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KR20050010054A - 단클론 항체 hPAM4 - Google Patents

단클론 항체 hPAM4 Download PDF

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KR20050010054A
KR20050010054A KR10-2004-7020362A KR20047020362A KR20050010054A KR 20050010054 A KR20050010054 A KR 20050010054A KR 20047020362 A KR20047020362 A KR 20047020362A KR 20050010054 A KR20050010054 A KR 20050010054A
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South Korea
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antibody
fragment
pam4
diagnostic
antibodies
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KR10-2004-7020362A
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KR101143035B1 (ko
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골든베르그데이비드엠.
한센한스
큐젱싱
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이뮤노메딕스, 인코오포레이티드
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Publication date
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Abstract

본 발명은 일가 및 다가, 단일특이성 항체 및 다가, 다중특이성 항체에 관한 것이다. 이들 항체의 한 실시예는 하나 이상의 동일한 결합 부위를 가지며, 각 결합 부위는 표적 항원 또는 표적 항원 상의 에피토프에 결합한다. 이들 항체의 다른 실시예는 둘 이상의 결합 부위를 가지며, 이들 결합 부위는 표적 항원 상의 다른 에피토프 또는 다른 표적 항원에 대한 친화도를 가지거나, 또는 표적 항원 및 합텐에 대한 친화도를 갖는다. 본 발명은 숙주에서 이러한 기능성 항체의 발현에 유용한 재조합 벡터에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 PAM4로 명시된 종양-결합 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간화 및 인간 PAM4 항체, 및 진단 및 치료에서 그러한 항체의 사용에 관한 것이다.

Description

단클론 항체 hPAM4{Monoclonal antibody hPAM4}
췌장은 신체가 글루코스를 에너지로 바꾸는 것을 돕기 위해 인슐린을 생산하고, 음식의 소화를 돕기 위해 효소를 생산한다. 췌장암은 주로 췌장관의 세포에서 발생하는 췌장의 악성 증식이다. 이 질병은 9번째로 가장 일반적인 형태의 암이면서, 남성과 여성에게 각각 4번째 및 5번째의 사망원인이 되는 질병이다. 췌장암은거의 항상 치명적이며, 3% 미만은 5년 이내의 생존률을 갖는다.
췌장암의 가장 일반적인 징후는 황달, 복통, 체중감소 등과 같이 다른 요인들에 의해서도 발생하는 비특이적인 것들을 포함한다. 그래서, 종양 성장 초기에 췌장암의 진단은 쉽지 않고, 상당한 의심 및 종종 예비 수술 등을 포함하는 광범위한 진단 작업이 요구된다. 내시경 초음파 검사법 및 컴퓨터 단층 촬영은 오늘날 췌장암의 진단에 있어서 가장 비침해적인 유용한 방법이다. 그러나, 초점성 췌장염으로부터의 췌장암의 분화 뿐 아니라, 작은 종양의 확실한 검출은 쉽지 않은 일이다. 운이 없게도, 많은 환자들은 현재 종양이 이미 낭(capsule)의 외부로 확장되어 주위의 기관으로 침투되고, 광범위하게 전이된 때인 후기에 진단이 이루어지고 있다. Gold et al., Crit. Rev. Oncology/Hematology, 39:147-54(2001). 이 질병의 늦은 검출은 일반적이며, "초기" 췌장암 진단은 임상적인 셋팅에서는 흔치 않다.
췌장암에 대해 유용한 최근의 치료 과정은 완쾌를 시키지 못할 뿐더러 생존시간을 상당히 증가시키지도 못하고 있다. 수술적인 절제는 단지 생존의 기회를 제공하는 형식적인 처리일 뿐이었다. 그러나, 큰 종양의 부담때문에 10%에서 25%의 환자만이 "치료상의 절제"에 대상이 되고 있다. 수술 치료를 받은 환자들에 대해서도 5년의 생존률은 약 10%로 여전히 많지 않은 숫자이다.
질병의 적당한 단계 뿐 아니라, 췌장암의 초기 검출 및 진단은 증가된 생존 이점들을 제공할 것이다. 많은 실험실에서는 종양-결합 마커를 혈류로 방출시키고, 생체 조직편 검체 내에서 마커 물질을 검출하는 것에 의거한 진단 방법의 개발을 진행하고 있다. 췌장암에 대한 최고의 종양-결합 마커는 CA19.9에 대한 면역분석이었다. 이러한 sialylated Lea에피토프 구조의 상승된 수준은 70%의 췌장암 환자에게서 발견되었으나, 실험된 초점성 췌장염 검체에서는 발견되지 않았다. 그러나, CA19.9 수준은 많은 수의 다른 악성 및 양성 조건에서 증가되는 것으로 나타났으며, 따라서 현재로서는 이러한 분석을 진단에 사용할 수 없다. 하지만, 이 분석은 약한 예후를 나타내는 수술 후에 CA19.9 혈청 수준의 계속적인 증가를 모니터링 하는데는 유용하다. 많은 다른 단클론 항체(MAbs)들은 다양한 발전 단계에서의 진단을 위한 면역 분석법과 함께 보고되어 왔다. 이들은 DUPAN2, SPANI, B72.3, Ia3, 및 다양한 항-CEA 항체를 포함하지만 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
사람 유래의 항체, 특히 MAbs 및 제조된 항체 또는 항체 단편은 광범위하게 실험되고, 암, 자가면역질환, 감염성 질병, 염증성 질병, 및 심장혈관질병을 포함하는 다른 다양한 인간 질병 뿐 아니라, 췌장암의 검출 및 치료의 결과를 보여왔다[Filpula 및 McGuire, Exp. Opin, Ther. Patents(1999)9:231-245]. 항체 또는 항체-유래 약제의 임상적인 용도는 일차적으로 그것이 특정한 질환에 연계된 특이적인 표적화 항원에 결합하는 능력에 의존한다. 선택성(selectivity)은 인간 질환의 검출 및 치료 단계 동안에 동위원소, 약물, 독소, 사이토카인, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 효소 저해제, 올리고뉴클레오타이드, 성장 인자, 방사성 핵종, 신생혈관 생성 저해제, 또는 금속류 등의 진단제 또는 치료제를, 특히 진단제 또는 치료제가 신체 내의 일반 조직에 독성을 가지는 경우에, 표적 위치에 전달하는데 유용하다. 방사능 표지화된 항체는 난소암, 결장암 및 림프종을 포함하는 방대한 악성 종양에서 성공적으로 사용되어 왔다. 이러한 기술 역시 췌장암에 대하여 유용한 것임을 증명하고 있다. 그러나, 항-CEA 항체 및 B72.3의 적용을 제외하면, 임상적인 정보는 거의 존재하지 않는다.
그러한 항체 시스템의 잠재적인 한계는 Goldenberg, The American Journal of Medicine, 94:298-299(1993)에서 토론되어 진다. 검출 및 치료 기술에서의 중요한 파라미터는 표적 세포가 존재하는 위치에서 특이적으로 집중되는 주입 약물의 양 및 섭취 비율, 즉 주위의 일반 조직에 존재하는 방사능 활성에 특이적으로 결합하는 항체의 농도이다. 항체가 혈류로 주입될 때, 그것이 대사되고 배설되면서 많은 수의 구획을 통과하게 된다. 항체는 신체의 나머지를 통과하는 동안에 표적 세포에 위치하고 결합할 수 있어야만 한다. 항원 표적화를 조절하는 인자는 위치, 크기, 항원 밀도, 항원 접근성, 병리학적 조직의 세포 조성 및 표적화된 항체의 약물 동력학을 포함한다. 항체에 의한 특이적으로 항원 표적화에 영향을 미치는 다른 인자는 종양 및 다른 조직 모두에서의 표적 항원의 발현, 및 방사능 표지화된 항체의 느린 혈액 청정작용에 의한 골수 독성을 포함한다. 표적화된 종양 세포에 부착되는 표적화 항체의 양은 종양내부압력 뿐 아니라, 혈관 발달 및 항체의 종양으로의 침투에 대한 장애물에 의해 영향을 받는다. 간, 신장 또는 골수과 같은 비-표적화 기관에 의한 비-특이적 섭취는, 특히 골수의 방사능 노출이 종종 약물-제한 독성을 유발하는 방사능면역치료법과 같은 기술의 또 다른 잠재적 한계이다.
직접 표적화로 언급되는, 표적 위치에 약물을 전달하는 하나의 제시안은 진단용 또는 치료용 방사능동위원소를 운반하는 항체가 특이적인 학원을 표적화하도록 만드는 것이다. 종양이 있는 상황에서, 직접 표적화 접근법은 항원을 통해 표적 종양을 인식하는, 방사능 표지화된 항-종양 단일특이성 항체를 사용한다. 이 기술은 표지화된 단일특이성 항체를 환자에게 투여하는 것 및 진단 및 치료에 대한 이익을 얻기 위해 표적 종양에 항체를 위치시키는 것을 포함한다. 결합하지 않은 항체는 체내에서 제거된다. 이러한 접근법은 다른 포유류의 질환을 진단하고 치료하는데에도 사용될 수 있다.
"친화도 상승 시스템"(Affinity Enhancement System; AES)로 언급되는, 또 다른 제시안은 특히 진단 또는 치료적인 방사능동위원소을 운반하는 항체에 의해 표적화된 종양의 부족을 극복하도록 고안되었다{US-5,256,395(1993), Barbet et al., Cancer Biotheraphy & Radiopharmaceuticals 14:153-166(1999)}. AES는 방사능 표지화된 이가의 합텐, 및 표적 종양 및 방사능 합텐을 모두 인식하는 항-종양/항-합텐 이중특이성 항체를 사용한다. 높은 원자가를 갖는 합텐 및 높은 특이성을 갖는 항체가 이 과정에 사용될 것이다. 이 기술은 항체를 환자에게 투여하는 것 및 항체를 표적 종양에 위치시키는 것을 포함한다. 적당한 시간이 지난 뒤에, 결합하지 않은 항체는 혈액 내에서 제거되고, 방사능 합텐이 투여된다. 합텐은 진단 또는 치료적인 이익을 얻기 위하여 표적 세포의 위치에서 항체-항원 복합체에 결합하게 되고, 반면 결합하지 않은 합텐은 체내에서 급속하게 제거된다. 바벳(Barbet)은 항체가 종양 표면에 결합했을 때, 이가의 합텐이 이중 특이적인 항체와 교차결합할 수 있는 가능성을 언급한다. 결과적으로, 방사능 표지화된 복합체는 더욱 안정화되고 오랜 시간동안 종양에 머무른다. 이 시스템은 포유류의 질환을 진단하거나 치료하는데 사용될 수 있다.
당 분야에서는 직접 표적화 시스템에 유용한 다가, 단일 특이성 항체의 생산 및 친화도 상승 시스템에 유용한 다가, 다중특이성의 항체의 생산이 필요한 상태이다. 구체적으로, 췌장암에 대하여 유용한 진단 도구로서의 역할을 수행할, 그리고 표적 항원에서의 상승된 섭취, 혈액에서의 감소된 농도, 및 일반 조직 및 세포에서 독성 약물로부터의 최적의 보호를 나타내는 항체가 필요하다.
본 발명은 일가 및 다가의 단일특이성 항체 및 다가의 다중특이성 항체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 PAM4라고 명명된 MUCI 항원에 특이적인 항체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 인간화 및 인간 PAM4 항체 및 이들의 단편, 및 진단 및 치료에서 이들 항체 및 단편의 사용에 관한 것이다.
한 실시예에서, 본 발명에 의한 항체는 하나 이상의 동일한 결합 부위를 가지며, 각각의 결합 부위는 표적 항원 또는 표적 항원상의 에피토프에 대한 친화도를 가진다. 다른 실시예에서, 본 발명에 의한 항체는 표적 항원상의 같거나 다른 에피토프 또는 같거나 다른 표적 항원에 대한 친화도를 갖는 하나 이상의 결합 부위를 가지고 있으며, 적어도 하나의 결합 부위는 표적 항원에 대한 친화도를 갖고, 적어도 하나의 결합 부위는 합텐에 대한 친화도를 갖는다. 본 발명은 또한 숙주 내에서 본 명세서에 기재된 항체를 발현하는데 유용한 재조합 벡터에 관한 것이다.
도 1은 클로닝된 V 유전자 및 마우스 PAM4의 유도된 아미노산 서열을 나타낸다. 도 1A는 PAM4VK의 DNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 도 1B는 PAM4VH의 DNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 대응하는 DNA 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열 한개-문자 코드 아래로 주어진다. 뉴클레오타이드 서열의 넘버링은 오른쪽에 있다. CDR 영역에서의 아미노산 잔기는 굵은체와 밑줄로 표시하였다. 카밧(Kabat) Ig 분자 넘버링은 아미노산 잔기 위의 넘버링에 의해 보여지는 것과 같이 아미노산 잔기에 대하여 사용된다. 문자에 의해 넘버링된 아미노산 잔기는 카밧의 넘버링 도표에 의해 정의된 삽입 잔기이다. 삽입 잔기는 앞의 잔기에서와 같은 진행 숫자를 갖는다. 예를 들어, 도 1B에서의 잔기 82, 82A, 82B, 및 82C는 82, A, B, 및 C로 각각 명시된다.
도 2는 Sp2/0 세포에서 발현되는 키메라 PAM4cPAM4 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 2A는 cPAM4VK의 아미노선 서열을 나타낸다. 도 2B는 cPAM4VH의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열은 하나의 문자 코드로 주어진다. CDR 영역에서의 아미노산 잔기는 굵은체와 밑줄로 표시하였다. 아미노산의 넘버링은 도 1에서와 같다.
도 3은 인간 항체, PAM4 및 hPAM4의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. 도 3A는 PAM4 및 hPAM4와 함께 인간 항체 워커(Walker)의 VK 아미노산 서열의 배열을 나타내며, 도 3B는 PAM4 및 hPAM4와 함께 인간 항체 Wil2(FR1-3) 및 NEWM(FR4)의 VH 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. PAM4의 잔기를 나타내는 점은 인간 항체의 대응 잔기와 동일하다. 박스로 된 영역은 CDR 영역을 나타낸다. hPAM4의 N-말단 및 C-말단 잔기(밑줄)는 사용된 단계 벡터에 의해 고정된다. 카밧 Ig 분자 숫자 표는 도 1에서와 같이 잔기의 넘버링에 사용된다.
도 4는 Sp2/0 세포에서 발현되는 인간화 PAM4(hPAM4) 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 DNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 도 4A는 hPAM4VK의 DNA 및 아미노산 서열을 나타내며, 도 4B는 hPAM4VH의 DNA 및 아미노산 서열을 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열의 넘버링은 오른쪽에 있다. 대응하는 DNA 서열에 의해 코딩된 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열 한개-문자 코드 아래로 주어진다. CDR 영역에서의 아미노산 잔기는 굵은체와 밑줄로 표시하였다. 카밧 Ig 분자 숫자 표는 도 1A 및 도 1B에서처럼 아미노산 잔기에 사용되었다.
도 5는 키메라 PAM4, cPAM4와 비교하여, 인간화 PAM4 항체, hPAM4의 결합 활성을 나타낸다. hPAM4는 다이아몬드에 의해 표시되고, cPAM4는 폐원형에 의해 표시된다. 결과는 CaPan1 Ag에 결합하는 125I-cPAM4를 비교하였을 때, hPAM4 항체 및 cPAM4의 비교되는 결합활성을 나타낸다. 키메라 항체는, 인간 항체의 CDR로부터 얻어진 불변 영역과 달리 하나의 종으로부터 얻어진 항체의 CDR을 포함하는 가변 영역을 가지는 재조합 단백질이다.
본 발명에서 의도한 것은 MUC1의 아미노 말단과 반복 도메인의 시작점 사이에 위치한 영역에 결합하는 항체, 융합 단백질, 및 이들의 단편이다. 바람직한 실시예에서, 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 단편은 PAM4 항체이다. 본 발명에서 PAM4 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 단편은 면역 및/또는 뮤신으로의 선별에 의해 얻어지며, 바람직하게는 췌장암의 뮤신에 대해 반응성을 갖는다. 따라서, 본 발명에서 PAM4 항체, 융합 단백질, 및 이들의 단편은 바람직하게 췌장암 세포와 결합된 항원에 결합한다.
바람직한 실시예에서, PAM4 항체 또는 이들의 단편은 인간화된 것 또는 완전한 인간유래이거나, 또는 PAM4 융합 단백질이 인간화 또는 완전한 인간유래의 PAM4 항체 또는 이들의 단편을 포함한다. 또한, 바람직하게, PAM4 항체, 융합 단백질, 및 이들의 단편은 적어도 하나의 치료제 및/또는 진단제에 접합될 수 있다.
본 명세서 내에서 주의깊게 봐야할 것은 마우스 PAM4 MAb의 상보성-결정 영역(CDRs) 및 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 프레임워크(framework, FR) 영역, 및 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 불변 영역이며, 여기서 인간화 PAM4 MAb의 경쇄 가변 영역의 CDRs는 SASSSVSSSYLY의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; STSNLAS의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 HQWNRYPYT의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하며; 인간화 PAM4 MAb의 중쇄 가변 영역의 CDRs는 SYVLH의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; YINPYNDGTQYNEKFKG의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; GFGGSYGFAY의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 인간화 PAM4 항체 또는 그의 단편의 경쇄 및 중쇄 가변영역의 FRs는 대응하는 마우스 PAM4 MAb의 FRs로부터 대체된 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 더욱 바람직하게, 인간화 PAM4 항체 또는 그의 단편은 도 1B의 마우스 중쇄 가변영역, PAM4 VH 아미노산 서열 중 아미노산 잔기 5, 27, 30, 38, 48, 66, 67, 및 69로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 또한, 바람직하게, 상기 마우스 MAb로부터의 상기 아미노산을 갖는 인간화 PAM4 항체 또는 그의 단편은 도 1A의 마우스 경쇄 가변 영역, PAM4 VK서열 중 아미노산 잔기 21, 47, 59, 60, 85, 87, 및 100으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 아미노산을 포함한다. 가장 바람직하게, 인간화 PAM4 항체 또는 그의 단편은 도 1A의 PAM4 VK뉴클레오타이드 서열 및 도 1B의 PAM4VH뉴클레오타이드 서열 및/또는 도 4A의 hPAM4 VH아미노산 서열 및 도 4B의 hPAM4 VK아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예는 본 발명에 의한 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 단편 중 어느 하나에 의한 항체 또는 그의 단편을 포함하는 항체 성분을 가지는 암세포 표적화 진단 면역접합(immunoconjugate)이며, 여기서 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 단편은 적어도 하나의 진단/검출제에 결합한다.
바람직하게, 진단/검출제는 방사성핵종, 조영제(contrast agent), 및 광활성 진단/검출제로 구성된 군으로부터 선택된다. 더욱 바람직하게, 진단/검출제는 20 및 4,000keV 사이의 에너지를 가진 방사성핵종이거나110In,111In,177Lu,18F,52Fe,62Cu,64Cu,67Cu,67Ga,68Ga,86Y,90Y,89Zr,94mTc,94Tc,99mTc,120I,123I,124I,125I,131I,154-158Gd,32P,11C,13N,15O,186Re,188Re,51Mn,52mMn,55Co,72As,75Br,76Br,82mRb,83Sr 또는 다른 감마-, 베타- 또는 양전자-이미터(positron-emitters)로 구성된 군으로부터 선택된 방사성 핵종이다. 또한, 바람직하게, 진단/검출제는 크롬(Ⅲ), 망간(Ⅱ), 철(Ⅲ), 코발트(Ⅱ), 니켈(Ⅱ), 구리(Ⅱ), 네오디뮴(Ⅲ), 사마륨(Ⅲ), 이테르븀(Ⅲ), 가돌리늄(Ⅲ), 바나듐(Ⅱ), 테르븀(Ⅲ), 디스프로슘(Ⅲ), 홀뮴Ⅲ) 및 에르븀(Ⅲ)을 포함하는 금속; 또는 바륨, 디아트리조에이트(diatrizoate), 에티오다이즈드 오일(ethiodized oil), 갈륨 시트레이트(gallium citrate), 아이오카믹 엑시드(iocarmic acid), 아이오세타믹 엑시드(iocetamic acid), 아이오다마이드(iodamide), 아이오디파마이드(iodipamide), 아이오독사믹 엑시드(iodozamic acid), 아이오굴라마이드(iogulamide), 아이오헥솔(iohexol), 아이오파미돌(iopamidol), 아이오파노익 엑시드(iopanoic acid), 아이오프로세믹 엑시드(ioprocemic acid), 아이오세파믹 엑시드(iosefamic acid), 아이오세릭 엑시드(ioseric acid), 아이오술라마이드 메글루민(iosulamide meglumine), 아이오세네틱 엑시드(iosernetic acid), 아이오타술(iotasul), 아이오테트릭 엑시드(iotetric acid), 아이오탈라믹 산(iothalamic acid), 아이오트록식 엑시드(iotroxic acid), 아이옥사글릭 엑시드(ioxaglic acid), 아이옥소트리조익 엑시드(ioxotrizoic acid), 이포데이트(ipodate), 메글루민(meglumine), 메트리자마이드(metrizamide), 메트리조에이트(metrizoate), 프로필아이오돈(propyliodone), 및 탈러스 클로라이드(thallous chloride)를 포함하는 방사능 비투과성 금속과 같은 파라마그네틱 이온이다.
또한 바람직하게, 진단/검출제는 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리트린(phycoerytherin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(alliphycocyanin), o-프탈알데하이드(o-phthaldehyde) 및 플르오레스카민(fluorescamine)으로 구성된 군으로부터 선택된 형광 표지화 화합물; 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 방향 아크리디늄 에스테르(aromatic acridinium ester), 이미다졸(imidazole), 아크리디늄 염(salt) 및 옥살레이트 에스테르(oxalate ester)로 구성된 군으로부터 선택된 화학발광 표지화 화합물; 또는 루시페린(luciferin), 루시페라제(luciferase) 및 애쿼린(aequorin)으로 구성된 군으로부터 선택된 생물발광 화합물이다.
본 발명의 다른 실시예는 본 발명의 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 단편 중 어느 한가지를 포함하는 항체 성분을 가지는 암세포 표적화 치료 면역컨쥬게이트(immunoconjugate)이며, 상기 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 단편은 적어도 하나의 칠제왕 결합한다.
바람직하게, 치료제는 방사성핵종, 면역조절제, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오타이드, 효소 저해제, 광활성 치료제, 세포독성제, 혈관생성 저해제, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 실시예에서, bcl-2 발현을 저해하는 안티센스 분자와 같은 올리고뉴클레오타이드가 미국특허 U.S. 5,734,033(Reed)에 기재되어 있는데, 이것은 참조 부분에 포함되어 있으며, 면역컨쥬게이트의 치료제 부분 또는 본 발명의 항체 융합 단백질을 형성하거나 여기에 접합될 것이다. 그렇지 않으면, 올리고뉴클레오타이드는 노출되거나 접합된 PAM4 항체 또는 본 발명의 항체 단편과 동시에 혹은 순차적으로 투입될 것이다. 바람직한 실시예에서, 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게 bcl-2와 같은 B-세포 악성 종양의 암유전자 또는 암유전자 생성물에 작용하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
바람직한 실시예에서, 치료제는 약물 또는 독소와 같은 세포독성제이다. 또한 바람직하게, 약물은 니크로겐 머스타드(nitrogen mustard), 에틸레니민 유도체(ethylenimine derivative), 알킬 술포네이트, 니트로소우리아스(nitrosoureas), 겜시타빈(gemcitabine), 트리아진(triazene), 폴릭 엑시드(folic acid) 유사체, 안트라사이클린(anthracycline), 텍산(texane), COX-2 저해제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항생제, 효소, 효소저해제, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxin), 플레티넘 조정 복합체(platinum coordination complex), 빈카 알카로이드(vincaalkaloid), 치환 요소(subtituted urea), 메틸 하이드라진 유도체, 아드레노코르티컬 반응억제제, 호르몬 길항제, 엔도스타틴(endostatin), 탁솔, 캄프토테신(camptothecin), SN-38, 독소루비신 및 그의 유사체, 항대사제, 알킬레이트제, 항세포분열제, 항혈관생성제, 아폽토시스제, 항암제(methotrexate), CPT-11, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다.
다른 실시예에서, 치료제는 올리고뉴클레오타이드이다. 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 bcl-2 및 p53과 같은 암유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오타이드와 같은 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 될 수 있다.
다른 바람직한 실시예에서, 치료제는 리신, 아브린, 알파 독소, 사포린, 리보뉴클레이즈(RNase), 디엔에이즈 Ⅰ(DNase Ⅰ), 스타필로코컬 엔테로독신-A(staphylococcal enterotoxin-A), 포케위드(pokeweed) 항바이러스 단백질, 겔로닌(gelonin), 디프테린 독소, 슈도모나스 외독소 및 슈도모나스 내독소, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되며, 면역조절제는 사이토카인, 줄기세포 성장인자, 림포톡신(lymphotoxin), 조혈인자, 콜로니 자극 인자(colony stimulating factor; CSF), 인터페론(IFN), 에리트로포이에틴(erythropoietin), 트롬보프로테인 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되고, 방사성핵종은32P,33P,47Sc,64Cu,67Ga,86Y,90Y,111Ag,111In,125I,131I,142Pr,153Sm,161Tb,166Dy, 166Ho,177Lu,186Re,188Re,189Re,212Pb,212Bi,213Bi,211At,223Ra 및225Ac, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되며, 광활성 치료제는 색원체(chromogen) 및 염료(dye)를포함하는 그룹으로부터 선택된다.
더욱 바람직하게, 치료제는 말레이트 디하이드로게나제(malate dehydrogenase), 스타필로코컬 뉴클레아제(staphylococcal nuclease), 델타-V-스테로이드 아이소머레이즈(delta-V-steroid isomerase), 효모 알콜 디하이드로게나제, α-글리세로포스페이트 디하이드로게나제, 트리오스 포스페이트 아이소머레이즈, 호스래디쉬 페록시다제, 알칼라인 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코즈 옥시다제, β-갈락토시다제, 리보뉴클레이즈, 요소, 카탈라아제, 글루코즈-6-포스페이트 디하이드로게나제, 글루코아밀레이즈 및 아세틸콜린에스테라제로 구성된 군으로부터 선택된 효소이다.
본 명세서에서 설명하는 것은 PAM4 표적 항원에 대한 친화도를 갖는 하나이상의 항원 결합 부위 및 합텐 분자에 친화도를 갖는 하나 이상의 합텐 결합 부위를 포함하는 다가, 다중특이성 항체 또는 이들의 단편이다. 바람직하게, 항체 또는 그의 단편은 인간화 또는 완전한 인간유래의 것 또는 그들의 단편이다. 또한 바람직하게 다가, 다중특이성 항체 또는 그의 단편은 진단/검출 및/또는 치료제를 더 포함한다.
또한 본 명세서에서 설명하는 것은 PAM4에 대한 친화도를 갖는 적어도 하나의 결합 부위 및 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택된 표적화 가능한 구조체/컨쥬게이트에 대하여 친화도를 갖는 적어도 하나의 결합 부위를 포함하는 이중 특이성 항체 또는 그의 단편이며, 적어도 하나의 진단 및/또는 치료제로서 사용될 수 있다:
DOTA-D-Asp-D-Lys(HSG)-D-Asp-D-Lys(HSG)-NH2(IMP271);
DOTA-D-Glu-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP277);
DOTA-D-Tyr-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP288);
DOTA-D-Ala-D-Lys(HSG)-D-Glu-D-Lys(HSG)-NH2(IMP0281); 및
DOTA-D-Phe-D-Lys(HSG)-D-Tyr-D-Lys(HSG)-NH2(IMP284)
본 발명에서 사용될 수 있는 다른 표적화 가능한 구조체가 2003년 6월 13일에 출원된 "D-아미노산 펩타이드"(McBride), 대리인 사건 번호 018733/1206 미국 가출원에 기재되어 있다.
본 발명의 다른 실시예는 적어도 두개의 PAM4 MAbs 또는 그의 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편이며, 상기 MAbs 또는 그의 단편은 본 발명의 항체 및 그의 단편 중 어느 한가지를 포함한다. 또한 바람직하게, 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 본 발명의 항체 또는 그의 단편 중 어느 한가지 중 PAM4 MAb 또는 그의 단편 및 본 발명의 항체 및 그의 단편의 MAb 또는 그의 단편을 제외한, 2차 MAb 또는 그의 단편을 적어도 하나씩 포함한다. 바람직하게, 2차 MAb는 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLea, 루이스(Lewis) 항원 Le(y)에 대한 항체, 및 CSAp에 대한 항체, 인슐린-형 성장 인자(IGF), 테나신, IL-6, MUC2, MUC3, MUC4, TAG-72, EGFR, CD40, 혈소판 유래 성장 인자, IL-6, 혈관생성 인자(예, VEGF), 암유전자 및 HER2/neu의 산물로 구성된 군으로부터 선택된 암종(carcinoma)-결합 항체이다. 본 발명의 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 적어도 하나의 진단제 및/또는 치료제를 더 포함한다.
또한 본 명세서에서 설명하는 것은 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택된 MAb 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 서열이다:
(a) 본 발명에 기재된 항체들 중 한가지의 PAM4 항체 또는 그의 단편;
(b) (a)에 기재된 MAb 또는 그의 단편 중 적어도 두개를 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편;
(c) 본 발명의 PAM4 항체 또는 그의 단편 중 상기 MAb 또는 그의 단편을 포함하는 적어도 하나의 1차 PAM4 항체 또는 그의 단편 및 본 발명의 항체 또는 그의 단편 중 MAb 또는 그의 단편을 제외한 적어도 하나의 2차 MAb 또는 그의 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편;
(d) 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 어느 한가지 중 상기 MAb 또는 그의 단편을 포함하는 적어도 하나의 1차 MAb 또는 그의 단편 및 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 어느 한가지 중 상기 MAb 또는 그의 단편을 포함하는 2차 MAb(암종 결합 항체) 또는 그의 단편. 바람직하게, 암종 결합 항체는 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLea, 루이스(Lewis) 항원 Le(y)에 대한 항체, 및 CSAp에 대한 항체, 인슐린-형 성장 인자(IGF), 테나신, IL-6, MUC2, MUC3, MUC4, TAG-72, EGFR, CD40, 혈소판 유래 성장 인자, IL-6, 혈관생성 인자(예, VEGF), 암유전자 및 HER2/neu의 산물로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명에서 설명하는 것은 본 발명의 항체, 융합 단백질 또는 이들의 단편 중 어느 한가지의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터 및 숙주 세포이다.
본 발명의 다른 실시예는 진단제 또는 치료제, 또는 이들의 조합을 (ⅰ) 적어도 하나의 진단/검출 및/또는 치료제에 접합된 PAM4 항체 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 제공하는 것 및 (ⅱ) 본 발명의 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 단편 중 어느 한가지의 진단 또는 치료 컨쥬게이트를 필요로 하는 대상으로 투여하는 것을 포함하여, 표적에 전달하는 방법이다. 바람직하게, 진단/검출제는 방사성핵종, 조영제, 및 광활성 진단/검출제로 구성된 군으로부터 선택되고, 치료제는 약물, 독소, 세포독성제, 사이토카인, 면역조절제, 호르몬, 호르몬 길항제, 성장인자, 방사성핵종, 금속으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또한, 본 발명에서 설명하는 것은 (a) PAM4 항원에 대한 친화도를 가지며 하나 이상의 합텐 결합 부위를 포함하는 본 발명에 의한 다가, 다중특이성 항체 또는 이들의 단편 중 어느 하나에 의한 항체 또는 그의 단편을 대상에 투여하는 것; (b) 대상의 혈액을 청소하기 위하여 많은 양의 비-항체에 대해서 충분한 시간동안 기다리는 것; 및 (c) 상기 대상에 항체의 결합 부위에 결합하는 진단/검출제, 치료제, 또는 이들의 조합을 포함하는 운송 분자를 투여하는 것을 포함하는, 진단/검출제, 치료제, 또는 그들의 조합을 표적에 전달하는 방법에 관한 것이다.
한 실시예에서, bcl-2 발현을 저해하는 안티센스 분자와 같은 올리고뉴클레오타이드가 미국특허 U.S. 5,734,033(Reed)에 기재되어 있는데, 이것은 참조 부분에 포함되어 있으며, 면역컨쥬게이트의 치료제 부분 또는 본 발명의 항체 융합 단백질을 형성하거나 여기에 접합될 것이다. 그렇지 않으면, 올리고뉴클레오타이드는 노출되거나 접합된 PAM4 항체 또는 본 발명의 항체 단편과 동시에 혹은 순차적으로 투입될 것이다. 바람직한 실시예에서, 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게 bcl-2와 같은 B-세포 악성 종양의 암유전자 또는 암유전자 생성물에 작용하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명에서 설명하는 것은 (a) (a) PAM4 항원에 친화도를 가지며 하나 이상의 합텐 결합부위를 포함하는 본 발명의 다가, 다중특이성 항체 또는 그의 단편을 필요에 따라 대상에 투여하는 것; (b) 비-결합 항체가 대상의 혈액에서 제거되는데 충분한 시간만큼 기다리는 것; (c) 항체의 결합 부위에 결합하는 진단/검출제, 치료제, 또는 이들의 조합을 포함하는 운송 분자를 상기 대상에 투여하는 것을 포함하는 암의 진단 또는 치료 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서 암은 췌장암이다. 또한 바람직하게, 상기 방법은 질병 조직의 수술중 확인, 질병 조직의 내시경 확인, 또는 질병 조직의 내혈관 확인에 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예는 (a) 본 발명의 항체, 융합 단백질 또는 이들의 단편 중 어느 한가지의 PAM4 MAb 또는 이들의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 이들의 단편을 포함하는 항체 또는 그의 단편의 치료학적으로 효과적인 양을 상기 대상에 투여하며, 상기 PAM4 MAb 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 적어도 하나의 치료제에 접합하는 것; (b) 상기 PAM4 MAb 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 제약학적으로 적합한 부형제로 제형화하는 것을 포함하는, 대상에서의 악성 종양을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 이 방법은 본 발명의 항체, 융합 단백질, 또는 그의 단편들 중 어느 것과도 다른 2차 MAb 또는 그의 단편을 더 포함한다. 더욱 바람직하게, 2차 MAb 또는 그의 단편은 노출 MAb 또는 그의 단편이다. 또한 바람직하게, 2차 MAb 또는 그의 단편은 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLea, 루이스 항원 Le(y)에 대한 항체, 및 CSAp, MUC1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, TAG-72, EGFR, CD40, 혈관생성 인자(예, VEGF), 인슐린-형 성장 인자(IGF), 테나신, 혈소판 유래 성장 인자, IL-6, 암유전자 및 HER2/neu의 산물로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
본 명세서에서 설명하는 것은 (a) 본 발명의 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편 중 어느 한가지의 PAM4 MAb 또는 그의 단편 또는 PAM4 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 포함하며, 상기 PAM4 MAb 또는 그의 단편 또는 PAM4 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 적어도 하나의 진단/검출제에 접합하는 진단학적으로 효과적인 양의 진단 컨쥬게이트를 상기 대상에 투여하는 것; 및 (b) 상기 PAM4 MAb 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 제약학적으로 적합한 부형제로 선택적으로 제형화하는 것을 포함하는, 대상에서 악성 종양을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시예는 (ⅰ) 본 발명의 노출 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 단편 중 어느 한가지의 노출 PAM4 MAb 또는 그의 단편 또는 노출 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 치료학적으로 효과적인 양의 조성물을 대상에 투여하는 것; (ⅱ) 상기 노출 PAM4 MAb 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 제약학적으로 적합한 부형제로 제형화하는 것을 포함하는, 대상에서 암 세포를 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 이 방법은 본 발명의 노출 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편이 아닌, 2차 노출 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 예를 들어, 2차 항체 또는 그의 단편은 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLea, 루이스 항원 Le(y)에 대한 항체, 및 CSAp, MUC1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, TAG-72, EGFR, CD40, 혈관생성 인자(예, VEGF), 인슐린-형 성장 인자(IGF), 테나신, 혈소판 유래 성장 인자, IL-6, 암유전자 및 HER2/neu의 산물로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.
본 발명은 또한 (ⅰ) 본 발명의 노출 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 단편 중 한가지의 노출 PAM4 MAb 또는 그의 단편 또는 노출 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 조성물을 가지고 상기 대상으로부터 얻은 검체상에 시험관 진단 분석을 수행하는 것을 포함하는 대상에서 악성 종양을 진단하는 방법에 대해 기재하고 있다.
본 발명의 다른 실시예는 (A) PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 팔(arm) 및 표적화 가능한 컨쥬게이트에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 팔을 가지며, 상기 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 하나의 팔은 hPAM4 항체 또는 그의 단편인, 이중특이성 항체 또는 항체 단편을 효과적인 양으로 투여하는 것; 및 (B) 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택된 표적화 가능한 복합체의 투여를 포함하는 대상에서 PAM4 항원을 발현하는 질환을 가진 조직을 수술적으로 확인하는 방법에 관한 것이다:
(ⅰ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
(ⅱ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
(ⅲ) Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2;
;및
또한 본 명세서에서 설명하는 것은 (A) PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 팔 및 표적화 가능한 복합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 팔을 가지며, 상기 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 하나의 팔은 hPAM4 항체 또는 그의 단편인, 이중특이성 항체 또는 항체 단편을 효과적인 양으로 투여하는 것; 및 (B) 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택된 표적화 가능한 복합체를 투여하는 것을 포함하는 대상에서 PAM4 항원을 발현하는 질병을가진 조직을 내시경으로 확인하는 방법에 관한 것이다:
(ⅰ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
(ⅱ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
(ⅲ) Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2;
;및
본 명세서에서 설명하는 것은 (A) PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 팔 및 표적화 가능한 복합체에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 팔을 가지며, 상기 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 하나의 팔은 hPAM4 항체 또는 그의 단편인, 이중특이성 항체 또는 항체 단편을 효과적인 양으로 투여하는 것; 및 (B) 하기와 같이 구성된 군으로부터 선택된 표적화 가능한 복합체를 투여하는 것을 포함하는 대상에서 PAM4 항원을 발현하는 질병을 가진 조직을 혈관내에서 확인하는 방법에 관한 것이다:
(ⅰ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
(ⅱ) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
(ⅲ) Ac-Lys(HSG)D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2;
;및
다른 실시예는 내시경, 내혈관 카테터(catheter), 또는 수술 과정 동안의 손상(lesion)을 검사하는 방법에 관한 것으로서, (a) PAM4 항원에 특이적으로 결합하는 1차 항체 결합 부위 및 합텐에 특이적으로 결합하는 2차 항체 결합 부위를 가지는 이중특이성 항체 F(ab)2또는 F(ab')2단편, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 또는 테트라바디(tetrabody)를 상기 과정을 겪는 대상에게 주입하는 것; 및 표적 부위에서 항체 단편을 부착시키는 것; (b) 이중특이성 단편이 주입 약 24시간 내에 순환으로부터 많이 제거되지 않을 경우에, 갈락토실레이트(galactosylated) 항-유전자형(idiotype) 제거제를 사용하여 비-표적화 항체 단편을 부가적으로 제거하는 것, 및 신속히 표적 부위에 위치하고 신장을 통해 제거되는 이가의 표지화 합텐을 주입하는 것; (c) 첫 번째 주입 48시간 내에 표적 부위에서 부탁된 표지의 상승 레벨에 대한 근-범위 검출법에 의해 합텐의 존재를 검출 수단으로 검출하는 것, 및 상기 검출이 조영제 또는 서브트랙션제(subtraction agent)를 사용하지 않고 수행되는, 상기 과정을 수행하는 것을 포함한다.
수술, 내혈관, 또는 내시경 과정 동안의 근-범위 손상 검출법은 (a) 효과적인 양의 hPAM4 면역컨쥬게이트 또는 그의 단편을 비경구적으로 대상에게 투입하는 것, (b) 주입 48시간 내에 과정을 수행하는 것; (c) 상기 표지화된 항체 또는 그의 단편의 존재를 확인하기 위한 검출 수단으로 근 범위에서 대상의 부착 내부를 정밀 검사하는 것, 및 (d) 항기 표지화된 항체 또는 그의 단편의 상승 레벨을 검출 수단으로 부착 부위에서 검출하는 것에 의해 상기 표지화된 항체 또는 그의 단편의 부착 부위를 결정하는 것을 포함하며, 이는 또한 본 발명에서 고려되어진다.
바람직한 실시예의 상세한 설명
개요
다른 명시가 없을 시, 단수명사는 하나 또는 그 이상을 뜻한다. 본 명세서에 기재된 "PAM4 항체"는 마우스, 인간, 및 인간화 PAM4 항체를 포함한다.
본 발명은 췌장암의 진단, 검출, 스테이징(staging), 및 치료에 유용한 단클론 항체, PAM4에 관련된 것이다. 바람직하게, 본 발명의 PAM4 항체 및 그의 단편은 인간화된 또는 완전한 인간유래의 항체이다. 마우스 PAM4(mPAM4) 항체는 면역원으로서의 이종이식편 RIP-1 인간 췌장암종으로부터 얻어진 췌장암 뮤신을 사용하여 개발된 MUC1 항체이다(Gold et al., Int. J. Cancer, 57:204-210(1994)). mPAM4 항체는 표적 췌장암 항원상의 독특하고 신규한 에피토프를 인식한다. 실시예 1에 기재된 것과 같은 면역조직화학적 염색 연구는 PAM4 MAb가 가슴에서 발현되는 MUC1 항원의 아미노 말단과 반복 도메인의 시작점 사이에 위치하는 영역, 췌장 및 다른 암 세포에 결합하며, 일반 인간 조직에는 제한된 결합을 가진다는 것을 보여준다. 본 발명의 PAM4 항체는 췌장암에 상당히 특이적이며, 따라서 췌장암 세포에 우선적으로 결합한다. 바람직한 실시예에서, PAM4 항체 및 그의 단편은 인간화된 것이다. PAM4 항체는 표적 에피토프에 반응하며, 급속하게 흡수된다. 이 에피토프는 초점성 췌장염이 아닌 췌장암에 결합된 항원에 의해 우선적으로 발현된다. 동물 모델에서 방사능표지화된 PAM4 MAb를 사용한 위치측정 및 치료 연구는 종양 표적화 및 치료학적인 효능을 입증하였다.
본 발명의 PAM4 항체는 많은 기관 및 종양 타입에 의해 생산되는 항원, MUC1의 반복 도메인의 아미노말단과 시작점 사이에 위치하는 영역인, PAM4 항원에 결합한다. 본 발명의 바람직한 PAM4 항체는 췌장암 세포에 우선적으로 결합한다. 실시예 2의 PAM4 단클론 항체와 같은 PAM4 MAb의 연구는 항체가 그것을 임상적인 진단 및 치료 적용에 대한 후보자로 만드는 몇가지 중요한 특징을 나타낸다는 것을 알려준다. PAM4 항원이 진단 및 치료에 대한 유용한 표적을 제공하기 때문에, 초기 연구에서 언급된 비-PAM4 항체(CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, aLea 및 루이스 항원)에 의해서 인식되는 에피토프와 구별되는 췌장암 항원의 에피토프를 인식하는 MAb를 획득하는 것이 바람직하다.
본 발명의 PAM4 항체와 조합 또는 결합되는데 사용되기 적합한 항체는 예를 들면, CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLea, 루이스 항원 Le(y)에 대한 항체, 또는 암태아성 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 결장-특이성 항원-p(CSAp), MUC1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, HER2/neu, EGFR, 혈관생성 인자(예, VEGF), 인슐린-형 성장 인자(IGF), 테나신, 혈소판 유래 성장 인자, IL-6, 암유전자의 산물, 및 Epstein et al.(미국 특허 6,071,491, 6,017,514, 5,019,368 및 5,882,626)과 같은 종양 괴사 물질에 대한 항체를 포함한다. 이러한 항체는 현재의 PAM4 항체 면역검출법 및 면역치료법을 보완하는데 유용할 것이다. 치료 적용에서, 종양 세포에 대한 작용체 세포 기능을 수반하는 면역조절제에 작용성 혹은 길항성을 가지는 항체는 PAM4 항체 단독의 조합 또는 다른 종양-결합 항체와의 조합에 또한 유용하게 사용될 수 있으며, 한가지 예는 CD40에 대한 항체이다(Todryk et al., J. Immunol Methods, 248:139`147(2001); Turner et al., J. Immunol, 166:89-94(2001)). 또 다른 사용은 마커 또는 암유전자의 산물에 대한 항체, 또는 VEGF와 같은 혈관 생성인자에 대한 항체이다. VEGF 항체는 Thorpe et al., 미국 특허 6,342,221, 5,965,132 및 6,004,554에 기재되어 있으며. 명세서의 참조란에 표시되어 있다.
또한, 다른 PAM4-형 항체의 유용성도 임상 샘플에서 PAM4 항원을 검출하는데 유용한 이중-결정성 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)의 개발에 필수적이다.
본 발명은 MUC1의 아미노 말단과 반복 도메인의 시작점 사이에 위치하는 영역에 결합하고 진단 및 치료법에 사용될 수 있는 인간화 및 완전한 인간 유래의 항체 및 이들의 단편에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, PAM4 항체는 인간화된 것이다. 또한 바람직하게, 본 발명의 PAM4 항체는 췌장암 세포에 우선적으로 결합한다. 비-인간 단클론 항체가 인간 숙주에서 외부 단백질로 인식될 수 있고, 반복적인 투여가 유해한 과민 반응을 초래할 수 있기 때문에, 마우스 PAM4 서열의 인간화는 환자가 겪을 수도 있는 역 면역 반응을 감소시킬 수 있다. 마우스-기반의 단클론 항체는 종종 인간 항-마우스 항체(HAMA)로 언급된다. 바람직하게, 인간화 PAM4 항체 또는 그의 단편의 프레임워크 영역에서 몇몇 인간 잔기는 마우스의 대응 부위로 대체된다. 또한, 두개의 다른 인간 항체로부터의 프렝임워크 서열의 조합이 VH에 대하여 사용되는 것이 바람직하다. 항체 분자의 불변 영역은 인간 항체로부터 얻어진다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예는 인간 PAM4 항체이다. 인간 항체는 예를 들면, 항원 투여시 반응에서 특정한 인간 항체를 생산하도록 하기 위하여 조작된이식 유전자 마우스로부터 얻어진 항체이다. 이 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌(locus)의 구성 요소는 내생 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 붕괴를 포함하는 태아 모세포주로부터 얻어지는 마우스 종으로 도입된다. 유전자 이식된 마우스는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 인간 항체-분비 하이브리도마를 생산하는데 사용될 수 있다. 유전자 이식된 마우스로부터 인간 항체를 얻는 방법은 Green et al., Nature Genet. 7:13(1994), Lonberg et al., Nature 368:856(1994), 및 Taylor et al., Int. Immun. 6:579(1994)에 기재되었다. 완전한 인간 항체는 또한 유전자 또는 염색체 트랜스펙션(transfection)법, 파지 디스플레이법(phage display technology)을 포함하여 당 분야에 알려진 모든 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역화되지 않은 도너(donor)로부터의 이뮤노글로불린 가변 영역 유전자 레퍼토리로부터, 시험관에서 인간항체 및 그의 단편을 생산하는 방법에 관한 McCafferty et al., Nature 348:552-553(1990)을 참고하라. 이 방법에서, 항체 가변 영역 유전자는 섬유형(filamentous) 박테리오파지의 메이저 또는 마이너 코트 단백질 유전자로 인-프레임 클로닝되고, 파지 입자의 표면에서 기능적인 항체 단편으로 나타난다. 섬유형 입자가 단일-가닥의 파지 게놈 DNA 복사체를 가지기 때문에, 항체의 기능적인 특징에 기반을 둔 선별은 또한 그러한 특징을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선별하는 결과를 가져온다. 이러한 방법에서, 파지는 B 세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다(예, Johnson 및 Chiswell, Current Opinion, Structural Biology 3:5564-571(1993)).
본 발명의 항체 및 그의 단편은 바람직하게 인간 췌장 종양에서 얻은 처리되지 않은 뮤신 표본에 대해 제조된다. 관련된 정맥에서, PAM4 항체는 충분히 순수한 PAM4 항원 표본을 사용하여 얻을 수 있다. 충분히 순수한 단백질은 실제로 단백질과 함께 결합된 오염된 세포 성분을 포함하지 않는 단백질이다.
정의
다음의 내용에서, 많은 용어들이 사용되고, 다음의 정의는 본 발명을 이해하는데 도움을 주기위해 제공된다.
본 명세서에 기재된 항체는 전체-길이(즉, 자연적으로 발생하거나 일반적인 이뮤노글로불린 유전자 단편 재조합 과정에 의해 형성된) 이뮤노글로불린 분자(즉, IgG 항체) 또는 면역학적으로 활성을 갖는(즉, 특이적으로 결함하는) 항체 단편과 같은 이뮤노글로불린 분자의 일부분이다.
항체 단편은 F(ab')2, F(ab)2, Fab', Fab, Fv, sFv 등과 같은 항체의 일부분이다. 구조에 관계없이, 항체 단편은 전체-길이 항체에 의해 인식되는 같은 항원에 결합한다. 예를 들어, 항-CD20 단클론 항체 단편은 CD20의 에피토프에 결합한다. 항체 단편이라는 용어는 또한 복합체를 형성하기 위하여 특이적인 항원에 결합함으로써 항체와 같이 작용하는 합성된, 또는 유전학적으로 조작된 임의의 단백질을 포함한다. 예를 들어, 항체 단편은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역; 경쇄 및 중쇄 가변 영역이 펩타이드 링커에 의해 연결된 재조합 단일 사슬 폴립펩타이드 분자(scFv 단백질) ; 및 초변이 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소한의 인식 단위로 구성된 "Fv" 단편과 같은 가변 영역으로 구성된 분리된 단편을 포함한다.
노출 항체는 일반적으로 치료제 또는 진단/검출제와 결합되지 않은 항체를 말한다. 그러나, 이것은 또한 진단/검출제 또는 치료제와 결합되지 않은 항체 단편일 수 있다. 이것은 항체 분자의 Fc 부분이 세포 용해(lysis)를 초래할 수도 있는 메카니즘을 수행하는 부가적인 고정 및 ADCC(항체 의존 세포 파괴)와 같은 작용 기능을 제공하기 때문이다. 그러나, Fc 부분은 아폽토시스와 같은 다른 메카니즘에서의 치료적인 기능을 요구하지 않는다. 노출 항체는 다클론 및 단클론 항체, 융합 단백질 및 키메라, 인간화 또는 인간 항체와 같은 어떠한 재조합 항체를 포함한다.
키메라 항체는 항체 분자의 불변 영역이 인간 항체의 CDR로부터 얻어지는 것과는 다르게, 한가지 종으로부터 얻은 항체, 바람직하게는 설치류 항체의 CDR을 포함하는 가변 영역을 가지는 재조합 단백질이다. 수의학적 적용에서, 키메라 항체의 불변 영역은 고양이나 강아지와 같은 다른 종에서 얻어질 것이다.
인간화 항체는 하나의 종으로부터 얻은 항체, 예를 들면 설치류 항체로부터의 CDR이 설치류 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 사슬로부터 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역으로 이동된 재조합 단백질이다.
인간 항체는 항원 투여에 대한 반응에서 특이적인 인간 항체를 생산하도록 하기 위해 조작된 유전자 이식 마우스로부터 얻은 항체이다. 이 기술에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자좌(locus)의 구성 요소는 내생 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 붕괴를 포함하는 태아 모세포주로부터 얻어지는 마우스 종으로 도입된다. 유전자 이식된 마우스는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 합성할 수 있고, 마우스는 인간 항체-분비 하이브리도마를 생산하는데 사용될 수 있다. 유전자 이식된 마우스로부터 인간 항체를 얻는 방법은 Green et al., Nature Genet. 7:13(1994), Lonberg et al., Nature 368:856(1994), 및 Taylor et al., Int. Immun. 6:579(1994)에 기재되었다. 완전한 인간 항체는 또한 유전자 또는 염색체 트랜스펙션(transfection)법, 파지 디스플레이법(phage display technology)을 포함하여 당 분야에 알려진 모든 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역화되지 않은 도너(donor)로부터의 이뮤노글로불린 가변 영역 유전자 레퍼토리로부터, 시험관에서 인간항체 및 그의 단편을 생산하는 방법에 관한 McCafferty et al., Nature 348:552-553(1990)을 참고하라. 이 방법에서, 항체 가변 영역 유전자는 섬유형(filamentous) 박테리오파지의 메이저 또는 마이너 코트 단백질 유전자로 인-프레임 클로닝되고, 파지 입자의 표면에서 기능적인 항체 단편으로 나타난다. 섬유형 입자가 단일-가닥의 파지 게놈 DNA 복사체를 가지기 때문에, 항체의 기능적인 특징에 기반을 둔 선별은 또한 그러한 특징을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선별하는 결과를 가져온다. 이러한 방법에서, 파지는 B 세포의 일부 특성을 모방한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다(예, Johnson 및 Chiswell, Current Opinion, Structural Biology 3:5564-571(1993)).
인간 항체는 또한 시험관에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 것이다. 참고부분에 기재된 미국 특허 5,567,610 및 5,229,275를 참고하라.
치료제는 항체 부분 또는 항체 부분에 접합된, 즉, 항체 또는 항체 단편 또는 하위단편과 별도로, 동시에 또는 순차적으로 투여되고, 질병의 치료에 유용한 분자 또는 원자이다. 치료제의 예로는 항체, 항체 단편, 약물, 독소, 뉴클리아제, 호르몬, 면역조절제, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제 또는 염료 및 방사성동위원소가 있다.
진단/검출제는 항체 부분, 즉, 항체 또는 항체 단편, 또는 하위단편에 접합되어 투여되며, 항원을 포함한 세포의 위치추적에 의해 질명을 진단하는데 유용한 분자 또는 원자이다. 유용한 진단/검출제는 방사능동위원소, 염료(바이오틴-스트렙타비딘 복합체), 조영제, 형광 화합물 또는 형광 분자 및 자기 공명 단층촬영(MRI)를 위한 상승제(enhancing agent)(예, 파라마그네틱 이온)를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 미국 특허 6,331,175는 MRI 상승제에 접합된 항체의 표본 및 MRI 기술을 기술하고 있으며, 본 명세서의 참고부분에 포함되어 있다. 바람직하게, 진단/검출제는 방사성동위원소, 자기 공명 단층촬영(MRI)를 위한 상승제, 및 형광 화합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 항체 성분을 방사능 금속 또는 파라마그네틱 이온과 함께 로딩하기 위해서는, 이온에의 결합을 위하여 다수의 킬레이트 그룹에 결합되는 긴 꼬리를 갖는 시약으로 상기 항체 성분을 반응시키는 것이 필요하다. 그러한 꼬리는 폴리리신, 폴리사카라이드, 또는 에틸린디아민테트라아세틱 엑시드(EDTA), 디에틸렌트리아민펜타아세틱 엑시드(DTPA), 포피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스-티오세미카바존, 폴리옥심(polyoxime), 및 이 목적에 유용한 것으로 알려진 유사 그룹과 같은 킬레이트 그룹에 결합할 수 있는 펜턴트(pendant) 그룹을 갖는 다른 유도된 혹은 유도가능한 사슬이 될 수 있다. 킬레이트는 표준 화학을 이용한 항체와 연결될 수 있다. 킬레이트는 일반적으로 면역반응력의 최소 손실 및 최소 응집 및/또는 내부 교차-연결을 갖는 분자와 결합의 형성할 수 있는 그룹에 의해 항체에 연결된다. 일반적이지 않은 것으로서, 킬레이트를 항체에 접합시키는 시약 및 방법이 1989년 4월 25일에 등록되고, 참고부분에 기재되어 있는 미국 특허 4,824,659, "항체 접합체", Hawthome)에 기술되어 있다. 특정하게 유용한 금속-킬레이트 조합은 방사성-이미징에 사용되는125I,131I,123I,124I,62Cu,64Cu,18F,111In,67Ga,68Ga,99mTc,94mTc,11C,13N,15O,76Br과 같은, 60에서 4,000 keV의 일반적 범위에서 진단성 방사성동위원소와 함께 사용되는 2-벤질-DTPA 및 그의 모노메틸 및 사이클로헥실 유사체를 포함한다. 망간, 철 및 가돌리늄과 같은 비-방사능 금속과 복합될 때, 동일한 킬레이트는 본 발명의 항체와 함께 사용되는 MRI에 유용하다. NOTA, DOTA, 및 TETA와 같은 마크로사이클릭 킬레이트는 다양한 금속 및 방사성 금속, 특히 갈륨, 이티륨 및 구리와 각각 함께 사용된다. 그러한 금속-킬레이트 복합체는 링의 크기를 원하는 금속에 맞춤으로써 매우 한정하게 만들 수 있다. RAIT에 대한223Ra와 같은 안정하게 결합된 핵종에 중요한 마크로사이클릭 폴리에테르와 같은 다른 링 타입의 킬레이트는 본 발명에 포함된다.
면역컨쥬게이트는 적어도 하나의 치료제 및/또는 진단/검출제에 결합된 항체, 융합 단백질, 또는 이들의 단편이다. 진단/검출제는 방사성핵종 또는비-방사성핵종, 조영제(자기공명영상법, 컴퓨터화 X선 단층촬영 또는 초음파 등)을 포함할 수 있으며, 방사성핵종은 감마-, 베타-, 알파-, 오제 전자-(Auger electron-), 또는 양전자-방출 동위원소이 될 수 있다.
발현 벡터는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 전형적으로, 유전자 발현은 구조 또는 유도 프로모터, 조직-특이적 조절 인자 및 인헨서(enhancer)를 포함하는 어떠한 조절 인자의 통제하에 있다. 그러한 유전자는 조절 인자에 "조작가능하게 연결되어 있다"고 한다.
재조합 숙주는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하고 있는 원핵세포 또는 진핵세포일 것이다. 이 용어는 또한 숙주 세포의 염색체 또는 게놈 또는 숙주세포의 세포에서 클로닝된 유전자를 포함하기 위하여 유전학적으로 조작된 유전자 이식 동물을 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 적합한 포유류 숙주세포는 항체의 발현에 유용한, SP2/0 세포 및 NS0 세포와 같은 골수종 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 하이브리도마 세포주 및 다른 포유류 숙주 세포를 포함한다. 또한 특히 mAbs 및 다른 융합 단백질의 발현에 유용한 것으로 CHO, COS, Vero, Hela, BHK 및 SP2 세포주와 같은 기존의 포유류 세포주에 비해서 2배에서 20배의 재조합 단백질을 생산하는, WO 0063403 A2에 기술된 인간 세포주, PER C6가 있다. 변형된 면역 시스템을 가진 특별한 유전자 이식 동물은 특히 완전한 인간 항체를 만드는데 유용하다.
항체 융합 단백질이라는 용어는 두 개이상의 같거나 다른 자연 항체, 같거나 다른 특이성을 가지는 단일-사슬 항체 또는 항체 단편 조각이 연결된, 재조합적으로 생산되는 항원 결합 분자를 말한다. 융합 단백질의 수가(valency)는 융합 단백질이 갖는 항원 또는 에피토프에의 결합 팔 및 결합 부위의 전체 수, 즉 1가, 2가,3가 또는 다가를 나타낸다. 항체 융합 단백질의 다가는 항원에 결합하는 다중 상호작용에 잇점이 있고, 따라서 항원에 결합하는 경향이 강해진다는 것을 의미한다. 특이성은 항체 융합 단백질이 결합할 수 있는 항원 및 에피토프가 얼마나 많은가; 즉, 단일특이성, 이중특이성, 삼중특이성, 다중특이성을 나타낸다. 이러한 정의를 사용해서, 자연 항체, 즉 IgG는 두 개의 결합 팔을 가지고 있으므로 이가이며, 그러나 하나의 항원에 결합하기 때문에 단일특이성이라 할 수 있다. 단일특이성, 다가의 융합 단백질은 예를 들어 같은 항원에 반응하는 두 개의 결합 부위를 가지는 디아바디처럼 같은 항원상의 같거나 다른 에피토프에만 결합하는 것이 아니라, 하나의 에피토프에 대한 하나 이상의 결합 부위를 가진다. 융합 단백질은 다른 항체 성분의 다가 또는 다중특이성 조합 또는 같은 항체 성분의 다중 복사체를 포함한다. 융합 단백질은 부가적으로 치료제를 포함할 것이다. 그러한 융합 단백질에 적합한 치료제의 예로는 면역조절제("항체-면역조절제 융합 단백질" 및 독소("항체-독소 융합 단백질")을 들 수 있다. 하나의 바람직한 독소는 리보뉴클레아제(RNase), 바람직하게는 재조합 RNase를 포함한다.
다중특이성 항체는 다른 구조의 적어도 두 개의 표적, 즉 두 개의 다른 항원, 같은 항원상의 두 개의 다른 에피토프, 또는 합텐 및/또는 항원 또에 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 한가지 특이성은 B-세포, T-세포, 미엘로이드-, 플라즈마-, 및 비만세포(mast cell) 항원 또는 에피토프에 대한 것일 것이다. 다른 특이성은 B-세포 상에서의 CD20, CD19, CD21, CD46, CD80, HLA-DR, CD74, 및 CD22과 같은 같은 세포 타입상에 대한 다른 항원이 될 수도 있다. 예를들면, 하나의 결합 부위가 하나의 항원 및 다른 항원에 반응하는 디아바디가 있다.
이중 특이성 항체는 다른 구조를 갖는 두 개의 표적에 동시에 결합할 수 있는 항체를 말한다. 이중특이성 항체(bsAb) 및 이중특이성 항체 단편(bsFab)는 예를 들어 B-세포, T-세포, 미엘로이드-, 플라즈마-, 및 비만세포 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 팔, 및 치료제 또는 진단/검출제를 가지는 표적화 가능한 컨쥬게이트에 특이적으로 결합하는 적어도 하나의 다른 팔을 가진다. 다양한 이중특이성 융합 단백질은 분자 조작을 이용하여 생산될 수 있다. 한가지 형태에서, 이중특이성 융합 단백질은 예를 들면 하나의 항원에 대해 하나의 결합 부위를 가지는 scFv 및 두 번째 항원에 대한 하나의 결합 부위를 가지는 Fab 단편으로 구성된 1가이다. 다른 형태에서는, 이중특이성 융합 단백질이 하나의 항원에 대한 결합부위를 가지는 IgG 및 두 번째 항원에 대한 두 개의 결합 부위를 가지는 두 개의 scFv로 구성된 2가이다.
인간화 및 인간 PAM4 항체의 제조
특이적인 항원에 대한 단클론 항체는 당 분야에 기술자에게 알려진 방법에 의해 얻어질 것이다. 예를 들어, Kohler 및 Milstein, Nature 256:495(1975), 및 Coligan et al.(eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, 2.5.1-2.6.7 페이지(John Wiley & Sons 1991)(이하 "Coligan이라 함)을 참고하라. 간략하게, PAM4 MAb는 PAM4 항원을 포함하는 조성물을 마우스에 투여하는 것, 혈청 샘플을 제거함으로써 항체 생산의 존재를 확인하는 것, B-림프구를 얻기 위해서 간을 제거하는것, 하이브리도마를 생성하기 위해서 미엘로마 세포와 B-림프구를 융합하는 것, 하이브리도마를 클로닝하는 것, PAM4 항원에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선별하는 것, PAM4 항원에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 PAM4 항체를 분리하는 것, 및 하이브리도마 배양체에서 PAM4 항체를 분리하는 것에 의해 얻어질 수 있다. 본 발명의 PAM4 항체는 MUC1의 아미노 말단과 반복 도메인 시작점 사이에 위치하는 영역인, PAM4 항원에 결합한다. 본 발명의 PAM4 항체는 췌장암 세포에 우선적으로 결합한다.
면역원에 대한 항체의 초기 증가이후에, 항체는 시퀀싱되고 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 마우스 항체 및 항체 단편의 인간화는 당 분야의 기술자들에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 인간화 단클론 항체는 마우스 상보성 결정 영역을 마우스 이뮤노글로불린의 중쇄 및 경쇄 가변영역으로부터 인간 가변 영역으로 이동시키고, 그 다음 마우스의 대응하는 프레임워크 영역에서 인간 잔기를 대체함으로써 생산될 수 있다. 인간화 단클론 항체로부터 얻어진 항체 성분의 사용은 마우스 불변 영역의 면역원성과 연계된 잠재적인 문제를 예방한다.
본 발명의 완전한 인간화 항체, 즉 인간 PAM4는 유전자 이식된 비-인간 동물로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, Mendez et al., Nature Genetics, 15:146-156(1997); 참고부분에 기재된 미국특허 제 5,633,425를 참고하라. 예를 들어, 인간 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 갖는 유전자 이식 마우스로부터 만들 수 있다. 마우스 체액의 면역 시스템은 내인성 이뮤노글로불린 유전자를 불활성화 시키고 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 도입하는 것에 의해 인간화 될 수 있다.인간 이뮤노글로불린 유전자좌는 상당히 복잡하며 인간 게놈의 거의 0.2%를 함께 차지하는 많은 수의 분리된 조각을 포함한다. 유전자 이식 마우스가 알맞은 항체 레퍼토리를 생산할 수 있는지를 확인하기 위해서, 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 많은 부분은 마우스 게놈으로 도입되어야만 한다. 이것은 점라인(germline) 배치에서 인간 중쇄 또는 경쇄 이뮤노글로불린 유전자좌를 포함하는 효모 인공 염색체(YACs)의 형성으로 시작되는 단계적인 과정에 의해 이루어진다. 중쇄 유전자좌를 포함하는 것과 경쇄 유전자좌를 포함하는 것으로 된 두개의 YACs는 효모 스페로블라스트(spheroblast)를 포함하는 YAC과 마우스 배아줄기세포와의 융합에 의해 마우스로 각각 도입된다. 그 다음, 배아줄기세포 클론은 마우스 포배기(blastocyte)로 마이크로 투여된다. 결과적으로 키메라 수컷은 그들의 점라인(germline)을 통해서 YAC를 전하는 능력에 대해 선별되고, 마우스 항체 생산을 결핍한 마우스와 함께 사육된다. 인간 중쇄 유전자좌를 포함하는 종 및 인간 경쇄 유전자좌를 포함하는 종, 두 개의 유전자 이식종을 키우는 것은 면역화에 대한 반응에서 인간 항체를 생산하는 결과를 만들어 낸다.
마우스 이뮤노글로불린 가변 영역을 클로닝하는 일반적인 기술은 예를 들어, 참고부분에 기재된, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86: 3833(1989)(Orlandi et al에 의해 출판)에 기술되어 있다. 인간화 MAb를 생산하는 기술은 예를 들어, 참고부분에 기재된 Carter et al., Proc. Nat'l Acad. USA 89:4285(1992), Singer et al., J, Immun. 150: 2844(1992), Mountain et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10:1(1992), 및 Coligan 10.19.1-10.19.11 페이지에 기술되어 있다.
일반적으로, PAM4 항체에 대한 VK(가변 경쇄) 및 VH(가변 중쇄) 서열은 RT-PCR, 5'-RACE 및 cDNA 라이브러리 시퀀싱과 같은 다양한 분자 클로닝 과정에 의해 얻어질 수 있다. 구체적으로, MAb PAM4의 VH및 VK유전자는 RT-PCR 및 5'-RACE에 의해 하이브리도마 세포로부터의 PCR 증폭에 의해 각각 클로닝되고, 그들의 서열은 DNA 시퀀싱에 의해 결정된다. 이들이 진짜임을 확인하기 위해서, 클로닝된 VL및 VH유전자는 참고부분에 기재된 Leung et al.(Mol. Immunol., 32:1413(1995)에 의해 언급된 Ab로서 세포 배양체에서 발현될 수 있다. cDNA는 일반적인 분자 클로닝 기술에 의해 마우스 또는 인간화 PAM4 항체를 생산하는 임의의 알려진 하이브리도마 또는 트렉스펙션된 세포주로부터 얻어질 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, laboratory manual, 2ndEd(1989)). 실시예 7은 hPAM4 MAb에 대해 사용되는 인간화 과정을 기술하고 있다.
항체는 일반적으로 하기와 같이 세포배양체로부터 분리될 수 있다. 트랜스펙토마 배양체는 혈청이 없는 배지에 적응시킨다. 인간화 항체의 생산을 위하여, 세포는 HSFM을 사용한 롤러 병에서 500㎖ 배양액으로 성장된다. 배양액은 원심분리되고 상층액은 0.2μ막을 통해 여과된다. 여과된 배지는 1㎖/분의 유속으로 단백질 A 컬럼(1×3 cm)를 통해 흘려준다. 그 다음, 수지는 약 10 컬럼부피의 PBS로 세척하고, 단백질 A-결합 항체는 10mM EDTA를 포함한 0.1M 글리신 버퍼(pH 3.5)와 함께 컬럼으로부터 용출된다. 1.0㎖의 분취물은 10㎕의 3M Tris(pH 8.6)를 포함하는 튜브에 수집되고, 단백질 농도는 280/260nm의 흡광도에서 결정된다. 피크 분취액은합쳐져서 PBS에 투석되고, 예를 들어 센트리콘 30(Centrion 30)(Amicon, Beverly, MA)로 항체를 모은다. 항체 농도는 앞에서와 마찬가지로 ELISA에 의해 결정되고, 그 농도는 PBS를 사용하여 약 1mg/㎖에 맞춘다. 소듐 아자이드(sodium azide), 0.01%(w/v)가 방부제로서 샘플에 알맞게 투여된다.
PAM4 항체를 제조하는데 사용된 프라이머의 뉴클레오타이드 서열은 하기 실시예 7에 기재되었다. 바람직한 실시예에서, 인간화 PAM4 항체 또는 항체 단편은 마우스 PAM4 MAb의 상보성-결정 영역(CDRs) 및 인간항체의 경쇄 및 중쇄 가변영역 및 인간항체의 경쇄 및 중쇄 불변영역을 포함하며, 상기 인간화 PAM4 경쇄 가변 영역의 CDRs은 SASSSVSSSYLY의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; STSNLAS의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; 및 HQWNRYPYT의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함하며; 인간화 PAM4 MAb의 중쇄 가변 영역의 CDRs는 SYVLH의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1; YINPYNDGTQYNEKFKG의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2; GFGGSYGFAY의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 인간화 PAM4 항체 또는 그의 단편의 경쇄 및 중쇄 가변영역의 FRs는 대응하는 마우스 PAM4 MAb의 FRs로부터 대체된 적어도 하나의 아미노산을 포함한다.
PAM4 MAb는 다양한 정착된 기술에 의해 하이브리도마 배양체로부터 분리 및 정제될 수 있다. 그러한 분리 기술은 단백질-A 세파로즈(Sephrose)로의 친화 크로마토그래피, 크기-배제 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, Coligan 2.7.1-2.7.12 및 2.9.1.-2.9.3 페이지를 참고하라. 또한, METHOD IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL 10, 79-104 페이지(The Humana Press, Inc.1992)내의 Baines et al., "이뮤노글로불린 G(IgG)의 정제"를 참고하라.
PAM4 MAb는 당 분야의 기술자들에게 잘 알려진 다양한 기술에 의해 특징화될 수 있다. 예를 들어, PAM4 MAb가 PAM4 항원에 결합하는 능력은 간접 효소 면역분석법, 플로우 사이토메트리 분석법(flow cytometry analysis), 또는 웨스턴 분석법(Western analysis)을 사용하여 확인될 수 있다.
PAM4 항체 단편의 생산
본 발명은 PAM4 항체 단편의 사용에 대하여 설명한다. 특이적인 에피토프를 인식하는 항체 단편은 알려진 기술에 의해 생성될 수 있다. 항체 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, sFv등과 같은 항체의 항원 결합부위이다. 예를 들어, F(ab')2단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있으며, Fab' 단편은 F(ab')2단편의 디설파이드(disulfide) 결합을 감소시킴으로써 생성될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, Goldenberg에 의한 미국 특허 제 4,036,945 및 4,331,647에 의해 기술되어 있고, 본 명세서의 참고부분에 포함되어 있다. 또한, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230(1960); Porter, Biochem. J. 73: 119(1959); Edelamn et al., METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, 422 페이지(Academic Press 1967) 및 Coligan 2.8.1-2.8.10 및 2.10-2.10.4를 참고하라. 이와 달리, 원하는 특이성을 가진 단클론 Fab' 단편에 대한 빠르고 간편한 확인을 위하여 Fab' 발현 라이브러리가 제조될 수 있다(Huse et al., 1989, Science, 246: 1274-1281). 본 발명은 항체 및항체 단편을 포함한다.
단일 사슬 Fv 분자(scFv)는 VL도메인과 VH도메인을 포함한다. VL도메인과 VH도메인은 표적 결합부위를 형성하기 위하여 결합된다. 이러한 두 개의 영역은 펩타이드 링커(L)에 의해 공유결합되어 있다. VL도메인이 scFv 분자의 N-말단 부분인 경우, scFv 분자는 VL-L-VH, 또는 VH도메인이 scFv 분자의 N-말단 부분인 경우, VH-L-VH로 표시된다. scFv 분자의 제조 및 적합한 펩타이드 링커의 제작 방법은 미국특허 제 4,704,692, 미국특허 제 4,946,778, R. Raag 및 M. Whitlow, "단일 사슬 Fvs." FASEB Vol 9: 73-80(1995) 및 R.E. Bird 및 B.W. Walker, "단일 사슬 항체 가변 영역", TIBTECH, Vol 9; 132-137(1991)에 기술되어 있다. 이들은 모두 본 명세서의 참고부분에 포함되어 있다.
항체 단편은 전체-길이 항체의 단백질 가수분해, 또는 대장균이나 항체 단편을 코딩하는 DNA의 다른 숙주에서의 발현에 의해서 제조될 수 있다. 항체 단편은 전통적인 방법에 의한 전체-길이 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 F(ab')2로 나타내어지는 대량 100Kd의 단편을 제공하기 위하여 펩신을 이용하여 항체를 효소적으로 절단함으로써 생산될 수 있다. 이 단편은 대략 50Kd의 Fab' 1가 단편을 생산하기 위하여 티올 환원제를 사용하고, 부가적으로 디설파이드 결합의 절단으로부터 초래되는 술피드릴 그룹(sufhydryl group)을 차단함으로써 더 절단될 수 있다. 또한, 파파인을 이용한 효소 절단은 두개의 1가 Fab 단편 및 Fc 단편을 직접 생산할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, Goldenberg에 의한 미국 특허 제 4,036,945 및 4,331,647에 의해 기술되어 있고, 본 명세서의 참고부분에 포함되어 있다. 또한, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230(1960); Porter, Biochem. J. 73: 119(1959); Edelamn et al., METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, 422 페이지(Academic Press 1967) 및 Coligan 2.8.1-2.8.10 및 2.10-2.10.4를 참고하라.
항체 단편의 다른 형태는 단일 상보성-결정 영역(CDRs)을 코딩하는 펩타이드이다. CDR은 항체가 결합하고 가변영역의 여분보다 더욱 가변적인 에피토프에 구조적으로 상보적인 항체의 가변영역 조각이다. 따라서, CDR은 때때로 초가변적 영역으로 언급된다. 가변 영역은 세 개의 CDR을 포함한다. CDR 펩타이드는 관심있는 항체의 CDR을 코딩하는 유전자를 제조함으로써 얻을 수 있다. 그러한 유전자는 예를 들어, 항체-생성 세포의 RNA로부터 가변 영역을 합성하기 위하여 폴리머레이즈 연쇄 반응(PCR)을 이용함으로써 제조된다. 예를 들어, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106(1991); Courtenay-Luck, "단클론 항체의 유전자 조작" MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al.(eds.), 166-179 페이지(캠브리지 대학 출판사 1995); 및 Ward et al., "유전자 조작 및 항체 발현" MONOCLONAL ATIBODIES: PRINCIPLE AND APPLICATION, Birch et al.,(eds.), 137-185 페이지(Wiley-Liss, Inc 1995)를 참고하라.
1가의 경쇄 사슬 단편을 형성하기 위하여 중쇄를 분리한 후, 단편을 절단하거나 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전학적 기술과 같은 항체를 절단하는 다른 방법이 본래 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 단편인 한은 역시 사용될 수 있다.
인간화 및 인간 PAM4 항체 융합 단백질의 제조
본 발명의 항체 융합 단백질은 글루타알데하이드 결합에서 기능기 사이의 더 특이적인 결합의 범위에서 많은 전통적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서에 기재된 융합 단백질을 포함하는 항체 및/또는 항체 단편은 직접 또는 링커 부분을 거쳐서, 항체 단편상의 하나 이상의 기능기, 즉 아민, 카르복실, 페닐, 티올 또는 하이드록실 기를 통해 다른 것과 공유 결합한다. 글루타알데하이드 뿐만 아니라 다양한 전통적인 링커, 즉 디이오소시아네이트(diiosothiocyanate), 디이오소티오시아네이트(diiosothiocyanate), 비스(하이드록시석시니마이드) 에스테르(bis(hydroxyxuccinimide) ester), 카르보디이마이드(carbodiimide), 말레이미디하이드록시석시니마이드 에스테르(maleimidehydroxyxuccinimide ester) 등이 사용될 수 있다.
인간화 및 인간 PAM4 융합 단백질을 생산하기 위한 간단한 방법은 글루타알데하이드 존재하에서 항체 또는 단편을 혼합하는 것이다. 초기 쉬프(Schiff) 염기 결합은 예를 들어, 두번째 아민에 보로하이드라이드(borohydride) 환원에 의해 안정화될 수 있다. 디이오소티오시아네이트 또는 카르보디이마이드는 비-위치-특이적 링커로서 글루타알데하이드 대신에 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시예에서, 항체 융합 단백질은 하나의 인간화 또는 인간 PAM4 MAb 또는 그의 단편을 포함하며, 상기 MAb는 MUC1의 아미노말단과 반복 도메인의 시작점에 위치하는 영역에 결합한다. 이 융합 단백질 및 그의 단편은 췌장암 세포에 우선적으로 결합한다. 이 1가, 단일특이성 MAb는 항원의 직접 표적화에 유용하며, 상기 MAb는 치료제, 진단/검출제 또는 이들의 조합에 부착되고, 단백질은 필요에 따라 환자에게 직접 투여된다.
본 발명의 PAM4 항체 융합 단백질 및 그의 단편은 적어도 두 개의 인간화 또는 인간 PAM4 MAb 또는 이들의 단편을 대신 포함할 것이며, 상기 적어도 두 개의 MAb 또는 그의 단편은 PAM4 항원의 독특한 에피토프에 결합한다. 두 개 이상의 scFv 분자의 비-공유 결합은 기능성 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 형성할 수 있다. 단일특이성 디아바디는 동일한 scFv의 호모다이머(homodimer)이며, 각 scFv는 짧은 링커에 의해 연결된 선별 항체로부터의 VH도메인 및 같은 항체의 VL도메인을 포함한다. 디아바디는 두 개의 Fv 결합 부위를 생산하는 두 개의 비-공유 결합 scFv에 의해 형성된 2가의 다이머(dimer)이다. 트리아바디는 세 개의 결합 부위를 생산하는 세 개의 3가 트라이머 scFv의 형성으로부터 얻어지며, 테트라바디는 네 개의 결합 부위를 생산하는 네 개의 3가 테트라머 scFv이다. 몇 가지 단일특이성 디아바디는 VH1-링커-VL1를 포함하는 재조합 유전자 구조체를 가지는 발현 벡터를 사용하여 반들어져 왔다. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993); Atwell et al., Molecular Immunology 33: 1301-1302(1996); Holliger et al., Nature Biotechnology 15: 632-631(1997); Helfrich et al., Int. J.Cancer 76: 232-239(1998); Kipriyanov et al., Int. J. Cancer 77: 763-772(1998); Holiger et al., Cancer Research 59: 2909-2916(1999)를 참고하라. 미국특허 제 4,946,778(1990) 및 제 5,132,405(1992)에는 scFv를 제조하는 방법이 기재되어 있다. 미국특허 제 5,837,242(1998), 제 5,844,094(1998) 및 WO-98/44001(1998)에는 scFv에 기초한 다가, 다중특이성 항체의 제조방법이 기재되어 있다. 다가, 단일특이성 항체 융합 댄박질은 같은 항원 또는 별도의 항원상에 적합할 수 있는 두 개 이상의 같은 타입의 에피토프에 결합한다. 상승된 수가(valency)는 부가적인 상호작용, 증가된 친화도, 및 더 긴 잔존 시간을 부가한다. 이러한 항체 융합 단백질은 직접 표적화 시스템에서 사용될 수 있으며, 상기 항체 융합 단백질은 치료제, 진단/검출제 또는 이들의 조합에 접합되고, 필요에 따라 환자에게 직접 투여된다.
본 발명의 바람직한 실시예는 PAM4 표적 에피토프 및 췌장암 항원에 겨합된 하나 이상의 부가적인 에피토프에 대한 친화도를 가지는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 다가, 다중특이성 항체 또는 이들의 단편이다. 이 융합 단백질은 같거나 다른 항원에 존재할 수 있는 적어도 두 개의 다른 에피토프에 결합하기 때문에 다중특이성이다. 예를 들어, 융합 단백질은 첫째로 PAM4 항원 에피토프에 대한 친화도 및 둘째로 TAG-72 또는 CEA와 같은 다른 표적 항원에 대한 친화도를 갖는 하나 이상의 항원 결합 부위를 포함할 것이다. 다른 예는 CA19.9 MAb(또는 그의 단편) 및 PAM4 MAb(또는 그의 단편)을 포함하는 이중특이성 PAM4 MAb 항체 융합 단백질이다. 그러한 융합 단백질은 MUC1의 아미노 말단과 반복 도메인의 시작점 사이에존재하는 영역 뿐 아니라 CA19.9에 대한 친화도를 가질 것이다. 또한 본 발명에서 설명하는 것은 적어도 두 개의 다른 PAM4 항원 에피토프에 대한 친화도를 갖는 하나 이상의 항원 결합부위를 포함하는 융합 단백질이다.
본 발명의 항체 융합 단백질 및 그의 단편은 항체 융합 단백질이 치료제, 진단/검출제 또는 이들의 조합에 결합되고, 필요에 따라 환자에게 투여되는 직접 표적화 시스템에서 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예는 PAM4 표적 에피토프에 대한 친화도를 갖는 하나 이상의 항원 결합 부위 및 합텐 분자에 친화도를 갖는 적어도 하나의 합텐 결합 부위를 포함하는 다가, 다중특이성 항체 및 그의 단편이다. 예를 들어, 이중특이성 PAM4 항체 융합 단백질은 679 MAb(또는 그의 단편) 및 PAM4 MAb(또는 그의 단편)을 포함할 것이다. 단클론 항체, 679는 트리-펩타이드 부분 히스타민 석시닐글리실(hsitamine sucinylglyciy, HSG)을 포함하는 분자에 대해 높은 친화도로 결합한다. 이러한 이중특이성 PAM4 항체 융합 단백질은 예를 들어, 상기와 같이 679로부터의 F(ab')2를 얻는 것에 의해 제조될 수 있다. 679 F(ab')2단편의 교차 디설파이드 결합은 경-중쇄 연결을 피하고 Fab'-SH 단편을 형성하도록 하는 사이토신(cytosine)으로 완만하게 감소된다. SH 기는 과량의 비스-말레이마이드 링커(1,1'-(메틸렌디-4,1-페닐렌)비스-말레마이드)(1,1'-(methylenedi-4,1-phenylene)bis-malemide)로 활성화된다. PAM4 MAb는 Fab'-SH로 전환되고, 그 다음 이중특이성 PAM4 항체 융합 단백질을 얻기 위하여 활성화된 MR23 Fab'-SH 단편과 반응된다.이러한 이중특이성 항체 융합 단백질은 표적 항원이 융합 단백질에 선표적화되고 선표적화에 의해 형성된 항체-항원 복합체와 결합하는 진단체 또는 치료제로 순차적으로 표적화된 표적 항원을 사용하는 친화도 증가 시스템에서 사용될 수 있다.
이중특이성 항체는 예를 들면 디설파이드 절단 및 전체 IgG 또는 바람직하게 하나 이상의 특이성을 가지는 항체를 생산하는 폴리오마(polyoma)를 형성하기 위하여 하나 이상의 하이브리도마의 융합체인 F(ab')2단편 혼합물의 재형성과 같은 기존의 다양한 방법, 및 유전공학에 의해 제조될 수 있다. 이중특이성 항체 융합 단백질은 다른 항체의 환원 절단으로부터 얻어진 Fab' 단편의 산화적 절단에 의해 제조되어 왔다. 이것은 본래 에피토프 각각에 특이적인 Fab' 부분을 포함하는 이중특이성 항체 융합 단백질을 가지는 F(ab')2단편의 혼합물을 형성하기 위하여 디설파이드 연결의 산화적인 재형성 후에 Fab' 단편의 혼합물을 형성하기 위한 환원적인 절단, 즉 두 개의 다른 항체의 펩신 분해에 의하여 제조되는 두 개의 다른 F(ab')2단편을 혼합하는 것에 의해 편리하게 수행될 수 있다. 항체 융합 단백질을 제조하는 일반적인 기술은 예를 들면, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 93: 470(1961), Hammerling et al., J. Exp. Med. 128: 1461(1968), 및 미국특허 제 4,331,647에 기재되어 있다. 본 발명에서 설명하는 것은 적어도 하나의 1차 PAM4 MAb 또는 그의 단편, 및 본 발명의 PAM4 MAb 또는 그의 단편이 아닌, 적어도 하나의 2차 MAb 또는 그의 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편이다.
더욱 선택적인 결합이 말레이마이드하이드록시석시니마이드 에스테르(maleimidehydroxysuccinimide ester)와 같은 이관능성(heterobifunctional) 링커를 사용함으로써 수행될 수 있다. 항체 또는 단편을 가진 에스테르의 반응은 항체 또는 단편 상의 아민 기를 유도하고, 유도체는 예를 들면, 자유 술피드릴 기를 가지는 항체 Fab 단편(또는 Traut's Reagent 등에 의해서 첨가된 술피드릴 기를 가지는 더 큰 단편 또는 항체 자체)와 반응시킬 수 있다. 이러한 링커는 같은 항체에서 교차 결합 기(group)일 가능성은 거의 없고, 결합의 선택도를 향상시킨다.
항체 또는 단편을 항원 결합부위에서 멀리 떨어진 위치에서 결합하는 것이 유리하다. 이것은 예를 들면, 상기에서처럼 절단된 교차 술피드릴 기로의 결합에 의해서 수행될 수 있다. 다른 방법은 산화 카르보하이드레이트 부분을 갖는 항체를 적어도 하나의 자유 아민기를 갖는 다른 항체와 반응시키는 것을 수반한다. 이것은 최종 혼합물을 형성하기 위하여 2차 아민으로의 환원, 예를 들면, 보로하이드라이드 환원에 의해 바람직하게 안정화되는 초기 쉬프(Schiff) 염기(마임) 결합을 야기한다. 이러한 위치-특이적 결합은 미국특허 제 4,671,958에서 작은 분자에 대하여, 그리고 미국특허 제 4,699,784에서 더 큰 분자에 대하여 기재되어 있으며, 본 명세서의 참고부분에 포함되어 있다.
다중특이성 PAM4 항체 융합 단백질은 PAM4 항원 결합 부분을 이중특이성 인간화 또는 인간 PAM4 항체 융합 단백질에 첨가함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체 융합 단백질은 상기 비스-말레마이드(bis-malemide) 활성 과정을 사용한 세번째 PAM4 MAb 또는 단편에 이중특이성 융합 단백질을 결합시키는데 사용되는 하나 이상의 술피드릴 기를 도입하기 위하여 2-이미노티오란(2-iminothiolane)과 반응시킬 수 있다. 항체 융합 단백질의 생산에 대한 이러한 기술은 당 분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 참고부분에 기재된 미국특허 제 4,925,648을 참고하라.
예를 들어, 15- 또는 18- 잔기 길이의 12 아미노 산 잔기 이상의 링커를 가지는 scFv는 동일한 사슬에서의 VH및 VL도메인 사이의 상호작용을 가능케 하고, 일반적으로 모노머, 다이머(디아바디) 및 적은 양의 고 질량 멀티머(multimer)의 혼합물을 형성한다(Kortt et al., Eur. J. Biochem. (1994) 221:151-157). 그러나, 5 이하의 아미노산 잔기의 링커를 가진 ScFv는 다른 사슬 상에서의 VH 및 VL 도메인의 결합을 강요하면서 같은 사슬 상의 VH 및 VL 도메인의 내분자성 결합을 저해한다. 3-잔기와 12-잔기 사이의 링커는 우선적으로 다이머를 형성한다(Atwell et al., Protein Engineering(1999) 12:597-604). 0 잔기 및 2 잔기 사이의 링커로, 트리메릭(트리아바디), 테트라메릭(테트라바디) 또는 scFv의 더 높은 올리고메릭 구조가 형성된다. 그러나, 정확한 고분자 저중합(oligomerization)의 패턴은 링커의 길이와 더불어, V-도메인의 정위(orientation)뿐만 아니라 조성에도 의존하는 것처럼 보인다. 예를 들어, 항-뉴라미니다제(anti-neuraminidase) 항체 NC10의 scFv는 0-잔기 링커와 함께 우선적으로 트라이머(VH에서 VL 정위) 또는 테트라머(VL에서 VH정위)를 형성하였다(Dolezal et al., Protein Engineering(1999) 12:597-574). 1-잔기 및 2-잔기 링커와 함께 NC10으로부터 제조된 scFv에 대해서는, VH에서 VL 정위는 우선적으로 디아바디를 형성하였다(Atwell et al., ProteinEngineering(1999) 12:597-604); 반대로 VL에서 VH정위는 테트라머, 트리머, 다이머 및 고 질량 멀티머의 혼합체를 형성하였다(Dolezal et al., Protein Engineering(1999) 12:597-574). VH에서 VL 정위에서 항-CD19 항체 HD37로부터 제조된 scFv에 대해서는, 0-잔기 링커가 광범위하게 트라이머를 형성하였고, 1-잔기 링커는 광범위하게 테트라머를 형성하였다(Le Gall et al., FEBS Letters(1999) 453: 164-168).
발현 벡터 및 숙주 세포
발현 벡터는 숙주 세포에서 발현되는 유전자를 포함하는 DNA 분자이다. 일반적으로, 유전자 발현은 구조 또는 유도 프로모터, 조직-특이성 조절 요소, 및 인헨서를 포함하는 어떠한 조절 요소의 조절을 받는다. 이러한 유전자는 조절 요소에 "조작가능하게 연결되어 있다"고 한다. 프로모터는 구조 유전자의 전사를 지시하는 DNA 서열이다. 구조 유전자는 메신저 RNA(mRNA)로 전사되어 다시 특이적인 폴리펩타이드로 특징화된 아미노산 서열로 번역되는 DNA 서열이다. 일반적으로, 프로모터는 구조 유전자의 전사 시작 위치에서 가장 가까운 유전자의 5' 영역에 위치한다. 프로모터가 유도성 프로모터일 경우, 전사율은 유도제와의 반응에서 상승한다. 반대로, 프로모터가 구조 프로모터일 경우에 전사율은 유도제에 의해 조절되지 않는다. 인헨서는 전사 시작 위치에 대한 인헨서의 거리 또는 정위에 관계없이, 전사의 효율을 증가시킬 수 있는 DNA 조절 요소이다.
분리 DNA 분자는 생물의 게놈 DNA에 통합되지 않는 DNA 단편이다. 예를 들어, 클로닝된 PAM4 항원 유전자는 포유류 세포의 게놈 DNA로부터 분리되어진 DNA 단편이다. 분리 DNA 분자의 다른 예는 생물의 게놈 DNA에 통합되지 않은 화학적으로 합성된 DNA 분자이다. 상보적 DNA(cDNA)는 역전사효소(reverse transcriptase)에 의해 mRNA 주형으로부터 형성된 단일 가닥 DNA 분자이다. 일반적으로, mRNA의 일부에 상보적인 짧게 합성된 올리고 뉴클레오타이드는 첫째 가닥 DNA를 생성하기 위하여 역전사의 시작에 필요한 프라이머로서 제공된다. 당 분야의 숙련자들은 또한 그러한 단일 가닥 DNA 분자 및 그의 상보적 DNA 가닥으로 구성된 이중 가닥 DNA 분자를 나타내기 위하여 cDNA"라는 용어를 사용한다.
클로닝 벡터는 플라스미드, 코스미드 또는 박테리오파지와 같이 숙주 세포내에서 자체적인 복제능력이 있는 DNA 분자를 말한다. 클로닝 벡터는 일반적으로 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 확인 및 선별에 사용하기 적합한 마커 유전자 뿐만 아니라, 벡터의 필수적인 생물학적 기능의 손실 없이 외부 DNA 서열이 결정가능한 형태로 삽입될 수 있는 하나 혹은 적은 수의 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 인식 부위를 함유한다. 마커 유전자는 일반적으로 테트라사이클린 저항성 또는 엠피실린 저항성을 제공하는 유전자를 포함한다. 재조합 숙주는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 포함하는 임의의 원핵세포 또는 진핵세포가 될 것이다. 이 용어는 또한 숙주의 염색체 또는 게놈에서 클로닝된 유전자를 포함하도록 유전적으로 조작된 그러한 원핵세포 또는 진핵세포를 포함한다. 발현은 유전자 산물의 생합성을 말한다. 예를 들어, 구조 유전자의 경우에서, 발현은 구조 유전자를 mRNA로 전사시키는 것 및 mRNA를 하나 이상의 폴리펩타이드로 번역하는 것을 포함한다.
적합한 숙주 세포는 미생물 또는 포유류 숙주 세포를 포함한다. 바람직한 숙주는 MAb의 생산을 위해 개발된 인간 세포주, PER.C6, 및 다른 융합 단백질이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시예는 PAM4 MAb, 복합체, 융합 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 숙주 세포이다. PER.C6 세포(WO 97/00326)은 인간 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터의 조절하에서 애드세로타입 5(Adserotype 5, Ad5) EIA- 및 EIB-코딩 서열(Ad5 뉴클레오타이드 459-3510)을 포함하는 플라스미드를 이용한 일차 인간 태아 망막 세포의 트랜스펙션에 의해 생성되었다. E1A 및 E1B는 각각 아데노바이러스 초기 유전자 활성 단백질 1A 및 1B이다. 이 방법 및 조성은 ,예를 들어 글리코실레이션(glycisylation)에 의해 번역 후에 변형된, 목표가 되는 인간 재조합 단백질의 안정한 발현을 발생시키는데 유용하다. PER.C6이 완전히 특징화된 인간 세포주이고 좋은 실험 실험에 순응하여 개발된 것 처럼, 몇가지 특징들이 PER.C6를 재조합 단백질 생산에 대한 숙주로 특히 유용하도록 만든다. 더욱이, PER.C6는 임의의 인간 및 동물 유래 단백질이 없는 제한된 혈청-비첨가 배지상에서 부유 배양체로서 성장할 수 있으며, 이것의 성장은 약 35시간의 배가 시간(doubling time)동안 롤러 병, 쉐이커 플라스크, 스피너 플라스크 및 생물반응기와 융화될 수 있다. 마지막으로, E1A의 존재는 CMV 인헨서/프로모터의 조절 하에 있는 유전자의 발현의 상향 조절을 야기하고, E13의 존재는 재조합 전이유전자의 과 발현을 통해 높아질 수도 있는 p53-의존 아폽토시스를 저해한다. 한 실시예에서, 이 세포는 기존의 포유류 세포주보다 2배에서 200배나 많은 재조합 단백질 및/또는 단백 물질을 생산할 수 있다.
치료 및 진단에 인간화 및 인간 PAM4 항체의 사용
본 발명에서 설명하는 것은 PAM4 MAb 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 치료학적으로 효과적인 양의 치료 복합체를 대상에게 투여하는 것을 포함하며, 상기 PAM4 MAb 또는 그의 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편은 적어도 하나의 진단제 및/또는 치료제에 결합하고, 그 후 제약학적으로 적합한 부형제로 제형화되는, 대상에서 악성 종양을 진단 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 바람직하게 본 발명에서 설명하는 것은 PAM4 항원에 대한 하나 이상의 항원 결합 부위 및 합텐 결합 부위를 포함하는 다가, 다중특이성 항체 또는 그의 단편을 필요에 따라 대상에 투여하는 것; 비-항체가 대상의 혈액 내에서 제거될 수 있을만큼 충분한 시간동안 기다리는 것; 및 다가, 다중특이성 항체 또는 그의 단편의 결합 부위에 결합하는 진단/검출제, 치료제, 또는 이들의 조합을 포함하는 운송 분자를 대상에 투여하는 것을 포함하는 암을 진단하거나 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, 암은 췌장암이다. 다른 바람직한 실시예에서, 항체는 다가, 단일특이성 항체 또는 그의 단편이다.
시험관 진단에 대한 MAb의 사용은 잘 알려져 있다. 예를 들어, Carlsson et al., Bio/Technology 7(6):567(1989)를 참고하라. 예를 들어, MAb는 생체검사(biopsy) 샘플로부터의 조직에서 종양-결합 항원을 측정하는데 사용될 수 있다. MAb는 또한 방사능면역분석법, 효소-결합 면역흡수분석법, 및 형광 면역분석법과 같은 기술을 이용하여 임상 체액 샘플에서 종양-결합 항원의 양을 측정하는데 사용될 수 있다.
종양-표적화된 MAb 및 독소의 컨쥬게이트는 생체 내에서 선택적으로 암세포를 없애기 위해서 사용될 수 있다(Spalding, Bio/Technology 9(8): 701(1991); Goldenberg, Scienfic American Science & Medicine 1(1): 64(1994)). 예를 들어, 실험 동물 모델에서의 치료 연구는 세포 독성 방사능 핵종을 운반하는 항체의 항-종양 활성을 입증하였다. 치료 연구의 동물 모델 고찰에 관한 실시예 3 및 실시예 5를 참고하라(Goldenberg et al., Cancer Res. 41: 4354(1981), Cheung et al., J. Nat'l Cancer Inst. 77:739(1986), 및 Senekowitsch et al., J. Nucl. Med. 30: 531(1989)).
인간화 및 완전한 인간 항체 및 그의 단편은 치료법 및 진단법에 사용되기 적합하다. 따라서, 본 발명에서 설명하는 것은 (ⅰ) 적어도 하나의 진단제 및/또는 치료제와 접합된 PAM4 항체 또는 그의 단편을 포함하는 성분을 제공하는 것; 및 (ⅱ) 필요에 따라 진단 또는 치료 항체 컨쥬게이트를 대상에 투여하는 것을 포함하는, 표적에 진단제 또는 치료제 또는 이들의 조합을 전달하는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시예에서, PAM4 항체 및 그의 단편은 인간화 또는 완전한 인간유래이다. 다른 실시예에서, 본 발명의 인간화 및 완전한 인간 PAM4 항체 및 그의 단편은 악성 종양을 치료하기 위한 방법에서 사용된다.
또한 본 명세서에서 설명하는 것은 본 발명의 임의의 항체의 PAM4 MAb 또는 그의 단편, 또는 항체 융합 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 항체 성분을 포함하는 암세포 표적화 진단 또는 치료 컨쥬게이트이며, 상기 항체 성분은 적어도 하나의 진단제 또는 적어도 하나의 치료제에 부착된다. 바람직하게, 진단 컨쥬게이트는 광활성 진단/검출제, 초음파 탐지제 또는 MRI 조영제이다. 더욱 바람직하게, 진단/검출제는 20에서 4,000keV 사이의 에너지를 갖는 방사성핵종이다.
본 발명의 다른 실시예는 적어도 하나의 노출 PAM4 항체 또는 그의 단편 및/또는 PAM4 융합 단백질 또는 그의 단편의 치료학적 또는 진단학적으로 효과적인 양을 투여하는 것, 및 제약학적인 부형제에서 PAM4 항체, 융합 단백질 또는 그의 단편을 선택적으로 제형화하는 것을 포함하는 악성 종야의 진단 또는 치료법에 관한 것이다.
치료의 성분은 적어도 하나의 인간화 또는 완전한 인간 PAM4 항체 또는 그의 단편이 다른 인간화 또는 키메라 항체, 인간 항체, 치료제 또는 면역조절제와 같은 다른 항체 또는 그의 단편과 단독 및 비접합상태로, 또는 접합 또는 비접합상태 및 조합된 것을 포함한다. 동일하거나 다른 에피토프 또는 항원에 대한 노출 또는 접합 항체는 본 발명의 하나 이상의 PAM4 항체 또는 그의 단편과 결합할 것이다.
따라서, 본 발명은 노출 항체 또는 그의 단편으로서 단독으로, 혹은 멀티모달(multimodal) 치료로서 투여되는 PAM4 융합 단백질 및 그의 단편의 투여에 관한 것이다. 바람직하게, 항체는 인간화 또는 완전한 인간 PAM4 항체 또는 그의 단편이다. 본 발명의 멀티모달 치료는 노출 항체의 형태인 다른 항체, 융합 단백질, 또는 면역컨쥬게이트의 부가적인 투여와 함께 노출 PAM4 항체로의 면역치료를 더 포함한다. 예를 들면, 인간화 또는 완전한 인간 PAM4 항체는 다른 노출 인간화 PAM4 또는 다른 항체 또는 인간화 PAM4 또는 동위원소와 접합된 다른 항체, 하나 이상의 화학요법제, 사이토카인, 독소 또는 이들의 조합과 결합할 것이다. 예를 들어, 본 발명은 종양 괴사 물질에 대한 항체 및 암유전자의 산물 뿐 아니라, 암배아 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 콜론-특이적 항원-p(CSAp)에 대한 항체, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, HER2/neu, EGFR, 혈관생성 인자(예, VEGF), 인슐린-형 성장 인자(IGF), 테나신, 혈소판 유래 성장인자 및 IL-6, CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, la3, aLea, 및 다른 루이스(Lewis) 항원 Le(y)에 대한 항체와 같은 다른 췌장암 결합 항체와의 조합에서, 혹은 전, 후에 노출 또는 접합 PAM4 항체 또는 그의 단편의 처리에 관한 것이다. 이러한 고체 종양 항체는 노출되거나 특히, 약물, 독소, 동위원소, 외부 방사능 또는 면역조절제에 접합될 것이다. 인간화 또는 완전한 인간 PAM4 항체와 독소의 융합 단백질은 본 발명에서 또한 사용된다. 많은 다른 항체 조합이 제조될 것이며, 노출 항체로서 또는 부분적으로 노출되거나 부분적으로 치료제 또는 면역조절제와 접합될 것이다. 또한, 다른 노출 항체 조합이 세포독성 약물 또는 방사능을 가진 것과 같은 다른 치료제와의 조합으로 연속적으로, 동시에, 혹은 순차적으로 투여될 것이다.
본 명세서에 기재된 직접적으로 진단제 또는 치료제에 결합된 단일특이성 항체는 PAM4 양성 종양을 표적화한다. 단일특이성 항체는 선택적으로 표적 항원에 결합하고, 분자상의 결합위치의 숫자가 증가할수록, 표적 세포에 대한 친화도는 증가하며, 더 긴 잔존 시간을 원하는 위치에서 관찰된다. 또한, 비-항원 결합 분자는 체내에서 신속하게 제거되며, 일반 조직에의 노출은 최소화된다. 다중특이성 항체는 PAM4가 진단제 또는 치료제의 연속적인 특이적 전달에 대한 양성 종양을 선-표적화하는 AES 시스템에서 사용된다. 진단제 및 치료제는 펩타이드를 포함하는 히스타민 석시닐 글리실(HSG)에 의해 운반된다. 679(IgG1, K)로 명시된 마우스 단클론 항체는 트리-펩타이드 부분, HSG을 포함하는 분자에 높은 친화도로 결합한다(Morel et al, Molecular Immunology, 27, 995-1000, 1990). 679 MAb는 HSG 및 표적 항원과 결합하는 hPAM4와 이중특이성 항체를 형성한다. 또한, 합텐도 사용될 수 있다. 이러한 항체는 높은 친화도 및 원하는 위치에서의 오랜 잔존 시간을 갖게 하는 표적 항원에 선택적으로 결합한다. 또한, 비-항원 결합 디아바디는 체내에서 신속하게 제거되고 일반 조직에의 노출은 최소화된다. PAM4 항체 및 그의 단편 및 컨쥬게이트는 암과 같은 포유류 질병을 진단하고 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 진단 또는 치료를 위하여 진단제 또는 치료제를 표적에 전달하는 것은 진단제 또는 치료제를 가진 PAM4 항체 또는 그의 단편을 제공하는 것 및 항체를 필요에 따라 대상에 투여하는 것을 포함한다. 진단은 알려진 기술을 이용하여 결합된 단백질을 검출하는 단계를 더 포함한다.
이 명세서의 맥락에서, "진단" 또는 "검출"은 상호교환적으로 사용될 수 있다. 진단은 보통 조직의 특이적인 진단학의 상태를 정의할 때 언급하고, 검출은 특정한 항원을 포함하는 조직, 손상 또는 유기체를 인식하고 위치지정한다.
진단제 또는 치료제에 대한 본 발명의 항체 및 그들의 단편의 투입은 포유류에서 정맥 내, 동맥 내, 복막 내, 근육 내, 피하, 늑막 내, 포막 내, 국지적 도뇨관을 통한 관류 또는 직접적인 손상 내 주입을 의해서 영향을 받을 수 있다.
진단제 또는 치료제에 대한 항체는 약학적으로 수용가능한 주입 운반체, 바람직하게는 생리학적 pH 및 농도에서 파스페이트-버퍼드 살린(PBS)에서 인간 또는 포유류의 치료상 및 진단상 이용을 위한 키트(kit)로서 제공되어질 수 있다. 준비는, 특히 인간에게 사용될 것이 의도된다면, 살균되는 것이 바람직하다. 그러한 키트의 선택적인 구성물들은 안정화제, 버퍼, 라벨링 시약, 방사성아이소토프, 상자성체 구성물, 향상된 제거 및 편리한 세척을 위한 두번째 항체, 컬럼, 바이알 및 이와 동일한 종류의 것을 포함한다.
노출 항체 치료
노출 인간화된 완전한 인간 PAM4 항체 또는 그것들의 단편, 또는 PAM4 융합 단백질 또는 그것들의 단편의 치료상의 영향을 주는 양은 약학적으로 수용가능한 첨가물 내에서 정해질 수 있다. 노출 인간화된 완전한 인간 PAM4 항체들 및 그들의 단편들의 영향력은 또한 하나 이상의 노출 항체, 하나 이상의 인간화된 또는 완전한 인간 PAM4 항체들의 면역컨쥬게이트들과 함께 이 노출 항체들의 보충에 의해 향상될 수 있고, 약물, 독, 면역조절자, 호르몬, 올리고뉴클레오타이드, 호르몬 안타고니스트, 효소, 효소 제한자, 치료상 방사성핵종, 안지오제네시스 제한자, 기타 등등을 포함하는 하나 이상의 치료제와 결합할 수 있고, PAM4 항체 및 그것들의 단편들과 동시적으로 또는 순차적으로 또는 처방된 용법에 따라서 투여된다. 노출 PAM4 항체 및 그것들의 단편들을 보충할 수 있는 노출 항체들은 같은 종양 타입 또는 선택 노출 항체의 항종양 효과를 향상시키기 위해 사용될 수 있는 면역조절자 세포들(예: CD40+ 세포들)에 반하여 직접적이 될 수 있다.
PAM4 면역컨쥬게이트들
본 발명은 또한 치료 또는 진단을 위해 적어도 하나의 치료제 및/또는 진단/검출제와 결합하는 인간화된 인간 PAM4 항체들 및 그것들의 단편의 사용을 의도한다. 면역치료를 위하여, 목적은 비 표적 조직들에 대한 노출을 최소화하면서 표적 세포들에 방사능의 세포독성 투약량, 독, 또는 약물을 전달하는 것이다. 본 발명의 PAM4 항체들은 췌장 종양를 진단하고 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 어떤 항체들, 항체 융합 단백질들 및 그것들의 단편들은 하나 이상의 치료제 또는 진단/검출제와 결합 될 수 있다. 일반적으로 하나의 치료제 또는 진단/검출제는 각각의 항체들, 융합 단백질 또는 그것들의 단편과 붙지만 하나 이상의 치료제 또는 진단/검출제는 같은 항체 또는 항체 단편에 붙여질 수 있다. 만약 Fc 부위가 없다면 (예를들어 면역컨쥬게이트의 항체 구성물로서 사용된 항체가 항체 단편일때), 탄수화물의 한 부분을 항체 또는 항체 단편의 한 완전한 길이의 경쇄의 다양한 부위에 삽입하는 것이 가능한다. 예를 들어 참고문헌에 나와있는 Leung et al., J. Immunol. 154:5919(1995); Hansen et al., U.S.Patent No.5,443,953(1995), Leung et al., U.S. Patent No.6,254,868 를 보라. 공정된 탄수화물 부분은 치료제 또는 진단/검출제를 붙이는 데 사용된다.
항체 탄수화물 부분을 경유하여 펩타이드를 항체 구성물에 결합하는 방법들은 당 분야에서 잘 알려져있다. 예를 들어, 참고문헌에 나와있는 Shih et al., Int. J. Cancer 41:832 (1988);Shih et al., Int. J. Cancer 46:1101 (1990); 및 Shih et al.,U.S. Patent No.5,057,313,를 보라. 일반적인 방법은 적어도 하나의자유 아민 기능을 갖고 대량의 펩타이드에 장착되는 운반 폴리머와 산화된 탄수화물 부분을 갖는 항체 구성물과 반응하는 것을 포함한다. 이 반응은 최종 결합을 형성하는 두번째 아민의 환원에 의해 안정화되는 첫번째 치프(Schiff) 염기(이민) 연결을 야기한다.
본 발명의 항체 융합 단백질 및 그것들의 단편들은 두 개 이상의 항체 또는 그것들의 단편 및 적어도 하나의 치료제 또는 진단/검출제를 포함할 수 있는 이 융합 단백질을 구성하는 각 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체 융합 단백질은 하나의 항체(두개의 항원 결합 부위) 및 하나의 항체 단편, 두개의 항체 단편, 또는 두개의 항체들을 구성할 수 있다. 항체 융합 단백질은 적어도 하나의 치료제 또는 진단/검출제와 결합될 수 있다.
따라서, 하나 이상의 항체 융합 단백질의 항체들 또는 그것들의 단편들은 하나 이상의 붙은 치료제 또는 진단/검출제를 가질 수 있다. 나아가, 치료제는 같은 것일 필요는 없고, 예를 들어, 같은 융합 단백질에 약물 및 방사성아이소토프를 붙일 수 있는 것과 같이 다른 치료제일 수 있다. 특정하게, IgG는131I는 방사성 표시될 수 있고 약물에 부착될 수 있다.131I는 IgG의 티로신 및 IgG 라이신의 엡실론 아미노 그룹에 부착된 약물에 포함될 수 있다. 치료제 또는 진단/검출제는 또한 둘 다 환원된 SH 그룹 및 탄수화물 곁 사슬에 부착될 수 있다.
광범위하게 다양한 진단제 및 치료제는 동시에 혹은 순차적으로 투입될 수 있고, 이롭게는, 예를 들어, 약물, 독, 올리고뉴클레오타이드, 면역조절자, 호르몬, 호르몬 안타고니스트, 효소, 효소 방해자, 치료상 방사성핵종, 안지오제네시스 제한자 및 기타 등등과 같이, 본 발명의 항체들에 결합될 수 있다. 여기서 열거된 치료제는 또한 상기에 설명된 바와 같이 노출 항체와 분리적으로 투여를 위해 유용하다. 치료제는, 예를 들어, 빈카 알카로이드, 안트라사이클린, 젬사이터빈, 에피도필로톡신, 탁산, 안티메타볼라이트, 알킬레이팅 제제, 항생제, SN-38, COX-2 제한자, 안티키토틱, 안티아지오제닉 및 아포토토익 제제, 특정하게 독소루비신, 메소트레세이트, 텍솔, CPT-11, 캠토테칸 및 이것들의 다른 형태 및 항암제의 다른 분류들 및 이와 동일한 종류의 것과 같은 화학요법 약물들을 포함한다. 동시적이거나 순차적인 투여 또는 면역컨쥬게이트 및 항체 융합 단백질을 위한 다른 유용한 암 화학 치료 약물은 니트로젠 머스타드, 알킬 설포네이트, 니트로소레아스, 드리아젠, 폴릭 에시드 아날로그, COX-2 제한자, 피리미딘 아날로그, 퓨린 아날로그, 플라디늄 코디네이션 복합체, 호르면 및 이와 동일한 종류의 것을 포함한다. 적용가능한 화학 치료제는 REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,12th Ed.(Mack Publishing Co.1995), 및 GOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS,7th Ed.(MacMillan Publishing Co.1985) 뿐만 아니라 이 발행물들의 재발행된 편집본에도 설명되어있다. 실험적인 약물과 같은 다른 적용가능한 화학 치료제들은 당 분야에서 잘 알려져있다.
한 실시예에서 본 발명의 인간화된 PAM4 항체들 및 그것들의 단편은 젬시타빈과 결합된다. 다른 실시예에서는, 젬시타빈은 본 발명의 노출 혹은 결합된 인간화된 PAM4 항체 또는 그것의 단편 전에, 후에, 혹은 동시에 주어진다. 바람직하게는, 결합된 인간화된 PAM4 항체 혹은 항체 단편은 방사성핵종과 결합된다.
독은 동물, 식물 또는 미생물로부터 유래될 수 있다. 슈도모나스 엑소톡신과 같은 독은 또한 본 발명의 PAM4 및 hPAM4 항체들의 면역컨쥬게이트의 치료제 부분을 형성하거나 그것들과 복합체를 이룰 수 있다. 그러한 컨쥬게이트들 또는 다른 융합 단백질의 준비에서 적합하게 사용되는 다른 독은 리신, 아브린, 리보뉴클리에이즈(RNase),DNase Ⅰ,스타필로코칼 엔터로톡신-에이, 포키위드 항바이버스 단백질, 겔로닌, 디프테린 톡신, 슈도모나스 엑소톡신, 및 슈도모나스 엔도톡신, 예를 들어. Pastan et al., Cell 47:641(1986), 및 Goldenberg, CA-A Cancer Journal for Clinicians 44:43(1994)을 보라. 본 발명에서 사용하는 데 적합한 부가적인 독들은 당 분야에서 잘 알려져 있고 참고문헌에 의한 그것의 전체 속에서 포함되어 있는 미국특허 6,077,499안에 명시되어 있다.
사이토키닌과 같은 면역조절자는 또한 PAM4 및 hPAM4 면역컨쥬게이트의 치료제 부분을 형성하거나 혹은 그것에 결합될 수 있거나 인간화되거나 인간 PAM4 항체 혹은 그것의 단편 또는 본 발명의 PAM4 융합 단백질 또는 그것의 단편에 결합되지는 않고 투여될 수 있다. PAM4 융합 단백질 또는 그것의 단편은 다른 항원에 결합하는 하나 이상의 항체 혹은 그것의 단편을 포함한다. 예를 들어, 융합 단백질은 세포나 인자의 면역조절뿐만 아니라 PAM4 항원과 결합할 수 있다. 대안적으로, 대상물은 노출 PAM4 항체의 투여 전에, 동시에, 혹은 후에 투여될 수 있는 노출 PAM4 항체, 융합 단백질 혹은 그것의 단편 및 분리적으로 투여된 사이토킨을 받을 수 있다. 여기서 사용된 바와 같이, 용어 "면역조절자"는 사이토킨, 줄기 세포 성장 인자, 종양 네크로시스 인자(TNF)와 같은 림포톡신, 인터류킨(예: 인터류킨-1(IL-1),IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12 및 IL-18, IL-21), 콜로니 스티뮬레이팅 인자(예: 그래뉴로사이트-콜로니 스티큘레이팅 인자(G-CSF) 및 글래뉴로사이트 매크로페이지-콜로니 스티뮬레이팅 인자(GM-CSF),인터페론(예: 인터페론-α,-β 및 -γ), "S1 인자"를 디자인하는 줄기 세포 성장 인자, 에리트로포이에틴 및 소롬보포이에틴과 같은 헤마토포이어틱 인자를 포함한다. 적합한 면역조절자 부분들의 예는 IL-2, IL-6, IL-10, IL-12 및 IL-18, IL-21, 인터페론-γ,TNF-α 및 이와 동일한 종류의 것을 포함한다.
대안적으로, 본 발명의 항체 및 단편들은 효소에 항체를 연결함으로써 검출할수 있게 라벨링 될 수 있다. 항체-효소 컨쥬게이트가 적절한 기질의 존재하에서 배양될 때, 효소 부분은 예를 들어, 스펙트로포토메트릭, 플루오로메틱 또는 시각적인 수단에 의해 검출될 수 있는 화학적 부분을 생산하는 기질과 함께 반응한다. 검출할 수 있게 항체를 표시하는데 사용될 수 있는 효소의 예들은 말레이트 디 하이드로케네이즈, 스탭필로코칼 디사이드로제네이즈, 드리오즈 파스페이트 아이소머러레이즈, 호르세라디시 페르옥사이데이즈, 알카라인 파스페이트, 아파라기네이즈, 글루코오즈 옥시데이즈, 베타-칼락토사이데이즈, 리보누클리에이즈, 유리에이즈, 카타레이즈, 글루코오스-6-파스페이트 디하이드로제네이즈, 글루코아밀레이즈 및 아세틸크로린에스에레이즈를 포함한다.
치료제 또는 진단/검출제는 다이설파이드 결합 형성을 경유해서 환원된 항체 구성물의 힌지 부위에 부착될 수 있다. 대안으로써, 이러한 제제들이 N-석시닐3-(2-피리딜디티오)프로프리오네이트(SPDP)와 같은 헤테로디퍽셔널 교차-연결자를 사용하는 항체 구성물에 부착될 수 있다. Yu et al.,Int.J.Cancer 56:244(1994). 그러한 결합을 위한 일반적인 기술은 당 분야에서 잘 알려져있다. 예를 들어, Wong,CHEMISTR OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LIKING(CRC Press1991); Upeslacis et al.,"Modification of Antibodies by Chemical Methods" in MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS,Brich et al.(eds.)pages 187-230(Wiley-Liss,Inc.1995)Prise,"Producion and Charaterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGEINEERING AND CLINICAL APPLICATION,Ritter et al.(eds.)pages 60-84(Campridge University Press 1995). 대안적으로 치료제 또는 진단/검출제는 항체의 Fc 부위에서 탄수화물 부분을 경유해서 결합될 수 있다. 탄수화물 그룹은 사이올 그룹에 연결된 같은 제제의 장착을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어, 표적화할 수 있는 구조는 감염된 조직을 검출하는데 유용한 하나 이상의 방사능 아이소토프를 포함한다. 특정하게 유용한 진단상 방사성핵종은, 제한적이지는 않지만, 바람직하게는 20 내지 4,000keV 범위에서, 더 바람직하게는 25 내지 4,000keV 에서, 좀 더 바람직하게는 10 내지 1,000keV 범위에서, 더욱 바람직하게는 70 내지 700keV 범위에서 붕괴에너지를 갖는110In,111In,177Lu,18F,52Fe,62Cu,64Cu,67Cu,67Ga,68GA,86Y,90Y,89Zr,94mTc,94Tc,99mTc,120I,123I,124I,125I,131I,154-158Gd,32P,11C,13N,15O,186Re,188Re,51Mn,52mMn,55Co,72As,75Br,76Br,82mRb,83Sr 또는 다른 감마-. 베타-, 또는 양전자-방사체들을 포함한다. 유용한 양전자 이미팅 방사성핵종의 총 붕괴에너지는 바람직하는게 <2,000keV, 더 바람직하게는 1,000keV이하이고, 더욱 바람직하게는 <700keV 이다. 감마선 검출을 이용하는 진단/검출제로서 유용한 방사성 핵종은, 제한적이지는 않지만, 다음을 포함한다:51Cr,57Co,58Co,59Fe,67Cu,67Ga,75Se,97Ru,99mTc,111In,114mIn,123I,125I,131I,169Yb,197Hg 및201Tl. 방사성핵종을 방사하는데 유용한 감마선의 붕괴에너지는 바람직하게는 20-2000keV, 더 바람직하게는 60-600keV이고 가장 바람직하게는 100-300keV이다.
본 발명의 방법에 있어, 표적화할 수 있는 구조는 감염된 조직을 치료하는데 유용한 하나이상의 방사능 아이소토프을 포함할 수있다. 특정하게 유용한 치료상 방사성핵종은, 제한적이지는 않지만,111In,177Lu,212Bi,213Bi,211At,62Cu,64Cu,67Cu,90Y,125I,131I,32P,33P,47Sc,111Ag,67Ga,142Pr,153Sm,161Tb,166Dy,166Ho,186Re,189Re,212Rb,223Ra,225Ac,59Fe,75As,89Sr,99Mo,105Pd,143Pr,149Pm,169Er,194Ir,198Au,199Au 및211Pb를 포함한다. 치료상 방사성핵종은 바람직하게는 20 내지 6,000keV 범위에서, 아우거 방사체에서는 60 내지 200keV 범위에서, 베타-방사체에서는 100-2,500keV에서, 알파 방사체에서는 4,000 내지 6,000keV에서 바람직하게 붕괴에너지를 갖는다. 예를 들어, Co-58,Ga-67, Br-80m, Tc-99m, Rh-103m, Pt-109,In-111, Sb-119, I-125, Ho-161, Os-189m 및 Ir-192. 베타 입자 방사 뉴클라이드에 유용한 붕괴 에너지는 바람직하게는 <1,000keV, 더욱 바람직하게는 <100keV, 가장 바람직하게는 <70keV이다. 또한 알파 입자의 발생과 함께 충분히 붕괴하는 방사성핵종이 바람직하다. 그러한 방사성핵종은 제한적이지는 않지만 다음을 포함한다. Dy-152, At-211, Bi-212, Ra-223, Rn-219, Po-215, Bi-211, Ac-225, Fr-221, At-217, Bi-213 및 Fm225. 유용한 알파-입자-방사 방사성핵종의 붕괴에너지는 바람직하게는 2,000 내지 10,000keV, 더 바람직하게는 3,000 내지 8,000keV, 가장 바람직하게는 4,000-7,000keV이다.
예를 들어, 그것의 61.5 반감기 및 풍부한 베타 입자 및 감마선의 공급때문에 방사성면역치료를 위한 하나 이상의 방사성아이소토프를 약속하는것으로 여겨지는67Cu는 킬레이팅 제제, p-브로모아세타미도-벤질-테트라에틸아민에테트라아세틱 산(TETA)을 사용하는 PAM4 항체에 연결될 수 있다. Chase, Supra. 대안적으로 에너제틱 베타 입자를 방사하는90Y는 디에틸렌에트리아민에펜타아세틱 산(DTPA)을 사용하는 PAM4 항체, 융합 단백질 또는 그것의 단편과 연결될 수 있다,
부가적이고 잠재적인 방사성 아이소토프는11C,13N,15O,75Br,198Au,224Ac,126I,133I,77Br,113mIn,95Ru,103Ru,105Ru,107Hg,203Hg,121mTe,125mTe,165Tm,167Tm,168Tm,197Pt,109Pd,105Rh,142Pr,143Pr,161Tb,166ho,199Au,57Co,58Co,51Cr,59Fe,75Se,201Tl,225Ac,76Br,169Tb, 및 이와 동일한 종류의 것을 포함한다.
다른 실시예에서 방사성증감제는 본 발명의 노출 혹은 연결된 PAM4 항체 또는 항체 단편과 조합에서 사용될 수 있다. 예를 들어 방사성증감제는 방사성 표시된 PAM4 항체 또는 항체 단편과의 조함에서 사용될 수 있다. 방사성 증감제의 첨가는 방사성 표시된 단독 항체 또는 항체 단편과 치료와 비교했을 때 증가된 영향력을 낳을 수 있다. 방사성 증감제는 여기서 참고문헌에 의해 그것의 전체가 포함되어 있는 D.M. GOldenberg(ed.),CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, CRC Press(1995)에 설명되어있다.
더멀 중성자 활성 요법을 위한 붕소 가수-부착 운반체를 가지고 있는 본 발명의 PAM4 항체 및 그것의 단편 또는 PAM4 융합 단백질 또는 그것의 단편은 일반적으로 같은 방법으로 영향 받을 것이다. 그러나 중성자 방사가 행해지기 전에 비-표적화된 PAM4 면역 컨쥬게이트이 사라질 때까지 기다리는 것이 이롭다. 제거는 PAM4 항체에 결합된 항체를 사용함으로써 가속화될 수 있다. 이 일반적인 법칙의 설명을 위해서는 미국 특허 제4,624,846호를 보라. 예를 들어, 카보레인과 같은 붕소 가수는 PAM4 항체에 부착되어 질 수 있다. 카보레인은 당 분야에서 잘 알려진 바와 같이 펜단트 곁 사슬의 카복실 기와 함께 준비되어질 수 있다. 아미노덱세이션과 같은 운반체에 카보레인의 부착은 운반체위의 아민과 중합 및 카보레인의 카복실 그룹의 활성에 의해 도달되어질 수 있다. 중간체 결합은 그 뒤 PAM4 항체에 연결된다. PAM4 항체 결합의 투여 후에, 붕소 가수는 더멀 중성자 방사에 의해 활성화되고 높은 독성과 짧은 범위의 효과를 생산하는 알파-방사에 의해 붕괴하는 방사성 원자로 전환된다.
더 나아가, 본 발명은 대상에서 암 진단 방법을 포함한다. 진단은 약학적으로 적합한 부형제로 제형된 진단상 결합의 진단상으로 효과가 있는 양의 투여 및 상기 식별을 검출함으로 인해 도달될 수 있다.
PAM4 항체, 융합 단백질 및 그것의 단편들은 진단/검침제와 결합할 수 있고 진단/검침제의 투여 전에, 동시에 혹은 후에 결합하지 않은 상태에서 진단/검침제와 투여될 수 있다. 진단/검침제로서 사용될 수 있는 방사능 제제들은 상기에 기술되어있다. 적합한 비 방사성 진단/검침제는 자기 공명 영상, 엑스레이, 컴퓨터 단층촬영 혹은 초음파에 적합한 조영제이다. 자기 영상 제제는 본 발명의 항체와 함께 쓰일 때 예를 들어, 2-benzyl-DTPA 및 그것의 모노메틸 및 사이클로헥실 아나로그를 포함하는 금속-킬레이트 조합들과 복합체를 이루는 망간, 철, 및 가돌리늄과 같은 비 방사성 금속을 포함한다. 참고 문헌에 나와있는 2001년 10월 10일에 제출된 U.S. Serial No.09/921,290을 보라.
본 발명에서 의도된 MRI 조영제와 같은 조영제는 예를 들어, 가돌리늄 이온, 란탄늄 이온, 디스프로시움 이온, 철 이온, 망간 이온 또는 본 발명에서 사용되는데 적합한 다른 비교할 수 있는 식별, CT 조영제 및 초음파 조영제를 포함한다.
본 발명에 적합한 상자성체 이온들은 특정하게 선호되는 가돌늄(Ⅲ)과 함께 크로미움(Ⅲ),망간(Ⅱ), 철(Ⅲ), 철(Ⅱ), 코발트(Ⅱ), 니켈(Ⅱ), 구리(Ⅱ), 네오디미움(Ⅲ), 삼마리움(Ⅲ), 이테르븀(Ⅲ), 가돌늄(Ⅲ), 반나디움(Ⅱ), 테르븀(Ⅲ),다이스포로슘(Ⅲ), 홀뮴(Ⅲ), 및 에르븀(Ⅲ)을 포함한다.
엑스레이 영상과 같은 다른 맥락에서 유용한 철들은 이에 제한적이지는 않지만 란탄늄(Ⅲ), 금(Ⅲ), 납(Ⅱ) 및 특별히 창연(Ⅲ)을 포함한다. 형광 라벨은 로다민, 플루오레세인 및 레노그래핀을 포함한다. 로다민 및 플루오레세이은 종종 아이소사이오사이네이트 중간체를 경유하여 연결된다.
금속은 또한 자기 공명 영상 기술을 위한 것들을 포함하는 진단/검침제에서 유용하다. 이 금속들은, 제한적이지는 않지만 다음을 포함한다: 가돌리늄, 망간, 철, 크로늄, 구리, 코발트, 니켈, 다이스프로슘, 레늄, 에우로퓸, 테르븀, 홀뮴, 및 네오다뮴. 항체 구성물을 방사성 금속 혹은 상자성체 이온에 부착하기 위해서는, 이온과 결합하기 위한 킬레이팅 그룹의 다중체에 붙여지는 긴 꼬리를 갖고 있는 시약과 반응하게 하는 것이 필요할 수 있다. 그러한 꼬리는 폴리라이신, 폴리사카라이드 또는 예를 들어 에틸렌디아민에테드라아세틱 산(EDTA), 디에틸렌에트리아민펜타아세틱 산(DTPA), 포피린, 폴리아민, 크라운 에테르, 비스사시오세미카르바존, 폴리옥심, 및 이 목적에 유용한 것으로 알려진 다른 그룹들과 같이 킬레이팅 그룹과 결합할 수 있는 펜단트 그룹을 갖고 있는 유도된 또는 유도될 수 있는 사슬일 수 있다. 킬레이트들은 표준 화학에서 사용되는 PAM4 항체, 융합 단백질 또는 그것의 단편들과 연결된다. 킬레이트는 일반적으로 최소한의 면역활성 손실 및 최소 집합 및/또는 내 교차 연결과 함께 분자 결합의 형성을 가능하게 하는 그룹에 의해 항체에 연결된다. 다른, 더 일반적으로, 항체에 킬레이트를 결합시키는 방법들 및 시약은 미국 특허 제4,824,659호, Hawthorne,1989년 4월2일에 발행된"Antibody Conjugates"에 나와있고 참고문헌에 명시되어 있다. 특정하게 유용한 금속-킬레이트 조합은 20 내지 2,000keV의 일반적인 에너지 범위에서 진단상의 아이소토프와 사용되는 2-벤질-DTPA 및 그것의 모노메틸 및 사이클로헥실 아날로그를 포함한다. 본 발명의 항체와 함께 사용되었을 때, 망간, 철 및 가돌륨과 같은,비 방사성 금속과 연결되어있는, 같은 킬레이트들은 MRI에 유용하다. NOTA, DOTA, 및 TETA와 같은 매크로사이클릭 킬레이트들은 금속 및 방사성금속의 다양함 및 가장 특정하게 갈륨, 이트륨 및 구리 각각과 사용될 수 있다. 그러한 금속-킬레이트 복합체들은 흥미있는 금속의 환 크기를 재단함으로써 매우 안정하게 만들어질 수 있다. 매크로사이클릭 폴리에테르와 같은, RAIT를 위한223Ra와 같은 안정적으로 뉴클라이드와 다른 환-형태 킬레이트는 본 발명에 의해 포함된다.
방사선 불투과성 및 대조 금속은 엑스레이 및 컴퓨트 단층촬영을 향상시키는데 사용되고 이오딘 화합물, 바륨 화합물, 갈륨 화합물, 탈륨 화학물 및 기타 등등을 포함한다. 특이한 화합물은 바륨, 다이아트리조에이트, 에사이오다이즈드 오일, 갈륨 키프레이트, 아이오칼믹 산, 아이세타믹 산, 아이오다마이드, 아이오다파미드, 아이도자믹 산, 아이글루마이드, 아이오헥솔, 아이오파미돌, 아이오파노익 산, 아이오프로세킥 산, 아이세파믹 산, 아이세릭 산, 아이술아마이드 에클루민, 아이세메틱 산, 아이오타술, 아이테트릭 산, 아이사라믹 산, 아이트록식 산, 아이자그릭 산, 아이조트리조익 산 아이포데이트, 메클루민, 메트리자마이드, 메트리조에이트, 프로필리오돈 및 잘로우스 클로라이드를 포함한다.
본 발명의 항체, 융합 단백질, 및 그것들의 단편은 또한 형광 화합물과 식별 표시될 수 있다. 형광 표시된 MAb의 존재는 항체를 적절한 파장의 빛에 노출시키고 결과 형광을 검출함으로써 검출되어진다. 형광 표시 화합물은 플루오레세이 아이소다이오사이네이트, 오다민, 피코에리데린, 피코사이아닌, 알로피코사이아닌, o-프탈알데하이드 및 플루오레스아민을 포함한다. 형광 표시된 항체들은 순환 사이토메트리 분석에 특정적으로 유용하다.
대안적으로, 본 발명의 항체들, 융합 단백질 및 그것의 단편들은 화학발광 화합물에 항체를 연결함으로써 검출할 수 있게 표시될 수 있다. 화학 발광 표식이 붙은 MAb의 존재는 화학 반응의 진행 동안에 일어나는 발광의 존재를 검출함으로써 정의된다. 화학발광 표시 화합물의 예들은 루미놀, 아이소루미놀, 아로마틱 아크리디윰 에스터, 이미다졸, 아크리디윰 염 및 옥살레이트 에스터를 포함한다.
비슷하게, 생물 발광 화합물은 본 발명에서 항체들 및 그것들의 단편을 표시할때 사용될 수 있다. 생물발광은 화학발광 반응의 효율을 증가시키는 촉매 단백질인 생물학적 체계에서 찾아지는 화학발광의 한 형태이다. 생물발광 단백질의 존재는 발광의 존재를 검출함으로써 정의된다. 표식을 위해 유용한 생물발광 화합물은 루시페린, 루시페레이즈 및 아에쿼오린을 포함한다.
따라서, 대상에서 악성종양을 진단하는 방법은 노출 PAM4 MAb 및 그것의 단편들 또는 노출 항체 융합 단백질 또는 그것들의 단편을 포함하는 조성과 함께 대상으로부터의 표본(액체, 조직, 또는 세포)을 시험관 진단 분석을 행하는 것을 포함하여 설명된다. 면역조직화학은 세포 또는 조직에서 PAM4의 존재를 검출하는 데사용될 수 있다. 바람직하게는, 진단되는 악성종양은 암이다. 더 바람직하게는 암은 췌장 암이다.
게다가, DTPA, DOTA, TETA 또는 NOTA 와 같은 킬레이터 또는 검출 가능한 식별을 위해 적합한 단백질, 형광 분자 또는 세포독성 제제, 중금속 또는 방사성핵종과 결합될 수 있다. 예를 들어, 치료상 유용한 면역컨쥬게이트은 항체 융합 단백질에 광활성 제제 또는 염료를 결합함으로써 얻어질 수 있다. 플루오로크롬 및 다른 크로모젠과 같은 형광 조성물 또는 가시광선에 반응하는 포피린과 같은 염료들은 손상에 적합한 빛을 검출함으로써 손상을 검출하고 치료하는데 사용되어 왔다. 치료요법에서, 이것은 광방사능, 광요법, 또는 광역학적인 요법으로 정의되어져 왔다.(Jori et al.(eds.),PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMOR AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985);idem, Cancer Res. 45:4380(1985); Oseroff et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:8744(1986); idem., Phtochem.Photobiol. 46:83(1987); Hasan et al.,Prog. Clin.Biol.Res.288:471(1989); Tatsuta et al., Lasers Surg.Med.9:422(1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529(1991). 그러나 이 선행 연구들은 내시경 요법의 적용의 사용, 특히 항체 단편 또는 하위단편의 사용을 포함하고 있지 않다. 따라서 본 발명은 광활성 제제 또는 염료를 포함하는 면역결합의 치료상 이용을 의도한다.
치료의 목적을 위하여, 본 발명의 PAM4 항체들 및 그것들의 조각들은 치료상으로 효과가 있는 양에서 환자에게 투여된다. 만약 투여된 양이 생리학적으로 뚜렷하다면 제제는 "치료상으로 효과가 있는 양"으로 투여된것으로 말해진다. 만약 그것의 존재가 수용하는 환자의 생리에 검출될만한 변화를 야기한다면 제제는 생리학적으로 뚜렸하다.
진단/검출제는 예를 들어 항체 또는 항체 단편과 같은 항체의 일부분 또는 하위단편, 융합단백질 및 그것의 조각과 결합하여 투여될 수 있는 분자 또는 원자이고 병과 연관된 항원을 함유하는 세포를 위치지정함으로써 병의 진단/검출에 유용하다. 유용한 진단/검출제는 제한적이지는 않지만 방사성아이소토프, 염료(비오틴-스트렙타비딘 복합체와 같은), 방사선 불투과성 물질(예: 이오딘, 바륨, 갈륨, 및 타륨 화합물 및 이와 동일한 종류의 것), 조영제, 형광 화합물 또는 분자들 및 자기 공명 영상(MRI)를 위한 증가제(예: 상자성체 이온)를 포함한다. 미국특허 제6,331,175호에는 MRI 기술 및 MRI 증가제에 결합하는 항체의 준비가 기술되어 있고 그것의 전체는 참고 문헌에 나와있다. 바람직하게는 진단/검출제는 핵 영상을 위한 방사성아이소토프, 내시경 및 동맥내 검출, 자기 공명 영상의 사용을 위한 증가제 또는 울트라소노그래피(ultrasonography), 엑스레이 및 컴퓨트 단층촬영을 위한 방사성 불투과성 및 조영제, 및 내시경 형광투시법을 포함하는 형광투시를 위한 형광화합물로 이루어진 군에서 선택되어 진다. 형광 및 방사성 제제는 항체에 결합하거나 이종특이성, 예비표적화 방법에 사용되거나 특정하게 감마-,베타-, 및 양전자-방출과 함께Goldenberg U.S.Pat.Nos.5,716,595,6,096,289 및 U.S.Application No.09/348,818에 기술되어 있는 것과 같이 악성 종양과 같은 감염된 조직 또는 세포 무리와 연관된 표적화된 항원의 내시경 내, 외과수술 중 또는 혈관내의 검출에 특정하게 유용하다. 내시경적 적용은 콜론(colon)과 같이 내시경을 허용하는 구조가 퍼져있을 때 사용될 수 있다. 양전자 방출 단층촬영을 위해 유용한 방사성핵종은, 제한적이지는 않지만 다음을 포함한다: F-18,Mn-51,Mn-52m,Fe-52,Co-55,Cu-62,Cu-64,Ga-68,As-72,Br-75,Br-76,Rb-82m,Sr-83,Y-86,Zr-89,Tc-94m,In-110,I-120 및 I-124. 유용한 양전자 방사 총 붕괴에너지는 바람직하게는 <2,000keV, 더 바람직하게는 1000keV이하, 가장 바람직하게는 <700keV이다. 감마선 검출을 사용하는 진단/검출제로서 유용한 방서성핵종은 제한적이지는 않지만 다음을 포함한다: Cr-51,Co-57,Co-58,Fe-59,Cu-67,Ga-67,Se-75,Ru-97,Tc-99m,In-111,In-114m,I123,I-125,I-131,Yb-169,Hg-197, 및 Tl-201. 방사성핵종을 방사하는 유용한 감마선의 붕괴에너지는 바람직하게는 20-2000keV, 더 바람직하게는 60-600keV, 가장 바람직하게는 100-300keV이다.
생체 밖 진단
본 발명은 PAM4 항원의 존재를 위한 생체 밖 생물학적인 표본을 스크린(screen)하기 위해 PAN4 융합 단백질 빛 그것의 단편을 포함하는 PAM4 항체의 사용을 의도한다. 그러한 면역분석에 있어, PAM4 항체, 융합 단백질, 또는 그것의 단편은 하기에 설명된 것과 같이 액체상에서 이용될 수 있거나 고체상 운반체에 결합될 수 있다. 바람직한 실시예에서, PAM4 항체 또는 그것의 단편은 인간화된다. 또한 바람직하게 PAM4 항체 및 그것의 단편은 완전히 인간의 것이다. 더 바람직하게는 PAM4 융합 단백질은 인간화된 혹은 완전한 인간 PAM4 항체로 구성된다.
생물학적 표본이 PAM4 항원을 가지고 있는지를 판단하기 위한 스크리닝(screening) 방법의 한 예는 방사성면역분석(RIA)이다. 예를 들어, RIA의 한 형태에서 실험하에 기질은 방사성 표시된 PAM4 항원의 존재에서 PAM4 항원 MAb와 혼합된다. 이 방법에서, 실험 기질의 농도는 MAb에 결합된 표시된 PAM4 항원의 양에 반비례하고 유리, 표시된 PAM4의 양에 직접적으로 연관이 있다. 다른 적합한 스크리닝(screening) 방법은 당 분야에서 쉽게 명백해질 것이다.
대안적으로, 생체 밖 분석은 PAM4 항체, 융합 단백질 또는 그것의 단편이 고체상 운반체와 결합되면서 행해질 수 있다. 예를 들어, MAb는 중합체 코티드 비드(polymer coated-bead), 플레이트, 또는 튜브와 같은 불용성 지지체에 MAb를 연결하기 위하여 아미노덱스트란과 같은 중합체에 부착되어질 수 있다.
다른 적합한 생체 밖 분석은 당 분야에서 쉽게 명백해질 것이다. 다른 분석 조건들 뿐만 아니라, 검출가능하게 표시된 PAM4 항체 및 PAM4항원의 특이적인 배양 농도, 온도, 및 시간은 표본, 표본의 자연상태, 이와 동일한 종류의 것에서 PAM4 항원의 농도를 포함하는 다양한 인자에 의존하여 다양해질 수 있다.PAM4 항체의 표본의 결합 활성은 잘 알려진 방법에 따라 정의될 수 있다. 당 분야의 기술은 정해진 실험을 행함으로써 각 결정을 위해 효력이 있는 최선의 분석 조건을 정할 수 있다.
워싱(washing), 스터링(stirring), 쉐이킹(shaking), 필터링(filtering) 및 이와 동일한 종류의 것은 특정한 상황에 관례적으로 또는 필요함에 따라 분석에 더하여 질 수 있다.
생물학적 표본에서 PAM4 항원의 존재는 효소-결합 면역흡착제 분석(ELISA)를 사용하여 정해질 수 있다. 직접적인 경쟁 ELISA에서, 순수한 또는 반순수한 항원의준비는 시험되고 있는 유액 또는 세포의 추출물에 불용성인 고체 지지체에 결합되고 고체상 항원과 표시된 항체 사이에서 형성된 이중 복합체의 검출 및/또는 양의 평가를 허용하기 위하여 검출 가능하게 표시된 가용성 항체의 양이 더해진다.
대조적으로, "양-부위(two-site)ELISA" 또는 "샌드위치 분석(sandwich assay)"라고 알려진 "이중-결정소(double-determinant)" ELISA는 적은 양의 항원을 필요로 하고 분석은 항원의 과도한 정제를 필요로 하지 않는다. 따라서 이중-결정소 ELISA는 임상 표본에서 항원의 검출을 위한 직접적인 경쟁 ELISA에 선호된다. 예를 들어 비옵시(biopsy) 견본에서 c-myc 종양단백질의 양의 평가를 위한 이중-결정소 ELISA의 사용을 보라. Field et al., Oncogene 4:1463(1989);Spandidos et al.,AntiCnacer Res.9:821(1989).
이중-결정소 ELISA에서, 표시되지 않은 MAb 또는 항체 단편("포획 항체")의 양은 고체 지지체에 결합되고 시험 표본은 포획 항체와 접촉에 데려와지고, 검출가능하게 표시된 가용성 항체의 양은 포획 항체, 항원 및 표시된 항체 사이에서 형성된 삼중 복합체의 검출 및/또는 양의 평가를 허용하기 위해 더해진다. 항체 단편은 F(ab')2, F(ab)2, Fab 및 이와 동일한 종류의 것과 같은 항체의 부분이다. 본 발명의 맥락에서, 항체 단편은 PAM4 항원의 한 아이소포트(isotope)에 결합하는 PAM4 MAb의 부분이다. 용어 "항체 단편"은 또한 복합체를 형성하기 위해 특이한 항원과 결합함으로써 항체와 같이 작용하는 합성의 또는 유전적으로 공정된 어떤 단박질을 포함한다. 예를 들어, 항체 단편들은 경쇄의 다양한 부위로 구성된 분리된 단편들,중쇄 및 경쇄의 다양한 부위들로 구성된 "Fv" 단편들, 및 경쇄와 중쇄의 다양한 부위들의 펩타이트 연결자에 의해 연결되어 있을 때 재조합 단일 사슬 폴리펩타이드 분자들을 포함한다. 항체 융합 단백질은 같거나 다른 특이성과 함께 두개 이상의 같거나 다른 단일 사슬 항체 또는 항체 단편 부분을 갖는 항원 결합 분자를 재조합적으로 생산한다. 융합단백질은 단일 항체 구성물, 다른 항체 구성물의 다가 또는 다중특이성 조합, 또는 같은 항체 구성물의 다중 복사를 포함한다. 융합 단백질은 부가적으로 진단/검출제 및/또는 치료제에 결합하는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 용어 PAM4 항체는 인간화된, 인간 및 마우스의 항체, 그것의 항체 단편들, 면역컨쥬게이트 및 그것의 단편들 및 항체 융합 단백질 및 그것의 단편들을 포함한다.
이중-결정소 ELISA를 행하는 방법은 잘 알려져있다. 예를 들어 Field et al., Supra, Spandidos et al., supra 및 Moore et al.,"Twin-Site ELISAs for fas and myc Oncoproteins Using the AMPAK System," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,VOL.10,pages 273-281(The Humana Press,Inc.1992)를 보라.
이중-결정소 ELISA에서, 가용성 항체 또는 항체 단편은 포획 항체에 의해 인식되는 에피토프(epitope)으로부터 분리된 PAM4 에피토프와 결합해야만 한다. 이중-결정소 ELISA는 PAM4 항원이 생체 검사 표본에서 존재하는지를 확인하기 위해 행해질 수 있다. 대안적으로 분석은 체액의 임상 표본에서 존재하는 PAM4 항원의 양을 평가하기 위해 행해질 수 있다. 양을 평가하는 분석은 정제된 PAM4 항원의 희석을 포함함으로써 행해질 수 있다.
본 발명의 PAM4 맵(Mab), 융합 단백질 및 그것의 단편들은 또한 분석 키트(kit)의준비를 위해 적합하다. 그러한 키트는 엄중한 감금 상태에서 바이알(vial), 튜브 및 이와 동일한 종류의 것과 같은 하나 이상의 용기 수단, 상기 각 용기 수단은 면역 분석의 분리된 요소를 포함함을 뜻하고,을 받기 위해 분류된 운반 수단을 포함한다.
예를 들어, 고체상 지지체에 고정화된 포획 항체를 포함하는 용기 수단 및 용액에서 검출 가능하게 표시된 항체를 포함하는 다른 용기 수단이 있을 수 있다. 다른 용기 수단은 PAM4 항원의 연속 희석을 포함하는 표준 용액을 포함할 수 있다. PAM4 항원의 표준 용액은 가로축에 PAM4 항원 농도를 나타내고 세로축에는 검출 신호를 나타내면서 표준 곡선을 준비하는데 사용될 수 있다. 결과는 생물학적 표본에서 PAM4 항원의 농도를 주기 위한 그러한 플롯(plot)으로부터 삽입될 수 있는 PAM4 항원을 포함하는 표본으로부터 얻어진다.
본 발명의 PAM4 항체, 융합 단백질, 및 그것의 단편들은 또한 조직학적인 부분으로부터 준비된 조직 부분에서 PAM4 항원의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 그러한 원 위치 검출은 시험받는 조직에서 PAM4 항원의 존재를 결정하고 PAM4 항원의 분할을 결정하는데 사용될 수 있다. 원위치 검출은 검출 가능하게 표시된 PAM4 항체를 얼린 조직 부분에 적용함으로써 이루어질 수 있다. 연구들은 PAM4 항원이 파라핀-삽입(paraffin-embedded) 부분에서 보존된다는 것을 가리킨다. 원위치 검출의 일반적인 기술들은 당 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application" in MAMMALIAN DEVELOPMENT:APRACTICAL APPROACH 113-38 Monk(ed.)(IRL Press 1987), alc Coligan at pages 5.8.1-5.8.8.
PAM4 항체, 융합 단백질, 및 그것의 단편들은 검출 가능하게 ,예를 들어, 방사성아이소토프, 효소, 형광 라벨, 염료, 색원체, 화학 발광 라벨, 생물발광 라벨 또는 상자성체 라벨과 같은 어떤 적절한 표지 부분과 함께 표시될 수 있다. 그러한 검출가능하게 표시된 PAM4 항체를 만들고 검출하는 방법은 당 분야에서 일반적인 기술로 잘 알려져 있고, 하기에 더 자세하게 설명되어 있다.
표지 부분은 감마 카운터(counter) 또는 신틸레이션(scintillation) 카운터의 사용과 같은 방법에 의해 또는 자동방사성촬영법에 의해 검출되어지는 방사성아이소토프가 될 수 있다. 바람직한 실시예에서는, 진단 결합은 감마-, 베타- 또는 양전자-방사 아이소토프이다. 본 발명의 설명에서 표지 부분은 예비 검출된 조건하에 신호를 유발할 분자를 말한다. 표지 부분들의 에는 방사성아이소토프, 효소, 발광 라벨, 화학발광 라벨, 생물발광 라벨 및 상자성체 라벨을 포함한다. 여기서 사용된 것과 같이 진단제 또는 치료제는 진단 및 치료에 유용한 결합을 생산할수 있는 항체 일부분과 결합하는 분자 또는 원자이다. 진단제 또는 치료제의 예들은 약물, 독, 올리고뉴클레오타이드, 면역조절자, 사이토키닌, 호르몬, 호르몬 안카고니스트, 효소, 효소 조절자, 아이소토프, 다른 항체, 킬레이터, 염료, 색원체, 붕소 화합물 및 표지 부분을 포함한다.
한 실시예에서, 그것의 전체가 참고문헌에 나타나있는 미국특허 제5,734,033호(Reed)에 기재되어있는 bcl2 발현을 제한하는 안티센스 분자와 같은 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 면역컨쥬게이트 또는 항체 융합단백질의 치료제 부분과 결합되거나 형성할 수 있다. 대안적으로, 올리고뉴클레오타이드는 본 발명의 노출 혹은 결합된 PAM4 항체 또는 항체 단편과 동시에 혹은 순차적으로 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 올리고뉴클레오타이드는 바람직하게는 bcl-2와 같이 B-세포 악성 종양의 종양유전자 또는 종양유전자 산물에 직접적으로 대항하는 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오타이드이다.
본 발명에 따라 고용될 수 있는 다른 적합한 라벨은 당 분야에서 잘 알려질 것이다. PAM4 항체에 대한 표시 부분의 결합은 당 분야에서 잘 알려진 표준 기술을 사용함으로써 달성되어질 수 있다. 이것에 관련된 전형적인 방법은 Kennedy et al.,Clin.Chim.Acta 70:1(1976),Schurs et al.,Clin.Chim.Acta 81:1(1977),Shih et al.,Int'l J.Cancer 46:1101(1990).
상기 설명된 생체 밖 및 원 위치 검출방법은 병리학적 조건의 진단 또는 단계에서 도움을 주기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 췌장암과 같은 PAM4 항원을 발현하는 종양을 검출하는데 그러한 방법이 사용될 수 있다.
생체 내 진단
본 발명은 또한 생체 내 진단을 위한 PAM4 항체의 사용을 의도한다. 방사능 표시된 MAbs를 사용하는 진단 영상 방법이 잘 알려져 있다. 면역신티그램촬영(immnoscintigraphy)의 기술에서, 예를 들어, 항체는 감마-방사 방사성아이소토프로 표시되고 환자에게 도입된다. 감마 카메라는 감마-방사 방사성아이소토프의 위치와 분할을 검출하는데 사용된다. 예를 들어, Srivastava(ed.)RADIOLABELEDMONOCLONAL ANTIBOSIES FOR IMAGING AND THERAPY(Plenum Press 1988),Chase,"Medical Applications of Radioisotopes," in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,18th Edtion, Gennaro et al.(eds.),pp.624-652(Mack Publishing Co.,1990), and b\Brown,"Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in BIOTECHNOLOGY AND PHARAMACY 227-49,Pwzzuto et al.(eds.)(Chapmen & Hall 1993)을 보라.
진단 영상을 위하여 방사성아이소토프는 PAM4항체와 직접적으로 또는 매개 기능 그룹을 사용함으로써 간접적으로 결합될 수 있다. 유용한 매개 기능 그룹은 에틸렌아이아민에테트라아세틱 산 및 디에틸렌트리아민펜타아세틱 산과 같은 킬레이터들을 포함한다. 예를 들어, Shih et al.,supra, 및 미국특허 제5,057,313호를 보라.
환자에게 전달된 방사능은 정확한 측량 및 검출을 허용할 최소한의 반감기, 최소한의 체내 보류, 및 아이소토프의 최소량의 가장 좋은 조합을 위한 아이소토프의 선택을 통해서 가능한 낮은 수준을 유지해야 한다. PAM4 항체에 결합할 수 있는 방사성아이소토프의 예는99mTc 및111In을 포함하는 진단 영상을 위해 적절한 것들이다.
PAM4 항체들, 융합 단백질들 및 그것의 단편들은 또한 생체 내 진단의 목적을 위해 다양한 방사성 조영제 및 상자성체 이온으로 표시될 수 있다. 자기 공명 영상에 특정하게 유용한 조영제들은 가돌늄, 망간, 디스프로슘, 란타늄, 또는 철이온을 포함한다. 부가적인 제제는 클로늄, 구리, 코발트, 니켈, 레늄, 유로퓸, 테르븀, 홀뮴, 또는 네오디뮴을 포함한다. PAM4 항체 및 그것의 단편은 또한 초음파 대조/증가제에 결합될 수 있다. 예를 들어, 초음파 조영제는 인간화된 PAM4 IgG 및 그것의 단편으로 구성된 리포좀이다. 또한 바람직하게는, 초음파 조영제는 기체로 채워진 리포좀이다.
바람직한 실시예에서, 이종특이성 항체는 조영제에 결합될 수 있다. 예를 들어, 이종특이성 항체는 초음파 영상에서 사용되기 위한 하나 이상의 이미지-증가제를 포함할 수 있다. 바람직한 실시예에서, 조영제는 리포좀이다. 바람직하게, 리포좀은 리포좀의 밖 표면에 공유적으로 부착된 이가 DTPA-펩타이드를 포함한다. 더 바람직하게는 리포좀은 기체로 체워진다.
약학적으로 적합한 부형제
추가적인 약학적 방법은 치료상 적용에서 PAM4 항체의 활동의 지속을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 조절 방출 준비는 PAM4 항체, 융합 단백질, 및 그것의 단편을 흡착하거나 복합체를 이루는 폴리머의 사용을 통해서 준비될 수 이TEk. 예를 들어, 생체조직과 잘 교합하는 폴리머는 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트)의 매트릭스(matrix) 및 스테아릭 산 다이머 및 세바식 산의 폴리안하이드라이드 코폴리머의 매트릭스를 포함한다. Sherwood et al.,Bio/Technology 10:1446(1992). 그러한 매트릭스로부터의 PAM4 항체, 융합 단백질 및 그것의 단편의 방출 속도는 PAM4 항체, 융합 단백질 및 그것의 단편의 분자량, 매트릭스 사이의 PAM4 항체의 양, 및 분산된 입자의 크기에 따라 다르다. Saltzman et al.Biophys.J.55:163(1989);Sherwood et al.,supra. 다른 고체 조제 형태는 문디 et al.,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition(Lee & Febiger 1990) 및 Gennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990), 및 그것의 재판본에 설명되어 있다.
대상에 전달되는 인간화된 또는 인간 PAM4 항체 및 그것의 단편은 항체, 면역컨쥬게이트, 융합 단백질 또는 그것의 단편 단독으로 구성될 수 있고 또는 하나이상의 약학적으로 적합한 부형제, 하나 이상의 첨가 재료, 또는 이것들의 조합을 포함한다.
본 발명의 면역컨쥬게이트, 노출 항체, 및 그것의 단편은 면역 컨쥬게이트 또는 노출 항체가 약학적으로 적합한 부형제와 혼합에서 만남으로해서 약학적으로 유용한 조성을 준비하는 알려진 방법에 따라 조제될 수 있다. 스테릴 파스페이트-버퍼드 살린은 약학적으로 적합한 부형제의 한 예이다. 다른 적합한 부형제는 당 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, Ansel et ak.,PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS,5th Edition(Les & Febiger 1990) 및 Gennaro (ed.),REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990) 및 그것의 재판본을 보라.
본 발명의 면역컨쥬게이트 또는 노출항체는 예를 들어 환약의 주입 또는 계속적인 주입을 경유하여 정맥 투여를 위해 조제될 수 있다. 주입을 위한 제형은 단위 복용 형태, 예를 들어 암플러스(amplus)또는 다중-복용 용기에서 첨가 보존제와 존재할 수 있다. 조성은 현탁액, 용액, 또는 유상 또는 수상 운반체의 에멀젼으로서 형성을 취할 수 있고 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형제를 함유할 수 있다. 대안적으로 활성 재료는 사용 전에 예를 들어 스테릴 피로젠-유리 물과 같은 적합한 운반체와 구조를 위한 분말 형태로 있을 수 있다.
면역컨쥬게이트, 노출 항체 및 그것의 단편은 포유류의 피하로 투여될 수 있고 심지어는 다른 비경구적 경로에 의해서도 투여될 수 있다. 바람직한 실시예에서, PAM4 항체 또는 그것의 단편은 복욕량 당 20 내지 2000 밀리그램 단백질의 양에서 투여된다. 게다가, 투여는 계속적인 투여 또는 단일 또는 다중의 환약에 의할 수 있다. 일반적으로, 인간을 위해 투여되는 면역컨쥬게이트, 융합단백질, 또는 노출 항체의 양은 환자의 나이, 몸무게, 키, 성, 일반적인 의학 조건 및 개인적인 의학 역사와 같은 인자들에 따라 다양하다. 전형적으로, 더 낮은 양이나 높은 양이 순환 지시로서 투여될수 있음에도 불구하고, 단일 정맥 주입으로서 약 1mg/kg 내지 20mg/kg 형채의 범위에 있는 면역 컨쥬게이트, 항체 융합 단백질 또는 노출 항체의 투약량과 부형제가 제공되는 것이 바람직하다. 이 투약량은 예를 들어 4주 내지 10주동안 일주일에 한번과 같이 필요에 따라 반복될수 있고 바람직하게는 8주 동안 일주일에 한번, 더 바람직하게는 4주동안 일주일에 한번이다. 또한 몇 달동안 격주마다와 같이 더 적은 빈도수로 주어질 수 있다. 투약량은 양 및 시간표의 적절한 판단에 따라 다양한 비경구 경로를 통해 주어질 수 있다.
본 발명의 PAM4 항체, 융합 단백질 및 그것의 단편은 PAM4 항체, 융합 단백질 및 그것의 단편이 약학적으로 수용될 수 있는 운반체와 혼합에서 결합됨으로 인해 약학적으로 유용한 조성을 준비하는 알려진 기술에 따라 조제될 수 있다. 조성은 만약 그것의 투여가 수용하는 환자에 의해 내성이 있을 수 있다면 "약학적으로 수용가능한 운반체"라고 말해진다. 다른 적합한 운반체는 당분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition을 보라.
치료의 목적을 위하여, 면역컨쥬게이트 또는 노출항체는 치료상으로 효과가 있는 양에서 포유류에 투여된다. 본 발명의 적합한 대상은 인간이 아닌 동물 대상 또한 의도됨에도 불구하고 일반적으로 인간이다. 항체 준비는 만약 투여된 양이 생리적으로 뚜렷하게 나타난다면 "치료상 효과가 있는 양"으로 투여되는 것을 말한다. 만약 그것의 존재가 수용하는 포유류의 생리에서 검출 가능한 변화를 야기한다면 생리적으로 뚜렸하게 나타나는 것이다.
하기의 예는 본 발명의 실시예를 묘사하지만, 어떤 방식으로든, 청구항들의 범위를 제한하는데 사용되어서는 안된다.
하기의 예들은 PAM4 MAb 및 CaPanl 인간 췌장 암을 사용한 실험 연구를 논의한다. CanPanl 인간 췌장 암은 피하 및 정소성 부위 모두에서 이종 이식으로써 옮겨진다. MAb 및 제제는 뚜렷하게 증가된 생존시간을 야기한다. PAM4 단일클론 항체의 높은 농도는 환자의 초기 그룹사이에서 췌장 종양의 대다수를 표적화하기위한 표적 이종 이식된 인간 종양 모델을 보여준다. 인간 혈액에서 PAM4-반응 항원의 양을 평가하기 위한 생체 밖 면역분석을 사용하는 것은 다른 질병 및 정상 그룹 뿐만 아니라 췌장으로부터의 췌장암을 식별하기 위한 그것의 능력을 약속하는 것을 나타낸다.
PAM4 MAb 치료 연구는 환자에서 표적화된 손상의 중요성 및 정상 조직의 흡수의 지시가 없음을 보여줬다. 약량측정은 3:1 내지 10:1의 붉은 골수 양에 대한 종양 비율과 함께 종양에 대한 10 내지 20 cGy/mCi를 전달하는 것이 가능함을 가리겼다. 이 자료들은 PAM4가 췌장암의 치료를 위한 1 단계 트라이얼(phage-1 trial)의 발달에 유용할 수도 있다는 것을 제안한다.
실시예 1 - 면역조직화학 염색 연구
정상 성인 조직에 면역조직화학은 PAM4 반응 에피토프가 염색은 약하지만 확실히 양성인 위장 경로에 한정된다는 것을 보여줬다(표 1). 도관, 소도관, 포도상선, 및 작은 섬 세포를 포함하여 정상적인 췌장 조직은 염색에 음성으로 나타났다. 항원으로서 조직 균질 현탁액과 함께 효소 면역분석에 기반한 PAM4는 면역조직학 자료를 뒷받침해줬다(표 2). PAM4 에피토프는 정상 췌장 및 다른 비위장 조직에는 존재하지 않았다. 종양 조직에서, PAM4는 25개의 췌장 암 중 21개(85%)와 반응했다(표 3). PAM4 반응성은 종양 분화의 단계에 함께 연관되어 나타났다. 예를 들어, 네개의 잘 분화되지 않은 종양 중 단지 한개가 양성을 나타낸 것에 반해 21개 잘 분화되고 적당하게 분화된 다른 췌장 종양 중 20개가 양성으로 나타났다. 일반적으로 잘 분화되지 않은 종양은 모든 췌장 암의 10%로 나타난다.
이 연구들은 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2,B72.3 및 Lewis 항원발표된 바와 다른 PAM4 활성 및 조직 분할 (정상 및 암 모두에서)을 보여준다. 이 MAb의 특정함과 함께 행해진 교차 블로킹(clossblocking) 연구와 함께, 자료는 PAM4 MAb가 특이하고 새로운 에피토프를 인식한다는 것을 제안한다. CA19.9, DUPAN2, 및 aLea와 비교했을 때 PAM4는 그것의 조직 분할 및 췌장 암과 높은 확율로 반응하는 것으로 더 제한되는 것을 보여준다. 게다가 그것은 등가 농도에서 반응의 전반적으로 더 높은강도를 주고 종양사이의 세포의 높은 퍼센티지와 반응한다. 마지막으로, PAM4는 CA19.9 및 DUPAN2가 12개의 표본 모두에 반응하는데 반해, 12개의 만성 췌장 표본 중 3개와 단지 약하게 반응하는 것으로 알려졌다. 특이성이 사용된 분석의 타입 및 실험된 조직의 숫자와 범위에 의존하는 것이 알려짐에도 불구하고, 반응의 높은 강도 뿐만 아니라 정상 및 종양 조직을 분별하는 PAM4의 능력, 암 표본의 높은 퍼센티지와 반응하는 능력은 치료상 적용의 개발적인 연구를 추진해야 하는 중요한 합리적인 이유이다.
MAb PAM4와 정상 성인 조직의 면역페르옥시다제(immnoperoxidase) 염색
조직 염색
반응
췌장(22)a
도관 -
포도상선 -
작은 섬 -
턱밑샘(2) -
식도(2) -
위(3) + 점액 분비 세포
십이지장(3) + 고블릿(goblet) 세포
공장(3) + 고블릿(goblet) 세포
회장(3) + 고블릿(goblet) 세포
결장(5) + 고블릿(goblet) 세포
간(3) -
쓸개(3) -
기관지(3) -
폐(3) -
심장(3) -
비장(3) -
신장(3) -
방광(3) -
전립선(2) -
고환(2) -
자궁(2) -
난소(2) -
a-( ) 실험된 개개의 표본의 수
EIA에 의한 정상 성인 조직 균질현탁액과 단클론 항체 PAM4 반응성
조직 ug/g 조직a
췌장 6.4
식도 8.1
61.3
십이지장 44.7
공장 60.6
결장 74.5
0.0
쓸개 5.6
심장 3.7
비장 3.4
신장 6.6
방광 4.9
갑상선 3.5
부신 1.3
자궁 2.6
고환 3.9
CaPanl 췌장 종양 569
a-두개의 해부 표본으로부터 나온 평균값
췌장 종양과 몇 몇의 단클론 항체의 면역조직화학 반응성
분화 PAM4 CA19.9 aLea DUPAN2
1 W +++ - - +++
2 M ++ +++ +++ +
3 M + - + +
4 M +++ +++ +++ +
5 M ++ + - -
6 M + ND ND ND
7 M' +++ +++ +++ +++
8 M + - - +++
9 M ++ + + -
10 M' ++ ++ ++ +++
11 M ++ +++ +++ +
12 M ++ + + +++
13 M + +++ +++ +
14 M ++ + + ++
15 M +++ + + ++
16 M + + ++ -
17 M - + + -
18 M ++ ++ ++ ++
19 M +++ + +++ ++
20 M + - - -
21 M +++ +++ + ++
22 P + + + +++
23 P - - - -
24 P - - - -
25 P - - + -
합계 21/25 17/24 18/24 16/24
-:음성;+:조직의 5-20%가 염색됨;++:조직의 21-50%가 염색된;+++:조직의 >50%가 염색됨;W:잘 분화됨;M:적당히 분화됨;P:잘 분화되지 않음;':전이 조직;ND:안됨
MAb PAM4와 종양 조직의 면역페르옥시다제 염색
조직 양성/총합계
췌장 21/25
결장 10/26
1/5
1/15
흉부 0/30
난소 0/10
전립선 0/4
0/10
신장 0/4
실시예 2 - 방사성표시된 PAM4의 생체내 생분포 및 종양 표적화
PAM4의 초기 생분포 연구는 예상되는 분화의 범위를 포함하는 서로 다른 네개의 인간 췌장 종양의 시리즈에서 수행되었다. 사용된 네개의 각 종양 라인, AsPcl, BxPc3, Hs766T 및 CaPan1,은 동시적으로 투여된 비특이성, 아이소타입-매치드(isotype-mached) Ag8 항체(범위:셋째날 3.6%-9.3%ID/g)보다 뚜렷하게(p<0.01-0.001) 높은 종양사이의 131I-PAM4의 농도(범위:셋째날 21%-48%ID/g)를 나타낸다. 생분포 자료는 AsPcl, BxPc3, Hs766T 및 CaPan1 제 각각 주입된 양의 12,230;10,684;6,835 및 15,843 cGy/mCi의 종양에 잠재적인 방사성 양을 평가하는데 사용되었다. o.7mCi의 실질적인 최대 내성 양(MTD)과 함께 PAM4는 충분한 방사성 양을 이종 이식된 각 종양 모델을 제공할수 있었다. 각 종양 라인에서 방사성표시된 PAM4의 혈액 레벨은 뚜렷하게(p<0.01-0.001) 비특이성 Ag8보다 낮다. PAM4로부터 나온 종양의 잠재적인 방사성양은 PAM4로부터 나온 혈액 양으로 표준화될 때, 종양은 혈액보다 제각각 2.2;3.3;3.4 및 13.1-폴드더 높은 양을 받는다. 중요하게는, 비-종양 조직에 잠재적인 방사성 양은 최소이다.
PAM4의 생분포는 CaPanl 종양 모델을 사용하여 항-CEA 항체, MAi4와 비교되었다. 종양 사이의 PAM4 농도는 이른 시간에 종양을 생성하는 MN14보다 훨씬 높았다:PAM4에 대한 12.7±2.3의 셋 째날 혈액 비율은 MN14에 대한 2.7±1.9에 비교되었다.
종양에 의해 집어올려진 PAM4가 초기 시간점(첫 째날-p<0.001;셋 째날-p<0.01)d에서 MN14에 대한 것보다 뚜렷하게 높았음에도 불구하고, 약량 측정 분석은 14일의 연구 기간동안 MN14와 비교했을 때 PAM4로부터 얻어진 종양에 3.2 폴드 더 높은 양을 나타냈다. 이것은 종양으로부터 나온 PAM4의 빠른 제거 때문에 후기 시간점에서 두 항체의 비슷한 농도가 존재한다. 종양으로부터 PAM4의 빠른 제거는 또한 BxPc3 및 Hs766T에서 나타나지만 AsPcl 종양 모델에서는 나타나지 않았다. 이 관찰은 MN14 항체와 비교하여 각 제시된 더 긴 보존시간인 결장 암에서 G9 및 B72.3의 예로서 다른 항-무친 항체에 대해 알려진 것들과는 같지 않다. PAM4 대사에 대한 연구의 결과는 종양 세포에 대한 초기 결합 후에 항원:항체 복합체로서 분해되거나 분리되면서 빠르게 방출된다는 것을 가리킨다. 이것은 환자에게 항체를 사용함에 있어 혈액 제거도 역시 빠르다는 것을 제외하고 선호되지 않는 암시였을 수도 있다. 이 자료는131I가 치료상 적용을 위한 아이소토프의 적절한 선택이 아닐수도 있다는 것을 나타낸다. 자주 투여될 수 있는90Y 또는188Re와 같은 짧은 수명의 아이소토프가 더 효과적인 시약으로 적절할 수 있다.
PAM4는 작지만 통계적으로 뚜렷한 비장의 흡착이 관찰되는(범위 3.1-7.5%ID/g 셋 째날)정상적인 조직, CaPanl 종양 모델을 제외하고,을 표적화하는 증거를 보여주지 않는다. 비장 표적화의 이 형태는 항-무친 B72.3 및 CC49의 치료상 적용에서 관찰되어져 왔다. 중요하게는, 이 연구들은 비장의 표적화가 종양의 항체 흡수에 영향을 주기 않고 핵 스캔의 해석을 방해하지도 않는다는 것을 나타낸다. 이 연구들은 비장의 표적화가 비장의 교차반응 항원, 또는 Fc 수용체에 의한 결합때문이 아니라 하기 설명된 가능성의 하나 이상의 것들 때문이라는 것을 알려준다:비장에서 걸린 항원의 직접적인 표적화 또는 항체의 간접적인 흡착: 종양 부위로부터 방출되거나 또는 혈액속에서 형성된 항체 복합체. 후자는 혈액속에서 면역 복합체의 존재를 필요로 할 수 있다; 그러나, 이것들이 5분 만큼 빨리 그리고 7일만큼 느리게 표본이 젤 여과(HPLC, GF-250 컬럼)에 의해 시험될었을 때 관찰되어지지 않았다; 방사성표시된 항체는 본래의 물질로서 씻겨져나갔다. 전 설명이 CAPanl종양이 다른 시험된 종양 세포 라인에 비해 많은 양의 PAM4-반응 항원을,100 내지 1000 폴드 더 높은, 생산해냈다는 사실의 관점에서 보여지는 듯하다. 이 다른 종양 라인에서 PAM4에 의한 비장의 표적화의 부족은 이 현상이 발현되는 항체 생산과 관련이 있었음을 나타낸다. 이 상황에서, 비장의 표적화는 단백질의 양을 본래의 2ug에서 10ug로 증가시킴으로써 극복될 수 있다. 비장의 갇힌 항원의 많은 양은 방사성표시된 항체 보다는 표시되지 않은 PAM4와 복합체를 이룬다. 단백질의 양을 증가시키는 것은 종양이나 정상 조직에 PAM4의 표적화에 반대의 영향을 부지 않는다. 사실, CaPanl 종양 사이의 방사성표시된 PAM4의 농도의 두배가 넘는 100 ug까지의 단백질 양의 증가.
실시예 3 - 무흉선 무모 마우스에서 정소성 췌장 종양의 발달
더 가깝게 동물 모델에서 췌장 암의 치료상 존재를 닮게 하기 위해서, 지원자는 췌장의 앞부분에 직접적으로 종양 세포를 주입함으로써 정소성 모델을 발달시킨다. 정소성 CaPanl 종양은 진행적으로 명백한 징후 없이 복수의 발달 및 10 내지 14주에 죽을 때까지 자라났다. 이식 후 3 내지 4주가 지남에 따라, 동물은 대략 0.2g의 뚜렷한 종양을 발달시켰다. 8주의 이장 사이에, 간 및 비장으로 전이됨에따라 대략 1.2g의 초기 종양이 관찰된다(1-3 전이 종양/동물;각 종양<0.1g). 10 내지 14주에 복수의 발달과 횡경막의 시딩(seeding)이 증거가 된다. 복수 형성 및 가끔 발생하는 황달은 보통 종양 성장의 첫번째 명백한 증상이다. 복수는 복강 및 혈액 내의 과도한 담즙 안료 때문에 피부 및 눈이 노랗게 되는 황달에서 유액이 축적된 것이다. 이번의 종양이 매우 컸고,1 내지 2g, 동물들은 죽을 때까지 최대 3 내지 4주밖에 걸리지 않았다.
4주 오래된 정소성 종양(약 0.2g)에 내성이 있는 동물들에 투여된, 방사성표시된131I-PAM4는 첫 날에 7.9±3.0에서 14일 째되는 날에 22.8±15.3으로 증가한 위치지정 목록들과 첫번 째 종양에 특이적으로 표적화하는 것을 보여준다. 다른 조직에 대한 특이적인 표적화는 나타나지 않았다. 간 및 비장으로 종양 전이가 관찰된 한 경우에서, 두 전이는 모두 표적화되었고 방사성표시된 항체의 높은 농도를 갖고 있었다. 게다가, 대략 동물들의 반이 절개된 부위에 피하 종양이 발달하였다.같은 동물 사이에서 정소성 및 피하 종양의 표적화에서 뚜렷한 차이점을 나타나지 않았으며, 동물이 추가적으로 피하 종양을 갖고 있는지 아닌지 정소성 종양의 표적화에서는 뚜렷한 차이점이 관찰되지 않았다. 측정된 PAM4로부터의 방사성 양은 첫번 째 종양 및 혈액 각각에 6,704 및 1,655 cGy/mCi이다.
실시예 4 - 순환 종양 항원의 양 평가를 위한 효소 면역분석의 진행
우리는 표시되지 않은 포획 시약으로서 PAM4를 사용하여 요소 면역분석을 진행하고, 검출 시약으로서 페르옥시다제 당나귀 항-토끼 IgG에 의해 따라오는 IgG토끼 다클론성의 항-췌장 무친으로부터 유도된 IgG를 정제하였다. 하기의 결과는 이 분석의 사용을 통해서 얻어진 것이다.
분석에 의해 검출되는 항원의 범위사이에서, 다양한 변수의 계수는 10% 이하이다. 25살의 건강한 개체들로부터의 혈청은 시험되었고 4.0±3.1 단위의 평균±S.D.를 나타내었다. 양성 반응의 차단값은 평균+2S.D=10.2 단위로 맞춰줬다. 오직 13명의 췌장염 환자들 중 3명만이 양성으로 나타난데 반해, 총 37명의 췌장 암 환자들 중에서, 32명 또는 86%가 이 분석에 양성으로 나타났다. PAM4 항원은 면역조직화학에 의해 PAM4와 반응하는 결장 암 표본의 40%에 가까운 결장 암 환자의 55%(18/33)에서 증가된다. 다른 암들 중에서, PAM4 항원은 모두 극심한 질병을 겪고 있는 16명의 난소 암 환자 중 4명에서, 20명의 흉부 암 환자 중 5명에서 양성을 나타냈다. 또한 하기의 표 5에서 보여지는 것과 같이, 췌장 암의 중간값(84.5 단위)은 심지어는 이 경우들의 마지막 단계, 많은 종양 다발의 압도적인 다수에도 불구하고 담즙 암을 제외하고 다른 모든 암 그룹에 대한 것보다도 10 폴드 더 많은 종류들이다.
혈청에 대한 PAM4의 반응성
단위/ml
n 평균 SD 중간값 범위 % 양성a
정상 25 4.0 3.1 4.7 0.0-9.4 0%
췌장염 13 14.6 20.3 6.8 0.4-66.7 23%
췌장암 37 317.5 427.1 84.5 0.9-1000 86%
담즙암 8 155.4 343.8 37.8 6.6-1000 63%
간암 30 7.9 8.0 6.4 0.0-32.8 30%
결장암 33 50.0 171.6 11.8 3.4-1000 55%
폐암 38 25.8 44.6 9.3 0.0-196.0 39%
흉부암 20 11.1 18.5 5.8 0.0-83.3 25%
난소암 16 68.9 248.4 5.5 0.0-1000 25%
비-호지킨 임파종 14 6.6 3.1 7.5 2.2-12.8 14%
a - 차단값 10.2 단위/ml (평균+2S.D.)
이 발견에 더하여, 예비 연구가 조작에서 이 PAM4 분석의 잠재적인 사용을 시험하기 위하여 정소성 모델에서 행해졌다. CaPanl 종양(0.15g의 종양 무게로 측정된) 이식 후 2주에 어떤 동물들도 혈액에서 항원이 검출되지 않았다. 4주에 (0.2g의 종양 무게로 측정된) 다섯 동물 중 하나가 검출 가능한 항원(범위:72 단위)을 가졌고 6주에 (4.0g의 종양무게로 측정된)다섯 동물 중 네 동물이 양을 평가할 수 있는 항원(범위:98-6080 단위)를 갖고 있었다. 검출될 수 있는 혈정 뼈 항원에서 가장 초기의 시간점을 검출하는 기간에서 엄격한 제한 인자는 반복적인 출혈이 일어날 수 있는 것과 같은 획득할 수 있는 제한된 혈액의 양이다. 따라서 혈정은 분석에 앞서 1:10으로 희석되었다.
실시예 5 - 췌장 암의 실험적인 방사성면역요법
치료를 위한131I-PAM4의 사용에 관한 초기 연구는 무흉선 마우스에서 피하 이종 이식으로서 자라나는 CaPanl과 함께 행해졌다. 0.25g의 종양을 견디는 동물들은 비특이성 Ag8의 비슷한 양의 치료 효과와 또한 비교되는 실험에서 350μCi,131I-PAM4가 투여되었다. 1cm3종양을 견디는 동물에 대한131I-PAM4의 투여에 대한 MTD는 700μCi이다. 5주 내지 6주가 지남에 따라, PAM4 처리된 동물들은 종양의 급격한 퇴화를 보여주었고 심지어 27주에는 8마리 중 5마리가 무종양 상태로 남아있었다. Ag8-처리된 동물 뿐만 아니라, 처리되지 않은 동물들도 두 조절 그룹사이의 뚜렷한 차이점을 나타냄에도 불구하고 종양 성장의 급격한 진전을 보였다. 7주에는, 처리되지 않은 그룹으로부터의 종양은131I-Ag8-처리된 그룹이 4.9±1.8 폴드만 성장한 것에 반해 초기부터 20.0±14.6 폴드 성장하였다. 이 시간점에서, PAM4 종양은 비처리(p<0.001) 및 비특이적인 Ag8-처리(p<0.01) 동물 양 쪽으로부터 뚜렷한 차이인 그들의 본래 크기의 0.1±0.1 폴드 퇴화하였다.
CaPanl 종양이131I-PAM와의 치료에 예민함에도 불구하고 결과적으로는 종양의 퇴화 및 진전은 초기 종양 크기를 포함하는 많은 인자들에 의존한다. 따라서, 0.25g,0.5g,1.0g 또는 2.0g 의 CaPanl의 종양 다발을 견디는 동물의 그룹은 350μCi131I-PAM4의 단일 투여량과 함께 처리된다. 0.25g 및 0.5g의 시작 크기의 종양을 갖는 대다수의 동물들(각 그룹의 10 중 9)은치료후 적어도 16 주에 종양의 퇴화 또는 성장 제한을 보여줬다. 1.0g 종양 그룹에서 7중의 5는 적어도 16주 내에 종양의 퇴화 또는 성장제한을 보여줬고, 2.0g 종양 그룹에서 9중 6은 진전이 일어나기 전인 6주의 기간동안에 종양의 성장이 없었다. 단일 350μCi 양이 더 많은 종양에 대항하여 효과적인 만큼은 아닐지라도, 단일 투약량은 적절한 처방계획이 매우 잘 될수 없다; 방사성면역요법의 다중 순환을 주는 능력을 지시하는 독성 연구. 평균적으로 1.0g의 CaPanl에 내성이 있는 동물들은 350μCi131I-PAM4의 단일 투약량이나 시작시간 및 4주에 두번 투약하는 것 또는 치료되지 않은 상태로 남아있었다. 치료되지 않은 그룹은 3.7+/-1.0 주의 평균 생존 시간을 가졌다(생존은 종양이 5cm3에 도달하는 시간으로 정의된다). 동물들은 3 주 만큼 일찍 죽었고, 후 6주 동안 살아남은 동물은 없었다. 350μCi131I-PAM4의 단일 추약량은 생존 시간에서 18.8+/-4.2 주(p<0.0001)로 뚜렷한 증가를 생산했다. 동물의 죽음의 범위는 13주에서 25주로 늘어났다. 26주의 기간의 실험이 끝날 때 어떤 동물도 살아있지 않았다.
생존 시간에서 뚜렷한 증가는 단일 투약량 그룹에 비교하여 두 투약량 그룹에서 관찰되어졌다. 동물들의 반이 1.0-2.8cm3로부터 종양 크기와 함께 26주 시간점에서 살아있었고 초기 종양 크리로부터 1.6+/-0.7의 평균 종양 성장 비율을 나타내었다. 26주에 살아남지 못한 동물들에 대해서는, 평균 생존 시간(17.7+/-5.3 주)은 단일 투약 그룹과 비슷하였다.
PAM4와 치료 연구는 정소성 종양 모델에 사용되었다. 4주 오래된 정소성 종양(0.25g의 종양 무게로 측정된)에 내성을 지닌 동물들은 치료되지 않은 상태로 남겨지거나 350uCi131IPAM4 또는 131I-비특이성 Ag8의 350uCidml 단일 투약으로 치료되었다. 치료되지 않은 그룹은 10주에 50% 의 사망 비율을 가졌고 15 주에 아무도 생존하지 못했다. 종양 성장의 4 주에 비특이성131I-Ag8이 투여된 동물은 7 주에서50%의 사망 비율을 보였고 14주에서 아무도 생존하지 않았다. 통계적으로 (logrank analysis) 이 두 그룹사이에 차이점이 없을지라도, Ag8 치료된 동물들의 약 반수에서 방사성 독성이 일어났다는 것은 가능하다. 그러나, 방사성표시된 PAM4는 치료되지 않거나 Ag8로 치료된 동물에 비해서 실험의 끝인 16주에 70% 생존하는 뚜렷한 생존 이점(p<0.001)을 제공한다. 이 시점에서 살아있는 동물들은 종양 크기를 결정하기 위하여 희생되었다. 7 마리 중 4마리의 동물들에서 하나 또는 두 개의 작은(<0.1g) 전이 증거 뿐만 아니라 모든 동물이 1.2g의 평균 무게의 종양을 가지고 있었다. 성장 16주에, 이 종양들은 8주 오래된 종양의 더한 대표였다.
실시예 6 - 젬자(gemzar) 화학요법 및131I-PAM4 방사성면역요법의 결합된 양식
131I-PAM4 방사성면역요법과 젬시타빈(gemcitabine:gemzar)의 결합된 사용에 관한 초기 연구는 체크보드(checkboard) 정렬로서 행해졌다;131I-PAM4의 단일 투약([MTD=700μCi] MTD의 100%,75%,50%,0%)에 대한 젬자의 단일 투약(0,100,200,500 mg/kg). 결합된 MTD는 350μCi 131I-PAM4와 500mg/kg 젬자로 찾아졌다(50%MTD).체중의 손실로서 특정되는 독성은 비독성에서 최대치가 되었다; 그것은 체중의 20% 손실이다. 결합된 치료 프로토콜이 확실히 단독으로 쓰인 젬자보다 더 효과적임에도 불구하고, 치료는 단독으로 쓰인 방사성면역요법보다 더 효과적이지 않았다. 다음 연구는 진짜 시너지스틱 치료 효과과 관찰되는지를 시험하기 위해 젬자 및 방사성면역요법의 낮은 투약량에서 행해졌다. 약 1cm3(약 체중의 5%)의 종양에 내성이있는 동물들은 시작시간에 100μCi 131I-PAM4와 함께, 시작시간, 세 번째, 여섯 번째, 아홉 번째, 및 열두번째 날에 100mg/kg의 젬자가 투여되었다. 단독으로 사용된 젬자와 비교하여 뚜렷한(p<0.0001) 퇴화(0.1cm3이하의 5개 중 2개) 및/또는 종양 성장 제한과 함께 치료 효과가 관찰되었다. 덧붙여서 이야기하자면, 체중의 기간동안 독성은 관찰되지 않았다. 조합 치료 프로토콜은, 만약 필요하다면, 상기된 설명된 연구에 단독으로 쓰이는 방사성면역요법과 함께 4 주에서 두 번째 치료 순환과 함께 다중 순환에서 전달될 수 있다.
실시예 7 - 인간화된 PAM4 Mab
본 발명의 바람직한 실시예는 췌장 암 무친으로부터 유래된 마우스(murine) PAM4의 인간화된 IgG인 단클론 항체,MAb hPAM4를 사용한다. 마우스 PAM4 서열의 인간화는 환자의 경험에 반응하는 인간의 항-마우스 항체를 감소하는데 사용된다. 인간화된 PAM4를 생산하기 위해서, 마우스의 상보적 결정 지역(CDR)은 그들의 마우스 중요부분과 뼈대 지역에서 약간의 사람 잔여에 교체로 인해 따라오는 인간 V-도메인 안에 마우스의 면역 글로블린 항체의 다양한(V) 중쇄 및 경쇄로부터 전달되었다. 본 발명에 따른 인간화된 단클론 항체는 생체 밖 및 생체 내 진단 및 치료법으로 사용되는데 적합하다.
카밧(Kabat) 데이터베이스에서 인간 항체에 등록된 마우스 PAM4 MAb의 다양한(V) 지역 구조(FR) 서열의 조합(도 1A 및 1B)은 인간 항체 Walker Vk 및 Wil2 FR4 각각의 것에 상동하는 서열의 가장 높은 정도를 보여준다. 따라서 각각의Walker Vk 및 Wil2 VH FR4은 PAM4 Vk 및 이식된 VH를 위한 마우스 CDR안의 인간 골격으로써 선택되어진다(도 3B). 추정되는 CDR의 측면인 PAM4 FRs에서 약간의 아미노 산 잔기는 다른 FR 잔기보다 더 Ag 결합에 충격을 주는 디 잔기들에 대한 고려에 기반한 hPAM4에서 유지된다. 이 잔기들은 Vk의 21M,47W,59P,60A,85S,87F, 및 100G 및 VH의 27Y,30P,38K,48I,66K,67A 및 69L이다. hPAM4 Vk 및 VH의 DNA 및 아미노산 서열은 도 3A 및 3B에 각각 보여진다.
Leung et al.(Leung et al.,1994)에 의해 설명된 조작 전략은 도 4에 묘사되어있는 긴 올리고뉴클레오타이드 합성 및 PCR의 조합을 사용하여 hPAM4를 위한 디자인된 Vk 및 VH 유전자를 만드는데 사용되었다. hPAM4 VH 도메인을 건설하기위하여 두 개의 긴 올리고뉴클레오타이드, hPAM4VHA(173-mer) 및 hPAM4VHB(173-mer)가 자동 DNA 합성기(생체계에 적용된)에서 합성되었다.
hPAM4VHA는 hPAM4 Vh 도메인의 nt 17 내지 189를 나타낸다.
5'-AGTCTGGGGC TGAGGTGAAG AAGCCTGGGGCCTCAGTGAA
GGTCTCCTGC GAGGCTTCTG GATACATT CCCTAGCTAT GTTTTGCACT
GGGTGAAGCA GGCCCTGGA CAAGGGCTTG AGTGGATTGG ATATATTAAT
CCTTACAATG ATGGTACTCA GTACAATGAG AAG-3'
hPAM4VHB는 hPAM4 VH 도메인 상보성 nt 169 내지 341의 마이너스 스탠다드를 나타낸다.
5'-AGGGTTCCCT GGCCCCAGTA AGCAAATCCG TAGCTACCAC
CGAAGCCTCT TGCACAGTAA TACACGGCCG TGTCGTCAGA TCTCAGCCTG
CTCAGCTCCA TGTAGGCTGT GTTGATGGAC GTGTCCCTGG TCAGTGTGGC
CTTGCCTTTG AACTTCTCAT TGTACTGAGT ACC-3'
hPAM4VHA 및 VHB의 3'-말단 서열(21 nt 잔기)은 서로 상보적이다. 정의된 pcr 조건하에, hPAM4VHA 및 VHB의 3'말단은 긴 올리고튜클레오타이드의 여분에 의해 측면에 위치하는 짧은 이중 나선 DNA를 형성하기 위해 애닐링(annealing)한다. 각 애닐링된 말단은 단일 나선 DNA의 전사를 위한 프라이머로서 제공되고, 결과적으로 hPAM4 VH의 nt 17 내지 341로 조성된 이중 나성 DNA를 형성한다. 이 DNA는 hPAM4 VH의 완전한 길이를 형성하기 위해 두 짧은 올리고뉴클레오타이드, hPAM4VHBACK 및 hPAM4VHFOR의 존재에서 더 확장한다. 밑줄 친 부분이 도 4B에 나타난 서브클로닝을 위한 제한 부위들이다.
hPAM4VHBACK 5'-CAG GTG CAGCTG CAGCAG TCT GGG GCT GAG GTG A-3'
hPAM4VHFOR 5'-TGA GGA GACGGT GAC CAG GGT TCC CTG GCC CCA-3'
hPAM4VHA 및 VHB의 최소량은 10x PCR 버퍼(500mM KCL, 100 Tris.HCL 버퍼, pH 8.3,15mM MgCL2)의 10??L, hPAM4VHBACK 및 hPAM4VHFOR의 2??mol, 및 Taq DNA 폴리머라이즈(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)의 2.5 단위의 존재안에서 확장되었다. 이 반응 혼합물은 94℃에서 1분간 해리, 45℃에서 1분간 애닐링 및 72℃에서 1.5분간 폴리머라이제이션으로 구성된 폴리머라이즈 사슬 반응(PCR)의 세 번 순환으로 대상화되었다. 이 과정은 94℃에서 1분간 해리, 55℃에서 1분간 애닐링 및 72℃에서 1분간 폴리머라이제이션으로 구성된 PCR 반응의 27 순환에 의한다. hPAM4 VH를 위한 이중 나선 PCR 확장 산물은 겔-정제되고, PstI 및 BstII 제한 부위와 함께 제한-소화되고, 5'-말단에서 결합된 프레임 안의 번역 시작 코돈 및 분비 신호 펩타이드를 인코딩하는 DNA 서열 및 3'-말단에서 의 인트론 서열과 함께 완전히 회합되는 VH 서열에서 중쇄 단계 벡터,VHpBS2, 의 상보적 Pstl/BstEII 제한 부위에 복제된다. VHpBS2는 다음 서브클로닝 단계를 촉진하는 번역 시작 코돈의 16 염기 업스트림에서 소개되는 Xhol 제한 부위 안에서, VHpBS2(Leung et al.,Hybridoma, 13:469(1994))의 조작된 단계 벡터이다. 회합된 VH 유전자는 선택 및 증폭을 위한 표지로서 마우스 dhfr 유전자 뿐만 아니라 IgH 인헨서 및 MT 프로모터의 조절하에 인간 IgG 중쇄 및 경쇄 모두를 위한 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터,pdHL2,안에 Xhol-BamHI 제한 단편으로서 하위복제 된다(도 4B). pdHL2의 중쇄 지역이 BamHI의 제한 부위가 부족하므로, 이 결합은 다양한 사슬의 BamHI 부위와 pdHL2에서 나타나는 HindIII사이의 다리를 제공한 연결자의 사용이 필요하다. 결과 발현 벡터는 hPAM4VHpdHL2로서 디자인되었다.
인간화된 Vk 서열의 완전한 길이의 DNA를 만들려면, hPAM4VKA(157-mer), 및 hPAM4VKB(156-mer)가 상기에 설명대로 합성되어야 한다. hPAM4VKA 및 VKB는 상기에 설명된 바와 같이 두 짧은 올리고뉴클레오타이드 hPAM4VHBACK 및 hPAM4VHFOR에 의해 확장되었다.
hPAM4VKA는 hPAM4 Vk 도메인의 nt 16 내지 172를 나타낸다.
5'-CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTA GGAGACAGAG
TCACCATGAC CTGCAGTGCC AGCTCAAGTG TAAGTTCCAG CTACTTGTAC
TGGTACCAAC AGAAACCAGG GAAAGCCCCC AAACTCTGGA TTTATAGCAC
ATCCAACCTG GCTTCTG-3'
hPAM4VKB는 hPAM4 VK 도메인 상보성 nt 153 내지 308의 마이너스 스탠다드를 나타낸다.
5'-GTCCCCCCTC CGAACGTGTA CGGGTACCTA TTCCACTGAT
GGCAGAAATA AGAGGCAGAA TCTTCAGGTT GCAGACTGCT GATGGTGAGA
GTGAAGTCTG TCCCAGATCC ACTGCCACTG AAGCGAGCAG GGACTCCAGA
AGCCAGGTTG GATGTG-3'
hPAM4VKA 및 VKB의 3'-말단 서열(20 nt 잔기)은 서로 상보적이다. 정의된 pcr 조건하에, hPAM4VKA 및 VKB의 3'말단은 긴 올리고튜클레오타이드의 여분에 의해 측면에 위치하는 짧은 이중 나선 DNA를 형성하기 위해 애닐링(annealing)한다. 각 애닐링된 말단은 단일 나선 DNA의 전사를 위한 프라이머로서 제공되고, 결과적으로 hPAM4 VK의 nt 16 내지 308로 조성된 이중 나성 DNA를 형성한다. 이 DNA는 hPAM4 VK의 완전한 길이를 형성하기 위해 두 짧은 올리고뉴클레오타이드, hPAM4VKBACK 및 hPAM4VKFOR의 존재에서 더 확장한다. 밑줄 친 부분이 서브클로닝을 위한 제한 부위들이다.
hPAM4VKBACK 5'-GAC ATCCAT CTGACC CAG TCT CCA TCC TCC CTG-3'
hPAM4VKFOR 5'-TTA GAT CTC CAG TCG TGT CCC CCC TCC GAA CGT-3'
hPAM4를 위해 겔-정제된 PCR 산물은 PvuII 및 BcII와 제한적으로 분해되었고 VKpBR2, 경쇄 단계 벡터의 상보적인 PvuII/BcII의 부위에 복제되었다. VKpBR2는 Xbal 제한 부위가 번역 시작 코돈의 16 염기 업스트림에서 사입된 VKpBR의 조작된단계 벡터이다(Leung et al.,Hybridoma, 13:469(1994)). 조립된 Vk 유전자는 Xbal-BamHI 제한 단편으로서 VH 서열을 함유하는 표현 벡터,hPAM4VHpdHL2,에 하위복제된다.
대략 30ug의 hPAM4VHpdHL2은 Sall의 분해에 의해 직선화되었고 450V 및 25μF의 일렉트로포레이션(electroporation)에 의해 Sp2/0-Ag14 세포안으로 옮겨졌다. 옮겨진 세포는 96-웰 플레이트에 놓여졌고 2 일동안 CO2세포 배지 배양기에서 배양된 후 MTX 저항을 위해 선택되어졌다. 2 내지 3주 안에 콜로니의 살아있는 부분은 합해졌고 ELISA 분석에 의해 인간 항체 분비를 위해 스크린되었다. 간단하게, 살아있는 콜로니로부터 뜨는 물질(~100ul)은 염소 항-인간 IgG F(ab') 단편-특이성 Ab로 예비코팅된 ELISA 마이크로플레이트의 웰로 더해졌다. 결합하지 않은 단백질은 워시 버퍼(0.05% Tween-20을 함유하고 있는 PBS)로 세번 씻어냄으로서 제거되었다. 호르세라디시(horseradish) 페르옥시데이즈-결합 염소 항-인간 IgG Fc 단편-특이적 Ab는 웰에 더해졌다.한 시간의 배양에 따라, 4mM o-페닐렌디아민 디하이드로틀로라이드(OPD) 및 PBS의 0.04% H2O2를 함유하고 있는 기질 용액(100μL/Well)이 더해졌다. 30분의 시간동안 어둠속에서 색이 전개됨이 허용되었고 반응은 4N H2SO4용액 50μL를 더함에 따라 멈추어졌다. 결합된 인간 IgG는 ELISA 리더에서 490nm에서 흡착을 읽힘으로써 측정되어졌다. 양성 세포 클론은 확장되었고 hPAM4 는 프로테인 A 컬럼에서 친화성 크로마토그래피에 의해 세포 배양 부유물로부터 정제되었다.
hPAM4의 Ag-결합 활성은 췌장 암 세포 추출물로 덮여진 마이크로타이터 플레이트에서 ELISA 분석에 의해 확인되어졌다. PAM4-항원으로 덮여진 플레이트를 사용하는 ELISA 경쟁 결합 분석은 마우스 V 및 인간 C 도메인으로 구성된 가상의 PAM4의 것과 구성된 hPAM4의 Ag-결합 친화성을 평가하기 위해 전개되었다. cPAM4 Ehsms hPAM4의 다양한 농도와 혼합된 HRP-결합 cPAM4의 대조-양은 코티드 웰에 더해졌고 1 내지 2시간 동안 상온에서 배양되었다. CaPanl Ag에 결합된 HPR-결합 cPAM의 양은 4mM o-페닐렌디아민 디하이드로틀로라이드 및 0.04% H2O2를 함유하고 있는 기질 용액을 첨가한 후, 490nm에서 흡착을 읽힘으로써 드러났다. 도 4의 경쟁 분석에서 보여지는 바와 같이, hPAM4 및 cPAM4 항체는 비슷한 결합 활성을 보여줬다.
적합한 숙주 세포는 미생물 또는 포유류 숙주세포를 포함한다. 바람직한 숙주는 MAb의 생산을 위해 발달된 인간 세포 라인,PER.C6, 및 다른 융합 단백질이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시예는 PAM4 MAb, 결합, 융합단백질, 또는 그것의 단편들을 인코딩하는 DNA 서열을 포함하는 숙주세포이다. PER.C6 세포(WO 97/00326)은 인간 파스포글리세레이트 키네이즈(PGK) 프로모터의 조절하에 아데세로타입 5(Ad5) EIA-및 EIB-코딩 서열(Ad5 뉴클레오타이드 459-3510)을 포함하는 플라스미드를 사용하여 첫번 째 인간 배 망막 세포를 이식함으로 인해 유발되었다. E1A 및 E1B은 각각 단백질 1A 및 1B 을 활성화하는 초기 유전 아데노바이러스이다. 방법 및 조성은 예를 들어 글라코실레이션과 같은 후-번역적으로 조작된 흥미있는 인간 재조합 단백질의 안정된 발현을 유발하는데 유용하다. PER.C6와 같은 재조합 단백질 생산에 숙주로서 특정하게 유용한 PER.C6를 만드는 몇몇 특징은 완전히 특징적이 된 인간 세포 라인이고 그것은 좋은 실험 실행에 따라 전개되었다. 게다가, PER.C6는 어떤 인간- 또는 동물-유도 단백질이 없는 무혈청으로 정의된 현탁액 배지에서 자랄 수 있고 그것의 성장은 약 35시간의 배가 시간동안 롤러 병, 쉐이커 플라스크 및 바이오리엑터에 적합하다. 마지막으로 E1A의 존재는 CMV 인헨서/프로모터의 조절하에 유전자의 발현 조절 증가를 야기하고 E1B는 재조합 전이유전자의 발현을 통해서 가능하게 증가된 p53-의존 아포프토시스를 막는다. 한 실시예에서, 세포는 종래의 포유류 세포 라인보다 2 내지 200 폴드 더 많은 재조합 단백질 및/또는 단백질과 관련되 기질을 생산할 수 있다. 다른 바람직한 세포는 Sp210-Ag14 세포이다.
실시예 8 - 수술이 불가능한 췌장 암 환자의 치료
극심하고, 수술이 불가능한 췌장 암(adenocarcinoma), 충분한 체중의 손실(30lb의 체중 혹은 그 이상),혼수상태 및 약함을 갖고 있는 56세 남성에게 두 시간의 i.v. 내융함에서 30mCi 90-Y 및 50mg 항체 단백질을 한 투약량으로 해서 90-Y-PAM4 방사성 표시된 인간화된 항체가 주어졌다. 5일 후에, 환자에게 젬시타빈 화학요법의 표준 과정이 주어졌다. 치료로부터 발생한 부작용이 그 후 몇 달 동안 없다면 치료 요법은 반복된다. 몇 주 후 그 후 실험동안에 환자는 더 활동적이 되고 체중 손실은 더 느려질 것이 예상된다. 췌장의 CT 스캔은 안정된 질병 또는 종양 중량의 가벼운 감소가 예상된다. 몇달 후 반복되는 실험은 컴퓨트 토모그래피에 의해 종양 중량의 충분한 감소를 보여줄 것이고 환자는 따라서 췌장 종양 중량의 절제를 고려할 수 있을지 모른다.
실시예 9 - 양특이성 PAM4 x 734 및99mTc 또는111In-표시된 펩타이드 헵텐의 예비표적화
예비 표적화된 접근을 사용하는 췌장 암의 영상 촬영을 위해서 우리는 가상 PAM4(cPAM4)Fab' 및 마우스 734(m734)Fab'로 구성된 양특이성 F(ab')2항체(bsMAb)를 준비하였다. m734 항체는 In-DTPA 복합체를 인식한다. 이 bsMAb는125I로 표시되었고 인간 췌장 암 이종이식(CaPanl)에 내성이 있는 무흉선 무모마우스에 주입(7μCi;15μg)되었다. 가상 rituximab(항-CD20 단클론항체)로부터 만들어진 비-표적화 F(ab')2bsMAb는111In 로 표시되고 대조군으로서 함께 주입되었다. 다양한 시간에(주입 후 4,24,36,48 및 72시간) 마우스는 해부되었고, 조직은 그램 당 퍼센트-주입된 양(%ID/g)을 결정하기 위해 제거되고 세어졌다. 대조군 bsRituximab에 비교하여 각 시간점에서 bsPAM4의 종양 흡착은 뚜렷하게 더 많이 나타났다(p<0.032 또는 더 나은). 예비표적화 체계의 이 유형에 대한 우리의 과거 경험은 1%ID/g이하의 혈액 레벨이 좋은 종양:비종양 비율을 얻기에 필요했다는 것을 알려주었다. bdPAM4의 투여 후 36시간에서, 주입후 48시간에 0.56±0.08%ID/g로 떨어진 혈액에서 1.10±0.40%ID/g 이 나타났다. 이 두 시간점에서 종양의 흡착은 각각 6.43±1.50%ID/g 및 5.37±2.38%ID/g 였다. 이 값들은 각각 36 시간 및 48시간에서 0.65±0.33%ID/g 및 0.47±0.19%ID/g를 나타내었던(p<0.018 및 p<0.0098) 대조군 bsRituximab보다 훨씬 높은 것이다. 그러나, 혈액 제거 비율은 매우 비슷했고 뚜렷한 차이가 없었다.
이 자료에 근거하여, 예비-표적화 실험은 방사성표시된 펩타이드 헵텐이 bsMAb 투여 후 40시간에 주입되는 CaPanl 종양 내성 마우스에서 수행되었다. 734 MAb에 의한 인식을 위해 다가 DTPA를 각각 포함하고 있는, 그러나 하나는99mTc에 안정하게 결합하는 특이적 추가 그룹을 갖고 있는(IMP-192) 두 펩타이드,IMP-192 및 IMP-156가 사용되었다. 종양 내성 마우스(종양 부피~0.30cm3)에 방사성 펩타이드-헵탄(34.5μCi;1.5x10-11moles;bsMAb:펩타이드=10:1) 40 시간 후125I-bsMAb(6μCi;15μg)가 투여되었다. 마우스의 두번째 그룹이111In로 표시된 IMP156를 받은 반면, 마우스의 한 그룹은99mTc-표시된 IMP192를 받았다. 비 특이성 표적화를 위한 대조군이 방사성 표시된 펩타이드의 투여 전에125I-bsRituximab를 받는 두 그룹 및 단독으로111In 또는99mTc-표시된 펩타이드를 받는 두 그룹을 포함했다.
마우스들은 펩타이드 투여후 3 및 24 시간 후에 희생되었고, %ID/g은 종양과 다양한 조직을 위해 결정되었다. 우리의 전 발견과 일관되게, 종양에서 더 많은 bsPAM4가 비-표적화 대조군 bsRituximab과 비교하여, 각각 8.2±3.4% 및 0.3±0.08%ID, 있었다(p<0.0001). 이것은111In-IMP156의 뚜렷하게 큰 종양 흡착(20.2±5.5%ID/g 대 0.9±0.1%ID/g)에서 번역되었다. 또한 bsRituximab로 예비 표적화된 것들 보다도 bsPAM4로 예비 표적화된 마우스에서99mTc-IMP192의 종양 흡착이 더 많이 나타났다(16.8±4.8%ID/g 대 1.1±0.2%ID/g,p<0.0005). 단독으로 투여되었을 때 각 펩타이드의 종양 흡착은 bsPAM4를 받은 마우스들보다도 뚜렷이 낮게 나타났다(99mTc-IMP192 및111In-IMP156에 대하여 각각 0.2±0.05%ID/g 및 0.1±0.03%ID/g, p<0.0004 및 p<0.0001).
시간점에서 3 시에서와 같이, 펩타이드 주입후 24시간(bsPAM4 투여 후 64시간)에 bsRituximab보다 훨씬 많은 bsPAM4가 나타났다(각각 6.4±2.2%ID/g 대 0.2±0.09%ID/g,p<0.0001).이 시간점에서 bsPAM4로 예비-표적화된 마우스의 종양에서 11.1±3.5%ID/g111In-IMP156 및 12.9±4.2%ID/g99mTc-IMP192 대 bsRIT 예비 표적화된 종양에서 0.5±0.2%ID/g 및 0.4±0.03%ID/g이 있었다(각각 p<0.0008 및 p<0.0002) 단독으로 펩타이드를 받은 마우스에서 bsPAM4 예비 표적화된 펩타이드와 비교해서 종양에서 더 적은99mTc-IMP192 (0.6±0.02%ID/g,p<0.0007) 및111In-IMP156(0.09±0.02%ID/g,p<0.0002)가 나타났다.
초기 시점에서 종양:비-종양 조직 비율
선-표적화111In-펩타이드(3시간) 선-표적화99mTc-펩타이드(3시간) 125I-bsPAM4 F(ab')2(4시간)
조직 평균 (±STD) 평균 (±STD) 평균 (±STD)
종양 1.00 0.00 1.00 0.00 1.00 0.00
36.07 11.74 16.66 7.19 2.34 0.61
비장 33.40 20.62 14.62 9.12 2.15 0.74
신장 7.79 2.81 8.13 3.33 1.10 0.20
44.55 12.99 15.75 5.85 1.58 0.37
혈액 36.47 8.28 9.93 5.21 0.47 0.11
123.24 40.00 - - - -
W. bone 378.00 124.57 - - - -
췌장 155.55 30.07 73.29 32.85 4.65 1.23
종양Wt.(g)(±STD) 0.189 (0.070) 0.174 (0.050) 0.179 (0.139)
상기의 표는 방사성표시된 산물의 투여 후 초기시각에서 각각 이 그룹들의 다양한 조직의 종양:비종양 비율(T:NT)를 나타낸다. bsPAM4 x m734 F(ab')2의 투여후 4 시간에서 종양:혈액 비율은 2:1보다 더 적게 나왔다는 것이 중요하다. 그러나, 투여 후 3시간에서 예비-표적화된111In-IMP156 및99mTc-IMP192은, 단독으로 쓰인125I-bsPAM4에 대한 4:1이 비하여, 각각 274:1 및 80:1의 뚜렷하게 더 높은 값을 가졌다. 이 자료들은 비 종양 조직에 전달하는 방사능의 양은 최소로 하면서 종양에는 높은 방사능의 양을 전달하는 짧은 반감기 및 높은 에너지의 방사성아이소토프을 갖는 예비 표적화된 bsPAM4 접근을 사용하는 능력을 강하게 제시한다.
본 발명의 생산물, 조성, 방법 및 공정으로부터 만들어질 수 있는 다양한 변경과 변형은 당 분야에서 그러한 기술로 명백해질 것이다. 따라서, 본 발명은 그러한 변경과 변형을 포함하는 것을 의도하며, 덧붙여진 청구항 및 그것들의 동등함의 범위에서 그것들이 제공된다.
상기 인용된 모든 출판물, 특허, 및 특허 출원들의 개시는 여기 참고 문헌에명백하게 기재되어 있다.
본 발명에 의한 항체는 췌장암에 대하여 유용한 진단 도구로서의 역할을 수행하며, 기존의 췌장암의 진단/검출 및 치료에 사용된 항체에 비하여 표적 항원에 대한 증가된 결합력, 혈액에서의 감소된 농도를 나타낼 뿐 아니라 일반 조직 및 세포를 독성 약물로부터 보호하는데 최적의 효과를 나타내므로, 이는 췌장암의 진단/검출 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (155)

  1. MUC1 반복 도메인의 아미노 말단과 개시부 사이에 위치하는 도메인에 결합하고, 뮤신에 의한 면역화 및/또는 선발에 의해 유래된 인간화된 항체 또는 그 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 췌장암의 뮤신에 대항해서 생성되거나 선발된 항체 또는 그 단편.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 PAM4 항체 또는 그 단편인 항체 또는 그 단편.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 인간화된 항체 또는 그 단편인 항체 또는 그 단편.
  5. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 온전히 인간 항체 또는 그 단편인 항체 또는 그 단편.
  6. 마우스 PAM4 단클론항체의 상보성 결정지역(CDRs) 및 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 변이 영역 및 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 특정 영역의 구조 영역(FR)을 포함하되,
    인간화된 PAM4 단클론항체의 경쇄 변이 영역의 CDRs은 아미노산 서열 SASSSVSSSYLY를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 STSNLAS을 포함하는 CDR2, 아미노산 서열 HQWNRYPYT를 포함하는 CDR3를 포함하고,
    인간화된 PAM4 단클론항체의 중쇄 변이 영역의 CDRs은 아미노산 서열 SYVLH를 포함하는 CDR1, 아미노산 서열 YINPYNDGTQYNEKFKG를 포함하는 CDR2, 아미노산 서열 GFGGSYGFAY를 포함하는 CDR3를 포함하는 인간화된 항체 및 그 단편.
  7. 제4항에 있어서, 상기 인간화된 항체 또는 그 단편의 경쇄 및 중쇄 변이 영역의 FRs가 마우스 PAM4 단클론항체의 대응 FRs으로부터 치환된 하나 이상의 아미노산을 포함하는 인간화된 항체 또는 그 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 마우스 PAM4 단클론항체로부터 치환된 상기 아미노산은 도 1B의 PAM4 VH 아미노산 서열의 마우스 중쇄 변이 영역의 아미노산 잔기 5, 27, 30, 38, 48, 66, 67 및 69로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산인 인간화된 항체 또는 그 단편.
  9. 제7항에 있어서, 상기 마우스 단클론항체로부터의 상기 아미노산이 도 1A의 PAM4Vκ 서열의 마우스 경쇄 변이 영역의 아미노산 잔기 21, 47, 59, 60, 85, 87 및 100으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산인 인간화된 항체 또는 그 단편.
  10. 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 도 1A의 PAM4Vκ 뉴클레오티드 서열 및 도 1B의 PAM4 VH 뉴클레오티드 서열을 하나 이상 포함하는 항체 또는 그 단편.
  11. 제4항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 도 4A의 hPAM4 VH아미노산 서열 및 도 4B의 hPAM4 Vκ 아미노산 서열을 포함하는 항체 또는 그 단편.
  12. 제1항 내지 11항 중 어느 한 항의 항체 또는 그 단편을 포함하고 하나 이상의 진단제 및/또는 치료제에 결합되어 있는 항체 성분을 포함하는 암세포 표적화 진단 또는 치료 컨쥬게이트.
  13. 제12항에 있어서, 상기 진단/검출제는 방사성핵종, 조영제(contrast agent) 및 광활성 진단/검출제로 이루어진 군으로부터 선택되는 진단 컨쥬게이트.
  14. 제13항에 있어서, 상기 진단/검출제는 방사성핵종인 진단 컨쥬게이트.
  15. 제14항에 있어서, 상기 방사성핵종이 20 내지 4,000 keV의 에너지를 갖는 진단 컨쥬게이트.
  16. 제14항에 있어서, 상기 방사성핵종이 감마-, 베타- 또는 양전자-방사 동위원소인 진단 컨쥬게이트.
  17. 제16항에 있어서, 상기 방사성핵종이110In,111In,177Lu,18F,52Fe,62Cu,64Cu,67Cu,67Ga,68Ga,86Y,90Y,89Zr,94mTc,94Tc,99mTc,120I,123I,124I,125I,131I,154-158Gd,32P,11C,13N,15O,186Re,188Re,51Mn,52mMn,55Co,72As,75Br,76Br,82mRb,83Sr 또는 다른 감마-, 베타-, 또는 양전자-방사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 진단 컨쥬케이트.
  18. 제13항에 있어서, 상기 진단/검출제가 방사성 조영제인 진단 컨쥬게이트.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조영제가 상자성 이온인 진단 컨쥬게이트.
  20. 제19항에 있어서, 상기 상자성 이온이 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및 에르븀(III)을 포함하는 금속인 진단 컨쥬게이트.
  21. 제18항에 있어서, 상기 조영제가 란탄(III), 금(III), 납(II) 및 특히 비스무스(III)를 포함하는 금속인 진단 컨쥬게이트.
  22. 제18항에 있어서, 상기 조영제가 초음파 향상제인 진단 컨쥬게이트.
  23. 제22항에 있어서, 상기 초음파 향상제가 리포좀(liposome)인 진단 컨쥬게이트.
  24. 제23항에 있어서, 상기 리포솜이 가스로 채워진 진단 컨쥬게이트.
  25. 제18항에 있어서, 상기 조영제가 요오드 화합물, 바륨 화합물, 갈륨 화합물 및 탈륨 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사선 불투과성 물질인 진단 컨쥬게이트.
  26. 제25항에 있어서, 상기 방사선 불투과성 물질이 바륨, 디아트리조에이트(diazotriate), 에티오다이즈드 오일(ethiodized oil), 갈륨 사이트레이트(gallium citrate), 이오카르믹산(iocarmic acid), 이오세타믹산(iocetamic acid), 이오다미드(iodamide), 이오디파미드(iodipamide), 이오독사믹산(iodoxamic acid), 이오굴라미드(iogulamide), 이오헥솔(iohexol), 이오파미돌(iopamidol), 이오파노익산(iopanoic acid), 이오프로세믹산(ioprocemic acid), 이오세파믹산(iosefamic acid), 이오세릭산(ioseric acid), 이오술라미드 메글루민(iosulamide meglumine), 이오세메틱산(iosemetic acid), 이오타술(iotasul), 이오테트릭산(iotetric acid), 이오탈라믹산(iothalamic acid), 이오트록식산(iotroxic acid), 이옥사글릭산(ioxaglic acid), 이옥소트리조익산(ioxotrizoic acid), 이포데이트(ipodate), 메글루민(meglumine), 메트리자미드(metrizamide), 메트리조에이트(metrizoate), 프로필리오돈(propyliodone) 및 탈로스 클로라이드(thallous chloride)로 이루어진 군으로부터 선택되는 진단 컨쥬게이트.
  27. 제13항에 있어서, 상기 진단/검출제가 광활성 진단/검출제인 진단 컨쥬게이트.
  28. 제27항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리테린(phycoerytherin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin),o-프탈데하이드(o-phthaldehyde) 및 플루오레스카민(fluorescamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 형광 표지 화합물인 진단 컨쥬게이트.
  29. 제27항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 방향성 아크리디늄 에스테르(aromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄염(acridinium salt) 및 옥살레이트 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학발광 표지 화합물인 진단 컨쥬게이트.
  30. 제27항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 루시페린, 루시페라아제 및 에쿼린(aequorin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오형광 화합물인 진단 컨쥬게이트.
  31. 제13항에 있어서, 상기 컨쥬게이트는 수술중, 내시경, 또는 혈관내 종양 진단에 사용되는 진단 컨쥬게이트.
  32. 제12항에 있어서, 상기 치료제는 방사성핵종, 면역조절제(immunomodulator), 호르몬, 호르몬 길항제, 올리고뉴클레오티드, 효소, 효소 억제제, 광활성 치료제, 세포독성제(cytotoxic agent), 혈관형성 억제제(angiogenesis inhibitor) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 컨쥬게이트.
  33. 제32항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)인 치료 컨쥬게이트.
  34. 제33항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 종양 유전자(oncogene)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드인 치료 컨쥬게이트.
  35. 제34항에 있어서, 상기 종양 유전자가 bcl-2 또는 p53인 치료 컨쥬게이트.
  36. 제32항에 있어서, 상기 치료제가 세포독성제인 치료 컨쥬게이트.
  37. 제36항에 있어서, 상기 세포독성제가 약물 또는 독소인 치료 컨쥬게이트.
  38. 제37항에 있어서, 상기 약물이 세포분열저지제(antimitotic agent), 알킬화제, 대사길항제(antimetabolite agent), 혈관형성저지제(antiangiogenic agent), 세포자사제(apoptotic agent), 알칼로이드 및 항생제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 특성을 갖는 치료 컨쥬게이트.
  39. 제37항에 있어서, 상기 약물이 질소 머스타드(nitrgen mustards), 제미시타빈(gemicitabine), 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아(nitrosourea), 트리아젠(triazenes), 폴릭산 유사체(folic acid analogs), 안트라사이클린(anthracyclines), 탁산(taxanes), SN-38, COX-2 억제제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항생제, 효소, 효소 억제제, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins), 백금 배위 착물, 유사분열억제제(vinca alkaloid), 치환 우레아, 메틸 히드라진 유도체, 부신피질 억제제, 호르몬 길항제, 엔도스타틴(endostatin), 탁솔(taxol), 캄토테신(camptothecins), 독소루비신(doxorubicins)및 이들의 유사체, 대사길항제, 알킬화제, 세포분열저지제(antimitotic), 혈관형성저지제(antiangiogenic agent), 세포자사제(apoptotic agent), 메트로트렉세이트(metrotrexate), CPT-11 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 컨쥬게이트.
  40. 제37항에 있어서, 상기 독소가 동물, 식물 및 미생물 근원으로 이루어진 군으로부터 선택된 근원으로부터 유래되는 치료 컨쥬게이트.
  41. 제37항에 있어서, 상기 독소가 리신(ricin), 아브린(abrin), 알파 독소(alpha toxin), 사포린(saporine), 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스타필로코칼 엔테로톡신-A(staphylcoccalenterotoxin-A), 미국자리공 항바이러스 단백질(pokeweed antivirul protein), 젤로닌(gelonin), 디프테린 독소(diphtherin toxin), 슈도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin) 및 슈도모나스 내독소(pseudomonas endotoxin)로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 컨쥬게이트.
  42. 제32항에 있어서, 상기 치료제가 면역조절제인 치료 컨쥬게이트.
  43. 제42항에 있어서, 상기 면역조절제가 사이토카인(cytokine), 줄기 세포 성장 인자(stem cell growth factor), 세포장애인자(lymphotoxin), 조혈인자(hematopoietic factor), 균체자극인자(colony stimulating factor, CSF), 인터페론(IFN), 줄기세포 성장 인자, 적혈구생성촉진인자(erythropoietin), 혈소판증식인자(thrombopoietin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료제.
  44. 제43항에 있어서, 상기 세포장애인자가 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF) 이고, 상기 조혈인자가 인터루킨(IL)이고, 상기 균체자극인자가 과립구-균체자극인자(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF) 또는 과립구 대식세포-균체자극인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GMCSF)이고, 상기 인터페론이 인터페론-α, -β 또는 -γ이고, 상기 줄기세포 성장 인자가 "S1 인자"로 표시되는 치료 컨쥬게이트.
  45. 제42항에 있어서, 상기 면역조절제가 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론-γ, TNF-α 또는 그 조합인 치료 컨쥬게이트.
  46. 제32항에 있어서, 상기 치료제가 방사성핵종인 치료 컨쥬게이트.
  47. 제46항에 있어서, 상기 방사성핵종이 60 내지 700 keV의 에너지를 갖는 치료 컨쥬게이트.
  48. 제47항에 있어서, 상기 방사성핵종이32P,33P,47Sc,64Cu,67Cu,67GA,86Y,90Y,111Ag,111In,125I,131I,142Pr,153Sm,161Tb,166Dy,166Ho,177Lu,186Re,188Re,189Re,212Pb,212Bi,213Bi,211At,223Ra 및225Ac 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 컨쥬케이트.
  49. 제32항에 있어서, 상기 치료제가 광활성 치료제인 치료 컨쥬게이트.
  50. 제49항에 있어서, 상기 광활성 치료제가 색원체(chromogens) 및 염료(dye)로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 컨쥬게이트.
  51. 제32항에 있어서, 상기 치료제가 효소인 치료 컨쥬게이트.
  52. 제51항에 있어서, 상기 효소가 말레이트 데하이드로제나제(malate dehydrogenase), 스타필로코칼 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이소머라아제(delta-V-steroid isomerase), 이스트 알콜 데하이드로제나아제, α-글리세로포스페이트 데하이드로제나아제, 트리오스 포스페이트 이소머라아제(triose phosphate isomerase), 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코스 옥시다아제, β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로제나아제, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스테라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 치료 컨쥬게이트.
  53. PAM4 표적 항원에 대한 친화성을 갖는 하나 이상의 항원 결합 부위 및 헵텐 분자에 대한 친화성을 갖는 하나 이상의 헵텐 결합 부위를 포함하는 다가 다중특이성 항체 또는 그 단편.
  54. 제53항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 인간화된 항체 또는 그 단편인 항체 또는 그 단편.
  55. 제53항에 있어서, 상기 항체 또는 그 단편이 온전히 인간 항체 또는 그 단편인 항체 또는 그 단편.
  56. 제53항에 있어서, 진단제 또는 치료제를 더 포함하는 항체 또는 그 단편.
  57. 둘 이상의 PAM4 단클론항체 또는 그 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편.
  58. 하나 이상의 제1 PAM4 단클론항체 또는 그 단편 및 PAM4 단클론항체 또는 그 단편이 아닌 하나 이상의 제2 단클론항체 또는 그 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편.
  59. 제58항에 있어서, 상기 제2 단클론항체는 암종(carcinoma)-결합 항체인 항체 융합 단백질 또는 그 단편.
  60. 제59항에 있어서, 상기 암종-결합 항체가 췌장암 항원에 결합하거나 췌장암으로부터 유래한 항체 융합 단백질 또는 그 단편.
  61. 제59항에 있어서, 상기 암종-결합 항체가 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLea, 루이스 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체, CSAp, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, TAG-72, EGFR, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장인자, IL-6, CD40, 혈관형성 인자(angiogenesis factor; e.g., VEGF), 종양유전자 산물 및 HER2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 융합 단백질 또는 그 단편.
  62. 제57항에 있어서, 상기 융합 단백질이 하나 이상의 진단제 또는 치료제를 더 포함하는 항체 융합 단백질.
  63. (a) PAM4 항체 또는 그 단편,
    (b) 상기 PAM4 단클론항체 또는 그 단편을 둘 이상 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편,
    (c) 상기 단클론항체 또는 그 단편을 포함하는 하나 이상의 제1 PAM4 단클론항체 또는 그 단편 및 PAM4 단클론항체 또는 그 단편이 아닌 하나 이상의 제2 단클론항체 또는 그 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편, 및
    (d) 하나 이상의 제1 PAM4 단클론항체 또는 그 단편 및 암종 결합 항체인 하나 이상의 제2 단클론항체 또는 그 단편을 포함하는 항체 융합 단백질 또는 그 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 단클론항체 또는 그 단편을 인코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 서열.
  64. 제63항에 있어서, 상기 암종 결합 항체가 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLea, 루이스 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체, CD40, 혈관형성 인자(angiogenesis factor; e.g., VEGF), 종양유전자 산물, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, TAG-72, EGFR, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장인자, IL-6 및 HER2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체 융합 단백질 또는 그 단편.
  65. 제60항의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터.
  66. 제63항의 DNA 서열을 포함하는 숙주세포.
  67. (i) 하나 이상의 진단제 및/또는 치료제에 접합된 PAM4 항체 또는 그 단편을 포함하는 조성물을 제공하는 단계, 및 (ii) 필요한 환자에게 제12항의 진단 또는 치료 컨쥬게이트를 투여하는 단계를 포함하는, 진단제 또는 치료제 또는 이들의 조합을 표적에게 전달하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 진단/검출제는 방사성핵종, 조영제 및 광활성 진단/검출제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 진단/검출제가 방사성핵종인 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 방사성핵종이 20 내지 4,000 keV의 에너지를 갖는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 방사성핵종이 감마-, 베타-, 또는 양전자-방사 동위원소인 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 방사성 핵종이110In,111In,177Lu,18F,52Fe,64Cu,64Cu,67Cu,67Ga,68Ga,86Y,90Y,89Zr,94mTc,94Tc,99mTc,120I,123I,124I,125I,131I,154-158Gd,32P,11C,13N,15O,186Re,188Re,51Mn,52mMn,55Co,72As,75Br,76Br,82mRb,83Sr 또는 다른 감마-, 베타-, 또는 양전자-방사체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  73. 제68항에 있어서, 상기 진단/검출제가 조영제인 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 조영제가 상자성 이온인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 상자성 이온이 크롬(III), 망간(II), 철(III), 철(II), 코발트(II), 니켈(II), 구리(II), 네오디뮴(III), 사마륨(III), 이테르븀(III), 가돌리늄(III), 바나듐(II), 테르븀(III), 디스프로슘(III), 홀뮴(III) 및 에르븀(III)을 포함하는 금속인 방법.
  76. 제73항에 있어서, 상기 조영제가 란탄(III), 금(III), 납(II) 및 특히 비스무스(III)를 포함하는 금속인 방법.
  77. 제73항에 있어서, 상기 조영제가 초음파 향상제인 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 초음파 향상제가 리포좀(liposome)인 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 리포솜이 가스로 채워진 방법.
  80. 제73항에 있어서, 상기 조영제가 요오드 화합물, 바륨 화합물, 갈륨 화합물 및 탈륨 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사선 불투과성 물질인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 상기 방사선 불투과성 물질이 바륨, 디아트리조에이트(diazotriate), 에티오다이즈드 오일(ethiodized oil), 갈륨 사이트레이트(gallium citrate), 이오카르믹산(iocarmic acid), 이오세타믹산(iocetamic acid), 이오다미드(iodamide), 이오디파미드(iodipamide), 이오독사믹산(iodoxamic acid), 이오굴라미드(iogulamide), 이오헥솔(iohexol), 이오파미돌(iopamidol), 이오파노익산(iopanoic acid), 이오프로세믹산(ioprocemic acid), 이오세파믹산(iosefamic acid), 이오세릭산(ioseric acid), 이오술라미드 메글루민(iosulamide meglumine), 이오세메틱산(iosemetic acid), 이오타술(iotasul), 이오테트릭산(iotetric acid), 이오탈라믹산(iothalamic acid), 이오트록식산(iotroxic acid), 이옥사글릭산(ioxaglic acid), 이옥소트리조익산(ioxotrizoic acid), 이포데이트(ipodate), 메글루민(meglumine), 메트리자미드(metrizamide), 메트리조에이트(metrizoate), 프로필리오돈(propyliodone) 및 탈로스 클로라이드(thallous chloride)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  82. 제68항에 있어서, 상기 진단/검출제가 광활성 진단/검출제인 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 플루오레세인 이소티오시아네이트(gluorescein isothiocyanate), 로다민(rhodamine), 피코에리테린(phycoerytherin), 피코시아닌(phycocyanin), 알로피코시아닌(allophycocyanin),o-프탈데하이드(o-phthaldehyde) 및 플루오레스카민(fluorescamine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 형광 표지 화합물인 방법.
  84. 제82항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 방향성 아크리디늄 에스테르(aromatic acridinium ester), 이미다졸, 아크리디늄염(acridinium salt) 및 옥살레이트 에스테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 화학발광 표지 화합물인 방법.
  85. 제82항에 있어서, 상기 광활성 진단/검출제가 루시페린, 루시페라아제 및 에쿼린(aequorin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 바이오형광 화합물인 방법.
  86. 제67항에 있어서, 상기 치료제는 세포사멸제, 사이토카인, 면역조절제, 호르몬, 호르몬길항제, 성장 인자, 방사성핵종, 금속, 조영제, 올리고뉴클레오티드, 효소, 효소 억제제 및 광활성 치료제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  87. 제86항에 있어서, 상기 뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucleotide)인 치료 컨쥬게이트.
  88. 제87항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 종양 유전자(oncogene)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드.
  89. 제88항에 있어서, 상기 종양 유전자가 bcl-2 또는 p53인 안티센스 올리고뉴클레이드.
  90. 제86항에 있어서, 상기 치료제가 세포독성제인 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 세포독성제가 약물 또는 독소인 방법.
  92. 제91항에 있어서,상기 약물이 세포분열저지제(antimitotic agent), 알킬화제, 대사길항제(antimetabolite agent), 혈관형성저지제(antiangiogenic agent), 세포자사제(apoptotic agent), 알칼로이드 및 항생제 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 약학적 특성을 갖는 방법.
  93. 제91항에 있어서, 상기 약물이 질소 머스타드(nitrgen mustards), 제미시타빈(gemicitabine), 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아(nitrosourea), 트리아젠(triazenes), 폴릭산 유사체(folic acid analog), 안트라사이클린(anthracyclines), 탁산(taxanes), SN-38, COX-2 억제제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체, 항생제, 효소, 효소 억제제, 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins), 백금 배위 착물, 유사분열억제제(vinca alkaloid), 치환 우레아, 메틸 히드라진 유도체, 부신피질 억제제, 호르몬 길항제, 엔도스타틴(endostatin), 탁솔(taxol), 캄토테신(camptothecins), 독소루비신(doxorubicins) 및 이들의 유사체, 대사길항제, 알킬화제, 세포분열저지제(antimitotic), 혈관형성저지제(antiangiogenic agent), 세포자사제(apoptotic agent), 메트로트렉세이트(metrotrexate), CPT-11 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  94. 제91항에 있어서, 상기 독소가 동물, 식물 및 미생물 근원으로 이루어진 군으로부터 선택된 근원으로부터 유래되는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 독소가 리신(ricin), 아브린(abrin), 알파 독소(alpha toxin), 사포린(saporine), 리보뉴클레아제(RNase), DNase I, 스타필로코칼 엔테로톡신-A(staphylcoccalenterotoxin-A), 미국자리공 항바이러스 단백질(pokeweed antivirul protein), 젤로닌(gelonin), 디프테린 독소(diphtherin toxin), 슈도모나스 외독소(pseudomonas exotoxin) 및 슈도모나스 내독소(pseudomonas endotoxin)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  96. 제86항에 있어서, 상기 치료제가 면역조절제인 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 면역조절제가 사이토카인(cytokine), 줄기 세포 성장 인자(stem cell growth factor), 세포장애인자(lymphotoxin), 조혈인자(hematopoietic factor), 균체자극인자(colony stimulating factor, CSF), 인터페론(IFN), 줄기세포 성장 인자, 적혈구생성촉진인자(erythropoietin), 혈소판증식인자(thrombopoietin) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  98. 제97항에 있어서, 상기 세포장애인자가 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF) 이고, 상기 조혈인자가 인터루킨(IL)이고, 상기 균체자극인자가 과립구-균체자극인자(granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF) 또는 과립구 대식세포-균체자극인자(granulocyte macrophage-colony stimulating factor, GMCSF)이고, 상기 인터페론이 인터페론-α, -β 또는 -γ이고, 상기 줄기세포 성장 인자가 "S1 인자"로 표시되는 방법.
  99. 제96항에 있어서, 상기 면역조절제가 사이토카인인 방법.
  100. 제96항에 있어서, 상기 면역조절제가 IL-1, IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IL-21, 인터페론-γ, TNF-α 또는 그 조합인 방법.
  101. 제86항에 있어서, 상기 치료제가 방사성핵종인 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 방사성핵종이 60 내지 700 keV의 에너지를 갖는 방법.
  103. 제96항에 있어서, 상기 방사성핵종이32P,33P,47Sc,64Cu,67Cu,67GA,86Y,90Y,111Ag,111In,125I,131I,142Pr,153Sm,161Tb,166Dy,166Ho,177Lu,186Re,188Re,189Re,212Pb,212Bi,213Bi,211At,223Ra 및225Ac 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  104. 제86항에 있어서, 상기 치료제가 광활성 치료제인 방법.
  105. 제104항에 있어서, 상기 광활성 치료제가 색원체(chromogens) 및 염료(dye)로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  106. 제86항에 있어서, 상기 치료제가 효소인 방법.
  107. 제106항에 있어서, 상기 효소가 말레이트 데하이드로제나제(malate dehydrogenase), 스타필로코칼 뉴클레아제, 델타-V-스테로이드 이소머라아제(delta-V-steroid isomerase), 이스트 알콜 데하이드로제나아제, α-글리세로포스페이트 데하이드로제나아제, 트리오스 포스페이트 이소머라아제(triose phosphate isomerase), 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase), 알칼라인 포스파타아제, 아스파라기나아제, 글루코스 옥시다아제, β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라아제, 글루코스-5-포스페이트 데하이드로제나아제, 글루코아밀라아제 및 아세틸콜린에스테라아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  108. (a) 제53항의 항체 또는 그 단편을 환자에게 투여하는 단계;
    (b) 소정량의 비-항체가 환자의 혈류를 깨끗이 하도록 충분한 시간을 기다리는 단계; 및
    (c) 상기 항체의 결합 부위에 결합하는, 진단/검출제, 치료제 또는 그 조합을 포함하는 담체 분자를 상기 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는 진단/검출제, 치료제 또는 이들의 조합을 표적에 전달하는 방법.
  109. 제108항에 있어서, 상기 담체 분자가 상기 항체의 하나 이상의 결합 부위에 결합하는 방법.
  110. 제108항에 있어서, 상기 진단/검출제 또는 상기 치료제가 동위원소, 약물,사이토카인, 호르몬, 호르몬 길항체, 올리고뉴클레오티드, 효소, 효소 억제제, 성장인자, 방사성핵종 및 금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  111. 제110항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  112. 제111항에 있어서, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드가 종양유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드인 방법.
  113. 제112항에 있어서, 상기 종양 유전자가 bcl-2 또는 p53인 방법.
  114. (a) 제50항의 항체 또는 그 단편을 필요한 환자에게 투여하는 단계;
    (b) 소정량의 비-항체가 환자의 혈류를 깨끗이 하도록 충분한 시간을 기다리는 단계; 및
    (c) 상기 항체의 결합부위에 결합하는, 진단/검출제, 치료제 또는 그 조합을 포함하는 담체를 상기 환자에게 투여하는 단계
    를 포함하는 암의 진단 또는 치료 방법.
  115. 제114항에 있어서, 상기 암이 췌장암인 방법.
  116. 제114항에 있어서, 상기 방법이 질병 조직의 수술중 동정, 질병 조직의 내시경 동정 또는 질병 조직의 혈관내 동정에 사용될 수 있는 방법.
  117. (a) 하나 이상의 치료제에 접합 되어 있는 PAM4 단클론항체 또는 그 단편 또는 PAM4 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 포함하는 치료학적 유효량의 항체 또는 그 단편을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및
    (b) 상기 PAM4 단클론항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 약학적으로 적절한 부형제로 제형화하는 단계
    를 포함하는 환자의 악성 종양을 치료하는 방법.
  118. 제117항에 있어서, 제2 단클론항체 또는 그 단편을 더 포함하는 방법.
  119. 제118항에 있어서, 상기 제2 단클론항체 또는 그 단편이 단클론항체 자체 또는 그 단편인 방법.
  120. 제118항에 있어서, 상기 제2 단클론항체 또는 그 단편이 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLea, 루이스 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체, CSAp, MUC1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, TAG-72, EGFR, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장인자, IL-6, CD40, 혈관형성 인자(angiogenesisfactor; e.g., VEGF), 종양유전자 산물 및 HER2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  121. 제118항에 있어서, 상기 제2 단클론항체 또는 그 단편이 치료제 또는 진단/검출제에 접합 되어 있는 방법.
  122. 제117항에 있어서, 제1항 내지 53항 중 어느 한 항의 제2 단클론항체 또는 그 단편을 더 포함하는 방법.
  123. 제117항에 있어서, 상기 PAM4 항체가 비경구 투여되는 방법.
  124. 제123항에 있어서, 상기 PAM4 항체가 매 복용 당 20 내지 2000 밀리그램 단백질의 복용량으로 투여되는 방법.
  125. 제124항에 있어서, 상기 복용량이 반복적으로 투여되는 방법.
  126. 제117항에 있어서, 상기 PAM4 항체 또는 그 단편이 유인(類人) 영장류 PAM4 항체 또는 그 단편, 인간 PAM4 항체 또는 그 단편 및 인간화된 PAM4 항체 또는 그 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  127. 제126항에 있어서, 상기 인간 및 인간화된 PAM4 항체의 특정 영역 및 경첩부는 인간 IgG의 특정 영역 및 경첩부를 포함하는 방법.
  128. 제117항에 있어서, 상기 악성 종양에 의해 발현되는 제2 종양 마커와 반응성이 있는 제2 항체 자체 또는 제2 컨쥬게이트 항체가 상기 환자에게 투여되기 전, 투여될 때 같이, 또는 투여된 후에 상기 PAM4 항체가 투여되는 방법.
  129. 제117항에 있어서, 하나 이상의 치료제가 상기 환자에게 투여되기 전, 동시에, 또는 그 후에 상기 PAM4 항체가 투여되는 방법.
  130. (a) 하나 이상의 진단/검출제에 접합 되어 있는 PAM4 단클론항체 또는 그 단편 또는 PAM4 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 포함하는 진단 컨쥬게이트의 진단학적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계; 및
    (b) 선택적으로, 상기 PAM4 단클론항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을 약학적으로 적절한 부형제로 제형화하는 단계
    를 포함하는 환자의 악성 종양 진단 방법.
  131. (i) PAM4 단클론항체 자체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 자체 또는 그 단편을 포함하는 조성물의 치료학적 유효량을 상기 환자에게 투여하는 단계 및 (ii) 상기 PAM4 단클론항체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 또는 그 단편을약학적으로 적절한 부형제로 제형화하는 단계를 포함하는 환자의 암세포 치료방법.
  132. 제131항에 있어서, 상기 조성물이 제2 항체 자체 또는 그 단편을 더 포함하는 방법.
  133. 제132항에 있어서, 상기 제2 항체 자체 또는 그 단편이 PAM4 단클론항체 또는 그 단편인 방법.
  134. 제132항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 그 단편이 PAM4 단클론항체 또는 그 단편이 아닌 방법.
  135. 제132항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 그 단편이 CA19.9, DUPAN2, SPAN1, Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLea, 루이스 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체, CSAp, MUC1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, TAG-72, EGFR, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장인자, IL-6, CD40, 혈관형성 인자(angiogenesis factor; e.g., VEGF), 종양유전자 산물 및 HER2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  136. 제134항에 있어서, 상기 제2 항체 또는 그 단편이 CA19.9, DUPAN2, SPAN1,Nd2, B72.3, CC49, CEA, aLea, 루이스 항원 Le(y)에 의해 정의된 항체, CSAp, MUC1, MUC-2, MUC-3, MUC-4, TAG-72, EGFR, 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 테나신(tenascin), 혈소판 유래 성장인자, IL-6, CD40, 혈관형성 인자(angiogenesis factor; e.g., VEGF), 종양유전자 산물 및 HER2/neu로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  137. 제131항에 있어서, 상기 PAM4 항체 자체가 비경구 투여되는 방법.
  138. 제137항에 있어서, 상기 PAM4 항체 자체가 매 복용 당 20 내지 2000 밀리그램 단백질의 복용량으로 투여되는 방법.
  139. 제138항에 있어서, 상기 복용량이 반복적으로 투여되는 방법.
  140. 제131항에 있어서, 상기 PAM4 항체 자체 또는 그 단편이 유인(類人) 영장류 PAM4 항체, 인간 PAM4 항체 및 인간화된 PAM4 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  141. 제140항에 있어서, 상기 인간 및 인간화된 PAM4 항체 자체의 특정 영역 및 경첩부는 인간 IgG의 특정 영역 및 경첩부를 포함하는 방법.
  142. 제132항에 있어서, 상기 제2 항체 자체가 상기 환자에게 투여되기 전, 투여될 때 같이, 또는 투여된 후에 상기 PAM4 항체 자체 또는 그 단편이 투여되는 방법.
  143. (i) 제1항의 PAM4 단클론항체 자체 또는 그 단편 또는 항체 융합 단백질 자체 또는 그 단편을 포함하는 조성물로써 환자의 표본에 대해 시험관내(in vitro) 진단 분석을 행하는 것을 포함하는 환자의 악성 종양 진단 방법.
  144. 제143항에 있어서, 상기 악성종양이 암종인 방법.
  145. 제144항에 있어서, 상기 암이 췌장암인 방법.
  146. 제143항에 있어서, 상기 시험관내 진단 분석이 면역측정법, PCR, PT-PCR 및 면역조직화학법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  147. 제146항에 있어서, 상기 시험관내 진단 분석이 PT-PCR 또는 면역측정법인 방법.
  148. 제147항에 있어서, 상기 표본이 체액 또는 조직인 방법.
  149. 제146항에 있어서, 상기 진단 분석이 면역조직화학법인 방법.
  150. 제149항에 있어서, 상기 표본이 세포 집단 또는 조직인 방법.
  151. (A) 적어도 한 팔은 PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하고 적어도 다른 한 팔은 표적화가능한 컨쥬게이트에 특이적으로 결합하되, 상기 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 한 팔은 hPAM4 항체 또는 그 단편인 이특이성 항체 또는 항체 단편의 유효량을 투여하는 단계; 및
    (B) (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
    (ii) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
    (iii) Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2;
    (iv)
    (v)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화가능한 컨쥬게이트를 투여하는 단계
    를 포함하는 환자의 PAM4 항원 발현 질병 조직을 수술중 동정하는 방법.
  152. (A) 적어도 한 팔은 PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하고 적어도 다른 한 팔은 표적화가능한 컨쥬게이트에 특이적으로 결합하되, 상기 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 한 팔은 hPAM4 항체 또는 그 단편인 이특이성 항체 또는 항체 단편의 유효량을 투여하는 단계; 및
    (B) (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
    (ii) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
    (iii) Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2;
    (iv)
    (v)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화가능한 컨쥬게이트를 투여하는 단계
    를 포함하는 환자의 PAM4 항원 발현 질병 조직을 내시경 동정하는 방법.
  153. (A) 적어도 한 팔은 PAM4-항원을 발현하는 표적화된 조직에 특이적으로 결합하고 적어도 다른 한 팔은 표적화가능한 컨쥬게이트에 특이적으로 결합하되, 상기 표적화된 조직에 특이적으로 결합하는 한 팔은 hPAM4 항체 또는 그 단편인 이특이성 항체 또는 항체 단편의 유효량을 투여하는 단계; 및
    (B) (i) DOTA-Phe-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
    (ii) DOTA-Phe-Lys(HSG)-Tyr-Lys(HSG)-NH2;
    (iii) Ac-Lys(HSG)-D-Tyr-Lys(HSG)-Lys(Tscg-Cys)-NH2;
    (iv)
    (v)
    로 이루어진 군으로부터 선택된 표적화가능한 컨쥬게이트를 투여하는 단계
    를 포함하는 환자의 PAM4 항원 발현 질병 조직을 혈관내 동정하는 방법.
  154. (a) PAM4 항원에 특이적으로 결합하는 제1 항체 결합 부위 및 헵텐에 특이적으로 결합하는 제2 항체 결합 부위를 갖는 이특이성 항체 F(ab)2또는 그의 F(ab')2단편, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 또는 테트라바디(tetrabody)를 내시경, 혈관 카테터 또는 외과 수술을 겪는 환자에게 주사하고, 이 항체 단편이 표적 부위에 부착되도록 하는 단계;
    (b) 선택적으로, 주사후 24시간 내 이특이성 단편이 순환중 대부분 제거되지 않는 경우에는 갈락토실화 안티-요오드형 제거제(galactosylated anti-idiotype clearing agent)를 사용하여 비표적화 항체 단편을 제거하고, 표적 부위에 신속히국소화하여 신장을 깨끗이 하는 이가 표지된 헵텐(bivalent labeled hepten)을 주사하는 단계;
    (c) 처음 주사 후 48시간 내에, 탐지 수단으로 표적 부위의 부착된 표지의 함량 상승을 근거리 탐지함으로써 헵텐의 존재를 감지하는 단계
    를 포함하는 내시경, 혈관 카테터 또는 외과수술 중의 병변 탐지 방법.
  155. (a) 수술중, 혈관내 또는 내시경 과정 동안 hPAM4 면역컨쥬게이트 또는 그 단편의 유효량을 환자에게 비경구 주사하는 단계;
    (b) 주사 후 48시간 내에 상기 과정을 실시하는 단계;
    (c) 상기 표지화된 항체 또는 그 단편의 존재를 탐지하는 탐지 수단으로 환자의 접근 내부를 근거리에서 스캐닝하는 단계; 및
    (d) 상기 표지화된 항체 또는 그 단편의 부착 부위에서 상기 표지화된 항체 또는 그 단편의 함량 상승을 탐지수단으로 탐지함으로써 상기 표지화된 항체 또는 그 단편의 부착 부위를 알아내는 단계
    를 포함하는 수술중, 혈관내 또는 내시경 과정 동안 근거리 병변 탐지 방법.
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