KR20050049525A

KR20050049525A - Ｇｌｐ-1 유도체 및 그의 경점막 흡수형 제제

Info

Publication number: KR20050049525A
Application number: KR1020057005890A
Authority: KR
Inventors: 유지 하야시; 미츠히로 마키노; 토시유키 코우자키; 모토히로 타케다; 타카히토 조모리
Original assignee: 가부시키가이샤산와카가쿠켄큐쇼
Priority date: 2002-10-11
Filing date: 2003-10-10
Publication date: 2005-05-25
Also published as: CA2502118A1; CN100354306C; US7291594B2; CN1703424A; JPWO2004037859A1; EP1559724A1; US20060194720A1; EP1559724A4; AU2003272970B2; AU2003272970A1; WO2004037859A1

Abstract

본 발명은 GLP-1(7-35)의 아미노산 서열에 있어서 1 또는 몇개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 서열로 되며, 또 GLP-1 활성을 갖는 펩티드의 C 말단에 Waa-(Xaa)n-Yaa (식중, Waa는 Arg 또는 Lys이고, Xaa는 Arg 또는 Lys이며, n은 0~14의 정수이고, Yaa는 Arg, Arg-NH₂, Lys, Lys-NH₂ 또는 Hse임)가 부가된 GLP-1 유도체이다. 본 유도체는 점막으로부터 흡수성이 높은 유도체이다. 본 발명에서는 또한 GLP-1 아미노산 서열의 8 위치를 Ser으로 치환하는 것으로 디펩티딜펩티다제 IV에 대한 내성을 부가하고 또 26 위치를 Gln으로, 34 위치를 Asn으로 치환하는 것으로 트립신 내성을 부가할 수 있다. 본 발명의 GLP-1 유도체는 표면전하를 마이너스로 조정한 전하조정 지방유제를 사용하여 제제화하는 것에 의해 그 점막흡수율을 더 높일 수 있다.

Description

ＧＬＰ-1 유도체 및 그의 경점막 흡수형 제제{GLP-1 derivatives and transmicosal absorption preparations thereof}

본 발명은 구강, 폐, 코 또는 장 등의 점막으로부터 흡수되는 비율이 높은 인간 글루카곤 유사 펩티드-1 (GLP-1)의 신규 유도체, 및 그의 제조와 이용방법에 관한 것이다.

GLP-1 (Glucagon like peptide-1)은 식물섭취에 의해 소화관으로부터 분비되며, 췌장에 작용하여 인슐린 분비를 자극하는 인크레틴 호르몬으로서 알려져 있다. 동일한 작용을 나타내는 것으로는 GIP(Gastric inhibitory polypeptide 또는 Glucose-dependent insulinotropic polypeptide)가 있다. 2형 당뇨병 환자에서는 건강한 사람에 비하여 이러한 인크레틴 효과가 결여되어 있거나 장애되어 있는 것이 시사되어 있고, 이것이 고혈당의 원인의 하나로 여겨지고 있다. 예컨대, 2형 당뇨병 환자에서는 혈중 GlP-1 농도가 저하되고 GIP는 건강한 사람과 변함없는 것이 보고되어 있다. 또한 2형 당뇨병 환자에게 인크레틴 호르몬을 투여하는 시험 결과, 인슐린 분비 촉진반응이 건강한 사람에 비하여 GLP-1 투여에서는 차이가 확인되지 않지만, GIP 투여에서는 현저하게 저하되어 있는 것이 보고되어 있다. 이 때문에, 당뇨병 환자에서는 GLP-1에 대한 응답성은 유지되어 있기 때문에 부족을 보충하는 GLP-1 제제는 인슐린 분비 촉진제로서의 당뇨병 치료약으로서의 응용에 기대가 되고 있다.

GLP-1의 인슐린 분비 작용의 특징은 혈당치가 110 mg/dl 이하에서는 인슐린 분비를 자극하지 않고, 그 이상의 혈당치로 되어야만 인슐린을 분비시키는 혈당치 의존성을 나타내는 것이다. 즉, GLP-1의 투여에 의해 혈당치에 따라서 인슐린 분비가 촉진되며, 혈당치가 정상 이하로 되면 인슐린 분비는 일어나지 않는다. 따라서 GLP-1을 사용한 경우, 저혈당의 우려가 없는 것, 또 인슐린의 과잉 분비가 없어 췌장을 피폐화시키지 않는 것이 큰 임상상의 장점이다. 한편, 2형 당뇨병의 치료에 있어서 중심적으로 사용되고 있는 술포닐요소제는 지속적으로 ATP 감수성 K⁺ 채널을 폐쇄시켜 인슐린 분비를 촉진시킨다. 그러나, 혈당치와는 무관하게 췌장의 인슐린 분비세포에 작용하기 때문에, 저혈당, β세포에 대한 과잉자극에 의한 췌장의 피폐, 장기투여에 의한 2차 무효가 보고되어 있다. 따라서, GLP-1의 약리학적 특성은 종래의 당뇨병약과는 상이한 유용한 것이다.

또한 GLP-1에는 글루카곤 분비를 억제하는 특성, 식물의 위로부터의 배설을 지연시키는 특성, 위산 분비를 억제하는 특성, 뇌에 작용하여 식이를 억제하는 특성, 또한 췌장 β 세포에서의 인슐린 합성과 췌장 β 세포의 증식을 촉진시키는 특성이 있다. 따라서, GLP-1은 2형 당뇨병에서 고 글루카곤혈증 등의 고혈당의 원인에 길항하므로, 당뇨병의 치료에 유용할 뿐만 아니라 비만 치료에도 유효한 것으로 생각되고 있다.

그러나, GLP-1의 활성본체는 GLP-1 (7-36) 아미드 또는 GLP-1 (7-37)의 폴리펩티드이고, GLP-1의 경구 섭취로는 소화관내에서 소화효소에 의해 소화, 분해되어 흡수되지 않는다. 이 때문에 임상에서는 점적에 의한 정맥내 주사나 피하주사가 시험되고 있는 실정이다. 더구나, 혈중이나 조직에 존재하는 디펩티딜펩티다제 IV(DPPIV)에 의해 GlP-1은 분해되고, 생체내 반감기는 1~2분으로 아주 짧은 것이 알려져 있으며, 이들이 임상 응용에 대한 문제로 되어 있다.

이 문제점을 해결하기 위하여, 몇개의 연구 개발이 실시되고 있다. 예컨대 분해되기 어렵고 반감기가 긴 8위치 아미노산 치환 유도체(Diabetologia 41: 271-278 (1998), Biochem 40: 2860-2869 (2001))와 피하로 부터의 흡수가 느린 서방형 주사제의 개발이 시도되고 있다. 또한 GLP-1 유사 아고니스트 활성을 갖고, 혈중 반감기가 긴 도마뱀 유래의 합성 Exendin-4에서의 주사제의 개발(Am J Physiol 281: E155-E161 (2001))이 실시되고 있다. 그러나, GLP-1이 당뇨병 치료약으로서 넓게 이용될 수 있기 위해서 환자의 부담이나 편의를 고려하면 주사 이외의 투여 경로가 바람직하다.

주사제나 경구 투여제 대신 침습성을 수반하지 않는 투여방법으로서 폐, 구강, 비강, 질, 눈, 직장 등의 점막 흡수제를 고려할 수 있다. 그러나, 일반적으로 GLP-1과 같은 펩티드는 고분자이기 때문에, 단독으로 점막으로부터의 흡수율은 낮다. 이 때문에, 일반적으로는 펩티드와 같은 고분자는 흡수촉진제와 함께 처방된다. 또한 약제의 지속흡수성을 확보하기 위해서는 수용성 또는 수팽윤성의 접착제가 사용되며, 피부층에 부착되는 필름, 바칼정, 연고, 트로치 형태로 처방된다. 지금까지 많은 흡수촉진제 또는 접착제가 시험되었고, 점막 약물투여를 용이하게 하고 유효한 것이 알려져 있다. 그러나, Gutniak 등(Diabetes Care 20: 1874-1879 (1997))에 의해 보고된 400 ㎍의 GLP-1을 포함하는 바칼정으로 인간 구강 점막으로부터의 GLP-1의 흡수는 상기한 바와 같은 종래 기술을 구사하여도 정맥내 주사의 7%, 피하 주사의 47%의 바이오어베일러빌리티(생물학적 이용율)이고, 그 흡수율은 충분하다고는 할 수 없다.

GLP-1를 분해하는 효소로서 알려진 디펩티딜펩티다제 IV는 신장, 간장, 소장, 수액선, 각종 결합조직 등 넓은 조직에 분포되는 외에, 혈액, 뇨, 수액 등의 액체나 비강 점막에도 존재하는 것이 분명하게 되어 있으며, 아마도 다른 점막 조직에도 존재하는 것으로 추측된다.

발명의 개시

GLP-1의 점막으로부터의 흡수는 막투과성의 낮음이나 흡수 부위에서의 분해에 의해 주사에 비하여 매우 비효율적이다. 예컨대, GLP-1를 경비 투여하는 것은 가능하지만, 그 흡수율이 낮기 때문에 충분한 약리효과를 얻기 위해서는 매우 고용량이 필요하다. 따라서, 펩티드의 원체생산 비용 면에서 천연형 GLP-1를 경비제로서 의약품 개발하는 것은 비현실적이다. GLP-1를 임상 응용하기 위해서는 점막으로부터의 흡수율이 주사제에 필적하는 GLP-1 유도체의 개발이 필요하다. 여기서 본 발명자들은 점막으로부터의 흡수성이 개선된 GLP-1 신규 유도체를 고안하고 주사제 대신 점막 투여제를 제공하기 위하여 예의 연구를 실시하였다.

그 결과, GLP-1에 플러스 전하를 가진 아르기닌 또는 리신을 부가하면 점막 흡수가 증대된다는 신규한 사상에 도달하였다. 더불어, 활성 발현에 중요한 N 말단측을 피하고, C 말단측에 몇개의 아르기닌 및/또는 리신을 부가하는 것을 고안하고, 하기 GLP-1 유도체를 얻었다. 또한 점막 흡수율을 증대시키기 위하여 표면전하를 마이너스로 조정한 전하 조정 지방유제를 이용하여 점막 흡수가 현저하게 증대된 GLP-1 제제를 창출하였다.

즉, 본 발명의 GLP-1 유도체는 GLP-1(7-35)의 아미노산 서열에서 1 또는 몇개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 서열로 되며, 또 GLP-1 활성을 갖는 펩티드의 C 말단에 Waa-(Xaa)n-Yaa (Waa는 Arg 또는 Lys이고, Xaa는 Arg 또는 Lys이며, n은 0~14의 정수, Yaa는 Arg, Arg-NH₂, Lys, Lys-NH₂ 또는 Hse)가 부착된 펩티드이다. 이와 같이 C 말단측에 수개의 아르기닌 및/또는 리신을 부가하는 것에 의해 점막으로부터의 흡수성이 높은, 즉 점막으로부터의 생물학적 이용능이 높은 신규GLP-1 유도체가 제공된다.

본 발명의 GLP-1 유도체에 있어서 디펩티딜펩티다제 IV에 대한 내성을 부가하기 위해서 8 위치의 알라닌을 세린으로 치환하는 것이 바람직하다. 그와 같은 펩티드는 일반식 [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Waa-(Xaa)n-Yaa (식중, Waa는 Arg 또는 Lys이고, Xaa는 Arg 또는 Lys이며, n은 0~14의 정수이고, Yaa는 Arg, Arg-NH₂, Lys, Lys-NH₂ 또는 Hse임)으로 표시된다.

또한 본 발명의 GLP-1 유도체에 있어서, 26 위치의 리신을 글루타민으로, 34 위치의 리신을 아스파라긴으로 치환하는 것에 의해 트립신 내성을 부여할 수 있다. 그와 같은 펩티드는 일반식 [Gln²⁶, Asn³⁴]-GLP-1(7-35)-Waa-(Xaa)n-Yaa (식중, Waa는 Arg 또는 Lys이고, Xaa는 Arg 또는 Lys이며, n은 0~14의 정수이고, Yaa는 Arg, Arg- NH₂, Lys, Lys-NH₂ 또는 Hse임)으로 표시된다.

이들 디펩티딜펩티다제 IV 내성 또는 트립신 내성의 GLP-1 유도체에 있어서도 물론 GLP-1(7-35)의 아미노산 서열중의 1 또는 몇개의 아미노산의 결실, 치환 및/또는 부가가 가능하다.

전술한 본 발명의 GLP-1 유도체에 있어서는 바람직하게는 n은 1~9의 정수이고, 더욱 바람직하게는 n은 3 ~5의 정수이다.

본 발명의 GLP-1 유도체에 있어서, 가장 바람직한 펩티드는 일반식 [Ser⁸, Gln²⁶, Asn³⁴]-GLP-1(7-35)-(Arg)n-Yaa (식중, n은 4~6의 정수이고, Yaa는 Arg 또는 Arg-NH₂임)으로 표시된다.

본 발명의 GLP-1 유도체를 마우스에 경비 투여한 후 내당능 시험을 실시하고, 혈당저하 작용 및 인슐린 분비 촉진 작용에 의해 GLP-1 유도체의 흡수 효율을 조사하였다. 그 결과, 높은 혈당저하 작용 및 인슐린 분비 촉진 작용을 나타내고 천연형 GLP-1의 10분의 1 용량으로 동등한 효과를 나타낼 수 있는 점에서 비점막으로부터의 흡수가 천연형 GLP-1에 비하여 10배 증대된 것으로 추측된다.

본 발명의 GLP-1 유도체는 또한 그 흡수율을 높이기 위하여 특개평 8-27018호에 기재한 전하조정 지방유제를 사용하여 제제화를 실시하였다. 즉, 본 발명은 표면 전하를 마이너스로 조정한 지방유제와 본 발명의 GLP-1 유도체를 함유하는 GLP-1 제제를 제공한다.

전하조정 지방유제는 표면전하를 마이너스로 조정한 지방유제로서, 펩티드 및 단백질을 흡착하며, 펩티드 및 단백질의 대효소 안정성을 향상시키며, 또한 약리효과의 증강과 지속시간의 연장을 유발할 수 있는 것으로 여겨진다. 한편, 본 발명의 GLP-1 유도체는 플라스 전하를 가진 아르기닌 또는 리신이 수개 부가되어 있기 때문에 상기 전하조정 지방유제에 흡착되기 쉽게 되어 있다. 따라서, 이 전하조정 지방유제를 사용하여 제제화하면 본 발명의 GLP-1 유도체의 점막흡수는 보다 증대되는 것으로 추측할 수 있다. 실제로, 글루코오스 부하 마우스에 대하여 상기 전하조정 지방유제를 병용하여 본 발명의 GLP-1 유도체를 경비투여하고 혈당 저하작용에 의한 흡수효율을 조사했더니, 본 발명의 GLP-1 유도체는 천연형 GLP-1의 30분의 1용량으로 동등한 효과를 나타내었다. 즉, 본 발명의 GLP-1 유도체는 전하 조정 지방유제를 병용하는 것에 의해 천연형 GLP-1에 비하여 코점막으로부터의 흡수가 30배 증대시키는 것으로 간주될 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 GLP-1 유도체는 점막 흡수성이 높고, 특히 코점막으로부터 흡수시키는 제제로 하는 것에 최적인 펩티드이다. 본 발명의 GLP-1 유도체는 8 위치를 세린으로 치환하는 것에 의해 혈중과 조직에 존재하는 디펩티딜펩티다제 IV에 의해 분해되기 어렵게 되며, 생체내 반감기가 긴 GLP-1 유도체로 될 수 있다. 또한 전술한 바와 같이, 트립신 내성을 부가하는 것으로 조직중에 존재하는 트립신에 의한 분해로부터도 보호되며 생물학적 이용율을 보다 높일 수 있다.

또한 본 발명의 GLP-1 유도체와 전하조정 지방유제를 조합하는 것에 의해 보다 점막 흡수성이 향상되고 피하 주사제 정도의 저용량으로도 효과를 발현시킬 수 있다. 즉, 본 발명은 종래의 주사제 대신 투여가 용이하고 고통을 수반하지 않는 점막 흡수형 GLP-1 제제의 임상응용 가능성을 상당히 높일 수 있어, 당뇨병 환자 및 비만 환자의 QOL 개선에 유용한 것으로 본다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하에 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. GLP-1(7-35)는 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly (서열번호 1)로 표시되는 서열을 갖는 펩티드이다. [Ser⁸]는 상기 서열의 2번째, 즉 8 위치의 Ala가 Ser로 변환되어 있는 것을 나타내고, 8S와 같은 의미이다. 또한 -NH₂는 아미드화되어 있는 것을 나타내며, 본 발명의 GLP-1 유도체는 C 말단이 아미드화되어 있는 경우와 아미드화되어 있지 않은 경우 어느 한쪽의 형태를 취할 수 있다.

본 발명의 GLP-1 유도체는 화학합성 또는 유전자 조합 기술에 의해 제조할 수 있다.

폴리펩티드의 화학합성의 원리는 본 발명의 기술분야에서 주지의 사실이다. 그 원리는 예컨대 이하와 같은 일반적인 문헌을 참고로 할 수 있다; Dugas H. 및 Penney C, Bioorganic Chemistry (1981) Springer-Verlag, New York, 54-92페이지, merrifields JM, Chem. Soc, 85: 2149 (1962) 및 Stewart 및 Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 24-66 페이지, Freeman (San Francisco, 1969). 예컨대 430A 펩티드 합성기 (PE-Applied Biosystems Inc, 850 Lincoln Center Drive, Foster City CA 94404) 및 PE-Applied Biosystems에 의해 공급된 합성 사이클을 사용하여 고상 방법에 의해 본 발명의 펩티드를 합성할 수 있다. Boc 아미노산 및 그외의 시약은 PE-Applied Biosystems 및 기타 약품 공급 업자로 부터 구입가능하다.

본 발명의 펩티드를 유전자 조합 기술에 의해 생산하는 방법에 관해서 이하에 상세하게 설명한다.

GLP-1의 DNA는 전합성 또는 큰 천연의 글루카곤이 코드화되어 있는 DNA의 수식에 의해 얻을 수 있다. 프레프로글루카곤을 코드하고 있는 DNA 서열은 Lund 등 [Proc Natl Acad Sci USA 79: 345-349 (1982)]에서 표시되어 있고, 이 천연의 서열을 변경하는 것에 의해, 본 발명 화합물의 생산에 사용할 수 있다. 합성 유전자의 구축 방법은 본 발명의 기술분야에서는 주지이며, 예컨대 Brown 등의 Methods in Enzymology, Academic Press, NY 제68권, 109-151 페이지를 참고할 수 있다. 본 발명의 펩티드를 코드하는 DNA 서열을 그 아미노산 서열에 기초하여 디자인하고, Model 380A 또는 380BDNA 합성기 (PE-Applied Biosystems Inc, 850 Lincoln Center Drive, Foster City CA 94404) 등의 통상의 DNA 합성기를 사용하여 그 서열 자신을 갖는 DNA를 제조할 수 있다.

또한 본 발명의 GLP-1 유도체의 생산에 사용되는 DNA로는 발현량을 높여 산물을 숙주내로 안정적으로 축적시키는 공정, 생산후의 정제를 용이하게 하는 공정, 또는 융합 단백질로서 생산시켜 용이하게 GLP-1 유도체를 빼내는 공정 등을 실시할수 있다. 예컨대 본 발명의 GLP-1 유도체 유전자의 복수개를 탄뎀으로 연결하고, 발현량을 높이는 수법 또는 β-갈락토시다제, β-락타마제, 프로테인 A, TrpE 등의 단백질의 유전자에 연결하여 융합 단백질로서 생산시키는 수법을 예시할 수 있다. 이들 경우, 예컨대 생산후 GLP-1 유도체를 단체로서 수득하기 위해서는 각 유전자와의 사이에 아미노산의 메티오닌에 대응하는 유전자를 넣어두고, 브롬화시안 처리할 수 있다. 이 경우에 C 말단은 Hse(호모세린)으로 된다. 또한 본 발명의 GLP-1 유도체 중에는 C 말단에만 아르기닌을 가진 것이 있고, 아르기닌 엔도펩티다제에 의한 효소 처리에 의해 GLP-1 유도체의 단체를 얻을 수 있다.

GLP-1 유도체 펩티드의 발현을 효과적으로 실시하기 위하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하고, 적절한 재조합 DNA 발현 벡터에 소정의 서열을 가진 합성 DNA를 삽입한다. 일반적으로는 Maniatis 등, (1989) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY 제1-3권을 참조할 수 있다. 이때, 합성 유전자의 효율적인 전사를 달성하기 위해서, 이것을 프로모터 오퍼레이터 영역과 기능적으로 결합시킨다. 합성 유전자 프로모터 오퍼레이터 영역을 합성 유전자의 ATG 개시 코돈에 관하여 동일 서열 배향성으로 배치한다. 원핵생물 및 진핵생물의 형질전환에 사용될 수 있는 각종의 발현 벡터는 주지이며, The Promega Biological Research Products Catalogue 및 The Stratagene Cloning Systems Catalogue를 참조할 수 있다.

GLP-1 유도체 펩티드를 위한 발현 벡터를 작성한 후, 그 벡터를 사용하여 적절한 숙주세포를 형질전환시킨다. 숙주세포로는 진핵성 세포 또는 원핵성 세포 어느 것이라도 사용할 수 있다. 세포를 형질전환하기 위한 기술은 본 분야에서 주지이며, 상기의 Maniatis 등의 일반적인 인용문헌으로 나타낼 수 있다. 원핵성 숙주세포는 일반적으로는 보다 높은 비율로 단백질을 생산하고 보다 배양이 용이하다. 높은 레벨의 세포발현계에서 발현되는 단백질은 특징적으로 응집되며 고 레벨의 과잉으로 발현된 단백질을 함유하는 입자 또는 봉입체로 된다. 이와 같은 전형적으로 응집되어 있는 단백질을 본 분야 주지의 기술을 이용하여 가용화하고 변성시키며 또한 다시 한번 폴딩한다. 이것에 관해서는 Protein Folding, Kreuger 등 (1990) 136-142 페이지, Gierasch 및 King 편, American Association for Adavancement of Science Publication 을 참조할 수 있다.

본 발명의 GLP-1 유도체는 제제적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 흡수촉진제와 조합하여 제제화되며, 의약조성물로 할 수 있다. 흡수촉진제로는 예컨대 킬레이트제(예컨대 EDTA, 쿠엔산, 살리실산염), 계면활성제(예컨대 도데실황산나트륨(SDS)), 비계면활성제(예컨대 불포화 환상 요소), 및 담즙산염(예컨대 데옥시콜산나트륨, 타우로콜산 나트륨)을 들 수 있다. 이와 같은 의약 조성물은 제약 분야에서 주지의 방법으로 제조할 수 있다. 또한 이들의 의약조성물은 비강 등의 점막 투여에 적합하며, 개별적으로 또는 다른 치료약과 조합하여 투여할 수 있다. 본 발명의 GLP-1 유도체는 주사제, 경구제 등, 점막투여 제제 이외의 제제로 할 수 있다.

본 발명 조성물은 본 기술분야에서 주지의 방법을 이용하여 환자에 투여한 후 신속하고 또 지속적이며 또는 지연된 활성성분의 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 예컨대 적절한 마크로 분자(예컨대 폴리에스테르, 폴리아미노산, 폴리비닐피롤리돈, 아세트산에틸렌비닐, 메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 및 질산프로타민) 또는 폴리에스테르, 폴리아미노산, 하이드로겔, 폴리(젖산) 또는 아세트산에틸비닐 코폴리머 등의 폴리머 물질 등을 사용하여 본 발명 펩티드를 복합체로 하든가 또는 본 발명의 펩티드를 흡착시키는 것에 의해 방출이 제어된 제제를 제조할 수 있다. 또한 이들의 폴리머 입자에 펩티드를 혼합하는 대신에 예컨대 코어세르베이션 기술 또는 계면중합에 의해 제조된 마이크로캅셀, 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴으로된 아미크로캅셀, 콜로이드상 약물 전달 시스템(예컨대 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캅셀) 또는 마이크로에멀젼 중에 본 발명 펩티드를 봉입할 수 있다.

본 발명에서는 특개평 8-27018호에 따라 제조되는 전하조정 지방유제에 본 발명 펩티드를 흡착시키는 것에 의해 본 발명 펩티드의 점막으로부터의 흡수가 보다 촉진된 제제를 제조할 수 있다. 전하제어제로서는 각종의 산성 인지질 및 그의 염, 각종의 지방산류 및 그의 염, 담즙산류 및 그의 염 등으로 부터 선택된 적어도 1 종류의 물질을 사용할 수 있다. 산성 인지질 및 그의 염은 특히 제한되지 않지만, 포스타티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딘산 및 그의 염을 예시할 수 있다. 지방산류 및 그의 염도 특별히 한정되지 않지만, 탄소수 6 이상의 지방산 및 그의 염이 바람직하다. 담즙산류 및 그의 염도 특별히 한정되지 않지만, 데히드로콜산, 데옥시콜산, 타우로콜산 및 그의 염을 예시할 수 있다. 전하조정제의 선택, 전하조정 지방유제 농도의 설정에 의해 투여 부위에 적합한 본 발명의 의약 조성물을 제조할 수 있다.

본 발명의 GLP-1 유도체는 GLP-1 제제가 유효한 각종 질환에 유효하다. 즉, 본 발명의 GLP-1 유도체는 예컨대 인슐린 비의존성 만성 당뇨병의 치료, 인슐린 의존성 만성 당뇨병의 치료, 비만의 치료 및/또는 식욕억제제 등을 위해, 사용될 수 있다.

본 발명의 GLP-1 유도체의 투여량은 각종 질환 개개의 환자에 대하여 당업자에 의해 결정되는 것이 바람직하다. 그러나, 일반적으로는 그 투여량은 1회 체중 kg당 1 ㎍ 내지 1 mg의 범위내, 바람직하게는 1회 체중 kg당 10 ㎍ 내지 100 ㎍의 범위내로 생각할 수 있다. 식사시간 직전에 사용하고 1일 1회 부터 3회 이상 투여할 수 있다.

이하에 실시예, 시험예를 들어 본 발명의 설명을 더 실시한다. 이들 실시예는 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것이 아니다.

제조예 GLP-1 유도체의 합성

GLP-1 유도체의 합성은 Model 430A 펩티드 합성기(PE-Applied Biosystems, Foster City, CA)에 의한 고상 합성에 의해 실시하고, HPLC에 의해 정제한 후, 매스 스펙트럼에 의해 합성품을 확인하였다. 순도는 대부분의 것에 대하여 95% 이상의 것을 사용하고, 시험관내 및 생체내에서의 시험을 실시하였다.

이하에 합성한 화합물을 나타낸다. GLP-1 (7-36)의 서열은 His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg (서열번호 2)이다(즉, GLP-1(7-36)은 GLP-1 (7-35)-Arg와 동일하다). 예컨대 GLP-1(7-36)+Arg-NH₂ 라는 것은 천연형 GLP-1 (7-36)의 C 말단에 아미드화 Arg를 1잔기 부가한 것이다. 또한 [Ser⁸]-GLP-1(7-35)는 2번째 (8 위치에 상당)의 Ala를 Ser로 변환하고, 최후 (36 위치에 상당)의 Arg을 삭제한 것이다.

비교제조예 1. GLP-1 (7-36)-NH₂ ···천연형 GLP-1

비교제조예 2. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Arg-NH₂ (서열번호 3)

···8S-GLP-1으로 약칭

제조예 1. GLP-1(7-36)+Arg-NH₂ (서열번호 4)

···GLP-1+1R로 약칭

제조예 2. GLP-1(7-36)+Arg-Arg-NH₂ (서열번호 5)

···GLP-1+2R로 약칭

제조예 3. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Arg-Arg-Arg-NH₂ (서열번호 6)

···8S-GLP-1+2R로 약칭

제조예 4. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Arg-Arg-Arg-Arg-NH₂ (서열번호 7)

···8S-GLP-1+3R로 약칭

제조예 5. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-NH₂ (서열번호 8)

···8S-GLP-1+4R로 약칭

제조예 6. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-NH₂ (서열번호 9)

···8S-GLP-1+5R로 약칭

제조예 7. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-NH₂

(서열번호 10)···8S-GLP-1+6R로 약칭

제조예 8. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-ArgNH₂

(서열번호 11)···8S-GLP-1+8R로 약칭

제조예 9. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Lys-Arg-NH₂ (서열번호 12)

···8S, des36R-GLP-1+1KR로 약칭

제조예 10. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Lys-Lys-Arg-NH₂ (서열번호 13)

···8S, des36R-GLP-1+2KR로 약칭

제조예 11. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Lys-Lys-Lys-Arg-NH₂ (서열번호 14)

···8S, des36R-GLP-1+3KR로 약칭

제조예 12. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-NH₂ (서열번호 15)

···8S, des36R-GLP-1+5KR로 약칭

제조예 13. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-NH₂

(서열번호 16)···8S, des36R-GLP-1+7KR로 약칭

제조예 14. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg-NH₂ (서열번호 17)···8S, des36R-GLP-1+10KR로 약칭

제조예 15. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Arg-Lys-Lys-NH₂ (서열번호 18)

···8S-GLP-1+2K로 약칭

참고제조예 1. [Ser⁸, Gln²⁶, Asn³⁴]-GLP-1(7-35)-Arg (서열번호 19)

···8S26Q34N-GLP-1로 약칭

참고제조예 2. [Gln²⁶, Asn³⁴]-GLP-1(7-35)-Arg-NH₂ (서열번호 20)

···26Q34N-GLP-1로 약칭

또한 이들 제조예 이외에도 예 16. [Ser⁸, Gln²⁶, Asn³⁴]-GLP-1(7-35)-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-NH₂ (서열번호 21) (8S26Q34N-GLP-1+4R로 약칭), 예. 17. [Ser⁸, Gln²⁶, Asn³⁴]-GLP-1(7-35)-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg--NH₂(서열번호 22) (8S26Q34N-GLP-1+6R로 약칭), 예 18. [Ser⁸, Gln²⁶, Asn³⁴]-GLP-1(7-35)-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Arg--NH₂(서열번호 23) (8S26Q34N, des36R-GLP-1+5KR로 약칭) 등의 GLP-1 유도체가 바람직한 것으로 볼 수 있다.

또한 이상의 제조예 1 내지 15, 예 16~18에 관해서는 C 말단은 아미드화(-NH₂)되어 있지만, 비아미드화(-OH)체로 할 수 있다. 예컨대, 제조예 5의 비아미드화(-OH)체는 예19. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Arg-Arg-Arg-Arg-Arg (서열번호 24) (8S-GLP-1+4R로 약칭)로 된다. 또한 C 말단은 Hse로 할 수 있다. 그와 같은 펩티드로서는 예 20. [Ser⁸]-GLP-1(7-35)-Arg-Arg-Arg-Arg-Hse (서열번호 25) (8S-GLP-1+3RHse로 약칭)을 예시할 수 있다.

시험예 1 GLP-1 유도체의 사이클릭 AMP 생산 활성

인간 GLP-1 수용체의 공표된 DNA 서열[Graziano 등, Biochem Biophys Res Com 196: 141-146 (1993)]을 기초로 하여 발현벡터를 작성하였다. 차이니즈 햄스터 난소 CHO-K1 세포를 각 벡터로 형질전환시키고, 인간 GLP-1 수용체를 발현하는 재조합 CHO 세포를 얻었다.

인간 GLP-1 수용체 발현세포를 1 x 10⁴ 세포/ml/웰로 24웰 플레이트에 심었다. 3일 후 에세이를 이용하고 완충액(PBS, 5.6 mM 글루코오스, 1mM 이소부틸메틸크산틴, 20μM Ro20-1724, 0.5% BSA, pH 7.4)중에서 GLP-1 유도체와 37℃에서 30분간 배양하였다. 5N 염산을 10μl 가하여 배양을 중지시켰다.

각종 GLP-1 유도체와 GLP-1 수용체의 반응에 의해 세포내에 형성되는 사이클릭 AMP 생성물은 cAMP-Screen^TM system (Applied Biosystems)에 의한 엔자임이뮤노에세이에 의해 측정하였다. 표 1에 각종 GLP-1 유도체의 사이클릭 AMP 생산활성을 천연형 GLP-1의 활성을 100%한 경우의 상대적 수치로 나타내었다.

이 결과, 어떤 GLP-1 유도체도 시험관내에서의 사이클릭 AMP 생산활성을 가지고 있었다. 그러나, 아르기닌 또는 리신이 많이 부가됨에 따라서 활성의 저하 경향이 보였다. 특히 리신에서도 그 경향이 확인될 수 있다. 그러나, 점막흡수시에는 부가된 아르기닌 또는 리신이 펩티다제에 의해 절제되는 가능성이 높기 때문에, 반드시 이 시험관내에서의 활성이 생체내에서의 활성을 반영하는 것이라고는 생각할 수 없으며, 이것이 이후 생체내 시험의 결과로 되어 있는 것으로 생각할 수 있다.

실험예 2 GLP-1 유도체의 점막으로부터의 흡수에 수반되는 혈당저하 작용 및 인슐린 분비 촉진작용

GLP-1 유도체의 점막으로부터의 흡수증대를 시험관내에서의 혈당저하 작용 및 인슐린 분비촉진 작용에 의해 평가하였다. 즉, 마우스에 GLP-1 유도체를 경비 투여하고, 글루코오스 부하후의 혈당치의 변동을 조사하는 경구 내당능 시험(OGTT)으로 평가하였다.

GLP-1 유도체는 증류수로 1mM로 조제하고, -80℃로 스톡하였다. 시험시에 생리식염수로 소정 농도로 희석시켜 사용하였다.

마우스는 에테르를 사용하여 경마취시켰다. 마이크로피펫을 사용하여 20μl의 GLP-1 유도체 용액을 칩의 선단으로부터 직접 마우스의 코로 천천히 방출하였다. 이때 GLP-1 유도체 용액은 마우스의 흡수에 의해 코로 부터 흡인되었다. GLP-1 유도체를 경비 투여하여 5분후 5% 글루코오스 용액을 10 ml/kg의 비율로 존데에 의해 경구투여하였다.

혈당치는 시험직전과 글루코오스 투여 5, 10, 20분 후에 꼬리 선단부를 절제시킨 상처로 부터 혈액 수 μl를 유출하고, 소형 혈당치측정기(글루테스토에스, (주식회사) 산와가가꾸겐뀨쇼)를 이용하여 측정하였다. GLP-1 유도체 투여 전의 혈당치로부터의 상승분의 곡선 아래 면적(AUG 0-20분)을 개개의 마우스에 관하여 산출하였다.

또한 혈중 인슐린치는 글루코오스 투여 5분후에 헤파린 처리시킨 유리 모세관을 이용하여 안와정맥총으로 부터 75μl 채혈하고, 원심분리에 의해 얻은 혈장을 사용하여 EIA법(레비스 마우스 인슐린 키트, (주식회사) 시바야기)에 의해 측정하였다.

각 GLP-1 유도체 투여군의 혈당치와 혈중 인슐린값을 평균치와 표준오차로 표 2에 나타내었다.

이 결과, 8S-GLP-1+4R 및 8S,des36R-GLP-1+5KR의 GLP-1 유도체에 관하여 가장 강한 혈당저하 작용이 나타났다. 또한 8S-GLP-1+4R 이상으로 아르기닌을 부가한 유도체, 또는 8S,des36R-GLP-1+5KR 이상으로 리신을 부가한 유도체에 있어서 가장 높은 인슐린 분비 촉진작용이 나타났다. 이때, 천연형 GLP-1에 비하여 10분의 1양으로 동등의 효과를 나타내고 있는 점으로부터 이들의 GLP-1 유도체는 천연형 GLP-1에 비하여 10배 흡수가 증대되었다고 보여진다.

시험예 3 전하조정 지방유제의 GLP-1 유도체의 점막 흡수에 대한 작용

시험예 2와 동일한 방법으로 경구 내당능 시험을 실시하고, 전하조정 지방유제의 병용에 의한 GLP-1 유도체의 혈당치 저하작용 및 인슐린 분비 촉진작용을 조사하였다. 사용한 전하조정 지방유제는 특개평 8-27018에 따라서 제조하고, 포스파티딜글리세롤 (나트륨염) 2% (w/w), 중성유 8%(w/w), 물 90%(w/w)를 사용하여 최종 농도 8% 전하조정 지방유제를 얻었다.

8% 전하조정 지방유제 용액 50 μl, 1mM 8S-GLP-1+5R 용액 3.56 μl, 증류수 146.4 μl를 혼합하고, 최종 농도 0.0178 mM 8S-GLP-1+5R 를 포함하는 2% 전하조정 지방유제 용액을 제조하였다. 비교 대조에는 2% 전하조정 지방유제 용액을 포함하지 않는 0.534 mM 천연형 GLP-1 용액(8S-GLP-1+5R에 비하여 30배량), 2% 전하 조정 지방유제 용액을 포함하지 않는 0.017 mM 8S-GLP-1+5R 용액, 및 생리적 식염수를 사용하였다.

혈당치는 시험직전과 글루코오스 투여 10, 20, 30분 후에 꼬리 선단부를 절제시킨 상처로 부터 혈액 수 μl를 유출하고, 소형 혈당치측정기(글루테스토에스, (주식회사) 산와가가꾸겐뀨쇼)를 이용하여 측정하였다. GLP-1 유도체 투여 전의 혈당치로부터의 상승분의 곡선 아래 면적(AUG 0-30분)을 개개의 마우스에 관하여 산출하였다.

또한 혈중 인슐린치는 글루코오스 투여 10분후에 헤파린 처리시킨 유리 모세관을 이용하여 안와정맥총으로 부터 75μl 채혈하고, 원심분리에 의해 얻은 혈장을 사용하여 EIA법(레비스 마우스 인슐린 키트, (주식회사) 시바야기)에 의해 측정하였다.

이 결과, 전하조정 지방유제를 병용한 8S-GLP-1+5R은 전하조정 지방유제를 병용하지 않은 천연형 GLP-1의 30분의 1 양으로 천연형 GLP-1과 동등한 혈당 저하 작용을 나타내었다. 즉, 전하조정 지방유제에 의해 8S-GLP-1+5R의 흡수가 증대되고 보다 저농도에서 효과가 발휘되었다.

시험예 4 GLP-1 유도체 8S26Q34N-GLP-1의 활성 평가

시험예 1의 방법에 따라서 GLP-1 유도체 8S26Q34N-GLP-1의 시험관내에서 사이클릭 AMP 생산 활성을 측정하였다. 아미노산 치환후도 활성을 유지하고 있었다(표 4).

8S26Q34N-GLP-1의 사이클릭 AMP 생산활성

8S26Q34N-GLP-1의 농도 (log M)	cAMP 생산량 (pmol/10⁵ 세포/30분)
-12	0.6
-11	4.7
-10	24.2
-9	76.1
-8	79.2

또한 마우스 랑게르한스섬을 이용하여 16.7 mM 글루코오스 존재하(고혈당 조건)에서 30분간의 인슐린 분비 활성을 조사했더니, GLP-1 유도체 8S26Q34N-GLP-1은 천연형 GLP-1에 비하여 활성이 강한 경향을 나타내었다(표 5)

에세이 농도(log M)	인슈린 분비량 (ng/섬/30분)
에세이 농도(log M)	천연형 GLP-1	8S26Q34N-GLP-1
0	2.61
-10	4.11	3.64
-9	5.11	6.61
-8	6.71	9.85

마우스 랑게르한스섬을 이용한, 16.7mM 글루코오스 존재하 8S26Q34N-GLP-1의 인슐린 분비 활성

또한 마우스에서 혈당저하 작용을 마우스에 GLP-1 유도체를 피하 투여한 지 5분후, 꼬리 정맥으로부터 글루코오스 0.5g/kg 부하를 실시하는 것에 의해 조사하였다. GLP-1 유도체 8S26Q34N-GLP-1은 농도의존적 혈당저하가 나타났으며, 그 작용은 천연형 GLP-1 보다 강하였다(표6).

8S26Q34N-GLP-1 유도체의 마우스 혈당저하 작용

투여량(㎍/kg)	글루코오스 부하 20분후에 Δ혈당치 (mg/dl)
투여량(㎍/kg)	천연형 GLP-1	8S26Q34N-GLP-1
0	123
5	119	110
10	103	95
20	75	21

시험예의 결과는 참고제조예 1의 GLP-1 유도체가 GLP-1 활성을 유지하고 있는 것을 나타내는 것이다. 표 1의 시험 결과를 합쳐서 생각하면, 이 GLP-1 유도체의 C 말단측에 수개의 아르기닌 및/또는 리신을 부가하여도 역시 GLP-1 활성을 유지하고 있는 것으로 결론지을 수 있다.

시험예 5 GLP-1 유도체 8S-GLP-1의 디펩티딜펩티다제 IV (DPPIV)에 대한 내성의 평가

500 pM GLP-1 유도체 8S-GLP-1을 40 μU/μl 디펩티딜페티다제 IV와 혼합하고, 37℃에서 60분간 반응시켰다. 그후 2배량의 에탄올로 추출하고, 원심 증발기에 의해 건조 고화시켰다. 수득한 건조 고형물을 1% BSA 함유 증류수에 용해시키고, 시험예 1에 따라 사이클릭 AMP 생산활성을 측정하여 잔존활성(%)을 산출하였다.

이 결과, 디펩티딜펩티다제 IV 에 의한 처리가 없으면 처리한 대로 활성에 차이가 없고, 본 GLP-1 유도체가 디펩티딜펩티다제 IV에 대하여 내성인 것을 알 수 있었다. 따라서 8 위치를 세린으로 치환하는 것에 의해 GLP-1 유도체는 디펩티딜펩티다제 IV 내성을 획득할 수 있다(표 7).

펩티드	잔존활성(%)
	DPPIV
	-	+
8S-GLP-1	100%	101%
천연형 GLP-1	100%	25%

시험예 GLP-1 유도체 26Q34N-GLP-1의 트립신에 대한 내성의 평가

참고제조예 2의 GLP-1 유도체 26Q34N-GLP-1을 50mM 탄산수소 암모늄 pH 7.8에 500 ㎍/ml의 농도로 되도록 용해시켰다. 이 용액 100 μl에 500㎍/ml 트립신 용액 (Promega Cat.No. V5113)을 5μl 가하고, 37℃, 1시간 반응시켰다. 반응 정지는 71.5% 에탄올을 1200 μl(final 65%)를 부가하여 실시하며 4℃에서 5분간 15,000 rpm 원심에 의해 상청을 회수하고, 잔존활성(%)을 구하였다.

이 결과, 트립신 처리가 없으면 처리그대로에서 활성에 차이가 없고, 본 GLP-1 유도체가 트립신에 내성인 것을 알았다(표 8).

펩티드	잔존활성(%)
	트립신
	-	+
26Q34N-GLP-1	100%	94.8%

이 결과는 GLP-1 유도체의 26위치를 글루타민으로, 34위치를 아스파라긴으로 치환하는 것에 의해 GLP-1 유도체가 트립신 내성을 획득하는 것을 나타낸다. 이것에 의해 이 GLP-1 유도체의 C 말단측에 수개의 아르기닌 및/또는 리신을 부가한 GLP-1 유도체도 역시 트립신 내성을 갖는 것으로 결론지을 수 있다.

GLP-1은 현재 피하주사로 임상개발이 진행되고 있다. 이 원인으로는 GLP-1이 펩티드이고, 경구투여로는 흡수되지 않는 점을 들 수 있다. 본 발명품은 이 점을 개선하고 주사 이외의 투여를 가능하게 한다. GLP-1을 사용한 당뇨병 치료는 장기간에 걸친 것이 예상되며, 환자에 의해 반복 주사로 부터 해방되는 이점은 크다.

SEQUENCE LISTING <110> SANWA KAGAKU KENKYUSHO CO.,LTD. <120> GLP-1 derivatives and the use <130> JP0304SKK <150> JP 2002-299283 <151> 2002-10-11 <160> 25 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GLP1(7-35) <400> 1 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly 20 25 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GLP1(7-36) <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-GLP1 <400> 3 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 4 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GLP1+1R <400> 4 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Arg 20 25 30 <210> 5 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> GLP1+2R <400> 5 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Arg Arg 20 25 30 <210> 6 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-GLP1+2R <400> 6 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Arg Arg 20 25 30 <210> 7 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-GLP1+3R <400> 7 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Arg Arg 20 25 30 Arg <210> 8 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-GLP1-4R <400> 8 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg <210> 9 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-GLP1+5R <400> 9 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg 35 <210> 10 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-GLP1+6R <400> 10 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg 35 <210> 11 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-GLP1-8R <400> 11 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg Arg Arg 35 <210> 12 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-des36R-GLP1+1KR <400> 12 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Lys Arg 20 25 30 <210> 13 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-des36R-GLP1+2KR <400> 13 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Lys Lys Arg 20 25 30 <210> 14 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-des36R-GLP1+3KR <400> 14 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Lys Lys Lys 20 25 30 Arg <210> 15 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-des36R-GLP1+5KR <400> 15 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Arg 35 <210> 16 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-des36R-GLP1+7KR <400> 16 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys Lys Arg 35 <210> 17 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-des36R-GLP1+10KR <400> 17 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg 35 40 <210> 18 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-GLP1+2K <400> 18 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Lys Lys 20 25 30 <210> 19 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S26Q34N-GLP1 <400> 19 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Arg 20 25 30 <210> 20 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 26Q34N-GLP1 <400> 20 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Arg 20 25 30 <210> 21 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S26Q34N-GLP1+4R <400> 21 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg <210> 22 <211> 36 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S26Q34N-GLP1-6R <400> 22 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg Arg Arg 35 <210> 23 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S26Q34N-des36R-GLP1-5KR <400> 23 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Lys Lys Lys 20 25 30 Lys Lys Arg 35 <210> 24 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-GLP1-4R <400> 24 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Arg <210> 25 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 8S-GLP1+3RHse <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> Xaa is Homoserine. <400> 25 His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Arg Arg 20 25 30 Arg Xaa 1/18

Claims

GLP-1(7-35)의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 몇개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된 서열로 되며, 또 GLP-1 활성을 갖는 펩티드의 C 말단에 Waa-(Xaa)n-Yaa (식중, Waa는 Arg 또는 Lys이고, Xaa는 Arg 또는 Lys이며, n은 0~14의 정수이고, Yaa는 Arg, Arg-NH₂, Lys, Lys-NH₂ 또는 Hse임)가 부가된 펩티드.
제 1항에 있어서, GLP-1 아미노산 서열의 8 위치가 Ser으로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항에 있어서, GLP-1 아미노산 서열의 26 위치가 Gln으로, 34 위치가 Asn으로 치환되어 있는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항에 있어서, n이 1~9의 정수인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항에 있어서, n이 3~5의 정수인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제 1항에 있어서, 일반식 [Ser⁸, Gln²⁶, Asn³⁴]-GLP-1(7-35)-(Arg)n-Yaa (식중, n은 4~6의 정수이고, Yaa는 Arg 또는 Arg-NH₂임)으로 표시되는 펩티드.
제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 천연형 GLP-1 보다도 높은 점막 흡수율을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제1항 내지 제3항중 어느 하나에 기재된 펩티드를 유효성분으로 하는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
제 8항에 있어서, 표면전하를 마이너스로 조정한 지방유제를 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 경점막 투여, 특히 경비투여에서 사용되는 것을 특징으로 하는 의약조성물.
제 8항 또는 제 9항에 있어서, 인슐린 비의존성 만성 당뇨병의 치료, 인슐린 의존성 만성 당뇨병의 치료, 비만의 치료 및/또는 식욕억제를 위한 의약조성물.