 임의로 0 내지 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개의 카르보닐기로 치환되거나 및/또는 0 내지 5 개의 히드록실기로 치환될 수 있 거나 또는, 0 내지 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개의 카르보닐기로 임의로 차단되거나 및/또는 0 내지 5 개의 히드록실기로 치환될 수 있는 포화 또는 불포화, 분지쇄형 또는 직쇄형 C1-C50-알킬쇄; 또는 M'-R6'을 나타내며;
    R2'는 C1-C4-설포알킬쇄; 임의로 0 내지 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개의 카르보닐기로 치환되거나 및/또는 0 내지 5 개의 히드록실기로 치환될 수 있거나 또는, 0 내지 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개의 카르보닐기로 임의로 차단되거나 및/또는 0 내지 5 개의 히드록실기로 치환될 수 있는 포화 또는 불포화, 분지쇄형 또는 직쇄형 C1-C50-알킬쇄; 또는 M'-R7'을 나타내며;
    R3', R4', R6' 및 R7'은 서로 독립적으로 -COOE1', -CONE1'E2', -NHCOE1', -NHCONHE1', -NE1'E2', -OE1', -OSO3E1', -SO3E1', -SO2NHE1' 또는 -E1'의 기를 나타내며, 여기서
    E1' 및 E2'은 서로 독립적으로 임의로 0 내지 15 개의 산소 원자 및/또는 0 내지 3 개의 카르보닐기로 차단되거나 및/또는 0 내지 5 개의 히드록실기로 치환된 포화 또는 불포화, 분지쇄형 또는 직쇄형 C1-C50-알킬쇄, C1-C4-설포알킬쇄, 수소 원자를 나타내며,
    M'은 CH2-CH2 또는 CH2-CH2-CH2를 나타내며;
    R5'은 -Q'-CH2-R8'을 나타내며;
    Q'는 C1-C5 알킬을 나타내며, C 원자는 O 또는 S로 임의로 치환되거나 또는
    Figure 112007015393024-PCT00060
    를 나타내며,
    R8'은 -CO-NH-R9'-R10', -NH-CS-NH-R9'-R10' 또는 -NH-CO-R9'-R10'을 나타내며, 여기서
    R9'은 비분지된 C2-C13 알킬로 구성된 군에서 선택되며, 여기서 C 원자는 O 또는 S로 임의로 치환되고,
    R10'은 B 또는, B에 결합된 커플링 부분의 나머지 부분이고,
    b'은 2 또는 3의 수를 의미하며,
    X' 및 Y'은 서로 독립적으로 O, S, =C(CH3)2, =C(C2H5)2, =C(C3H7)2, =C(이소C3H7)2, =C(C4H9)2 또는 -(CH=CH)-를 나타낸다.
  11. 제10항에 있어서,
    A'은 화학식 XVI 또는 화학식 XVII의 라디칼을 나타내며, 여기서 화학식 XVII의 라디칼은 파라 위치에서 C1-C4-알킬 라디칼로 임의로 치환될 수 있으며,
    C'은 화학식 XII의 라디칼을 나타내며,
    R1'은 M-R6'을 나타내고;
    R2'은 M-R7'을 나타내며;
    R3', R4', R6' 및 R7'은 서로 독립적으로 SO3H 또는 H를 나타내지만, 단 R3', R4', R6' 및 R7' 중 3 개 이상은 SO3H이고,
    X' 및 Y'은 서로 독립적으로 O, S, =C(CH3)2, =C(C2H5)2, =C(C3H7)2, =C(이소C3H7)2 또는 =C(C4H9)2를 나타내며,
    b'은 3인 것인 용도.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    A'은 화학식 XVI의 라디칼을 나타내며;
    M'은 CH2-CH2를 나타내며; 및
    Q'은 C1-C5 알킬을 나타내며, C 원자는 O 또는 S로 임의로 치환되는 것인 용도.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, Q'은 C1-C5 알킬을 나타내는 것인 용도.
  14. 제10항 또는 제11항에 있어서, A'은 화학식 XVII의 라디칼을 나타내며,
    b'은 3을 의미하고,
    Q'는
    Figure 112007015393024-PCT00061
    을 나타내는 것인 용도.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, R8'은 CO-B 또는 NH-B를 나타내는 것인 용도.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소증식성 병변은 소원발 종양, 전암 증상, 이형성증, 화생(metaplasia), 염증성 병변, 자궁내막증 및/또는 안 질환으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 생체내 진단을 위한 것인 용도.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세전이암 및/또는 소증식성 병변은 처치 과정 이전에, 과정 도중에 및/또는 과정 이후에 진단하는 것인 용도.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세전이암 및/또는 소증식성 병변은 직경이 10 ㎜ 미만, 바람직하게는 8 ㎜ 미만인 것인 용도.
  20. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세전이암 및/또는 소증식성 병변은 직경이 6 ㎜ 미만, 바람직하게는 5 ㎜ 미만인 것인 용도.
  21. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세전이암 및/또는 소증식성 병변은 직경이 4 ㎜ 미만, 바람직하게는 3 ㎜ 미만인 것인 용도.
  22. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세전이암 및/또는 소증식성 병변은 직경이 2.0 내지 0.2 ㎜인 것인 용도.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미세전이암은 의인성 미세전이암, 혈행성 미세전이암, 강내 미세전이암, 관내 미세전이암, 림프성 전이, 국소 미세전이암, 및/또는 부위 미세전이암인 것인 용도.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전암 증상은 피부의 전암 증상, 특히 광선 각화증, 피부 각질, 광선 구순염, 타르 각화증, 비소 각화증, X선 각화증, 보웬(Bowen's) 질환, 보웬양 구진증, 악성 흑점, 경화성 태선 및 태선 고무 점막; 소화관의 전암 증상, 특히 홍색판, 백반, 바레트 식도, 플러머-빈슨(Plummer-Vinson) 증후군, 다리 궤양, 거대 비후성 위질환, 경계 암종, 종양 장 폴립, 직장 폴립, 석회화 담낭; 부인과적 전암 증상, 특히 유관상피내암종 (CDIS), 경부 상피내 종양 (CIN), 백반, 자궁내막 증식증 (III급), 외음부 이상증, 외음부 상피내 종양 (VIN), 포상기태; 비뇨기과 전암 증상, 특히 방광 유두종증, 퀴이라 홍색비후증, 고환 상피내 종양 (TIN), 백반; 상피내암종(CIS); 만성 염증에 의하여 야기된 전암 증상, 특히 화농피부증, 골수염, 응괴성 여드름, 심상 루푸스 및 누공으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화생은 원인불명 골수 화생, 아포크린 화생, 비정형 화생, 자가실질 화생, 결합 조직 화생, 상피 화생, 장 화생, 후형질 빈혈, 후형질 골화, 후형질 폴립, 골수양 화생, 원발성 골수양 화생, 2차 골수양 화생, 편평 화생, 양막의 편평 화생, 대증 골수양 화생 및 재생성 화생으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  26. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이형성증은 발한결핍성 외배엽 이형성증, 전후안면두개골(anterofacial) 이형성증, 질식 흉 이형성증, 심장사지(atriodigital) 이형성증, 기관지폐 이형성증, 대뇌 이형성증, 경부 이형성증, 연골외배엽 이형성증, 쇄골두개골 이형성증, 선천성 외배엽 이형성증, 두골간 이형 성증, 머리 손목 발목 이형성증, 두개골-골간단 이형성증, 상아질 이형성증, 골간 이형성증, 외배엽 이형성증, 에나멜 이형성증, 뇌-눈 이형성증, 편지(heminelia) 골단 이형성증, 다발성 골단 이형성증, 점상 골단 이형성증, 상피 이형성증, 안면지생식기 이형성증, 턱의 가족성 섬유 이형성증, 가족성 백색 굴곡 이형성증, 섬유근성 이형성증, 골의 섬유 이형성증, 개화성 골 이형성증, 유전 신장-망막 이형성증 발한성 외배엽 이형성증, 발한저하성 외배엽 이형성증, 림프구 감소성 가슴샘 이형성증, 유방 이형성증, 하악안면 이형성증, 정신 이형성증, 몬디니(Mondini) 이형성증, 단일골 섬유 이형성증, 점막 상피 이형성증, 다발성 골단 이형성증, 안이척추 이형성증, 안이지 이형성증, 안척추 이형성증, 치원 이형성증, 안구하악사지 이형성증, 근단주위 시멘트질 이형성증, 다골성 섬유 이형성증, 가성연골발육부전 척추골단 이형성증, 망막 이형성증, 중격-시신경 이형성증, 척추골단 이형성증 및 뇌실요골 이형성증으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
  27. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 병변은 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, 패혈성 쇽, 골다공증, 골관절염, 신경병변성 동통, 바이러스성 감염, 세균성 감염, 인슐린 의존성 당뇨병, 비-인슐린 의존성 당뇨병, 치주 질환, 재협착, 원형 탈모증, 건선, 건선성 관절염, 급성 췌장염, 동종이식 거부, 알러지, 폐에서의 알러지성 염증, 죽상동맥경화증, 다발성 경화증, 악액질, 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 크론 질환, 염증성 장 질환, 허혈, 울혈성 심부전증, 폐섬유증, 간염, 길랑-바레(Guillain-Barre) 증후군 및 전신성 홍반 루푸스로 구성된 군 에서 선택된 질환 또는 증상에 의하여 야기되는 것인 용도.
  28. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자궁내막증은 혈행성 세포 무리, 강내 세포 무리, 관내 세포 무리, 림프 세포 무리, 국소 세포 무리 및/또는 부위 세포 무리를 포함하는 것인 용도.
  29. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안 질환은 트라코마, 미숙아 망막병증, 당뇨병성 망막병증, 신생혈관 녹내장 및 노년기 황반 변성으로 구성된 군에서 선택된 것인 용도.
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