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KR20030016250A - 중추신경계 림프종 치료용 리툭시맵의 초내 투여 - Google Patents

중추신경계 림프종 치료용 리툭시맵의 초내 투여 Download PDF

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KR20030016250A
KR20030016250A KR1020027014281A KR20027014281A KR20030016250A KR 20030016250 A KR20030016250 A KR 20030016250A KR 1020027014281 A KR1020027014281 A KR 1020027014281A KR 20027014281 A KR20027014281 A KR 20027014281A KR 20030016250 A KR20030016250 A KR 20030016250A
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KR
South Korea
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antibody
antibodies
administered
cell
fragment
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Application number
KR1020027014281A
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English (en)
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그릴로로페즈안토니오제이.
Original Assignee
아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션
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Publication date
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Abstract

본 발명은 항-B 세포 항체, 바람직하게는 항-CD20 항체, 가장 바람직하게는 리툭시맵을 사용하여, 뇌의 B세포 림프종, 특히 일차성 중추신경계 림프종(PCNSLs)을 치료하고, 수막 재발을 예방하는 방법에 관한 것이다. 이 항체는 초내에 단독으로 또는 메토트렉세이트와 같은 다른 화학요법제 또는 다른 항-B 세포 항체와 조합 투여하여, 면역저하된 및 면역저하되지 않은 환자 모두에게서 PCNSL을 치료할 수 있다. 이러한 항체는 CNS 림프종 환자, 특히 면역저하된 환자의 진단에 사용할 수도 있다.

Description

중추신경계 림프종 치료용 리툭시맵의 초내 투여{INTRATHECAL ADMINISTRATION OF RITUXIMAB FOR TREATMENT OF CENTRAL NERVOUS SYSTEM LYMPHOMAS}
I. 항-CD20 항체
CD20은 90% 이상의 B-세포 림프종에서 발현되는 세포 표면 항원으로, 종양 세포에서 제한(shed) 또는 조절(modulate)되지 않는다(McLaughlinet al.,J. Clin. Oncol.16:2825-2833(1998b)). 연구 및 치료 모두에 사용하기 위하여 항-CD20 항체가 제조되었다. 항-CD20 항체 중 하나가 모노클로날 B1 항체이다(미합중국 특허 제 5,843,398호). 항-CD20 항체는 B-세포 림프종을 치료하기 위한 방사성핵종의 형태(예를 들어,131I-표지된 항-CD20 항체)나, 전립선 또는 유방 암 전이로 인한 뼈의 통증을 완화하기 위한89Sr-표지된 형태로 제조되기도 하였다(Endo,Gan To Kagaku Ryoho26: 744-748(1999)).
쥐의 모노클로날 항체인 1F5(항-CD 항체)는 연속 정맥 주입으로 B 세포 림프종 환자에게 투여되는 것으로 보고되었다. 그러나, 순환 종양 세포(circulating tumor cells)를 고갈시키기 위해서는 극도로 높은 수준(>2g)의 1F5가 필요한 것으로 보고되었으며, 그 결과는 "일시적"이었다(Presset al.,Blood69:584-591(1987)). 치료에 모노클로날 항체를 사용함으로써 발생가능한 문제는, 이러한 비-인간 모노클로날 항체(예를 들어, 쥐의 모노클로날 항체)는 일반적으로 인간 효과기(effector) 작용성이 부족하다는 것이다. 즉, 이들은 특히 보체 의존성 용해를 매개하거나, 항체-의존성 세포 독성 또는 Fc-수용체 매개 식균작용을 통하여 인간 표적 세포를 용해시킬 수 없다. 또한, 인간 숙주는 비-인간 모노클로날 항체를 외래 단백질로서 인식할 수 있다; 따라서, 이러한 외래 항체를 반복 주입하면, 면역 반응이 유도되어 해로운 과민 반응이 일어날 수 있다. 쥐를 기본으로 하는 모노클로날 항체에 대해, 이를 인간 항-마우스 항체 반응이라고 하거나 "HAMA" 반응이라고 한다. 또한, 이러한 "외래" 항체는 숙주의 면역계에 의해 공격당하여, 표적 부위에 도달하기 전에 사실상 무력화될 수 있다.
A.리툭시맵
리툭시맵(Rituxan, MabThera및 IDEC-C2B8로도 알려짐)은 FDA가 최초로 승인한 모노클로날 항체이며, IDEC 제약회사가 개발하였다(미합중국 특허 제 5,843,439호; 5,776,456 및 5,736,137호). 리툭시맵은 저급 또는 소포성 B-세포 비-호지킨 림프종 환자의 치료에 추천되는 키메라 항-CD20 모노클로날(MAb)이다(McLaughlinet al.,Oncology(Huntingt)12:1763-1777(1998a);Legetet al.,Curr. Opin. Oncol. 10:548-551(1998)). 유럽에서, 리툭시맵은 재발된 III/IV기 소포성 림프종 치료에 승인되었다(Whiteet al.,Pharm. Sci. Technol. Today2:95-101(1999)). 리툭시맵으로 치료되는 다른 질환으로는, 소포성 중추 세포 림프종(FCC), 외투 세포 림프종(MCL), 광범성 거대 세포 림프종(diffuse large cell lymphoma)(DLCL) 및 소형 림프구성 림프종/만성 림프구성 백혈병(SLL/CLL)이 포함된다(Nguyenet al., 1999). 리툭시맵은 I기 및 II기 임상 연구에서 저급 비-호지킨 림프종(NHL)에 치료 활성이 크고 독성이 최소였다(Berinsteinet al.,Ann. Oncol. 9:995-1001(1998)).
B 세포 NHL을 치료하기 위하여, 재발된 또는 난치성 저급 또는 소포성 NHL의 경우에 일반적으로 주당 375mg/M2의 용량으로 4주간 단독 사용되는 리툭시맵은, 내성이 좋고 임상 활성이 컸다(Piroet al., Ann. Oncol. 10:655-61(1999); Nguyenet al.,Eur.J.Haematol. 62:76-82(1999); 및 Coiffier et al.,Blood92:1927-1932(1998)). 그러나, 항체를 사용한 시험에서, 주당 500mg/M2의 4회 용량까지도투여되었다(Maloneyet al.,Blood90:2188-2195(1997)). 리툭시맵을 CHOP(예를 들어, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손)와 같은 화학요법제와 조합하여 저급 또는 소포성 B-세포 비-호지킨 림프종을 치료하기도 하였다(Czuczmanet al.,J. Clin. Oncol.17:268-76(1999); 및 McLaughlinet al.,Oncology(Huntingt)12:1763-1777(1998)).
II.CD40 및 CD40L
CD40은 성숙한 B 세포의 세포 표면 상에서와, 백혈병 및 림프구성 B 세포 및 호지킨 질병(HD)의 호지킨 및 리드-스턴버그(Reed-Sternberg)(RS) 세포 상에서 발현된다(Valle et al ., Eur. J. Immunol.19:1463-1467(1989); 및 Grusset al.,Leuk. Lymphoma24:393-422(1997)). CD40은 비-호지킨 소포성 림프종과 같은 정상 및 악성종양 B 세포를 활성화하고 생존하도록 하는 B 세포 수용체이다(Johnsonet al.,Blood82:1848-1857(1993)). CD40 수용체를 통한 신호전달은 미성숙 B 세포 및 B 세포 림프종을 IgM- 또는 fas-유도 세포사멸로부터 보호한다(Wanget al.,J.Immunol.155:3722-5(1995)). 유사하게, 외투 세포 림프종 세포는 높은 수준의 CD40을 가지며, 외인성 CD40L을 첨가하면 이의 생존이 개선되고 플루다라빈-유도 세포사멸이 일어나지 않았다(Clodiet al.,Brit. J. Haematol. 103:217-9(1998)). 대조적으로, CD40 자극이 시험관내(Funakoshiet al.,Blood83:2787-2794(1994)) 및 생체내(Murphyet al.,Blood86: 1946-1953(1995))에서 종양 B 세포의 성장을 억제할 수 있는 것으로 보고되었다.
항-CD40 항체는 인간 B-세포 림프종 쥐의 생존을 증가시킨 것으로 보고되었다(Funakoshiet al., (1994); 및 Tuttet al., J. Immunol. 161:3176-3185(1998)). 항-CD40 항체를 사용하여 B 세포 림프종 및 EBV-유도 림프종을 포함하는 종양을 치료하여 C40-CD40L 상호작용을 저해하는 방법이 미합중국 특허 제 5,674,492호(1997) 및 국제 PCT 출원 WO 95/17202호에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 전반적으로 참조 병합되어 있다. CD40 신호는 또한 CD20과의 상호 상승 작용과 관련이 있는 것으로 보고되었다(Ledbetter et al.,Circ. Shock44: 67-72(1994)). 항-CD20 항체의 제조 및 사용을 설명하는 다른 문헌으로는, 미합중국 특허 제 5,874,085호(1999), 5874,082호(1999), 5,801,227호(1998) 및 5,674,492호(1997)가 포함되며, 본 명세서에 전반적으로 참조 병합되어 있다.
CD40 리간드, gp39(CD40 리간드 또는 CD40L)는 휴면 중이 아닌 활성화된 CD4+Th 세포 상에서 발현된다(Spriggset al.,J.Exp.Med.176:1543-1550(1992); Langet al.,Eur. J. Immunol.22: 2573-2578(1992); 및 Royet al.,J. Immunol.151:1-14(1993)). CD40 및 CD40L은 모두 클로닝되었고, 특징지워졌다(Stamenkoviet al., EMBO J.8:1403-1410(1989); Armitageet al.,Nature357:80-82(1992); Ledermanet al.,J. Exp.Med.175: 1091-1101(1992); 및 Hollenbaughet al.,EMBO J.11:4313-4321(1992)). CD40L 유전자로 트랜스펙션되어 이의 표면 상에서 CD40L 단백질을 발현하는 세포는, B 세포 증식을 유발할 수 있으며, 다른 자극 신호와 함께 항체 생성을 유도할 수 있다(armitageet al.,(1992)). CD40L은, 종양 소포 안의 종양 B-세포(CD40+) 또는 호지킨 질병 부위의 리드-스턴버그 세포(CD40+)의 세포 접촉-의존성 상호작용에 있어서 중요한 역할을 할 수 있다(Carboneet al.,Am. J. Pathol.147:912-22(1995)).
항-CD40L 모노클로날 항체는 LP-BM5-감염 마우스에서 쥐의 AIDS(MAIDS) 유도를 억제하기 위하여 효과적으로 사용되었다(Greenet al.,Virology241:260-268(1998)). 항-CD40 항체는 또한 미합중국 특허 제 5,874,082호(1999)와 같은 알러지 및 자가면역 질환과 같은 항체-매개 질병을 치료하거나 예방하기 위하여 제조되었다. 항-CD40 항체는 항-CD20항체와 조합되어 세포 배양액에서 비-호지킨 B 세포 림프종 B 세포 림프종의 성장을 억제하는 부가적인 효과를 갖는 것으로 보고되었다(Benoitet al., (1996)Immunopharmacology35:129-139(1996)). 마우스의 생체내 연구를 통해, 림프종 라인을 일부(전부가 아닌) 갖는 마우스의 생존을 높임에 있어서, 항-CD20 항체는 개별적으로 투여된 항-CD40보다 더 효과적인 것으로 증명되었다(Funakoshiet al.,J. Immunother. Emphasis Tumor Immunol.19:93-101(1996)). 항-CD19는 생체내에서 두가지 유전적 동계 마우스 B 세포 림프종, BCL1 및 A31을 치료하기에도 효과적이다(Tuttet al.,(1998)).
CD40L에 대한 항체는 B 세포 활성화와 관련있는 질환을 치료하기 위하여 사용되는 것으로 기재되어 있다(유럽 특허 제 555,880호(1993)). 항-CD40L 항체에는, 미합중국 특허 제 5,747,037호(1998)에 기재된 바와 같은 모노클로날 항체 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 및 89-79와, 이식편대숙주질환을 치료하기 위하여 사용되는 미합중국 특허 제 5,876,718호(1999)에 기재된 항-CD40L 항체가 포함된다.
III 중추 신경계 암 및 이의 치료
A.일차성 중추 신경계 림프종(PCNSLs)
일차성 중추 신경계 림프종(PCNSL)은 전신성 질병이 아니라 뇌 및 뇌간에 한정되는 림프종으로 정의된다. 이는 중추 신경계에서 생기는 이에 한정되는 비-호지킨 림프종(NHL)에 적용되는 용어이다. 과거에는 이 종양을 소교세포종, 세망 세포 육종 또는 혈관주위 육종이라고도 하였다. 그러나 현재에는, 이의 림프적 기원이 잘 확립되어 있다.
PCNSL은 이전에는 희귀 종양으로, 신장 이식으로 인한 면역억제 또는 비스 코트-알드리치(Wiskott-Aldrich) 증후군과 같은, 일반적으로 선천성, 후천성 또는 의원성 면역 결핍 상태와 관련있는 모든 두개내 종양 중 0.5 내지 1.2%만 해당되었다. PCNSL은 후천성 면역결핍 증후군(AIDS) 환자에게서 가장 많이 발병하는 것으로 보고되었다(이들 중 1.9 내지 6%에서 나타난다)(DeAngelis & PrRACTICE OF ONCOLOGY 2233-2242(DeVitaet al., eds. 1997)). 그러나, 면역저하되지 않은 환자에게서도 PCNSL의 발병이 증가하고 있다.
AIDS 환자에게는 전신성 및 일차성 CNS 비-호지킨 림프종이 모두 발병한다(Krameret al.,Cancer80: 2469-2477(1997)). 또한, 임상, 진단 및 예후적으로 PCNSL에 걸린 AIDS 및 비-AIDS 환자 사이에는 실질적 차이가 있다(Fineet al.,Ann. Intern. Med.119:1093-1104(1993)).
HIV-관련 PCNSL는 공격적인 비-호지킨 림프종(NHL)이며, CNS에만 포함되어 있다. 대부분의 HIV-관련 PCNSL은, 조직학적으로 B 세포 기원의 광범성, 거대 세포 또는 거대 세포 면역아세포 림프종으로 분류된다. 또한, PCNSL의 기원은, 이것이 침윤 비-악성종양 림프구의 두개내 형질전환으로부터 발생하는지, 또는 말초 종양 세포가 CNS 내로만 이동하여 결합하는지에 관하여 논쟁 중인 문제로 남아있다(Moseset al., 1999).
PCNSL 의 최적 치료법은 또한 밝혀지지 않았다(Reniet al.,Ann. Oncol.8:227-234(1997); 및 Lesseret al.,Cancer Treatment. Rev.19:261-281(1993)). AIDS 합병증으로 발생하는 PCNSL은, 이의 위치 및 다병소성으로 인해, 수술로 절제할 수 없는 것이 일반적이다. 이의 전형적인 치료법은 용량 4,000-5,000 cGy의 외부 빔 방사선요법을 포함하는 두개 방사(cranial radiation)였다. 임상 및 방사선사진법이 빠르게 진보되어도, 생존 중앙값(median survival)은 두달 내지 다섯달에 불과하다. 또한, 뇌 전체 방사선 조사 및, 방사선 조사 전에 CHOP(예를 들어, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손) 및 방사선 조사 후에 시타라빈을 포함하는 보조 화학요법을 사용하였으나, 그럼에도 불구하고 많은 환자가 사망하였다(O'Neillet al., Int'l J. Radiation Oncol. Biol. Phys.33:663-673(1995)). 조합된 시타라빈(예를 들어, ARA-C), 메토트렉세이트 및 두개 방사선요법은 방사선요법 단독보다 더 효과적인 것으로 보고되었다(Abreyet al.,J. clin. Oncol.16: 859-63(1998)). 높은 용량의 메토트렉세이트, 류코보린, 티오테파, 빈크리스틴 및 덱사메타손을 조합한 것도 면역저하되지 않은 환자의 치료에 효과적인 것으로 보고되었다(Sandoret al.,J.Clin.Oncol.16:3000-3006(1998)). 오미야 저장소(Ommaya reservoir)를 사용하여 메토트렉세이트 및 시타라빈을 조합투여하면 CNS 침습과 조합된 안내 림프종을 치료하기에 효과적인 것으로 보고되었다(Valluriet al., Retina15:125-9(1995)); PCNSL 환자 중 20%에 안내 침습이 발생함에 따라, 이러한 안내 림프종의 신규한 치료 양식(modalities)은 유용하다(Monjouret al.,Rev. Neurol.(Paris)148:589-600(1992)). 불운하게도, 의원성 백질내종으로 인해 이러한 강력한 치료법은 인지부족이 심각한 것으로 보고되었다. 데이터를 검토하면, 방사선 치료 전에 화학요법을 사용하는 경우, 치매의 위험성이 감소하는 것으로 나타난다(Fineet al.,Annals Intern. Med.119:1093-1104(1993); 및 Blayet al.,J. Clin. Oncol.16:864-871(1998)). 기타 연구에 서는, PCNSL을 치료하기 위하여 화학요법을 단독으로 사용하도록 제안하였다. 혈액-뇌 장벽(blood-brain barrier)을 가로질러 화학요법제의 투과성을 증가시키는 약제를 사용함으로써 화학요법의 효과를 높일 수 있는 것으로 보고되었다(Chenget al., Cancer82: 1946-51(1998)).
그러나, 이와같이 치료법을 선택할 수 있음에도 불구하고, 생존 중앙값은 약 40 개월로 변화가 없다(Abreyet al., J. Clin. Onc.16:859-863(1998)). 또한, 이러한 치료법은, 60세 이상의 환자(100%)에게 심각한 지발성 신경독성의 확정적 및 고정된 위험성이 있다(Abreyet al., "Combination chemotherapy in primary central nervous system lymphoma,"(abstract)Proc. Am. Soc. Clin. Onc.(1999)). 또한, CNS 침습은 전신성 NHL 중 5-29%에서 합병증으로 나타나며, 극도로 중요한 예후와 관련이 있다(Fineet al.,Ann. Intern. Med.119:1093-1104(1993); 및 van Besienet al.,Blood91:1178-1184(1998)).
B.다른 CNS 암 및 이의 치료
다른 CNS 암에는 연수막 전이(LM)와 같이 NHL이 뇌로 전이된 것이 포함된다. LM은 메토트렉세이트 및111인듐-디에틸렌트리아민 펜타아세트산(111In-DTPA)을 혼합한 것을 오미야-내 주입하여 치료되었다(Masonet al.,Meurology50:438-444(1998)). 시타라빈 및 티오테파를 또한 방사선 조사와 조합하여 LM을 치료하였다(Schabetet al.,Nervenarzt63: 317-27(1992)). IV기의 호지킨 질병(HD) 환자에게서도 LM이 진단되었다; 이 환자는 뇌 전체 방사선 조사 및 초내 내 메토트렉세이트를 사용하여 성공적으로 치료된 것으로 보고되었다(Orlowskiet al.,Cancer53:1833-1835(1984)).
모노클로날 항체를 사용하는 것을 포함하여, 일차성 뇌 종양, 뇌 전이 및 연수막 암종증의 현재 치료법은, 불충분하거나 치료 활성이 낮았다. CNS 암을 치료하기 위한 약제로서 모노클로날 항체를 단백질 독소와 결합하는 것이 제안되었다(Youle,Semin. Cancer Biol.7:65-70(1996)). 예를 들어, LM의 동물 모델에서와 같이 항-CD7 리신 A 사슬(DA7)과 같은 면역독소가 보고되었다(Herrlingeret al.,J. Neurooncol.40:1-9(1998)). LMB-7(쥐의 모노클로날 항체 B3 및 절단된 슈도모나스 외독소 PE38로 구성된 단일 사슬 면역독소)을 마우스 모델의 종양 수막염을 치료하기 위하여 사용한 것으로 보고되었다(Pastanet al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA92:2765-2769(1995)).
IV. 뇌로의 약물 전달
어떤 종류의 뇌 종양을 치료하기 위하여 뇌에 치료제를 전달하는 것은 혈액-뇌 장벽(BBB) 때문에 어려움이 있었다. 뇌암의 치료법에는: (1) 가능한 경우에 외과적 처리; (2) 뇌 전체 방사선 요법; (3) 면역저하되지 않은 환자에게 코르티코스테로이드; 및 (4) BBB를 투과할 수 있는 화학요법이 포함된다. 화학요법제 투여는 뇌 간질성 주입(Shin et al., J.Neurosurg. 82:1021-1029(1995))과 같은 모든 주입 경로 또는 초내 투여가 가능하다. 삼투 BBB 파괴법도 대뇌내종양을 치료하기 위하여 디자인되었다(Krollet al.,Neurosurgery42: 1083-99(1998)).
BBB를 침투하는 다른 약제도 개발되었다. 예를 들어, PCNSL을 치료하기 위하여 친지성(lipophilic) 전달 벡터(예를 들어, 프로카바진) 및 고용량 CNS 침투성 약제(예를 들어, 고용량 메토트렉세이트)가 제시되었다(DeAngeliset al.,1997). 최근, 뇌암을 표적화하는데 사용하기 위하여, 래트의 BBB를 통하여 벡터-매개 약물 전달을 가능하도록 하는 모노클로날 항체 OX26의 사용이 제안되었다(Partridgeet al.,Pharm. Res.15:576-82(1998)). OX26 MAb를 사용하여 접합된 펩티드 방사성약물을 뇌에 전달할 수 있는 것으로 보고되었다(Deguchiet al.,Bioconjug. Chem.10:32-37(1999)). 생체 내 BBB를 포함하는 뇌 모세혈관 내피 상의 세포 표면 수용체(예를 들어, 트란스페린 수용체 또는 인슐린 수용체)에 대한 뇌 약물-전달 벡터로서, 다른 모노클로날 항체가 제조된 것으로 보고되었다(Wuet al., Drug. Metabl. Dispos.26:937-9(1998)).
항-종양제인 다우노마이신을 래트 뇌에 전달할 수 있는 것으로 보고된 면역리포좀(항체-지시 리포좀(antibody-directed liposomes))도 제조되었다(Huwyleretal.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA93: 14164-14169(1996)). 생체분자 친지성 복합체도 포유류의 뇌에 활성제를 전달할 수 있는 것으로 보고되었다(미합중국 특허 제 5,716,614호).
따라서, 뇌의 PCNSL 및 다른 B 세포 림프종의 진단 및 치료법은, 이전에 문헌을 통해 보고되었음에도 불구하고 개선의 필요성이 있다. 또한, 본 발명자가 아는 바로는, 중추신경계 림프종 및 수막 재발을 치료하기 위하여, 항-CD20 항원을 초내에 단독 투여하거나, 다른 항암제 또는 항체(예를 들어, 항-CD40 또는 항-CD40L 항체)와 조합하여 투여하는 것은 제안된 바 없다.
본 출원은 2000년 4월 25일자로 출원되어 본 명세서에 참조 병합된 미합중국 가특허출원 제 60/199,365호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은, B 세포 표적에 대한 항체, 예를 들어 항-CD20, 항-CD21, 항-CD22, 항-CD23, 항-CD40 또는 항-CD37 항체, 바람직하게는 항-CD20 항체, 더 바람직하게는 리툭시맵(Rituximab)의 사용하여, 중추 신경계 림프종을 치료 및/또는 예방하고, 수막 재발을 방지하는 방법을 기재한다. 이러한 항-B 세포 항체는 단독으로 사용하거나 다른 항체, 예를 들어 항-CD40L과 같은 B 세포 활성화에 관련된 T 세포에 대한 항체 또는 다른 치료법(예를 들어 화학요법 또는 방사선요법)과 조합하여 사용할 수 있다.
본 발명의 목적은, B 세포 표적에 치료적 유효량의 항체, 예를 들어 항-CD22, 항-CD21, 항-CD23, 항-CD37, 항-CD40, 및 항-CD20 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 림프종 환자의 수막 재발을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은, 치료적 유효량의 B 세포에 대한 항체 또는 B 세포 활성화에 영향을 주는 항체, 예를 들어 항-CD 21, 항-CD22, 항-CD23, 항-CD40, 항-CD40L, 또는 항-CD20 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는, 중추 신경계(CNS) 림프종의 치료 방법을 제공하는 것이다. 치료의 표적이 되는 CNS 림프종에는: 일차성 CNS 림프종, (PCNSL) 연수막 전이(LM) 또는 CNS 침습된 호지킨 질병이 포함된다.
본 발명의 목적은 특히, 인간 항체, 인간화 항체, 이특이적(bispecific) 항체 또는 키메라 항체인 항-B 세포 항체를 사용하여 CNS 림프종을 치료하는 것이다.예를 들어 Fab, Fab' 및 F(ab')2와 같은 항-CD20, 항-CD21, 항-CD22, 항-CD23, 항-CD40 또는 항-CD40L 항체 단편을 사용하여 CNS 림프종을 치료하는 것을 생각할 수 있다.
본 발명의 더 바람직한 목적은 리툭시맵을 항-CD20 항체로 사용하여 CNS 림프종을 치료하는 것이다. 항-CD20 항체를 바람직하게는 실내(intraventrically) 또는 초내에 주당 약 10mg 내지 약 375mg/M2의 용량으로 4주간 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 항-CD20 항체를, (1) 항-CD40 항체 또는 다른 B 세포 결합 항체, (2) CD40L 길항제, (3) 화학요법제 또는 약제, 및/또는 (4) CNS 림프종 치료용 항-B 세포 항체 중 어떤 하나 이상과 조합하여 투여하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항-B 세포 항체, 예를 들어 항 CD20 항체 또는 아래 확인된 다른 B 세포 표적에 대한 항체를, 방사성 동위원소와 결합하여, CNS 림프종을 치료 또는 진단하는 것이다. 항-CD20 항체 또는 다른 항-B 세포 항체를211At,212Bi,67Cu,123I,131I,111In,32P,212Pb,186Re,188Re,153Sm,99mTc, 또는90Y에 결합시킬 수 있으며, 치료 목적으로 투여하는 경우, 방사선면역요법적 유효량으로 환자에게 투여한다.
본 발명의 또다른 목적은, (A) 검출가능한 표지에 결합된 B 세포에 대한 항체, 항-CD20 항체 또는 항-CD20 항체 단편을 환자에게 투여하는 단계; 및 (B) 상기 표지의 위치를 검출하는 단계를 포함하여 이루어지는, 환자에게서 PCNSL과 같은 CNS 림프종을 진단하는 방법이다.
CNS 림프종을 치료하기 위하여 투여하는 조성물은, 뇌 혈액 장벽(BBB) 투과성 증진 약제와 조합하거나, 이와 결합시킬 수 있다.
I 정의
"CNS 림프종"은 중추신경계(CNS)의 모든 B 세포 림프종을 의미한다. 여기에는 호지킨 질병(ND) 림프종, 비-호지킨 림프종(NHL), 연수막 전이 및 일차성 CNS 림프종("PCNSL")이 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 "항체"라는 용어는, 완전한, 손상되지 않은 항체, 이의 Fab 단편, Fv, scFv 및 F(ab)2단편을 의미한다. 완전한, 손상되지 않은 항체에는 쥐의 모노클로날 항체(mAb)와 같은 모노클로날 항체, 키메라 항체, 영장류화 항체(primatized antibodies), 인간화 항체 및 인간 항체가 포함된다. 항체의 제조 및 완전한, 손상되지 않은 항체, Fab 단편 및 F(ab)2단편의 단백질 구조 및 이러한 분자를 암호화하는 유전자 서열의 구성은 주지되어 있으며, 예를 들어 문헌(Harlowet al., ANTIBODIES:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988))에 기재되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조 병합되어 있다.항체(예를 들어, 항-CD20, 항-B 세포 항체 등)는 면역독소 또는 이특이적 항체 형태의 완전한, 손상되지 않은 항체의 형태일 수 있다.
"항-CD40 항체"에는 CD40 단백질 또는 이의 펩티드 또는 CD40 융합 단백질과 특이적으로 반응하는 면역글로불린 및 이의 단편이 포함된다. 항-CD40 항체에는 인간 항체, 키메라 항체, 이특이적 항체 및 인간화 항체가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 "B 세포 표면 마커" 또는 "B 세포 표적" 또는 "B 세포 항원"은, 이에 결합하는 길항제를 사용하여 표적화 가능한 B 세포 표면 상에 발현되는 항원이다. 대표적인 B 세포 표면 마커에는, CD10, CD14, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CD75, CD76, CD77, CD78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 및 CD86 백혈구 표면 마커가 포함된다. 특히 관심있는 B 세포 표면 마커는, 포유류의 다른 비-B 세포 조직과 비교하여 B 세포 상에서 우선적으로 발현되며, 전구체 B 세포 및 성숙한 B 세포 모두에서 발현될 수 있는 것이다. 바람직한 실시형태에서, B 세포 마커는 CD19, CD20 또는 CD22를 사용하며, B 세포 상에서 줄기 세포 단계로부터 플라즈마 세포로 최종 분화되기 직전의 시점까지 혈통 분화 전반에 걸쳐 발견된다. 가장 바람직한 B 세포 마커는 CD20이다.
"B 세포에 대한 항체" 또는 "B 세포 항체"는 예를 들어 아래 확인되는 것과 같은 B세포 상의 항원과 특이적으로 결합하는 항체이다.
"B 세포 길항제"는, B 세포 표면 마커에 결합시, 예를 들어 B 세포에 의한 체액 반응을 감소시키거나 방지함으로써, 포유류의 B 세포를 파괴하거나 고갈시키거나 및/또는 하나 이상의 B 세포 기능을 방해하는 분자이다. 길항제는, 길항제로 치료된 포유류에서 B 세포를 고갈시킬 수 있는 것(즉, 순환 B 세포 수준을 감소시킬 수 있는 것)이 바람직하다. 이러한 고갈은, 항체-의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC), B 세포 증식 억제 및/또는 B 세포 치사 유도(예를 들어, 세포사멸을 통해)와 같은 다양한 메카니즘을 통해 가능하다. 본 발명의 범위에 포함되는 길항제에는, B 세포 마커에 결합되고, 선택적으로 세포독성제와 접합되거나 이에 융합되는 항체, 합성 또는 자연 서열 펩티드 및 소형 분자 길항제가 포함된다. 바람직한 길항제에는 항체, 더 바람직하게는 B 세포 고갈 항체가 포함된다.
"항-CD40L 항체"에는 CD40L 단백질 또는 이의 펩티드 또는 CD40L 융합 단백질과 특이적으로 반응하는 면역글로불린 및 이의 단편이 포함된다. 항-CD40L 항체에는 인간 항체, 키메라 항체, 이특이적 항체 및 인간화 항체가 포함될 수 있다.
"항-CD20 항체"에는 CD20 단백질 또는 이의 펩티드 또는 CD20 융합 단백질과 특이적으로 반응하는 면역글로불린 및 이의 단편이 포함된다. 항-CD20 항체에는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이특이적 또는 삼특이적 항체가 포함될 수 있다. 바람직한 항-CD20 항체는 리툭시맵이다.
"B 세포 고갈 항체"는, 치료를 위해 투여되는 경우, 항체가 투여된 환자의 B 세포수를 고갈시키는 모든 항체(키메라 및 인간화 항체를 포함) 또는 이의 단편 또는 면역독소를 의미한다. 이러한 B 세포 고갈 항체에는 예를 들어, 상기 확인된 B 세포 항원 중 어느 것과 결합하는 항체가 포함되나, 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 항-CD20 항체, 항-CD19 항체, 항-CD22 항체, 항-CD38 항체(예를 들어, OKT10 항체, Flavellet al.,Int. J. Cancer62:337-44(1995) 참조) 및 항-주 조직적합성 복합체(MHC) II 항체(Illidgeet al.,Blood94:233-43(1999) 참조)가 포함된다. B 세포 고갈 항체는 항-CD20 항체가 바람직하다. B 세포 고갈 항체는, 독성제에 결합된 면역독소로서, 치료 동위원소에 결합된 방사성 형태, 전체 항체또는 이의 단편(예를 들어, Fab')과, B 세포 고갈 항체의 키메라 항체 및 인간화 항체가 될 수 있다.
"항-CD19 항체"는 B 세포상에 발현되는 CD19 항원을 인식하고 이에 결합하는 모든 항체 또는 이의 단편 또는 면역 독소를 의미한다. 바람직한 항-CD19 항체는 환자에게서 B 세포를 치료적으로 고갈시키거나, B 세포가 다른 약제에 더 민감해지도록 만들거나 세포 수명을 줄이는 방식으로 B 세포에 작용할 수 있는 항체이다. 특이적 항-CD19 항체에는 모노클로날 항체 HD37(Ghetieet al., Clin.Cancer Res.5:3920-7(1999)참조), 모노클로날 항체 B43 또는 이의 유도된 단일 사슬 Fv(VFS191)(Liet al.,Cancer Immunol. Immunother.47:121-30(1998) 참조), 모노클로날 쥐 항체 HD37(Stoneet al.,Blood88:1188-97(1996)) 및 단일 사슬 Fv(scFv) 항체 단편 FVS192(Bejceket al.,Cancer Res. 55:2346-51(1995))가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
"항-CD22 항체"는 B 세포상에 발현되는 CD22 항원을 인식하고 이에 결합하는 모든 항체 또는 이의 단편 또는 면역 독소를 의미한다. 바람직한 항-CD22 항체는 환자에게서 B 세포를 치료적으로 고갈시키거나, B 세포가 다른 약제에 더 민감해지도록 만들거나 세포 수명을 줄이는 방식으로 B 세포에 작용할 수 있는 항체이다. 특이적 항-CD22 항체에는 인간화 항-CD22 항체 hLL2(Behret al.,Clin.Cancer Res.5:3304s-14s(1998)), 모노클로날 항체 OM124(Bolognesiet al., Br. J. Haematol.101:179-88(1998)) 및 항-CD22 IgG1항체 RFB4 및 이의면역독소(Mansfieldet al.,Bioconjug. Chem.7:557-63(1996))가 포함되나, 이에 제한되지 않는다
"이특이적 항체"는 하나의 항원에 특이적인 하나의 항원-결합 부위 및 다른 항원에 특이적인 다른 항원-결합 부위를 갖는 항체 분자를 의미한다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는, Fc 수용체(FcRs)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(즉, 자연살해(Natural Killer(NK)) 세포, 호중구, 마크로파지)가 표적 세포 상에 결합되어 있는 항체를 인식한 후, 표적세포를 용해하는 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC, NK 세포를 매개하는 일차성 세포는 FcyRIII만을 발현하며, 단핵구는 FcyRI, FcyRII 및 FcyRIII을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌(kinet,Annu. Rev. Immunol9:457-92(1991)) 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미합중국 특허 제 5,500,362호 또는 5,821,337호에 기재된 바와 같이 시험관내 ADCC 분석을 실시할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 효과기 세포에는 말초혈액 단핵세포(PBMC) 및 자연살해(NK)세포가 포함된다. 이와 달리, 또는 추가적으로, 관심있는 분자의 ADCC 활성을 생체내에서, 예를 들어 문헌(Clynes et al. PNAS(USA) 95:652-656(1998))에 기재된 것과 같은 동물모델에서 평가할 수 있다.
"인간 효과기 세포"는 하나 이상의 FcRs를 발현하여 효과기 작용을 하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이 세포는 적어도 FcyRIII를 발현하며, ADCC 효과기 기능을 갖는다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는, 말초혈액 단핵 세포(PBMC), 자연살해(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되며; PBMCs 및 NK세포가 바람직하다.
"Fc 수용체" 또는 "FCR" 이라는 용어는 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 나타내기 위하여 사용한다.
바람직한 FcR은 자연 서열 인간 FcR이다. 또한, 바람직한 FcR는 IgG항체(감마 수용체)와 결합하는 FcR로, FcyRI, FcyRII 및 RcyRIII 서브 클래스 수용체가 포함되며, 대립형질 변형체 및 이와 달리 이러한 수용체의 스플라이싱된 형태가 포함된다. FcyRII 수용체에는, FcyRIIA("활성화 수용체") 및 FcyRIIB("저해 수용체")가 포함되며, 이들은 본질적으로 세포질 도메인에서 상이한 유사 아미노산 서열을 갖는다. 활성화 수용체 FcyRIIA 는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-계 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 저해 수용체 FcyRIIB는 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-계 저해 모티프(ITIM)를 함유한다. (Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234(1997) 참조). FcRs는 문헌(Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34(1994) and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995))에 기재되어 있다. 앞으로 확인될 것들을 포함한 다른 FcRs는 본 명세서에서의 "FCR"이라는 용어에 포함된다. 이 용어는 또한, 어머니 IgGs가 태아로 전달되도록 하는 신생아 수용체, FcRn를 포함한다(Guyer et al., J. Immunol. 117:587(1976) and Kim et al., J. Immunol.24:249(1994)).
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재 하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 의미한다. 보체 활성화 경로는 동계 항원과 복합된 분자(예를 들어 항체)에, 보체 시스템(Clq)의 제 1 성분이 결합함으로써 개시된다. 보체 활성을평가하기 위하여, CDC 분석(예를 들어 Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163(1996)을 실시할 수 있다.
"성장 저해" 길항제는, 이 길항제가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 방해하거나 감소시키는 길항제이다. 예를 들어, 이 길항제는 세포내 및/또는 시험관내에서 B 세포의 증식을 방해하거나 감소시킬 수 있다.
"세포사멸을 유도하는" 길항제는, 애넥신 V 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체 팽창, 세포 단편화, 및/또는 막 베지클(세포사멸체라 함) 형성과 같은 표준 세포사멸 분석으로 측정할 때 예를 들어 B 세포의 계획된 세포 사망을 유도하는 길항제이다.
"항체 단편"은 손상되지 않은 항체의 일부를 포함하여 이루어지며, 바람직하게는 이의 항원-결합 또는 가변영역을 포함하여 이루어진다. 항체 단편의 예로는, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 다이어바디(diabodies); 선형 항체; 단일사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로 형성된 다중특이적 항체가 포함된다.
"자연 항체(native antibodies)"는 일반적으로 두개의 동일한 경쇄(L) 및 두개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유 디술파이드 결합으로 중쇄에 결합되나, 다른 면역글로불린 아이소타입의 중쇄에서 디술파이드 결합의 수는 달라진다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 간격이 규칙적인 사슬내 디술파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단에 가변 도메인(VH)을 가지고, 다수의 불변 도메인이 이어져있다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단(VL)에 가변 도메인 및 다른쪽 말단에 불변 도메인을 가지며;경쇄의 불변도메인은 중쇄의 제 1 불변도메인과 일렬로 있고, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 일렬로 있다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 간에 계면을 형성하는 것으로 생각된다.
"가변"이라는 용어는, 가변 도메인의 어떤 부분이, 항체간에 서열이 크게 다르고, 이의 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 특이성 및 결합에 이용된다는 사실을 의미한다. 그러나, 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 가변성이 골고루 분배되어 있지 않다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에서 과가변 영역으로 불리는 세 부분에 집중되어 있다. 가변 도메인 중 더 많이 보존된 부분은 골격 영역(Framework regions)(FRs)으로 불린다. 자연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 주로 P-시트 구조를 가지며 세개의 과가변 영역에 연결되어 있는 네개의 FRs를 포함하여 이루어지고, 이는 루프연결을 형성하며, 경우에 따라 3-시트 구조부의 일부를 형성한다. 각 사슬의 과가변 영역은 근방에 FRs가 함께 있으며, 다른 사슬로부터의 과가변 영역과 함께 항체의 항원-결합 부위를 형성한다(Kabatel al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Sevice, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합과 직접적인 관련이 없으나, 항체 의존성 세포 세포독성(ADCC)에서의 항체 관여와 같은 다양한 효과기 작용을 한다.
항체를 파파민으로 분해하면, "Fob" 단편이라 불리며 각각 단일 항원-결합 부위를 갖는 두개의 동일한 항원-결합 단편과, 그 명칭으로 쉽게 이의 결정화 능력을 알 수 있는 잔류 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신 처리로 두개의 항원-결합 부위를가지며 쉽게 항원과 가교결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 얻는다.
"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 부위를 갖는 최소 항체 단편이다. 이 영역은, 단단하게 비공유 결합되어 있는 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인을 갖는 다이머로 구성된다. 이 구조에서, 각 가변 도메인의 세 과가변 영역은 상호작용을 통하여, VH-VL 다이머 표면 상의 항원-결합 부위를 형성한다. 집합적으로, 여섯개의 과가변 영역은 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 세개의 과가변 영역만을 포함하여 이루어지는 Fv의 반)조차도, 전체 결합 부위보다는 친화도가 낮을지라도, 항원을 인식하여 결합하는 능력을 가진다.
Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제 1 불변 도메인(CHI)을 포함한다. Fab' 단편은, 항체 힌지(hinge) 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CHI 도메인의 카복시 말단에 잔기 몇개가 첨가되어 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 본 명세서에서, 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 Fab'를 나타낸다. F(ab')Z 항체 단편은 원래, 그 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편쌍들로 형성되었다. 항체 단편이 다른 화학적 커플링이 된 것도 알려져 있다.
어떤 척추동물 종의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는, 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(x) 및 람다(k)로 불리는 두가지 명백히 다른 형태중 하나로 지정될 수 있다.
중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 항체는 다른 클래스로 지정될수 있다. 손상되지 않은 항체의 다섯가지 주 클래스:IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 있으며, 이들 중 몇가지는 서브 클래스(아이소타입), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 세분될 수 있다. 다른 항체 클래스에 대응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 a, 8, s, y, 및 R로 불린다. 다른 면역글로불린 클래스의 서브유닛 구조 및 3차원 구조는 주지되어 있다.
"단일 사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하여 이루어지며, 이들 도메인은 단일 폴리펩티드 사슬로 존재하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는, scFv가 항원결합에 필요한 구조를 형성하도록 하는 폴리펩티드 링커를 VH 및 VL 도메인 사이에 더 포함하여 이루어진다. scFv를 검토하기 위해서는 문헌(Pluckthun inThe Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg and Moore, eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315(1994))을 참조한다.
"다이어바디"라는 용어는, 두 개의 항원-결합 부위를 갖는 소형 항체 단편을 의미하며, 이 단편은 동일한 폴리펩티드 사슬(VH-VL) 내에 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결되어 있는 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함하여 이루어진다. 너무 짧아 동일한 사슬 상의 두 도메인 간에 쌍을 이루어주기 어려운 링커를 사용하여, 도메인이 다른 사슬의 상보적 도메인과 쌍을 이루어, 두개의 항원 결합 부위를 형성하도록 한다. 다이어바디는 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 문헌(Hollingeret al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA.90:6444-6448(1993))에 더 자세히 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 "모노클로날 항체"라는 용어는, 실질적으로 동종 항체 집단으로부터 얻어지는 항체를 의미하며, 즉 이 집단을 구성하는 개별 항체들은, 소량 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이고, 단일 항원 부위에 대하여 지정된다. 또한, 일반적으로 다른 결정기(에피토프)에 대한 다른 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와 달리, 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정기에 대한 것이다. 모노클로날 항체는 특이성에 추가적으로, 하이브리도마 배양으로 합성되어 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는다는 점에서 유리하다. 수식어 "모노클로날"은, 실질적으로 동종 집단의 항체로부터 얻어지는 항체의 특징을 나타내며, 어떤 특정한 방법으로 항체를 제조해야 함을 의미하지 않는다. 예를들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 먼저 문헌(Kohler et al., Nature, 256:495(1975))에 기재된 하이브리도마법으로 만들거나, 재조합 DNA 법을 사용하여 만들 수 있다(미합중국 특허 제 4,816,567호 참조). "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌(Clacksonet al., Nature,352:624-628(1991) and Markset al., J.Mol. Biol.,222:581-597(1991))에 기재된 방법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리할 수 있다.
본 명세서에서 모노클로날 항체에는 구체적으로, 원하는 생물학적 활성을 보이기만 한다면, 중쇄 및/또는 경쇄 중 일부가, 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브 클래스에 속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 동종이고, 사슬(들)의 잔부가, 다른 종에서 유래하거나 다른 항체 클래스 또는 서브 클래스에속하는 항체의 대응하는 서열과 동일하거나 동종인 "키메라(chimeric)" 항체(면역글로불린)와 이러한 항체의 단편이 포함된다(미합중국 특허 제 4,816,567호; Morrisonet al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 81:6851-6855(1984)). 본 명세서에서 관심있는 키메라 항체에는, 비-인간 영장류(예를 들어, 비비, 뱅골원숭이, 시노몰구스 원숭이와 같은 구세계 원숭이)에서 유래한 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열(미합중국 특허 제 5,693,780호)을 포함하여 이루어지는 "영장류화(primatized)" 항체가 포함된다.
비-인간(예를 들어 쥐) 항체의 "인간화" 형태는, 비-인간 면역글로불린에서 유래한 최소 서열을 갖는 키메라 항체이다. 대부분, 인간화 항체는, 수혜자의 과가변 영역으로부터의 잔기가, 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간 영장류와 같은 비-인간 종(공여자 항체)의 과가변 영역으로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이다. 몇가지 예에서, 인간 면역글로불린의 골격 영역(FR) 잔기는 대응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 또한, 인간화 항체는, 수혜자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함하여 이루어질 수 있다. 이들 변형으로 항체 성능을 더 정제할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는, 하나 이상, 일반적으로 두 개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하여 이루어지며, 과가변 루프의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로불린의 것에 대응하며, FRs의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 서열의 것이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린의 것을 포함하여 이루어진다. 더상세하게는 문헌(Joneset al.,Nature321:522-525(1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329(1988); and Presta,Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596(1992))을 참조한다.
본 명세서에서 사용되는 "과가변 영역"이라는 용어는, 항원-결합을 가능하도록 하는 항체의 아미노산 잔기를 의미한다. 과가변 영역은, "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"으로부터의 아미노산 잔기(예를 들어 경쇄 가변 도메인의 잔기 24-34 (LI), 50-56(L2) 및 89-97(L3)와 중쇄 가변 도메인의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); Kabatet al., Sequence of Proteins of Immunological Interest,5th Ed. Public Health Service., National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 및/또는 "과가변 루프"로부터의 이러한 잔기(예를 들어 경쇄 가변 도메인의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3)와 중쇄 가변 도메인의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); Chothia and Lesk J. Mol.Biol.196:901-917(1987))를 포함하여 이루어진다. "골격" 또는 "FR" 잔기는, 본 명세서에 정의된 바와 같은 과가변 영역 잔기를 제외한 가변 도메인 잔기이다. B 세포 표면 마커와 같은 관심있는 항원과 "결합하는" 길항제는, 이 길항제가 항원 발현 세포를 표적화하는 치료제로서 유용하도록, 충분한 친화도 및/또는 결합성(avidity)을 갖는, 그 항원과 결합할 수 있는 길항제이다.
CD20 항원과 결합하는 항체의 예로는: "리툭시맵(Rituximab)"("RITUXAN")이라 불리는 "C2B8"(미합중국 특허 제 5,736,137호, 본 명세서에 참조 병합); "Y2B8"로 명명된 이트륨-[90]-표지 2138 쥐 항체(미합중국 특허 제 5,736,137호,본 명세서에 참조 병합); 선택적으로 131I로 표지되어 "131I-B1" 항체(BEXXARTM)를 생성하는 쥐의 IgG2a "131"(미합중국 특허 제 5,595,721호, 본 명세서에 참조 병합); 쥐의 모노클로날 항체 "1F5"(Press et al. Blood69(2); 584-591(1987)); "키메라 2H7" 항체(미합중국 특허 제 5,677,180호, 본 명세서에 참조 병합); 및 국제 백혈구 타이핑 워크샵에서 입수가능한 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1133, B-Cl 또는 NU-B2(Valentineet al., In:Leukocyte Typing III(McMichael, Ed., p.440, Oxford University Press(1987)))가 포함된다. CD19 항원과 결합하는 항체의 예로는, 문헌(Hekmanet al., Cancer Immunol. Immunother.32:364-372(1991) 및 Vlasveldet al. Cancer Immunol. Immunother.40:37-47(1995))의 항 CD19 항체; 및 문헌(Kieselet al. Leukemia Research11, 12:1119(1987))의 B4 항체가 포함된다.
본 명세서에서 "리툭시맵" 또는 "RITUXAN"는, 미합중국 특허 제 5,736,137호(본 명세서에 참조 병합)에서 "C2B8"로 명명된 CD20 항원에 대한 유전적으로 조작된 키메라 쥐/인간 모노클로날 항체를 의미한다. 이 항체는, 쥐의 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열과 인간 불변 영역 서열을 포함하는 IgG, 카파 면역글로불린이다. 리툭시맵은 약 8.OnM의 CD20 항원에 대한 결합 친화도를 갖는다.
"분리된" 길항제는, 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 것이다. 자연 환경의 오염 성분은 길항제의 진단 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이며, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질이 포함될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 길항제는 (1) 로리(Lowry) 법으로 측정시 길항제의 95 중량%이상, 가장 바람직하게는 99 중량% 이상이 되도록, (2) 스피닝 컵 서열확인기(sequenator)를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15 잔기 이상을 얻기에 충분한 정도로, (3) 코마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원성 또는 비환원성 조건하에 SDS-PAGE에 의해 동종으로 정제된다. 길항제의 자연 환경 성분은 하나 이상 존재하지 않으므로, 분리된 길항제에는, 재조합 세포 내 원위치의 길항제가 포함된다. 그러나, 통상적으로, 분리된 길항제는 하나 이상의 정제 단계로 제조한다. 치료 목적의 "포유류"는 인간, 가축 및 사육동물, 및 동물원, 스포츠용 또는 애완용 동물(예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등)을 포함하는 포유류로 분류되는 어떤 동물을 의미한다. 바람직하게는 포유류는 인간이다.
"치료"는 치료적 처치 및 예방 또는 방지 조치를 모두 의미한다. 치료가 필요한 경우로는, 질환 또는 질병에 이미 걸린 경우와, 질병 또는 질환이 예방되어야 하는 경우가 포함된다. 따라서, 포유류는 질병 또는 질환을 갖는 것으로 진단되었거나, 질병에 걸리기 쉽거나 쉽게 감염되는 경우가 가능하다.
"치료적 유효량"이라는 표현은, 당해 자가면역 질환을 방지, 호전 또는 치료하기에 유효한 길항제의 양을 의미한다. 본 명세서에서 부가 치료를 위하여 사용되는 "면역억제제"라는 용어는, 치료하려는 포유류의 면역 체계를 억제하거나 차폐하는 작용을 하는 물질을 의미한다. 여기에는, 사이토카인 제조를 억제하거나, 자가-항원 발현을 하향조정 또는 억제하거나, MHC 항원을 차폐하는 물질이 포함된다.
이러한 약제의 예로는, 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘(미합중국 특허 제 4,665,077호, 본 명세서에 참조 병합 개시); 아자티오프린; 사이클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 댑손; 글루타르알데하이드(이는 MHC 항원을 차폐하며, 미합중국 특허 제 4,120,649호에 기재되어 있다); MHC 항원 및 MHC 단편의 항-유전자형 항체; 사이클로스포린 A; 예를 들어 프리드니손, 메틸프레드니손, 및 덱사메타손과 같은 글루코코르티소스테로이드 등의 스테로이드; 항-인터페론-y, -3, 또는 -a 항체, 항-종양괴사 인자-a 항체, 항-종양괴사 인자-i 항체, 항-인터류킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체를 포함하는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 길항제; 항-CD 11a 및 항-CD18 항체를 포함하는 항-LFA-1 항체; 항-L3T4 항체; 이형 항-림프구 글로불린; pan-T 항체, 바람직하게는 항 CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3- 결합 도메인을 포함하는 가용성 펩티드(WO 90/08187호, 7/26/90 공개); 스트렙토키나제; TGF-0; 스트렙토도나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체(Cohen et al., 미합중국 특허 제 5,114,721호); T-세포 수용체 단편(Offner et al., Science 251:430-432(1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature, 341:482(1989); 및 WO 91/01133); TLOB9와 같은 T 세포 수용체 항체(EP 340,109)가 포함된다.
본 명세서에 사용되는 "세포독성제"라는 용어는 세포의 기능을 저해 또는 방해하거나 및/또는 세포를 파괴하는 물질을 의미한다. 이 용어에는 방사성 동위원소(예를 들어, I131, Y90, Ar211, P32, Re188, Re186, Sm153, B212등), 화학요법제 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 또는 저분자 독소와 같은 독소와, 이의 단편이 포함된다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예로는, 티오테파 및 사이클로포스파미드(CYTOXANTM)와 같은 알킬화제; 부술판, 임프로술판 및 피포술판과 같은 알킬 술포네이트; 벤조도파, 카보쿠온(carboquone), 메투레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드 및 트리메틸로로멜라민을 포함하는 에틸렌이미드 및 메틸아멜라민; 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜파란, 노벰비에힌(novembiehin), 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드와 같은 질소 머스터드; 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로스우레아; 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신(authramycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신(calicheamicin), 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모이나이신(chromoinycins), 닥티노마이신, 다우노루비신(daunorubicin), 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이담비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생물질; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)와 같은 항-대사산물; 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트와 같은 엽산 유사체; 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모퍼, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘(floxuridine), 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄과 같은 항-아드레날; 프롤린산과 같은 엽산 보충물; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 나이트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK; 라족산; 시조프란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀(TAXOLO, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁셀(TAXOTEW, Rh6ne-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 겜시타빈(gemcitabine); 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 플라티늄 유사체; 빈플라스틴; 플라티늄; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈(navelbine); 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크엘로다(xeloda); 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기된 어떤 것의약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 이러한 정의에는, 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(Fareston)과 같은 항-에스트로겐; 및 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 상기된 것 어떤 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체와 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 저해하는 항-호르몬제도 포함된다.
"사이토카인"이라는 용어는, 한 세포 집단에 의해 배출되어 세포간 매개물로서 다른 세포 상에 작용하는 단백질에 대한 유전 용어이다. 이러한 사이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인, 및 통상적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인에는, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬, 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 파라티로이드 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신; 프로렐락신; 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상성 자극 호르몬(TSH), 및 루테인화 호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토겐; 종양 괴사 인자-a 및 -O; 뮐러(mullerian)-억제 물질; 마우스 고나도트로핀-관련 펩티드; 인히빈; 악티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린;트롬보포이에틴(TPO); NGF-P와 같은 신경 성장 인자; 혈소판 성장 인자; TGF-a 및 TGF-0와 같은 형질전환 성장 인자(TGFs); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론-a, -P 및 -y와 같은 인터페론; 마크로파지-CSF(M-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자(CSFs); 과립구-마크로파지-CSF(GM-CSF); 및과립구-CSF(GCSF); IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15와 같은 인터류킨(ILs); TNF-a 또는 TNF-P와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본 명세서에 사용되는 사이토카인이라는 용어는 단백질을 자연 공급원 또는 재조합 세포 배양액 및 자연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물을 포함한다.
본 출원의 "약물 전구체(prodrug)"라는 용어는, 모약물에 비해 종양 세포에 대한 세포독성이 적으며, 효소로 활성화되거나 활성이 더 큰 모형태(parent form)로 전환가능한, 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형체를 의미한다. 문헌(예를 들어, Wihnan, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast(1986) and Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp.247-267, Humana Press (1985))을 참조한다. 본 발명의 약물 전구체에는 포스페이트-함유 약물 전구체, 티오포스페이트-함유 약물 전구체, 술페이트-함유 약물 전구체, 펩티드-함유 약물 전구체, D-아미노산-변형 약물 전구체, 글리코실화된 약물 전구체, (3-락탐-함유 약물 전구체, 선택적으로 치환된 페녹시아세트아미드-함유 약물 전구체 또는 선택적으로 치환된 페닐아세트아미드-함유 약물 전구체, 5 플루오로시토신 및 다른 활성이 더 큰 세포독성 유리 약물로 전환가능한 5-플루오로우리딘 약물 전구체가 포함되며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 약물 전구체 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는, 상기된 화학요법제가 포함되며, 이에 제한되지 않는다.
"리포좀"은, 포유류에 약물(본 명세서에 개시된 길항제 및 선택적으로 화학요법제 등)을 전달하기에 유용한, 다양한 형태의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성되는 소형 베지클이다. 리포좀의 성분은 일반적으로, 생물 막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다. "패키지 삽입물"이라는 용어는, 시판 치료제품 패키지에 통상적으로 포함되어 있는 설명서를 나타내기 위하여 사용하며, 여기에는 이러한 치료제품의 사용과 관련있는 지시사항, 용도, 용량, 투여법, 금기사항 및/또는 유의사항에 대한 정보가 들어 있다.
"치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량" 또는 "투여 유효량"은, CNS 림프종 진행을 저해하는 약제의 양을 의미한다. 이러한 저해는, 림프종의 존재가 검출불가능하게 되는 완전 반응 또는 부분 반응이 될 수 있다. 투여가 쉽고 용량이 일정한 투여 단위 형태로 비경구적 조성물을 조성하는 것이 특히 유리하다. 본 명세서에서 "투여 단위 형태"란 치료해야 하는 포유류 환자에게 단일 투여하기 적합한, 물리적으로 분리된 단위를 의미한다; 소정량의 활성 화합물을 함유하는 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 결합하여 원하는 치료 효과를 갖도록 계산한다. 본 발명의 투여 단위 형태는 구체적으로: (A) 활성 화합물의 독특한 성질 및 필요로 하는 특정한 치료 효과; 및 (B) 이러한 활성 화합물을 혼합하여 개인의 감수성을 치료하는 기술 분야에 있어서의 제한사항에 따라 직접적으로 달라진다.
"방사선면역요법적 유효량"이란, CNS 림프종 치료를 위하여 환자에게 투여되는 경우, CNS 림프종을 완전히 또는 부분적으로 경감시키는 방사성 동위원소에 결합된 항-CD20 항체의 양을 의미한다. 전형적으로, 논의되는 어떤 항체라도 300 내지 1500mg/m3의 용량 범위로 투여한다.
"약제학적 부형제"는, 적당하거나 편리한 투여 형태를 제조하기 위하여 활성 약물, 약제 또는 항원과 결합되는 모든 불활성 물질을 의미한다.
"면역원성"이란, 환자에게 투여시 면역 반응(예를 들어 체액성 또는 세포성)을 일으키는 표적 단백질 또는 치료 잔기의 능력을 의미한다.
II. 길항제의 제조
본 발명의 제조 방법 및 제조 물품은, 예를 들어 CD20, CD19, CD21, CD22, CD40 등과 같은 B 세포 표면 마커에 결합하는 길항제를 사용하거나 포함한다. 따라서, 이러한 길항제를 제조하는 방법을 여기서 설명하고자 한다. 길항제를 제조 또는 스크리닝하는데 사용되는 B 세포 표면마커 또는 사이토카인은 예를 들면 원하는 에피토프를 포함하는 항원 또는 그 일부의 가용성 형태일 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 그 세포표면에서 B 세포 표면마커를 발현하는 세포는 길항제를 생성하거나 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 길항제를 생성하는데 유용한 다른 형태의 B 세포 표면마커는 당업자가 잘 알 것이다. 바람직하게는, B 세포 표면표지는 CD19 또는 CD20 항원이다.
바람직한 길항제는 항체이지만, 항체가 아닌 길항제도 본 명세서에서 고려된다. 예를 들면, 길항제는 세포독성제(본 명세서에서 설명된 것과 같은)와 선택적으로 융합되거나 접합된 소형 분자 길항제를 포함할 수 있다. 소형분자의 라이브러리는 그 항원에 결합하는 소형분자를 확인하기 위하여 본 명세서에서 관심있는 B 세포 표면마커에 대해 스크리닝될 수 있다. 소형분자는 그 길항특성에 대해 추가로 스크리닝되거나 및/또는 세포독성제와 접합될 수 있다.
길항제는 또한 합리적 설계에 의해 또는 파지 디스플레이에 의해 생성된 펩티드일 수도 있다(예를 들면 1998년 8월 13일에 공개된 WO98/35036을 참조). 일실시형태에서, 선택된 분자는 항체의 CDR에 기초하여 디자인된 "CDR 유사체" 또는 항체 유사체일 수 있다. 그러한 펩티드는 그 자체로 길항제일 수 있지만, 펩티드는 선택적으로 펩티드의 길항특성을 추가하거나 증진시키기 위하여 세포독성제에 융합될 수 있다.
본 발명에 따라 사용되는 항체 길항제의 제조를 위한 예시적인 기술에 대해 다음에 설명한다.
폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 관련 항원 및 보조제를 피하(sc) 또는 복강 내(ip) 수회 주입함으로써 동물에서 생산하는 것이 바람직하다. 예를 들면 키홀 림펫(keyhole limpet) 헤모시아닌, 혈청알부민, 소 타이로글로불린, 또는 콩 트립신 저해제와 같은 면역시키는 종에서 면역원성인 단백질에, 예를 들면, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통해 결합), N-하이드록시숙신이미드(리신 잔기를 통해 결합), 글루타르알데하이드, 숙신산 무수물, SOC12, 또는 R1N=C=NR(R과 R1은 다른 알킬기이다)과 같은 이작용성 또는 유도제를 사용하여 관련 항원을 결합시키는 것이 유용할 수 있다. 100pg 또는 5wg의 단백질 또는 접합체(각각 래빗 또는 마우스에 대한 것임)를 3부피의 프룬드(Freund's) 완전보조제와 조합하고 용액을 여러 부위에서 내피에 주입함으로써, 동물들을 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대해 면역시킨다. 1개월 후 프룬드 완전 보조제 중의 펩티드 또는 접합체를, 원래의 1/5 내지 1/10 양으로 동물의 여러 부위에서 피하주입함으로써 추가자극한다. 7 내지 14일 후, 동물의 혈액을 채취하고 혈청을 항체 역가에 대하여 분석한다. 역가안정상태가 될 때까지 동물을 추가자극한다. 다른 가교결합제를 통하거나 및/또는 다른 단백질에 접합된, 동일한 항원의 접합체로 동물을 추가자극하는 것이 바람직하다. 접합체는 단백질융합으로 재조합 세포배양 중에서 만들어질 수도 있다. 또한, 면역반응을 증진시키기 위하여 명반과 같은 응집제를 사용하는 것도 적합하다.
모노클로날 항체
모노클로날 항체는, 소량으로 존재할 수도 있는 가능한 자연발생 돌연변이를 제외하고는 집단을 구성하는 개별항체가 동일한, 실질적으로 동종인 항체 Le의 집단으로부터 얻어진다. 따라서 수식어 "모노클로날"은 분리성 항체 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다. 모노클로날 항체는 예를 들면 문헌[Kohleret al., Nature, 256:495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마법을 사용하여 만들거나 재조합 DNA 법(미국특허 제4,816,567호)에 의해 만들 수 있다.
하이브리도마법에서, 마우스 또는 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주동물을 상기 설명한 바와 같이 면역화시켜 면역화에 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하거나 제조할 수 있는 림프구를 알아낸다. 선택적으로, 림프구는 시험관 내에서 면역시킬 수 있다. 그 다음에 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마세포를 형성한다[Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Prctice,pp. 59-103(Academic Press, 1986)].
따라서 제조된 하이브리도마 세포는 미융합 어버이 골수종 세포의 성장 또는 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 것이 바람직한 적합한 배양배지에 접종하여 성장시킨다. 예를 들면, 어버이 골수종 세포가 효소 하이폭산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있다면, 하이브리도마용 배양배지는 일반적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인 하이폭산틴, 아미놉테린 및 티미딘을 포함할 것이다(HAT 배지).
바람직한 골수종 세포는, 효과적으로 융합하여, 선택된 항체-생산세포에 의한 안정한 고수준의 항체 생산을 돕고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 SICDC(Salk Institute Cell Distribution Center, Sandiego, California USA)에서 입수할 수 있는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양에서 유래된 것, 및 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA)에서 입수할 수 있는 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포와 같은, 쥐의 골수종 세포주이다. 인간 골수종 및 마우스 인간 헤테로골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체의 생산에 대해 설명되어 있다[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeuret al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)].
항원에 대한 모노클로날 항체의 생산을 위하여 하이브리도마 세포가 성장하는 배양배지를 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법에 의해 또는 RIA(radioimmunoassay) 또는 ELISA(enzyme-linked immunoabsorbent assay)와 같은 시험관 내 결합분석법에 의해 확인한다. 모노클로날 항체의 결합 친화력은 예를 들면 스캐차드 분석[Scatchard analysis of Munsonet al., Anal. Biochem.,107:220 (1980)]에 의해 확인할 수 있다.
원하는 특이성, 친화력, 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 클론을 한계 희석 방법에 의해 서브클로닝하고 표준방법[Goding,Monoclonal Antibodies: Principles and Prctice,pp. 59-103(Academic Press, 1986)]에 의해 성장시킬 수 있다. 이러한 목적에 적합한 배양배지에는 예를 들면, D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물 내 복수종양으로서 생체 내에서 성장할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면 단백질 A-세파로오즈, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제방법에 의해 배양배지, 복수액, 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.
모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들면, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 탐침을 사용함으로써) 쉽게 분리하여 서열확인한다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원의 역할을 한다. 일단 분리되면, DNA를 발현 벡터 내에 위치시킨 후, 대장균 세포, 유인원 COS 세포, CHO(Chinese Hamster Ovart)세포, 또는 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주세포 속으로 트랜스펙션시켜, 재조합 숙주세포 내에서 모노클로날 항체를 합성한다. 항체를 암호화하는 DNA의 박테리아에서의 재조합 발현에 대한 논문에는 문헌[Skerraet al., Curr. Opinion in Immunol.,5:256-262 (1993) 및 Phickthun,Immunol. Revs.,130:151-188 (1992)]이 포함된다.
다른 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 문헌[McCaffertyet al., Nature,348:552-554 (1990)]에 기재된 기술을 사용하여 생산된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 문헌[Clacksonet al., Nature,352:624-628 (1991) 및 Markset al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에는 파지 라이브러리를 사용하여 쥐 및 사람 항체를 각각 분리하는 것이 기재되어 있다. 이어지는 간행물에 사슬 재편성에 의한 고친화력(nM 범위) 인간항체의 생산[Markset al., BioTechnology,10:779-783 (1992)]뿐 아니라 매우 큰 파지 라이브러리를 구성하기 위한 방법으로서 조합 감염 및 생체 내 재조합[Waterhouseet al., Nuc. Acids. Res.,21:2265-2266 (1993)]이 기재되어 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 분리를 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 대안으로 사용할 수 있다.
또한 DNA는 동종 쥐 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변도메인의 암호화 서열을 치환함으로써[미국특허 제4,816,567호; Morrisonet al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)], 또는 비면역글로불린 폴리펩티드에 대한 암호화서열모두 또는 일부를 면역글로불린 암호화서열에 공유 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. 일반적으로 그러한 비면역글로불린 폴리펩티드를 항체의 불변 도메인에 치환시키거나, 항체의 하나의 항원-결합부위의 가변도메인에 치환시켜 하나의 항원에 대한 특이성을 가지는 하나의 항원-결합 부위와 다른 항원에 대한 특이성을 가지는 다른 항원 결합 부위를 포함하는 키메라 이가 항체를 생산한다.
인간화 항체
비인간 항체를 인간화시키는 방법이 당해 기술분야에서 설명되어 있다. 바람직하게는, 인간화 항체는 비인간인 공급원으로부터 그 속으로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 흔히 "수입(import)"잔기라고 하는데, 이들은 일반적으로 "수입" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 대응하는 인간항체의 서열에 대한 과가변 영역 서열을 치환함으로써, 윈터 등(Winter and co-workers)의 방법[Joneset al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmannet al., Nature,332:323-327 (1988); Verhoeyenet al., Science,239:1534-1536 (1988)]에 따라 행해질 수 있다. 따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 실질적으로 더 적은 완전한 인간 가변도메인이 비인간종의 대응하는 서열로 치환된 키메라 항체(미국특허 제4,816,567호)이다. 실제, 인간화 항체는 일반적으로 일부 과가변영역 잔기 및 가능하다면 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위의 잔기에 의해 치환된 인간항체이다.
인간화 항체를 만드는데 사용되는, 인간 가변 도메인, 경쇄 및 중쇄 모두를 선택하는 것은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. 소위 "최적(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지의 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 그리고 나서 설치류의 것에 가장 가까운 인간서열을 인간화된 항체에 대한 인간 골격영역(FR)으로 한다[Simset al., J. Immunol,151:2296 (1993); Chothiaet al., J. Mol. Biol,196:901 (1987)]. 다른 방법에서는 특정 서브그룹의 경쇄 또는 중쇄 인간 항체 모두의 컨센서스(consensus) 서열로부터 유래된 특정 골격영역을 사용한다. 동일한 골격이 여러 가지 다른 인간화 항체에 대해 사용할 수 있다[Carteret al., Proc. Nad. Acad.Sci. USA, 89:4285 (1992); Prestaet al., J. Immunol,151:2623 (1993)].
항체가 항원에 대한 높은 친화력 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하도록 인간화하는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위하여, 바람직한 방법에 따르면, 인간화 항체를 어버이 서열 및 어버이 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 사용한 다양한 개념적 인간화된 산물의 분석방법에 의해 생산된다. 3차원적 면역글로불린 모델은 일반적으로 이용되며 당업자에게 공지되어 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형상 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이들 디스플레이를 조사하면 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있다, 즉, 후보 면역글로불린이 그 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기를 분석할 수 있다. 이러한 방식으로, FR 잔기는 수혜자로부터 선택되어 조합될 수 있고, 표적항원에 대한 증가된 친화력과 같은 원하는 항체특성이 달성되도록 서열을 들여올 수 있다. 일반적으로, 과가변영역 잔기는 항원결합에 영향을 미치는데 직접적이고 가장 실질적으로 관련된다.
인간항체
인간화에 대한 대안으로서, 인간항체가 생산될 수 있다. 예를 들면, 면역화에 따라 내생적 면역글로불린 생산없이 인간항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있는 유전자도입동물(예를 들면, 마우스)을 현재 생산할 수 있다. 예를 들면, 키메라 및 배아 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합영역(JH) 유전자의 동질접합성 결실이 내생적 항체 생산을 완전히 저해한다는 것이 설명되어 있다. 그러한 배아 돌연변이 마우스에 인간 배아 면역글로불린 유전자 배열을 전이시키면 항원 면역성검사에 의해 인간 항체가 생산될 것이다[예를 들면, Jakobovitset al., Proc. Mad. Acad. Sci. USA,90:2551 (1993); Jakobovitset al., Nature,362:255-258 (1993); Bruggermannet al., Year in Immuno.,7:33 (1993); 및 미국특허 제5,591,669호, 제5,589,369호 및 제5,545,807호 참조]. 선택적으로, 비면역 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관 내에서 인간항체 및 항체 단편을 생산하는데 파지 디스플레이 기술[McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)]을 사용할 수 있다. 이 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 필라멘트성 박테리오파지의 주요 또는 소수 코트 단백질 유전자 중 하나 속으로 골격 내 클로닝되어, 파지 입자의 표면에서 작용성 항체 단편으로 디스플레이된다. 필라멘트성 입자는 파지 게놈의 단일가닥 DNA 카피를 포함하기 때문에, 항체의 작용적 특성에 근거하여 선택하면 이들 특성을 나타내는 항체를 암호화하는 유전자도 선택된다. 따라서, 파지는 B 세포의 특성 중 일부를 닮는다. 파지 디스플레이는 다양한 형식으로 행해질 수 있다[예를 들면, Johnson, Kevin S. andChiswell, David J.,Current Opinion in structural Biology3:564-571 (1993) 참조]. V-유전자 단편의 여러가지 공급원이 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌[Clacksonet al., Nature,352:624-628 (1991)]에서는 면역화된 마우스의 비장에서 유래된 V 유전자의 소형 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 배열의 항-옥사졸론 항체를 분리하였다. 비면역 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 구성될 수 있고, 다양한 배열의 항원에 대한 항체를 문헌[Markset al., J. Mol. Biol.222:581-597 (1991), 또는 Griffithet al., EMBO J.12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 분리할 수 있다(또한 미국특허 제5,565,332호 및 제5,573,905 참조). 인간 항체는 시험관 내에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수도 있다(미국특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조).
항체 단편
항체단편을 생산하기 위한 다양한 기술이 개발되어 있다. 전통적으로, 이들 단편은 완전한 항체의 단백질분해를 통해 얻어진다[예를 들면, Morimotoet al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117 (1992) 및 Brennanet al., Science,229:81 (1985) 참조]. 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주세포에 의해 직접적으로 생산될 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 상기 설명한 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 선택적으로, Fab'-Sli 단편은 대장균으로부터 직접 회수되고 화학적으로 결합되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다[Carteret al., Bio/Technology10:163-167 (1992)]. 다른 접근방법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주세포 배양물로부터 직접적으로 분리될 수 있다. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기술은 당업자가 잘 알 것이다. 다른 실시형태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편(scFv)이다[WO 93/16185; 미국특허 제5,571,894; 및 미국특허 제5,587,458호 참조]. 항체 단편은 예를 들면, 미국특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은, "선형 항체"일 수도 있다. 그러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이특이적일 수 있다.
이특이적 항체
이특이적 항체는 둘 이상의 다른 에피토프에 대한 결합특이성을 가지는 항체이다. 예시적인 이특이적 항체는 B 세포 표면표지의 두 개의 다른 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 그러한 항체는 제1 B 세포 표면표지에 결합하고 제2 B 세포 표면표지에 추가로 결합할 수 있다. 선택적으로, 항-B 세포 마커결합 암(arm)은 B 세포에 대한 세포방어메카니즘을 집중시키기 위하여 T-세포 수용체 분자(예를 들면 CD2 또는 CD3)와 같은 백혈구 상의 유발분자, 또는 FcyRI(CD64), FcyRII(CD32) 및 FcyRIII(CD16)와 같은 IgG(FcyR)에 대한 Fc 수용체에 결합하는 암과 결합될 수 있다. 이특이적 항체는 세포독성제를 B 세포에 편재시키는데 사용될 수도 있다. 이들 항체는 B 세포 표지-결합 암과 세포독성제(예를 들면, 사포린, 항-인터페론 a, 빈카 알칼로이드, 리신 A 사슬, 메토트렉세이트 또는 방사선 동위원소 합텐)에 결합하는 암을 가진다. 이특이적 항체는 전장 항체 또는 항체단편(예를 들면, F(ab')2 이특이적 항체)으로 제조될 수 있다.
이특이적 항체를 만드는 방법은 당해 기술분야에서 공지되어 있다. 전장 이특이적 항체의 전통적인 생산방법은 두개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초하며, 이때 이들 두 사슬은 다른 특이성을 가진다[Millsteinet al., Nature,305:537-539 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄가 무작위로 분류되기 때문에, 이들 하이브리도마(quadromas)는 10가지 다른 항체분자의 잠재적인 혼합물을 생산하고, 이들 중 오직 하나만이 정확한 이특이적 구조를 가진다. 보통 친화 크로마토그래피에 의해 행해지는 정확한 분자의 정제는 다소 성가지고, 생산수율이 낮다. 유사한 절차가 문헌[WO 93/08829, 및 Trauneckeret al., EMBO J,10:3655-3659 (1991)]에 개시되어 있다.
다른 접근방법에 따르면, 원하는 결합특이성을 가진 항체 가변 도메인(항체-항원 조합 부위)은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변도메인을 사용하는 것이 바람직하다. 하나 이상의 융합에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변영역(CHI)을 가지는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합을 암호화하는 DNA, 및 필요하다면 면역글로불린 경쇄를 별도의 발현 벡터 속에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체에 공통 트랜스펙션한다. 이것은 구성에 사용되는 3 폴리펩티드 사슬의 동일하지 않은 비율이 최적 수율을 제공하는 실시예에서 3 폴리펩티드 단편의 상호비율을 조절하는데 큰 융통성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 2 이상의 폴리펩티드 사슬이 높은 수율로 발현되는 경우 또는 비율이 그다지 중요하지 않은 경우에는 한 발현벡터 내에 둘 또는 모든 3 폴리펩티드 사슬에 대한 암호화서열을 삽입할 수도 있다.
이 접근방법의 바람직한 실시형태에서, 이특이적 항체는 한 암의 제1결합 특이성을 가지는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른 암의 하이브리드 면역글로불린 중쇄 경쇄 쌍(제2결합특이성을 부여함)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조는 이특이적 분자의 1/2에서만 면역글로불린 경쇄가 존재하여 분리가 용이하기 때문에, 원하지 않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이특이적 화합물을 분리하는 것을 촉진하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근방법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이특이적 항체를 생성하는 보다 상세한 내용에 대해서는 문헌[예를 들면, Sureshet al., Methods in Enzymology,121:210 (1986)]을 참조하기 바란다.
미국특허 제5,731,168호에 기재된 다른 접근방법에 따르면, 한 쌍의 항체 분자 사이의 계면을 조작하여 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로다이머의 백분율을 최대화할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1항체분자의 계면의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄(예를 들면, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄와 동일하거나 유사한 크기의 상보적 "공동"은 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것(예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체함으로써 제2항체 분자의 계면에서 만들어진다. 이것은 호모다이머와 같은 다른 원하지 않는 최종산물에 대한 헤테로다이머의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이특이적 항체에는 가교결합 또는 "헤테로접합" 항체가 포함된다. 예를 들면, 헤테로접합체 내의 항체 중 하나는 아비딘에 결합되고, 다른 것은 바이오틴에 결합될 수 있다. 그러한 항체는 예를 들면 원하지 않는 세포에 대한 면역시스템 세포를 표적으로 하고(미국특허 제4,676,980호), 및 HIV감염을 치료하기 위해(WO91/00360, WO 92/200373, 및 EP 03089) 제안되었다. 헤테로접합 항체는 임의의 편리한 가교결합방법을 사용하여 만들 수 있다. 적합한 가교결합제는 당해 기술분야에서 공지되어 있고, 다수의 가교결합기술과 함께 미국특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.
항체 단편으로부터 이특이적 항체를 생성하는 기술도 문헌에 기재되어 있다. 예를 들면, 이특이적 항체는 화학결합을 이용하여 제조할 수 있다. 문헌[Brenannet al., Science,229:81(1985)]에는 완전한 항체가 단백질 분해되어 F(ab')2 단편을 생성하는 방법이 기재되어 있다. 이들 단편은 디티올 착물형성제 나트륨 아르세나이트의 존재 하에서 환원되어 인접 디티올을 안정화시키고 분자간 다이술파이드 형성을 방지한다. 그리고 나서, 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 그리고 나서, Fab'-TNB 유도체 중 하나는 멜캅토에틸아민으로 환원되어 Fab'-티올로 재전환되고 동몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이특이적 항체를 형성한다. 생산된 이특이적 항체는 효소의 선택적 고정화를 위한 작용인자로서 사용될 수 있다.
최근 기술의 진보로, 화학적으로 결합되어 이특이적 항체를 형성할 수 있는 Fab'-SH 단편을 대장균으로부터 직접 회수하는 것이 촉진되었다. 문헌[Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225(1992)]에는 완전히 인간화된 이특이적 항체 F(ab')2 분자의 생산이 기재되어 있다. 각 Fab' 단편은 대장균으로부터 별도로 분비되고 시험관 내에서 화학결합되어 이특이적 항체를 형성한다. 따라서 형성된 이특이적 항체는 인간 유방종양 표적에 대한 인간 세포독성 림프구의 용해활성을 유발할 뿐 아니라 ErbB2 수용체와 정상적인 인간 T 세포를 과발현하는 세포에 결합할 수 있었다.
재조합 세포배양물로부터 이특이적 항체 단편을 직접적으로 만들고 분리하기 위한 다양한 기술도 설명되어 있다. 예를 들면, 이특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 생산될 수 있다[Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)]. Fos와 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 다른 항체의 Fab' 부분에 결합되었다. 항체 호모다이머는 힌지영역에서 환원되어 모노머를 형성한 후 재산화되어 항체 헤테로다이머를 형성한다. 이 방법은 항체 호모다이머를 생산하는 데에도 이용될 수 있다. 문헌[Hollingeret al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA.90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "다이어바디" 기술은 이특이적 항체 단편을 만드는 대안적 메카니즘을 제공하였다. 단편들은 너무 짧아서 동일한 사슬 상의 두개의 도메인 사이에 쌍을 형성할 수 없는 링커에 의해 경쇄 가변도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다.
따라서, 한 단편의 VH 및 VL 도메인은 다른 단편의 상보적 VL 및 VH 도메인과 쌍을 형성하게 되어, 두개의 항원-결합 부위를 형성하다. 단일쇄 Fv(sFv) 다이머를 사용하여 이특이적 항체 단편을 만드는 다른 방법도 보고되어 있다[Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조]. 2 이상의 가수를 가지는 항체도 고려된다. 예를 들면, 삼특이적 항체도 제조될 수 있다(Tuttet al. J. Immunol.147:60 (1991)].
III. 길항제의 접합체 및 다른 변형
본 명세서의 제조방법에 사용되거나 제조물품에 포함되는 길항제는 선택적으로 세포독성제와 접합된다. 그러한 길항제-세포독성제 접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기 설명하였다.
길항제와 칼리케아마이신, 마이탄신(미국특허 제5,208,020호), 트리코텐, 및 CC1065와 같은 하나 이상의 소형 분자 독소의 접합체도 본 명세서에서 고려된다. 본 발명의 일실시형태에서, 길항제는 하나 이상의 마이탄신 분자에 접합된다(예를 들면 길항제 분자 당 약 1 내지 약 10 마이탄신 분자). 예를 들면, 마이탄신은 May-SH3로 환원될 수 있는 May-SS-Me로 전환되어 변형된 길항제와 반응하여 마이탄시노이드-길항제 접합체를 생성할 수 있다[Chariet al. Cancer Research52:127-131 (1992)].
선택적으로, 길항제는 하나 이상의 칼리케아마이신 분자에 접합된다. 칼리치아마니신 족의 항생제는 서브-피코몰 농도에서 이중가닥 DNA 단선을 생산할 수 있다. 사용될 수 있는 칼리케아마이신의 구조적 유사체에는 'yJ1, a21, a31, N-아세틸-yl', PSAG 및 011이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다[Hinmanet al. Cancer Research53:3336-3342 (1993) 및 Lodeet al. Cancer Research58:2925-2928 (1998)].
사용될 수 있는 효소학적으로 활성인 독소 및 그 단편에는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성단편, 엑소톡신 A 사슬(슈도모나스 아에루기노사 유래), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 41 유리테스포르디(euritesfordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolacaamericana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 젤로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 포함된다[예를 들면, 1993년 10월 28일에 공개된 WO 93/21232 참조].
본 발명은 또한 핵분해 활성을 가진 화합물(예를 들면, 데옥시리보뉴클레아제(DNase)와 같은 DNA 엔도뉴클레아제 또는 리보뉴클레아제)과 접합된 길항제도 고려한다. 다양한 방사성 동위원소를 방사성접합된 길항제를 생산하는데 이용할 수 있다. 그 예에는 At211, I125, Re188, In111, Tc99m, Pb212, Y90, Re186, Sm153, Cu67, I131, P52, B212및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 길항제와 세포독성제의 접합체는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 사이클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올레인(IT), (디메틸 아디피미데이트 HCL과 같은) 이미도에스테르의 이작용성 유도체, (디숙신이미딜 수버레이트와 같은) 활성 에스테르, (글루타르알데하이드와 같은) 알데하이드, (비스(p-아지도벤조일)헥산디아민과 같은) 비스 아지도 화합물, (비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민과 같은) 비스-디아조늄 유도체, (톨리엔 2,6-디이소시아네이트와 같은) 디이소시아네이트) 및 (1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠과 같은) 비스-활성 플루오르 화합물과 같은 다양한 이작용성 단백질 링커를 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌[Vitettaet al. Science238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 길항제에 대한 방사성 뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다[WO 94/11026 참조]. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 배출을 촉진하는 "분해성 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술파이드-함유 링커[Chariet al. Cancer Research52:127-131 (1992)]가 사용될 수 있다. 선택적으로, 길항제와 세포독성제를 포함하는 융합단백질이 예를 들면 재조합 기술이나 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다.
또다른 실시형태에서, 길항제는 종양 전표적화에 이용하기 위한 (스트렙타비딘과 같은) "수용체"에 접합될 수 있고, 길항제-수용체 접합체는 환자에게 투여된 후 클리어링제를 사용하여 순환시켜 미결합 접합체를 제거한 후 세포독성제(예를 들면, 방사성 뉴클레오티드)에 접합된 "리간드"(예를 들면, 아비딘)를 투여한다. 본 발명의 길항제는 약물전구체(예를 들면, 펩티딜 화학요법제, WO 81/01145 차조)를 활성 항암 약물로 전환하는 약물전구체-활성화 효소와 접합될 수도 있다(예를 들면, WO 88/07378 및 미국특허 제4,975,278호 참조).
그러한 접합체의 효소 성분은 약물전구체를 보다 활성적, 세포독성 형태로 전환하는 방식으로 약물전구체에 작용할 수 있는 효소를 포함한다. 본 발명의 방법에 유용한 효소에는 포스페이트-함유 약물전구체를 유리약물로 전환하는데 유용한 알칼라인 포스파타제; 약물전구체를 함유하는 술페이트를 유리약물로 전환하는데 유용한 아릴술파타제; 비독성 5-플루오로사이토신을 항암약물인 5-플루오로우라실로 전환하는데 유용한 사이토신 디아미나제; 펩티드-함유 약물전구체를 유리 약물로 전환하는데 유용한, 세라티아 프로테아제, 서모라이신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 및 (카텝신 B 및 L과 같은) 카텝신과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환체를 함유하는 약물전구체를 전환하는데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화된 약물전구체를 유리약물로 전환하는데 유용한 1i-갈락토시다제와 뉴라미니다제와 같은 탄수화물분해효소; (3-락탐으로 유도된 약물을 유리약물로 전환하는데 유용한 (3-락타마제; 및 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸그룹으로 그 아민 질소에서 유도된 약물을 유리약물로 전환하는데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제가 포함된다. 선택적으로, 당해 기술분야에서 "애브자임(abzyme)"으로도 알려진 효소적 활성을 가진 항체를 본 발명의 약물전구체를 유리 활성약물로 전환하는데 사용할 수 있다[Massey,Nature328:457-458 (1987)]. 길항제-애브자임 접합체는 애브자임을 종양세포 집단으로 전달하기 위하여 본 명세서에서 설명된 바와 같이 제조할 수 있다.
본 발명의 효소는 상기 헤테로이작용성 가교결합제를 사용하는 것과 같은 당해 기술분야에서 공지된 기술에 의해 길항제에 공유결합될 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 효소의 적어도 기능적 활성 부분에 결합된 본 발명의 길항제의 적어도 항원결합영역을 포함하는 융합단백질을 당해 기술분야에서 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성할 수 있다[예를 들면, Neubergeret al., Nature,312:604-608 (1984) 참조].
길항제의 다른 변형도 본 명세서에서 고려된다. 예를 들면, 길항제는 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌과 같은 다양한 비단백질성 중합체, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 코폴리머 중 하나에 결합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 길항제는 리포좀으로 조성될 수도 있다. 길항제를 함유하는 리포좀은 문헌[Epsteinet al., Proc. Mad. Acad Sci. USA,82:3688 (1985); Hwanget al., Proc. Natl Acad Sci.USA, 77:4030 (1980); 미국특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 1997년10월 23일에 공개된 WO 97/38731]에 기재된 바와 같은, 당해 기술분야에서 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 순환시간이 증진된 리포좀은 미국특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유래 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하여 역상 증발법에 의해 생성할 수 있다. 리포좀은 원하는 직경을 가진 리포좀을 생산하기 위하여 정해진 천자크기의 필터를 통해 압출한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 원하는 디술파이드 교환반응을 통해 문헌[Martinet al., J. Biol. Chem.257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합될 수 있다. 선택적으로 리포좀 내에 화학요법제를 포함시킬 수 있다[Gabizonet al. J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989) 참조]. 본 명세서에 기재된 단백질 또는 펩티드 길항제의 아미노산서열 변형도 고려된다. 예를 들면, 길항제의 결합친화력 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선하는 것이 바람직할 수 있다.
길항제의 아미노산서열 변형체는 길항제 핵산 속에 적합한 뉴클레오타이드 변화를 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 그러한 변형에는 예를 들면, 길항제의 아미노산서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환이 포함된다. 최종 구조체가 원하는 특성을 갖는다면, 최종구조체에서 나타나는 결실, 삽입 및 치환의 어떠한 조합도 만들어질 수 있다. 또한 아미노산 변화는 글리코실레이션 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은 길항제의 번역 후 가공을 변화시킬 수 있다.
돌연변이유발에 바람직한 위치인 길항제의 특정 잔기 또는 영역을 확인하는데 유용한 방법은 문헌[Cunningham and WellsScience, 244:1081-1085(1989)]에 기재된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 그룹을 확인하고(예를 들면, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기), 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 미치는 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체한다. 그리고 나서, 치환에 대한 작용적 감수성을 나타내는 이들 아미노산 위치를 치환 부위에서 또는 치환부위에 대해서 추가 또는 다른 변형체를 도입하여 정제한다. 따라서, 아미노산서열 변형을 도입하는 부위는 미리 정해져 있지만, 돌연변이 자체의 특성은 미리 정해질 필요가 없다. 예를 들면, 주어진 부위에서 돌연변위의 수행을 분석하기 위하여, 표적코돈 또는 영역에서 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 행하고 발현된 길항제 변형체를 원하는 활성에 대해 스크리닝한다.
아미노산서열 삽입에는 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열 내 삽입뿐 아니라, 하나의 잔기에서 백 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드까지의 길이를 가진 아미노- 및/또는 카복시-말단 융합이 포함된다. 말단 삽입의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 가진 길항제 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 길항제가 포함된다. 길항제 분자의 다른 삽입변형체에는 효소의 길항제의 N- 또는 C-말단, 또는 길항제의 혈청반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 융합이 포함된다.
다른 형태의 변형체는 아미노산 치환 변형체이다. 이들 변형체는 다른 잔기로 대체된 길항제 분자 내에 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 항체 길항제의 치환 돌연변이유발에 대해 가장 관심있는 부위에는 과가변영역이 포함되지만, FR 변형도 고려된다.
보존성 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제 하에 표 1에서 나타낸다. 그러한 치환이 생물학적 활성에서의 변화를 일으킨다면, 그 다음에 표 1에서 "예시적인 치환"으로 명명되거나 아미노산 분류를 참조하여 하기 추가로 설명하는 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고 산물을 스크리닝한다.
원 잔기 예시적 치환 바람직한 치환
Ala(A) val; leu; ile val
Arg(R) lys; gln; asn lys
Asn(N) gln; his; asp, lys; arg gln
Asp(D) glu; asn glu
Cys(C) ser; ala ser
Gln(Q) asn; glu asn
Glu(E) asp; gln asp
Gly(G) ala ala
His(H) asn; gln; lys; arg arg
Ile(I) leu; val; met, ala; phe; norleucine ICU
Lea(L) norleucine; ile; val; met; ala; phe ile
Lys(K) arg; gln; asn arg
Met(M) leu; phe; ile leu
Phe(F) leu; val; ile; ala; tyr tyr
Pro(P) ala ala
Ser(S) thr thr
Thr(T) ser ser
TIP(W) tyr; phe tyr
Tyr(Y) trp; phe; thr; ser phe
Val(V) ile; leu; met; phe; ala; norleucine ICU
길항제의 생물학적 특성에서 실질적인 변형은 (a) 예를 들면, 시트 또는 나선형 구조와 같은, 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 크기를 유지하는데 대한 그 효과가 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연발생 잔기는 공통 측쇄특성에 근거하여 그룹으로 나누어진다:
(1) 소수성 : norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성 : cys, ser, thr;
(3) 산성 : asp, glu;
(4) 염기성 : asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기 : gly, pro; 및
(6) 방향성 : trp, tyr, phe.
비보존성 치환은 이들 분류 중 하나의 요소를 다른 분류로 교환하는 것을 필요로 할 것이다.
길항제의 적절한 구조를 유지하는데 관련되지 않은 임의의 시스테인 잔기는 분자의 산화안정성을 개선하고 비정상적인 가교결합을 방지하기 위하여, 일반적으로 세린으로, 치환될 수 있다. 반대로, 그 안정성을 개선하기 위하여 길항제에 시스테인 결합이 첨가될 수도 있다(특히 길항제가 Fv 단편과 같은 항체단편인 경우).
특히 바람직한 치환 변형체의 형태에는 어버이 항체의 하나 이상의 과가변영역 잔기를 치환하는 것이 포함된다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택된 생성된 변형체는 그들이 생성되는 어버이 항체에 비해 생물학적 특성이 개선되었을 것이다. 그러한 치환변형체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 사용한 친화 성숙이다. 간단하게 말하면, 각 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 생성하기 위하여 여러 개의 과가변 영역 부위(예를 들면, 6-7부위)가 돌연변이된다. 따라서 생성된 항체 변형체는 각 입자 내에 조립된 M13의 유전자 III 산물에 대한 융합으로서 필라멘트성 파지입자로부터 1가인 형식으로 디스플레이된다. 그 다음에, 파지-디스플레이 변형체를 본 명세서에서 개시된 바와 같이 그 생물학적 활성(예를 들면, 결합 친화력)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 과가변영역 부위를 확인하기 위하여, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 행하여 항원결합에 상당히 기여하는 과가변영역 잔기를 확인할 수 있다. 선택적으로, 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위하여 항원-항체 복합체의 결정구조를 분석하는 것이 유용할 수 있다. 그러한 접촉잔기와 인접하는 잔기는 본 명세서에서 자세히 설명된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 그러한 변형체가 생성되면, 변형체의 패널을 본 명세서에서 설명한 바와 같이 스크리닝하고 하나 이상의 관련분석법에서 우수한 특성을 가진 항체를 추가개발을 위해 선택할 수 있다.
길항제의 아미노산 변형체의 다른 형태는 길항제의 원 글리코실레이션 패턴을 변형시킨다. 변형시킨다는 것은 길항제에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기를 결실시키거나, 및/또는 길항제에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실레이션 부위를 추가하는 것을 의미한다.
폴리펩티드의 글리코실레이션은 일반적으로 N-결합 또는 O-결합이다. N-결합은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 탄수화물 잔기가 부착하는 것을 말한다. 트리펩티드서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌(X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 탄수화물 잔기가 효소적으로 부착하기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드 내에 이들 트리펩티드 서열 중 어느 것이 존재하면 잠재적인 글리코실레이션 부위를 만든다. O-결합 글리코실레이션은 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 사용될 수 있지만, 가장 흔하게는 세린 또는 트레오닌인, 하이드록시아미노산에 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오즈, 또는 자일로오즈 중 하나가 부착하는 것을 말한다. 길항제에 글리코실레이션 부위를 추가하는 것은 (N-결합 글리코실레이션 부위에 대한) 하나 이상의 상기 트리펩티드 서열을 포함하도록 아미노산 서열을 변형시킴으로써 쉽게 달성된다. 이러한 변형은 (O-결합 글리코실레이션 부위에 대한) 원 길항제의 서열에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 추가 또는 치환함으로써 이루어질 수도 있다.
길항제의 아미노산 서열 변형체를 암호화하는 핵산 분자는 당해 기술분야에서 공지된 다양한 방법으로 제조된다. 이들 방법에는 (자연발생 아미노산 서열 변형체의 경우) 자연공급원으로부터의 분리 또는 올리고뉴클레오티드-매개(또는 부위 지정) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 길항제의 이미 제조된 변형체 또는 비변형체 판의 카세트 돌연변이유발이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다.
길항제의 항원-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성(CDC)을 증진시키기 위한 것과 같은 효과기 작용과 관련하여 본 발명의 길항제를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체 길항제의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입할 수 있고, 그것에 의하여 이 영역 내에 사슬간 디술파이드 결합이 형성될 수 있다. 따라서 생성된 호모다이머 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 가질 수 있다[Caronet al., J. Exp Med.176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, B.J. Immunol.148:2918-2922 (1992) 참조]. 증진된 항종양 활성을 가진 호모다이머 항체는 문헌[Wolffet al. Cancer Research53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같은 헤테로이작용성 가교결합제를 사용하여 제조될 수도 있다. 선택적으로, 항체를 이중 Fc 영역을 가지도록 조작할 수 있고 그것에 의해 보체 용해성 및 ADCC 능력을 증진시킬 수 있다[Stevensonet al. Anti-Cancer Drug Design3:219-230 (1989)].
길항제의 혈청반감기를 증가시키기 위하여, 예를 들면 미국특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이, 길항제 (특히 항체 단편) 속에 구조(salvage) 수용체 결합 에피토프를 삽입할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은, "구조 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체 내 혈청반감기를 증가시키는 IgG 분자(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 영역의 에피토프를 말한다.
IV. 약제학적 조성
본 발명에 따라 사용되는 길항제의 치료적 조성은 원하는 정도의 순도를 가지는 길항제 또는 길항제들을 선택적인 약제학으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합함으로써[Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol, A. Ed. (1980)] 동결건조된 조성 또는 수용액의 형태로 저장하도록 제조한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제는 사용되는 용량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; (옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸과 같은) 방부제; (약 10잔기 이하의) 저분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류, 및 글루코즈, 만노즈, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 슈크로즈, 만니톨, 트레할로즈 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염형성 카운터이온; 금속 착체(예를 들면, Zn-단백질 착체); 및/또는 TWEENTM, PLURONICSTM또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
예시적인 항-CD20 항체 조성은 인용에 의해 명백하게 삽입된 WO 98/56418에 기재되어 있다. 이 공개문헌에는 2-8℃에서 2년의 최소 저장수명을 가지는 pH 5.0의 40mg/㎖ rituximab, 25Mm 아세테이트, 150mM 트레할로즈, 0.9% 벤질알콜, 0.02% 폴리소르베이트 20을 포함하는 액상 다중투여 조성이 기재되어 있다. 관심있는 다른 항-CD20 조성은 pH 6.5로 9.0mg/㎖ 염화나트륨 중의 10mg/㎖ rituximab, 7.35mg/㎖ 나트륨 시트레이트 디하이드레이트, 0.7mg/㎖ 폴리소르베이트 80, 및주입용 멸균수를 포함한다. 피하투여에 적합한 동결건조된 조성이 WO 97/04801에 기재되어 있다. 그러한 동결건조된 조성은 적합한 희석제를 사용하여 높은 단백질농도로 재구성될 수 있고 재구성된 조성은 본 명세서에서 치료되는 포유동물에 피하 투여될 수 있다.
본 명세서에서의 조성은 치료되는 특정 징후에 필요한, 바람직하게는 서로 악영향을 미치지 않는 상보적 활성을 가지는 하나 이상의 활성화합물 zi.를 포함할 수도 있다. 예를 들면, 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인 또는 면역억제제(예를 들면, 사이클로스포린과 같이 T 세포에 작용하는 것 또는 LFA-1과 결합하는 것과 같이 T세포와 결합하는 항체)를 더 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 다른 약제의 유효량은 조성 내에 존재하는 길항제의 양, 질병 또는 질환 또는 치료의 형태 및 상기 다른 인자에 따라 결정된다. 이들은 일반적으로 동일한 용량으로 및 지금까지 사용된 바와 같은 투여경로로 또는 지금까지 사용된 용량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
활성성분은 콜로이드성 약물 운반시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민, 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 중에서 또는 마크로에멀젼 중에서, 각각 하이드록시메틸셀룰로오즈 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐과 같은 예를 들면, 코아세르베이션 기술 또는 계면중합에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에 포획될 수도 있다. 그러한 기술은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-배출 제제도 제조될 수 있다. 지속-배출 제제의 적합한 예에는 길항제를 함유하는 고형 소수성 폴리머의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 이 매트릭스는 막과 같은 구체화된 물품, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속-배출 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들면, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드(미국특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, LUPRON DEPOTTM(락트산 글리콜산 코폴리머 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주입용 마이크로스피어)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머, 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다.
생체 내 투여에 사용되는 조성은 멸균되어야 한다. 멸균여과 막을 통해 여과함으로써 쉽게 멸균할 수 있다.
V. 항-B 세포 항체 투여를 위한 방법 및 조성물
A.항-B 세포 항체의 투여 방법
CNS 림프종 치료에 사용하기 위한 항-B 세포 항체의 투여 방법은 정맥내(iv), 경구 또는 복강내가 가능하다. 그러나, 중추신경계 림프종 또는 관련 상태를 치료하기 위하여, 항-B 세포 항체, 예를 들어 항-CD20 항체 또는 이의 면역원성 활성 단편을 초내 투여로 투여하는 것이 바람직한 방법이다. 오미야 저장소에 의해 초내 투여하는 것이 바람직하지만, 요부 천자를 통하거나 실내 투여도 가능하다. 항-B 세포 항체는 다른 약물과 조합하여 동일한 경로로 투여할 수 있다;이와 달리, 이차 약제를 별도 경로를 통하여 투여할 수 있다. 또한, 계획된 항-B 세포 항체를 두개(cranial) 방사선 조사 전 또는 후에 투여할 수 있다.
이와 달리, 혈액뇌 장벽(BBB)를 파괴(disrupt) 후 동맥내에 약물을 투여할 수 있다. B 세포와 결합하는 항-CD20 항체 또는 B 세포를 저해하는 항-CD40L 항체와 같은 항-B 세포 항체를 단독으로 또는 다른 약제(예를 들어 항-CD40 항체, 다른 항-B 세포 항체, 메토트렉세이트, 사이클로포스파미드, 프로카바진 및 덱사메타손)와 조합하여 투여할 수 있다. BBB를 파괴하는 방법에는, 문헌(Krollet al.,Neurosurgery42:1083-99(1998) 및 Dahlborget al.,Cancer J. Sci. Am.2:166(1996))에 기재된 방법이 포함된다.
언급한 바와 같이, 항-B 세포 항체, 예를 들어 리툭시맵과 같은 항-CD20 항체, 또는 치료에 유효한 이의 단편(예를 들어 Fab, Fab' 또는 F(ab')2)을 하나 이상의 추가 활성제와 혼합하거나 단독으로 투여한다. 추가 활성제에는 상기된 바와 같은 류코보린, CHOP, 메토트렉세이트, 시타라빈, 티오테파 또는 빈크리스틴 등의 다른 화학요법제가 포함될 수 있다. 항-B 세포 항체 또는 치료에 유효한 이의 단편은 CD40과 이의 리간드 CD4L 간의 상호작용을 저해하는 약제와 조합하여 투여할 수 있다. CD40/CD40L 저해제에는 항-CD40 항체 또는 이의 단편, 항-CD40L 항체 또는 이의 단편 및 CD40 또는 CD40L 중 어느 하나의 펩티드 유사체가 포함될 수 있다. 항-CD20 항체는 특히, 항- CD19, 항-CD22, 항-CD38 및 항-MHCII 항체와 같은 다른 항-B 세포 항체와 함께 투여할 수도 있다. 또한, 항-CD20 항체는 단독으로,또는 다른 항체와 조합하거나, 다른 치료 양식(예를 들어, 화학요법 및 방사선요법)과 조합하거나, 이들을 조합하여 투여할 수 있다.
이러한 활성제(예를 들어 리툭시맵과 같은 항-CD20 항체)는 약제학적으로 유효한 담체 또는 벡터 내에 존재할 수 있다. 벡터에는 문헌(Huwyleret al.,Proc. Nat'l Acad. Sci. USA93:14164-14169(1996) 및 미합중국 특허 제 5,716,614호)에 기재된 것과 같은 친지성 벡터(예를 들어 프로카바진) 또는 면역친지성 벡터가 포함될 수 있다. 이와 달리, 활성제를 뇌 상피 상의 수용체(예를 들어 트란스페린 수용체)를 표적화하는 벡터에 결합시킬 수 있다(Wuet al.,Drug. Metabol. Dispos. 26:937-9(1998)).
VI. 다른 약제 또는 치료 방법과 항-CD20 항체의 조합 사용
A.방사선과 조합한 항-B 세포 항체
방사선 단독으로는, 화학요법과 같은 다른 방법과 조합하여 사용하는 경우와 같이 PCNSL 치료에 유효한 것으로 판명되지 않았다. 본 발명의 일실시형태는, 항 CD20 항체를 단독으로, 또는 뇌 방사선조사와 조합된 다른 약제 또는 약제들(예를 들어 CHOP)과 조합하여 뇌림프종 환자를 치료하는 것이다. 뇌 방사선 조사 전, 후, 또는 전후에 모두 항체를 투여할 수 있다. 예를 들어, 환자에게 전체 뇌 방사선요법(WBRT)을 실시한 후, 시타라빈 및 항-CD20 항체를 단독으로 또는 다른 항-B 세포 항체와 조합하여 고용량으로 치료할 수 있다. 환자에게 4,000 내지 5,000 cGy를 조사하는 것이 바람직하다. 이와 달리, 문헌(DeAngeliset al., 1997)에 논의된 바와 같이 뇌에 4,000cGy의 방사선요법 및 관련 영역에 2,000cGy의추가조사(boost)로 환자를 치료할 수 있다. 환자에게 눈의 침습이 있다면, 이어서 눈에 3,600cGy를 조사할 수 있다.
우선 방사선 조사 후, 항-CD20을 단독으로 또는 다른 항-B 세포 항체와 조합하여 치료할 수 있다. 항-CD20 항체의 후 방사선 조사를 프로카바진, 로무스틴 및 빈크리스틴(PCV)과 조합할 수 있다. PCV 투여는 문헌(Chamberlainet al.,J. Neuro. Oncol.14:271-275(1992))에 기재된 바와 같이 실시할 수 있다. 이와 달리, 항체를 사이클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손(CHOP) 또는 사이클로포그파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 덱사메타손(CHOD)과 조합할 수 있다. 전체 뇌 방사선요법 전에 이러한 항체 및 화학요법 조합을 실시할 수 있다. 본 발명의 항-CD20 항체는, 두개 방사선 조사 전에, 메토트렉세이트(400mg/M2), 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손 및 블레오마이신(MACOP-B)과 조합할 수도 있다. MACOP-B, CHOP 및 CHOD는 문헌(DeAngeliset al., 1997) 및 여기에 인용된 참고문헌에 기재된 바와 같이 투여하는 것이 바람직하다.
이와 달리, 항-CD20 항체 자체를 의학적으로 유용한 동위원소에 결합시킬 수 있다. 이러한 방사선핵종은 아래에 더 설명한다.
B.화학요법과 조합한 항-CD20 항체
본 발명의 다른 실시형태는, 방사선요법을 사용하지 않고, 항-B 세포 항체, 예를 들어 항-CD 항체 또는 치료에 유용한 이의 단편을 화학요법제와 조합 사용하여 뇌 림프종을 치료하는 것이다.
항-CD20 항체를 고용량의 메토트렉세이트와 함께 투여하는 것이 일례이다. 이러한 조합과 함께 추가적인 약제를 투여할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 항-CD20 항체를 고용량의 메토트렉세이트(2.5g/M2), 프로카바진 및 빈크리스틴과 함께 메토트렉세이트, 프로카바진 및 빈크리스틴과 함께 문헌(Freilichet al., Neurology46:435-439(1996))에 기재된 바와 같이 투여할 수 있다. 고용량의 메토트렉세이트를 문헌(Perez-Jaffeet al.,Diagn. Cytopathol. 20:219-223(1999))에 기재된 바와 같이 투여할 수도 있다. 이와 달리, 항-CD20 항체를 고용량의 시타라빈(3g/M2)과 함께 투여할 수도 있다. 고용량의 시타라빈은 문헌(Strauchenet al.,Cancer63:1918-21(1989))에 기재된 바와 같이 투여할 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태는 항-CD20 항체 및 화학요법제를, 및/또는 항-CD40 또는 항-CD40L 항체와 함께 및/또는 다른 항 B-세포 항체와 함께 조합투여하는 것이다.
C.혈액뇌 장벽 투과도를 높이는 약제와 조합한 항-CD20 항체와 같은 항-B 세포 항체
혈액뇌 장벽로 인해 환자에게 약물 투여시 문제가 발생할 수 있으므로, 초내 투여가 필요없는 경우에, 또는 이와 다른 형태의 항-CD20 항체 투여가 바람직한 경우에, 혈액뇌 장벽(BBB) 투과도를 높이는 약제를 사용하거나 방법을 사용할 수 있다. BBB 투과도를 높이는 약제의 일례는 뇌 모세관 내피 세포에 존재하는 트란스페린 수용체와 반응하는 항체이다. 트란스페린 수용체의 적어도 일부와 반응하는 모노클로날 항체에는: OX-26, B3/25, Tf6/14, OKT-9, L5.1, 5E-9, RI7 217 및T58/30이 포함된다. 이러한 항-트란스페린 수용체 항체는 문헌(미합중국 특허 제 5,182,107호, 전체적으로 본 명세서에 참조 병합)에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 뇌의 표적 부위에 항체를 전달하는 친지성 벡터(예를 들어, 프로카바진)를 포함하여 이루어질 수도 있다. 면역리포좀도 고려된다(Huwyleret al., 1996). 친지성 분자는 오메가-3 시리즈의 지방산 또는 이의 지질 유도체가 바람직하다. 다른 친지성 분자로는, 지방산, 디아실 글리세롤, 디아실 포스포리피드, 라이소-포스포리피드, 콜레스테롤 및 탄소수 18 내지 46의 다-불포화 탄화수소기를 갖는 다른 스테로이드가 있다.
바람직한 생물폴리머 담체로는 폴리(알파)-아미노산(예를 들어, PLL, 폴리 L-아르기닌: PLA, 폴리 L-오르니틴;PLO), 인간 혈청 알부민, 아미노덱스트란, 카제인 등이 있다. 이러한 담체로는 약물 전달 시스템으로서 잠재성이 크고, 생물분해성, 생체적합성인 것을 바람직하다. 이러한 담체 및 이의 투여에 관한 상세한 내용은, 본 명세서에 전체적으로 참조병합되어 있는 미합중국 특허 제 5,716,614호를 참조한다.
VII. CD40/CD40L 상호작용을 방해하는 약제와 조합한 항-CD20 항체와 같은 항-B 세포 항체의 투여
본 발명에 따른 다른 방법은, B 세포 항체, 바람직하게는 B 세포 고갈 항체, 가장 바람직하게는 고갈 항-CD20 항체를, CD40/CD40L 상호작용을 방해하는 약제, 바람직하게는 항-CD40 또는 항-CD40L 항체와 조합 사용하여 뇌 림프종을 치료하는것이다.
본 발명의 일실시형태에 따르면, "CD40L 길항제"는 환자에게 항-B 세포 항체, 예를 들어 RITUXAN와 조합 투여되어, CD40L 및 이의 결합 파트너인 CD40의 상호작용을 방해한다. "CD40L 길항제"는 이러한 상호작용을 방해하는 분자로 정의된다. CD40L 길항제는 CD40L에 대한 항체(예를 들어, CD40L 에 대한 모노클로날 항체), CD40L 에 대한 항체의 단편 또는 유도체(예를 들어, Fab 또는 F(ab)'2단편, 키메라 항체 또는 인간화 항체), CD40의 가용성 형태, CD40을 포함하는 융합 단백질의 가용성 형태 또는 CD40L-CD40 상호작용을 방해하거나 간섭하는 약제가 될 수 있다.
항-CD40L 항체를 생산하기 위하여, 포유류에서 항체 반응을 일으킬 수 있는 CD40L 단백질 또는 이의 단백질 단편의 면역원성 형태로 포유류(예를 들어, 마우스, 햄스터, 래빗 또는 유제동물)를 면역화 시킬 수 있다. 이의 표면에서 CD40L을 발현하는 세포를 면역원으로 사용할 수도 있다. 다른 면역원으로는 정제된 CD40L 단백질 또는 단백질 단편이 포함된다. CD40L은 CD40L 발현 세포로부터 표준 정제 기술(Armitageet al.,Nature357:80-82(1992); Ledermanet al.,J. Exp. Med.175:1091-1101(1992); 및 Hollenbaughet al.,EMBO J.11:4313-4321(1992))로 정제할 수 있다. 이와 달리, 문헌(Armitageet al., (1992))에 기재된 바와 같이 CD40L 아미노산 서열에 기초하여 CD40L 펩티드를 생산할 수 있다. 단백질에 면역원성을 부여하는 기술에는 담체에 접합하는 것 또는 본 기술분야에서 주지되어 있는 다른 기술이 포함된다. 예를 들어, 보조제의 존재하에 단백질을 투여할 수 있다. 혈장 또는 혈청에서 항체 역가를 검출함으로써 면역화 과정을 모니터할 수 있다. 항체 수준을 평가하기 위한 항원으로서 면역원을 이용하는 표준 ELISA 또는 다른 면역분석법을 사용할 수 있다. 면역화 후, 항혈청을 얻어 폴리클로날 항체를 분리할 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위하여, 문헌(미합중국 특허 제 5,833,987호(1998) 및 5,747,037호(1997))에 기재된 바와 같이, 항체 생산 세포를 채취하여 표준 체세포 융합 방법으로 골수종 세포와 융합할 수 있다. 유사한 방법으로 항-CD20 및 항-CD40 항체를 생산할 수 있다. 몇가지 항-CD40L 항체, 항-CD40 항체 및 항-CD20 항체가 문헌에 보고되어 있으며, 이는 공중이 이용가능하다.
항체는 단편이 될 수 있으며, 이 단편은 전체 항체에 대하여 상기된 바와 동일한 방법으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2단편은 펩신으로 항체를 처리하여 얻을 수 있다. 얻어진 F(ab')2단편은 Fab' 단편을 얻기 위하여 이황화물 브릿지가 환원되도록 처리될 수 있다. 다른 항체 단편으로는 Fab 및 scFv가 포함된다.
일반적인 면역 억제 이외에 인간의 치료에 사용되는 경우, 비-인간 항체에 대한 인식을 최소화하는 한 가지 방법은, 키메라 항체 유도체, 즉 비-인간 동물 가변 영역 및 인간 불변 영역을 조합한 항체 분자를 생산하는 것이다. 키메라 항체 분자에는 예를 들어 마우스, 래트 또는 다른 종의 항체로부터의 항원 결합 도메인이 포함될 수 있다. 키메라 항체를 만드는 방법에는 문헌(미합중국 특허 제5,833,987호)에 인용된 참조문헌들이 포함된다.
인간을 치료할 목적으로, 가변 영역의 부분들, 특히 항원-결합 도메인의 보존된 골격 영역이 인간 유래이고, 과가변영역만이 비-인간 유래인 인간 가변 영역 키메라를 생산함으로써, CD40L 단백질 또는 펩티드와 특이적으로 반응하는 항체를 더 인간화할 수 있다. 본 기술분야에서 공지된 몇가지 기술 중 어느 기술(예를 들어, Tenget al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.80:7308-7312(1983); Kozboret al.,Immunology Today4:7279(1983)); Olssonet al.,Meth. Enzymol.92:3-16(1982))을 사용하여 이러한 변화된 면역글로불린 분자를 생산할 수 있으며, PCT 공개 WO92/06193 또는 EP 0239400의 교시내용에 따라 생산하는 것이 바람직하다. 인간화 항체는 스코트젠사(Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Great Britain)에 의해 시판 가능하다.
CD40L 단백질 또는 펩티드에 반응성인 특이적 항체 또는 항체 단편을 생산하는 다른 방법은, CD40L 단백질 또는 펩티드를 갖는 박테리아에서 발현되는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편을 암호화하는 발현 라이브러리를 스크리닝하는 것이다. 예를 들어, 파지 발현 라이브러리를 사용하여 박테리아에서 완전한 Fab 단편, VH영역 및 Fv 영역을 발현시킬 수 있다. 예를 들어 문헌(Wardet al.,Nature341:544-546(1989); Huseet al., Science246; 1275-1281(1989); 및 McCaffertyet al.,Nature348:552-554(1990))을 참조한다. 이러한 라이브러리를 예를 들어 CD40L 펩티드를 사용하여 스크리닝하면, CD40L과 반응하는 면역글로불린 단편을 확인할 수 있다. 이와 달리, SCID-hu 마우스(Genpharm에서 입수가능)를 사용하여 항체 또는 이의 단편을 생산할 수 있다.
인간 CD40L 및 마우스 CD40L을 포함하는 CD40L 에 대한 모노클로날 항체(mAb)의 생산 방법, 및 본 발명의 방법에 사용하기 위한 적당한 모노클로날 항체는 PCT 특허출원 제 WO95/06666호의 "항-gp39 항체 및 이의 사용"에 기재되어 있으며, 이의 교시내용은 본 명세서에 전체적으로 참조병합되어 있다. 본 발명의 특히 바람직한 항-인간 CD40L 항체는 하이브리도마 24-31 및 89-76에 의해 각각 생산되는 MAbs 24-31 및 89-76이다. (이들 항체는 미합중국 특허 제 5,747,037호에 기재된 바와 같이 클로닝한다). 89-76 및 24-31 항체를 각각 생산하는 89-76 및 24-31 하이브리도마를 1994년 9월 2일자로 ATCC(American Type Culture Collection, 10801, University Blvd., Manassas, VA 20110-2209)에 부다페스트 조약의 규정 하에 기탁하였다. 89-76 하이브리도마는 ATCC 입수 번호 HB11713호 및 24-31 하이브리도마는 ATCC 입수 번호 HB11712호가 부여되었다.
키메라 및 인간화 항체와 같은 재조합 항-CD40L 항체는 표준 재조합 DNA 기술에 따라 항-CD40L 항체를 암호화하는 핵산(예를 들어, DNA 또는 cDNA)을 조작하여 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 실시형태는 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 일부를 암호화하는 분리된 핵산 분자에 관한 것이다. 면역글로불린-암호화 핵산은, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역(또는 이의 일부)이 결합되어 있거나 결합되지 않은 상태로, 면역글로불린 경쇄(VL) 또는 중쇄(VH) 가변 영역을 암호화할수 있다. 이러한 핵산은 표준 기술에 의해 항-인간 CD40L mAb를 생산하는 세포(예를 들어 하이브리도마)로부터 분리할 수 있다. 예를 들어, 24-31 또는 89-76 mAb를 암호화하는 핵산을 cDNA 라이브러리 스크리닝, PCR 증폭 또는 다른 표준 기술을 사용하여 24-31 또는 89-76 하이브리도마로부터 각각 분리할 수 있다. 또한, 항-인간 CD40L mAb를 암호화하는 핵산을 발현 벡터 내에 포함시키고 적당한 숙주 세포 내에 도입하여, 항-인간 CD40L 항체의 재조합 형태의 발현 및 생산을 용이하게 할 수 있다.
항-CD20, 항-CD40L 또는 항-CD40 항체의 생산에 있어서도 상기된 방법을 사용할 수 있다.
CD40L을 인식하여 결합하고 CD40과 CD40의 상호작용을 억제하는 항체에 부가적으로, 다른 CD40L 길항제를 단독으로 또는 다른 치료(예를 들어, 방사선 또는 화학요법)와 조합하여 B-세포 림프종 및 백혈병의 치료에 사용하는 것이 고려된다. CD40L 길항제는 가용성 CD40L 리간드 형태가 될 수 있다. 가용성 CD40과 같은 CD40L의 일가 가용성 리간드는 CD40L과 결합함으로써, 발현된 B-세포 상에서 CD40L과 CD40의 상호작용을 억제할 수 있다. "가용성"이라는 용어는, 이 리간드가 세포막과 영구적으로 결합되지 않는다는 것을 의미한다. 가용성 CD40L 리간드는 화학 합성 또는 바람직하게는 제조합 DNA 기술, 예를 들어 리간드의 세포외 도메인(트란스멤브레인 및 세포질 도메인)만을 발현시킴으로써 생산할 수 있다. 가용성 CD40이 바람직한 가용성 CD40L 리간드이다. 이와 달리, 가용성 CD40L 리간드는 융합 단백질의 형태가 될 수 있다. 이러한 융합 단백질은 제 2 분자에 부착된 CD40L 리간드의 적어도 일부를 포함하여 이루어진다. 예를 들어, CD40이 면역 글로불린과의 융합 단백질(즉, CD40Ig 융합 단백질)로서 발현될 수 있다. 일 실시형태에서, 면역글로불린 중쇄(예를 들어 Cα1)의 힌지, CH2및 CH3에 대응하는 서열의 아미노산 잔기에 결합된 CD40 분자의 세포외 도메인 부분의 아미노산 잔기를 포함하여 이루어지는 융합 단백질을 생산하여, CD40Ig 융합 단백질을 형성한다(Linsleyet al.,J. Exp. Med.1783:721-730(1991); Caponet al.,Nature337:525-531(1989); 및 미합중국 특허 제 5,116,964호(1992) 참조). 화학 합성 또는 바람직하게는 CD40의 cDNA 에 기초한 재조합 DNA 기술(Stamenkovicet al.,EMBO J.8:1403-1410(1989))을 사용하여 이러한 융합 단백질을 생산할 수 있다.
CD40L 또는 CD40 길항제는 생체내 약제학적 투여에 적합한 생물 적합성 형태로 환자에게 투여한다. "생체내 투여에 적합한 생물 적합성 형태"는 단백질의 치료 효과가 어떤 독성 효과보다 비중있는 길항제의 투여 형태를 의미한다. "환자"라는 용어는 예를 들어 포유류와 같은 면역 반응이 일어날 수 있는 살아있는 유기체를 포함한다. 환자의 바람직한 예로는, 인간, 개, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 마우스, 래트 및 이의 유전자도입종이 포함된다. CD40L 또는 CD40 길항제를 어떤 약리학적 형태로, 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체로 투여할 수 있다. CD40L 또는 CD40 길항제의 치료적 유효량의 투여는, 원하는 결과(예를 들어, 치료하려는 뇌 림프종의 진행 또는 증식 저해)를 얻기 위하여 필요한 기간동안 및 용량의 효과적인 양으로 정의된다. 예를 들어, CD40L 길항제의 치료적 활성량은 환자의 질병 단계(예를 들어, I기 대 IV기), 나이, 성별, 의학적 합병증(예를 들어, AIDS) 및 체중과 같은 인자, 및 환자에게서 원하는 반응을 일으키는 길항제의 능력에 따라 변할 수 있다. 최적의 치료 반응을 위하여 용량 섭생을 조절할 수 있다. 예를 들어, 용량을 여러번으로 나누어 날마다 투여하거나, 치료 상황의 요구에 따라 용량을 점차 감소시킬 수 있다. 항-CD 항체와 같은 활성 화합물은, 그 자체 또는 다른 활성제와 조합하여, 주입(피하, 근육내, 초내, 실내, 정맥내 등), 경구 투여, 흡입, 경피 적용 또는 직장 투여와 같은 편리한 방법으로 투여가능하다. 투여 경로에 따라, 효소, 산 및 화합물을 불활성화할 수 있는 다른 자연 조건의 작용으로부터 화합물을 보호하는 물질로 활성 화합물을 코팅할 수 있다. 바람직한 투여 경로는 정맥내(i.v.) 주입이다.
비경구적 투여 이외의 방법으로 CD40L 길항제 또는 CD40 길항제를 투여하기 위하여, 길항제의 불활성화를 막는 물질로 길항제를 코팅하거나, 길항제를 이 물질과 공동-투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 길항제를 환자에게 적당한 담체 또는 희석제로 투여하거나, 효소 저해제와 함께 또는 리포좀과 같은 적당한 담체 또는 벡터로 공동-투여할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 희석제에는 식염수 및 수용성 완충액이 포함된다. 효소 억제제에는 췌장 트립신 저해제, 디이소프로필플루오로포스페이트(DEP) 및 트라실올이 포함된다. 리포좀에는 통상적인 리포좀 뿐 아니라 워터-인-오일-인-워터(water-in-oil-in-water) 에멀젼이 포함된다(Strejanet al.,J. Neuroimmunol. 7:27(1984)). 추가적인 약제학적으로 허용가능한 담체 및 부형제는 본 기술분야에 공지되어 있다.
활성 화합물은 또한 비경구 또는 복강내 투여될 수 있다. 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물, 및 오일로 분산물을 제조할 수도 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 제제는 미생물의 성장을 막기 위하여 방부제를 함유할 수 있다.
주입에 적합한 약제학적 조성물에는, 임시제제인 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산물 및 멸균 주입액 또는 분산물의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다. 모든 경우, 이 조성물은 멸균되어야 하며, 주사기 사용이 용이한 범위로 액상이 되어야 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정해야 하며, 박테리아 및 균류와 같은 미생물 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액상 폴리에틸렌 글리콜, 등)을 함유하는 용매 또는 분산물 매질, 및 이의 적당한 혼합물이 될 수 있다. 예를 들어 레시틴 등의 코팅을 사용함으로써, 분산물의 경우 필요한 입경을 유지함으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써 적당한 유동성을 유지할 수 있다. 다양한 항박테리아제 및 항균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 타이메로살 등으로 미생물의 작용을 억제할 수 있다. 많은 경우, 등장 약제, 예를 들어, 설탕, 만니톨, 솔비톨 또는 염화나트륨과 같은 폴리알콜을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 약제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 주입 조성물의 흡수를 연장시킬 수 있다.
활성화합물(예를 들어, CD40L 또는 CD40 길항제 자체 또는 이와 다른 활성제또는 항-CD20 항체 및 항-B 세포 항체의 조합)을, 필요시 여기에 열거된 성분 중 하나 또는 이의 조합을 사용하여, 적당한 용매 중에서 필요한 양으로 포함시킨 후, 멸균 여과를 통하여 멸균 주입액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 기본적인 분산 매질 및 상기 열거된 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내에 활성 화합물을 포함시켜 분산물을 제조한다. 멸균 주입액을 제조하기 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조이며, 이를 통하여, 활성 성분 + 이의 이전의 멸균 여과액으로부터의 어떤 추가적인 원하는 성분의 분말을 얻는다.
활성 화합물이 상기된 바와 같이 적당히 보호되는 경우, 단백질을 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체로 경구투여할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "약제학적으로 허용가능한 담체"에는 어떤 및 모든 용매, 분산매질, 코팅, 항박테리아 및 항균제, 등장 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적 활성 물질의 이러한 매질 및 약제의 사용법은 이 기술분야에서 주지되어 있다. 어떤 통상적인 매질 및 약제가 활성 화합물과 적합하지 않은 경우를 제외하고는, 이를 치료 조성물에 사용할 수 있다. CD40L 또는 CD40 길항제와 함께 사용하는 상기 모든 조성물은 조성물 내에 추가 활성 화합물(예를 들어 화학요법제)을 포함하여 이루어질 수도 있다. 또한, 상기 약제학적 조성물은 항-CD20 항체를 포함하여 이루어지는 화합물을 제조할 때 사용할 수도 있다.
VIII. 방사선면역요법을 이용한 CNS 의 치료
치료 또는 진단에 사용하기 위한 활성 항체(예를 들어 항-B 세포 항체 등)에 대하여 방사선 표지에 몇가지 고려사항이 있다. 우선, 방사성동위원소를 선택한후, 방사성동위원소를 항체에 부착시키는 방법을 선택해야 한다. 방사성동위원소의 선택에 관하여, 문헌(Magerstadt, ANTIBODY CONHUGATES AND MALIGNANT DISEASE, 93-109(1991))에 몇가지 고려사항이 제공되어 있다. 원칙적으로, 원하는 방사 범위(종양의 조직 형태, 고형 또는 산재성 종양인지, 및 모든 종양 세포가 항원 양성으로 예상되는지 아닌지를 포함하는 파라미터에 의해 영향을 받는다), 에너지 방출 속도, 주입 시간과 비교되는 동위원소의 반감기, 및 클리어런스 속도, 표지된 항원의 투여 목적이 영상화인지 또는 치료인지 등을 고려해야 한다. 본 발명에 따른 진단 영상화를 목적으로 하는 경우,99Tc,111In,123I 또는131I로 표지하는 것이 바람직하고,111In 또는131I 표지가 가장 바람직한 것으로 생각된다. 본 발명에 따른 치료가 목적인 경우,90Y 또는131I와 같은 β-에미터로 표지하는 것이 바람직하다. 치료 또는 진단에 사용할 수 있는 다른 의학적으로 적합한 동위원소는:186Re,188Re,153Sm,212Bi,32P,211At,67Cu,212Pb 및 Lu의 방사성 동위원소이다.
방사성동위원소를 항체에 부착시키는 방법을 생각하면, 우선 동위원소의 성질을 고려해야 한다. 공유결합으로 동위원소를 단백질에 직접 부착시키는 다수의 방법으로 요오드 동위원소를 항체에 부착시킬 수 있다. 방사능요오드 표지(radioiodine labeling) 법 중 일반적으로 사용되는 두가지 방법은 클로라민 T 표지(Greenet al., Biochem. J.89:114(1963)) 및 요오도젠 표지(Frakeret al.,Biochem. Biophys. Res. Comm.80:849-857(1978))이다. 예를 들어90Y 또는186Re와 같은 금속의 동위원소에 대하여, 항체에 킬레이팅 잔기를 공유결합 부착시킨 후, 킬레이터를 금속에 배위시킴으로써, 일반적으로 이 동위원소를 부착시킨다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌(Gansow et al., 미합중국 특허 제 5,831,175호; 4,454,106호 및 4,472,509호, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참조 병합되어 있다)에 기재되어 있다. 요오드 동위원소(예를 들어,131I)로 표지된 항체는 표적 세포에 내면화시에 할로겐제거되며, 킬레이트화로 표지된 항체는 킬레이터가 방사선-유도 절단되어, 배위 착체가 분리됨으로써 방사성동위원소를 잃게 된다는 것을 주목해야 한다. 몇몇 경우, 착체로부터 분리된 금속은 다시-착체화되어, 비-특이적으로 배치된 동위원소가 더 신속하게 클리어란스되고, 따라서, 비-표적 조직에 독성이 거의 없게 될 수 있다. 예를 들어, EDTA 또는 DTPA와 같은 킬레이터 화합물을 환자에게 주입하여 배출된 방사성금속과 결합하는 킬레이터 풀을 제공하고, 유리 방사성동위원소가 소변으로 쉽게 배설되도록 할 수 있다. 또한, 할로겐제거에 따른 유리 요오드 및 소형 요오드화 단백질이 신체로부터 신속하게 제거되는 것은 주목할 만 하다. 이것은 방사성독성 작용으로부터 골수를 포함하는 정상 조직을 손상시키지 않으므로 유리하다.
투여 방법은 문헌(Magerstadt(1991d))에도 기재되어 있다. 림프종을 치료하기 위하여, 한편으로, 표지된 항체를 신속하게 분배하여 철저히 순환시키는 것이 유리하므로, 특히 주입 부위에 국부적으로 방사선 표지 농도가 높은 것을 피하기위하여, 정맥 내 주입이 우수한 방법으로 생각된다. 정맥내(iv) 투여는 맥관계의 내피 세포 및 내피하 매트릭스를 포함하여 이루어지며 BBB도 구성하는 "혈관 장벽"에 의해 제한된다. 상기된 어떤 주입 경로를 위하여, 적당한 표지된 항체 조성물을 조성하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
투여 시간의 실질적으로 다양하게 선택할 수 있다. 단일 식괴(bolus)로 총 용량이 제공될 수 있다. 이와 달리, 장기간 주입하는 방법 또는 몇주에 걸친 반복 주입을 통하여 용량이 제공될 수 있다. 바람직한 시간 간격은 방사선면역요법 용량에 있어서 6 내지 12 주이다. 방사선면역요법에 저용량이 사용되는 경우, 두 주 간격으로 약제를 투여할 수 있다. 총 치료 용량이 분할하여 전달되는 경우, 2 내지 4일에 걸쳐 투여할 수 있다. 저용량을 주입함에 따라, 짧은 시간간격으로 흔적-표지(trace-labeled) 용량을 투여할 수 있다; 임상적인 목적으로는, 1 내지 2주 간격이 바람직하다.
적용되는 방사계(radiometric) 용량은 실질적으로 변화 가능하다. 면역진단 영상을 위하여, 항체의 흔적-표지가 사용되며, 일반적으로 약 1-20mg의 항체는 약 1 내지 약 35 mCi 의 방사성동위원소로 표지된다. 용량은 영상을 위해 사용되는 동위원소에 따라 다소 결정된다; 범위 중 상한의 양, 바람직하게는 약 20 내지 약 30mCi은99mTc 및123I에 사용되며; 범위 중 하한의 양, 바람직하게는 약 1-10mCi의 양은131I 및111In에 사용되어야 한다. 영상의 목적으로, 약 1 내지 약 30mg의 이러한 흔적-표지 항체를 환자에게 투여한다. 방사선면역요법의 목적으로, 항체를 높은 특이 활성으로 표지한다. 얻어지는 특이 활성은 사용되는 방사성동위원소에 따라 결정된다;131I의 경우, 활성은 일반적으로 1 내지 10mCi/mg이다. 전신에 수용되는 선량이 1,100cGy, 바람직하게는 500cGy 이하인 충분한 양으로 항체를 환자에게 투여한다. 표지 및 비표지 항체를 모두 포함하는 항체의 양은, 환자 체중 kg 당 약 0.2 내지 약 40mg 범위가 가능하다. PCNSL 또는 다른 뇌 림프종의 위치를 진단하거나 결정하기 위하여 표지된 항-CD20 또는 항-CD40을 사용할 수 있다.
신체 전체에 약 500cGy를 제공하는 방사능의 양은131I에 대하여 약 825mCi로 추정된다. 다시 투여되는 방사능의 양은 선택되는 동위원소에 따라 일부 결정된다.131I을 사용하는 치료법의 경우, 약 5 내지 약 1,500mCi, 바람직하게는 약 5 내지 약 800 mCi, 가장 바람직하게는 약 5 내지 약 250mCi를 사용한다.90Y의 경우, 약 1 내지 약 200mCi의 방사능 양이 적합하고, 더 바람직하게는 약 1 내지 약 150mCi, 가장 바람직하게는 약 1 내지 약 100mCi인 것으로 생각된다. 투여된 방사능 양으로부터 조직 용량을 측정하는 바람직한 방법은, 트레이서 용량으로 영상 또는 다른 약물생체반응법을 실시하여, 예측 용량결정(predicted dosimetry) 추정값을 얻는 것이다.
비표지 항체의 "예비-용량" 후 진단 및 치료 투여 중 하나 또는 모두를 실시할 수 있다. 영상 및 치료에 미치는 예비-용량의 효과는 환자에 따라 다양한 것으로 밝혀졌다. 일반적으로, 비표지 항체의 예비-용량을 증가시켜 일련의 진단 영상화 투여를 실시하는 것이 바람직하다. 이어서, 방사선면역요법 용량을 투여하기 전에, 종양 용량 대 전신 용량의 비율이 가장 우수한 예비-용량을 사용한다.
문헌(Goldberget al.)에, 항-암배(CEA) 항원 항체(J.Clin. Oncol.9:548(1991))를 사용하는 고형 종양(암)의 방사선면역진단 영상 및 방사선면역요법이 기재되어 있다. 본 명세서에 전체적으로 참조 병합되어 있는 미합중국 특허 제 4,348,376호 및 4,460,559호에 기재된 물질 및 방법의 많은 실시형태도 뇌 림프종의 진단 및 치료에 대한 본 발명에 적용가능하다. 환자에게 수용되는 방사계 용량의 측정 방법은 참조문헌(Siegelet al.,Med. Phys.20:579-582(1993))에 추가적으로 기재되어 있다.
IX. 약제학적 조성물
본 발명의 항-B 세포 항체(예를 들어, 항-CD20, 항-CD22, 항-CD21, 항-CD40 또는 항-CD40L 항체 또는 이의 단편)는 공유결합 또는 다른 화학적 결합 수단에 의해 검출가능한 마커 또는 약제에 접합 또는 결합한다. 화학적 결합 수단에는 예를 들어 글루타르알데하이드, 헤테로이작용성 및 호모이작용성 링커가 포함될 수 있다. 헤테로이작용성 링커에는 예를 들어 SMPT(숙신이미딜 옥시카보닐-α-메틸-α-(2-피리딜디션)-톨룸), SPDP(N-숙신이미딜-3-(2-피리딜일리티오)프로피오네이트) 및 SMCC(숙신이미딜-4-(N-메일-이미도메틸)-사이클로헥산-1-카복실레이트)가 포함될 수 있다. 호모이작용성 링커에는 예를 들어 DMP(디메틸피멜리미데이트), DMA(디메틸 수베리니데이트) 및 DTBP(디메틸 3,3'-디티오-비스프로피온이미데이트)가 포함될 수 있다.
특정 단백질 검출가능한 마커 및 치료제를 본 발명의 모노클로날 항체의 가변 영역과 재조합을 통해 조합하여, 모노클로날 항체 가변 영역이 이의 결합 특이성을 유지하고, 검출가능한 마커 또는 치료제가 이의 활성을 유지하는 융합 단백질인 조성물을 구성할 수 있다. 이러한 융합 단백질을 구성하는 재조합 방법은 본 기술분야에서 주지되어 있다.
접합되거나 접합되지 않은 모노클로날 항체 또는 재조합 결합 단백질을 포함하여 이루어지는 약제학적 조성물이 본 발명에 포함된다. 약제학적 조성물은 모노클로날 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하여 이루어질 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, "약제학적으로 허용가능한 담체"는 본 기술분야에서 주지된 모든 표준 담체가 될 수 있다. 예를 들어, 적당한 담체에는 인산염 완충 식염수 용액, 오일/물 에멀젼과 같은 에멀젼 및 다양한 형태의 습윤제가 포함될 수 있다. 다른 담체에는 멸균 용액, 정제, 제피정 및 캅셀이 포함될 수도 있다. 일반적으로 이러한 담체에는, 전분, 우유, 설탕, 클레이(clay) 형태, 젤라틴, 스테아르산, 또는 이의 염, 마그네슘 또는 스테아르산 칼슘, 탈크, 식물성 지방 또는 오일, 검, 글리세롤 또는 다른 공지된 부형제와 같은 부형제가 포함될 수 있다. 이러한 담체에는 또한 향미제 및 착색 첨가제, 방부제 또는 다른 성분이 포함될 수 있다. 이러한 담체를 포함하여 이루어지는 조성물은, 주지된 통상적인 방법으로 조성한다. 문헌(REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE(15th ed. 1980))을 참조한다.
진단의 목적으로 항체 및 재조합 결합 단백질을 표지하거나 표지하지 않을 수 있다. 일반적으로, 진단 분석은 세포 표면에서의 인간 CD20에 대한 모노클로날항체 또는 재조합 결합 단백질의 결합을 통해 착체의 형성을 검출한다. 표지되지 않은 경우, 항체 및 재조합 결합 단백질을 응집 분석에서 사용한다. 또한, 면역글로불린에 특이적인 항체와 같은, 모노클로날 항체 또는 재조합 결합 단백질과 특이적으로 반응하는 표지되지 않은 항체를 다른 표지된 항체(2차 항체)와 조합하여 사용할 수 있다. 이와 달리, 모노클로날 항체 및 재조합 결합 단백질을 직접 표지할 수 있다. 방사성핵종, (상기 논의된) 플루오레서(fluorescers), 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제, 리간드(특히 햅텐) 등과 같은 광범위한 다양한 표지를 사용할 수 있다. 많은 형태의 면역분석법이 본 기술분야에 주지되어 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 및 재조합 결합 단백질은 일반적으로 형광 분석에 사용하며, 이 때 환자 항체 또는 재조합 결합 단백질을 플루오레스신 이소티오시아네이트(FITC)와 같은 형광 분자에 접합한다.
이하 제공되는 실시예는 본 발명을 어떤 방식으로 제한하고자 하는 것이 아니며, 본 발명의 바람직한 실시형태를 제공하고자 하는 것이다.
실시예 1
비-인간 영장류의 초내 리툭시맵
수막 재발은 림프종 환자에게서 공통적으로 재발하는 부위이므로, 수막 재발이 일어나는 것을 예방하거나 저해하기 위하여 리툭시맵을 사용하는 것은 유리할 수 있다.
물질 및 방법.피하 오미야 저장소에 부착되어 있는 장기간 내재하는Pudenz 4th 뇌실 카테터를 갖는, 연속적으로 유지된 비-인간 영장류 모델이 NCI에 의해 승인되었다. 이 카테터로 여러 시점에서 마취 동물로부터 뇌척수액(CSF)을 샘플링할 수 있다(McCullyet al.,Lab. Animal Sci. 40:520-525(1990)).
10mg 이하의 리툭시맵 용량을 고농도(10mg/ml)로 투여하거나, 방부제 없이 멸균 식염수 중에서 1ml 이하로 희석한다. 희석된 약물 용액 시료는 나중에 리툭시맵 농도를 분석하기 위하여 저장한다.
사용되는 동물은 몸무게 약 10kg의 다 자란 숫놈 벵골원숭이(Macaca mulatta) 네마리이다. 이 동물을 식이(NIH Open Formula Extruded Non-Human Primate Diet) 유지하되, 하루 두번 공급한다. 동물 #1(CSF 엑세스 디바이스 없음)에게 임시 요부 카테터를 통하여 리툭시맵을 요부내 주입한다. 동물 #1이 리툭시맵의 투여에 대해 내성이 있으면, 추가의 동물 세마리의 측뇌실에 피하 엑세스 디바이스를 통해 리툭시맵 용량을 투여한다. 이러한 동물에게서 4th 뇌실 오미야 저장소로부터 시료를 얻고, 동물 중 한 마리 이상에게서 요부 공간으로부터 시료를 얻는다. 각 CSF 시료의 수집 전후에 뇌실 CSF와 적당히 혼합되도록 오미야 저장소를 네번 펌핑한다. 오미야 저장소를 갖는 동물 두마리에 대해서도, 요부 공간으로부터 뇌실까지의 약물 분배를 평가하기 위하여, 리툭시맵을 요부내 투여한 후 4th뇌실 CSF 샘플링을 할 것이다. 일단 약물생체반응 연구가 완료되면, 세마리의 동물에게 요부내 용량을 6주 이상 매주 주입하여 초내의 리툭시맵 내성을 평가한다.
10mg 이하를 초내 또는 실내 투여하여 4마리의 동물에 대해 리툭시맵의 CSF약물생체 반응을 연구한다. 투여 전에 CSF 시료(0.3ml)를 수집하고, 리툭시맵을 투여한 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 및 24 시간 후에 다시 수집한다. 이들 시료를 -70?C 에서 즉시 동결하여 폴리프로필렌 튜브에 동결저장한다.
실시예 2
래트 모델에서 일차성 CNS 림프종 치료시 뇌척수액으로의 리툭시맵 투여
물질 및 방법. 종양이 없는 누드 래트에게, 조 천자로 항체 용량를 단계적으로 증대 투여하여 독성을 평가한다. 리툭시맵(10mg/ml)을 래트에게 5-100㎕ 부피(래트의 CSF 부피는 약 1ml)로 투여한다. 이어서, 독성이 없음을 가정하여 효능 연구를 실시한다. 항-CD20 감수성이 입증되어 있는 B-림프 종양 세포를 래트의 대조(cisterna magna)에 이식한다. 이어서, 종양 이식 일주일 후에 동물들을 10마리의 두 그룹:대조구 및 리툭시맵 치료구로 나눈다. 종료점은 신경계 성능, 체중 손실, 생존 및 항-림프종 활성의 생물형태계측 및 조직학 상관관계 측정이다.
실시예 3
PCNSL을 사용한 인간 환자의 리툭시맵 시험
물질 및 방법.오미야 저장소에 5-10ml의 리툭시맵을 주입 투여한다. 주입 전에 동일 부피의 CSF를 제거하여 CSF 부피의 큰 변동을 최소화한다(성인의 CSF 평균 부피는 104ml). 어떤 화학요법 또는 방사선요법도 적용하지 않는다. 치료는 5-10ml 부피의 리툭시맵을 오미야 저장소에 주입하는 것으로 구성된다. 리툭시맵의 CSF 및 혈청 수준을 1, 2, 4, 24, 48, 72 시간 및 7일, 그 이후에는 규칙적인 간격을 두고 측정한다.
재발 PCNSL 환자는 병리학 분석시 CD20+이어야 한다. 환자는 17세 이상이어야 하며, KPS가 50 이하이고, 예상 수명이 두달 이하이고, PCNSL 전신성 침습을 가져야 하며, 리툭시맵의 CSF-내 투여 개시 5주 전 이후에 방사선 또는 화학요법을 받을 수 없었다.
연구 환자를 세 그룹으로 나누어, 각 그룹에 오미야 저장소를 통하여 주어진 용량 수준의 리툭시맵을 투여하였다. 일주일 후, 영장류의 계산된 클리어란스로 간격을 결정하여 CSF에 리툭시맵 투여를 반복한다. 리툭시맵 투여를 90일간 진행하고, 그동안 독성 및 반응을 계속 평가한다. 리툭시맵의 CSF-내 투여로 인한 어떤 등급 네가지의 신경독성에 대하여 초기 종결이 필수이다. 신경독성은 안전성을 평가하고, 연구가 종료되어야 하는지 더 낮은 용량이 사용되어야 하는지를 결정하기 위한 기초이다. 주어진 용량 수준에서 독성이 없는 것이 분명하면, 이어서 다음 수준으로 용량을 단계적으로 증대시켜야 한다. 인간의 활성과 관련있는 혈청 바닥(trough) 수준보다 열배 이상 큰, CSF의 리툭시맵의 바닥 수준을 달성하는 안전한 용량을 결정하는 것이 목표이다(McLaughlinet al.,J. Clin. Oncol.16:2825-2833(1998)).
실시예 4
PCNSL을 치료하기 위하여 인간 환자에게 메토트렉세이트와 함께 리툭시맵을 투여하는 방법
리툭시맵과 조합한 초내 메토트렉세이트(15mg)를 매주 네번 250mg/M2내지매주 네번 350mg/M2의 용량으로 사용하여 림프종과 CNS 침습 환자를 치료할 수 있다.
실시예 5
방사성 표지 리툭시맵 및 CHOP로 PCNSL을 치료하는 방법
방사성 표지 리툭시맵 및 화학요법 조합 CHOP(예를 들어, 사이클로소프파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니손)을 하기와 같이 사용하여 PCNSL 환자를 치료할 수 있다. CHOP 치료는 표준 방법에 따라 정맥내 투여한다. 131-요오드로 표지된 리툭시맵은 약 1 내지 약 10mCi의 용량으로 환자에게 초내 투여하며, 리툭시맵(표지 및 비표지 모두)의 양은 환자 체중 kg당 약 0.2 내지 약 40mg 범위이다. 방사성 리툭시맵은 단일 식괴로 투여하거나 약 2 내지 약 4일의 기간에 걸쳐 투여할 수 있다.
상기된 모든 참조 문헌은 전체적으로 본 명세서에 참조 병합되어 있다.

Claims (50)

  1. 치료적 유효량의 항-CD20 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는 중추신경계(CNS) 림프종의 치료 방법.
  2. 치료적 유효량의 항-CD20 항체 또는 이의 단편을 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는 림프종 환자의 수막 재발의 치료 또는 예방 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 CNS 림프종이: 일차성 CNS 림프종, (PCNSL) 연수막 전이(LM) 또는 CNS 침습된 호지킨 질병으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 CNS 림프종은 LM이고, 항-CD20 항체 또는 이의 단편이 시타라빈 및 티오테파 또는 메토트렉세이트 및111In-디에틸렌트리아민 펜타아세트산과 조합 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체 단편이 Fab, Fab' 및 F(ab')2으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 2항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체 단편이 Fab, Fab' 및 F(ab')2으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 인간 항체이거나, 인간화, 이특이적 또는 키메라인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 2항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 인간 항체이거나, 인간화, 이특이적 또는 키메라인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD20 은 리툭시맵 또는 IF5인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 2항에 있어서,
    상기 항-CD20 은 리툭시맵 또는 IF5인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 리툭시맵이고, 주당 약 10mg 내지 약 375mg/M2의 용량으로 4주동안 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 리툭시맵이고, 주당 약 10mg 내지 약 375mg/M2의 용량으로 4주동안 환자에게 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 초내 또는 실내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 2항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 초내 또는 실내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 메토트렉세이트, CHOP, CHOD 시타라빈, 류코보린, 티오테파 및 빈크리스틴 또는 이의 조합물과 조합 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 2항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 메토트렉세이트, CHOP, CHOD 시타라빈, 류코보린, 티오테파 및 빈크리스틴 또는 이의 조합물과 조합 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 전체 뇌 방사선 조사 전에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 리툭시맵이고, 메토트렉세이트와 함께 초내 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 리툭시맵이고, 항체가 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    리툭시맵은211At,212Bi,67Cu,123I,131I,111In,32P,212Pb,186Re,188Re,153Sm,99mTc, 또는90Y로 구성되는 그룹에서 선택되는 동위원소로 표지되어 방사선면역요법적 유효량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 방사선면역요법적 유효량은 환자의 전신에 약 10 내지 약 200cGy의 범위의 용량으로 방사선 조사되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 22항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 항-CD40 항체 또는 CD40과 CD40L의 상호작용을 억제하는 약제와 조합 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 인간 체중 kg당 약 0.001 내지 약 30mg의 약제학적으로 허용가능한 항체 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 인간 체중 kg당 약 0.001 내지 약 25mg의 약제학적으로 허용가능한 항체 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 인간 체중 kg당 약 0.4 내지 약 20.0mg의 약제학적으로허용가능한 항체 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. (A) 환자에게 검출가능한 표지에 결합된 항-CD20 항체 또는 항-CD20 항체 단편을 투여하는 단계; 및
    (B) 상기 표지의 위치를 검출하는 단계를 포함하여 이루어지는 환자의 PCNSL 진단 방법.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 검출가능한 표지는211At,212Bi,67Cu,123I,131I,111In,32P,212Pb,186Re,188Re,153Sm,99mTc, 또는90Y인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 26항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 리툭시맵인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 뇌 혈액 장벽(BBB) 투과성 촉진제에 결합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서,
    상기 BBB 투과성 촉진제는 OX-26, B3/25, Tf6/14, OKT-9, L5.1, 5E-9, RI7 217 또는 T58/30인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 1항에 있어서,
    상기 항-CD20 항체는 친지성 벡터 또는 면역친지성 벡터를 더 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31항에 있어서,
    상기 친지성 벡터는 프로카바진, 오메가-3 지방산, 디아실 글리세롤, 디아실 포스포리피드, 라이소-포스포리피드, 콜레스테롤 또는 스테로이드인 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 1항에 있어서,
    항-B 세포 항체 또는 이의 단편을 항-CD20 항체 또는 이의 단편과 조합하여 투여하는 단계를 더 포함하여 이루어지는 방법.
  34. 제 33항에 있어서,
    상기 항-B 세포 항체는, 항-CD19 항체 또는 이의 단편, 항-CD22 항체 또는 이의 단편, 항-CD38 항체 또는 이의 단편, 또는 항-주 조직적합성 복합체(MHC) II 항체 또는 이의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 항체가 인간 체중 kg당 약 0.4 내지 약 20.0 mg의 용량으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 항-CD20 항체 및 항-B 세포 항체를 포함하여 이루어지는 초내 투여를 위한 CNS 림프종 치료용 조성물.
  36. B 세포 항원에 결합된 치료적 유효량의 항체 또는 항체 단편을 초내 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는 중추 신경계(CNS) 림프종의 치료 방법.
  37. 제 36항에 있어서,
    상기 항원이 CD10, CD14, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CD75, CD76, CD77, CD78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 및 CD86 으로 구성되는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 36항에 있어서,
    상기 항체는 B 세포 고갈 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 36항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 독소에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 36항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 약물에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 36항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 효소에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 36항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 방사성핵종에 접합된 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제 36항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 하나 이상의 화학요법과 조합 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서,
    상기 화학요법제는, 티오테파, 사이클로포스파미드, 부술판, 임프로술판, 피포술판, 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파, 우레도파, 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포라미드, 트리에틸렌티오포스파오라미드, 트리메틸로로멜라민, 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜파란, 노벰비에힌, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스터드, 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모이나이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이담비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실(5-FU), 데놉테린, 메토트렉세이트, 프테롭테린, 트리메트렉세이트, 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌, 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모퍼, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU, 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄, 프롤린산, 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코사이드, 아미노레불린산, 암사크린, 베스트라부실, 비산트렌, 에다트락세이트, 데포파민, 데메콜신, 디아지쿠온, 엘포르니틴, 엘립티늄 아세테이트, 에토글루시드, 갈륨 나이트레이트, 하이드록시우레아, 렌티난, 로니다민, 미토구아존, 미톡산트론, 모피다몰, 니트라크린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 포도필린산, 2-에틸하이드라지드, 프로카바진, 라족산, 시조프란, 스피로게르마늄, 테누아존산, 트리아지쿠온, 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민, 우레탄, 빈데신, 다카바진, 만노무스틴, 미토브로니톨, 미토락톨, 피포브로만, 가사이토신, 아라비노사이드, 사이클로포스파미드, 티오테파, 파클리탁셀, 독세탁셀, 클로람부실, 겜시타빈, 6-티오구아닌, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트,시스플라틴, 카보플라틴, 빈플라스틴, 플라티늄, 에토포사이드(VP-16), 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크리스틴, 비노렐빈, 나벨빈, 노반트론, 테니포사이드, 다우노마이신, 아미노프테린, 크엘로다, 이반드로네이트, 토포이소머라제 억제제, 디플루오로메틸오르니틴(DMFO), 레티놀산, 에스페라미신, 카페시타빈, 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해 4(5)-이미다졸, 4 하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 토레미펜, 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드, 고세렐린; 및 상기된 어떤 것의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 36항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 CD19, CD20, CD21, CD22, CD37 및 CD40에서 구성되는 그룹에서 선택되는 B 세포 항원에 특이적인 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 45항에 있어서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 RITUXAN이고, 상기 치료 방법은 사이토카인 투여를 더 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 46항에 있어서,
    상기 사이토카인은 IL-10인 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제 36항에 있어서,
    고갈 항-CD20 항체 및 CD40L 길항제를 투여하는 단계를 포함하여 이루어지는 방법.
  49. 제 48항에 있어서,
    상기 CD40L 길항제는 CD40L에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 36항에 있어서,
    CD20에 대한 방사성표지 항체를 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
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