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JP5139626B2 - モノクローナル抗体ｈＰＡＭ４ - Google Patents

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Description

発明の背景
発明の分野
本発明は一価および多価の単一特異性抗体、ならびに多価多重特異性抗体に関する。詳しくは、本発明は、ＰＡＭ４と呼ばれる、ＭＵＣＩ抗原特異的抗体に関する。本発明はさらにヒト化およびヒトＰＡＭ４抗体ならびにそのフラグメント、ならびに診断および治療におけるこのような抗体およびそのフラグメントの使用に関する。
一つの態様では、本発明の抗体は一以上の同一結合部位を有し、各結合部位は標的抗原または標的抗原上のエピトープに対して親和性を有する。もう一つの態様では、本発明の抗体は標的抗原上の同じ、もしくは異なるエピトープ、または同じ、もしくは異なる標的抗原に対して親和性を有する二以上の結合部位を有するか、あるいは、少なくとも一つの結合部位が標的抗原に対して親和性を有し、少なくとも一つの結語部位がハプテンに対して親和性を有する。本発明はまた、宿主内で本明細書に記載の抗体を発現するのに有用な組換えベクターも記載する。
背景技術
膵臓は体がグルコースをエネルギーに変換するのを助けるインスリンと、体が食物を消化するのを助ける酵素を産生する。膵臓癌は、主として膵管の細胞に起こる膵臓の悪性増殖である。この疾病は９番目に多い癌の形態であるが、男性および女性での癌での主要な死因のそれぞれ４番目および５番目である。膵臓の癌はほぼ常に死に至り、５年後の生存率は３％に満たない。
膵臓癌の最も一般的な症状は黄疸、異常な痛みと体重減少であり、これらは存在する他の因子とともに、本質的に特異的なものではない。従って、腫瘍増殖の初期ステージで膵臓癌を診断するのは難しい場合が多く、相当な疑ぐりと徹底的な診断的精密検査（検査のための手術を含む場合が多い）を必要とする。内視鏡超音波検査法およびコンピューター断層撮影法は膵臓癌の診断に現在利用できる最良の非侵襲的手段である。しかし、小さな腫瘍の信頼できる検出、ならびに巣状膵炎から膵臓癌を見分けることは厄介である。残念ながら、現在のことろ、大多数の患者は、腫瘍がすでに被膜の外へ拡がって周囲の器官へ浸潤し、かつ／または著しく転移した後期ステージで診断されている。Gold et al., Crit. Rev. Oncology/Hematology, 39:147-54 (2001)．この疾病の後期検出が一般的で、「初期」膵臓癌の診断は臨床の場ではまれである。
膵臓癌に利用できる現行の治療手順は治癒にも至らず、実質的な生存期間の向上にも至っていない。外科的切除が生存の機会を与える唯一の物理療法である。しかし、腫瘍量が大きいため、１０％〜２５％の患者が「治癒的切除」の候補者となるに過ぎない。外科的処置を受けた患者でも、５年の生存期間はなお不十分であり、平均約１０％でしかない。
膵臓癌の初期検出および診断、ならびに疾病の適切なステージ判断が生存上の利益の向上をもたらすであろう。いくつかの研究室では、血流中への腫瘍関連マーカーの放出、ならびに生検検体内でのマーカー物質の検出に基づく診断法の開発を進めている。膵臓癌の最良の腫瘍関連マーカーはＣＡ１９．９の免疫アッセイである。このシアリル化Ｌｅａエピトープ構造のレベルの上昇は膵臓癌患者の７０％で見られたが、検査した巣状膵炎検体ではいずれも見られなかった。しかし、ＣＡ１９．９レベルは他のいくつかの悪性および良性症状でも上昇が見られたことから、現在、このアッセイは診断に使用できない。しかし、アッセイはモニタリングには有用であり、術後のＣＡ１９．９血清レベルにおける継続的上昇は予後が短いことを示す。多くの他のモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は発達の種々のステージで診断のための免疫アッセイを用いて報告されている。これらには、限定されるものではないが、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｂ７２．３、Ｉａ３および種々の抗ＣＥＡ抗体が含まれる。
人工の抗体、特に、ＭＡｂおよび操作抗体または抗体フラグメントが幅広く試験され、膵臓癌、ならびに癌、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、および心血管疾患をはじめとする他の種々のヒト疾患の検出および治療において重要なものであることがわかってきた[Filpula and McGuire, Exp. Opin. Ther. Patents (1999) 9: 231-245]。抗体または抗体由来薬剤の臨床的有用性は、主として、特定の疾患に関連した特定の標的抗原とのその結合能に依存している。選択性は、とりわけ、診断薬または治療薬が体内の正常組織に対して毒性がある場合に、ヒト疾患の検出および治療段階において診断薬または治療薬、例えば、同位元素、薬物、毒素、サイトカイン、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、オリゴヌクレオチド、増殖因子、オリゴヌクレオチド、放射性核種、脈管形成因子阻害剤、または金属を標的位置に送達するのに有用である。放射性標識抗体は、卵巣癌、結腸癌、およびリンパ腫をはじめとする多くの悪性腫瘍において、ある程度の成功をもって用いられている。またこの技術は、膵臓癌にも有用であることが分かっている。しかし、抗ＣＥＡ抗体およびＢ７２．３以外のものでは臨床上の情報は存在しない。
このような抗体系の潜在的な制限については、Goldenberg, The American Journal of Medicine, 94: 298-299 (1993)に記載されている。検出および治療技術において重要なパラメーターは、標的細胞が存在する部位に特異的に局在した注入投与量および摂取率、すなわち、正常組織周辺に存在する放射能濃度に対する特異的に結合した抗体の濃度の比である。抗体を血流に注入すると、それは代謝、排出されるため、多くのコンパートメントを通過する。抗体は位置を突きとめ、標的細胞抗原と結合することが可能でなければならないが、その一方で体の他の部分も通過する。抗原のターゲッティングを制御する因子としては、位置、大きさ、抗原密度、抗原接近可能性、病理組織の細胞組成、およびターゲッティングする抗体の薬物動態学が挙げられる。抗体による腫瘍ターゲッティングに特異的に影響を与えるその他の因子としては、腫瘍およびその他の組織の両方における標的抗原の発現、および放射性標識した抗体の血液クリアランスが遅いために起こる骨髄毒性が挙げられる。標的腫瘍細胞が付着するターゲッティング抗体の量は、腫瘍の血管形成および抗体浸透を妨げる障害、ならびに腫瘍内圧力によって影響を受ける。特に放射線免疫療法では、非標的器官、例えば、肝臓、腎臓または骨髄による非特異的取り込みがこの技術のもう一つの潜在的制限となり、骨髄照射では線量制限毒性がしばしば起こる。
標的部位への薬剤の送達のために提案される一つのアプローチはダイレクト・ターゲッティングと呼ばれ、診断用または治療用放射性同位元素を含む抗体を用いて特異的抗原をターゲッティングするよう設計された技術である。腫瘍に関しては、このダイレクト・ターゲッティングアプローチでは、その抗原によって標的腫瘍を認識する放射性標識抗腫瘍単一特異性抗体を用いる。この技術は標識された単一特性抗体を患者に注入し、標的腫瘍に抗体を局在させ、診断または治療上の効用を得ることを含む。結合していない抗体は体内から除去する。このアプローチは他の哺乳類疾患を診断または治療するためにも使用できる。
もう一つ提案される解決法は、「親和性増強系（Affinity Enhancement System, AES）」と呼ばれ、特に、診断用または治療用放射性同位元素を含む抗体による腫瘍ターゲッティングの欠陥を克服するよう設計された技術である［米国特許第５，２５６，３９５号(1993), Barbet et al., Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 14: 153-166 (1999)］。ＡＥＳでは、放射性標識した二価ハプテンと、標的腫瘍および放射性ハプテンの両方を認識する抗腫瘍／抗ハプテン二重特異性抗体を用いる。この手法ではまた、価数のより高いハプテンおよび特異性のより高い抗体を用いてもよい。この技術では、抗体を患者に注入し、それを標的腫瘍に局在させることを含む。結合していない抗体が血流からクリアリングされるに十分な時間の後、放射性標識したハプテンを投与する。ハプテンは標的細胞の部位に局在する抗体−抗原複合体と結合し、診断上または治療上の効用が得られ、同時に、結合していないハプテンは体内から急速にクリアリングされる。Barbetは、後者が腫瘍表面と結合すると二価ハプテンが二重特異性抗体と架橋し得るという可能性を記述している。結果として、放射性標識複合体はより安定となり、より長い時間腫瘍に留まる。この系は哺乳類の疾患を診断または治療するために使用できる。
当該技術分野では、ダイレクト・ターゲッティング系で有用な多価多重特異性抗体の生産、および親和性増強系で有用な多価多重特異性抗体の生産の必要がある。詳しくは、膵臓癌に有用な診断手段として働き、かつ、標的抗原において高い取り込みを示し、血中濃度は低く、正常な組織および細胞を有毒な医薬から最適に保護する抗体の必要がある。
発明の概要
本発明では、ＭＵＣ１のアミノ末端とリピートドメインの開始部との間に位置するドメインに結合する抗体、融合タンパク質およびそのフラグメントが意図される。ある好ましい態様では、抗体、融合タンパク質およびそのフラグメントはＰＡＭ４抗体である。本発明のＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントはムチンを用いた感作および／または選択により誘導され、好ましくは膵臓癌のムチンに対して反応性がある。従って、本発明のＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントは好ましくは膵臓癌細胞に関連する抗原と結合する。
ある好ましい態様では、ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントはヒト化または完全ヒト型であるか、あるいは、ＰＡＭ４融合タンパク質はヒト化または完全ヒトＰＡＭ４抗体もしくはそのフラグメントを含む。また、ＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントは少なくとも一つの治療薬および／または診断薬と結合させることができることも好ましい。
本明細書では、マウスＰＡＭ４ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域ならびにヒト抗体の軽鎖および重鎖定常領域のフレームワーク（ＦＲ）領域とを含んでなる、ヒト化ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントであって、ヒト化ＰＡＭ４ ＭＡｂの軽鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＨＱＷＮＲＹＰＹＴを含んでなるＣＤＲ３を含んでなり；かつ、ヒト化ＰＡＭ４ ＭＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸配列ＳＹＶＬＨを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸配列ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹを含んでなるＣＤＲ３を含んでなる、ヒト化ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントが意図される。ある好ましい態様では、ヒト化ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントの軽鎖および重鎖可変領域のＦＲは、対応するマウスＰＡＭ４ ＭＡｂのＦＲから置換されている少なくとも一つのアミノ酸を含んでなる。さらに好ましくは、ヒト化ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントは、図１Ｂのマウス重鎖可変領域、ＰＡＭ４ ＶＨアミノ酸配列のアミノ酸残基５、２７、３０、３８、４８、６６、６７、および６９からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸を含む。また、該マウスＭＡｂ由来のアミノ酸が、図１Ａのマウス軽鎖可変領域、ＰＡＭ４ＶＫ配列のアミノ酸残基２１、４７、５９、６０、８５、８７、および１００からなる群から選択される少なくとも一つのアミノ酸であるヒト化ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントも好ましい。最も好ましくは、ヒト化ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントは、図１ＡのＰＡＭ４ ＶＫヌクレオチド配列および図１ＢのＰＡＭ４ ＶＨヌクレオチド配列を含んでなり、かつ／または図４ＡのｈＰＡＭ４ ＶＨアミノ酸配列および図４ＢのｈＰＡＭ４ ＶＫアミノ酸配列を含んでなる。
本発明のもう一つの態様は、本発明の抗体、融合タンパク質もしくはそのフラグメントのいずれか一つの抗体またはそのフラグメントを含んでなり、その抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントが少なくとも一種の診断／検出薬に結合されている抗体成分を含んでなる癌細胞をターゲッティングする診断免疫複合体である。
好ましくは、診断／検出薬は、放射性核種、造影剤、および光活性診断／検出薬からなる群から選択される。さらに好ましくは、診断／検出薬は２０〜４，０００ｋｅＶのエネルギーを有する放射性核種であるか、または、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、またはその他のγ、β、もしくは陽電子放射核種からなる群から選択される放射性核種である。また、好ましくは、診断／検出薬は、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）を含んでなる金属などの常磁性イオン、またはバリウム、ジアトリアゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリアゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドンおよび塩化タリウムなどの放射線不透過性物質である。
また、好ましくは、診断／検出薬はフルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオロスカミンからなる群から選択される蛍光標識化合物、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルからなる群から選択される化学発光標識化合物、またはルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンからなる群から選択される生物発光化合物である。もう一つの態様では、本発明の診断免疫複合体は手術中、内視鏡的、または血管内腫瘍診断に用いられる。
本発明のもう一つの態様は、本発明の抗体、融合タンパク質もしくはそのフラグメントのいずれか一つの抗体またはそのフラグメントを含んでなり、その抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントが少なくとも一種の治療薬に結合されている抗体成分を含んでなる癌細胞をターゲッティングする治療免疫複合体である。
好ましくは、治療薬は放射性核種、免疫調節剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、オリゴヌクレオチド、酵素阻害剤、光活性治療薬、細胞傷害剤、脈管形成阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
一つの態様では、ｂｃｌ−２発現を阻害するアンチセンス分子などのオリゴヌクレオチドが、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許第５，７３４，０３３号(Reed)に記載されており、本発明の免疫複合体または抗体融合タンパク質の治療薬部分に結合されているか、または治療薬部分を形成し得る。あるいは、このオリゴヌクレオチドは本発明の裸の、または結合されているＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントと同時投与してもよいし、逐次投与してもよい。ある好ましい態様では、このオリゴヌクレオチドは癌遺伝子またはｂｃｌ−２などＢ細胞悪性腫瘍の癌遺伝子産物に対して向けられていることが好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
ある好ましい態様では、治療薬は薬物または毒素などの細胞傷害剤である。また、好ましくは、薬物はナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、ゲムシタビン、トリアゼン、葉酸類似体、アントラサイクリン、タキサン、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、抗生物質、酵素、酵素阻害剤、エピポドフィロトキシン、プラチナ錯体、ビンカアルカロイド、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモンアンタゴニスト、エンドスタチン、タキソール、カンプトセシン、ＳＮ−３８、ドキソルビシン、およびそれらの類似体、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗有糸分裂剤、抗脈管形成剤、アポトーシス剤、メトトレキサート、ＣＰＴ−１１、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される。
もう一つの態様では、治療薬はオリゴヌクレオチドである。例えば、このオリゴヌクレオチドはｂｃｌ−２およびｐ５３のような癌遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドなどのアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。
もう一つの態様では、治療薬はリシン、アブリン、アルファトキシン、サポリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌(Staphylococcal)内毒素−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス(Pseudomonas)外毒素、およびシュードモナス内毒素、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される毒素、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される免疫調節剤、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、２２３Ｒａおよび２２５Ａｃ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される放射性核種、または色素原および色素からなる群から選択される光活性治療薬である。
さらに好ましくは、治療薬はマレイン酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼからなる群から選択される酵素である。
本明細書では、ＰＡＭ４標的抗原に対して親和性を有する一を超える抗原結合部位とハプテン分子に対して親和性を有する一以上のハプテン結合部位を含んでなる、多価多重特異性抗体またはそのフラグメントが意図される。好ましくは、抗体またはそのフラグメントはヒト化または完全ヒト抗体もしくはそのフラグメントである。また、好ましくは、多価多重特異性抗体またはそのフラグメントは診断／検出および／または治療薬をさらに含んでなる。
本明細書ではまた、ＰＡＭ４標的抗原に対して親和性を有する少なくとも一つの結合部位と、少なくとも一種の診断薬および／または治療薬を運び得る
Figure 0005139626
 からなる群から選択されるターゲッティング可能な構築物／複合体に対して親和性を有する少なくとも一つの結合部位を含んでなる、二重特異性抗体またはそのフラグメントが記載される。本発明で用いるのに好適な他のターゲッティング可能な構築物が、「Ｄ−アミノ酸ペプチド」と題された、２００３年６月１３日出願の米国仮出願(McBride)、代理人整理番号０１８７３３／１２０６に開示されている。
本発明のもう一つの態様は、少なくとも二つのＰＡＭ４ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなり、そのＭＡｂまたはそのフラグメントが本発明の抗体およびそのフラグメントのいずれかを含んでなる、抗体融合タンパク質またはそのフラグメントである。また、好ましくは、抗体融合タンパク質またはそのフラグメントは本発明の抗体およびそのフラグメントのいずれか一つの、少なくとも一種の第一のＰＡＭ４ ＭＡｂまたはそのフラグメントと、本発明の抗体およびそのフラグメントのＭＡｂまたはそのフラグメント以外の、少なくとも一種の第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる。好ましくは、第二のＭＡｂは、ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、ＣＥＡ、ａＬｅａ、Ｌｅｗｉｓ抗原Ｌｅ（ｙ）により定義される抗体、およびＣＳＡｐに対する抗体、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、テネイシン、ＩＬ−６、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＣＤ４０、血小板由来増殖因子、ＩＬ−６、脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）、癌遺伝子の産物およびＨＥＲ２／ｎｅｕからなる群から好ましくは選択される癌腫関連抗体である。本発明の抗体融合タンパク質またはそのフラグメントは少なくとも一種の診断および／または治療薬をさらに含み得る。
また、本発明では、
（ａ）本明細書に記載の抗体のいずれか一つのＰＡＭ４抗体またはそのフラグメント；
（ｂ）（ａ）に記載の少なくとも二種のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント；
（ｃ）本発明のＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントの該ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる少なくとも一種の第一のＰＡＭ４ ＭＡｂまたはそのフラグメントと、本発明の抗体またはそのフラグメントのいずれか一つのＭＡｂまたはそのフラグメント以外の、少なくとも一種の第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメント；ならびに
（ｄ）本発明の抗体またはそのフラグメントのいずれか一つの該ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる少なくとも一種の第一のＭＡｂまたはそのフラグメントと、本発明の抗体またはそのフラグメントのいずれか一つのＭＡｂまたはそのフラグメント以外の、少なくとも一種の第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなり、該第二のＭＡｂが癌関連抗体である、抗体融合タンパク質またはそのフラグメント
からなる群から選択されるＭＡｂまたはそのフラグメントをコードする核酸を含んでなるＤＮＡ配列である。好ましくは、この癌関連抗体は、ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、ＣＥＡ、ａＬｅａ、Ｌｅｗｉｓ抗原Ｌｅ（ｙ）により定義される抗体、ＣＤ４０に対する抗体、脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）、癌遺伝子の産物、ＭＵＣ１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血小板由来増殖因子、テネイシン、ＩＬ−６、およびＨＥＲ２／ｎｅｕからなる群から選択される。
また、本発明には、本発明の抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントのいずれか一つのＤＮＡ配列を含んでなる発現ベクターおよび宿主細胞が記載される。
本発明のもう一つの態様は、診断薬もしくは治療薬またはそれらの組み合わせを標的に送達する方法であって、（ｉ）少なくとも一種の診断／検出薬および／または治療薬に結合されたＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントを含んでなる組成物を準備し、かつ、（ii）本発明の抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントのいずれか一つの診断または治療複合体をそれを必要とする被験体に投与することを含んでなる方法である。好ましくは、診断／検出薬は放射性核種、造影剤、および光活性診断／検出薬からなる群から選択され、治療薬は好ましくは薬物、毒素、細胞傷害剤、サイトカイン、免疫調節剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、増殖因子、放射性核種からなる群から選択される。
また、本明細書では、診断／検出薬、治療薬またはそれらの組み合わせを標的に送達する方法であって、（ａ）ＰＡＭ４抗原に対して親和性を有し、かつ、一以上のハプテン結合部位を含む本発明の多価多重特異性抗体またはそのフラグメントのいずれか一つの抗体またはそのフラグメントを被験体に投与すること；（ｂ）一定量の非抗体が被験体の血流からクリアリングされるに十分な時間待つこと；および（ｃ）該被験体に、該抗体の結合部位と結合する、診断／検出薬、治療薬またはそれらの組み合わせを含んでなる担体分子を投与することを含んでなる方法が意図される。好ましくは、この担体分子は抗体の一を超える結合部位に結合する。さらに好ましくは、この診断／検出薬または治療薬は、同位元素、薬物、毒素、サイトカイン、オリゴヌクレオチド、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、増殖因子、放射性核種および金属からなる群から選択される。
ある態様では、ｂｃｌ−２発現を阻害するアンチセンス分子などのオリゴヌクレオチドが、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許第５，７３４，０３３号(Reed)に記載されており、本発明の免疫複合体または抗体融合タンパク質の治療薬部分に結合されているか、または治療薬部分を形成し得る。あるいは、このオリゴヌクレオチドは本発明の裸の、または結合されているＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントと同時投与してもよいし、逐次投与してもよい。ある好ましい態様では、このオリゴヌクレオチドは癌遺伝子またはｂｃｌ−２などＢ細胞悪性腫瘍の癌遺伝子産物に対して向けられていることが好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
本発明では、癌を診断または治療する方法であって、（ａ）ＰＡＭ４抗原に対して親和性を有し、かつ、一以上のハプテン結合部位を含む本発明の多価多重特異性抗体またはそのフラグメントのいずれか一つの抗体またはそのフラグメントをそれを必要とする被験体に投与すること；（ｂ）一定量の非結合抗体が被験体の血流からクリアリングされるに十分な時間待つこと；および（ｃ）該被験体に、該抗体の結合部位と結合する、診断／検出薬、治療薬またはそれらの組み合わせを含んでなる担体分子を投与することを含んでなる方法が記載される。ある好ましい態様では、癌は膵臓癌である。また、好ましくは、この方法は罹患組織の手術中同定、罹患組織の内視鏡的同定、または罹患組織の血管内同定に使用できる。
本発明のもう一つの態様は、被験体において悪性腫瘍を治療する方法であって、（ａ）該被験体に、ＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または本発明の抗体、融合タンパク質もしくはそのフラグメントのいずれか一つの抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを含んでなり、該ＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが少なくとも一種の治療薬に結合されている、治療上有効量の抗体またはそのフラグメントを投与すること；および（ｂ）該ＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを医薬上好適な賦形剤中に調剤することを含んでなる方法である。好ましくは、この方法は、本発明の抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントのいずれでもない第二のＭＡｂまたはそのフラグメントをさらに含んでなる。さらに好ましくは、この第二のＭＡｂまたはそのフラグメントは裸のＭＡｂまたはそのフラグメントである。また、好ましくは、第二のＭＡｂまたはそのフラグメントはＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、ＣＥＡ、ａＬｅａ、Ｌｅｗｉｓ抗原Ｌｅ（ｙ）により定義される抗体、ＣＳＡｐに対する抗体、ＭＵＣ１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＣＤ４０、脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、テネイシン、血小板由来増殖因子、ＩＬ−６、癌遺伝子の産物、およびＨＥＲ２／ｎｅｕからなる群から選択される。
本明細書では、被験体において悪性腫瘍を診断する方法であって、（ａ）該被験体に、ＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または本発明の抗体、融合タンパク質もしくはそのフラグメントのいずれか一つのＰＡＭ４抗体融合タンパク質またはそのフラグメントを含んでなり、該ＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、またはＰＡＭ４抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントが少なくとも一種の診断／検出薬に結合されている、診断上有効量の診断複合体を投与すること；および（ｂ）所望により、該ＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを医薬上好適な賦形剤中に調剤することを含んでなる方法が意図される。
本発明のもう一つの態様は、被験体において癌細胞を治療する方法であって、（ｉ）該被験体に、裸のＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または本発明の裸の抗体、融合タンパク質もしくはそのフラグメントのいずれか一つの、裸の抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる、治療上有効量の組成物を投与すること、および（ii）該裸のＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを医薬上好適な賦形剤中に調剤することを含んでなる方法である。好ましくは、この方法は、本発明の裸の抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントのいずれでもない第二の裸の抗体またはそのフラグメントをさらに含んでなる。例えば、この第二の抗体またはそのフラグメントはＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、ＣＥＡ、ａＬｅａ、Ｌｅｗｉｓ抗原Ｌｅ（ｙ）により定義される抗体、ＣＳＡｐに対する抗体、ＭＵＣ１、ＭＵＣ−２、ＭＵＣ−３、ＭＵＣ−４、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＣＤ４０、脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、テネイシン、血小板由来増殖因子、ＩＬ−６、癌遺伝子の産物、およびＨＥＲ２／ｎｅｕからなる群から選択され得る。
本発明はまま、被験体において悪性腫瘍を診断する方法であって、（ｉ）裸のＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または本発明の裸の抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントのいずれか一つの裸の抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる組成物を用いて、該被験体からの検体に対してin vitro診断アッセイを行うことを含んでなる方法を記載する。好ましくは、悪性腫瘍は癌である。さらに好ましくは、癌は膵臓癌である。
本発明のもう一つの態様は、被験体においてＰＡＭ４抗原を発現する罹患組織を手術中に同定する方法であって、（Ａ）ＰＡＭ４抗原を発現する標的組織と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを含んでなる、有効量の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与すること（ここで、標的組織と特異的に結合する該一つのアームはｈＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントである）；および（Ｂ）下記：
Figure 0005139626
Figure 0005139626
からなる群から選択されるターゲッティング可能な複合体を投与すること
を含んでなる方法である。
また本明細書には、被験体においてＰＡＭ４抗原を発現する罹患組織を内視鏡的に診断する方法であって、（Ａ）ＰＡＭ４抗原を発現する標的組織と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを含んでなる、有効量の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与すること（ここで、標的組織と特異的に結合する該一つのアームはｈＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントである）；および（Ｂ）下記：
Figure 0005139626
Figure 0005139626
からなる群から選択されるターゲッティング可能な複合体を投与することを含んでなる方法も記載される。
本明細書では、被験体においてＰＡＭ４抗原を発現する罹患組織を血管内同定する方法であって、（Ａ）ＰＡＭ４抗原を発現する標的組織と特異的に結合する少なくとも一つのアームと、ターゲッティング可能な複合体と特異的に結合する少なくとも一つの他のアームとを含んでなる、有効量の二重特異性抗体または抗体フラグメントを投与すること（ここで、標的組織と特異的に結合する該一つのアームはｈＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントである）；および（Ｂ）下記：
Figure 0005139626
Figure 0005139626
からなる群から選択されるターゲッティング可能な複合体を投与すること
を含んでなる方法が意図される。
もう一つの態様は、内視鏡手順、血管内カテーテル、または手術中に病変部を検出する方法であって、（ａ）このような手順を受ける被験体に二重特異性抗体Ｆ（ａｂ）２またはそのＦ（ａｂ’）２フラグメント、ダイアボディー、トリアボディー、またはテトラボディーを注射して（ここで、該二重特異性抗体またはそのフラグメント、ダイアボディー、トリアボディー、またはテトラボディーは、ＰＡＭ４抗原と特異的に結合する第一の抗体結合部位を有し、かつ、ハプテンと特異的に結合する第二の抗体結合部位を有する）、この抗体フラグメントを標的部位に結合させること；（ｂ）所望により、この二重特異性フラグメントが注射から約２４時間以内に循環からあまりクリアリングされない場合には、ガラクトシル化抗イディオタイプクリアリング剤を用いて非標的抗体フラグメントをクリアリングし、標的部位に迅速に局在し、腎臓からクリアリングする二価の標識ハプテンを注射すること；（ｃ）最初の注射から４８時間以内に、検出手段を用いて、標的部位における付着標識の上昇レベルの近距離検出によりハプテンの存在を検出し、該手順を行うこと（ここで、該検出は造影剤またはサブトラクション剤を用いずに行われる）を含んでなる方法である。
手術、血管内手順、内視鏡手順中の近距離病変部検出のための方法であって、（ａ）このような手順に対する被験体に有効量のｈＰＡＭ４免疫複合体またはそのフラグメントを非経口注射すること；（ｂ）注射から４８時間以内にその手順を行うこと；（ｃ）該標識抗体またはそのフラグメントの存在を検出するための検出手段を用いて、接近を受けた被験体内部を近距離でスキャンすること；および（ｄ）検出手段で、このような部位における該標識抗体またはそのフラグメントの上昇レベルを検出することにより、該標識抗体またはそのフラグメントの付着部位を限局化することを含んでなる方法も本発明で意図される。
発明の具体的な説明
概説
特に断りのない限り、単数形表現の名詞は複数形の場合も意味する。本明細書において「ＰＡＭ４抗体」は、マウス、ヒト、およびヒト化ＰＡＭ４抗体を含む。
本発明は膵臓癌の診断、検出、ステージ判定、および治療に有用なモノクローナル抗体ＰＡＭ４に関する。好ましくは、本発明のＰＡＭ４抗体およびそのフラグメントはヒト化されているか、または完全ヒト型である。マウスＰＡＭ４（ｍＰＡＭ４）抗体は、異種移植されたＲＩＰ−１ヒト膵臓癌腫に由来する膵臓癌ムチンを免疫原として用いることにより開発されたＭＵＣ１抗体である。Gold et al., Int. J Cancer, 57:204-210 (1994).このｍＰＡＭ４抗体は標的膵臓癌抗原上の独特かつ新規なエピトープを認識する。実施例１に記載されているものなどの免疫組織化学染色研究では、ＰＡＭ４ ＭＡｂが、乳癌、膵臓癌およびその他の癌細胞によって発現されたＭＵＣ１抗原のアミノ末端とリピートドメインの開始部の間に位置するドメインに結合し、正常なヒト組織には結合が制限されることが示されている。本発明のＰＡＭ４抗体は相対的に膵臓癌に特異的であることから、膵臓癌細胞と優先的に結合する。ある好ましい態様では、ＰＡＭ４抗体およびそのフラグメントはヒト化されている。ＰＡＭ４抗体は標的エピトープと反応性があり、迅速にインターナライズされ得る。このエピトープは主として膵臓癌に関連する抗原により発現され、巣状膵炎に関連する抗原では発現されない。動物モデルにおいて放射性標識ＰＡＭ４ ＭＡｂを用いた限局化および治療研究では、腫瘍ターゲッティングおよび治療効果が示されている。
本発明のＰＡＭ４抗体は、多くの器官および腫瘍種によって産生される抗原である、ＭＵＣ１のアミノ末端とリピートドメインの開始部の間に位置するドメインであるＰＡＭ４抗原と結合する。本発明の好ましいＰＡＭ４抗体は膵臓癌細胞と優先的に結合する。実施例２のＰＡＭ４モノクローナル抗体などのＰＡＭ４ ＭＡｂを用いた研究では、この抗体がいくつかの重要な特性を示し、臨床診断および治療適用の候補となることが示されている。ＰＡＭ４抗原は診断および治療に有用な標的となるので、初期の研究で記載されている非ＰＡＭ４抗体（ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、ａＬｅａ、およびＬｅｗｉｓ抗原）により認識されるエピトープとは異なる膵臓癌抗原のエピトープを認識するＭａｂを得ることが望ましい。
本発明のＰＡＭ４抗体と組み合わせて、またはともに用いるのに好適な抗体としては、例えば、抗体ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、ＣＥＡ、ａＬｅａ、Ｌｅｗｉｓ抗原Ｌｅ（ｙ）により定義される抗体、または癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＥＧＦＲ、脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、テネイシン、血小板由来増殖因子およびＩＬ−６に対する抗体、ならびに癌遺伝子の産物、およびEpstein et al.による特許（米国特許第６，０７１，４９１号、同第６，０１７，５１４号、同第５，０１９，３６８号および同第５，８８２，６２６号）に記載のものなど、腫瘍壊死物質に対する抗体が挙げられる。このような抗体は現行のＰＡＭ４抗体免疫検出および免疫治療法を補うのに有用であろう。治療適用では、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞機能に関与する免疫調節剤に促進作用または阻害作用のある抗体もまた、ＰＡＭ４抗体単独または他の腫瘍関連抗体（一例としてＣＤ４０に対する抗体がある）と組み合わせたＰＡＭ４抗体と組み合わせると有用であり得る。Todryk et al., J Immunol Methods, 248:139-147(2001); Turner et al., J Immunol, 166:89-94 (2001).また、癌遺伝子のマーカーもしくは産物に対する抗体、またはＶＥＧＦなどの脈管形成因子に対する抗体も用いられる。ＶＥＧＦ抗体は、Thorpe et al, 米国特許第６，３４２，２２１号、同第５，９６５，１３２号および同第６，００４，５５４号に記載されており、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
さらに、臨床サンプル中でＰＡＭ４抗原を検出するのに有用な二重決定基固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）の開発のためには、別のＰＡＭ４様抗体が利用できることが不可欠である。ＥＬＩＳＡ実験は実施例４および７に記載されている。
本発明はＭＵＣ１のアミノ末端とリピートドメインの開始部の間に位置するドメインに結合し、かつ、診断および治療法に使用できるヒト化および完全ヒト抗体およびそのフラグメントを記載する。ある好ましい態様では、ＰＡＭ４抗体はヒト化されている。また、好ましくは、本発明のＰＡＭ４抗体は膵臓癌細胞に優先的に結合する。非ヒトモノクローナル抗体はヒト宿主によっては外来タンパク質として認識され、繰り返し注射すると体液性の過敏感反応を招く可能性があることから、マウスＰＭＡ４配列のヒト化は患者が受け得る有害な免疫応答を軽減することができる。マウスに基づくモノクローナル抗体に関しては、これはしばしばヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答と呼ばれる。ヒト化ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントのフレームワーク領域のいくつかのヒト残基がそれらのマウス対応物で置換されていることが好ましい。また、ＶＨとして、二種の異なるヒト抗体由来のフレームワーク領域の組み合わせを用いるのも好ましい。この抗体分子の定常ドメインはヒト抗体のそれに由来する。
本発明のもう一つの好ましい態様は、ヒトＰＡＭ４抗体である。ヒト抗体は、例えば、抗原投与に応答して特定のヒト抗体を産生するよう「操作」されているトランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントを、内在する重鎖および軽鎖遺伝子座のターゲッティング破壊を含む胚幹細胞系統に由来するマウス株へ導入する。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスを用いてヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作出することができる。トランスジェニックマウス由来のヒト抗体を得る方法は、Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)、およびTaylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)により記載されている。また、完全ヒト抗体も、遺伝子または染色体トランスフェクション法、ならびにファージディスプレー技術により構築することができ、これらは総て当該技術分野で公知である。例えば、非免疫化ドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからのヒト抗体およびそのフラグメントのin vitro生産に関しては、McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)を参照。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子を糸状バクテリオファージの主働または微働外被タンパク質遺伝子のフレーム内にクローン化し、ファージ粒子表面の機能的抗体フラグメントとして提示する。この糸状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含んでいるので、抗体の機能的特性に基づいて選択すればまた、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択されることになる。このように、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣する。ファージディスプレーは種々の形式で行うことができる。総説としては、例えば、Johnson and Chiswell, Current Opiniion in Structural Biology 3:5564-571 (1993)参照。
本発明の抗体およびそのフラグメントは、ヒト膵臓腫瘍由来の粗ムチン調製物に対して惹起するのが好ましい。これに関して、これに関して、ＰＡＭ４抗体はＰＡＭ４抗原の実質的に純粋な調製物を用いて得ることができる。実質的に純粋なタンパク質とは、本来そのタンパク質に伴っている細胞成分が実質的に混入しないタンパク質である。
定義
以下の説明において、多数の専門用語が使用されており、以下、本発明の理解を容易にするために定義を示す。
本明細書において、抗体とは、全長（すなわち、天然に存在するまたは通常の免疫グロブリン遺伝子フラグメント組換えプロセスにより形成される）免疫グロブリン分子（例えばＩｇＧ抗体）、または抗体フラグメントのような、免疫グロブリン分子の免疫学的に有効な（すなわち、特異的に結合する）部分をいう。
抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、 Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどのような抗体の部分をいう。構造に関係なく、抗体フラグメントは全長抗体により認識される同じ抗原と結合する。例えば、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体フラグメントは、ＣＤ２０のエピトープと結合する。「抗体フラグメント」とはまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のようにふるまういずれの合成または遺伝子操作タンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントとしては、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメントのような可変領域からなる単離されたフラグメント、軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）により接続されている組換え単鎖ポリペプチド分子、および超過変領域を模倣したアミノ酸残基からなる最小認識ユニットが挙げられる。
裸の抗体（naked antibody）は一般的に治療薬または診断／検出薬と結合していない抗体である。しかし、それはまた診断／検出薬または治療薬と結合していない抗体フラグメントであってもよい。これは抗体分子のＦｃ部分が、細胞溶解を引き起こす作用をするようメカニズムを設定する補体結合およびＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）のようなエフェクター機能を提供するためである。しかし、治療機能のためにはこのＦｃ部分は必要なく、アポトーシスなどの他のメカニズム機能を果たす可能性がある。裸の抗体には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方、ならびに融合タンパク質、およびキメラ、ヒト化またはヒト抗体のようなある種の組換え抗体が含まれる。
キメラ抗体は、一つの種、好ましくは齧歯類の抗体由来の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含み、この抗体分子の定常ドメインはヒト抗体の定常領域に由来する組換えタンパク質である。獣医学領域への適用のためには、このキメラ抗体の定常ドメインは、ネコまたはイヌのような他の種由来のものであってもよい。
ヒト化抗体(humanized antibody)は、一つの種、例えば齧歯類抗体由来の抗体のＣＤＲが齧歯類抗体のＨおよびＬ可変鎖からヒトＨおよびＬ可変ドメインに移された組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体の定常ドメインに由来する。
ヒト抗体は、抗原刺激に応答して特定のヒト抗体を産生するために「操作された」トランスジェニックマウスから得られる抗体である。この技術では、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座のエレメントが、内在性重鎖および軽鎖遺伝子座が標的破壊されている胚幹細胞株由来のマウス系統に導入される。このトランスジェニックマウスはヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、このマウスをヒト抗体を分泌するハイブリドーマを作製するために使用することができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得るための方法は、Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994),およびTaylor et al., Int. Immun. 6:579(1994)に記載されている。完全ヒト抗体はまた、遺伝子または染色体トランスフェクション法ならびにファージディスプレー技術により構築でき、これらは総て当該技術分野で公知である。例えば、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーからのin vitroにおけるヒト抗体およびそのフラグメントの産生に関しては、McCafferty et al., Nature 348:552-553（1990）を参照。この技術では、抗体可変ドメイン遺伝子がフレーム内で糸状バクテリオファージの主要または微量コートタンパク質遺伝子へクローニングされ、機能的抗体フラグメントとしてファージ粒子表面上に提示される。この糸状粒子はファージゲノムの単鎖ＤＮＡコピーを含み、抗体の機能特性に基づいて選択すれば、それらの特性を示す抗体をコードする遺伝子が選択されることになる。このように、ファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレーはさまざまな形式で行うことが可能であり、総説としては例えば、Johnson and Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571 (1993)を参照。
ヒト抗体はまた、in vitro活性化Ｂ細胞により産生させることができる。引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照。
治療薬は、個別に、同時にまたは逐次に、抗体部分とともにまたは抗体部分（すなわち抗体、または抗体フラグメント、またはサブフラグメント）と結合させて投与される分子または原子であり、疾病の治療に有用である。治療薬の例としては、抗体、抗体フラグメント、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、キレート剤、ホウ素化合物、光活性薬または色素および放射性同位元素が挙げられる。
診断／検出薬は、抗体部分（すなわち抗体、または抗体フラグメント、またはサブフラグメント）と結合させて投与される分子または原子であり、その抗原を含む細胞を限局化することにより疾病の診断に有用である。有用な診断／検出薬としては、限定されるものではないが、放射性同位元素、色素（ビオチン−ストレプトアビジン複合体など）、造影剤、蛍光化合物または分子、および核磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のための増強剤（例えば、常磁性イオン）などがある。米国特許第６，３３１，１７５号はＭＲＩ技術およびＭＲＩ増強剤に結合させた抗体の調製について記載しており、その全開示内容は引用することにより本明細書の一部とする。好ましくは、これらの診断／検出薬は放射性同位元素、核磁気共鳴イメージングで使用する増強剤、および蛍光化合物からなる群から選択される。抗体成分に放射性金属または常磁性イオンを付加するためには、イオンを結合させるための多様なキレート基を付着させた長いテールを有する試薬と反応させる必要があろう。このようなテールは、ポリリシン、多糖、または例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリミキシン、およびこの目的のために有用なことが公知の基といった、キレート基に結合できるペンダント基を有する他の誘導体化または誘導体化可能な鎖であり得る。キレート剤は標準的な化学法を用いて抗体に結合させる。キレート剤は通常、免疫反応性の損失が最小で、凝集および／または内部架橋が最小となる分子との結合を形成し得る基により抗体に連結される。キレート剤を抗体に結合させるその他の、もっと特殊な方法および試薬は、１９８９年４月２５日出願の「Antibody Conjugates」と題されたHawthorneの米国特許第４，８２４，６５９号に開示されており、その開示内容は引用することにより本明細書の一部とする。特に有用な金属−キレートの組み合わせとしては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、１８Ｆ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、９４ｍＴｃ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏおよび７６Ｂｒのような一般エネルギー範囲６０〜４００ｋｅＶの診断用同位元素とともに用いられる２−ベンジルＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が含まれ、ラジオイメージングに用いられる。同じキレート剤がマンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯化した場合は、本発明の抗体とともに使用するとＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡのような大環状のキレート剤は種々の金属および放射性金属とともに、最も詳しくは、それぞれガリウム、イットリウム、および銅などの放射性核種とともに用いられる。このような金属−キレート錯体は、環のサイズを目的の金属にあわせて調整することにより極めて安定にすることができる。大環状ポリエーテルのような他のリング型キレート剤は、ＲＡＩＴのための２２３Ｒａのような、安定に結合する核種を対照とするものであり、本発明に包含される。
免疫複合体(immunoconjugate)は、少なくとも一種の治療薬および／または診断／検出薬に結合された抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントである。診断／検出薬は、放射性核種または非放射性核種、造影剤（核磁気共鳴イメージング、コンピューター断層撮影法または超音波診断法など）を含んでなり、この放射性核種はγ、β、α、オージェ電子、または陽電子放射性同位元素であり得る。
発現ベクターは、宿主細胞中で発現される遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子である。通常、遺伝子発現は構成または誘導プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーをはじめとする、特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子は調節エレメントに「作動可能なように連結されている」といわれる。
組換え宿主は、クローニングベクターまたは発現ベクターのどちらかを含む任意の原核または真核細胞であってもよい。この語はまた、それらの原核または真核細胞、ならびに宿主細胞の染色体もしくはゲノム、または宿主細胞の細胞中にクローニングされた遺伝子を含むように遺伝子操作されたトランスジェニック動物も含む。好適な哺乳類宿主細胞としては、ＳＰ２／０細胞およびＮＳ０細胞のような骨髄腫細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ハイブリドーマ細胞株および抗体発現に有用な他の哺乳類宿主細胞が挙げられる。また、ｍＡｂおよび他の融合タンパク質の発現に特に有用なものはＷＯ ００６３４０３ Ａ２に開示されているヒト細胞株ＰＥＲ．Ｃ６であり、ＣＨＯ、ＣＯＳ、 Ｖｅｒｏ、 ＨｅＬａ、 ＢＨＫおよびＳＰ２などの従来の哺乳類細胞株に比べて２〜２００倍の組換えタンパク質を産生する。免疫系が改変された特別なトランスジェニック動物は完全なヒト抗体を作製するために特に有用である。
本明細書において、抗体融合タンパク質とは、特異性が同じまたは異なる二以上の同じまたは異なる天然抗体、単鎖抗体もしくは抗体フラグメントのセグメントが連結されている、組換え生産された抗原結合分子である。融合タンパク質の原子価は、この融合タンパク質が抗原またはエピトープに対して有している結合アームまたは結合部位の総数を示し、すなわち、一価、二価、三価または多価などである。抗体融合タンパク質が多価であるということは、抗原に対する結合において複数の相互作用を利用できることを意味し、従って、抗原に結合する結合力が高まる。特異性は、抗体融合タンパク質がいくつの抗原またはエピトープに結合できるかを示し、すなわち、一重特異性、二重特異性、三重特異性、多重特異性などである。これらの定義により、例えばＩｇＧのような天然の抗体は、結合腕を二本持つために二価であるといえるが、この抗体は一つのエピトープに結合するために一重特異性である。一重特異性、多価融合タンパク質は、エピトープに対して一を超える結合部位を有するが、同じ抗原上の同じまたは異なるエピトープとしか結合せず、例えばダイアボディーは同じ抗原と反応性のある二つの結合部位を有する。融合タンパク質、異なる抗体成分の多価もしくは多重特異性の組み合わせ、または同じ抗体成分の複数のコピーを含んでもよい。この融合タンパク質はさらに治療薬を含んでもよい。このような融合タンパク質に好適な治療薬の例としては、免疫調節剤（「抗体-免疫調節剤融合タンパク質」）および毒素（「抗体-毒素融合タンパク質」）が挙げられる。好ましい一つの毒素としては、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）であり、好ましくは組換えＲＮアーゼである。
多重特異性抗体(multispecific antibody)は、同時に少なくとも二つの異なる構造の標的、例えば二つの異なる抗原、同じ抗原上の二つの異なるエピトープ、またはハプテンおよび／または抗原、もしくはエピトープに結合できる抗体である。一つの特異性は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞、形質細胞および肥満細胞抗原またはエピトープに対するものであろう。もう一つの特異性は、Ｂ細胞上のＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ７４、ＭＵＣ１およびＣＤ２２のような、同じ細胞種上の異なる抗原に対するものであり得る。多重特異性、多価抗体は一を超える結合部位を有する構築体であり、その結合部位は異なる特異性を有する。例えばダイアボディーでは、一つの結合部位は一つの抗原と反応し、もう一方は他の抗原と反応する。
二重特異性抗体(bispecific antibody)は、同時に二つの異なる構造の標的に結合できる抗体である。二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）および二重特異性抗体フラグメント（ｂｓＦａｂ）は、例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、骨髄性細胞、形質細胞および肥満細胞抗原またはエピトープに特異的に結合する少なくとも一つのアーム、および治療薬または診断／検出薬を担持するターゲッティング可能な複合体に特異的に結合する少なくとも一つの他のアームを有する。分子工学技術を用いて種々の二重特異性融合タンパク質を作製できる。一つの形態においては、二重特異性融合タンパク質は一価であり、例えば一つの抗原に対する一つの結合部位を有するｓｃＦｖと第二の抗原に対する単一結合部位を有するＦａｂフラグメントからなる。もう一つの形態においては、この二重特異性融合タンパク質は二価であり、例えば一つの抗原に対する一つの結合部位を有するＩｇＧおよび第二の抗原に対する二つの結合部位を有する二つのｓｃＦｖからなる。
ヒト化およびヒトＰＡＭ４抗体の調製
特定の抗原に対するモノクローナル抗体は当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、Kohler and Milstein, Nature 256:495（1975)、およびColigan et al.(eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5. 1-2.6.7（John Wiley & Sons 1991）[以下「Coligan」]を参照。要するに、ＰＡＭ４ ＭＡｂは、マウスにＰＡＭ４抗原を含む組成物を注射し、血清サンプルを採取して抗体産生の存在を確認し、脾臓を摘出してＢリンパ球を採取し、そのＢリンパ球と骨髄腫細胞を融合させてハイブリドーマを作製し、そのハイブリドーマをクローニングし、ＰＡＭ４抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、ＰＡＭ４抗原に対する抗体を産生するクローンを培養し、ＰＡＭ４抗体をハイブリドーマ培養物から単離することにより得ることができる。本発明のＰＡＭ４抗体はＰＡＭ４抗原、すなわち、ＭＵＣ１のアミノ末端とリピートドメインの開始部の間に位置するドメインと結合する。本発明のＰＡＭ４抗体は膵臓癌細胞と優先的に結合する。
免疫原に対する最初の抗体惹起の後に、その抗体の配列を決定し、次いで組換え技術により作製することができる。マウス抗体および抗体フラグメントのヒト化は当業者に周知である。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖由来のマウス相補性決定領域をヒト可変ドメインに移し、次いでフレームワーク領域中のヒト残基をマウスの対応物で置換することにより作製する。ヒト化モノクローナル抗体由来の抗体成分を使用することによってマウス定常領域の免疫原性に伴う潜在的な問題が防げる。
本発明の完全ヒト抗体、すなわち、ヒトＰＡＭ４はトランスジェニック非ヒト動物から得ることができる。例えば、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とするMendez et al., Nature Genetics, 15: 146-156 (1997); 米国特許第５，６３３，４２５号参照。例えば、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックマウスから回収することができる。このマウス体液性免疫系は、内在する免疫グロブリン遺伝子を不活化し、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を導入することによりヒト化する。ヒト免疫グロブリン遺伝子座は極めて複雑で、多数の離散セグメントを含み、それはヒトゲノムのほぼ０．２％を占める。トランスジェニックマウスが十分な抗体レパートリーを産生できることを保証するには、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の大きな部分をマウスゲノムに導入しなければならない。これは、生殖系構造においてヒト重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座のいずれかを含む酵母人工染色体（ＹＡＣ）の形成に始まる段階的なプロセスで達成される。それぞれの挿入配列はほぼ１Ｍｂのサイズなので、ＹＡＣ構築体は免疫グロブリン遺伝子座の重複フラグメントの相同的組換えを必要とする。一つは重鎖遺伝子座、もう一つは軽鎖遺伝子座を含む二つのＹＡＣを、ＹＡＣ含有酵母スフェロプラストとマウス胚幹細胞の融合を通じてマウスに個々に導入する。次いで、胚幹細胞クローンをマウス胚盤胞にマイクロインジェクションする。得られたキメラ雄動物を、生殖細胞系を通じてＹＡＣを伝達する能力に関してスクリーニングし、マウス抗体産生を欠損しているマウスと交配させる。一種はヒト重鎖遺伝子座を含み、もう一種はヒト軽鎖遺伝子座を含む二種のトランスジェニック系統を繁殖させ、免疫感作に応答してヒト抗体を産生する後代をつくる。
マウス免疫グロブリン可変ドメインのクローニングのための一般的な技術は、例えば、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、刊行物Orlandi et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:3833 (1989)に記載されている。ヒト化ＭＡｂを産生する技術は、例えば、Carter et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 89:4285 (1992)、Singer et al., J Immun. 150:2844 (1992)、Mountain et al. Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 10:1 (1992)、およびColigan at pages 10.19.1-10.19.11に記載されており、これらはそれぞれ引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。
一般に、ＰＡＭ４抗体のＶＫ（可変軽鎖）およびＶＨ（可変重鎖）配列はＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥおよびｃＤＮＡライブラリースクリーニングなどの種々の分子クローニング手順によって得ることができる。特に、ＭＡｂ ＰＡＭ４のＶＨおよびＶＫ遺伝子は、ハイブリドーマ細胞からそれぞれＲＴ−ＰＣＲおよび５’−ＲＡＣＥによりＰＣＲ増幅によりクローニングし、それらの配列をＤＮＡシーケンシングにより決定した。それらの忠実性を確認するため、クローニングしたＶＬおよびＶＨ遺伝子を、引用することにより本明細書の一部とするOrlandi et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86: 3833 (1989))が記載しているように、細胞培養にてＡｂとして発現させることができる。このＶ遺伝子配列に基づき、次にヒト化ＰＡＭ４抗体を、引用することにより本明細書の一部とするLeung et al. (Mol. Immunol., 32:1413 (1995))が記載しているように設計および構築することができる。ｃＤＮＡは一般的な分子クローニング技術(Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd Ed (1989))により、マウスまたはヒト化ＰＡＭ４抗体を産生する、いずれの公知のハイブリドーマ系統またはトランスフェクション細胞系統から調製してもよい。実施例７はｈＰＡＭ４ ＭＡｂに対して用いたヒト化方法を記載している。
抗体は一般に細胞培養培地から次のようにして単離することができる。トランスフェクトーマ培養物を血清フリー培地に適用する。ヒト化抗体の生産のためには、ＨＳＦＭを用い細胞を回転瓶中５００ｍｌの培養物として細胞を増殖させる。培養物を遠心分子し、上清を０．２μメンブランで濾過する。濾過した培地をＡタンパク質カラム（１×３ｃｍ）に流速１ｍｌ／分で通す。次にこの樹脂を約１０倍カラム量のＰＢＳで洗浄し、１０ｍＭＥＤＴＡを含有する０．１Ｍグリシンバッファー（ｐＨ３．５）を用いて、Ａタンパク質結合抗体をカラムから溶出させる。１．０ｍｌ画分を、１０μｌの３Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．６）の入った試験管に回収し、２８０／２６０ｎｍの吸光度からタンパク質濃度を求める。ピーク画分をプールし、ＰＢＳの対して透析し、例えばCentricon 30(Amicon, Beverly, MA)を用いて抗体を濃縮する。抗体濃度は上記のようにＥＬＩＳＡにより測定し、その濃度をＰＢＳを用いて約１ｍｇ／ｍｌに調整する。保存のためにはサンプルにアジ化ナトリウム０．０１％（ｗ／ｖ）を加えると便宜である。
ＰＡＭ４抗体の調製に用いるプライマーのヌクレオチド配列は下記実施例７に述べられている。ある好ましい態様では、ヒト化ＰＡＭ４抗体または抗体フラグメントはマウスＰＡＭ４ ＭＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）、およびヒト抗体の軽鎖および重鎖可変領域とヒト抗体の軽鎖および重鎖定常領域のフレームワーク（ＦＲ）領域を含んでなり、ここでヒト化ＰＡＭ４の軽鎖可変領域のＣＤＲは、アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＨＱＷＮＲＹＰＹＴを含んでなるＣＤＲ３を含んでなり；かつ、ヒト化ＰＡＭ４ ＭＡｂの重鎖可変領域のＣＤＲはアミノ酸配列ＳＹＶＬＨを含んでなるＣＤＲ１；アミノ酸配列ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２；およびアミノ酸配列ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹを含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。また、好ましくは、ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域のＦＲは、マウスＰＡＭ４ ＭＡｂの対応するＦＲから置換された少なくとも一つのアミノ酸を含んでなる。
ＰＡＭ４ ＭＡｂは十分確立されている種々の技術によりハイブリドーマ培養物から単離および精製することができる。このような単離技術としては、タンパク質Ａセファロースを用いたアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが挙げられる。例えば、Coligan at pages 2.7.1-2.7.12およびpages 2.9.1-2.9.3を参照。また、Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)も参照。
ＰＡＭ４ ＭＡｂは当業者に周知の種々の技術によって同定することができる。例えば、ＰＡＭ４ ＭＡｂのＰＡＭ４抗原に対する結合能力は、間接的免疫蛍光アッセイ、フローサイトメトリー分析、またはウエスタン分析を用いて確認することができる。
ＰＡＭ４抗体フラグメントの生産
本発明はＰＡＭ４抗体フラグメントの使用を意図する。特定のエピトープを認識する抗体フラグメントは、公知の技術により作製し得る。抗体フラグメントは、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆａｂ'、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖなどの抗体の抗原結合部分である。例えば、Ｆ（ａｂ）'２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化により作製でき、Ｆａｂ'フラグメントは、Ｆ（ａｂ'）２フラグメントのジスルフィド結合を還元することにより作製できる。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号、ならびにそこに含まれている参照文献により記載されており、これらの特許はその全開示内容を引用することにより本発明の一部とされる。また、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89: 230 (1960); Porter, Biochem. J. 73: 119 (1959), Edelman et al., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422 (Academic Press 1967)、およびColigan at pages 2.8.1-2.8.10および2.10.-2.10.4も参照。あるいは、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ’フラグメントの迅速で容易な同定を可能にするには、Ｆａｂ’発現ライブラリーを構築することができる（Huse et al., 1989, Science, 246:1274-1281）。本発明は抗体および抗体フラグメントを包含する。
単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含んでなる。このＶＬおよびＶＨドメインは組み合わさって標的結合部位を形成している。これらの二つのドメインはペプチドリンカー（Ｌ）によりさらに共有結合されている。ｓｃＦｖ分子は、ＶＬドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、ＶＬ−Ｌ−ＶＨ、またはＶＨドメインがｓｃＦｖ分子のＮ末端部である場合、ＶＨ−Ｌ−ＶＬと表される。ｓｃＦｖ分子の作製方法、および好適なペプチドリンカーの設計方法は、米国特許第４，７０４，６９２号、同第４，９４６，７７８号、R. Raag and M. Whitlow,"Single Chain Fvs."FASEB Vol 9:73-80（1995）およびR. E. Bird and B. W. Walker,"Single Chain Antibody Variable Regions,"TIBTECH, Vol 9:132-137(1991）に記載されている。これらの参照文献は引用することにより本明細書の一部とされる。
抗体フラグメントは、全長抗体のタンパク質加水分解、またはフラグメントをコードするＤＮＡの、大腸菌(E.coli)もしくは他の宿主中での発現により調製することができる。抗体フラグメントは、常法により全長抗体のペプシンまたはパパイン消化により得られる。例えば、抗体フラグメントは抗体をペプシンで酵素的に切断して、Ｆ（ａｂ’）２で示される約１００Ｋｄのフラグメントを得ることにより作製することができる。このフラグメントはチオール還元剤、および所望によりジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基の遮断基を用いてさらに切断することができ、約５０Ｋｄ Ｆａｂ’一価フラグメントが得られる。あるいは、パパインを用いる酵素的切断により二つの一価Ｆａｂフラグメントと一つのＦｃフラグメントが直接的に生じる。これらの方法は、例えば、Goldenbergの米国特許第４，０３６，９４５号および同第４，３３１，６４７号、ならびにそこに含まれる参照文献に記載されており、これらの特許は引用することによりその全開示内が本明細書の一部とされる。また、Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230(1960); Porter, Biochem. J 73:119(1959)、Edelman et al., in METHODS IN ENZYMOLOGY VOL. 1, page 422(Academic Press 1967)、および Coligan at pages 2.8. 1-2.8.10および2.10.-2. 10.4.も参照。
抗体フラグメントのもう一つの形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲは抗体の可変領域のセグメントであり、抗体が結合するエピトープに対し相補的な構造であり、残りの可変領域よりもさらに変化に富んでいる。従って、ＣＤＲはしばしば超過変領域と呼ばれる。可変領域は三つのＣＤＲを含んでなる。ＣＤＲペプチドは、対象となる抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することにより得られる。このような遺伝子は、例えば抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて調製される。例えば、Larrick et al., Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:106(1991); Courtenay-Luck,"Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES:PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al.(eds.), pages 166-179 (Cambridge University Press 1995);およびWard et al.,"Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES:PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al., (eds.), pages 137-185（Wiley-Liss, Inc. 1995）参照。
重鎖を分離して一価の軽鎖−重鎖フラグメントを形成し、さらにフラグメントを切断するような抗体を切断する他の方法、または他の酵素学的、化学的または遺伝学的技術も、それらのフラグメントが無傷の抗体により認識される抗原に結合する限り用いてよい。
ヒト化およびヒトＰＡＭ４抗体融合タンパク質の生産
本発明の抗体融合タンパク質は、官能基間のグルタルアルデヒド結合からより特異的な結合まで、種々の常法により調製することができる。本明細書に記載の融合タンパク質を含んでなる抗体および／または抗体フラグメントは好ましくは、別のものに直接共有結合させるか、リンカー部分を介して、または例えばアミン、カルボキシル、フェニル、チオールもしくはヒドロキシル基など、抗体またはフラグメント上の一以上の官能基を介して共有結合させる。グルタルアルデヒドの他、例えばジイソシアネート、ジイソチオシアネート、ビス（ヒドロキシスクシンイミド）エステル、カルボジイミド、マレイミドヒドロキシスクシンイミドエステルなどの種々の通常のリンカーを使用できる。
ヒト化およびヒトＰＡＭ４融合タンパク質を生産する簡単な方法としては、グルタルアルデヒドの存在下で抗体またはフラグメントを混合するものがある。最初のシッフの塩基結合は例えば第二級アミンへのホウ化水素還元により安定化させることができる。非位置特異的リンカーとしてグルタルアルデヒドの代わりにジイソチオシアネートまたはカルボジイミドを使用することもできる。本発明の一つの態様では、抗体融合タンパク質は、一つのヒト化またはヒトＰＡＭ４ ＭＡｂまたはそのフラグメント含んでなり、このＭＡｂはＭＵＣ１抗原のアミノ末端とリピートドメインの開始部の間に位置するドメインと結合する。この融合タンパク質およびそのフラグメントは膵臓癌細胞と優先的に結合する。この一価単一特異性ＭＡｂは抗原のダイレクト・ターゲッティングに有用であり、ここではＭＡｂが治療薬、診断／検出薬、またはそれらの組み合わせに結合され、そのタンパク質がそれを必要とする患者に直接投与される。
本発明のＰＡＭ４抗体融合タンパク質およびそのフラグメントは、代わりに、少なくとも二種のヒト化またはヒトＰＡＭ４ ＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでもよく、ここで、この少なくとも二種のＭＡｂまたはそのフラグメントはＰＡＭ４抗原の異なるエピトープと結合する。例えば、これらのＭＡｂは抗原特異的ダイアボディー、トリアボディーおよびテトラボディーを作出することができ、これらは多価であるが、ＰＡＭ４抗原に対して単一特異的である。二以上のｓｃＦｖ分子の非共有結合的結合が機能的なダイアボディー、トリアボディーおよびテトラボディーを形成することができる。単一特異性ダイアボディーは同種のｓｃＦｖのホモ二量体であり、各ｓｃＦｖは、選択された抗体に由来する、短いリンカーによって同じ抗体のＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含んでなる。ダイアボディーは二つのｓｃＦｖの非共有結合的結合によって形成された二価の二量体であり、二つのＦｖ結合部位が生じる。トリアボディーは三つのｓｃＦｖからなる三価の三量体の形成によるもので、三つの結合部位が生じ、また、テトラボディーは四つのｓｃＦｖからなる四価の四量体であり、四つの結合部位が生じている。数種の単一特異性ダイアボディーが、ＶＨ１−リンカー−ＶＬ１を含んでなる組換え遺伝子構築物を含む発現ベクターを用いて作製されている。Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993); Atwell et al., Molecular Immunology 33: 1301-1302 (1996); Holliger et al., Nature Biotechnology 15: 632-631(1997); Helfrich et al., Int. J. Cancer 76: 232-239 (1998); Kipriyanov et al., Int. J. Cancer 77: 763-772 (1998); Holiger et al., Cancer Research 59: 2909-2916(1999)参照。ｓｃＦｖの構築方法は米国特許第４，９４６，７７８号（１９９０）および同第５，１３２，４０５号（１９９２）で開示されている。ｓｃＦｖに基づく多価多重特異性結合タンパク
質の作製方法は、米国特許第５，８３７，２４２号（１９９８）、同第５，８４４，０９４号（１９９８）およびＷＯ９８／４４００１（１９９８）で開示されている。多価単一特異性抗体融合タンパク質は、同じ抗原上または別の抗原上に存在し得る二以上の同種のエピトープと結合する。価数の増加にはさらなる相互作用、親和性の増強、および滞留時間の延長が見込まれる。これらの抗体融合タンパク質はダイレクト・ターゲッティング系で使用することができ、ここでは抗体融合タンパク質が治療薬、診断／検出薬、またはそれらの組み合わせに結合され、それを必要とする患者に直接投与される。
本発明の好ましい態様は、ＰＡＭ４標的エピトープ、および膵臓癌抗原に関連する一以上のさらなるエピトープに対して親和性を有する一を超える抗原結合部位を含んでなる多価多重特異性抗体またはそのフラグメントである。この融合タンパク質は、同じまたは異なる抗原上に存在し得る少なくとも二つの異なるエピトープと結合するので、多重特異性である。例えば、この融合タンパク質は一を超える抗原結合部位を含んでよく、第一のものは一つのＰＡＭ４抗原エピトープに対して親和性を有し、第二のものはＴＡＧ−７２またはＣＥＡなどの別の標的抗原に対して親和性を有する。別の例として、ＣＡ１９．９ ＭＡｂ（またはそのフラグメント）およびＰＡＭ４ ＭＡｂ（またはそのフラグメント）を含んでもよい、二重特異性ＰＡＭ４抗体融合タンパク質がある。このような融合タンパク質はＣＡ１９．９、ならびにＭＵＣ１のアミノ末端とリピートドメインの開始部の間に位置するドメインに対して親和性を有する。本発明ではまた、少なくとも二つの異なるＰＡＭ４抗原エピトープに対して親和性を有する一を超える抗原結合部位を含んでなる融合タンパク質も意図される。
本発明の抗体融合タンパク質およびそのフラグメントはダイレクト・ターゲッティング系で使用することができ、ここでは抗体融合タンパク質が治療薬、診断／検出薬、またはそれらの組み合わせに結合され、それを必要とする患者に直接投与される。
本発明のもう一つの好ましい態様は、ＰＡＭ４標的エピトープに対して親和性を有する一を超える抗原結合部位と、ハプテン分子に対して親和性を有する少なくとも一つのハプテン結合部位を含んでなる多価多重特異性抗体およびそのフラグメントである。例えば、二重特異性ＰＡＭ４抗体融合タンパク質は６７９ＭＡｂ（またはそのフラグメント）およびＰＡＭ４ ＭＡｂ（またはそのフラグメント）を含んでもよい。モノクローナル抗体６７９はトリペプチド部分ヒスタミンスクシニルグリシル（ＨＳＧ）を含む分子に、高い親和性で結合する。このような二重特異性ＰＡＭ４抗体融合タンパク質は、例えば、上記のように６７９からＦ（ａｂ’）２フラグメントを得ることにより調製することができる。６７９Ｆ（ａｂ’）２フラグメントの鎖内ジスルフィド結合は、軽鎖−重鎖結合が起こらないよう注意しながらシステインで穏やかに還元し、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントを形成させる。このＳＨ基をビス−マレイミドリンカー（１，１’−（メチレンジ−４，１−フェニレン）ビス−マレイミド）で活性化させる。ＰＡＭ４ ＭＡｂをＦａｂ’−ＳＨに変換した後、活性化させたＭＲ２３ Ｆａｂ’−ＳＨフラグメントと反応させて二重特異性ＰＡＭ４抗体融合タンパク質を得る。このようなものなどの二重特異性抗体融合タンパク質はアフィニティー増強系で用いることができ、ここでは標的抗原が融合タンパク質でプレターゲッティングされ、次に、プレターゲッティングにより形成された抗体−抗体複合体と結合する診断薬または治療薬でターゲッティングされる。
二重特異性抗体は、例えばジスルフィド結合を切断し、全ＩｇＧまたは好ましくはＦ（ａｂ’）２フラグメントの混合物を再形成し、一を超えるハイブリドーマを融合して一を超える特異性を有する抗体を生産するなどの種々の従来法、また、遺伝子操作により作製することができる。二重特異性抗体融合タンパク質は異なる抗体の還元的切断によって生じるＦａｂ’フラグメントの酸化的切断によって作製されてきた。これは二つの異なる抗体のペプシン消化によって生じた二つの異なるＦ（ａｂ’）２フラグメントを混合し、還元的切断によりＦａｂ’フラグメントの混合物を形成し、次いで、酸化的にジスルフィド結合を再形成して、元のエピトープの各々に特異的なＦａｂ’部分を含む二重特異性抗体融合タンパク質を含むＦ（ａｂ’）２フラグメントの混合物を作製することにより行うのが有利である。抗体融合タンパク質の調製のための一般的技術は、例えばNisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 93: 470 (1961)、Hammerling et al., J. Exp. Med. 128: 1461 (1968)、および米国特許第４，３３１，６４７号に見出せる。本発明では、少なくとも一つの第一のＰＡＭ４ ＭＡｂまたはそのフラグメントと、本発明のＰＡＭ４ ＭＡｂまたはそのフラグメント以外の少なくとも一つの第二のＭＡｂまたはそのフラグメントを含んでなる抗体融合タンパク質またはそのフラグメントが意図される。
より選択性の高い結合は、マレイミドヒドロキシスクシンイミドエステルなどのヘテロ二官能性リンカーを用いることで達成することができる。このエステルと抗体またはフラグメントとの反応により抗体またはフラグメント上のアミン基が誘導体化され、次にこの誘導体は例えば遊離スルヒドリル基を有する抗体Ｆａｂフラグメント（あるいは、例えばトラウトの試薬によりスルヒドリル基が付加されたより大きなフラグメントまたは完全抗体）と反応させることができる。このようなリンカーは同じ抗体の基を架橋しているとは考えにくく、結合の選択性は向上する。
抗原結合部位から離れた部位で抗体またはフラグメントを連結するのが有利である。これは、例えば上記のように切断された鎖内スルヒドリル基に連結することで達成することができる。別法としては、酸化された炭化水素部分を有する抗体を、少なくとも一つの遊離アミン官能基を有する別の抗体と反応させることを含む。これにより最初のシッフ塩基（mime）結合が生じ、これは好ましくは、例えばホウ化水素還元により第二級アミンへ還元することにより安定化され、最終複合体が形成される。このような部位特異的結合が、小分子に関しては米国特許第４，６７１，９５８号に、大きな付加物に関しては米国特許第４，６９９，７８４号に開示されており、これらは引用することにより本明細書の一部とされる。
多重特異性ＰＡＭ４抗体融合タンパク質は、二重特異性ヒト化またはヒトＰＡＭ４抗体融合タンパク質にＰＡＭ４抗原結合部分を付加することにより得ることができる。例えば、二重特異性抗体融合タンパク質は、上記のビス−マレイミド活性化手順を用いて、二重特異性融合タンパク質を第三のＰＡＭ４ ＭＡｂまたはフラグメントと結合させる際に用いられる一以上のスルヒドリル基を導入するために２−イミノチオランと反応させることができる。これらの抗体融合タンパク質生産技術は当業者に周知である。例えば、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許第４，９２５，６４８号参照。
１２アミノ酸残基長よりも長いリンカー（例えば１５または１８残基のリンカー）を有するＳｃＦｖでは、同じ鎖上のＶＨとＶＬドメイン間の相互作用が可能であり、一般に単量体、二量体（ダイアボディーと呼ばれる）、および少量のより高次の多量体の混合物が生じる(Kortt et al., Eur. J. Biochem. (1994) 221: 151-157)。しかし、５以下のアミノ酸残基のリンカーを有するＳｃＦｖでは、同じ鎖上のＶＨとＶＬドメインの分子内対合は妨げられ、異なる鎖上のＶＨとＶＬドメインの対合が促される。３〜１２残基の間のリンカーでは主として二量体が形成される(Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604)。０〜２残基の間のリンカーでは、ｓｃＦｖの三量体（トリアボディーと呼ばれる）、四量体（テトラボディーと呼ばれる）、またはより高次のオリゴマー構造が形成されるが、オリゴマー化の厳密なパターンはリンカーの長さの他、Ｖドメインの組成ならびに方向に依存するようである。例えば、抗ノイラミニダーゼ抗体ＮＣ１０のｓｃＦｖでは、０残基のリンカーと用いた場合、主として三量体（ＶＨからＶＬ方向）または四量体（ＶＬからＶＨ方向）が生じた(Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574)。１および２酸基のリンカーを用いてＮＣ１０から構築されたｓｃＦｖでは、ＶＨからＶＬ方向で、主としてダイアボディーが形成されたが(Atwell et al., Protein Engineering (1999) 12: 597-604)、これに対して、ＶＬからＶＨ方向では四量体、三量体、二量体およびより高次の多量体が形成された(Dolezal et al., Protein Engineering (2000) 13: 565-574)。抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７から、ＶＨからＶＬ方向で、構築されたｓｃＦｖについては、０残基リンカーではもっぱら三量体が形成され、１残基リンカーではもっぱら四量体が形成された(Le Gall et al., FEBS Letters (1999) 453: 164-168)。
発現ベクターおよび宿主細胞
発現ベクターは、宿主細胞中で発現される遺伝子を含んでなるＤＮＡ分子である。通常、遺伝子発現は構成または誘導プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーをはじめとする特定の調節エレメントの制御下に置かれる。このような遺伝子は調節エレメントに「作動可能なように連結されている」といわれる。プロモーターは構造遺伝子の転写を指令するＤＮＡ配列である。構造遺伝子はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へと転写されるＤＮＡ配列であり、これは次に特定のポリペプチドに特徴的なアミノ酸配列へと翻訳される。典型的には、プロモーターは構造遺伝子の転写開始部位に隣接して遺伝子の５’領域に置かれる。プロモーターが誘導プロモーターであれば、誘導因子に応答して転写速度が高まる。これに対し、プロモーターが構成プロモーターであれば、転写速度は誘導因子によって調節を受けない。エンハンサーは転写の開始部位に対してエンハンサーの距離または方向に関係なく、転写効率を高め得るＤＮＡ調節エレメントである。
単離されたＤＮＡ分子とは、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていないＤＮＡの断片である。例えば、クローニングされたＰＡＭ４抗原遺伝子は、哺乳類細胞のゲノムＤＮＡから分離されているＤＮＡ断片である。単離されたＤＮＡ分子の別の例としては、生物のゲノムＤＮＡに組み込まれていない化学合成されたＤＮＡ分子がある。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、逆転写酵素によってｍＲＮＡ鋳型から形成された一本鎖ＤＮＡ分子である。逆転写の開始には、典型的にはｍＲＮＡの一部に相補的な短い合成オリゴヌクレオチドがプライマーとして用いられ、第一鎖ＤＮＡが生成する。当業者はまた、このような一本鎖ＤＮＡ分子およびその相補的ＤＮＡ鎖からなる二本鎖ＤＮＡ分子に対しても「ｃＤＮＡ」を用いる。
クローニングベクターは、プラスミド、コスミドまたはバクテリオファージなど、宿主細胞で自律的に複製する能力を有するＤＮＡ分子である。クローニングベクターは典型的には一または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含み、この部位に、ベクターの必須の生物学的機能を失わずに定量可能な様式で外来ＤＮＡ配列、ならびにクローニングベクターで形質転換された細胞の同定および選択に用いるのに好適なマーカー遺伝子を挿入することができる。マーカー遺伝子は典型的にはテトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を与える遺伝子を含む。組換え宿主としては、クローニングベクターか発現ベクターのいずれかを含むいずれの原核または真核細胞であってもよい。この用語はまた、宿主細胞の染色体またはゲノム中にクローニングされた遺伝子を含むよう遺伝子操作された原核または真核細胞も含まれる。発現とは、遺伝子産物の生合成をさす。例えば、構造遺伝子の場合、発現とは、その構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写およびｍＲＮＡの一以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
好適な宿主細胞としては微生物または哺乳類宿主細胞が挙げられる。好ましい宿主としては、ＭＡｂおよびその他の融合タンパク質の生産のために開発されたヒト細胞系統ＰＥＲ．Ｃ６がある。よって、本発明の一つの好ましい態様は、ＰＡＭ４ ＭＡｂ、複合体、融合タンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含む宿主細胞である。ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＷＯ９７／００３２６）は、ヒトホスホグリセンリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下にＡｄ血清型５（Ａｄ５）Ｅ１Ａ−およびＥ１Ｂ−コード配列（Ａｄ５ヌクレオチド４５９−３５１０）を含むプラスミドを用いた、ヒト胎児網膜一次細胞のトランスフェクションにより作製されたものである。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂはそれぞれアデノウイルス初期遺伝子活性化タンパク質１Ａおよび１Ｂである。これらの方法および組成物は、例えばグリコシル化により翻訳後修飾されている、目的のヒト組換えタンパク質の安定発現を作り出すのに特に有用である。ＰＥＲ．Ｃ６は完全に同定されたヒト細胞系統であり、また、実験室での実践に応じて開発されたものであるなど、いくつかの特徴によりＰＥＲ．Ｃ６は組換えタンパク質の生産のための宿主として特に有用なものとなる。さらに、ＰＥＲ．Ｃ６はいずれのヒト由来または動物由来タンパク質も含まない規定の血清フリー培地中の懸濁培養物として増殖させることができ、その増殖は倍加時間約３５時間の、回転瓶、シェーカーフラスコ、スピンフラスコおよびバイオリアクターに適合している。最後に、Ｅ１Ａが存在すると、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターの制御下にある遺伝子の発現がアップレギュレートされ、Ｅ１３が存在すると、おそらくは組換えトランスジーンの過剰発現によって増強されたｐ５３依存性のアポトーシスが妨げられる。ある態様では、この細胞は従来の哺乳類細胞系統よりも２００倍高い組換えタンパク質および／またはタンパク質性物質を産生することができる。
治療および診断に用いるヒト化およびヒトＰＡＭ４抗体
本発明では、被験体の悪性腫瘍を診断または治療する方法であって、該被験体に、ＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる、治療上有効量の治療用複合体を投与することを含んでなる方法が意図され、ここでは、ＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントは少なくとも一種の診断薬および／または治療薬と結合され、医薬上好適な賦形剤中に調剤されている。また、癌を診断または治療する方法であって、ＰＡＭ４抗原に対する一以上の抗原結合部位および一以上のハプテン結合部位を含んでなる多価多重特異性抗体またはそのフラグメントを、それを必要とする被験体に投与すること、一定量の非抗体が被験体の血流からクリアリングされるに十分な時間待つこと、および該被験体に、その多価多重特異性抗体またはそのフラグメントの結合部位と結合する診断／検出薬、治療薬またはそれらの組み合わせを含んでなる担体分子を投与することを含んでなる方法が好ましい。ある好ましい態様では、癌は膵臓癌である。もう一つの態様では、抗体は多価多重特異性抗体またはそのフラグメントである。
in vitro診断のためのＭＡｂの使用は周知である。例えば、Carlsson et al., Bio/Technology 7 (6): 567 (1989)参照。例えば、ＭＡｂは生検サンプル由来の組織における腫瘍関連抗原の存在を検出するのに用いることができる。ＭＡｂはまた、ラジオイムノアッセイ、固相酵素免疫検定法、および蛍光免疫アッセイなどの技術を用い、臨床液体サンプル中の腫瘍関連抗原の量を測定するためにも使用できる。
腫瘍標的化ＭＡｂと毒素との複合体はin vivoにおいて癌細胞を選択的に死滅させるために使用できる(Spalding, Bio/Technology 9(8): 701 (1991); Goldenberg, Scientific American Science & Medicine 1(1): 64 (1994))。例えば、試験動物モデルにおける治療研究では、細胞傷害性放射性核種を有する抗体の抗腫瘍活性が証明されている。動物モデルおよび治療研究の考察については実施例３および５を参照。(Goldenberg et al., Cancer Res. 41: 4354 (1981), Cheung et al., J. Nat'l Cancer Inst. 77: 739 (1986)、およびSenekowitsch et al., J. Nucl. Med. 30: 531 (1989))。
ヒト化および完全ヒト抗体ならびにそのフラグメントは治療法および診断法に用いるのに好適である。従って、本発明では、診断薬もしくは治療薬またはそれらの組み合わせを標的に送達する方法であって、（ｉ）少なくとも一種の診断薬および／または治療薬に結合されたＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントを含んでなる組成物を準備すること、および（ii）その診断または治療用抗体複合体をそれを必要とする被験体に投与することを含んでなる方法が意図される。ある好ましい態様では、ＰＡＭ４抗体およびそのフラグメントはヒト化されているか、完全ヒト型である。もう一つの態様では、本発明のヒト化および完全ヒトＰＡＭ４抗体ならびにそのフラグメントは悪性腫瘍を治療する方法で用いられる。
また、本明細書では、本発明の抗体のいずれかのＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる抗体成分を含んでなる、癌細胞を標的とする診断または治療複合体も記載され、ここではこの抗体成分は少なくとも一種の診断薬または少なくとも一種の治療薬に結合されている。好ましくは、診断複合体は光活性診断／検出薬、超音波検出剤、またはＭＲＩ造影剤である。さらに好ましくは、診断／検出薬は２０〜４，０００ｋｅＶの間のエネルギーを有する放射性核種である。
本発明のもう一つの態様は、悪性腫瘍を診断または治療する方法であって、治療上または診断上有効量の、少なくとも一種の裸のＰＡＭ４抗体もしくはそのフラグメント、および／またはＰＡＭ４融合タンパク質もしくはそのフラグメントを投与すること、および所望によりＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントを医薬賦形剤中に調剤することを含んでなる方法である。
治療用組成物は少なくとも一種のヒト化または完全ヒトＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントを単独かつ非結合型で、他のヒト化またはキメラ抗体、ヒト抗体、治療薬または免疫調節剤など、他の抗体またはそのフラグメントと結合して、あるいは結合させずに組み合わせて含有する。同じまたは異なるエピトープまたは抗原に対する裸のまたは結合型の抗体を本発明の一以上のＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントと組み合わせてもよい。
よって、本発明は、ＰＡＭ４融合タンパク質およびそのフラグメントを含むＰＡＭ４抗体およびそのフラグメントの、裸の抗体またはフラグメントとして単独での投与、あるいは多モード療法としての投与を意図する。好ましくは、この抗体はヒト化または完全ヒトＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントである。本発明の多モード療法はさらに、裸の抗体、融合タンパク質の形での、または免疫複合体としての他の抗体の投与を伴う、裸の抗ＰＡＭ４抗体による免疫療法を含む。例えば、ヒト化または完全ヒトＰＡＭ４抗体は別の裸のヒト化ＰＡＭ４もしくはその他の抗体、あるいは同位元素、一以上の化学療法剤、サイトカイン、毒素またはそれらの組み合わせと結合されたヒト化ＰＡＭ４もしくはその他の抗体と組み合わせてもよい。例えば、本発明は、ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、ＣＣ４９、ｌａ３、ａＬｅａ抗体、他のＬｅｗｉｓ抗原（例えば、Ｌｅ（ｙ））、ならびに癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、結腸特異的抗原−ｐ（ＣＳＡｐ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、脈管形成因子（例えば、ＶＥＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、テネイシン、血小板由来増殖因子、およびＩＬ−６に対する抗体、ならびに癌遺伝子の産物および腫瘍壊死物質に対する抗体などの他の膵臓腫瘍関連抗体の前に、または組み合わせて、またはその後に、裸のまたは結合型のＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントを処置することを意図する。これらの固形腫瘍抗体は裸であってもよいし、あるいはとりわけ薬物、毒素、同位元素、内部照射または免疫調節剤と組み合わせてもよい。また、本発明では、ヒト化または完全ヒトＰＡＭ４抗体と毒素の融合タンパク質を用いてもよい。裸の抗体として、または部分的に裸で、部分的に治療薬または免疫調節剤と結合したものとして多くの異なる組み合わせを構築してもよい。あるいは、細胞傷害剤などの他の治療薬または放射線と組み合わせて投与する（連続的、同時または逐次に施与する）ために、種々の裸の抗体の組み合わせを用いてもよい。
診断薬または治療薬に結合された本明細書に記載の単一特異性結合タンパク質はＰＡＭ４陽性腫瘍を直接ターゲッティングする。これらの単一特異性分子は標的抗原と選択的に結合し、分子上の結合部位の数が増すにつれ、標的細胞に対する親和性が増し、所望の場所に見られる滞留時間が長くなる。さらに、非抗原結合分子は身体から速やかにクリアリングされ、正常組織の暴露が最小となる。多重特異性抗体の使用はＡＥＳ系におけるものであり、ここで、ＰＡＭ４はその後の診断薬または治療薬の特異的送達のために陽性腫瘍をプレターゲッティングする。これらの薬剤はヒスタミンスクシニルグリシル（ＨＳＧ）含有ペプチドによって運ばれる。６７９と呼ばれるマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１，Ｋ）は高い親和性でトリペプチド部分ＨＳＧを含む分子と結合する(Morel et al, Molecular immunology, 27, 995-1000, 1990)。６７９ ＭＡｂはｈＰＡＭ４とともに、ＨＳＧと標的抗原に結合する二重特異性抗体を形成することができる。また、この代わりにハプテンを用いてもよい。これらの抗体は標的抗原に選択的に結合し、親和性の増強および所望の場所での滞留時間の延長を可能とする。さらに、非抗原結合ダイアボディーは身体から速やかにクリアリングされ、正常組織の暴露が最小となる。ＰＡＭ４抗体およびそのフラグメントならびに複合体は、癌などの哺乳類の疾患の診断および治療に使用することができる。
本発明に従う診断または治療を目的とした診断薬または治療薬の標的への送達は、ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントを診断薬または治療薬とともに準備すること、およびその抗体をそれを必要とする被験体に投与することを含む。さらに診断では、既知の技術を用いて結合したタンパク質を検出する工程が必要である。
この適用に関して、「診断」または「治療」の用語は互換的に使用できる。診断は通常、組織の特定の組織学的状態を判定することをさし、検出は特定の抗原を含む組織、病変部または生物を認識および限局化する。
本発明の抗体およびそれらのフラグメントの、診断薬または治療薬を伴う投与は、哺乳類では静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜腔内、髄腔内、局所的カテーテルを通じた潅流、または直接病巣注射により行うことができる。抗体を注射により投与する場合には、投与は点滴、または単回もしくは複数回のボーラス注射によればよい。
診断薬または治療薬を伴う抗体は医薬上許容される注射用ビヒクル、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中、生理的ｐＨおよび濃度で、ヒトまたは哺乳類の治療および診断用キットとして提供してもよい。この製剤は、特にヒトでの使用を意図する場合には無菌であることが好ましい。このようなキットの任意の成分としては、安定剤、緩衝剤、標識試薬、放射性同位元素、常磁性化合物、クリアランスを促進するための第二の抗体、および通常のシリンジ、カラム、バイアルなどが挙げられる。
裸の抗体での療法
治療上有効量の裸のヒト化および完全ヒトＰＡＭ４抗体もしくはそれらのフラグメント、またはＰＡＭ４融合タンパク質もしくはそのフラグメントは、医薬上許容される賦形剤中に調剤することができる。また、裸のヒト化および完全ヒトＰＡＭ４抗体およびそれらのフラグメントの効力は、これらの裸の抗体を、一以上の他の裸の抗体、あるいは薬物、毒素、免疫調節剤、ホルモン、オリゴヌクレオチド、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、治療用放射性核種、脈管形成阻害剤などをはじめとする一以上の治療薬と結合され、ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントと同時に、または逐次に、または指示された投与計画に従って投与される、ヒト化および完全ヒトＰＡＭ４抗体の一以上の免疫複合体で補うことにより増強することもできる。裸のＰＡＭ４抗体およびそのフラグメントを補い得る裸の抗体は同じ腫瘍種に向けられたものでもよいし、あるいは、選択された裸の抗体の抗腫瘍作用を増強すべく補充することができる免疫調節細胞（例えば、ＣＤ４０＋細胞）に対して向けられたものでもよい。
ＰＡＭ４免疫複合体
本発明はまた、治療または診断のため、少なくとも一種の治療薬および／または診断／検出薬に結合されたヒト化およびヒトＰＡＭ４抗体ならびにそのフラグメントの使用を意図する。免疫療法では、その目的は、非標的組織への暴露を最小限にしつつ、細胞傷害量の放射活性、毒素、または薬物を標的細胞へ送達することである。本発明のＰＡＭ４抗体は、膵臓腫瘍の診断および治療に使用できる。
本発明のいずれの抗体、抗体融合タンパク質およびその断片を、一種以上の治療薬または診断／検出薬と結合させてもよい。一般に、一種の治療薬または診断／検出薬がそれぞれの抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントに結合されるが、一を超える治療薬および／または診断／検出薬を同じ抗体または抗体フラグメントに結合させることもできる。Ｆｃ領域が存在しなければ（例えば免疫複合体の抗体成分としても用いられる抗体が抗体フラグメントである場合）、全長抗体または抗体フラグメントの軽鎖可変領域へ炭水化物部分を導入することができる。例えば、Leung et al., J. Immunol. 154: 5919 (1995); Hansen et al., 米国特許第５，４４３，９５３号(1995), Leung et al., 米国特許第６，２５４，８６８号参照（ここで、これらは総て、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）。この操作された炭水化物部分を用いて治療薬または診断／検出薬を結合させる。
抗体の炭水化物部分を介して抗体成分にペプチドを結合させる方法は当業者に周知である。例えば、Shih et al., Int. J. Cancer 41: 832 (1988); Shih et al., Int. J. Cancer 46: 1101 (1990);およびShih et al., 米国特許第５，０５７，３１３号を参照（ここで、これらは総て、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする）。一般的な方法としては、炭水化物部分が酸化された抗体成分を、少なくとも一つの遊離アミン基を有し、かつ、複数のペプチドが付加された担体ポリマーと反応させることを含む。この反応により最初のシッフ塩基（イミン）結合が生じ、これは第二級アミンへの還元により安定化され最終の複合体を形成し得る。
本発明の抗体融合タンパク質およびそのフラグメントは二種以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり、この融合タンパク質を構成する各々の抗体は少なくとも一種の治療薬および／または診断／検出薬を含むことができる。例えば、抗体融合タンパク質は一つの抗体（二つの抗原結合部位）および抗体フラグメント、二つの抗体フラグメント、または二つの抗体を含んでよい。次に、この抗体融合タンパク質は少なくとも一種の診断／検出薬および／または治療薬と結合させることができる。
よって、抗体融合タンパク質の一以上の抗体またはフラグメントは結合した一を超える治療薬および／または診断／検出薬を含むことができる。さらに、これらの治療薬は同一である必要はなく、異なる治療薬であってもよく、例えば、薬物および放射性同位元素を同じ融合タンパク質へ結合させることができる。特に、ＩｇＧは１３１Ｉで放射性標識し、薬物と結合させることができる。この１３１ＩはＩｇＧのチロシンへ導入でき、薬物はＩｇＧリジンのεアミノ基へ結合させることができる。また、治療薬および診断／検出薬は双方とも還元されたＳＨ基、および炭水化物側鎖に結合させることもできる。
多種多様な診断薬および治療薬（例えば、薬物、毒素、オリゴヌクレオチド、免疫調節剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、治療用放射性核種、脈管形成阻害剤など）が、本発明の抗体と同時もしくは逐次投与可能であり、または有利には本発明の抗体と結合させることができる。本明細書に列挙された治療薬は、上記のように裸の抗体とは別に投与しても有用である薬剤である。治療薬としては、例えば、ビンカアルカロイド、アントラサイクリン、ゲムシタビン、エピトフィロトキシン、タキサン、代謝拮抗剤、アルキル化剤、抗生物質、ＳＮ−３８、ＣＯＸ−２阻害剤、抗有糸分裂剤、抗脈管形成剤およびアポトーシス剤、特にドキソルビシン、メトトレキサート、タキソール、ＣＰＴ−１１、カンプトテカン、およびこれらまたは他の種類の抗癌剤由来の他のものなどが挙げられる。同時または逐次投与のため、あるいは免疫複合体および抗体融合タンパク質の調製のために有用な他の癌化学療法剤としては、ナイトロジェンマスタード、スルホン酸アルキル、ニトロソウレア、トリアゼン、葉酸類似体、ＣＯＸ−２阻害剤、ピリミジン類似体、プリン類似体、プラチナ錯体、ホルモンなどが挙げられる。好適な化学療法剤はREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES,19th Ed.(Mack Publishing Co. 1995およびGOODMAN AND GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, 7th Ed. (MacMillan Publishing Co. 1985)、ならびにこれらの刊行物の改訂版に記載されている。実験薬のような他の好適な化学療法剤も、当業者に公知である。
一つの態様では、本発明のヒト化ＰＡＭ４抗体およびそのフラグメントをベムシタビンに結合させる。もう一つの態様では、本発明の裸の、または結合型のヒト化ＰＡＭ４抗体または抗体フラグメントの前、後または同時にゲムシタビンを与える。好ましくは、結合型のヒト化ＰＡＭ４抗体または抗体フラグメントを放射性核種に結合させる。
毒素は動物、植物または微生物起原のものであり得る。シュードモナス外毒素のような毒素も複合化し得るし、あるいは本発明のＰＡＭ４およびｈＰＡＭ４抗体の免疫複合体の治療薬部分を形成することができる。このような複合体または他の融合タンパク質の調製に適切に使用される他の毒素としては、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）、ＤＮアーゼＩ、ブドウ球菌内毒素−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ゲロニン、ジフテリア毒、シュードモナス外毒素、およびシュードモナス内毒素が挙げられる。例えば、Pastan et al., Cell 47:641(1986)、およびGoldenberg, CA-A Cancer Journal for Clinicians 44:43(1994)参照。本発明で用いるのに好適なさらなる毒素は当業者に公知であり、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許第６，０７７，４９９号に開示されている。
サイトカインのような免疫調節剤もまた結合させ得るし、あるいはＰＡＭ４およびｈＰＡＭ４免疫複合体の治療薬部分を形成することができるし、あるいは本発明のヒト化またはヒトＰＡＭ４抗体もしくはそのフラグメント、またはＰＡＭ４融合タンパク質もしくはそのフラグメントに結合させずに投与することができる。ＰＡＭ４融合タンパク質またはそのフラグメントは、異なる抗原に結合する一以上の抗体またはそのフラグメントを含んでなり得る。例えば、融合タンパク質はＰＡＭ４抗原ならびに免疫調節細胞または因子と結合し得る。あるいは、被験体に、裸のＰＡＭ４抗体、融合タンパク質、またはそのフラグメントを与え、サイトカインを個別に投与することができ、このサイトカインは裸のＰＡＭ４抗体の投与前、同時または投与後に投与することができる。本明細書において「免疫調節剤」としては、サイトカイン、幹細胞増殖因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのリンホトキシン、ならびにインターロイキン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１）、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ））、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α、−βおよび−γ）、「Ｓ１因子」と呼ばれる幹細胞増殖因子、エリスロポエチンおよびトロンボポエチンなどの造血因子が挙げられる。好適な免疫調節剤部分の例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、Ｌ−２１、インターフェロン−γ、ＴＮＦ−αなどが挙げられる。
あるいは、本発明の抗体およびフラグメントは、抗体を酵素と連結することにより、検出可能なように標識することができる。この抗体−酵素複合体を適当な基質の存在下でインキュベートすると、酵素部分は基質と反応して、例えば分光光度的、蛍光測定的または視覚的手段により検出することができる化学部分を生じる。抗体を検出可能に標識するために使用できる酵素の例としては、マレイン酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース６リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、およびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。
治療薬または診断／検出薬は、ジスルフィド結合形成を介して還元された抗体成分のヒンジ領域に結合することができる。あるいは、このようなペプチドはＮ−スクシニル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）のようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて抗体成分に結合させることができる。Yu et al., Int. J. Cancer 56 : 244(1994)。このような結合に関する一般的な技術は当該技術分野で周知である。例えば、Wong, CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING (CRC Press 1991); Upeslacis et al.,"Modification of Antibody by Chemical Methods, "in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Birch et al.(eds), pages 187-230（Wiley-Liss, Inc. 1995）; Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies, "in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRODUCTION, ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION, Ritter et al.(eds.), pages 60-84（Cambridge University Press 1995）参照。あるいは、治療薬または診断／検出薬は抗体のＦｃ領域の炭化水素部分を介して結合させることもできる。この炭化水素基は、チオール基に結合している同じ薬剤の付加量を増大させるためにも使用できるし、あるいはこの炭化水素部分は異なるペプチドに結合するためにも使用できる。
本発明の方法では、ターゲッティング可能な構築物は罹患組織を検出するのに有用な一以上の放射性同位元素を含んでもよい。特に有用な診断用放射性核種としては、限定されるものではないが、１１０Ｉｎ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１８Ｆ、５２Ｆｅ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、８９Ｚｒ、９４ｍＴｃ、９４Ｔｃ、９９ｍＴｃ、１２０Ｉ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１５４−１５８Ｇｄ、３２Ｐ、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、５１Ｍｎ、５２ｍＭｎ、５５Ｃｏ、７２Ａｓ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、８２ｍＲｂ、８３Ｓｒ、またはその他のγ、β、もしくは陽電子放射核種が挙げられ、好ましくは２０〜４，０００ｋｅＶの範囲、より好ましくは２５〜４，０００ｋｅＶの範囲、いっそうより好ましくは２５〜１，０００ｋｅＶの範囲、なおより好ましくは７０〜７００ｋｅＶの範囲の崩壊エネルギーを有するのが好ましい。有用な陽電子放出放射性核種の総崩壊エネルギーは好ましくは＜２，０００ｋｅＶ、より好ましくは１，０００ｋｅＶ未満、最も好ましくは＜７００ｋｅＶである。γ線検出を用いる診断／検出薬として有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、５ｌＣｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、７５Ｓｅ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、ｌ１１Ｉｎ、１１４ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂ、１９７Ｈｇ、および２０１Ｔｌが挙げられる。有用なガンマ線放出放射性核種の崩壊エネルギーは好ましくは２０〜２０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。
本発明の方法では、ターゲッティング可能な構築物は罹患組織の治療に有用な一種以上の放射性同位元素を含んでよい。特に有用な治療用放射性核種としては、限定されるものではないが、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１１Ａｔ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３３Ｐ、４７Ｓｃ、１１１Ａｇ、６７Ｇａ、１４２Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｄｙ、１６６Ｈｏ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、２１２Ｐｂ、２２３Ｒａ、２２５Ａｃ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、７７Ａｓ、８９Ｓｒ、９９Ｍｏ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１４３Ｐｒ、１４９Ｐｍ、１６９Ｅｒ、１９４Ｉｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、および２ｌｌＰｂが挙げられる。治療用放射性核種は好ましくは２０〜６，０００ｋｅＶの範囲、好ましくはオージェ放射核種に関しては６０〜２００ｋｅＶの範囲、β放射核種については１００〜２，５００ｋｅＶ、およびα放射核種については４，０００〜６，０００ｋｅＶの崩壊エネルギーを有する。有用なβ放射核種の最大崩壊エネルギーは好ましくは２０〜５，０００ｋｅＶ、より好ましくは１００〜４，０００ｋｅＶ、最も好ましくは５００〜２，５００ｋｅＶである。また、オージェ放射粒子を伴って実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。例えば、Ｃｏ−５８、Ｇａ−６７、Ｂｒ−８０ｍ、Ｔｃ−９９ｍ、Ｒｈ−１０３ｍ、Ｐｔ−１０９、Ｉｎ−１１１、Ｓｂ−１１９、Ｉ−１２５、Ｈｏ−１６１、Ｏｓ−１８９ｍおよびＩｒ−１９２がある。有用なβ粒子放射性核種の崩壊エネルギーは好ましくは＜１，０００ｋｅＶ、より好ましくは＜１００ｋｅＶ、最も好ましくは＜７０ｋｅＶである。また、α粒子の生成を伴って実質的に崩壊する放射性核種も好ましい。このような放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｄｙ−１５２、Ａｔ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｒａ−２２３、Ｒｎ−２１９、Ｐｏ−２１５、Ｂｉ−２１１、Ａｃ−２２５、Ｆｒ−２２１、Ａｔ−２１７、Ｂｉ−２１３およびＦｍ−２５５が挙げられる。有用なα粒子放出放射性核種の崩壊エネルギーは好ましくは２，０００〜１０，０００ｋｅＶ、より好ましくは３，０００〜８，０００ｋｅＶ、最も好ましくは４，０００〜７，０００ｋｅＶである。
例えば、６７Ｃｕは６１．５というその半減期とβ粒子とγ線を豊富に供給することから放射線免疫療法のためのより有望な放射性同位元素と考えられるが、これはキレート剤ｐ−ブロモアセタミド−ベンジル−テトラエチルアミン四酢酸（ＴＥＴＡ）を用いてＰＡＭ４抗体と結合させることができる。Chase,前掲。あるいは、エネルギーに富んだβ粒子を放出する９０Ｙは、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）を用いてＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントに結合させることができる。
可能性のあるさらなる放射性同位元素としては、１１Ｃ、１３Ｎ、１５０、７５Ｂｒ、１９８Ａｕ、２２４Ａｃ、１２６Ｉ、１３３Ｉ、７７Ｂｒ、１１３ｍＩｎ、９５Ｒｕ、９７Ｒｕ、１０３Ｒｕ、１０５Ｒｕ、１０７Ｈｇ、２０３Ｈｇ、１２１ｍＴｅ、１２２ｍＴｅ、１２５ｍＴｅ、１６５Ｔｍ、１６７Ｔｍ、１６８Ｔｍ、１９７Ｐｔ、１０９Ｐｄ、１０５Ｒｈ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１６１ｂ、１６６Ｈｏ、９１９Ａｕ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、５９Ｆｅ、７５Ｓｅ、２０１Ｔｌ、２２５Ａｃ、７６Ｂｒ、１６９Ｙｂなどが挙げられる。
もう一つの態様では、放射線増感剤を本発明の裸の、または結合型のＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントと組み合わせて使用することができる。例えば、放射性増感剤は放射性標識ＰＡＭ４抗体または抗体フラグメントと組み合わせて使用することができる。放射線増感剤は、放射性標識抗体または抗体フラグメント単独で処理した場合に比べ、効力の増強が可能である。放射線増感剤は、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、D. M. Goldenberg (ed. ), CANCER THERAPY WITH RADIOLABELED ANTIBODIES, CRC Press (1995)に記載されている。
熱中性子活性化療法のためホウ素付加物を付加した担体を有する本発明のＰＭＡ４抗体もしくはそのフラグメント、またはＰＡＭ４融合タンパク質もしくはそのフラグメントも通常同様にして達成される。しかし、中性子照射を行う前に非標的ＰＡＭ４免疫複合体がクリアリングされるまで待つのが有利である。クリアランスはＰＡＭ４抗体に結合する抗体を用いて促進することができる。この一般原理を記載したものとしては、米国特許第４，６２４，８４６号を参照。例えば、カルボランなどのホウ素付加物をＰＡＭ４抗体に結合させることができる。カルボランは当該技術分野で周知のようにペンダント側鎖上のカルボキシル官能基を用いて調製することができる。アミノデキストランなどの担体へのカルボランの結合はカルボランおよび縮合物のカルボキシル基を担体上のアミンで活性化されることにより達成することができる。次に、この中間複合体をＰＡＭ４抗体と結合させる。ＰＡＭ４抗体複合体を投与した後、熱中性子の照射でホウ素付加物を活性化し、α放射により崩壊して毒性の高い、短期の作用を生じる放射性原子へと変換させる。
さらに本発明は、被験体の癌を診断する方法を含む。診断は、医薬上好適な賦形剤中に調剤した診断上有効量の診断用複合体を投与し、該標識を検出することによって達成すればよい。ＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントは診断／検出薬と結合させてもよいし、または、診断／検出薬とは結合させずに、診断／検出薬の投与前、同時もしくは投与後に投与してもよい。診断／検出薬として使用できる放射性薬剤は上記で述べた。好適な非放射性診断／検出薬は磁気共鳴イメージング、Ｘ線、コンピューター断層撮影法または超音波法に好適な造影剤である。磁気イメージング剤としては、例えば、本発明の抗体とともに用いる場合は、マンガン、鉄およびガドリニウムなどの非放射性金属を、２−ベンジル−ＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体を含む金属キレート剤の組み合わせと錯化したものを含む。引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする、２００１年１０月１０日出願の米国出願番号０９／９２１，２９０参照。
本発明で意図されるＭＲＩ造影剤のような造影剤としては、例えば、ガドリニウムイオン、ランタンイオン、ジスプロシウムイオン、鉄イオン、マンガンイオンまたはその他同等の標識、ＣＴ造影剤、および超音波造影剤が本発明における使用に好適である。
本発明に好適な常磁性イオンとしては、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）およびエルビウム（III）が挙げられ、ガドリニウムが特に好ましい。
Ｘ線イメージングなどのその他の場合に有用なイオンとしては、限定されるものではないが、ランタン（III）、金（III）、鉛（II）、および特にビスマス（III）が挙げられる。蛍光標識としては、ローダミン、フルオレセインおよびレノグラフィンが挙げられる。ローダミンおよびフルオレセインはイソチオシアネート中間体を介して結合させる場合が多い。
また、金属は磁気共鳴イメージング技術用のものなど、診断／検出薬においても有用である。これらの金属としては、限定されるものではないが、ガドリニウム、マンガン、鉄、クロム、銅、コバルト、ニッケル、ジスプロシウム、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウムおよびネオジムが挙げられる。抗体成分に放射性金属または常磁性イオンを付加するためには、イオンを結合させるための多様なキレート基を付着させた長い尾部を有する試薬と反応させる必要があろう。このような尾部は、ポリリシン、多糖、または例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ポルフィリン、ポリアミン、クラウンエーテル、ビス−チオセミカルバゾン、ポリミキシン、およびこの目的のために有用なことが公知の基といった、キレート基に結合できるペンダント基を有する他の誘導体化または誘導体化可能な鎖であり得る。キレート剤は標準的な化学法を用いてＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントに結合させる。キレート剤は通常、免疫反応性の損失が最小で、凝集および／または内部架橋が最小となる分子との結合を形成し得る基により抗体に連結される。キレート剤を抗体に結合させるその他の、もっと特殊な方法および試薬は、１９８９年４月２５日出願の「Antibody Conjugates」と題されたHawthorneの米国特許第４，８２４，６５９号に開示されており、引用することによりその開示内容を本明細書の一部とする。特に有用な金属−キレートの組み合わせとしては、一般エネルギー範囲２０〜２，０００ｋｅＶの診断用同位元素とともに用いられる２−ベンジルＤＴＰＡならびにそのモノメチルおよびシクロヘキシル類似体が挙げられる。同じキレート剤がマンガン、鉄およびガドリニウムのような非放射性金属と錯化した場合は、本発明の抗体とともに使用するとＭＲＩに有用である。ＮＯＴＡ、ＤＯＴＡ、およびＴＥＴＡのような大環状のキレート剤は種々の金属および放射性金属とともに、最も詳しくは、それぞれガリウム、イットリウム、および銅などの放射性核種とともに用いられる。このような金属−キレート錯体は、環のサイズを目的の金属にあわせて調整することにより極めて安定にすることができる。大環状ポリエーテルのような他のリング型キレート剤は、ＲＡＩＴのための２２３Ｒａのような、安定に結合する核種を対照とするものであり、本発明に包含される。
Ｘ線およびコンピューター断層撮影を増強するためには放射線不透性剤および造影剤が用いられるが、これらにはヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物、タリウム化合物などが含まれる。特定の化合物としては、バリウム、ジアトリアゾエート、エチオド化オイル、クエン酸ガリウム、イオカルム酸、イオセタム酸、ヨーダミド、ヨージパミド、ヨードキサム酸、イオグラミド、イオヘキソール、イオパミドール、イオパン酸、イオプロセム酸、イオセファム酸、イオセル酸、イオスラミドメグルミン、イオセメ酸、イオタスル、イオテトル酸、イオサラム酸、イオトロキシ酸、イオキサグル酸、イオキソトリアゾ酸、イポデート、メグルミン、メトリザミド、メトリゾエート、プロピリオドンおよび塩化タリウムが含まれる。
本発明の抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントはまた、蛍光化合物で標識することもできる。蛍光標識ＭＡｂの存在は抗体を適当な波長の光に曝し、生じた蛍光を検出することにより決定される。蛍光標識化合物としては、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリセリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒドおよびフルオロスカミンが挙げられる。蛍光標識抗体は特にフローサイトメトリー分析に有用である。
あるいは、本発明の抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントは、抗体と化学発光化合物を結合させることにより検出可能に標識することができる。化学発光タグ付きＭＡｂの存在は、化学反応の経過の間に生じる発光の存在を検出することにより決定される。化学発光標識化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。
同様に、生物発光化合物を用いて本発明の抗体およびそのフラグメントを標識することもできる。生物発光は触媒タンパク質が化学発光反応の効力を高める生体系で見られる一種の化学発光である。生物発光タンパク質の存在は発光の存在を検出することにより決定される。標識に有用な生物発光化合物としては、ルシフェリン、ルシフェラーゼおよびエクオリンが挙げられる。
よって、被験体において悪性腫瘍を診断する方法であって、被験体由来の検体（体液、組織または細胞）に対して、裸のＰＡＭ４ ＭＡｂもしくはそのフラグメント、または裸の抗体融合タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなる組成物を用いてin vitro診断アッセイを行うことを含んでなる方法が記載される。細胞または組織においてＰＡＭ４の存在を検出するには免疫組織化学が使用できる。好ましくは、診断される悪性腫瘍は癌である。最も好ましくは、癌は膵臓癌である。
これに加えて、ＤＴＰＡ、ＤＯＴＡ、ＴＥＴＡまたはＮＯＴＡのようなキレート剤または好適なペプチドに、蛍光分子のような検出可能な標識または、重金属もしくは放射性核種のような細胞傷害剤を結合させることができる。例えば、治療上有用な免疫複合体は、光活性薬または色素を抗体融合タンパク質に結合させることにより得られる。蛍光色素のような蛍光組成物、および他の色素原、または可視光線に感受性のあるポルフィリンのような色素は好適な光線を病巣に当てることにより病巣の検出および治療に使用されてきた。治療においては、これは光照射、光療法または光線力学療法と呼ばれている（Jori et al. (eds.）, PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES（Libreria Progetto 1985); van den Bergh, Chem. Britain 22:430（1986））。さらに、光療法を行うためにはモノクローナル抗体が光活性化色素と結合させられてきた。Mew et al., J.Immunol. 130:1473(1983);前掲, Cancer Res. 45:4380 (1985); Oseroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8744 (1986);前掲, Photochem. Photobiol. 46:83 (1987); Hasan et al., Prog. Clin. Biol. Res. 288:471 (1989); Tatsuta et al., Lasers Surg. Med.9:422 (1989); Pelegrin et al., Cancer 67:2529（1991)。しかし、これらの初期の研究には、特に抗体フラグメントまたはサブフラグメントの使用を伴った内視鏡療法の適用は含まれていなかった。従って本発明は、光活性薬または色素を含んでなる免疫複合体の治療的使用を意図する。
治療目的では、本発明のＰＡＭ４抗体およびそのフラグメントは治療上有効量で患者に投与する。抗体は、投与される量が生理学上有意であれば、「治療上有効量」で投与されると言われる。その存在が受容患者の生理に検出可能な変化をもたらす場合に、薬剤は生理学上有意である。
診断／検出薬は、抗体部分、すなわち、抗体もしくは抗体フラグメント、またはサブフラグメント、融合タンパク質、およびそのフラグメントに結合させて投与し得る分枝または原子であり、疾病関連抗原を含む細胞を限局化することにより疾病を診断／検出する上で有用である。有用な診断／検出薬としては、限定されるものではないが、放射性同位元素、色素（ビオチン−ストレプトアビジン複合体を伴うものなど）、放射線不透過性物質（例えば、ヨウ素、バリウム、ガリウムおよびタリウム化合物など）、造影剤、蛍光化合物または分子、および磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）のための増強剤（例えば、常磁性イオン）が挙げられる。米国特許第６，３３１，１７５号はＭＲＩ技術およびＭＲＩ増強剤に結合された抗体の調製を記載し、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする。好ましくは、診断／検出薬は核イメージング、内視鏡検査および血管内検査のための放射性同位元素、磁気共鳴イメージングまたは超音波検査法で用いる増強剤、Ｘ線およびコンピューター断層撮影法のための放射線不透過剤および造影剤、ならびに内視鏡蛍光透視法を含む蛍光透視法のための蛍光化合物からなる群から選択される。抗体と結合されているか、または二重特異性プレターゲッティング法で用いられる蛍光剤および放射活性剤は、特にγ、βおよび陽電子放射核種を伴い、引用することによりその全開示内を本明細書の一部とするGoldenbergの米国特許第５，７１６，５９５号、同第６，０９６，２８９号および米国出願番号０９／３４８，８１８に開示されているような、悪性腫瘍などの罹患組織または細胞塊に関連する標的抗原の内視鏡検査、手術中検査または血管内検査に特に有用である。内視鏡適用は、結腸などの内視鏡検査が可能な構造に換算している場合に用い得る。陽電子放射断層撮影法に有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｆ−１８、Ｍｎ−５１、Ｍｎ−５２ｍ、Ｆｅ−５２、Ｃｏ−５５、Ｃｕ−６２、Ｃｕ−６４、Ｇａ−６８、Ａｓ−７２、Ｂｒ−７５、Ｂｒ−７６、Ｒｂ−８２ｍ、Ｓｒ−８３、Ｙ−８６、Ｚｒ−８９、Ｔｃ−９４ｍ、Ｉｎ−１１０、Ｉ−１２０およびＩ−１２４が挙げられる。有用な陽電子放出放射性核種の総崩壊エネルギーは好ましくは＜２，０００ｋｅＶ、より好ましくは１，０００ｋｅＶ未満、最も好ましくは＜７００ｋｅＶである。γ線検出を用いる診断／検出薬として有用な放射性核種としては、限定されるものではないが、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−５７、Ｃｏ−５８、Ｆｅ−５９、Ｃｕ−６７、Ｇａ−６７、Ｓｅ−７５、Ｒｕ−９７、Ｔｃ−９９ｍ、Ｉｎ−１ｌｌ、ｍ−１１４ｍ、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｙｂ−ｌ６９、Ｈｇ−１９７、およびＴｌ−２０１が挙げられる。有用なγ線放出放射性核種の崩壊エネルギーは好ましくは２０〜２０００ｋｅＶ、より好ましくは６０〜６００ｋｅＶ、最も好ましくは１００〜３００ｋｅＶである。
in vitro診断
本発明は生体サンプルをＰＡＭ４抗原の存在に関してin vitroスクリーニングするための、ＰＡＭ４抗体（ＰＡＭ４融合タンパク質およびそのフラグメントを含む）の使用を意図する。このような免疫アッセイでは、ＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントは以下に記載されるように、液相で用いてもよいし、固相担体に結合させてもよい。ある好ましい態様では、ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントはヒト化されている。また、好ましくは、ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントは完全ヒト型である。さらに好ましくは、ＰＡＭ４融合タンパク質はヒト化または完全ヒトＰＡＭ４抗体を含んでなる。
生体サンプルがＰＡＭ４抗原を含むかどうかを判定するためのスクリーニング方法の一例として、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）がある。例えば、ＲＩＡの一形態では、試験下の物質を放射性標識ＰＡＭ４抗原の存在下でＰＡＭ４抗原ＭＡｂと混合する。この方法では、試験物質の濃度は、ＭＡｂと結合している標識ＰＡＭ４抗原の量と反比例し、遊離している標識ＰＡＭ４抗原の量と直接相関する。他の好適なスクリーニング法も当業者には容易に明らかになろう。
あるいは、ＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントが固相担体に結合されているin vitroアッセイを行うこともできる。例えば、ポリマーをコーティングしたビーズ、プレートまたは試験管などの不溶性の支持体にＭＡｂを結合させるためには、ＭＡｂをアミノデキストランのようなポリマーに結合させればよい。
他の好適なin vitroアッセイも当業者には容易に明らかになろう。検出可能なように標識されたＰＡＭ４抗体およびＰＡＭ４抗原の固有濃度はインキュベーションの温度および時間、ならびにその他のアッセイ条件はサンプル中のＰＡＭ４抗原の濃度、サンプルの性質などをはじめとする種々の因子によって異なる。ＰＡＭ４抗体のサンプルの結合活性は周知の方法に従って測定することができる。当業者ならば通常の実験を用いて各測定に関して実施可能で最適なアッセイ条件を決定することができるであろう。
特定の条件に関する慣例または必要に応じて洗浄、攪拌、振盪、濾過などの他の工程をアッセイに加えてもよい。
生体サンプル中のＰＡＭ４抗原の存在は固相酵素免疫検定アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて判定することができる。直接競合ＥＬＩＳＡでは、純粋または半精製抗原調製物を、試験する体液または細胞抽出物に不溶な固相支持体に結合させ、検出可能なように標識した一定量の可溶性抗体を加えれば、固相抗原と標識抗体の間で形成された二元複合体の検出および／または定量が可能となる。
これに対し、「二部位ＥＬＩＳＡ」または「サンドイッチアッセイ」としても知られる「二重決定基」ＥＬＩＳＡでは少量の抗原しか必要とせず、このアッセイでは抗原の大量精製の必要はない。このように二重決定基ＥＬＩＳＡは、臨床サンプル中の抗原の検出に関しては直接競合ＥＬＩＳＡと呼ばれる。例えば、生検験体中のｃ−ｍｙｃ癌タンパク質の定量のための二重決定基ＥＬＩＳＡの使用(Field et al., Oncogene 4: 1463 (1989); Spandidos et al., AntiCancer Res. 9: 821 (1989))参照。
二重決定基ＥＬＩＳＡでは、一定量の非標識ＭＡｂまたは抗体フラグメント（「キャプチャー抗体」）を固相支持体に結合させ、試験サンプルをキャプチャー抗体と接触させ、検出可能なように標識した可溶性抗体（または抗体フラグメント）を加えればキャプチャー抗体、抗原および標識抗体の間で形成された三元複合体の検出および／または定量が可能となる。抗体フラグメントとは、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、 Ｆａｂなどのような抗体の部分をいう。本発明では、抗体フラグメントＰＡＭ４抗原のエピトープと結合するＰＡＭ４ ＭＡｂの部分である。「抗体フラグメント」とはまた、特定の抗原に結合して複合体を形成することにより抗体のようにふるまういずれの合成または遺伝子操作タンパク質も含む。例えば、抗体フラグメントとしては、軽鎖可変領域からなる単離されたフラグメント、重鎖および軽鎖の可変領域からなる「Ｆｖ」フラグメント、および軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカーにより連結されている組換え単鎖ポリペプチド分子が挙げられる。抗体融合タンパク質とは、同じ、または異なる特異性を有する同じ、または異なる単鎖抗体または抗体フラグメントの、二以上のセグメントが連結されている、組換え生産された抗原結合分子である。融合タンパク質は単一の抗体成分、異なる抗体成分の多価または多重特異性の組み合わせ、または同じ抗体成分の複数コピーを含み得る。融合タンパク質はさらに、診断／検出薬および／または治療薬に結合された抗体または抗体フラグメントを含んでもよい。ＰＡＭ４抗体には、ヒト化、ヒトおよびマウス抗体、その抗体フラグメント、免疫複合体およびそのフラグメント、ならびに抗体融合タンパク質およびそのフラグメントが含まれる。
二重決定基ＥＬＩＳＡを行う方法は周知である。例えば、Field et al.,前掲、Spandidos et al.,前掲、およびMoore et al., "Twin-Site ELISAs for fos and myc Oncoproteins Using the AMPAK System," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 273-281 (The Humana Press, Inc. 1992)参照。
二重決定基ＥＬＩＳＡでは、可溶性抗体または抗体フラグメントは、キャプチャー抗体によって認識されるエピトープとは異なるＰＡＭ４エピトープと結合しなければならない。二重決定基ＥＬＩＳＡは生検サンプル中にＰＡＭ４抗原が存在するかどうかを確認するために行うことができる。あるいは、このアッセイは体液の臨床サンプル中に存在するＰＡＭ４抗原を定量するために行うこともできる。この定量アッセイは精製されたＰＡＭ４抗原の希釈物を含めて行うことができる。
本発明のＰＡＭ４ ＭＡｂ、融合タンパク質およびそのフラグメントはまたアッセイキットの製造にも適している。このようなキットはバイアル、試験管などのような一以上の密閉収容手段（これらの各収容手段は免疫アッセイの個々のヨウ素を含む）に収容するように区画化されている輸送手段を含んでなってもよい。
例えば、固相支持体に固定化されたキャプチャー抗体を含む収容手段と、液相として検出可能なように標識された抗体を含むさらなる収容手段が存在してもよい。さらなる収容手段にはＰＡＭ４抗原の連続希釈物を含む標準液を含んでもよい。ＰＡＭ４抗原の標準液は、横座標にプロットしたＰＡＭ４抗原の濃度と縦座標上の検出シグナルを用いて標準曲線を作成するために使用できる。ＰＡＭ４抗原を含むサンプルから得られた結果をこのようなプロットから推定し、生体サンプル中のＰＡＭ４抗原の濃度を得ることができる。
本発明のＰＡＭ４抗体、融合タンパク質およびそのフラグメントはまた、組織学的験体から作製した組織切片中のＰＡＭ４抗原の存在を検出するためにも使用できる。このようなin situ検出を用いてＰＡＭ４抗原の存在を判定したり、また、検査組織におけるＰＡＭ４抗原の分布を調べたりすることができる。in situ検出は、検出可能なように標識したＰＡＭ４抗体を凍結組織切片に適用することで達成することができる。研究によれば、ＰＡＭ４抗原はパラフィン包埋切片でにおいて保存される。in situ検出の一般技術は当業者に周知である。例えば、Ponder, "Cell Marking Techniques and Their Application," in MAMMALIAN DEVELOPMENT: A PRACTICAL APPROACH 113-38 Monk (ed.) (IRL Press 1987)、およびColigan at pages 5.8.1-5.8.8参照。
ＰＡＭ４抗体、融合タンパク質およびそのフラグメントは好適ないずれかのマーカー部分、例えば放射性同位元素、酵素、蛍光標識、色素、色素原、化学発光標識、生物発光標識または常磁性標識で検出可能なように標識することができる。このような検出可能なように標識されたＰＡＭ４抗体を作製および検出する方法は当業者に周知であり、また、以下にもさらに詳細に記載する。
マーカー部分はγカウンターまたはシンチレーションカウンターを用いるなどの手段、またはオートラジオグラフィーによって検出される放射性同位元素であってもよい。ある好ましい態様では、診断用複合体はγ線、β線または陽電子放出同位元素である。本明細書においてマーカー部分とは、所定の条件下でシグナルを生じる分子をさす。マーカー部分の例としては、放射性同位元素、酵素、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および常磁性標識が挙げられる。本明細書において、診断薬または治療薬とは、診断または治療に有用な複合体を形成するように抗体部分と結合されている分子または原子である。診断薬または治療薬の例としては薬物、毒素、オリゴヌクレオチド、免疫調節剤、サイトカイン、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、酵素、酵素阻害剤、同位元素、他の抗体、キレート剤、色素、色素原、ホウ素化合物、およびマーカー部分が挙げられる。
一つの態様では、ｂｃｌ−２発現を阻害するアンチセンス分子などのオリゴヌクレオチドが、引用することによりその全開示内容を本明細書の一部とする米国特許第５，７３４，０３３号(Reed)に記載されており、本発明の免疫複合体または抗体融合タンパク質の治療薬部分に結合されているか、または治療薬部分を形成し得る。あるいは、このオリゴヌクレオチドは本発明の裸の、または結合されているＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントと同時投与してもよいし、逐次投与してもよい。ある好ましい態様では、このオリゴヌクレオチドは癌遺伝子またはｂｃｌ−２などＢ細胞悪性腫瘍の癌遺伝子産物に対して向けられていることが好ましいアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
当業者ならば本発明に従って使用できる他の好適な標識を知っている。マーカー部分とＰＡＭ４抗体との結合は当該技術分野で公知の標準技術を用いて達成することができる。これに関する典型法は、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1 (1976)、Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1 (1977)、Shih et al., Int'l J. Cancer 46:1101 (1990)に記載されている。
上記のin vitroおよびin situ検出法を診断または病状の病期判定の補助に用いてもよい。例えば、このような方法は膵臓癌など、ＰＡＭ４抗原を発現する腫瘍を検出するのに用いることができる。
in vovo診断
本発明はまた、in vivo診断のためのＰＡＭ４抗体の使用も意図する。放射性標識ＭＡｂを用いた診断イメージングの方法は周知である。イムノシンチグラフィー技術では、例えば抗体をγ線放出放射性同位元素で標識し、患者へ導入する。γ線を放出する放射性同位元素の位置および分布を検出するにはガンマカメラを用いる。例えば、Srivastava (ed.), RADIOLABELED MONOCLONAL ANTIBODIES FOR IMAGING AND THERAPY (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition, Gennaro et al. (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990)、およびBrown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies," in BIOTECHNOLOGY AND PHARMACY 227-49, Pezzuto et al. (eds.) (Chapman & Hall 1993)参照。
診断イメージングでは、放射性同位元素をＰＡＭ４抗体に直接または中間的官能基を用いることで間接的に結合させればよい。有用な中間的官能基としては、エチレンジアミン四酢酸およびジエチレントリアミン五酢酸などのキレート剤が挙げられる。例えば、Shih et al.,前掲、および米国特許第５，０５７，３１３号参照。
患者に送達する線量は最小の半減期、最小の身体残留、および検出と正確な測定が可能な最少の同位元素量の最良の組み合わせとして同位元素を選択することで可能な限り低レベルに維持される。ＰＡＭ４抗体と結合させることができ、かつ、診断イメージングに適当な放射性同位元素の例としては９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎがある。
ＰＡＭ４抗体、融合タンパク質およびそのフラグメントはまた、in vivo診断目的での常磁性イオンおよび種々の放射線造影剤で標識することができる。磁気共鳴イメージングに特に有用な造影剤は、ガドリニウム、マンガン、ジスプロシウム、ランタン、または鉄イオンを含んでなる。さらなる薬剤としては、クロム、銅、コバルト、ニッケル、レニウム、ユーロピウム、テルビウム、ホルミウムまたはネオジムが挙げられる。ＰＡＭ４抗体およびそのフラグメントはまた、超音波造影／増強剤と結合させることもできる。例えば、超音波造影剤はヒト化ＰＡＭ４ ＩｇＧまたはそのフラグメントを含んでなるリポソームである。また、超音波造影剤はガス充填されたリポソームであるのが好ましい。
ある好ましい態様では、二重特異性抗体は造影剤と結合させることができる。例えば、二重特異性抗体は超音波イメージングで用いるための一種以上のイメージ増強剤を含んでなってもよい。ある好ましい態様では、造影剤はリポソームである。リポソームはリポソームの外面に共有結合された二価のＤＴＰＡ−ペプチドを含んでなるのが好ましい。リポソームがガス充填されているのがいっそう好ましい。
医薬上好適な賦形剤
治療適用においてＰＡＭ４抗体の作用期間を制御するためにさらなる薬学的方法を用いてもよい。徐放性製剤はＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントと複合体形成するか、それらを吸着するポリマーの使用を通じて調製することができる。例えば、生体適合性ポリマーとしては、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）マトリックスおよびステラリン酸二量体とセバシン酸の無水共重合体マトリックスが挙げられる。Sherwood et al., Bio/Technology 10: 1446 (1992)。このようなマトリックスからのＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントの放出速度はＰＡＭ４抗体、融合タンパク質またはそのフラグメントの分子量、マトリックス内のＰＡＭ４抗体の量、および分散している粒子の大きさによって異なる。Saltzman et al., Biophys. J. 55: 163 (1989); Sherwood et al.,前掲。その他の固相投与形はAnsel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition (Lea & Febiger 1990)、およびGennaro (ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990）およびそれらの改訂版(1990)に記載されている。
被検体に送達されるヒト化およびヒトＰＡＭ４抗体およびそのフラグメントは、抗体、免疫複合体、融合タンパク質またはそのフラグメント単独から構成されるか、または一以上の医薬上好適な賦形剤、一以上の付加的成分またはこれらのある組み合わせを含み得る。
本発明の免疫複合体、裸の抗体およびそのフラグメントは医薬上有用な組成物を調製するための公知の方法に従って調剤され、それによりこの免疫複合体または裸の抗体は混合物中で医薬上好適な賦形剤と合わさる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は医薬上好適な賦形剤の一例である。他の好適な賦形剤は当業者に周知である。例えば、Ansel et al., PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, 5th Edition （Lea & Febiger 1990)、およびGennaro(ed.), REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Edition (Mack Publishing Company 1990）およびそれらの改訂版を参照。
本発明の免疫複合体または裸の抗体は、例えばボーラス注射または点滴による静脈内投与のために調剤できる。注射製剤は、例えばアンプルのような単位投与形、または保存剤を加えた複数回投与用容器で提供することができる。この組成物は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルションの形態をとってもよく、沈殿防止剤、安定剤および／または分散剤のような処方剤を含むことができる。あるいは、その活性成分は使用前に例えば滅菌パイロジェンフリー水のような好適なビヒクルで構成するための粉末形態であってもよい。
また、免疫複合体、裸の抗体、およびそのフラグメントは哺乳類に皮下投与または他の非経口経路でも投与できる。ある好ましい態様では、ＰＡＭ４抗体またはそのフラグメントは一用量当たり２０〜２０００ｍｇタンパク質の用量で投与される。さらに、投与は点滴でも単回または複数回のボーラス注射によってもよい。一般に、ヒトにおいては投与される免疫複合体、融合タンパク質または裸の抗体の用量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の健康状態、および以前の病歴といった因子によって異なる。通常、単回の静脈点滴として約１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量の免疫複合体、抗体融合タンパク質または裸の抗体をレシピエントに与えるのが望ましいが、状況によってはより低い、またはより高い用量を投与してもよい。この用量は必要に応じで繰り返してもよく、例えば、１週間に１回の投与を４〜１０週間、好ましくは１週間に１回の投与を８週間、そしてより好ましくは、１週間に１回の投与を４週間繰り返してもよい。また、１週間おきの投与を数ヶ月といったように低い頻度で投与してもよい。用量および日程を適宜調節して、種々の非経口経路により投与してよい。
本発明のＰＡＭ４抗体、融合タンパク質およびそのフラグメントは医薬上有用な組成物を調製する既知の方法に従って調剤することができ、それによりＰＡＭ４抗体は混合物中で医薬上許容される担体と合わさる。組成物は、その投与が受容患者によって許容される場合、「医薬上許容される担体」であると言われる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は医薬上許容される担体の一例である。他の好適な担体は当業者に周知である。例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Ed. (1990)参照。
治療目的では、治療上有効な量の免疫複合体、または裸の抗体を哺乳類に投与する。ヒト以外の動物被検体もまた意図されるが、本発明の好適な被検体は通常ヒトである。抗体製剤は、投与される量が生理学上有意であれば、「治療上有効量」で投与されると言われる。薬物は、その存在が受容哺乳類の生理に検出可能な変化をもたらす場合に、生理学上有意である。
以下の実施例は本発明の態様を例示するものであり、特許請求の範囲を何ら限定するものではない。
下記実施例はＰＡＭ４ ＭＡｂおよびＣａＰａｎ１ヒト膵臓癌を用いた実験的研究を述べる。ＣａＰａｎ１ヒト膵臓癌は皮下および正所双方の異種移植片として担持される。ＭＡｂおよび薬剤は生存期間に著しい向上をもたらした。高濃度のＰＡＭ４モノクローナル抗体は、異種移植ヒト腫瘍モデルをターゲッティングし、最初の患者群の大多数の膵臓腫瘍をターゲッティングすることが示される。患者の血液中のＰＡＭ４反応性抗原を定量するためにin vitro免疫アッセイを用いると、膵炎ならびに他の疾病および正常群から膵臓癌を識別する能力が有望であることが明らかである。
ＰＡＭ４ ＭＡｂを用いた臨床試験は、患者の大部分の病変部がターゲッティングされたこと、および正常組織における取り込みが示されなかったことを示している。線量計測によれば、１０〜２０ｃＧｙ／ｍＣｉを腫瘍に送達することができ、腫瘍対赤色髄比は３：１〜１０：１であったことが示された。これらのデータは、ＰＡＭ４が膵臓癌の治療の第一相試験の進展に有用であることを示唆している。
実施例１ 免疫組織化学染色研究
正常成体組織に対する免疫組織化学によれば、ＰＡＭ４反応性エピトープが胃腸管に制限され、染色は弱かったが、明らかに陽性であることを示した（表１）。膵管、細導管、腺房および島細胞を含む正常な膵臓組織は染色は陰性であった。抗原として組織ホモジネートを用いたＰＡＭ４に基づく酵素免疫アッセイは全般的に免疫組織化学データを支持した（表２）。ＰＡＭ４エピトープは正常な膵臓およびその他の非胃腸管組織には存在しなかった。腫瘍組織では、ＰＡＭ４は２５のうち２１の膵臓癌（８５％）と反応性があった（表３）。ＰＡＭ４反応性は腫瘍同定のステージと相関しているようであった。例えば、よく分化した膵臓腫瘍およびある程度分化した膵臓腫瘍２１のうち２０が陽性であり、一方、分化の不十分な腫瘍では４つのうち１つだけが陽性であった。一般に、分化の不十分な腫瘍は総ての膵臓癌の１０％に満たない。
これらの研究により、ＰＡＭ４反応性および組織分布（正常なものと癌の双方）は、ＣＡｌ９．９、ＤＵＰＡＮ２、ＳＰＡＮ１、Ｎｄ２、Ｂ７２．３、およびＬｅｗｉｓ抗原に関して報告されているものとは異なることが示された。これらのＭＡｂのあるもので行った交差遮断研究と考え合わせると、そのデータはＰＡＭ４ ＭＡｂは独特かつ新規なエピトープを認識することを示唆する。ＣＡ１９．９、ＤＵＰＡＮ２、およびａＬｅａと比べた場合、ＰＡＭ４はその組織分布により制限があるものと思われ、高いパーセンテージの膵臓腫瘍と反応性がある。さらに、同じ濃度でも反応全体の強度が大きく、腫瘍内の高いパーセンテージの細胞と反応性がある。最後に、ＰＡＭ４は、慢性膵炎検体１２のうち３と弱い反応性を示すに過ぎず、一方、ＣＡ１９．９およびＤＵＰＡＮ２は１２総ての検体と強い反応性を示した。特異性は用いるアッセイのタイプおよび試験する組織の範囲および数、正常膵臓組織と腫瘍膵臓組織を識別するＰＡＭ４の能力によって異なることが認識されるが、は臨床適用の発展的検討を行うためには、癌検体の大きなパーセンテージと反応するその能力ならびに高い反応強度が重要な原理であった。
Figure 0005139626
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実施例２ 放射性標識ＰＡＭ４のin vivo生体分布および腫瘍ターゲッティング
ＰＡＭ４の最初の生体分布研究は、予測される分化の範囲にわたる、一連の４種の異なる異種移植ヒト膵臓腫瘍において行った。用いた４つの腫瘍系統ＡｓＰｃ１、ＢｘＰｃ３、Ｈｓ７６６ＴおよびＣａＰａｎ１は、腫瘍内に１３１Ｉ−ＰＡＭ４の濃縮を示し（範囲は３日目で２１％〜４８％ＩＤ／ｇ）、同時に投与された非特異的なイソタイプ合致Ａｇ８抗体（範囲は３日目で３．６％〜９．３％ＩＤ／ｇ）よりも有意に高かった（ｐ＜０．０１〜０．００１）。この生体分布データを用いて、ＡｓＰｃ１、ＢｘＰｃ３、Ｈｓ７６６ＴおよびＣａＰａｎ１それぞれに注射量１２，２３０；１０，６８４；６，８３５；および１５，８４３ｃＧｙ／ｍＣｉの腫瘍に対する潜在的線量を見積もった。実際の最大許容量（ＭＴＤ）０．７ｍＣｉでは、ＰＡＭ４は異種移植腫瘍モデルの各々に実質的な線量をもたらすことができた。各腫瘍系統において、放射性標識ＰＡＭ４の血液レベルは非特異的Ａｇ８よりも有意に低かった（ｐ＜０．０１〜０．００１）。ＰＡＭ４からの血液への潜在線量はＡｇ８のものより１．４〜４．４倍低かった。ＰＡＭ４からの腫瘍への線量をＰＡＭ４から血液への線量に対してノーマライズしたところ、腫瘍が受け取った線量は２．２；３．３；３．４であり、それぞれ血液よりも１３．１倍高かった。重要なことに、非腫瘍組織に対する潜在線量は最小であった。
ＣａＰａｎ１腫瘍モデルを用い、ＰＡＭ４の生体分布を抗ＣＥＡ抗体であるＭＮ１４と比べた。腫瘍内のＰＡＭ４の濃度は初期の時点ではＭＮ１４よりもずっと高く、３日目の腫瘍：血液比はＭＮ１４では２．７±１．９であるのに対し、ＰＡＭ４では１２．７±２．３であった。腫瘍内へのＰＡＭ４の取り込みは初期の時点でＭＮ１４より有意に高かったが（１日目ではｐ＜０．００１；３日目ではｐ＜０．０１）、線量計測によれば、１４日の試験期間にわたって、ＭＮ１４に比べ、ＰＡＭ４から腫瘍へは３．２倍高い線量であったに過ぎなかったことが示された。これはＰＡＭ４が腫瘍から迅速にクリアランスされるためであり、従って後の時点では、腫瘍内には２種の抗体とも同等濃度が存在していた。腫瘍からのＰＡＭ４の迅速なクリアランスはＢｘＰｃ３およびＨｓ７６６Ｔにおいても注目されたが、ＡｓＰｃ１腫瘍モデルでは見られなかった。これらの知見は、例えば結腸直腸癌におけるＧ９およびＢ７２．３などの他の抗ムチン抗体に関して報告されているもの（各々、ＭＮ１４抗体と比べた場合に長い保持時間を示した）とは異なった。ＰＡＭ４の代謝についての研究から得られた結果は、まず腫瘍細胞に結合した後、抗体が迅速に放出され、おそらくは異化作用を受けるか、または抗原：抗体複合体として隔離される。これは、血液クリアランスが極めて速いことを除けば、患者における抗体の使用にとって好ましくない意味を持つであろう。これらのデータは、１３１Ｉが治療適用のための同位元素の適当な選択肢とはなり得ないことを示唆する。頻繁に投与できる９０Ｙまたは１８８Ｒｅのような短命な同位元素がより効果的な試薬であるといえよう。
ＰＡＭ４は、ＣａＰａｎ１腫瘍モデルを除き、正常組織へのターゲッティングの証拠は示されず、ＣａＰａｎ１腫瘍モデルでは、小さいが、実質的に有意な脾臓取り込みが見られた（範囲は３日目で３．１〜７．５％ＩＤ／ｇ）。この種の脾臓ターゲッティングは抗ムチン抗体Ｂ７２．３およびＣＣ４９の臨床適用で見られている。重要なことに、これらの研究では、また、脾臓ターゲッティングが抗体の取り込みに影響しなかったし、各スキャンの解釈の妨げとならなかった。これらの研究から、脾臓ターゲッティングが脾臓中の交差反応抗原によるものでなく、Ｆｃ受容体による結合によるものでもなく、むしろ以下の可能性：脾臓にトラップされた抗原の直接ターゲッティング、または血液中で形成されたか、または腫瘍部位から放出された抗原：抗体複合体の間接的取り込みの一以上によるものであったことを示唆した。後者には血液中に免疫複合体が存在することが必要であるが、５分といった初期および７日目といった後期の検体をゲル濾過（ＨＰＬＣ，ＧＦ−２５０カラム）により調べた場合には見られず、放射性標識抗体は本来のものとして溶出した。前者の説明は、ＣａＰａｎ１腫瘍が大量のＰＡＭ４反応性抗原を産生し、検討した他の腫瘍細胞系統よりも１００〜１０００倍高いという点でより可能性が高いと思われる。これらの他の腫瘍系統においてＰＡＭ４による脾臓ターゲッティングがないということから、この減少は過剰な抗原産生に関連したものであることが示唆される。いずれにせよ、脾臓ターゲッティングはタンパク質用量をもとの２μｇから１０μｇに引き上げることによって克服することができる。脾臓にトラップされた抗原の多くはおそらく放射性標識抗体よりも非標識ＰＡＭ４と複合体形成した。タンパク質用量を増すことで、腫瘍または非腫瘍組織へのＰＡＭ４のターゲッティングに悪影響は無かった。実際、タンパク質用量を１００μｇまで引き上げたところ、ＣａＰａｎ１腫瘍内の放射性標識ＰＡＭ４濃度が二倍を超えた。
実施例３ 無胸腺ヌードマウスにおける正所膵臓腫瘍モデルの開発
動物モデルにおける膵臓癌の臨床像をさらに近似させるため、出願者らは膵臓のヘッドに直接腫瘍細胞を注入することにより正所モデルを開発した。正所ＣａＰａｎ１腫瘍は、腹水が貯留し、１０〜１４週間で死に至るまでは明らかな徴候なく次第に成長した。移植後３〜４週間で、動物は触知可能な約０．２ｇの腫瘍を発達させた。成長８週間以内に約１．２ｇの一次腫瘍が、肝臓および脾臓への転移を伴って見られた（転移腫瘍１〜３個／動物；各腫瘍＜０．１ｇ）。１０〜１４週間で腹水の貯留を伴う横隔膜のシーディング(seeding)が明らかになった。通常、腹水の形成および副次的な黄疸が腫瘍成長の最初の明らかな徴候であった。腹水は腹腔内における体液の蓄積であり、黄疸は血中の過剰な胆汁色素による皮膚および眼の黄化である。この時点で腫瘍は１〜２ｇとかなり大きくなり、動物は死に至るまで長くて３〜４週間でしかなかった。
４週齢の正所腫瘍（約０．２ｇ）を担持する動物に投与した腫瘍放射性標識１３１Ｉ−ＰＡＭ４は、１日目に７．９±３．０の局在インデックス(localization indice)で一次腫瘍への特異的ターゲッティングを示し、１４日目には２２．８±１５．３に高まった。タンパク質の組織への特異的ターゲッティングの形跡は見られなかった。肝臓および脾臓への腫瘍転移が見られた場合には、両転移ともターゲッティングされ、高い濃度の放射性標識抗体を有した。さらに、約半分の動物が切開部位に皮下腫瘍を発症した。同じ動物の正所および皮下腫瘍のターゲッティングにおいて有意な差はなく、動物が付加的な腫瘍を持つ持たないにかかわらず、正所腫瘍のターゲッティングにおいて有意な差はなかった。見積もられたＰＡＭ４から一次腫瘍および血液への線量はそれぞれ６，７０４および１，６５５ｃＧｙ／ｍＣｉであった。
実施例４ 循環腫瘍抗原の定量のための酵素免疫アッセイの開発
発明者らは、ウサギポリクローナル抗膵臓ムチン由来非標識精製ＩｇＧとともにＰＡＭ４をキャプチャー試薬として用い、次いで検出試薬としてペルオキシダーゼ標識ロバ抗ウサギＩｇＧを用いる酵素免疫アッセイを開発した。このアッセイの使用から次のような結果が得られた。
アッセイによって検出された抗原の範囲内で、得られた変動係数値は１０％に満たなかった。２５の健常個体からの血清を調べたところ、平均±Ｓ．Ｄ．は４．０±３．１単位であった。次に、陽性応答の限界値を平均＋２Ｓ．Ｄ．＝１０．２単位に設定した。全３７人の膵臓癌患者のうち３２人、すなわち８６％がこのアッセイで陽性であり、１３人の膵炎患者では３人だけが陽性であった。ＰＡＭ４抗原は直腸結腸癌患者の５５％（１８／３３）で上昇したが、この数字は免疫組織化学によりＰＡＭ４と反応性のある結腸直腸癌検体の４０％とだいたい同じである。他の癌では、１６人の卵巣癌患者のうち４人、２０人の乳癌患者のうち５人でＰＡＭ４抗原陽性であり、彼らは総て疾病の進展を示した。また、下記の表５で示されるように、膵臓癌の中央値（８４．５単位）は、これらの症例の圧倒的多数が後期で大きな腫瘍負荷を有していたとしても、他の総ての癌の群（胆管癌を除く）よりも１０倍高いオーダーであった。
Figure 0005139626
これらの知見に加え、管理におけるこのＰＡＭ４アッセイの使用の可能性を検討するため、同所モデルで予備試験を行った。同所ＣａＰａｎ１腫瘍（腫瘍重０．１５ｇと推定）の移植後２週間の時点で、血中に検出可能な抗原を有していた動物はいなかった。４週間の時点（腫瘍重は０．２ｇと推定）では、５個体のうち１個体で検出可能なレベルの抗原（７２単位）を示し、６週間の時点（腫瘍重０．４ｇと推定）では、５個体のうち４個体で定量可能な抗原（範囲は９８〜６０８０単位）を有していた。血清が運ぶ抗原が検出できる最初の時点の決定という点での重大な制限因子は得られる血液の量が限られていることであったが、繰り返し採血できた。その後、血清はアッセイ前に１：１０希釈した。
実施例５ 膵臓癌の試験的放射免疫療法
治療用１３１Ｉ−ＰＡＭ４の使用に関する最初の試験は、無胸腺マウスで皮下異種移植片として成長させたＣａＰａｎ１腫瘍を用いて行った。同等量の非特異的Ａｇ８の治療効果とも比較する試験において、０．２５ｇの腫瘍を担持する動物に３５０μＣｉの１３１Ｉ−ＰＡＭ４を投与した。１ｃｍ３の腫瘍を担持する動物への１３１Ｉ−ＰＡＭ４の投与のＭＴＤは７００μＣｉである。５週間目よ６週間目で、ＰＡＭ４処置した動物は劇的な腫瘍退縮を示し、２７週間でも８個体のうち５個体で腫瘍のないままであった。無処置ならびにＡｇ８処置動物は、腫瘍成長の急速な進行を示し、この二つの対照群の間で有意な差は見られなかった。７週間で、無処置群の腫瘍は最初の時点の２０．０±１４．６倍成長したが、１３１Ｉ−Ａｇ８処置腫瘍は４．９±１．８倍しか成長しなかった。この時点で、ＰＡＭ４腫瘍はもとの大きさの０．１±０．１倍に退縮し、無処置（ｐ＜０．００１）および非特異的Ａｇ８処置（ｐ＜０．０１）動物の双方の間に有意差があった。
ＣａＰａｎ１腫瘍は１３１Ｉ−ＰＡＭ４処置に感受性があったが、結果、すなわち、腫瘍の退縮または進行は最初の腫瘍の大きさをはじめとする多くの因子に依存する。従って、０．２５ｇ、０．５ｇ、ｌ．０ｇ、または２．０ｇのＣａＰａｎ１腫瘍負荷を有する動物群を一回量の３５０μＣｉ １３１Ｉ−ＰＡＭ４で処置した。最初の腫瘍の大きさが０．２５ｇおよび０．５ｇの動物の大多数（各群１０個体のうち９個体）は少なくとも処置６週間後に腫瘍退縮または成長阻害を示した。１．０ｇ腫瘍群では、７個体のうち５個体で６週間の間、腫瘍成長がなく、２．０ｇ腫瘍群では、９個体のうち６個体で６週間の間、腫瘍成長がなく、その後、進行した。３５０μＣｉ一回では翁腫瘍には効果がなく、一回投与はあまり適切な投与計画とは言えないが、毒性試験は放射免疫療法を複数回行うことができることを示している。平均１．０ｇのＣａＰａｎ１腫瘍を担持する動物に、３５０μＣｉ １３１Ｉ−ＰＡＭ４を一回か二回、０時点と４週間目に施与するか、無処置とした。無処置群の平均生存期間は３．７＋／−１．０週間であった（生存とは腫瘍が５ｃｍ３に達する時間と定義）。動物は３週間といった早期に死に至り、６週間を過ぎて生き残った動物はいなかった。３５０μＣｉ １３１Ｉ−ＰＡＭ４の一回投与により、生存期間は１８．８＋／−４．２週間まで有意に延長された（ｐ＜０．０００１）。動物の死亡の範囲は３週間から２５週間まで延長された。２６週間の試験期間の終了時に生存していた動物はいなかった。
一回投与群に比べて二回投与群では生存期間の有意な延長が見られた。動物の半数が、腫瘍の大きさ１．０〜２．８ｃｍ３で、２６週間の時点で生存しており、平均腫瘍成長率は最初の腫瘍サイズのは１．６＋／−０．７倍であった。２６週間目に生存していなかった動物については、平均生存期間（１７．７＋／−５．３週間）は一回投与群と同程度であった。
ＰＡＭ４による治療試験では正所腫瘍モデルも用いた。４週齢の正所腫瘍（腫瘍重０．２５ｇと推定）を担持する動物群を無処置のままか、３５０μＣｉ １３１Ｉ−ＰＡＭ４または３５０μＣｉの１３１Ｉ−非特異的Ａｇ８の一回投与で処置した。無処置動物は１０週までに死亡率５０％を示し、１５週間目に生存しているものはいなかった。腫瘍成長４週間目に非特異的１３１Ｉ−Ａｇ８を投与した動物は７週間で死亡率５０％を示し、１４週間目に生存しているものはいなかった。この二群の間に統計学的（ログランク解析）に有意な差はなかったが、Ａｇ８処置動物の約半数で放射線毒性が起こった可能性がある。しかし、放射性標識ＰＡＭ４は、無処置またはＡｇ８処置動物と比べた場合に有意な生存利益をもたらし（ｐ＜０．００１）、試験の終了時６週間の時点で生存率７０％であった。この時点で生存していた動物を屠殺し、腫瘍の大きさを測定した。動物は平均重１．２ｇの腫瘍を有しており、また、７個体のうち４個体で１または２箇所の小さな（＜０．１ｇ）転移の形跡があった。成長６週間の時点で、これらの腫瘍は８週齢の腫瘍に典型的なものであった。
実施例６ 理学的ジェムザール(Gemzar)化学療法と １３１ Ｉ−ＰＡＭ４の組み合わせ
ゲムシタビン（ジェムザール）と１３１Ｉ−ＰＡＭ４放射免疫療法の併用の最初の試験はチェッカーボードアレイとして行い、ジェムザール一回量（０、１００、２００、５００ｍｇ／ｋｇ）に対して１３１Ｉ−ＰＡＭ４一回量（［ＭＴＤ＝７００μＣｉ］ＭＴＤの１００％、７５％、５０％、０％）とした。組み合わせのＭＴＤは５００ｍｇ／ｋｇジェムザールと３５０μＣｉ １３１Ｉ−ＰＡＭ４（５０％ＭＴＤ）であることが分かった。毒性は、最大値を無毒として体重減少により測定するが、体重の２０％の減少とする。組み合わせ処置プロトコールはジェムザール単独よりも有意に効果が高かったが、放射免疫療法単独より効果が高いいとは言えなかった。次の試験は、真の相乗的治療効果が見られるかどうかを調べるため、低容量のジェムザールと放射免疫療法で行った。約１ｃｍ３（体重の約５％）の腫瘍を担持する動物に、０、３、６、９および１２日目にジェムザール１００ｍｇ／ｋｇを投与し、０日目に１００μＣｉの１３１Ｉ−ＰＡＭ４を施与した。治療効果が見られ、統計学的に有意（ｐ＜０．０００１）な退縮（５個のうち２個の腫瘍が０．１ｃｍ３未満）および／またはジェムザール単独と比べて腫瘍の成長阻害を伴っていた。さらに注目すべきは、体重の点で、毒性が見られなかったことである。この組み合わせ処置プロトコールは、必要であれば、上記の放射免疫療法単独試験で行ったように、４週目に二回目の処置をはじめ、複数回施与することができる。
実施例７ ヒト化ＰＡＭ４ ＭＡｂ
本発明の好ましい態様は、膵臓癌ムチンから惹起されたマウスＰＡＭ４のヒト化ＩｇＧであるモノクローナルＭＡｂ ｈＰＡＭ４を用いる。マウスＰＡＭ４配列のヒト化は、患者が受けるヒト抗マウス抗体応答を軽減するために用いる。ヒトＰＡＭ４を生産するため、マウス免疫グロブリンのの重鎖および軽鎖可変鎖（Ｖ）からマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒトＶドメインへ移した後、フレームワーク領域のいくつかのヒト残基をマウスの対応物で置換する。本発明のヒト化モノクローナル抗体はin vitroおよびin vivo診断および治療法で用いるのに好適である。
マウスＰＡＭ４ ＭＡｂの可変（Ｖ）領域フレームワーク（ＦＲ）配列（図１Ａおよび１Ｂ）とＫａｂａｔデータベースに登録されているヒト抗体とを比較すると、ＰＡＭ４ ＶＫおよびＶＨのＦＲがそれぞれヒト抗体Ｗａｌｋｅｒ ＶＫおよびＷｉｌ２ ＶＨと最も高い程度の配列ホモロジーを示すことが示された。従って、このＷａｌｋｅｒＶＫおよびＷｉｌ２ ＶＨ ＦＲをヒトフレームワークとして選択し、これにＰＡＭ４ＶＫおよびＶＨのマウスＣＤＲをそれぞれグラフトした（図３）。しかし、ＰＡＭ４重鎖のヒト化のためのＷｉｌ２ ＦＲ４配列を置換するためには、ヒト抗体ＮＥＷＭのＦＲ４配列を用いた（図３Ｂ）。推定ＣＤＲをフランキングするＰＡＭ４ ＦＲの数個のアミノ酸残基はＦＲ残基以外のＡｇ結合により大きな影響を持つとの考慮に基づき、これらの残基はｈＰＭＡ４では維持した。これらの残基はＶＫの２１Ｍ、４７Ｗ、５９Ｐ、６０Ａ、８５Ｓ、８７Ｆおよび１００Ｇ、ならびにＶＨの２７Ｙ、３０Ｐ、３８Ｋ、４８Ｉ、６６Ｋ、６７Ａおよび６９Ｌである。ｈＰＡＭ４ ＶＫおよびＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列はそれぞれ図３Ａおよび３Ｂに示されている。
Leung et al. (Leung et al., 1994))が記載しているような改良法を用い、図４に示されているような長いオリゴヌクレオチド合成とＰＣＲの組み合わせを用い、ｈＰＡＭ４のデザインされたＶＫおよびＶＨ遺伝子を構築した。ｈＰＡＭ４ ＶＨドメインの構築に関してた、二つの長いオリゴヌクレオチドｈＰＡＭ４ＶＨＡ（１７３−マー）およびｈＰＡＭ４ＶＨＢ（１７３−マー）を自動ＤＮＡ合成装置(Applied Biosystem)で合成した。
ｈＰＡＭ４ＶＨＡはｈＰＡＭ４ ＶＨドメインのｎｔ１７〜１８９に相当する。
Figure 0005139626
ｈＰＡＭ４ＶＨＢはｎｔ１６９〜３４１に相補的なｈＰＡＭ４ ＶＨドメインの開始部を除いたものに相当する。
Figure 0005139626
ｈＰＡＭ４ＶＨＡとＶＨＢの３’末端配列（２１ｎｔ残基）は互いに相補的である。所定のＰＣＲ条件下で、ｈＰＡＭ４ＶＨＡとＶＨＢの３’末端をアニーリングして、長いオリゴヌクレオチドの残りの部分によりフランキングされた短い二本鎖ＤＮＡを形成する。各アニール末端は一本鎖ＤＮＡの転写のためのプライマーとして働き、ｈＰＡＭ４ ＶＨのｎｔ１７〜３４１からなる二本鎖ＤＮＡが生じる。このＤＮＡを、二種類の短いオリゴヌクレオチドｈＰＡＭ４ＶＨＢＡＣＫおよびｈＰＡＭ４ＶＨＦＯＲの存在下でさらに増幅し、全長ｈＰＡＭ４ ＶＨを形成させた。下線部は図４Ｂで示されるようなサブクローニングのための制限部位である。
Figure 0005139626
１０μＬの１０×ＰＣＲバッファー（５００ｍＭ ＫＣＬ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ．ＨＣＬバッファー，ｐＨ８．３、１５ｍＭ ＭｇＣｌ２）、２μｍｏｌのｈＰＡＭ４ＶＨＢＡＣＫおよびｈＰＡＭ４ＶＫＦＯＲ、ならびに２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT)の存在下で最少量のｈＰＡＭ４ＶＨＡおよびＶＨＢ（経験的に決定）を増幅した。この反応混合物に対して、９４℃で１分の変性、４５℃で１分のアニーリングおよび７２℃で１．５分の重合からなる３サイクルのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。この手順に続いて、９４℃で１分の変性、５５℃で１分のアニーリングおよび７２℃で１分の重合からなる２７サイクルのＰＣＲ反応を行った。ｈＰＡＭ４ ＶＨの二本鎖ＰＣＲ増幅産物をゲル精製し、ＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩ制限部位で制限消化し、重鎖足場ベクターＶＨｐＢＳ２（ここでＶＨ配列は、５’末端にフレーム内連結された転写開始コドンと分泌シグナルペプチドを、そして３’末端にイントロン配列をコードするＤＮＡ配列を用いて完全に構築されている）の相補的ＰｓｔＩ／ＢｓｔＥＩＩ制限部位にクローニングした。ＶＨｐＢＳ２はＶＨｐＢＳ(Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994))の改良型足場ベクターであり、次のサブクローニング工程を容易にするため、転写開始コドンの１６塩基上流にＸｈｏＩ制限部位を導入したものである。構築したＶＨ遺伝子を発現ベクターｐｄＨＬ２（ＩｇＨエンハンサーおよびＭＴ１プロモーターの制御下にヒトＩｇＧ重鎖および軽鎖双方のための発現カセット、ならびに選択および増幅のためのマーカーとしてｄｈｆｒ遺伝子を含む）にＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ制限断片としてサブクローニングした（図４Ｂ）。ｐｄＨＬ２の重鎖領域はＢａｍＨＩ制限部位を欠いているので、この連結には可変鎖のＢａｍＨＩ部位とｐｄＨＬ２ベクターに存在するＨｉｎｄＩＩＩ部位との間を架橋するためのリンカーの使用が必要である。得られた発現ベクターはｈＰＡＭ４ＶＨｐｄＨＬ２と称した。
ヒト化ＶＫ配列の全長ＤＮＡを構築するため、ｈＰＡＭ４ＶＫＡ（１５７−マー）およびｈＰＡＭ４ＶＫＢ（１５６−マー）を上記のように合成した。ｈＰＡＭ４ＶＫＡおよびＶＫＢを上記のような二種類の短いオリゴヌクレオチドｈＰＡＭ４ＶＫＢＡＣＫおよびｈＰＡＭ４ＶＫＦＯＲにより増幅した。
ｈＰＡＭ４ＶＫＡはｈＰＡＭ４ＶＫドメインのｎｔ１６〜１７２に相当する。
Figure 0005139626
ｈＰＡＭ４ＶＫＢはｎｔ１５３〜３０８に相当するｈＰＡＭ４ＶＫドメインの開始部を除いたものに相当する。
Figure 0005139626
ｈＰＡＭ４ＶＫＡとＶＫＢの３’末端配列（２０ｎｔ残基）は互いに相補的である。所定のＰＣＲ条件下で、ｈＰＡＭ４ＶＫＡとＶＫＢの３’末端をアニーリングして、長いオリゴヌクレオチドの残りの部分によりフランキングされた短い二本鎖ＤＮＡを形成する。各アニール末端は一本鎖ＤＮＡの転写のためのプライマーとして働き、ｈＰＡＭ４ ＶＫのｎｔ１６〜３０８からなる二本鎖ＤＮＡが生じる。このＤＮＡを、二種類の短いオリゴヌクレオチドｈＰＡＭ４ＶＫＢＡＣＫおよびｈＰＡＭ４ＶＫＦＯＲの存在下でさらに増幅し、全長ｈＰＡＭ４ ＶＫを形成させた。下線部は下記に示されるようなサブクローニングのための制限部位である。
Figure 0005139626
ｈＰＡＭ４ ＶＫのゲル精製したＰＣＲをＰｖｕＩＩおよびＢｇｌＩＩで制限消化し、軽鎖足場ベクターＶＫｐＢＲ２の相補的ＰｖｕＩＩ／ＢｃｌＩＩ部位にクローニングした。ＶＫｐＢＲ２はＶＫｐＢＲ(Leung et al., Hybridoma, 13:469 (1994))の改良型足場ベクターであり、転写開始コドンの１６塩基上流にＸｂａＩ制限部位を導入したものである。構築されたＶＫ遺伝子を、ＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ制限断片として、ＶＨ配列を含む発現ベクターｈＰＡＭ４ＶＨｐｄＨＬ２にサブクローニングした。得られた発現ベクターはｈＰＡＭ４ｐｄＨＬ２と称した。
約３０μｇのｈＰＡＭ４ｐｄＨＬ２をＳａｌＩで消化することで線状化し、４５０Ｖおよび２５μＦでのエレクトポレーションによってＳｐ２／０−Ａｇ１４細胞へトランスフェクトした。トランスフェクト細胞を９６ウェルプレートにプレーティングし、ＣＯ２細胞培養インキュベーターにて２日間インキュベートし、その後、ＭＴＸ耐性に関して選択した。２〜３週間で選択に生残したコロニーが出現し、ＥＬＩＳＡアッセイにより、ヒト抗体の分泌に関してスクリーニングした。要するに、生存コロニーからの上清（〜１００μｌ）を、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）２フラグメント特異的ＡｂをプレコートしたＥＬＩＳＡマイクロプレートのウェルに加えた。このプレートを室温で１時間インキュベートした。結合していないタンパク質を洗浄バッファー（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄することにより除去した。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＦＣフラグメント特異的Ａｂをウェルに加えた。１時間インキュベートした後、ＰＢＳ中、４ｍＭのｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリド（ＯＰＤ）および０．０４％のＨ２Ｏ２を含有する基質溶液（１００μＬ／ウェル）を洗浄後のウェルに加えた。３０分間暗所で発色させ、５０μｌの４Ｎ Ｈ２ＳＯ４溶液を加えることで反応を停止した。結合したヒトＩｇＧは、ＥＬＩＳＡリーダーにて４９０ｎｍでの吸光度を読みとることで測定した。陽性細胞クローンを増殖させ、タンパク質Ａカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより細胞培養上清からｈＰＡＭ４を精製した。
ｈＰＡＭ４のＡｇ結合活性を、膵臓癌細胞抽出物でコートしたマイクロタイターブレートにおけるＥＬＩＳＡアッセイにより確認した。マウスＶおよびヒトＣドメインからなるキメラＰＡＭ４との比較においてｈＰＡＭ４のＡｇ結合親和性を評価するため、ＰＡＭ４抗原コートプレートを用いるＥＬＩＳＡ競合結合アッセイを開発した。一定量のＨＲＰ結合ｃＰＡＭ４に種々の濃度のｃＰＡＭ４またはｈＰＡＭ４を加えたものをコートウェルに加え、室温で１〜２時間インキュベートした。ＣａＰａｎ１ Ａｇに結合したＨＲＰ−結合ｃＰＡＭ４の量は、４ｍＭのｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロリドおよび０．０４％のＨ２Ｏ２を含有する基質溶液を添加した後、４９０ｎｍでの吸光度を読みとることにより明らかにした。図４の競合結合アッセイによって示されるように、ｈＰＡＭ４およびｃＰＡＭ４抗体は同等の結合活性を示した。
好適な宿主細胞としては微生物または哺乳類宿主細胞が挙げられる。好ましい宿主細胞系統としては、ＭＡｂおよびその他の融合タンパク質の生産のために開発されたＰＥＲ．Ｃ６がある。よって、本発明の好ましく態様は、ＰＡＭ４ ＭＡｂ、複合体、融合タンパク質またはそのフラグメントをコードするＤＮＡ配列を含んでなる宿主細胞である。ＰＥＲ．Ｃ６細胞（ＷＯ９７／００３２６）は、ヒトホスホグリセンリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターの制御下にＡｄ血清型５（Ａｄ５） Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂコード配列（Ａｄ５ヌクレオチド４５９〜３５１０）を含んだプラスミドを用いた、ヒト胎児一次網膜細胞のトランスフェクションにより作出されたものである。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂはそれぞれアデノウイルス初期遺伝子活性化タンパク質１Ａおよび１Ｂである。これらの方法および組成物は、例えばグリコシル化により翻訳後修飾される、目的のヒト組換えタンパク質の安定発現を生じるのに特に有用である。ＰＥＲ．Ｃ６は完全に同定されたヒト細胞系統であること、また、医薬品安全性試験実施基準(good laboratory practices)に適合するように開発されたものであるなど、いくつかの特徴から、ＰＥＲ．Ｃ６は組換えタンパク質生産のための宿主に特に有用なものである。さらに、ＰＥＲ．Ｃ６はヒトまたは動物由来タンパク質を含まない規定の血清フリー培地で懸濁培養として増殖させることができ、その増殖は回転瓶、シェーカーフラスコ、スピンフラスコおよびバイオリアクターに適合し、約３５時間で倍加する。最後に、Ｅ１Ａの存在は、ＣＭＶエンハンサー／プロモーターの制御下にある遺伝子の発現のアップレギュレーションを引き起こし、Ｅ１Ｂの存在は組換えトランスジーンの過剰発現によって促進される可能性のあるｐ５３依存性アポトーシスを阻害する。一つの態様では、この細胞は通常の哺乳類細胞系統よりも２〜２００倍高い組換えタンパク質および／またはタンパク質性基質を産生することができる。別の好ましい細胞として、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４がある。
実施例８ 手術不能膵臓癌腫を有する患者の治療
広範な手術不能膵臓腺癌、実質的な体重減少（３０ポンドを超える）、嗜眠および虚弱を伴う５６歳の男性に９０Ｙ−ＰＡＭ４放射性標識ヒト化抗体を３０ｍＣｉの９０−Ｙの用量で、および５０ｍｇの抗体タンパク質を２時間静脈点滴で投与した。５日後、次に患者にゲムシタビン化学療法の標準的なコースを施与した。数ヶ月後、療法による副作用の形跡がなければ、この治療計画を繰り返す。追跡検査中、数ヶ月後、患者は活動的になり、体重減少も遅くなるものと推測された。膵臓のＣＴスキャンは、安定疾病または腫瘍塊の若干の減少を示唆するものと思われた。数ヶ月後に検査を繰り返すと、コンピューター断層撮影法により、腫瘍重の実質的減少を示すはずであり、従って、患者に対し、膵臓腫瘍塊の切除を考慮し得る。
実施例９ 二重特異的ＰＡＭ４×７３４および ９９ｍ Ｔｃまたは １１１ Ｉｎ標識ペプチドハプテンによるプレターゲッティング
プレターゲッティングアプローチを用いた膵臓癌のイメージングに関して、発明者らは、キメラＰＡＭ４（ｃＰＡＭ４）Ｆａｂ’およびマウス７３４（ｍ７３４）Ｆａｂ’からなる二重特異性Ｆ（ａｂ’）２抗体（ｂｓＭＡｂ）を調製した。ｍ７３４抗体はＩｎ−ＤＴＰＡ複合体を認識する。このｂｓＭＡｂを１２５Ｉで標識し、ヒト膵臓癌異種移植片（ＣａＰａｎ１）を担持する無胸腺ヌードマウスに注射した（７μＣｉ；１５μｇ）。キメラリツキシマブ（抗ＣＤ２０モノクローナル抗体）およびｍ７３４から作製した非ターゲッティングＦ（ａｂ’）２抗体ｂｓＭＡｂを１３１Ｉで標識し、対照として同時注射した。種々の時点（注射後４、２４、３６、４８および７２時間後）でマウスを解剖し、組織を摘出し、計数してグラム当たりの注入量％（％ＩＤ／ｇ）を求めた。対照ｂｓリツキシマブに比べて、各時点でのｂｓＰＡＭ４の腫瘍取り込み量は有意に高かった（ｐ＜０．０３２より良好）。このタイプのプレターゲッティング系を用いた発明者らのこれまでの実験から、良好な腫瘍：非腫瘍比を得るには１％ＩＤ／ｇ未満の血液レベルが必要であることが示唆された。ｂｓＰＡＭ４の投与後３６時間では、血中１．１０±０．４０％ＩＤ／ｇであったが、注射後４８時間では０．５６±０．０８％ＩＤ／ｇまで下がった。これら二つの時点での腫瘍取り込みはそれぞれ６．４３±１．５０％ＩＤ／ｇおよび５．３７±２．３８％ＩＤ／ｇであった。これらの値は、３６時間および４８時間の時点でそれぞれ腫瘍中０．６５±０．３３％ＩＤ／ｇおよび０．４７±０．１９％ＩＤ／ｇ（ｐ＜０．０１８およびｐ＜０．００９８）であった対照ｂｓリツキシマブよりも有意に高かった。しかし、血液クリアランス速度はまさに同等で、有意な差はなかった。
これらのデータに基づき、放射性標識ペプチド−ハプテンをｂｓＭＡｂの投与後４０時間目に投与したＣａＰａｎ１腫瘍担持マウスでプレターゲッティング実験を行った。二種類のペプチドＩＭＰ−１９２およびＩＭＰ−１５６を用い、各々は７３４ＭＡｂによる認識のための二価ＤＴＰＡを含有するが、一方は、９９ｍＴｃ安定結合のために特異的な付加的な基を含まない（ＩＭＰ−１９２）。腫瘍担持マウス（腫瘍体積〜０．３０ｃｍ３）に１２５Ｉ−ｂｓＰＡＭ４（６μＣｉ；１５μｇ）を投与し、４０時間後に放射性標識ペプチド−ハプテン（３４．５μＣｉ；１．５×１０−１１モル；ｂｓＭＡｂ：ペプチド＝１０：１）を投与した。一方のマウス群に９９ｍＴｃ標識ＩＭＰ１９２を投与し、もう一方のマウス群には１１１Ｉｎ標識ＩＭＰ１５６を投与した。非特異的ターゲッティングの対照としては、放射性標識ペプチドの投与前に１２５Ｉ−ｂｓリツキシマブを投与した二群、および１１１Ｉｎまたは９９ｍＴｃ標識ペプチド単独を投与した別の二群を含んだ。
ペプチドを投与した後、２時間および２４時間でマウスを屠殺し、腫瘍および種々の組織について％ＩＤ／ｇを求めた。発明者らのこれまでの知見と一致して、非ターゲッティング対照ｂｓリツキシマブに比べて腫瘍におけるｂｓＰＡＭ４は有意に高く、それぞれ８．２±３．４％および０．３±０．０８％ＩＤ／ｇ（ｐ＜０．０００１）であった。このことから、１１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６（２０．２±５．５％ＩＤ／ｇ対０．９±０．１％ＩＤ／ｇ、ｐ＜０．０００１）という有意に高い腫瘍取り込みであることが解釈される。ｂｓＰＡＭ４でプレターゲッティングされたマウスにおける９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２の腫瘍取り込みも、ｂｓリツキシマブでプレターゲッティングされたもの（１６．８±４．８％ＩＤ／ｇ対１．１±０．２％ＩＤ／ｇ、ｐ＜０．０００５）よりも有意に高かった。単独で用いた場合の各ペプチドの腫瘍取り込みは、ｂｓＰＡＭ４を投与したマウスの場合よりも有意に低かった（それぞれ、９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２および１１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６に関して０．２±０．０５％ＩＤ／ｇおよび０．１±０．０３％ＩＤ／ｇ、ｐ＜０．０００４およびｐ＜０．０００１）。
３時間の時点と同様、ペプチド注射後２４時間（ｂｓＭＡｂ投与から６４時間後）での腫瘍中のｂｓＰＡＭ４は、ｂｓリツキシマブよりも有意に高かった（それぞれ６．４±２．２％ＩＤ／ｇ対０．２±０．０９％ＩＤ／ｇ；ｐ＜０．０００１）。この時点で、ｂｓＰＡＭ４でプレターゲッティングされたマウスの腫瘍では１１．１±３．５％ＩＤ／ｇ １１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６および１２．９±４．２％ＩＤ／ｇ ９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２に対して、ｂｓＲＩＴでプレターゲッティングされた腫瘍では０．５±０．２％ＩＤ／ｇおよび０．４±０．０３％ＩＤ／ｇであった（それぞれｐ＜０．０００８およびｐ＜０．０００２）。ペプチド単独を投与したマウスでは、ｂｓＰＡＭ４プレターゲッティングペプチドの場合と比べ、腫瘍における９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２（０．０６±０．０２％ＩＤ／ｇ、ｐ＜０．０００７）および１１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６（０．０９±０．０２％ＩＤ／ｇ、ｐ＜０．０００２）は有意に低かった。
Figure 0005139626
上記の表はこれらの群について、放射性標識産物の投与後の初期の各時点における種々の組織の腫瘍：非腫瘍比（Ｔ：ＮＴ）を示している。ｂｓＰＡＭ４×ｍ７３４Ｆ（ａｂ’）２の投与後４時間において、腫瘍：血液比は２：１より小さかったことに着目することが重要である。しかし、投与後３時間では、プレターゲッティング１１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６および９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２は、調べた総ての組織に関して有意に高い腫瘍：非腫瘍比を示し、特に腫瘍：血液比は３６：１および９：１に相当した（それぞれｐ＜０．００１およびｐ＜０．０１１）。発明者らが２４時間時点の腫瘍：血液比を調べたところ、１２５Ｉ−ｂｓＰＡＭ４単独では４：１であるのに対し、プレターゲッティング１１１Ｉｎ−ＩＭＰ１５６および９９ｍＴｃ−ＩＭＰ１９２はそれぞれ２７４：１および８０：１と、有意に高い値を示した（ｐ＜０．０００２）。これらのデータは、このプレターゲッティングｂｓＰＡＭ４アプローチが、非腫瘍組織には最小の線量で腫瘍へ高い線量を送達する、半減期の短い高エネルギー放射性同位元素とともに使用できることを強く示唆するものである。
当業者には、本発明の生成物、組成物、方法および方法に対して種々の改変および変更をなし得ることが自明である。よって、本発明は、それらが付属の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内にある限り、このような改変および変更を含むものとする。
上記で挙げた総ての刊行物、特許、および特許出願の開示は、その各々が個々に引用することにより本明細書の一部とされるのと同等に、引用することによりその全開示内容が明らかに本明細書の一部とされる。
マウスＰＡＭ４のクローニングされたＶ遺伝子および推定アミノ酸配列を示す。図１ＡはＰＡＭ４ ＶｋのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図１ＢはＰＡＭ４ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列はヌクレオチド配列の下に一文字コードで示されている。ヌクレオチド配列のナンバリングは右側にある。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。アミノ酸残基の上にナンバリングすることで示しているように、アミノ酸残基にはＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。文字によりナンバリングされているアミノ酸残基はＫａｂａｔナンバリング法で定義された挿入残基である。これらの挿入残基はそれまでの残基と同じ進数を有する。例えば、図１Ｂの残基８２、８２Ａ、８２Ｂおよび８２Ｃは、それぞれ８２、Ａ、ＢおよびＣとして示される。 マウスＰＡＭ４のクローニングされたＶ遺伝子および推定アミノ酸配列を示す。図１ＡはＰＡＭ４ ＶｋのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図１ＢはＰＡＭ４ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。対応するＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列はヌクレオチド配列の下に一文字コードで示されている。ヌクレオチド配列のナンバリングは右側にある。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。アミノ酸残基の上にナンバリングすることで示しているように、アミノ酸残基にはＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。文字によりナンバリングされているアミノ酸残基はＫａｂａｔナンバリング法で定義された挿入残基である。これらの挿入残基はそれまでの残基と同じ進数を有する。例えば、図１Ｂの残基８２、８２Ａ、８２Ｂおよび８２Ｃは、それぞれ８２、Ａ、ＢおよびＣとして示される。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたキメラＰＡＭ４（ｃＰＡＭ４）重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。図２ＡはｃＰＡＭ４Ｖｋのアミノ酸配列を示す。図２ＢはｃＰＡＭ４ＶＨのアミノ酸配列を示す。これらの配列は一文字コードで示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。アミノ酸のナンバリングについては図１の場合と同様である。 ヒト抗体、ＰＡＭ４およびｈＰＡＭ４の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。図３Ａはヒト抗体ＷａｌｋｅｒのＶＫアミノ酸配列アライメントをＰＡＭ４およびｈＰＡＭ４とともに示し、図３Ｂはヒト抗体Ｗｉｌ２（ＦＲ１−３）およびＮＥＷＭ（ＦＲ４）のＶＨアミノ酸配列アライメントをＰＡＭ４およびｈＰＡＭ４とともに示す。ドットは対応するヒト抗体の残基と同じＰＡＭ４の残基を示す。囲んだ領域はＣＤＲ領域を示す。ｈＰＡＭ４のＮ末端およびＣ末端残基（下線）は双方とも用いた足場ベクターにより固定されている。図１同様、残基のナンバリングにはＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。 ヒト抗体、ＰＡＭ４およびｈＰＡＭ４の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列のアライメントを示す。図３Ａはヒト抗体ＷａｌｋｅｒのＶＫアミノ酸配列アライメントをＰＡＭ４およびｈＰＡＭ４とともに示し、図３Ｂはヒト抗体Ｗｉｌ２（ＦＲ１−３）およびＮＥＷＭ（ＦＲ４）のＶＨアミノ酸配列アライメントをＰＡＭ４およびｈＰＡＭ４とともに示す。ドットは対応するヒト抗体の残基と同じＰＡＭ４の残基を示す。囲んだ領域はＣＤＲ領域を示す。ｈＰＡＭ４のＮ末端およびＣ末端残基（下線）は双方とも用いた足場ベクターにより固定されている。図１同様、残基のナンバリングにはＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたヒト化ＰＡＭ４（ｈＰＡＭ４）重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図４ＡはｈＰＡＭ４ＶＫのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示し、図４ＢはｈＰＡＭ４ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。ヌクレオチド配列のナンバリングは右側にある。対応するＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列は一文字コードとして示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。図１Ａおよび図１Ｂ同様、アミノ酸残基にはＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。 Ｓｐ２／０細胞で発現されたヒト化ＰＡＭ４（ｈＰＡＭ４）重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。図４ＡはｈＰＡＭ４ＶＫのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示し、図４ＢはｈＰＡＭ４ＶＨのＤＮＡおよびアミノ酸配列を示す。ヌクレオチド配列のナンバリングは右側にある。対応するＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列は一文字コードとして示されている。ＣＤＲ領域のアミノ酸残基は太字と下線で示されている。図１Ａおよび図１Ｂ同様、アミノ酸残基にはＫａｂａｔのＩｇ分子ナンバリング法を用いている。 キメラＰＡＭ４、ｃＰＡＭ４と比較した場合の、ヒト化ＰＡＭ４抗体、ｈＰＡＭ４の結合活性を示す。ｈＰＡＭ４は菱形で示され、ｃＰＡＭ４は黒丸で示されている。結果は、ＣａＰａｎ１ Ａｇへの１２５Ｉ−ｃＰＡＭ４結合と競合する場合、ｈＰＡＭ４抗体およびｃＰＡＭ４の結合活性が匹敵するものであることを示す。キメラ抗体は、ある種に由来する抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含みながら、抗体領域の定常領域はヒト抗体に由来する組換えタンパク質である。

Claims (29)

  1. 配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むヒト化抗体またはそのフラグメント。
  2. 請求項１に記載のヒト化抗体またはそのフラグメントを含んでなる抗体成分を含んでなり、該抗体成分が少なくとも一種の診断薬および／または治療薬に結合されている、癌細胞をターゲッティングする診断または治療複合体。
  3. 診断／検出薬が、放射性核種、造影剤、および光活性診断／検出薬からなる群から選択される、請求項２に記載の診断複合体。
  4. 診断／検出薬が放射性核種である、請求項３に記載の診断複合体。
  5. 診断／検出薬が放射線造影剤である、請求項３に記載の診断複合体。
  6. 造影剤が常磁性イオンまたは超音波増強剤である、請求項５に記載の診断複合体。
  7. 造影剤が、ヨウ素化合物、バリウム化合物、ガリウム化合物およびタリウム化合物からなる群から選択される放射線不透過性物質である、請求項５に記載の診断複合体。
  8. 複合体が手術中腫瘍診断、内視鏡的腫瘍診断、または血管内腫瘍診断に用いられる、請求項３に記載の診断複合体。
  9. 治療薬が、放射性核種、免疫調節剤、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、オリゴヌクレオチド、酵素、酵素阻害剤、光活性治療薬、細胞傷害剤、脈管形成阻害剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２に記載の治療複合体。
  10. オリゴヌクレオチドが、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項９に記載の治療複合体。
  11. 治療薬が細胞傷害剤である、請求項９に記載の治療複合体。
  12. 細胞傷害剤が、薬物または毒素である、請求項１１に記載の治療複合体。
  13. 免疫調節剤が、サイトカイン、幹細胞増殖因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、幹細胞増殖因子、エリスロポエチン、トロンボポエチン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の治療複合体。
  14. 治療薬が酵素である、請求項９に記載の治療複合体。
  15. 請求項１に記載のヒト化抗体またはそのフラグメントを含んでなる、多価多重特異性抗体またはそのフラグメント。
  16. 多価多重特異性抗体またはそのフラグメントが、ハプテン分子に対して親和性を有する一以上のハプテン結合部位をさらに含んでなる、請求項１５に記載の抗体またはそのフラグメント。
  17. 診断薬または治療薬をさらに含んでなる、請求項１５または１６に記載の抗体またはそのフラグメント。
  18. 少なくとも二種の請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントを含んでなる、抗体融合タンパク質。
  19. 少なくとも一種の請求項１に記載の第一の抗体またはそのフラグメントと、少なくとも一種の第二のＭＡｂまたはそのフラグメントとを含んでなり、該第二のＭＡｂまたはそのフラグメントが請求項１に記載の抗体またはそのフラグメントではない、抗体融合タンパク質。
  20. 第二のＭＡｂまたはそのフラグメントがハプテンと結合する、請求項１９に記載の抗体融合タンパク質。
  21. 第二のＭＡｂが癌腫関連抗原と結合する、請求項１９に記載の抗体融合タンパク質。
  22. 第二のＭＡｂが、膵臓癌上の抗原と結合するか、または膵臓癌に由来する、請求項２１に記載の抗体融合タンパク質またはそのフラグメント。
  23. 融合タンパク質が少なくとも一種の診断薬または治療薬をさらに含んでなる、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の抗体融合タンパク質。
  24. 請求項１〜２２のいずれか一項に記載のＭＡｂもしくはそのフラグメントまたは融合タンパク質をコードする核酸。
  25. ヒト化抗体またはそのフラグメントを有効成分として含んでなる、医薬であって、
    有効量の請求項１６に記載の二重特異性抗体またはフラグメントを、被験体に投与し、次いで
    （ｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；
    （ｉｉ）ＤＯＴＡ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−ＮＨ２；および
    （ｉｉｉ）Ａｃ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）Ｄ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ（ＨＳＧ）−Ｌｙｓ（Ｔｓｃｇ−Ｃｙｓ）−ＮＨ２
    からなる群から選択され、かつ、少なくとも一種の治療薬または診断薬と複合化している、ターゲッティング可能な複合体を被験体に投与することを含んでなる、ＭＵＣ１を発現する罹患組織を手術中に、内視鏡的にもしくは血管内にて同定および／または治療する方法において用いられる、医薬。
  26. ＭＵＣ１を発現する癌を治療する方法において用いられる医薬であって、
    請求項１〜２３のいずれか一項に記載の抗体もしくはそのフラグメントまたは融合タンパク質を有効成分として含んでなる、医薬。
  27. マウスＰＡＭ４抗体のＭＵＣ１抗原への結合と競合する、ヒト化抗体またはそのフラグメントであって、
    軽鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸配列ＳＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＹを含んでなるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＳＴＳＮＬＡＳを含んでなるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＨＱＷＮＲＹＰＹＴを含んでなるＣＤＲ３の配列を有し、かつ、
    重鎖可変領域のＣＤＲが、アミノ酸配列ＳＹＶＬＨを含んでなるＣＤＲ１、アミノ酸配列ＹＩＮＰＹＮＤＧＴＱＹＮＥＫＦＫＧを含んでなるＣＤＲ２、およびアミノ酸配列ＧＦＧＧＳＹＧＦＡＹを含んでなるＣＤＲ３の配列を有する
    ことを含む、ヒト化抗体またはそのフラグメント。
  28. 抗体またはそのフラグメントが少なくとも１つの診断薬または治療薬と結合している、請求項２７に記載のヒト化抗体またはそのフラグメント。
  29. ＭＵＣ１を発現する癌の治療用医薬の製造における、請求項２７または２８に記載のヒト化抗体またはそのフラグメントの使用。
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