KR20040079417A

KR20040079417A - 염증을 감소시키는 국소용 소염 조성물과 방법

Info

Publication number: KR20040079417A
Application number: KR10-2004-7010852A
Authority: KR
Inventors: 제임스알. 메인; 해리 로-슈미트
Original assignee: 알티코 인크.
Priority date: 2002-01-31
Filing date: 2003-01-30
Publication date: 2004-09-14
Also published as: US6881427B2; CN100421647C; CN1622796A; WO2003063806A1; US20030143288A1

Abstract

아마인 추출물과 감초 추출물의 효과량을 함유하는 국소용 소염 조성물을 제시한다. 이에 더하여, 아마인 추출물과 감초 추출물을 함유하는 조성물의 효과량을 염증 부위에 국소 도포하여 염증을 감소시키는 방법을 제시한다.

Description

염증을 감소시키는 국소용 소염 조성물과 방법{TOPICAL ANTI-INFLAMMATORY COMPOSITIONS AND METHODS OF REDUCING INFLAMMATION}

사람 피부는 수많은 환경 조건에 노출된다. 이들 환경 조건중 일부, 예를 들면 화상은 피부를 자극한다. 이에 더하여, 피부 각질제거제, 예를 들면 하이드록시 산(hydroxy acid) 및 피부선과 주름살을 감소시키는데 사용되는 다른 미용 화합물의 사용 역시 피부를 종종 자극한다. 이런 이유로, 이들 피부 자극인자를 해결하는 국소용 소염 조성물을 제공하는 것이 바람직하다.

한가지 해결방법은 NSAID로 알려진 비-스테로이드성 소염제를 사용하는 것이다. 폭넓은 사용에도 불구하고, NSAID는 잠재적으로 생명을 위협하는 궤양과 신독성을 비롯한 광범위한 부작용으로 인하여 치료요법적 효용이 상쇄된다. 국소용 코스티코스테로이드 역시 NSAID에 대한 대안으로 사용되고 있긴 하지만, 이런 스테로이드 치료제는 장기간동안 사용하는 경우에 발생중인 태아 세포의 기형발생(teratogenesis)을 비롯한 광범위한 중증 부작용을 유발한다.

이런 이유로, 통상적인 국소용 소염 치료제의 사용과 관련된 문제점을 해결하는 국소용 소염 조성물을 제공하는 것이 바람직하다. 또한, 자연발생 성분을 사용하는 것이 바람직하다.

요약

본 발명의 범위는 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정되고, 요약에 기술된 내용에 의해 영향을 받지 않는다.

본 발명의 특징을 구현하는 국소용 소염 조성물은 효과량의 아마인(linseed) 추출물과 감초(licorice) 추출물을 함유한다. 따라서, 본 발명은 제약학적으로 또는 미용학적으로 수용가능한 국소 치료용 담체 및 아마인 추출물과 감초 추출물의 효과량을 함유하는 국소용 미용 또는 피부의약 조성물을 제시한다.

본 발명의 특징을 구현하는 2번째 국소용 소염 조성물은 조성물의 대략 0.00001 내지 50 wt% 함량의 아마인 추출물 및 대략 0.00001 내지 50 wt% 함량의 감초 추출물을 함유한다.

또한, 본 발명은 아마인 추출물과 감초 추출물을 함유하는 조성물의 효과량을 염증 부위에 국소 도포하여 염증을 감소시키는 방법을 제시한다.

달리 명시하지 않는 경우에, 아래의 명세서와 특허청구범위에 이용된 모든 비율은 중량에 기초한다. 이에 더하여, 달리 명시하지 않는 경우에, 수용액에 관련하여 이용된 중량 비율은 현존하는 고체와 액체를 모두 포함한다.

본 발명은 소염 조성물, 좀더 구체적으로 국소용 소염 조성물에 관한다. 본 발명의 조성물은 미용 및/또는 피부의약 조성물로 특히 유용하다.

도 1에서는 TESTSKIN Ⅱ 시료에 대한 다양한 물질의 독성을 나타내는 막대그래프를 보여준다.

도 2에서는 다양한 자극에 반응하여 분비된 GM-CSF의 함량 도면을 보여준다.

도 3에서는 다양한 자극에 반응하여 분비된 PGE₂의 함량 도면을 보여준다.

본 발명의 특징을 구현하는 국소용 소염 조성물은 효과량의 아마인 추출물과 감초 추출물을 함유한다.

본 발명의 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, "아마인 추출물"은 아마인으로부터 수득된 임의의 화합물이나 이런 화합물의 조합(즉, "아마인(flaxseed)", "아마속(linum)", "아마(Linum usitatissimum)" 또는 "아마과(Linaceae)" 등), 아마인으로부터 수득된 오일 및/또는 이들의 화학적 유도체를 의미한다. 본 발명의 바람직한 구체예에 사용되는 대표적인 아마인 추출물에는 아마인; 경화된 아마인과 경화되지 않은 아마인 오일; 정제된 아마인 오일(예, 알칼리성 정제된 아마인 오일, 산성 정제된 아마인 오일, 끓임된 아마인 오일, 산화된 아마인 오일 등); 리나마린(linamarin), 리나틴(linatine), 리놀렌산과 이의 글리세리드; 리놀레산과 이의 글리세리드; 올레산과 이의 글리세리드; 스테아르산과 이의 글리세리드; 팔미트산과 이의 글리세리드; 미리스트산과 이의 글리세리드; 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 바람직한 구체예에 사용되는 아마인 추출물은 포화되거나 포화되지 않을 수 있다. 본 발명의 바람직한 아마인 추출물은 Silab(Cedex, France)에 의해 상품명 SENSILINE으로 판매되고 있는 폴리사카라이드(예, β-글루칸, 우론산)와 펩티드글리칸이 풍부한 아마인의 순수한 분획물이다.SENSILINE 아마인 추출물은 수용액으로 제공되는데, 대략 12 내지 20 g/ℓ의 고체 분석을 제공한다. 이에 더하여, SENSILINE 아마인 추출물은 대략 4 내지 7 g/ℓ 함량의 단백질, 대략 6 내지 9 g/ℓ 함량의 당, 대략 1300 ㎍/㎖ 미만 함량의 우론산을 함유한다.

적절하게는, 본 발명에 사용되는 아마인 추출물은 조성물의 대략 0.00001 내지 50 wt% 함량으로 존재한다. 좀더 적절하게는, 아마인 추출물은 조성물의 대략 0.00001 내지 40 wt% 함량으로 존재한다. 이보다 좀더 적절하게는, 아마인 추출물은 조성물의 대략 0.00001 내지 10 wt%, 이보다 좀더 적절하게는 대략 0.001 내지 6 wt%, 이보다 좀더 적절하게는 대략 0.1 내지 5 wt% 함량으로 존재한다. 본 발명의 바람직한 특정 구체예에서, 아마인 추출물은 조성물의 적어도 1 wt%, 좀더 적절하게는 적어도 2 wt%, 이보다 좀더 적절하게는 적어도 3 wt% 함량으로 존재한다. 특히 적절하게는, 조성물에서 아마인 추출물은 대략 4 wt% 함량으로 존재한다.

전형적으로, 가수분해된 아마인 추출물은 대략 12 내지 20 g/ℓ의 고체 함량을 보유하는 수용액으로 제공된다. 따라서, 이런 수용액의 4 wt% 분량은 "활성"아마인 추출물의 대략 0.008 wt%에 상응한다.

본 발명의 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, "감초 추출물"은 감초(glycyrrhiza), 글리시레트산(glycerrhetic acid)[일명, "에녹솔론(enoxolone)", "우랄렌산(uralenic acid)", "글리시레틴산(glycyrrhetinic acid")], 글리시리즈산(glycyrrhizic acid)[일명, "글리시리진(glycyrrhizin)", "글리시리진산(glycyrrhizinic acid)", "글리시레틴산 글리코시드(glycerrhetic acidglycoside)"], 이들의 유도체, 이들의 조합을 비롯한 감초과(glycyrrhiza family)[즉, 유럽 감초(Glycyrrhiza glabra)]의 임의의 화합물 또는 이들 화합물의 조합을 의미한다. 감초 추출물의 바람직한 유도체에는 염(예, 금속염, 암모늄염 등)과 에스테르[예, 포화 지방산 에스테르, 불포화 지방산 에스테르, 양쪽산 반 에스테르(diacid half ester), 글리코시드 에스테르 등]가 포함된다.

본 발명의 바람직한 구체예에 사용되는 대표적인 포화 지방산 에스테르 유도체에는 부티레이트 에스테르, 이소발레레이트 에스테르, 카프로에이트 에스테르, 카프릴레이트 에스테르, 카프레이트 에스테르, 라우레이트 에스테르, 미리스테이트 에스테르, 팔리테이트 에스테르, 스테아레이트 에스테르, 아라키데이트 에스테르, 베헤네이트 에스테르, 리그노세레이트 에스테르, 세로테이트 에스테르, 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구체예에 사용되는 대표적인 불포화 지방산 에스테르 유도체에는 데실리네이트 에스테르, 스틸린게이트 에스테르, 도데실리네이트 에스테르, 팔미톨리에이트 에스테르, 올리에이트 에스테르, 리시놀리에이트 에스테르, 페트로셀리네이트 에스테르, 바세네이트 에스테르, 리놀리에이트 에스테르, 리놀리네이트 에스테르, 엘리오스테아레이트 에스테르, 푸니케이트 에스테르, 리카네이트 에스테르, 파리나레이트 에스테르, 가돌리에이트 에스테르, 아라키도네이트 에스테르, 에이코시네이트 에스테르, 도코시네이트 에스테르, 세톨리에이트 에스테르, 에루케이트 에스테르, 도코사디에네이트 에스테르, 셀라콜리에이트 에스테르, 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구체예에 사용되는 대표적인 양쪽산 반 에스테르 유도체(즉, 감초 추출물 및 양쪽산, 적절하게는 α,ω-양쪽산의 2가지 카르복실산 부분중 하나 사이에 에스테르 결합을 포함하는 감초 추출물 유도체)에는 숙시네이트 반 에스테르, 글루타레이트 반 에스테르, 아디페이트 반 에스테르, 피멜레이트 반 에스테르, 수베레이트 반 에스테르, 아젤레이트 반 에스테르, 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

바람직한 감초 추출물 에스테르 유도체에는 글리세레트산과 글리시리즈산의 포화 에스테르와 불포화 에스테르가 포함되는데, 여기서 상기 분자의 에스테르 영역은 2 내지 24개 탄소 원자, 적절하게는 10 내지 24개 탄소 원자, 좀더 적절하게는 16 내지 24개 탄소 원자를 보유한다. 본 발명에 사용되는 대표적인 감초 추출물 에스테르 유도체에는 모노암모늄 글리시리진에이트, 모노포타슘 글리시리진에이트, 디포타슘 글리시리진에이트, 1-베타-글리시레트산, 스테아릴 글리시레틴에이트, 3-스테아릴옥시-글리시레틴산, 디소디움 3-숙시닐옥시-베타-글리시레틴에이트 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 감초 추출물로 스테아릴 글리시레틴에이트가 바람직하고, Barnet Products Corporation(Englewood Cliffs, NJ)에 의해 상품명 NET-STG로 판매되고 있는 스테아릴 글리시레틴에이트가 특히 바람직하다.

적절하게는, 본 발명에 사용되는 감초 추출물은 조성물의 대략 0.00001% 내지 50% wt% 함량으로 존재한다. 좀더 적절하게는, 감초 추출물은 조성물의 대략 0.00001 내지 40 wt% 함량으로 존재한다. 이보다 좀더 적절하게는, 감초 추출물은 조성물의 대략 0.00001 내지 3 wt%, 이보다 좀더 적절하게는 대략 0.0001 내지 2wt%, 이보다 좀더 적절하게는 대략 0.001 내지 1.5 wt% 함량으로 존재한다.

본 발명의 바람직한 특정 구체예에서, 감초 추출물은 조성물의 적어도 0.01 wt%, 좀더 적절하게는 적어도 0.03 wt%, 이보다 좀더 적절하게는 적어도 0.05 wt%함량으로 존재한다. 특히 적절하게는, 조성물에서 감초 추출물은 대략 0.1 wt% 함량으로 존재한다.

본 발명의 특징을 구현하는 조성물은 자극인자-유도된 염증의 생물마커인 PGE₂(프로스타글란딘 E₂) 및 면역-유도된 염증의 생물마커인 GM-CSF(과립구-대식세포 콜로니 자극 인자)의 배경 수준을 낮추는데 효과적이다. 이들 조성물의 효능은 오랜 기간동안 면역억제제와 소염제로 사용되고 있는 합성 글루코코르티코이드인 덱사메타손의 효능과 유사하다. 특정 이론에 국한되거나 첨부된 특허청구범위와 이의 등가물의 범위를 한정하지 않으면서, 본 발명의 특징을 구현하는 조성물의 작용 기전은 상승 작용으로 염증 반응을 조절하는 아마인 추출물과 감초 추출물의 조합에 의해 발휘되는 새로운 전사 조절 효과를 수반한다. 실제로, 아마인 추출물과 감초 추출물의 조합은 PGE₂와 GM-CSF의 배경 수준 강하에 상승효과를 발휘하는데, 이는 예상치 못한 놀라운 발견이다.

본 발명의 한 구체예에서, 한가지이상의 바이오플라보노이드(bioflavonoid)를 조성물에 첨가하여 자극인자 포르볼(phorbol) 미리스테이트 아세테이트(PMA)-유도된 세포 반응을 감소시키는데 추가적인 이점을 제공한다. 바람직한 바이오플라보노이드에는 다원(multi-source) 감귤류 바이오플라보노이드, 광귤(bitterorange) 꽃 바이오플라보노이드, 지방산-변형된 헤스페레틴(hesperetin) 라우레이트 바이오플라보노이드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.

본 발명에 따른 조성물을 제조하기 위하여, 아마인 추출물과 감초 추출물은 제약학적으로/미용학적으로 수용가능한 운반제 또는 담체와 혼합한다. 미용학적으로 수용가능한 운반제는 조성물에 존재하는 다른 물질에 대한 희석제, 분산제 또는 담체로 작용하여, 조성물이 피부에 도포될 때 이들의 분포를 조장한다. 물 이외의 운반제는 액체 또는 고체 연화제(emollient), 용매, 습윤제, 점증제, 분말을 함유할 수 있다. 다른 적합한 운반제는 U. S. Patent No. 6,184,247에서 기술한다.

제약학적으로 또는 미용학적으로 수용가능한 운반제는 전체 조성물의 대략 10 내지 99.9 wt%, 적절하게는 대략 50 내지 99 wt%를 구성하는데, 다른 미용학적 보조물질이나 첨가제가 부재하는 경우에 조성물의 나머지 부분을 구성할 수 있다.

본 발명의 조성물은 용액, 겔, 로션, 크림, 연고, 수중유(oil-in-water) 에멀젼, 유중수(water-in-oil) 에멀젼, 스틱(stick), 스프레이, 페이스트, 무스, 좌약 및 다른 제약학적으로 수용가능한 형태로 제제화될 수 있다. 이에 더하여, 조성물은 점착성 붕대, 예를 들면 Johnson & Johnson(Skillman, NJ)에 의해 상품명 BAND-AID로 판매되고 있는 유형의 점착성 붕대의 거즈 부분으로 염증 부위로 전달될 수 있다.

본 발명의 조성물은 아마인 추출물과 감초 추출물의 조합에 의해 제공되는 소염 효과에 부정적인 영향을 주지 않는 다양한 공지된 통상적인 미용학적 성분을 함유할 수도 있다. 가령, 본 발명의 조성물은 한가지이상의 첨가제 또는 당분야에널리 공지된 다른 선택적 성분을 추가로 함유할 수 있는데, 여기에는 충전제(예, 고체, 반-고체, 액체 등); 담체; 희석제; 연화제; 유화제; 계면활성제; 조직화제(structuring agent); 점증제; 겔화제(gelling agent); 비타민, 레티노이드, 안드레티놀(예, 비타민 B₃, 비타민 A 등); 색소; 방향; 일광차단제와 자외선방지제; 항-산화제와 라디칼 소거제; 유기 하이드록시 산; 박리제(desquamation agent); 각질제거제; 피부 미백제; 피부 컨디셔녀; 보습제; 세라마이드, 수유도세라마이드, 인지질, 스핑고지질, 콜레스테롤, 히알루론산과 이의 유도체, 콜라겐 합성 촉진물질, 글루코사민, 제약학적으로 수용가능한 침투제(예, n-데실메틸 설폭사이드, 레시틴 오가노겔(organogels) 등); 보존제; 항균제 및 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다른 적합한 첨가제 및/또는 보조물질은 U. S. Patent No. 6,184,247에서 기술한다.

본 발명의 특징을 구현하는 염증 감소 방법은 본원에서 밝힌 조성물의 효과량을 염증 부위에 국소 도포하는 단계로 구성되고, 상기 조성물은 아마인 추출물과 감초 추출물을 함유한다. 본 발명에 따른 국소 도포의 빈도는 제한이 없고, 치료되는 염증의 유형과 심각도에 따라 달라진다. 이에 더하여, 본 발명의 특징을 구현하는 조성물을 국소 도포하여 치료할 수 있는 염증의 유형과 원인은 제한이 없고, 본 발명에 따른 조성물과의 접촉으로 잠재적인 이득을 얻을 수 있는 모든 유형과 원인의 염증을 포괄한다.

아마인 추출물과 스테아릴 글리시레틴에이트를 함유하는 조성물에 관한 아래의 실시예는 설명을 목적으로 하고, 첨부된 특허청구범위 또는 이의 등가물의 범위를 제한하지 않는다.

아마인 추출물과 감초 추출물의 조합을 함유하는 본 발명에 따른 조성물의 소염 잠재력은 아래와 같이 평가하였다. 피부 조직으로부터 PGE₂와 GM-CSF의 방출은 검사 물질과의 사전-배양이후 보호 잠재력의 척도를 제공하고, MTT(3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐-2H-테트라졸륨 브로마이드)의 감소는 독성 잠재력의 평가를 제공한다.

본 연구에 이용된 피부 조직, TESTSKIN Ⅱ(Organogenesis Inc., Canton, MA)는 실제 살아있는 피부를 모의하는 해부학적 구조와 생리학적 기능을 갖는 사람 피부로부터 확립된다. 상기 조직은 잘-분화된 각화세포와 각질층을 보유하는 상부 표피층 및 콜라겐 매트릭스를 생산할 수 있는 살아있는 섬유아세포를 보유하는 하부 진피층으로 구성된다.

본 연구의 검사 물질을 포함하는 조성물은 하기 표 1에 요약한다. 표 1에 기재된 검사 물질은 바탕값 크림(검사 물질 2), 스테아릴 글리시레틴에이트를 함유하는 크림(검사 물질 4), 아마인 추출물을 함유하는 크림(검사 물질 6), 스테아릴 글리시레틴에이트와 아마인 추출물의 조합을 함유하는 크림(검사 물질 8), 파지티브 대조(덱사메타손), 네거티브 대조(처리없음)이다.

	검사 물질 2	검사 물질 4	검사 물질 6	검사 물질 8
성분	%	%	%	%
탈이온수	56.919	56.819	52.919	52.819
글리세린	0.500	0.500	0.500	0.500
글리세릴폴리메트아크릴레이트	15.000	15.000	15.000	15.000
폴리솔베이트 20	0.500	0.500	0.500	0.500
스쿠알렌	10.000	10.000	10.000	10.000
솔비탄 스테아레이트	3.000	3.000	3.000	3.000
L-아르기닌	5.000	5.000	5.000	5.000
부틸렌 글리콜	4.900	4.900	4.900	4.900
스테아릴 글리시레틴에이트(Barnet)		0.100		0.100
가수분해된 아마(Linum usitatissimum) 추출물 (Silab)			4.000	4.000
다른 첨가제	4.181	4.181	4.181	4.181

이들 검사 물질은 4, 8, 24 시간의 노출 기간동안 평가하고, 이들의 독성은 24 시간의 노출 기간동안 평가하였다. 검사 물질 2, 4, 6, 8은 순수하게 사용하였다. 파지티브 대조(즉, 덱사메타손)는 100 μM 농도로 사용하였다. 모든 희석액은 성장 배지에서 만들고, 분석은 삼중으로 실시하였다.

6-웰 Falcon 평판은 Becton Dickinson & Company(Bedford, MA)로부터 구입가능하다. Millicell 배양용기(transwell) 삽입물과 투약 패드는 Millipore Corporation(Bedford, MA)으로부터 구입가능하다. 성장 배지, DMEM/F12는 Invitrogen Corporation(Carlsbad, CA)의 자회사인 Life Technologies로부터 구입가능하다. PGE₂에 대한 고감도 비색 경쟁 ELISA 면역분석 키트 및 사람 GM-CSF에 대한 Quantikine 비색 샌드위치 ELISA 면역분석 키트(각각, R&D DE2100과 R&D DGM00)는 R&D Systems, Inc.(Minneapolis, MN)로부터 구입가능하다. MTT(예,M2128)은 Sigma-Aldrich(Milwaukee,WI)로부터 구입가능하다. 본 실시예에 이용된 분석 방법은 J. Imm. Methods, 1983, Mosman; Biochem. Pharm., 1976, R. J. Flower and G. J. Blackwell; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, J. Raud et al.; J. Immunol., 1985, J. G. Giri et al.; Science, 1974, M. B. Taubman et al.; Med. Pharm., 1990, S. Haga et al.; J. Cell Physio, 1990, A. F. Lopez et al.; Nature, 1989, F.Bussolino et al.을 비롯한 수많은 참고문헌에서 기술한다.

모든 공급과 처리 장치는 멸균하고, 무균 상태로 유지하는 기술을 이용한다. 피부 조직은 중간선으로부터 8 ㎜ 생검 펀치를 이용하여 타인(打印)하고, 배양용기 삽입물과 1 ㎖ 성장 배지를 포함하는 6-웰 평판의 웰에 이전한다. 조직은 10% CO₂가 공급된 축축한 37℃ 배양기에 이전하고 하룻밤동안 배양한다.

사용된 검사 물질은 무균 투약 패드(10 ㎕/패드)에 집어넣고 조직 상부에 위치시킨다. 투약된 조직은 배양기에 되돌리고 특정 시간(예, 4시간)동안 배양하며, 이후 상층액을 새로운 배지로 교체한다. 수집된 상층액은 PGE₂와 GM-CSF 분석에 사용한다.

PGE ₂ 탐지

특정 시점에서 상층액에서 PGE₂의 정량은 공급업자에 의해 권장된 프로토콜에 따라 실시한다. 가령, 100 ㎕ 시료 또는 표준(분석 완충액 ED1에서 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6, 7.8 pg/㎖로 연속 희석되는 50 ㎍/㎖ 재조합 PGE₂)은항-생쥐 항체로 피복된 적당한 웰에 첨가한다. 4가지 대조를 포함시킨다: 전체 활성, 비-특이적 결합, 최대 결합, 기질 바탕값. 전체 활성 대조는 직접 결합된 PGE₂HS 공액체만을 포함한다. 비-특이적 결합 대조는 시료 또는 표준을 대신하는 완충액에 PGE₂HS 공액체를 포함하지만 항-PGE₂HS 항체가 부재한다. 최대 결합 대조는 PGE₂HS 공액체와 항-PGE₂HS 항체를 모두 포함하지만 시료 또는 표준을 대신하여 완충액을 함유한다. 기질 바탕값 대조는 완충액만을 함유한다. 50 ㎕ PGE₂HS 공액체 용액과 50 ㎕ 항-PGE₂HS 항체 용액을 시료, 표준, 적당한 대조 웰에 첨가한 이후, 평판은 4-8℃에서 18시간동안 배양한다. 배양후, 용액은 웰로부터 흡입하고, 상기 웰은 세척 완충액에서 3회 세척한다. 기질(완충액에서 pNPP, 200 ㎕)은 각 웰에 첨가하고, 평판은 37℃에서 1시간동안 배양한다. 배양후, 50 ㎕ 중단 용액(트리소디움 포스페이트)을 첨가하고, 마이크로평판 분광광도계를 이용하여 405 nm(570-590 nm의 참조 파장)에서 광학 밀도를 측정한다. 상층액에 존재하는 PGE₂의 함량은 재조합 PGE₂표준에 의해 산출된 교정 곡선과 비교하여 측정한다.

GM-CSF 탐지

특정 시점에서 상층액에서 GM-CSF의 정량은 공급업자에 의해 권장된 프로토콜에 따라 실시한다. 가령, 100 ㎕ 시료(배양 상층액) 또는 표준(시료 희석제에서 250, 125, 62.5, 31.2, 15.6, 7.8 pg/㎖로 연속 희석되는 50 pg/㎖ 재조합 GM-CSF)은 항-GM-CSF 항체로 피복된 적당한 웰에 첨가한다. 평판은 실온에서 2시간동안배양한다. 배양후, 시료는 웰로부터 제거하고, 상기 웰은 세척 완충액으로 4회 세척한다. 항-GM-CSF 공액체(200 ㎕)는 각 웰에 첨가하고, 평판은 실온에서 1시간동안 배양한다. 배양후, 시료는 다시 한번 제거하고, 상기 웰은 전술한 바와 같이 4회 세척한다. 최종 세척이후, 200 ㎕ 기질 용액은 각 웰에 첨가하고, 평판은 실온에서 20분동안 배양한다. 중단 용액(1N 황산, 50 ㎕)을 첨가하고, 450 nm(540-570 nm의 참조 파장)에서 광학 밀도를 측정한다. 상층액에 존재하는 GM-CSF의 함량은 재조합 GM-CSF 표준에 의해 산출된 교정 곡선과 비교하여 측정한다.

MTT

검사 물질이 존재하지 않는 조직은 10% CO₂가 공급된 축축한 37℃ 배양기에서 2 ㎎/㎖ MTT 용액(성장 배지에서 만듦)과 함께 배양한다. 2시간 배양후, MTT 용액은 제거하고, 조직은 PBS로 세척한다. 형성된 포마즌(formazan) 염은 1시간동안 4 ㎖ 이소프로판올과 함께 배양하여 용리한다. 소모된 MTT 용액은 A₅₄₀에서 96 웰 편평 바닥 평판에서 판독한다.

하기 표 2에서는 24시간 노출 기간동안 다양한 검사 물질로 처리된 세포에서 MTT 데이터를 보여준다. 분석은 삼중으로 실시하는데, 여기에 도시된 수치는 삼중 처리의 평균에 상응한다.

자극	검사 물질	생존 % ± SD
없음	2	105 ± 10
	4	96 ± 6
	6	100 ± 11
	8	97 ± 2
	덱사메타손	104 ± 11

도 1에서는 24시간 노출 기간동안 TESTSKIN Ⅱ 시료에 대한 다양한 물질의 독성의 막대그래프를 도시한다. 독성은 노출 기간이후 MTT 감소로 분석한다.

표 2와 도 1의 데이터에 도시된 바와 같이, 검사 물질은 처리이후 생존 %에기초하여 유해한 독성을 보이지 않는다. 접촉 자극의 파지티브 대조로 이용되는 PMA(10 ng/㎖)는 통계학적으로 유의하진 않지만 TESTSKIN Ⅱ 조직에 약한 독성을 나타낸다(기준: p ≤ 0.01).

하기 표 3에서는 24시간 노출 기간동안 다양한 검사 물질로 처리된 세포에서 IL-1α, PGE₂, GM-CSF 분비에 상응하는 데이터를 보여준다. 분석은 삼중으로 실시하는데, 여기에 도시된 수치는 삼중 처리의 평균에 상응한다.

검사 물질	IL-1α
	0 Hr	4 Hr	8 Hr	24 Hr
2	22.00 ± 9.69	27.80 ± 4.38	29.37 ± 2.83	32.66 ± 2.27
4	22.00 ± 9.69	31.83 ± 14.02	34.29 ± 14.80	42.96 ± 12.97
6	22.00 ± 9.69	32.02 ± 15.35	34.54 ± 16.14	43.95 ± 12.10
8	22.00 ± 9.69	25.56 ± 10.31	26.18 ± 10.27	40.46 ± 14.37
네거티브 대조	22.00 ± 9.69	26.16 ± 10.33	27.18 ± 10.40	32.47 ± 10.94
덱사메타손	22.00 ± 9.69	23.35 ± 10.39	24.45 ± 9.47	25.42 ± 8.94
검사 물질	PGE₂
	0 Hr	4 Hr	8 Hr	24 Hr
2	1420 ± 169	2453 ± 92	3398 ± 137	5836 ± 377
4	1420 ± 169	2159 ± 220	2572 ± 236	4911 ± 409
6	1420 ± 169	2264 ± 144	3190 ± 159	5758 ± 145
8	1420 ± 169	1874 ± 145	2012 ± 159	3555 ± 278
네거티브 대조	1420 ± 169	2816 ± 92	4219 ± 382	6693 ± 171
덱사메타손	1420 ± 169	1964 ± 444	2077 ± 487	2161 ± 564
검사 물질	GM-CSF
	0 Hr	4 Hr	8 Hr	24 Hr
2	92.61 ± 5.64	153.40 ± 6.42	176.26 ± 6.87	390.34 ± 15.89
4	92.61 ± 5.64	155.55 ± 5.25	181.21 ± 9.99	374.39 ± 14.97
6	92.61 ± 5.64	156.18 ± 14.87	186.36 ± 9.62	437.31 ± 40.48
8	92.61 ± 5.64	101.54 ± 6.16	105.22 ± 6.48	182.86 ± 9.09
네거티브 대조	92.61 ± 5.64	147.76 ± 6.17	166.04 ± 6.87	394.30 ± 15.89
덱사메타손	92.61 ± 5.64	116.00 ± 5.64	120.40 ± 5.52	262.03 ± 35.82

도 2와 도 3에서는 다양한 검사 물질에 노출이후 분비된 GM-CSF와 PGE₂의 함량 도면을 각각 보여준다. 조직은 PMA 또는 히스타민으로 자극하기에 앞서 4시간동안 검사 물질과 함께 사전-배양한다. 분비된 IL-1α, PGE₂, GM-CSF는 ELISA 방법으로 측정한다. 표 3과 도 2-3에 도시된 사이토킨 PGE₂와 GM-CSF가 자극 작용, 염증, 면역자극의 지표로 이용되긴 하지만, TESTSKIN Ⅱ 피부 모델은 APC(항원 제시 세포)와 같은 면역 세포가 결여된다.

도 2에 도시된 바와 같이, 스테아릴 글리시레틴에이트와 아마인 추출물을 모두 포함하는 크림(검사 물질 8)은 분비된 GM-CSF 함량을 덱사메타손에 의해 달성되는 수준 및 개별 성분, 스테아릴 글리시레틴에이트와 아마인 추출물을 각각 함유하는 크림(검사 물질 4와 6)에 의해 달성되는 수준 이하로 성공적으로 감소시킨다.

유사하게, 도 3에 도시된 바와 같이 스테아릴 글리시레틴에이트와 아마인 추출물을 모두 포함하는 크림(검사 물질 8)은 분비된 PGE₂의 함량을 개별 성분, 스테아릴 글리시레틴에이트와 아마인 추출물을 각각 함유하는 크림(검사 물질 4와 6)에 의해 달성되는 수준 이하로 성공적으로 감소시킨다. 따라서, 이런 결과는 아마인 추출물과 감초 추출물의 조합이 PGE₂와 GM-CSF의 배경 수준 강하에 놀랍고 예상치 못한 상승효과를 보인다는 것을 증거한다.

검사 물질에 노출된 직후에 추가적인 자극이 없으면, 배경 수준(즉, 네거티브 대조) 이상으로 현저한 IL-1α, PGE₂, GM-CSF의 분비는 발생하지 않는다. 하지만, 스테아릴 글리시레틴에이트와 아마인 추출물을 함유하는 시료(8)는 추가적인 자극없이 24시간후 PGE₂와 GM-CSF의 배경 수준을 감소시킨다.

PMA에 의한 자극은 24시간 노출이후 PGE₂분비를 배경 수준 이상으로 유도하지 못하지만, PMA 노출에 앞서 조직을 검사 물질 8 또는 덱사메타손으로 사전처리하면 PGE₂분비의 배경 수준이 억제된다. 이에 더하여, 조직을 외인성 히스타민으로 공격하는 경우에, 검사 물질 8은 히스타민 유도된 GM-CSF 분비로부터 상당한 보호를 제공한다.

SENSILINE 아마인 추출물, NET-STG 스테아릴 글리시레틴에이트, 또는 이들의 조합을 함유하는 아이 크림(eye cream)은 본 연구에서 피부 모델에 비-독성(MTT 세포 생존 데이터에 기초하여)이고, 비-자극성(IL-1α, PGE₂, GM-CSF 분비 데이터에 기초하여)인 것으로 밝혀졌다. 이들 2가지 활성 성분의 조합을 함유하는 아이 크림은 PMA(비-감작화 자극인자) 또는 히스타민(Ⅳ형 과민성-유사 반응)으로 외인성 자극직후에 염증/자극 반응으로부터 보호 수단을 제공한다. 이들 2가지 활성 성분의 동시 존재는 PGE₂와 GM-CSF의 배경 수준을 덱사메타손에서 관찰되는 수준으로 감소시키는데 상승적으로 작용한다.

앞서 기술된 상세한 설명과 실시예는 설명을 목적으로 하고, 첨부된 특허청구범위의 범위를 한정하지 않는다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 다양한 개변은 당업자에게 자명하고 첨부된 특허청구범위와 이의 등가물의 범위에 포섭된다.

Claims

아마인 추출물과 감초 추출물의 효과량을 함유하는 소염 조성물을 포함하는 국소용 조성물.
제 1 항에 있어서, 감초 추출물은 감초(glycyrrhiza), 글리시레트산(glycerrhetic acid), 글리시리즈산(glycyrrhizic acid), 이들의 유도체, 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 2 항에 있어서, 유도체는 염, 에스테르, 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 3 항에 있어서, 염은 금속염과 암모늄염에서 선택되는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 3 항에 있어서, 에스테르는 지방산 에스테르, 양쪽산 반 에스테르, 글리코시드 에스테르에서 선택되는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 5 항에 있어서, 지방산 에스테르는 포화 지방산 에스테르와 불포화 지방산 에스테르에서 선택되는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 6 항에 있어서, 감초 추출물은 스테아릴 글리시레틴에이트인 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 1 항에 있어서, 아마인 추출물은 조성물의 0.00001 내지 10 wt% 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 1 항에 있어서, 아마인 추출물은 조성물의 0.001 내지 6 wt% 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 1 항에 있어서, 아마인 추출물은 조성물의 4 wt% 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 1 항에 있어서, 감초 추출물은 조성물의 0.00001 내지 3 wt% 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 8 항에 있어서, 스테아릴 글리시레틴에이트는 조성물의 0.0001 내지 2 wt% 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 8 항에 있어서, 스테아릴 글리시레틴에이트는 조성물의 0.1 wt% 함량으로존재하는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
제 1 항에 있어서, 적어도 한가지 바이오플라보노이드를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
아마인 추출물과 감초 추출물을 함유하는 소염 조성물을 포함하는 국소용 조성물에 있어서, 아마인 추출물은 조성물의 0.1 내지 5 wt% 함량으로 존재하고, 감초 추출물은 0.001 내지 1.5 wt% 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 국소용 조성물.
아마인 추출물과 감초 추출물의 효과량을 함유하는 소염 조성물을 포함하는 국소용 조성물을 염증 부위에 국소 도포하여 염증을 감소시키는 방법.
제 16 항에 있어서, 감초 추출물은 감초(glycyrrhiza), 글리시레트산(glycerrhetic acid), 글리시리즈산(glycyrrhizic acid), 이들의 유도체, 이들의 조합에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 17 항에 있어서, 감초 추출물은 스테아릴 글리시레틴에이트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 아마인 추출물은 조성물의 0.00001 내지 10 wt% 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 16 항에 있어서, 감초 추출물은 조성물의 0.00001 내지 3 wt% 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.