KR20030016233A - 사람 정신분열증 유전자 - Google Patents

Abstract

뉴레굴린 1 유전자 (NRG1)을 포함하고 NRG1 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 공개한다. 또한 NRG1 폴리펩티드를 엔코딩하는 관련 핵산, NRG1 폴리펩티드, NRG1 폴리펩티드에 결합하는 항체; 정신분열증에 대한 감수성의 진단 방법; NRG1 폴리펩티드의 활성을 변경하거나 NRG1 결합 제제를 동정하는 제제에 대한 분석법; 분석법에 의해 동정된 제제 또는 결합 제제; NRG1 핵산, NRG1 폴리펩티드 또는 NRG1 폴리펩티드의 활성을 변경하는 제제를 포함하는 NRG1 치료 제제; NRG1 치료 제제를 포함하는 약제학적 조성물 및 정신분열증 치료 방법을 기술한다.

Description

사람 정신분열증 유전자 {HUMAN SCHIZOPHRENIA GENE}

정신분열증은 전세계 인구의 0.5% 내지 1%에 만연되어 있는 정신병리학의 파괴적인 형태이다. 쌍둥이 및 입양자 연구는 유전적 요인 및 환경적 요인 둘 모두가 감수성에 영향을 끼침을 시사하였다 (참고 문헌: Tsuang, M.T. et al., Schizophr. Res. 4(2):157-71, 1991; Tienari, P.J. and Wynne, L.C., Ann. Med. 26(4):233-7, 1994; Franzek, E. and Beckmann, H., Am. J. Psychiatry 155(1):76-83, 1998; Tsuang, M. T., J. Biomed. Sci. 5(1):28-30, 1998). 직계가족 사이에서, 정신분열증에 걸린 개체의 부모의 경우 6%에서부터 형제들은 10%, 아이들의 경우 13%에까지 발병 위험률은 다양한 것으로 보고되었으며; 부모중 한명이 또한 정신분열증인 경우, 형제에 대한 위험률은 17%로 증가하고, 두명의 정신분열증 환자의 아이는 46%의 발병 위험률을 가진다 (참고 문헌: McGue, M. and Gottesmann, I.I., Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci 240:174-181, 1991; Lim, L.C. and Sim, L.P., Singapore Med. J. 33(6):645-7, 1992). 그러나 전달 형태는 불명확한 채로 남아있다.

3번, 5번, 6번, 8번, 10번, 13번, 20번, 22번 염색체 및 X 염색체 상의 유전자좌를 포함하여, 몇몇 유전자좌에 대한 시사적인 연관성에 관한 보고서들이 간행되었다 (참고 문헌: for chromosomes 3p and 8p, Pulver, A.E., et al., Am. J.Med. Genet. 60(4):252-60, 1995; for chromosomes 5q, 6p and 8p, Kendler, K.S. et al., Am. J. Med. Genet. 88(1):29-33, 1999; for chromosomes 5q, 6p, 8p, 20p and 22q, Hovatta, I. et al., Mol. Psychiatry 3(5):452-7, 1998; for chromosome 6p, Schwab, S.G. et al., Nat. Genet. 11(3):325-7, 1995, Brzustowicz, L.M. et al., Am. J. Hum. Genet. 61(6):1388-96, 1997 and Cao, Q. et al., Genomics 43(1):1-8, 1997; for chromosomes 6 and 8, Straub, R.E. et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol 61I:823-33, 1996; for chromosome 8, Kendler, KS. et al., Am. J. Psychiatry 153(12):1534-40, 1996; for chromosome 10, Straub, R.E. et al., Am. J. Med. Genet. 81(4):296-301, 1998 and Schwab, S.G. et al., Am. J. Med. Genet. 81(4):302-307, 1998; for chromosome 13, Lin, M.W. et al., Psyciatr. Genet. 5(3):117-26, 1995; Lin, M.W. et al., Hum. Genet. 99(3):417-420, 1997 and Blouin, J.L. et al., Nat. Genet. 20(1):70-73, 1993 (8 and 13); for chromosome 22, Gill, M. et al., Am. J. Med. Genet. 67(1):40-45, 1996 and Bassett, A.S. et al., Am. J. Med. Genet. 81(4):328-37, 1998; and for the X chromosome, Milunsky, J. et al., Clin. Genet. 55(6):455-60, 1999).

발명의 요약

본 발명은 뉴레굴린 1 유전자(NRG1)을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 일 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 1의 상보서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가로 본 발명은 매우 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 1의 상보서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 핵산 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가적으로 NRG1 폴리펩티드(예를 들어, SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38, 또는 NRG1 폴리펩티드의 또 다른 스플라이싱 변이체)를 엔코딩하는 단리된 핵산 분자(예를 들어, cDNA 분자)에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 선택적인 혼성화를 위한 적절한 조건하에서 시료를 NRG1 폴리펩티드를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열(예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 1의 상보서열; SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38, 또는 NRG1 폴리펩티드의 또 다른 스플라이싱 변이체를 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열), 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하는 제 2 핵산 분자와 접촉시키는 것을 포함하여, 시료내의 NRG1의 전부 또는 일부분을 포함하는 핵산 분자의 존재에 대해 시료를 검정하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가적으로 NRG1 폴리펩티드, 이의 단편 또는 유도체의 발현의 수준을 검출(직접 또는 간접적으로)하는 것을 포함하여, NRG1 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 유도체의 발현의 수준에 대해 시료를 검정하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 조절 서열에 작동가능하게 연결된 본 발명의 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터, 뿐만 아니라 상기 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 핵산 분자의 발현을 위한 적합한 조건하에 본 발명의 재조합 숙주 세포를 배양시키는 것을 포함하여, 본원에 기술된 단리된 핵산 분자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드(NRG1 폴리펩티드)를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 추가로 본 발명의 단리된 핵산 분자에 의해 엔코딩된 단리된 폴리펩티드(예를 들어, NRG1 폴리펩티드), 뿐만 아니라 이의 단편 또는 유도체를 제공한다. 특정 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38 중의 임의의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 NRG1 폴리펩티드의 또 다른 스플라이싱 변이체이다. 또한 본 발명은 SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38중의 임의의 하나의 아미노산 서열과 약 90% 초과의 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.

또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 선택적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 뿐만 아니라 시료를 엔코딩된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 것을 포함하여, 시료내에 본 발명의 단리된 핵산 분자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 존재를 검정하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 정신분열증에 대한 소인을 진단하는 방법에 관한 것이다. 개체의 정신분열증에 대한 소인을 진단하는 방법은 NRG1내의 돌연변이의 존재를 검출하는 것 뿐만 아니라 NRG1 폴리펩티드의 상이한 스플라이싱 변이체의 존재와 같은 NRG1 폴리펩티드의 발현에 있어서의 변화를 검출하는 것을 포함한다. 발현에서의 변화는 양적, 질적, 또는 양적 및 질적 둘 모두 일 수 있다.

본 발명은 추가적으로 하나 이상의 NRG1 폴리펩티드의 활성 또는 발현을 변화시키는(예를 들어, 증강시키거나 억제시키는) 제제를 동정하기 위한 분석법에 관한 것이다. 예를 들어, NRG1 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체를 함유하는 세포, 세포성 분획 또는 용액은 시험대상인 제제와 접촉될 수 있으며, NRG1 폴리펩티드 발현 또는 활성의 수준이 평가될 수 있다. 하나 이상의 NRG1 폴리펩티드의 활성 또는 발현은 동시에 평가될 수 있다(예를 들어, 세포, 세포성 분획 또는 용액은 상이한 스플라이싱 변이체와 같은 NRG1 폴리펩티드의 하나 이상의 타입을 함유할 수 있고, 상이한 폴리펩티드 또는 스플라이싱 변이체의 수준은 평가될 수 있다).

또 다른 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 NRG1 폴리펩티드와 상호작용하는 폴리펩티드를 동정하기 위한 검정에 관한 것이다. 효모 2-하이브리드 시스템에서, 예를 들어, DNA 결합 도메인 및 NRG1 폴리펩티드, 스플라이싱 변이체, 또는 이의 단편 또는 유도체를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 제 1 벡터가 사용되고, 전사 활성화 도메인을 엔코딩하는 핵산, 및 NRG1 폴리펩티드, 스플라이싱 변이체, 또는 이의 단편 또는 유도체와 잠재적으로 상호작용할 수 있는 폴리펩티드(예를 들어, NRG1 폴리펩티드 결합제 또는 수용체)를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터가 사용된다. 적당한 조건하에 제 1 벡터 및 제 2 벡터 둘 모두를 함유하는 효모의 배양을 통해 NRG1 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체와 상호작용함으로써 NRG1 폴리펩티드의 발현의 활성을 변화시키는 제제일 수 있는 폴리펩티드의 동정이 가능하다.

NRG1 폴리펩티드 발현 또는 활성을 증강시키거나 억제시키는 제제는, NRG1 또는 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 증강시키거나 억제시키는 제제와 NRG1 및/또는 폴리펩티드를 함유하는 세포를 접촉시키거나 NRG1 폴리펩티드를 접촉시킴으로써 NRG1 폴리펩티드 발현 또는 활성을 변화시키는(증강시키거나 억제시키는) 방법에서와 같이, 본 발명에 포함된다.

추가적으로, 본 발명은 본 발명의 핵산, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 NRG1폴리펩티드의 활성을 변화시키는 제제를 포함하는 제제학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 핵산, 본 발명의 폴리펩티드, NRG1 폴리펩티드의 활성을 변화시키는 제제, 또는 핵산, 폴리펩티드, 및/또는 NRG1 폴리펩티드의 활성을 변화시키는 제제를 포함하는 조성물과 같은 NRG1 치료제를 투여함으로써 정신분열증을 치료하는 방법에 관한 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 8p21-11상의 정신분열증 유전자좌에 대한 비파라미터적 멀티포인트 LOD 스코어의 대표도이다.

도 2는 정신분열증에 걸린 개체에서 발견된 일배체형 (haplotype)을 도시한 것이다. 여러 일배체형에서 발견된 부분들을 녹색으로 도시하였다.

도 3은 시퀀싱된 BACS의 순서 및 유전자좌 8p12에서 정신분열증에 대한 위험 상태에 대한 경계를 도시한 것이다.

도 4는 엑손, 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP), 및 유전자좌 8p12에서 뉴레굴린 1 유전자의 엑손을 도시한 것이다. 원통형은 돌연변이에 대해 스크리닝된 부분이고; N은 새로운 엑손이고; 속이 빈 별모양은 SNP(코딩)이고; 채워진 별모양은 SNP(비번역된)이고; 속이 빈 원은 5' 엑손이고; 채워진 원은 3' 엑손이고; 선은 게놈 네이버(neighbor)이다.

본원에 기술하는 바와 같이, 출원인은 염색체 8p12상의 1.5 Mb 시그먼트 (segment)에 위치하는 정신분열증에 대한 질환 감수성 유전자를 동정하기 위해 연관성 및 일배체형 분석을 사용하였다. 상기 유전자는 뉴레굴린 1 유전자(NRG1)이다. 뉴레굴린 1 유전자의 전체 서열을 부록 I에 나타내었다. 서열내의 마이크로세틀라이트(microsatellite) 마커 및 단일 염기 다형성(SNP)를 부록 II에 나타내었다. 부록 III에는 뉴레굴린 1 유전자 엑손에 대한 스플라이스 변이체를 나타내었다.

본 발명의 핵산

따라서, 본 발명은 포유류(예를 들어, 영장류 또는 사람) 뉴레굴린 1 유전자(NRG1)을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 용어 "NRG1"은 8p21-11 유전자좌에서 단리된 핵산 분자(이는 정신분열증에 대한 감수성과 관련되어 있다), 및 NRG1 폴리펩티드(예를 들어, 부록 I에 기술된 바와 같이 SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38을 갖는 폴리펩티드, 또는 NRG1 폴리펩티드의 또 다른 스플라이싱 변이체)를 엔코딩하는 단리된 핵산 분자(예를 들어, cDNA 또는 유전자)를 칭한다. 바람직한 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1(부록 I에 기술된) 또는 SEQ ID NO: 1의 상보서열을 포함한다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 단리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1의 서열 또는 SEQ ID NO: 1의 상보서열을 포함하되, 부록 II에 기술된 바와 같이 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 다형성이 존재한다.

본 발명의 단리된 핵산 분자는 RNA, 예를 들어 mRNA, 또는 cDNA 및 게놈 DNA와 같은 DNA일 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "뉴레굴린 1 유전자 핵산"("NRG1-핵산")은 NRG1을 엔코딩하는 핵산 분자(RNA, mRNA, cDNA 또는 단일가닥이거나 이중가닥인 게놈 DNA)를 칭한다. DNA 분자는 이중가닥이거나 단일가닥일 수 있고; 단일 가닥 RNA 또는 DNA는 코딩 또는 센스 가닥, 또는 비코딩 또는 안티센스 가닥일 수 있다. 핵산 분자는 유전자의 코딩 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있고 인트론 및 비코딩 3' 및 5' 서열(예를 들어, 조절 서열을 포함하여)과 같은 추가적인 비코딩 서열을 추가로 포함할 수 있다. 추가적으로, 핵산 분자는 마커 서열, 예를 들어, 폴리펩티드의 단리 또는 정제시에 도움을 주는 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열과 융합될 수 있다. 이러한 서열에는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST) 융합 단백질을 엔코딩하는 서열 및 인플루엔자로부터의 적혈구응집소 A(HA) 폴리펩티드 마커를 엔코딩하는 서열이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "단리된" 핵산 분자는 정상적으로 유전자 또는 뉴클레오티드 서열의 측부에 있고/있거나(게놈 서열에서와 같이) 다른 전사된 서열로부터 완전히 정제되거나 부분적으로 정제된(예를 들어, RNA 라이브러리에서와 같이) 핵산으로부터 분리된 핵산 분자이다. 예를 들어, 본 발명의 단리된 핵산은 천연 발생하는 복잡한 세포성 환경, 또는 재조합 기술에 의해 생성되는 경우 배양 배지, 또는 화학적으로 합성되는 경우 화학적 전구체 또는 다른 화학물질에 대해서 실질적으로 단리될 수 있다. 일부 예에서, 단리된 물질은 조성물(예를 들어, 다른 물질을 함유하는 미정제 추출물), 완충 시스템 또는 시약 혼합물의 일부분을 형성할 것이다. 다른 환경에서는, 상기 물질은 예를 들어, PAGE 또는 HPLC와 같은 컬럼 크로마토그래피에 의해 결정되는 바와 같이, 본질적인 동종성에 대해 정제될 수 있다. 바람직하게는, 단리된 핵산 분자는 존재하는 모든 종의 거대분자중 약50, 80 또는 90%(몰농도를 기준으로 하여) 이상을 포함한다. 게놈 DNA에 관하여, 용어 "단리된"은 또한 게놈 DNA가 천연적으로 결합되어 있는 염색체로부터 분리된 핵산 분자를 칭할 수 있다. 예를 들어, 단리된 핵산 분자는 상기 핵산 분자가 유래된 세포의 게놈 DNA내의 핵산 분자의 측부에 있는 약 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb 또는 0.1 kb 미만의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다.

상기 핵산 분자는 그 밖의 코딩 또는 조절 서열과 융합될 수 있으며 여전히 단리되었다고 여겨진다. 따라서, 벡터내에 함유된 재조합 DNA는 본원에서 사용되는 "단리된"의 정의내에 포함된다. 또한, 단리된 핵산 분자는 이종 숙주 세포내의 재조합 DNA 분자 뿐만 아니라 용액내의 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제된 DNA 분자를 포함한다. "단리된" 핵산 분자는 또한 본 발명의 DNA 분자의 생체내 및 시험관내 RNA 전사체를 포함한다. 단리된 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열은 화학적으로 합성되거나 재조합 수단에 의해 합성된 핵산 분자 또는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 그러므로, 벡터에 함유된 재조합 DNA는 본원에서 사용되는 "단리된"의 정의에 포함된다. 또한, 단리된 뉴클레오티드 서열은 이종 생물체의 재조합 DNA 분자 뿐만 아니라 용액중의 부분적으로 정제되거나 실질적으로 정제된 DNA 분자를 포함한다. 본 발명의 DNA 분자의 생체내 및 시험관내 RNA 전사체는 또한 "단리된" 뉴클레오티드 서열에 포함된다. 이러한 단리된 뉴클레오티드 서열은 엔코딩된 폴리펩티드의 제조에서 상동 서열을 단리하거나(예를 들어, 다른 종의 포유류로부터), 유전자를 매핑하거나(예를 들어, 염색체를 사용하는 동일계내(in situ) 혼성화에 의해), 예를 들어, 노던 블롯 분석에 의해 조직(예를 들어, 사람조직)에서의 유전자의 발현을 검출하기 위한 탐침으로서 유용하다.

본 발명은 또한 반드시 천연에서 발견되는 것은 아니지만 NRG1 폴리펩티드(SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 NRG1 폴리펩티드의 또 다른 스플라이싱 변이체)를 엔코딩하는 변이체 핵산 분자에 관한 것이다. 따라서, 예를 들어, 천연 뉴클레오티드 서열과 상이한 서열을 포함하지만, 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 본 발명의 NRG1 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA 분자는 또한 본 발명의 대상이다. 본 발명은 또한 일부분(단편) 또는 NRG1 폴리펩티드의 유사체 또는 유도체와 같은 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 변이체는 대립형질의 변이 또는 단일 뉴클레오티드 다형성의 경우에서와 같이 천연발생하거나, 다양한 돌연변이원 및 돌연변이생성 과정에 의해 유도되는 것과 같이 천연발생하지 않을 수 있다. 의도된 변이에는 첨가 또는 결실을 포함하여, 보존적 또는 비보존적 아미노산 변화를 초래할 수 있는 하나 이상의 뉴클레오티드의 첨가, 결실 및 치환이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 뉴클레오티드(및/또는 생성된 아미노산) 변화는 침묵성이거나 보존된다; 즉, 이들은 NRG1 폴리펩티드의 특징 또는 활성을 변화시키지 않는다. 바람직한 일 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 다형성 마이크로세틀라이트 마커를 포함하는 단편이다(예를 들어, 부록 II에 기술된 바와 같이). 또 다른 바람직한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 NRG1 유전자내에 하나 이상의 뉴클레오티드 다형성을 포함하는 단편이다(예를 들어, 부록 II에 기술된 바와 같이).

본 발명의 핵산 분자의 다른 변경에는 예를 들어, 표지, 메틸화, 비하전된 결합(예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카르바메이트), 하전된 결합(예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트), 펜던트 잔기(예를 들어, 폴리펩티드), 인터컬레이터(intercalator)(예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌), 킬레이터, 알킬레이터 및 수식된 연결 (예를 들어, 알파 아노머 핵산)과 같은 뉴클레오티드간 변화가 포함될 수 있다. 또한 수소 결합 및 다른 화학적 상호작용을 통해 지정된 서열에 결합하는 능력면에서 핵산 분자를 모방한 합성 분자가 포함된다. 이러한 분자에는 예를 들어, 분자의 골격에서 포스페이트 결합이 펩티드 결합으로 대체된 분자들이 포함된다.

또한 본 발명은 예를 들어, 선택적인 혼성화를 위한 매우 엄격한 혼성화 조건하에 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 핵산 분자(예를 들어, 본원에 기술되고, 임의로 상기 폴리펩티드의 활성을 가진 폴리펩티드를 엔코딩하는 뉴클레오티드서열과 특이적으로 혼성화되는 핵산 분자)에 관한 것이다. 일 구체예에서, 본 발명은 매우 엄격한 혼성화 조건하에(예를 들어, 선택적인 혼성화를 위한) SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 1의 상보서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화되는 본원에 기술된 변이체를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 본 발명은 매우 엄격한 혼성화 조건하에(예를 들어, 선택적인 혼성화를 위한) SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38로부터 선택된 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열과 혼성화 되는 본원에 기술된 변이체를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 매우 엄격한 혼성화 조건하에 혼성화되는 변이체는 NRG1의활성(예를 들어, 결합 활성)을 갖는다.

이러한 핵산 분자는 특이적인 혼성화(예를 들어, 매우 엄격한 조건하에)에 의해 검출되고/되거나 단리될 수 있다. 본원에서 사용되는 "특이적인 혼성화"는 제 1 핵산이 제 2 핵산 이외의 어떠한 핵산과 혼성화되지 않도록 하는 수단으로(예를 들어, 제 1 핵산이 혼성화가 수행되는 시료내의 어떤 다른 핵산에 대한 유사성 보다 제 2 핵산과 더 높은 유사성을 가지는 경우) 제 2 핵산에 혼성화되는 제 1 핵산의 능력을 칭한다. 혼성화를 위한 "엄격한 조건"은 제 2 핵산에 대한 특정 핵산의 혼성화를 가능하게 하는 인큐베이션 및 세척 조건, 예를 들어, 온도 및 완충액 농도의 조건을 칭하는 당분야의 용어이며; 제 1 핵산은 제 2 핵산에 대해 완벽하게(즉, 100%) 상보적일 수 있거나, 제 1 및 제 2 핵산은 완벽한 상보성 미만으로 어느 정도의 상보성(예를 들어, 70%, 75%, 85%, 95%)을 공유할 수 있다. 예를 들어, 특정한 매우 엄격한 조건은 완벽하게 상보적인 핵산과 상보성이 낮은 핵산을 구별하는데 사용될 수 있다. 핵산 혼성화를 위한 "매우 엄격한 조건", "보통 엄격한 조건" 및 "다소 엄격한 조건"은 문헌[Current Protocols in Molecular Biology]의 페이지 2.10.1-2.10.16 및 페이지 6.3.1-6.3.6에 설명되어 있다(참고 문헌: Ausubel, F.M. et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, 1998, 본 문헌의 전체 교시를 본원에 참조로 인용하였다). 혼성화의 엄격도를 결정하는 정확한 조건은 이온 강도(예를 들어, 0.2XSSC, 0.1XSSC), 온도(예를 들어, 실온, 42℃, 68℃) 및 포름아미드와 같은 탈안정화제 또는 SDS와 같은 변성제의 농도 뿐만 아니라 핵산 서열의 길이, 염기 조성, 혼성화되는 서열간의불일치 (mismatch) 퍼센트 및 다른 비-동일 서열내의 상기 서열의 서브세트의 존재의 빈도에 달려 있다. 따라서, 동등한 조건은 두 가지 핵산 분자간의 동일성 또는 유사성의 유사한 정도를 유지시키면서 하나 이상의 이들 파라미터를 변경함으로써 결정될 수 있다. 전형적으로, 조건은 서로에 대해 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 약 95% 이상 또는 그 이상 동일한 서열이 서로 혼성화되어 유지되도록 사용된다. 어떠한 혼성화도 일어나지 않는 엄격도의 수준로부터 혼성화가 최초로 발견되는 수준까지 혼성화 조건을 변경시킴으로써, 소정의 서열이 시료내의 가장 유사한 서열과 혼성화(예를 들어, 선택적으로)되도록 하는 조건을 결정할 수 있다.

예시적인 조건은 문헌(참고 문헌: Krause, M.H. and S.A. Aaronson, Methods in Enzymology, 200:546-556, 1991)에 기재되어 있다. 또한, 문헌 (Ausubel, et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, 1998)에는 적당하거나 낮은 엄중 조건을 위한 세척 조건의 결정이 기재되어 있다. 세척은 대개 하이브리드의 상보성의 최소 수준을 결정하기 위해 세팅된 조건중의 단계이다. 일반적으로, 동종 혼성화만이 일어나는 가장 낮은 온도로부터 시작하여, 1℃씩 최종 세척 온도를 감소시키는 것은(SSC 농도는 일정하게 유지) 혼성화되는 서열사이에 불일치의 최대 크기를 1%까지 증가시킨다. 일반적으로, SSC의 농도의 배가는 약 17℃로의 T_m에서의 증가를 초래한다. 이러한 지침을 사용하여, 세척 온도는 발견된 불일치의 수준에 따라, 높거나, 중간 또는 낮은 엄격도에 대한 경험에 의해결정될 수 있다.

예를 들어, 낮은 엄격도 세척은 0.2XSSC/0.1% SDS를 함유하는 용액중에 실온에서 10분 동안 세척하는 것을 포함할 수 있고; 중간 엄격도 세척은 0.2XSSC/0.1% SDS를 함유하는 예비가열된(42℃) 용액중에 42℃에서 15분 동안 세척하는 것을 포함할 수 있고; 높은 엄격도 세척은 0.1XSSC/0.1% SDS를 함유하는 예비가열된(68℃) 용액중에 68℃에서 15분 동안 세척하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 세척은 당분야에 공지된 바와 같이 바람직한 결과를 얻기위해 반복적으로 또는 순차적으로 수행될 수 있다. 동등한 조건은 표적 핵산 분자와 사용된 프라이머 또는 탐침 사이의 동일성 또는 유사성의 유사한 정도를 유지시키면서, 당분야에 공지된 바와 같이, 예로써 주어진 하나 이상의 파라미터를 변경시킴으로써 결정될 수 있다.

2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 동일성(%)은 최적의 비교 목적을 위해 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다(예를 들어, 갭이 제 1 서열의 서열에 도입될 수 있다). 그런 다음 상응하는 부분에서 뉴클레오티드 또는 아미노산을 비교하고, 두 서열간의 동일성(%)는 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, 동일성(%) = 동일한 위치의 수/위치의 전체수 x 100). 특정 구체예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 70%, 80% 또는 90% 이상이다. 두 서열의 실제 비교는 널리 공지된 방법, 예를 들어, 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 수학적 알고리즘의 바람직한 예는 문헌 (Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877, 1993)에 기재되어 있지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 알고리즘은 문헌(Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997)에 기술된 바와 같이 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)에 혼입되어 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각각의 프로그램(예를 들어, NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다. 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 참조하라. 일 구체예에서, 서열 비교를 위한 파라미터는 스코어=100, 단어길이=12로 설정될 수 있거나, 다를 수 있다(예를 들어, W=5 또는 W=20).

서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 또 다른 바람직한 예는 메이어스(Myers)와 밀러(Miller)의 알고리즘[CABIOS (1989)]이지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 알고리즘은 CGC 서열 정렬 소프트웨어 팩키지의 일부분인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 혼입되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM120 중량 레지듀(residue) 테이블, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티가 사용될 수 있다. 서열 분석을 위한 추가적인 알고리즘이 당분야에 공지되어 있으며 이에는 문헌 (Torellis and Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10:3-5)에 기재되어 있는 바와 같이 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌 (Pearson and Lipman PNAS, 85:2444-8, 1998)에 기술된 FASTA가 포함된다.

또 다른 구체예에서, 두 아미노산 서열간의 동일성(%)은 Blossom 63 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스중 하나, 및 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 2, 3 또는 4의 길이 중량을 사용하는 CGC 소프트웨어 팩키지중의 GAP 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다(http://www.cgc.com에서 이용가능함). 또 다른 구체예에서, 두 핵산서열간의 동일성(%)은 50의 갭 중량 및 3의 길이 중량을 사용하는 CGC 소프트웨어 팩키지중의 GAP 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다(http://www.cgc.com에서 이용가능함).

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 1의 상보서열로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열과 높은 엄중 조건하에 혼성화되는 단편 또는 부분을 함유하는 단리된 핵산 분자를 제공하며, SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38로부터 선택된 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열과 높은 엄중 조건하에 혼성화되는 단편 또는 부분을 함유하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 핵산 단편의 길이는 약 15 뉴클레오티드 이상, 바람직하게는 약 18, 20, 23 또는 25 뉴클레오티드 이상이고, 30, 40, 50, 100, 200 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다. 본원에 기술된 항원성 폴리펩티드를 엔코딩하는 예를 들어, 길이가 30 뉴클레오티드 또는 그 이상인 긴 단편은 예를 들어, 하기 기술하는 바와 같이 항체의 생성을 위해 특히 유용하다.

관련된 일면에서, 본 발명의 핵산 단편은 본원에 기술된 바와 같은 검정에서 탐침 또는 프라이머로서 사용된다. "탐침" 또는 "프라이머"는 핵산 분자의 상보 가닥과 염기 특이적인 수단으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 탐침 및 프라이머에는 문헌 (Nielsen et al., Science, 254, 1497-1500, 1991)에 기술된 바와 같이, 폴리펩티드 핵산이 포함된다. 또한 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "프라이머"는 특히 본원에 기술된 방법을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 널리 공지된 방법(예를 들어, PCR, LCR)을 사용하는 주형으로부터 직접적인 DNA 합성의 개시점으로서 작용하는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 칭한다.

전형적으로, 탐침 또는 프라이머는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1의 상보서열 또는 SEQ ID NO: 2 내지 5 및 10 내지 38로부터 선택된 아미노산 서열을 엔코딩하는 서열로부터 선택된 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 약 15개 이상, 전형적으로는 약 20 내지 25개, 더욱 전형적으로는 약 40, 50 또는 75개의 연속 뉴클레오티드와 혼성화되는 뉴클레오티드 서열의 영역을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 탐침 또는 프라이머는 100개 이하의 뉴클레오티드, 바람직하게는 6 내지 50개 뉴클레오티드, 바람직하게는 12 내지 30개 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 탐침 또는 프라이머는 연속 뉴클레오티드 서열 또는 연속 뉴클레오티드 서열의 상보서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더욱 더 바람직하게는 95% 이상 동일하거나, 심지어 연속 뉴클레오티드 서열 또는 연속 뉴클레오티드 서열의 상보서열과 선택적으로 혼성화될 수 있다. 종종, 탐침 또는 프라이머는 표지물, 예를 들어, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보인자를 추가로 포함한다.

탐침 또는 프라이머로서 유용한 대표적인 올리고뉴클레오티드에는 부록 II에 기술된 마이크로세틀라이트 마커들이 포함된다.

상기 기술된 바와 같은 본 발명의 핵산 분자는 표준 분자생물학 기술 및 SEQ ID NO: 1, 및/또는 2 내지 5 및 10 내지 38에서 제공된 서열 정보를 사용하여 동정되고 단리될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 및/또는 SEQ ID NO: 의 상보서열에서 제공된 하나 이상의 서열을 기초로 하여 디자인되거나 SEQ ID NO:2 내지 5 또는 10 내지 38에서 제공된 하나 이상의 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 디자인된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭되고 단리될 수 있다. 일반적으로 문헌들 [PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplication(ed. H.A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Eds. Innis, et al., Academic Press, San Diego, CA, 1990); Mattila et al., Nucleic Acids Res., 19:4967, 1991; Eckert et al., PCR Methods and Applications, 1:17, 1991; PCR(eds, McPherson et al., IRL Press, Oxford); and 미국 특허 제 4,683,202호]을 참조하라. 핵산 분자는 주형으로서 cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA를 사용하여 증폭되고, 적절한 벡터내로 클로닝되어 DNA 서열 분석에 의해 특징화될 수 있다.

다른 적합한 증폭 방법에는 리가제 연쇄 반응(LCR)(참고 문헌: Wu and Wallace, Genomics, 4:560, 1989; Landegren et al., Science, 241:1077, 1988), 전사 증폭(참고 문헌: Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173, 1989), 및 자립 서열 복제 (참고 문헌: Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87:1874, 1990) 및 핵산 기재 서열 증폭(NASBA)이 포함된다. 후자의 두 가지 증폭 방법은 등온 전사에 기초하는 등온 반응과 관련있으며, 증폭 생성물로서 단일가닥 RNA(ssRNA) 및 이중가닥 DNA(dsDNA) 둘 모두를 각각 약 30 또는 100 대 1의 비로 생성시킨다.

증폭된 DNA는 방사능 표지되어, 사람 세포로부터 유래된 cDNA 라이브러리,Zap Express, ZIPLOX 또는 다른 적절한 벡터내의 mRNA를 스크리닝하기 위한 탐침으로서 사용될 수 있다. 상응하는 클론은 단리될 수 있고, DNA는 생체내 절제 이후 수득될 수 있고, 클로닝된 삽입서열은 적절한 분자량의 폴리펩티드를 엔코딩하는 정확한 리딩 프레임을 동정하기 위해 공지된 방법에 의해 어느 한쪽 또는 모든 방향에서 시퀀싱될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자의 뉴클레오티드서열의 직접적인 분석은 상업적으로 유용한 널리 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd Ed., CSHP, New York 1989); Zyskind et al., Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988)]을 참조하라. 이러한 방법 또는 유사 방법을 사용하여, 폴리펩티드 및 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA를 단리하고, 시퀀싱하고 추가로 특징화할 수 있다.

본 발명의 안티센스 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 및/또는 SEQ ID NO: 1의 상보서열, 및/또는 SEQ ID NO: 1의 일부분 또는 SEQ ID NO: 1의 상보서열의 뉴클레오티드 서열, 및/또는 SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38의 아미노산 서열을 엔코딩하거나 SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38의 일부분을 엔코딩하는 서열을 사용하여 디자인되고, 당분야에 공지된 방법을 사용하는 화학적 합성 및 효소적 연결 반응을 사용하여 작제될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 분자(예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드)는 천연 발생 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있거나, 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 안티센스 및 센스 핵산, 예를 들어, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드 사이에형성된 듀플렉스의 물리적 안정성을 증가시키기 위해 디자인된 다양하게 변경된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 또한, 안티센스 핵산 분자는 핵산 분자가 안티센스 배향으로 서브클로닝되는 발현 벡터를 사용하여 생물학적으로 생성될 수 있다(즉, 삽입된 핵산 분자로부터 전사된 RNA는 관심있는 표적 핵산에 대해 안티센스 배향일 것이다).

일반적으로, 본 발명의 단리된 핵산 서열은 서던 겔상에서 분자량 마커로서 사용될 수 있고, 관련 유전자 위치를 매핑하기 위해 표지되는 염색체 마커로서 사용될 수 있다. 또한 핵산 서열은 유전 질환을 동정하기 위해 환자의 내인성 DNA 서열을 비교하기 위해 사용될 수 있고, 예를 들어, 관련된 DNA 서열을 혼성화시켜 발견하거나 시료로부터 공지된 서열을 빼기 위한 탐침으로서 사용될 수 있다. 핵산 서열은 추가로 유전학적 핑거프린팅을 위한 프라이머를 유도하고, DNA 면역화 기술을 사용하여 안티-폴리펩티드 항체를 증가시키고, 항원으로서 안티-DNA 항체를 증가시키거나 면역 반응을 일으키기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 동정된 뉴클레오티드 서열의 부분 또는 단편(및 상응하는 완전한 유전자 서열)은 폴리뉴클레오티드 시약으로서 수많은 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들 서열은 (i) 염색체상의 이들 각각의 유전자들을 매핑하고, 따라서 유전 질환과 관련된 유전자 영역의 위치를 결정하고; (ii) 미세한 생물학적 시료로부터 개체를 동정하고; (iii) 생물학적 시료의 수사적 동정에 도움을 주는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 뉴클레오티드 서열은 분석, 특징화 또는 치료적 용도, 또는 상응하는 폴리펩티드가 본질적으로 조직 분화 동안 또는 질환에 걸린 상태에서 발현되는 조직에대한 마커로서 재조합 폴리펩티드를 동정하고 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 핵산 서열은 추가적으로 본원에 기술된 스크리닝 및/또는 진단 검정에서 시약으로서 사용될 수 있으며, 또한 본원에 기술된 스크리닝 및/또는 진단 검정에 사용하기 위한 키트(예를 들어, 시약 키트)의 구성요소로서 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일면은 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 1의 상보서열(또는 이의 일부분)으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산 분자를 함유하는 핵산 작제물에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 일면은 SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38의 아미노산 서열을 엔코딩하는 핵산 분자를 함유하는 핵산 작제물에 관한 것이다. 상기 작제물은 본 발명의 서열이 센스 또는 안티센스 배향으로 삽입되어 있는 벡터(예를 들어, 발현 벡터)를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "벡터"는 벡터에 연결된 또 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 칭한다. 벡터중 하나의 타입은 "플라스미드"이며, 플라스미드는 추가적인 DNA 시그먼트이 연결될 수 있는 환형의 이중가닥 DNA 루프를 칭한다. 벡터의 또 다른 타입은 바이러스 벡터이며, 여기서 추가적인 DNA 시그먼트은 바이러스 게놈내로 연결될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제를 할 수 있다(예를 들어, 세균의 복제 원점을 가진 세균 벡터 및 에피솜 포유류 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비-에피솜 포유류 벡터)는 숙주 세포내로의 도입시에 숙주 세포의 게놈내로 통합됨으로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터, 즉 발현 벡터는 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 그러나, 본 발명은 동일한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 다른 형태의 발현 벡터를 포함시키고자 한다.

본 발명의 바람직한 재조합 발현 벡터는 숙주 세포내에서 핵산 분자의 발현을 위해 적절한 형태로 본 발명의 핵산 분자를 포함한다. 이것은 재조합 발현 벡터가 발현될 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 발현을 위해 사용되는 숙주 세포에 근거하여 선택된 하나 이상의 조절 서열을 포함함을 의미한다. 재조합 발현 벡터에서, "작동가능하게 연결된"은 관심있는 뉴클레오티드 서열이 뉴클레오티드 서열의 발현이 가능하도록 하는 수단내(예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템내 또는 벡터가 숙주 세포내로 도입되는 경우 숙주 세포내)의 조절 서열(들)에 연결됨을 의미한다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 엘리먼트(예를 들어, 폴리아데닐화 시그널)가 포함된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어, 문헌 (Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, 1990)에 기재되어 있다. 조절 서열에는 많은 타입의 숙주 세포내의 뉴클레오티드 서열의 구성성 발현에 관한 조절 서열 및 특정 숙주 세포내에서만의 뉴클레오티드 서열의 발현에 관한 조절 서열(예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)이 포함된다. 발현 벡터의 디자인이 형질전환될 숙주 세포의 선택 및 바람직한 폴리펩티드의 발현 수준과 같은 인자에 의존할 수 있음은 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포내로 도입됨으로써 본원에 기술된 바와 같이 핵산 분자에 의해 엔코딩된 융합 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 생성시킬 수 있다.

본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포, 예를 들어, 대장균과 같은 세균 세포, 곤충 세포(바큘로바이러스 발현 벡터를 사용), 효모 세포 또는 포유류 세포에서 본 발명의 폴리펩티드의 발현을 위해 디자인될 수 있다. 적절한 숙주 세포는 괴델(Goeddel)의 문헌(상기)에 추가로 논의되어 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 중합효소를 사용하여 시험관내에서 전사되고 번역될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일면은 본 발명의 재조합 발현 벡터가 도입되는 숙주 세포에 관한 것이다. 용어 "숙주 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손 또는 잠재적인 자손을 칭하는 것으로 이해되고 있다. 돌연변이 또는 환경적 영향에 기인하여 후대에서 특정한 변경이 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 모세포와 동일하지 않을 수 있지만, 본원에 사용된 바와 같이 상기 용어의 범위내에 여전히 포함된다.

숙주 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 핵산 분자는 세균 세포(예를 들어, 대장균), 곤충 세포, 효모 또는 포유류 세포(차이니스 햄스터 난소 세포(CHO) 또는 COS 세포와 같은)에서 발현될 수 있다. 다른 적절한 숙주 세포는 당업자에게 공지되어 있다.

벡터 DNA는 통상적인 형질전환 또는 트랜스펙션 기술을 통해 원핵 세포나 진핵 세포내로 도입될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "형질전환" 및 "트랜스펙션"은 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공동침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 리포펙션 또는 일렉트로포레이션을 포함하는, 숙주 세포내로 외래 핵산 분자(예를 들어, DNA)를 도입시키기 위한 당분야에 공지된 다양한 기술을 칭한다. 숙주 세포를 형질전환시키거나 트랜스펙션시키기 위한 적절한 방법은 문헌[Sambrook, et al. (상기)] 및 기타 실험 매뉴얼에서 찾아볼 수 있다.

포유류 세포의 안정한 트랜스펙션에 있어서, 사용된 발현 벡터 및 트랜스펙션 기술에 따라, 세포의 소분획만이 이의 게놈내로 외래 DNA를 통합시킬 수 있음은 공지되어 있다. 이들 통합물을 동정하고 선택하기 위해, 일반적으로 선별 마커를 엔코딩하는 유전자(예를 들어, 항생제에 대한 내성)는 관심있는 유전자와 함께 숙주 세포내로 도입된다. 바람직한 선별 마커에는 약물, 예를 들어 G418, 하이그로마이신 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 선별 마커가 포함된다. 선별 마커를 엔코딩하는 핵산 분자는 본 발명의 핵산 분자와 동일한 벡터상에서 숙주 세포내로 도입될 수 있거나 별도의 벡터상에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산 분자로 안정하게 트랜스펙션된 세포는 약물 선별에 의해 동정될 수 있다(예를 들어, 선별 마커 유전자가 혼입된 세포는 생존하지만 다른 세포는 죽는다).

본 발명의 숙주 세포, 예를 들어 배양물내의 원핵 숙주 세포 또는 진핵 숙주 세포는 본 발명의 폴리펩티드를 생성(즉, 발현)시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 사용하여 폴리펩티드를 생성시키는 방법을 추가로 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명은 폴리펩티드가 생성되도록 하는 적합한 배지중에 (본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 재조합 발현 벡터가 도입되는) 본 발명의 숙주 세포를 배양시키는 것을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 상기 방법은 배치 또는 숙주 세포로부터 폴리펩티드를 단리하는 것을 추가로 포함한다.

또한 본 발명의 숙주 세포는 사람을 제외한 트랜스제닉 동물을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 일 구체예에서, 본 발명의 숙주 세포는 본 발명의 핵산 분자(예를 들어, 외인성 NRG1 유전자, 또는 NRG1 폴리펩티드를 엔코딩하는 외인성 핵산)가 도입되는 수정된 난모세포 또는 배아간세포이다. 이후 이러한 숙주 세포는 외인성 뉴클레오티드 서열이 게놈내로 도입된 사람을 제외한 트랜스제닉 동물 또는 내인성 뉴클레오티드 서열이 변화된 게놈 또는 동종 재조합 동물을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 동물은 뉴클레오티드 서열 및 상기 서열에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 기능 및/또는 활성을 연구하고 이들의 활성의 조절인자를 동정하고/하거나 평가하는데 유용하다. 본원에 사용되는 바와 같이, "트랜스제닉 동물"은 사람을 제외한 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 래트 또는 마우스와 같은 설치류이고, 여기서 상기 동물의 하나 이상의 세포는 트랜스유전자를 포함한다. 트랜스제닉 동물의 다른 예에는 사람을 제외한 영장류, 양, 개, 소, 염소, 닭 및 양서류가 포함된다. 트랜스유전자는 트랜스제닉 동물이 발생하게 되는 세포의 게놈내에 통합되어 성숙한 동물의 게놈에 남아있게 됨으로써 트랜스제닉 동물의 하나 이상의 세포 타입 또는 조직에서 엔코딩된 유전자 생성물을 발현시키는 외인성 DNA이다. 본원에 사용되는 바와 같이, "동종 재조합 동물"은 사람을 제외한 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 마우스이며, 여기서 내인성 유전자는 내인성 유전자, 및 동물의 발생 이전에 동물의 세포, 예를 들어 동물의 배아세포내로 도입된 외인성 유전자 사이의 동종 재조합에 의해 변화된다.

배 조작 및 미세주입을 통해 트랜스제닉 동물, 특히 마우스와 같은 동물을 생성시키는 방법은 당분야에 보편화되었고, 예를 들어 문헌[U.S. Patent Nos. 4,736,866 and 4,870,009, U.S. Patent No. 4,873,191 and Hogan, Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986]에 기재되어 있다. 동종 재조합 벡터 및 동종 재조합 동물을 작제하는 방법은 추가로 문헌 (Bradley, Current Opinion in Bio/Technology, 2:823-829, 1991 and PCT Publication Nos. WO 90/11354, WO 91/01140, WO 92/0968, and WO 93/04169]에 기재되어 있다. 본원에 기술된 사람을 제외한 트랜스제닉 동물의 클론은 또한 문헌 (Wilmut et al., Nature, 385:810-813, 1997 and PCT Publication Nos. WO 97/07668 and WO 97/07669)에 기술된 방법에 따라 생성될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드

본 발명은 또한 NRG1에 의해 엔코딩된 단리된 폴리펩티드("NRG1 폴리펩티드"), 및 이의 단편 및 변이체 뿐만 아니라 본원에 기술된 뉴클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 폴리펩티드(예를 들어, 다른 스플라이싱 변이체)에 관한 것이다. 용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체를 칭하고, 특정한 길이가 아니며; 따라서, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의내에 포함된다. 본원에 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드가 재조합 세포 및 비-재조합 세포로부터 단리되는 경우 실질적으로 세포성 물질을 포함하지 않거나, 화학적으로 합성되는 경우 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 포함하지 않을 때 "단리"되거나 "정제"되었다고 말한다. 그러나, 폴리펩티드는 세포에 정상적으로 결합되지 않은 다른 폴리펩티드(예를 들어, 융합 단백질)에 결합될 수 있으며 여전히 "단리"되거나 "정제"될 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는 동종성으로 정제될 수 있다. 그러나, 폴리펩티드가 동종성으로 정제되지 않는 제법이 유용하다고 알려져 있다. 중요한 특징은 상기 제법이 심지어 상당한 양의 다른 성분의 존재하에서도 폴리펩티드의 요망되는 기능을 허용한다는 것이다. 따라서, 본 발명은 다양한 순도를 포함한다. 일 구체예에서, 용어 "실질적으로 세포성 물질을 포함하지 않는"은 약 30%(건조 중량) 미만의 다른 단백질(즉, 오염 단백질), 약 20% 미만의 다른 단백질, 약 10% 미만의 다른 단백질을 갖는 폴리펩티드의 제조물을 포함한다.

폴리펩티드가 재조합적으로 생성되는 경우, 실질적으로 배양 배지를 포함하지 않을 수 있다. 즉, 배양 배지는 폴리펩티드 제조물의 부피의 약 20% 미만, 약 10% 미만 또는 약 5% 미만을 나타낸다. 용어 "실질적으로 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 포함하지 않는"은 이의 합성에 관여하는 화학 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된 폴리펩티드의 제조물을 포함한다. 일 구체예에서, 용어 "실질적으로 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 포함하지 않는"은 약 30%(건조 중량) 미만의 화학 전구체 또는 다른 화학물질, 약 20% 미만의 화학 전구체 또는 다른 화학물질, 약 10% 미만의 화학 전구체 또는 다른 화학물질 또는 약 5% 미만의 화학 전구체 또는 다른 화학물질을 갖는 폴리펩티드의 제조물을 포함한다.

일 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 1 및 이의 상보서열 및부분, 예를 들어 SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38, 또는 SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38의 일부분으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는 또한 단편 및 서열 변이체를 포함한다. 변이체는 실질적으로 생물체내의 동일한 유전자 유전자좌에 의해 엔코딩된 동종 폴리펩티드, 즉 대립형질 변이체 뿐만 아니라 다른 스플라이싱 변이체를 포함한다. 변이체는 또한 생물체내의 다른 유전자 유전자좌로부터 유래되지만, SEQ ID NO: 1 및 이의 상보서열 및 부분으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드와 실질적인 상동관계를 가지거나, SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드와 실질적인 상동관계를 가지는 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 또한 이들 폴리펩티드와 실질적으로 상동성이거나 동일하지만 또 다른 생물체로부터 유래된 폴리펩티드, 즉, 오르톨로그(ortholog)를 포함한다. 변이체는 또한 화학적 합성에 의해 생성된 이들 폴리펩티드와 실질적으로 상동성이거나 동일한 폴리펩티드를 포함한다. 변이체는 또한 재조합 방법에 의해 생성된 이들 폴리펩티드와 실질적으로 상동성이거나 동일한 폴리펩티드를 포함한다.

본원에 사용되는 바와 같이, 두 가지 폴리펩티드(또는 폴리펩티드의 영역)는 아미노산 서열이 약 45 내지 55% 이상, 전형적으로는 약 70 내지 75% 이상, 더욱 전형적으로는 약 80 내지 85% 이상, 가장 전형적으로는 약 90% 이상 상동성이거나동일한 경우 실질적으로 상동성이거나 동일하다. 본 발명에 따라, 실질적으로 상동성인 아미노산 서열은 상기 기술한 엄중 조건하에서 SEQ ID NO: 1 또는 이의 부분과 혼성화되는 핵산 분자에 의해 엔코딩되거나, 상기 기술한 엄중 조건하에서 SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38, 또는 이의 부분을 엔코딩하는 핵산 서열과 혼성화되는 핵산 분자에 의해 엔코딩될 것이다.

두 가지 아미노산 서열, 또는 두 가지 핵산 서열의 상동성(%) 또는 동일성(%)를 결정하기 위해, 서열을 최적의 비교 목적을 위해 정렬한다(예를 들어, 하나의 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 서열내에는 다른 폴리펩티드 또는 핵산 분자와의 최적 정렬을 위해 갭이 도입될 수 있다). 그런 후에 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 하나의 서열내의 일부분이 다른 서열내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 상기 분자는 그 위치에서 상동성이다. 본원에 사용되는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동등하다. 두 서열간의 상동성(%)은 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수에 대한 함수이다(즉, 상동성(%) = 동일 위치의 수/위치의 전체 수 x 100).

또한 본 발명은 낮은 동일성을 가지지만 본 발명의 핵산 분자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드에 의해 수행되는 하나 이상의 동일한 기능을 수행하기 위한 충분한 유사성을 가진 폴리펩티드를 포함한다. 유사성은 보존된 아미노산 치환에 의해 결정된다. 이러한 치환은 폴리펩티드내의 소정의 아미노산을 유사한 특징을 가진 다른 아미노산으로 치환된 치환이다. 보존적 치환은 표현형적으로 침묵성인 것 같다. 보존적 치환으로서 전형적으로 관찰되는 것은 지방족 아미노산 Ala, Val, Leu 및 Ile사이의 다른 것에 대한 대체, 하이드록실 잔기 Ser 및 Thr의 상호교환, 산성 잔기 Asp 및 Glu의 교환, 아미드 잔기 Asn 및 Gln사이의 치환, 염기성 잔기 Lys 및 Arg의 교환 및 방향족 잔기 Phe 및 Tyr 사이의 대체이다. 아미노산 변화가 표현형적으로 침묵성인 것 같다는 것에 관한 안내는 문헌 (Bowie et al., Science 247:1306-1310, 1990)에 기재되어 있다.

변이체 폴리펩티드는 하나 이상의 치환, 결실, 삽입, 역위, 융합, 및 트렁케이션(truncation) 또는 이들의 임의의 조합에 의한 아미노산 서열에 있어서 상이할 수 있다. 또한, 변이체 폴리펩티드는 완전한 기능을 가지거나 하나 이상의 활성에 있어서 기능이 결여될 수 있다. 완전한 기능을 가진 변이체는 전형적으로 보존적 변이 또는 중요하지 않은 잔기 또는 중요하지 않은 영역내의 변이만을 함유한다. 기능적인 변이체는 또한 기능에 있어서 변화를 초래하지 않거나 중요하지 않은 변화를 초래하는 유사한 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 치환은 어느 정도 기능에 포지티브 또는 네가티브하게 영향을 미칠 수도 있다. 기능이 없는 변이체는 전형적으로 하나 이상의 비-보존적 아미노산 치환, 결실, 삽입, 역위 또는 트렁케이션, 또는 중요한 잔기 또는 중요한 영역내에 치환, 삽입, 역위 또는 결실을 함유한다.

기능을 위해 필수적인 아미노산은 특정부위 돌연변이유발 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이유발 (참고 문헌: Cunningham et al., Science, 244:1081-1085, 1989)과 같은 당분야에 공지된 방법에 의해 동정될 수 있다. 후자 방법은 분자내의 모든 잔기에 단일 알라닌 돌연변이를 도입시키는 것이다. 그런 다음 생성된 돌연변이체 분자를 시험관내에서 생물학적 활성에 대해 시험하거나, 시험관내에서 증식 활성에 대해 시험하였다. 폴리펩티드 활성을 위해 중요한 부위는 또한 결정화, 핵자기공명 또는 포토어피니티 라벨링(photoaffinity labeling)에 의해 결정될 수 있다 (참조 문헌: Smith et al., J. Mol. Biol., 224:899-904 (1992); de Vos et al. Science, 255:306-312, 1992).

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 폴리펩티드 단편을 포함한다. 단편은 SEQ ID NO: 1 또는 이의 일부분 및 이의 상보서열(예를 들어, SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38, 또는 다른 스플라이싱 변이체)를 포함하는 핵산 분자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드로부터 유래될 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한 본원에 기술된 폴리펩티드의 변이체의 단편을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 단편은 6개 이상의 연속 아미노산을 포함한다. 유용한 단편에는 폴리펩티드의 하나 이상의 생물학적 활성을 보유한 단편 뿐만 아니라 폴리펩티드-특이적 항체를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용될 수 있는 단편이 포함된다.

생물학적으로 활성인 단편(예를 들어, 길이가 6, 9, 12, 15, 16, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100개 또는 그 이상의 아미노산인 펩티드)은 널리 공지된 방법을 사용하는 폴리펩티드 서열의 분석에 의해 동정되는 도메인, 시그먼트 또는 모티프, 예를 들어, 시그널 펩티드, 세포외 도메인, 하나 이상의 트랜스멤브레인 시그먼트 또는 루프, 리간드 결합 영역, 징크 핑거 도메인, DNA 결합 도메인, 아실화 부위, 글리코실화 부위 또는 인산화 부위를 포함할 수 있다.

단편은 (다른 아미노산 또는 폴리펩티드와 융합하지 않고) 분리될 수 있거나 더 큰 폴리펩티드내에 존재할 수 있다. 또한, 수개의 단편이 하나의 더 큰 폴리펩티드내에 포함될 수 있다. 일 구체예에서, 숙주내에서 발현을 위해 디자인된 단편은 폴리펩티드 단편의 아미노 말단에 융합된 이종성 프리(pre)-폴리펩티드 및 프로(pro)-폴리펩티드 영역 및 단편의 카복실 말단에 융합된 추가적인 영역을 가질 수 있다.

따라서 본 발명은 키메라 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드를 제공한다. 이들은 폴리펩티드와 실질적으로 동종성이 아닌 아미노산 서열을 갖는 이종성 단백질 또는 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다. "작동가능하게 연결된"은 폴리펩티드와 이종 단백질이 프레임적으로(in-frame) 융합되어 있음을 지칭한다. 이종 단백질은 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 일 구체예에서 융합 폴리펩티드는 폴리펩티드 그 자체의 기능에 영향을 미치지 않는다. 예를 들어, 융합 폴리펩티드는 폴리펩티드가 GST 서열의 C-말단에 융합된 GST-융합 폴리펩티드일 수 있다. 다른 타입의 융합 폴리펩티드에는 효소적 융합 폴리펩티드, 예를 들어 β-갈락토시다제 융합체, 효모 2-하이브리드 GAL 융합체, 폴리-His 융합체 및 Ig 융합체가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 융합 폴리펩티드, 특히 폴리-His 융합체는 재조합 폴리펩티드의 정제가 용이하도록 할 수 있다. 특정 숙주 세포(예를 들어, 포유류 숙주 세포)에서, 폴리펩티드의 발현 및/또는 분비는 이종 시그널 서열을 사용함으로써 증가될 수 있다. 그러므로, 또 다른 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 이의 N-말단에 이종 시그널 서열을 함유한다.

EP-A-O 464 533에는 면역글로불린 불변 영역의 여러 부분을 포함하는 융합 단백질이 기재되어 있다. Fc는 치료 및 진단에 유용하며, 따라서 예를 들어 향상된 약리역학적 특성을 초래한다(EP-A 0232 262). 약물 발견에서, 예를 들어 사람 단백질은 길항제를 동정하기 위한 고산출 스크리닝 검정의 목적을 위해 Fc 부분과 융합된다. 문헌 (Bennett et al., Journal of Molecular Recognition, 8:52-58, 1995 and Johanson et al., The Journal of Biological Chemistry, 270, 16:9459-9471, 1995)을 참조하라. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 가용성 융합 폴리펩티드 및 면역글로불린의 여러 서브클래스(IgG, IgM, IgA, IgE)의 중쇄 또는 경쇄의 불변 영역의 여러 부분을 포함한다.

키메라 폴리펩티드 또는 융합 폴리펩티드는 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 단편을 통상적인 기술에 따라 프레임적으로 서로 연결시킨다. 또 다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동화된 DNA 합성기를 포함하는 통상적인 기술에 의해 합성될 수 있다. 또한, 핵산 단편의 PCR 증폭은 후속적으로 어닐링되고 재증폭되어 키메라 핵산 서열을 생성시킬 수 있는 2개의 연속 핵산 단편 사이에 상보적인 오버행을 생성시키는 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있다 (참고 문헌: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1992). 또한, 융합 잔기(예를 들어, GST 단백질)를 엔코딩하는 많은 발현 벡터가 이미 시판되고 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자는 융합 잔기가 폴리펩티드에 프레임적으로 연결되도록 발현벡터내로 클로닝될 수 있다.

단리된 폴리펩티드는 이를 천연적으로 발현시키는 세포로부터 정제되거나, 이를 발현시키도록 변화된 세포(재조합체)로부터 정제되거나, 공지된 단백질 합성 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 일 구체예에서, 폴리펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 생성된다. 예를 들어, 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 분자는 발현 벡터내로 클로닝되고, 발현 벡터는 숙주 세포내로 도입되고 폴리펩티드는 숙주 세포내에서 발현된다. 그런 다음 폴리펩티드는 표준 단백질 정제 기술을 사용하는 적절한 정제 체계에 의해 세포로부터 단리될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 SDS-PAGE 겔 또는 당분야에 공지된 방법을 사용하는 분자 체 겔 여과 컬럼상에서 분자량 마커로서 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 증가시키거나 면역 반응을 일으키기 위해 사용될 수 있다. 또한 폴리펩티드는 생물학적 유체내에서 결합하는 폴리펩티드 또는 분자(예를 들어, 수용체 또는 리간드)의 수준을 양적으로 결정하기 위한 검정에서 시약, 예를 들어, 표지된 시약으로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 또한 상응하는 폴리펩티드가 구성적으로 조직 분화 동안 또는 질환 상태에서 우선적으로 발현되는 세포 또는 조직에 대한 마커로서 사용될 수 있다. 폴리펩티드는 예를 들어, 상호작용 트랩 검정에서와 같은 상응하는 결합제, 예를 들어 수용체 또는 리간드를 단리하고, 결합 상호작용의 펩티드 또는 소분자 길항제 또는 작용제를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 뉴레굴린 1 유전자가 erbB 수용체 티로신 키나아제와 결합하고 활성화기 때문에, 폴리펩티드는 상기 erbB 수용체 키나아제를 단리하는데 사용된다.

본 발명의 항체

또 다른 일면에서, 본 발명은 예를 들어, SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38 또는 이들의 일부분을 엔코딩하는 아미노산 서열을 갖거나, SEQ ID NO: 1 전부 또는 일부분(예를 들어, SEQ ID NO: 2 내지 5 또는 10 내지 38 또는 또 다른 스플라이싱 변이체, 또는 이들의 부분)을 포함하는 핵산 분자에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 갖는 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리펩티드 단편에 대한 항체를 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분, 즉, 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 칭한다. 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 분자는 폴리펩티드 또는 이의 단편에 결합하지만, 천연적으로 폴리펩티드를 함유하는 시료, 예를 들어 생물학적 시료내의 다른 분자에 실질적으로 결합하지 않는 분자이다. 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 부분의 예에는 펩신과 같은 효소로 항체를 처리함으로써 생성될 수 있는 F(ab) 및 F(ab')₂단편이 포함된다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 제공한다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 본 발명의 폴리펩티드의 특정 에피토프와 면역반응할 수 있는 1종의 항원 결합 부위만을 함유하는 항체 분자의 군집을 칭한다. 따라서, 모노클로날 항체는 전형적으로 면역반응하는 본 발명의 특정 폴리펩티드에 대해 단일 결합 친화성을 나타낸다.

폴리클로날 항체는 바람직한 면역원, 예를 들어 본 발명의 펩티드 또는 이의 단편을 가진 적합한 피검자를 면역화시킴으로써 상기 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 면역화된 피검자내의 항체 역가는 고정된 폴리펩티드를 사용하는 효소결합 면역흡착 검정(ELISA)과 같은 표준 기술에 의해 시간의 경과에 따라 모니터링될 수 있다. 요망되는 경우, 폴리펩티드에 대한 항체 분자는 포유류로부터(예를 들어, 혈액으로부터) 단리되어 IgG 분획을 수득하기 위한 단백질 A 크로마토그래피와 같은 널리 공지된 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다. 면역화시킨지 적당한 시간 후에, 예를 들어 항체 역가가 최고일 때, 항체 생성 세포는 피검자로부터 수득되어 하이브리도마 기술 (참고 문헌: Kohler and Milstein, Nature, 256:495-497, 1975), 사람 B 세포 하이브리도마 기술 (참고 문헌: Kozbor et al., Immunol. Today, 4:72, 1983), EBV-하이브리도마 기술 (참고 문헌: Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1985) 또는 트리오마 기술과 같은 표준 기술에 의해 모노클로날 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 하이브리도마를 생성시키는 기술은 널리 공지되어 있다 (참고 문헌: Current Protocols in Immunology, Coligan et al. (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, 1994). 요약하면, 불멸 세포주(전형적으로 골수종)는 상기 기술한 바와 같이 면역원으로 면역화된 포유동물로부터의 림프구(전형적으로 비장세포)와 융합되고, 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상층액은 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마를 동정하기 위해 스크리닝된다.

림프구와 불멸화된 세포주를 융합시키기 위해 사용되는 널리 공지된 임의의 많은 프로토콜은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체를 생성시키는 목적을 위해 적용될 수 있다 (참고 문헌: Current Protocols in Immunology, supra; Galfre et al., Nature, 266:55052, 1977; R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York, 1980; and Lerner, Yale J. Biol. Med., 54:387-402, 1981). 또한, 당업자는 이러한 방법의 많은 변화가 또한 유용할 것임을 이해할 것이다.

모노클로날 항체-분비 하이브리도마를 제조하는 것 뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체는 폴리펩티드를 사용하여 재조합 결합성 면역글로불린 라이브러리(예를 들어, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하여 폴리펩티드에 결합하는 면역글로불린 라이브러리를 단리함으로써 동정하고 단리될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 스크리닝하기 위한 키트는 시판되고 있다[예를 들어, 파마시아(Pharmacia)의 Recombinant Pharge Antibody System, Catalog No. 27-9400-01; 및 스트라타진(Stratagene)의 SurfZAP^TMPharge Display Kit, Catalog No. 240612]. 또한, 특히 항체 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 스크리닝하는데 사용하기 쉬운 방법 및 시약의 예는 예를 들어 문헌 (U.S. Patent No. 5,223,409; PCT Publication No. WO 92/18619; PCT Publication No. WO 91/17271; PCT Publication No. WO 92/20791; PCT Publication No. WO92/15679; PCT Publication No. WO 93/01288; PCT Publication No. WO 92/01047; PCT Publication No. WO 92/09690; PCT Publication No. WO 90/02809; Fuchs et al., Bio/Technology, 9:1370-1372, 1991; Hay et al. (1992) Hum. Antibod, Hybridomas, 3:81-85; Huse et al. Science, 246:1275-1281, 1991; Griffiths et al., EMBO J., 12:725-734, 1991)에서 찾아볼 수 있다.

또한, 사람 및 비-사람 부분 둘 모두를 포함하는 키메라 모노클로날 항체 및 사람화된 모노클로날 항체와 같은 재조합 항체는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있고, 본 발명의 범위내에 포함된다. 이러한 키메라 모노클로날 항체 및 사람화된 모노클로날 항체는 당분야에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 항체(예를 들어, 모노클로날 항체)는 친화도 크로마토그래피 또는 면역침전법과 같은 표준 기술에 의해 본 발명의 폴리펩티드를 단리하기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드-특이적 항체는 세포로부터의 천연 폴리펩티드 및 숙주 세포에서 발현되는 재조합적으로 생성된 폴리펩티드의 정제가 수월하도록 할 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드에 특이적인 항체는 폴리펩티드의 발현의 양과 패턴을 평가하기 위해 (예를 들어, 세포성 용해질, 세포 상층액 또는 조직 시료에서) 폴리펩티드를 검출하기 위해 사용될 수 있다. 항체는 예를 들어, 소정의 치료 체제의 효능을 결정하기 위한 임상학적 시험 절차의 일부분으로서 조직내의 단백질 수준을 모니터링하기 위해 진단학적으로 사용될 수 있다. 검출은 검출될 수 있는 물질에 항체를 커플링시킴으로써 수월해질 수 있다. 검출될 수 있는 물질의 예에는 다양한 효소, 보결분자족, 형광성 물질, 발광성 물질, 생체발광성 물질 및 방사성 물질이 포함된다. 적합한 효소의 예에는 호오스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린스테라제가 포함되고; 적합한 보결분자족 복합체의 예에는 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴이 포함되고; 적합한 형광성 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 포함되고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 포함되고; 생체발광 물질의 예에는 루시퍼라제, 루시페린 및 에쿼린이 포함되고, 적합한 방사성 물질에는 125I, 131I, 35S 또는 3H가 포함된다.

본 발명의 진단학적 검정 및 스크리닝 검정

본 발명은 또한 NRG1 유전자 발현을 평가하거나 본 발명의 NRG1 폴리펩티드의 활성을 평가하기 위한 진단학적 검정에 관한 것이다. 하나의 예에서, 상기 검정은 개체가 정신분열증에 걸렸는지, 또는 정신분열증이 발생할 (소인 또는 감수성을 가질) 위험성이 있는지를 결정하기 위해 생물학적 시료(예를 들어, 혈액, 혈청, 세포, 조직)에 대하여 사용된다. 또한 본 발명은 개체가 정신분열증 발생에 대해 감수성인지를 결정하기 위한 예후(또는 예측) 검정을 제공한다. 예를 들어, 유전자에서의 돌연변이는 생물학적 시료에서 검정될 수 있다. 이러한 검정은 예후 또는 예측 목적을 위해 사용됨으로써 정신분열증과 관련된 징후를 개시하기 이전에 개체를 예방학적으로 치료할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일면은 본 발명의 유전자 발현 또는 폴리펩티드의 활성에 대한 제제(예를 들어, 약물, 화합물 또는 다른제제)의 영향을 모니터링하기 위한 검정 뿐만 아니라 NRG1 폴리펩티드에 결합하는 제제를 동정하기 위한 검정에 관한 것이다. 이들 검정 및 다른 검정 및 제제는 하기 절에 추가로 상세하게 기재되어 있다.

진단 분석

본원에서 기술된 핵산, 탐침, 프라이머, 폴리펩티드 및 항체는 정신분열증에 대한 감수성의 진단방법 및 정신분열증에 대한 감수성의 진단에 유용한 키트에 사용된다.

본 발명의 일 구체예에서, 정신분열증에 대한 감수성의 진단은 NRG1의 다형성 (polymorphism)을 검출함에 의하여 수행된다. 다형성은 NRG1에서의 돌연변이 예를 들어, 프레임 쉬프트 돌연변이를 유발하는 뉴클레오티드 한 개 또는 한 개 이상의 삽입 또는 결실; 엔코딩된 아미노산에 변화를 유발하는 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화; 미성숙 종결 코돈을 발생시키는 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화; 뉴클레오티드에 의해 엔코딩된 하나 이상의 아미노산의 결실을 유발하는 수개의 뉴클레오티드의 변화; 유전자의 코딩 서열의 단절을 초래하는, 예를 들어 균등하지 않은 재조합 또는 유전자전환에 의한 하나 또는 수개의 뉴클레오티드의 삽입; 유전자의 전부 또는 일부의 중복; 유전자 전부 또는 일부의 전위 (transposition); 또는 유전자 전부 또는 일부의 재배열 (rearrangement)이다. 하나 이상의 돌연변이가 한 개의 유전자에 존재할 수 있다. 상기 서열 변화는 NRG1에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 돌연변이를 유발한다. 예를 들어, 돌연변이가 프레임 쉬프트 돌연변이인 경우에, 프레임 쉬프트는 엔코딩된 아미노산의 변화를 유발하여 절단(truncated) 폴리펩티드를 발생시킨다. 선택적으로, 정신분열증에 대한 감수성과 관련된 다형성은 하나 이상의 뉴클레오티드의 동의 (synonymous) 돌연변이 (예를 들어, NRG1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드에는 변화가 없는 돌연변이)이다. 상기 다형성은 스플라이싱 위치를 변경하여 mRNA의 안정성 또는 이동에 영향을 미치거나, 그렇지 않으면 유전자의 전사 또는 면역에 영향을 미친다. 상기에 기술된 임의의 돌연변이를 가지는 NRG1은 본원에서 "돌연변이 유전자"라고 한다.

정신분열증을 진단하는 제 1 방법에서, 혼성화 방법 예를 들어, 서던 분석 (Southern analysis), 노던 분석 (Northern analysis) 또는 인시투 혼성화 (In situ hybridization)가 사용된다 (참고 문헌: Current Protocol in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., John Wiley & Sons, including all supplement through 1999). 예를 들어, 게놈 DNA, RNA, 또는 cDNA의 시험 피검체의 생물학적 시료 ("시험 시료")를 정신분열증에 감수성을 가지거나, 이에 걸리기 쉽거나, 이에 대한 결함을 가졌다고 추측되는 개체 ("시험 개체")로부터 획득한다. 개체는 어른, 어린이 또는 태아이다. 시험 시료를 게놈 DNA를 함유하는 임의의 공급원 예를 들어, 혈액 시료, 양수 시료, 뇌척수액 시료, 또는 피부, 근육, 협측 (buccal) 또는 결합 점막, 태반, 위장관 또는 다른 기관의 조직 시료로부터 획득한다. 태아 세포 또는 조직의 DNA의 시험 시료를 양수천자 또는 융모막 융모 채취와 같은 적절한 방법에 의하여 획득한다. DNA, RNA 또는 cDNA 시료를 검사하여 NRG1의 다형성이 존재하는지 여부 및/또는 어떤 NRG1에 의해 엔코딩된 스플라이싱 변이체가 존재하는지를 결정한다. 다형성 또는 스플라이싱 변이체의 존재는 핵산 탐침과 게놈DNA, RNA 또는 cDNA의 유전자의 혼성화에 의해 알수 있다. 본원에서 사용된 "핵산 탐침"은 DNA 탐침 또는 RNA 탐침이고; 핵산 탐침은 하나 이상의 NRG1의 다형성을 함유하고 NRG1의 특정 스플라이싱 변이체를 엔코딩하는 핵산을 함유한다. 탐침은 상기에 기술된 임의의 핵산 분자이다 (예를 들어, 유전자, 단편, 유전자를 함유하는 백터, 탐침 또는 프라이머 등).

정신분열증의 감수성을 진단하기 위하여, 혼성화 시료를 NRG1을 함유하는 시험 시료를 하나 이상의 핵산 탐침과 접촉시켜 형성한다. mRNA 또는 게놈 DNA를 검출하기 위한 바람직한 탐침은 본원에서 기술된 mRNA 또는 게놈 DNA 서열과 혼성화할 수 있는 라벨링된 핵산 탐침이다. 핵산 탐침은 예를 들어, 전장 (full-length) 핵산 분자 또는 이의 일부 예를 들어, 15, 30, 50, 100, 250 또는 500 뉴클레오티드 길이 이상의 올리고뉴클레오티드이고, 엄격 조건 (stringent condition)하에서 적절한 mRNA 또는 게놈 DNA와 특이적으로 혼성화하기에 충분하다. 예를 들어, 핵산 탐침은 SEQ ID NO: 2-5 또는 10-38 중 임의의 하나 (또는 그 이상) 전부 또는 일부를 엔코딩하는 핵산이다. 본 발명의 진단 분석에 사용되는 다른 적절한 탐침은 상기에 기술된다 ("본 발명의 핵산"이라는 제목으로 논의된 탐침 및 프라이머를 참조).

혼성화 시료를 NRG1과 핵산 탐침의 특이적 혼성화를 충분히 가능하게 하는 조건하에서 유지하였다. 본원에서 사용된 "특이적 혼성화"는 정확한 하이드리드화 (예를 들어, 일치하지 않는 것이 없는 것)를 의미한다. 특이적 혼성화는 높은 엄격도 조건 또는 보통 엄격도 조건하에서, 예를 들어 상기 기술한 바와 같이 수행한다. 특정 바람직한 구체예에서, 특이적 혼성화의 혼성화 조건은 높은 엄격도이다.

특이적 혼성화가 존재하는 경우에 이를 표준 방법을 사용하여 검출한다. 특이적 혼성화가 시험 물질의 핵산 탐침 및 NRG1 사이에서 일어나는 경우에, NRG1은 핵산 탐침에 존재하는 다형성을 가지거나 스플라이싱 변이체이다. 상기 방법에는 하나 이상의 핵산 탐침이 동시에 사용된다. 임의의 핵산 탐침의 특이적 혼성화는 NRG1의 다형성 또는 NRG1에 의해 엔코딩된 특정 스플라이싱 변이체의 존재를 의미하므로, 정신분열증에 대한 감수성을 진단하는데 사용될 수 있다.

노던 분석에서 (참고 문헌: Current Protocol in Molecular Biology, Ausubel, F. etal., eds., John Wiley & Sons, supra), 상기에 기술된 혼성화 방법은 정신분열증에 대한 감수성과 관련된 다형성 또는 특정 스플라이싱 변이체의 존재를 동정하는 데 사용된다. 노던 분석을 위하여, RNA의 시험 시료를 적절한 수단에 의해 개체로부터 획득한다. 상기에 기술된, 개체의 RNA에 대한 핵산 탐침의 특이적 혼성화는 NRG1의 다형성, 또는 NRG1에 의해 엔코딩된 특정 스플라이싱 변이체의 존재를 의미하므로, 정신분열증에 대한 감수성을 진단하는데 사용될 수 있다.

핵산 탐침의 사용의 대표적인 예로는 미국 특허 제 5,188,611호 및 제 4,851,330호를 들 수 있다.

선택적으로, 펩티드 핵산 (PNA) 탐침이 상기에 기술된 혼성화 방법의 핵산 탐침을 대신하여 사용될 수 있다. PNA는 메틸렌 카르보닐 링커를 통해 글리신 질소에 부착된 유기 염기 (A, G, C, T 또는 U)를 지닌, N-(2-아미노에틸)글리신 단위와 같은 펩티드-유사 무기 골격을 가지는 DNA 유사물이다 (참고 문헌: Nielson, P.E. et al., Bioconjugate Chemistry, 1994, 5, American Chemical Society, p 1, 1994). PNA 탐침은 정신분열증에 대한 감수성과 관련된 다형성을 가지는 유전자와 특이적으로 혼성화하도록 설계된다. NRG1에 대한 PNA 탐침의 혼성화는 정신분열증에 대한 감수성을 진단하는 데 사용된다.

본 발명의 다른 방법에서, 유전자의 돌연변이 또는 다형성이 제한 부위를 형성하거나 제거하는 경우에, 제한 효소 처리에 의한 돌연변이 분석법이 돌연변이체 유전자 또는 다형성을 지니는 유전자를 검출하는데 사용된다. 게놈 DNA를 함유하는 시험 시료는 개체로부터 획득된다. 중합효소 연쇄 반응 (PCR)이 시험 개체로부터 획득한 게놈 DNA의 시험 시료의 NRG1 [및, 필요한 경우에, 측부서열 (flanking sequence)]을 증폭하는데 사용된다. RFLP 분석을 기술된 바와 같이 수행한다 (참고 문헌: Current Protocol in Molecular Biology, supra). 관련된 DNA 단편의 소화 형태는 NRG1의 돌연변이 또는 다형성의 존재 또는 부재를 의미하므로, 정신분열증에 대한 감수성의 존재 또는 부재를 의미한다.

또한, 서열 분석이 NRG1의 특이적 다형성을 검출하는데 사용된다. DNA 또는 RNA의 시험 시료를 시험 개체로부터 획득한다. 요망되는 경우에, PCR 또는 다른 적절한 방법이 유전자 및/또는 이의 측부 서열을 증폭하기 위하여 사용된다. NRG1, 유전자의 단편, cDNA, cDNA의 단편, mRNA, 또는 mRNA 단편의 서열을 표준 방법을 사용하여 결정한다. 유전자, 유전자 단편, cDNA, cDNA의 단편, mRNA, 또는 mRNA 단편을 적절한 공지된 유전자, cDNA [예: SEQ ID NO:1, 또는 SEQ ID NO:2-5 또는 10-38 중 임의의 하나 (또는 그 이상)을 엔코딩하는 핵산 서열 또는 이의 단편) 또는 mRNA의 핵산 서열과 비교한다. NRG1의 다형성의 존재는 개체가 정신분열증에 대한 감수성을 가진다는 것을 의미한다.

또한, 대립유전자 (allele)-특이적 올리고뉴클레오티드가 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 (ASO) 탐침으로 증폭된 올리고뉴클레오티드의 닷-블랏 (dot-blot) 혼성화를 사용하여 NRG1의 다형성의 존재를 검출하는데 사용된다 (참고 문헌: Saiki, R., et al., Nature (London) 324: 163-166, 1986). "대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드" (본원에서 "대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 탐침"이라고도 칭한다)는 NRG1에 특이적으로 혼성화되고 정신분열증에 대한 감수성과 관련된 다형성을 가지는, 약 10-50 염기쌍, 바람직하게는 약 15-30 염기쌍의 올리고뉴클레오티드이다. NRG1의 특정 다형성에 특이적인 대립유전자-특이적올리고뉴클레오티드 탐침을 표준 방법을 사용하여 제조한다 (참고 문헌: Current Protocol in Molecular Biology, supra). 정신분열증에 대한 감수성과 관련된 유전자의 다형성을 동정하기 위하여, DNA의 시험 시료를 개체로부터 획득한다. PCR은 NRG1의 전부 또는 단편, 및 이의 측부 서열을 증폭하기 위하여 사용된다. 증폭된 NRG1 (또는 유전자의 단편)을 지니는 DNA를 표준 방법을 사용하여 닷-블랏팅하고 (참고 문헌: Current Protocol in Molecular Biology, supra), 블랏을 올리고뉴클레오티드와 접촉시킨다. 다음에 증폭된 NRG1에 대한 탐침의 특이적 혼성화의 존재를 검출한다. 개체의 DNA에 대한 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 탐침의 특이적 혼성화는 NRG1의 다형성을 의미하므로, 정신분열증에 대한 감수성을 의미한다.

다른 구체예에서, 개체의 표적 핵산 서열 시그먼트 (segment)에 상보적인 올리고뉴클레오티드 탐침의 어레이가 NRG1의 다형성을 동정하는데 사용된다. 예를 들어, 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 어레이가 사용된다. 올리고뉴클레오티드 어레이는 일반적으로 다른 공지 위치의 기질의 표면에 결합된 다수의 다른 올리고뉴클레오티드 탐침을 포함한다. 또한, "제네칩스. TM. (Genechips. TM.)"으로 기술되는 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 미국 특허 제 5,143,854호 및 국제 특허 출원 공개번호 제 90/15070호 및 제 92/10092호에 일반적으로 기술된다. 상기 어레이는 일반적으로 포토리토그래피 방법 (photolithigraphic method) 및 고체상 올리고뉴클레오티드 합성 방법의 조합을 구체화하는 기계적 합성 방법 또는 광유도합성법을 사용하여 생산된다. 문헌 (Fodor et al., Science, 251:767-777, 1991; Pirrung et al.), 미국 특허 출원 제 5,143,854호 (Pirrung et al.) (및 국제 특허 출원 공개번호 제 90/15070호), 국제 특허 출원 공개번호 제 92/10092호 (Fodor et al.) 및 미국 특허 출원 제 5,424,186호를 참조할 수 있고, 이의 전체 내용은 본원의 내용에 통합된다. 기계적 합성 방법을 사용한 상기 어레이의 합성 기술은 미국 특허 제 5,384,261호에 기술되고, 이의 전체 내용은 본원에 참고문헌으로 통합된다.

올리고뉴클레오티드 어레이를 준비하고, 대상 핵산을 어레이와 혼성화하고 다형성에 대해서 스캐닝한다. 혼성화 및 스캐닝은 본원 및 국제 특허 출원 공개 번호 제 92/10092호 및 제 95/11995호 및 미국 특허 출원 제 5,424,186호에 기술된 방법에 의해 일반적으로 수행되고, 이의 전체 내용은 본원에 참고문헌으로 통합된다. 간략하게, 종래에 동정된 다형성 마커를 포함하는 표적 해간 서열을 공지된증폭 기술, 예를 들어 PCR에 의하여 증폭한다. 일반적으로 이는 다형성에 대한 업스트림 (upstream) 및 다운스트림 (downstream)의 표적 서열의 두개의 가닥에 상보적인 프라이머 서열의 사용을 포함한다. 또한, 비대칭 PCR 기술이 사용된다. 일반적으로 라벨을 결합시키는, 증폭된 표적은 적절한 조건하에서 어레이와 혼성화된다. 어레이의 혼성화 및 세척의 완료후에, 어레이를 스캐닝하여 표적 서열이 혼성화하는 어레이의 위치를 결정한다. 스캔으로부터 획득된 혼성화 결과는 통상적으로 어레이상의 위치 지정의 기능으로서 형광 강도의 형태이다.

예를 들어, 한 개의 다형성의 검출을 위한 한 개의 검출 블록으로 앞서 기술되었으나, 어레이는 다수 검출 블록을 포함하므로, 다수의 특이적 다형성을 분석할 수 있다. 선택적인 배열에서, 검출 블록은 어레이에 대한 표적의 혼성화 과정동안 최적의 조건이 사용되도록 한개의 어레이내로 또는 다수의 분리된 어레이로 분류될 수 있다. 예를 들어, 다형성이 A-T 풍부 시그먼트에 해당하는 것과 별도로, 게놈 서열의 GC 풍부 스트레치 (stretch)에 해당하는 상기 다형성의 검출을 위하여 이를 제공하는 것이 바람직하다. 이는 각 상황을 위한 혼성화 조건의 개별적인 최적화를 가능하게 한다.

다형성의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 어레이의 용도의 추가적인 설명은 예를 들어, 미국 특허 출원 제 5,858,659호 및 제 5,837,832호에 기술되어 있고, 이의 전체 내용은 본원에 참고문헌으로 통합된다.

핵산 분석의 다른 방법은 NRG1의 다형성 및 NRG1에 의하여 엔코딩된 스플라이싱 변이체를 검출하는데 사용될 수 있다. 대표적인 방법은 예를 들어, 직접적인매뉴얼 시퀀싱 (참고 문헌: Church and Gilbert, Proc, Natl, Acad, Sci. USA 81: 1991-1995, 1988; Sanger, F. et al., Proc, Natl, Acad, Sci. 74: 5463-5467, 1977; Beavis et al., 미국 특허 제 5,288,644호); 자동 형광 시퀀싱; 단일가닥 입체형태적 다형성 분석 (SSCP); 클램트된 변성 겔 전기영동 (Clamped denaturing gel electrophoresis, CDGE) (참고 문헌: Sheffield, V. C. et al., Proc, Natl, Acad, Sci. USA 86:232-236, 19891); 운동성 이동 분석 (mobility shift analysis) (참고 문헌: Orita, M. et al., Proc, Natl, Acad, Sci. USA 86:2766-2770), 제한 효소 분석 (참고 문헌: Flavella et al., Cell 15: 25, 1978; Greever et al., Proc, Natl, Acad, Sci. USA 78:5081, 1981); 헤테로듀플렉스 분석 (heteroduplex analysis); 화학적 불일치 절단 (chemical mismatch cleavage, CMC) (참고 문헌: Cotton et al., Proc, Natl, Acad, Sci. USA 85: 4397-4401); 리보뉴클라아제 보호 분석 (RNase protection analysis) (참고 문헌: Myers, R. M. et al., Science 230: 1242, 1985); 대장균 mutS 단백질과 같은 뉴클레오티드 불일치를 인식하는 폴리펩티드의 사용; 대립유전자-특이적 PCR을 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 정신분열증에 대한 감수성의 진단은 또한, 효소결합 항체법 (ELISA), 웨스턴 블랏, 면역침전법 및 면역현광법을 포함하는 다양한 방법에 의하여, NRG1 폴리펩티드의 발현 및/또는 조성을 검사함에 의하여 행해진다. 개체의 시험 시료는 NRG1에 의해 엔코딩된 특정 스플라이싱 변이체의 존재, 또는 NRG1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 조성의 변경 및/또는 발현의 변경의 존재에 대하여 검사된다. NRG1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 발현의 변경은 예를 들어, 정량적인 폴리펩티드 발현의 변경 (예: 생산된 폴리펩티드의 양)이고; NRG1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 조성의 변경은 정량적 폴리펩티드 발현의 변경 (예: 다른 스플라이싱 변이체 또는 돌연변이체 NRG1 폴리펩티드의 발현)이다. 바람직한 구체예에서, 정신분열증에 대한 감수성의 진단은, 스플라이싱 변이체의 특정 패턴 또는 NRG1에 의해 엔코딩된 특정 스플라이싱 변이체를 검출함에 의하여 행해진다.

또한, 정량적 및 정성적 변경 둘 모두 존재할 수 있다. 본원에서 사용된 폴리펩티드 발현 또는 조성의 "변경"은 대조 시료의 NRG1에 의한 폴리펩티드의 조성 또는 발현과 비교해서, 시험 시료의 발현 또는 조성의 변경을 의미한다. 대조 시료는 시험 시료에 대응하는 시료이고 (예: 동일한 타입의 세포유래), 정신분열증에 걸리지 않은 개체로부터 유래된다. 대조 시료와 비교하여, 시험 시료의 폴리펩티드의 발현 또는 조성의 변경은 정신분열증에 대한 감수성을 의미한다. 유사하게, 대조 시료와 비교하여, 시험 시료내 하나 이상의 다른 스플라이싱 변이체의 존재 또는 시험 시료내 상당히 다른 양의 다른 스플라이싱 변이체의 존재는 정신분열증에 대한 감수성을 의미한다. NRG1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 발현 또는 조성을 검사하는 다양한 수단이 사용될 수 있는데, 이는 분광법, 비색정량법, 전기영동, 등전점 포커싱 및 면역블랏팅 (참고 문헌: Current Protocol in Molecular Biology, chapter 10)과 같은 면역 분석법 (참고 문헌: Davis et al., 미국 특허 제 4,376,110호)을 포함한다. 예를 들어, 일 구체예에서, 폴리펩티드, 바람직하게는 검출 라벨이 결합된 항체에 결합할 수 있는 항체 (예: 상기에 기술된 바와 같음)를 사용할 수 있다. 항체는 폴리클로날이고, 바람직하게는 모노클로날이다.완전한 항체 또는 이의 단편 (예: Fab 또는 F(ab')₂)을 사용할 수 있다. 탐침 또는 항체에 관하여, 용어 "라벨(링)"은, 직접 라벨링된 다른 반응물과의 반응성에 의한 탐침 또는 항체의 간접적인 라벨링 및 탐침 또는 항체에 검출 물질을 결합함 (예: 물리적인 연결)에 의한 탐침 또는 항체의 직접적인 라벨링을 포함한다. 간접적인 라벨링의 예는 형광 라벨링된 2차 항체를 사용하는 1차 항체의 검출 및 형광 라벨링된 스트렙타비딘으로 검출될 수 있는 바이오틴을 지닌 DNA 탐침의 말단-라벨링을 포함한다.

돌연변이체 NRG1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 상기에 기술된 항체, 또는 비돌연변이체 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 NRG1에 의해 엔코딩된 특정 스플라이싱 변이체에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여, 웨스턴 블랏팅 분석이 돌연변이체 NRG1 또는 다형성에 의해 엔코딩된 특정 스플라이싱 변이체의 시험 시료내 존재 또는 비다형성 또는 비돌연변이 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 또는 특정 스플라이싱 변이체의 시험 시료내 부존재를 동정하는데 사용된다. 다형성 또는 돌연변이체 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 존재 또는 비다형성 또는 비돌연변이체 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 부재는 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 특정 스플라이싱 변이체의 존재 (또는 부재)와 같이, 정신분열증에 대한 감수성을 진단하는데 사용될 수 있다.

상기 방법의 일 구체예에서, 시험 시료의 NRG1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 수준 또는 양을 대조 시료의 NRG1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 수준 또는 양과 비교한다. 대조 시료의 폴리펩티드의 수준 또는 양보다 높거나 낮은 시험 시료의 폴리펩티드의 수준 또는 양은, 그 차이가 통계적으로 중요한 경우에, NRG1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 발현의 변경을 의미하여, 정신분열증에 대한 감수성을 진단하는데 사용된다. 선택적으로, 시험 시료에서 NRG1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 조성은 대조 시료에서 NRG1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 조성과 비교된다. 대조 시료의 폴리펩티드의 조성 (예: 다른 스플라이싱 변이체의 존재)과 비교하여, 시험 시료의 폴리펩티드의 조성의 차이는 정신분열증에 대한 감수성의 진단을 위해 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드의 수준 또는 양, 및 조성의 둘 모두의 차이가 시험 시료 및 대조 시료에서 평가된다. 대조 시료와 비교한 시험 시료의 폴리펩티드의 양 또는 수준의 차이; 대조 시료와 비교한 시험 시료의 조성의 차이; 또는 양 또는 수준의 차이 및 조성 둘 모두의 차이는 정신분열증에 대한 감수성을 의미한다.

진단 방법에 유용한 키트 (예: 반응물 키트)는 예를 들어, 본원에 기술된 혼성화 탐침 또는 프라이머 (예: 라벨링된 탐침 또는 프라이머), 라벨링된 분자의 검출을 위한 반응물, 제한 효소 (예: RFLP 분석용), 대립유전자-특이적 올리고뉴클레오티드, 돌연변이체 또는 비돌연변이체 (천연) NRG1 폴리펩티드 (예:SEQ ID NO: 2-5 또는 10-38) 중 임의의 하나 또는 그 이상)에 결합하는 항체, 또는 NRG1을 포함하는 핵산의 증폭 또는 NRG1 폴리펩티드의 아미노산 서열의 분석 수단 등을 포함하여, 본원에 기술된 임의의 방법에 유용한 구성 성분을 포함한다.

스크리닝 분석 및 이들에 의해 동정된 항원

본 발명은 본 발명의 핵산에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 존재를 동정하고, 본 발명의 핵산에 혼성화하는 뉴클레오티드의 존재르 동정하기 위한 방법 (본원에서 "스크리닝 분석"이라고도 칭함)을 제공한다. 일 구체예에서, 시료내 대상 핵산 분자 (예: 본 발명의 핵산과 상당한 상동성을 가지는 핵산)의 존재 (또는 부재)를, 상기 기술된 높은 엄격도 조건하에서 본 발명의 핵산 (예: SEQ ID NO: 1의 서열을 가지는 핵산 또는 SEQ ID NO: 1의 상보서열, 또는 SEQ ID NO: 2-5 또는 10-38 중 임의의 하나의 서열을 가지는 아미노산을 엔코딩하는 핵산 또는 상기 핵산의 단편 또는 변이체)을 포함하는 핵산과 시료를 접촉시킨 후에, 혼성화의 존재 (또는 부재)에 대해 시료를 분석하여 분석한다. 바람직한 구체예에서, 높은 엄격도 조건은 선택적인 혼성화에 적절한 조건이다. 바람직한 구체예에서, 높은 엄격도 조건은 선택적인 혼성화에 적절한 조건이다. 또 다른 구체예에서, 대상 핵산 분자를 함유하는 시료를 대상 핵산 분자의 부분과 적어도 부분적으로 상보적인 연속적인 뉴클레오티드 서열 (예: 상기에 기술된 프라이머 또는 탐침)을 함유하는 핵산과 접촉시키고, 접촉된 시료를 혼성화의 존재 또는 부재에 대하여 검사한다. 바람직한 구체예에서, 연속적인 뉴클레오티드 서열을 함유하는 핵산은 대상 핵산 분자의 부분과 완전히 상보적이다.

상기 구체예에서, 대상 핵산의 전부 또는 일부를 혼성화하기 전에 증폭시킨다.

다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체와 같은, 대상 폴리펩티드의 존재 (또는 부재)를, 대상 폴리펩티드 (예: 상기에 기술된 것과 같은 항체)에 특이적으로 혼성화하는 항체와 시료를 접촉시킨 후에, 대상 폴리펩티드와 항체의 결합의 존재 (또는 부재)에 대하여 시료를 분석하여 평가한다.

다른 구체예에서, 본 발명은 본원에서 기술된 폴리펩티드의 활성을 변경하거나 그렇지 않으면 본원의 폴리펩티드와 상호작용하는 (예: 증가시키거나 감소시키는) 제제 [예: 융합 단백질, 폴리펩티드, 펩티도미메틱 (peptidomimetic), 전구약물, 수용체, 결합 제제, 항체, 소분자 또는 다른 약물, 또는 리보자임]를 동정하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 제제는 본원에 기술된 폴리펩티드 (예: NRG1 결합 제제)와 결합하는 제제; 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 활성에 자극 또는 억제 효과를 가지는 제제; NRG1 결합 제제 (예: 수용체 또는 다른 결합 제제)와 상호작용하는 본 발명의 폴리펩티드의 능력을 변화 (예: 증강 또는 억제)시키는 제제; NRG1 폴리펩티드의 번역후 프로세싱을 변경하는 제제 (예: 폴리펩티드를 세포 표면과 같은 세포의 다른 위치로 정상적으로 합성되도록 단백질 분해 프로세싱을 변졍하는 제제; 보다 더 많은 폴리펩티드가 세포로부터 분비되도록 하는 단백질 분해 프로세싱을 변경하는 제제 등)이다.

일 구체예에서, 본 발명은 분석에 의해 동정될 수 있는 제제 및 본원에서 기술된 폴리펩티드 (또는 생물학적 활성을 가지는 이의 일부)의 활성을 조절하거나 이에 결합하는 후보 또는 시험 제제를 스크리닝하는 분석법을 제공한다. 시험 제제는 당 기술분야에서 공지된 조합 라이브러리 방법의 임의의 많은 접근법을 사용하거 획득되고, 생물학적 라이브러리; 공간 어드레서블 평행 고체상(spatiallyaddressable parallel solid phase) 또는 액상 라이브러리; 얽힘풀기 (deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; '일-비드 일-화합물' 라이브러리 방법; 및 친화성 폴리펩티드 선별을 사용한 합성 라이브러리 방법을 포함한다. 생물학적 라이브러리 접근법은 폴리펩티드 라이브러리에 한정되는 반면에, 다른 네개의 접근법은 폴리펩티드, 비펩티드 올리고머 또는 화합물의 저분자 라이브러리에 적용가능하다 (참고 문헌: Lam, K. S., Anticancer Drug Des., 12:145, 1997).

일 구체예에서, NRG1 폴리펩티드의 활성을 변경하는 제제를 동정하기 위하여, NRG1 폴리펩티드 (예: SEQ ID NO: 2-5 또는 10-38, 또는 NRG1에 의해 엔코딩된 다른 스플라이싱 변이체) 또는 이의 단편 또는 이의 유도체 (상기에 기술된 것과 같음)를 함유하거나 발현하는 세포, 세포 용해질 또는 용액을 시험 대상인 제제와 접촉시키고, 선택적으로 폴리펩티드를 시험 대상인 제제와 직접 접촉시킨다. NRG1 활성의 수준 (양)을 분석하고 (예: NRG1 활성의 수준 (양)을 직접적으로 또는 간접적으로 측정한다) 대조군의 활성 수준 (시험 대상인 제제가 존재하지 않는 경우의 NRG1 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체의 활성 수준)과 비교한다. 제제의 존재하의 활성 수준이 제제의 부재하의 활성 수준과 통계적으로 중요한 정도의 양으로 다른 경우에, 제제는 NRG1 폴리펩티드의 활성을 변경하는 제제이다. 대조군에 대한 NRG1 폴리펩티드 활성 수준의 증가는 제제가 NRG1 활성을 증가시키는 제제 (이의 작용물질)임을 의미한다. 다른 구체예에서, 시험 대상인 제제의 존재하에 NRG1 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 단편의 활성 수준이 그 전에 확립된 대조군 수준과 비교된다. 대조군 수준과 통계학적으로 중요한 정도의 양이 다른 제제의 존재하의 활성 수준은 제제가 NRG1 활성을 변경한다는 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 분석에 의하여 동정될 수 있는 제제, 및 유전자의 발현 (예: 전사 또는 번역)을 변경하거나 (예: 증가 또는 감소), 그렇지 않으면 본원에 기술된 핵산과 상호작용하는 NRG1의 발현을 변경하는 제제를 동정하는 분석법에 관한 것이다. 예를 들어, NRG1 폴리펩티드 (예: NRG1)을 엔코딩하는 핵산을 함유하는 용약을 시험 대상인 제제와 접촉시킨다. 용액은 예를 들어, 핵산을 함유하는 새포 또는 핵산을 함유하는 세포 용해질을 포함하고; 선택적으로 핵산의 전사/번역에 필요한 요소를 포함하는 다른 용액이다. 요망되는 경우에, 용액에 부유되지 않은 세포를 적용하였다. NRG1 발현의 수준 및/또는 패턴 (예: 다른 스플라이싱 변이체의 수준 및/또는 패턴과 같은 발현된 mRNA 또는 단백질의 수준 및/또는 패턴)을 검사하고 대조군의 발현 수준 및/또는 패턴 (예: 시험 대상인 제제의 부재하의 NRG1의 발현 수준 및/또는 패턴)을 비교한다. 제제의 존재하의 수준 및/또는 패턴이 제제의 부재하의 수준 및/또는 패턴과 통계학적으로 중요한 정도 또는 양으로 다른 경우에, 제제는 NRG1의 발현을 변경하는 제제이다. NRG1 발현의 증강은 제제가 NRG1의 작용 물질임을 의미한다. 유사하게, NRG1 발현의 억제는 제제가 NRG1의 활성의 길항 물질임을 의미한다. 다른 일 구체예에서, 시험 대상인 제제의 존재하에 NRG1 폴리펩티드 (예: 다른 스플라이싱 변이체)의 수준 및/또는 패턴을 그 전에 확립된 대조군 수준 및/또는 패턴과 비교한다. 대조군 수준 및/또는 패턴과 통계적으로 중요한 정도 또는 양으로 다른, 제제의 수준 및/또는 패턴은 제제가 NRG1발현을 변경한다.

본 발명의 다른 구체예에서, 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하거나, 그렇지 않으면 본원에서 기술된 핵산과 상호작용하는 제제는 리포터 유전자에 실시가능하게 연결된 뉴레굴린 1 유전자의 프로모터 영역을 엔코딩하는 핵산을 함유하는 세포, 세포 용해물 또는 용액을 사용하여 동정된다. 시험 대상인 제제와 접촉시킨 후에, 리포터 유전자의 발현 수준 (예: mRNA 또는 발현된 단백질의 수준)을 검사하고, 대조군의 발현 수준 (예: 시험 대상인 제제의 부재하의 리포터 유전자의 발현 수준)과 비교한다. 제제의 존재하의 수준이 제제의 부재하의 수준과 통계학적으로 중요한 상당한 정도 또는 양으로 다른 경우에, NRG1 프로모터에 실시가능하게 연결된 유전자의 발현을 변경할 수 있는 이의 능력에 의해 알 수 있는 바와 같이, 제제는 NRG1의 발현을 변경하는 제제이다. 리포터 발현의 증강은 제제가 NRG1 활성의 길항 물질임을 의미한다. 다른 구체예에서, 시험 대상인 제제의 존재하의 리포터의 발현 수준을 그 전에 확립된 대조군 수준과 비교한다. 대조군 수준과 통계학적으로 중요한 정도 또는 양으로 다른 제제의 존재하의 수준은 제제가 NRG1 발현을 변경하는 것을 의미한다.

NRG1에 의해 엔코딩되는 다른 스플라이싱 변이체의 양을 변경하는 제제 (제 1 스플라이싱 변이체의 활성을 증강시키고 제 1 스플라이싱 변이체의 활성을 억제하는 제제) 및 제 1 스플라이싱 변이체 활성의 작용 물질 및 제 2 스플라이싱 변이체 활성의 길항 물질인 제제는, 상기에 기술된 방법에 방법을 사용하여 용이하게 동정될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 분석법은 NRG1 결합 제제와 관련된 NRG1 폴리펩티드의 활성에 대한 시험 제제의 영향을 검사하는데 사용된다. 예를 들어, NRG1 폴리펩티드와 상호작용하는 화합물 (본원에서 수용체와 같은 NRG1폴리펩티드와 상호작용하는 폴리펩티드 또는 다른 분자인 "NRG1 결합 제제"로서 언급된다)을 발현하는 세포를 시험 제제의 존재하에 NRG1 폴리펩티드와 접촉시키고, NRG1 폴리펩티드 및 NRG1 결합 제제 사이의 상호작용을 변경하는 시험 제제의 능력을 결정한다. 선택적으로, NRG1 결합 제제를 함유하는 세포 용해질 또는 용액이 사용된다. NRG1 폴리펩티드에 결합하는 제제 또는 NRG1 결합 제제는, NRG1 폴리펩티드가 NRG1 결합 제제와 결합하거나, 관련하거나, 그렇지 않으면 상호작용하는 능력을 증강시키거나 방해함에 의해 상호작용을 변경한다. NRG1 폴리펩티드에 결합하는 시험 제제 또는 NRG1 폴리펩티드 결합 제제의 능력의 결정은, 예를 들어 폴리펩티드와 시험 제제의 결합이 직접 또는 간접적으로 라벨링된¹²⁵I,³⁵S,¹⁴C, 또는³H, 및 래디오에미션 (radioemmission)의 직접적인 계수 또는 신티레이션 계수 (scintillation counting)에 의하여 검출된 방사선동위원소를 검출함에 의해 결정되도록, 방사선동위원소 또는 효소 라벨을 지닌 시험 제제를 결합함에 의해서 수행된다. 선택적으로, 시험 제제는, 예를 들어 홀스래디쉬 페록시다제 (horseradish peroxidase), 알카리성 인산가수분해효소 또는 루시퍼라아제, 및 적절한 기질의 생산물로의 전환을 결정함에 의하여 검출되는 효소 라벨로 효소적으로 라벨링된다. 또한, 임의의 상호작용제의 라벨링없이 폴리펩티드와 상호작용하는 시험 제제의 능력을 결정하는것도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 마이크로피지오미터 (microphysiometer)가 시험 제제, NRG1 폴리펩티드 또는 NRG1 결합 제제의 라벨링없이 NRG1 폴리펩티드 및 NRG1 결합 제제와 시험 제제의 상호작용을 검출하는데 사용된다 (참고 문헌: McConnell, H. M. et al., Science 257: 1906-1912, 1992). 본원에서 사용된 "마이크로피지오미터" (예: Cytosensor^TM)는 광-어드레서블 포텐티오메트릭 센서 (light-addresable potentiometric sensor, LASP)를 사용하여 세포가 그 주변을 산성화하는 비율을 측정하는 분석기구이다. 산성화 비율의 변화는 리간드 및 폴리펩티드사이의 상호작용의 척도로서 사용된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 분석법이 본원에서 기술된 바와 같이, 하나 이상의 NRG1 폴리펩티드와 상호작용하는 폴리펩티드를 동정하는데 사용된다. 예를 들어, 필드 및 송에 의해 기술된 바와 같이 (참고 문헌: Fields, S. and Song, O., Nature 340: 245-246, 1989), 효모 이-하이브리드 시스템 (yeast two-hybrid system)은 하나 이상의 NRG1 폴리펩티드와 상호작용하는 폴리펩티드를 동정하는데 사용된다. 상기 효모 이-하이브리드 시스템에서, 벡터를 두개의 작용 도메인 (DNA 결합 도메인 및 전사 활성 도메인)을 가지는 전사 인자의 유연성에 기초하여 제조한다. 두개의 도메인이 분리되어 있으나 서로 상호작용하는 두개의 다른 단백질과 융합된 경우에 전사가 활성화되고, 특이적 마커 (예: His 및 Ade와 같은 영양 마커, 및 Lac Z와 같은 색 마커)의 전사가 상호작용 및 전사 활성화의 존재를 동정하는데 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서, DNA 결합 도메인을 엔코딩하는핵산 및 NRG1 폴리펩티드, 스플라이싱 변이체 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하는 제 1 벡터가 사용되고, 전사 활성화 도메인을 엔코딩하는 핵산, 및 잠재적으로 NRG1 폴리펩티드, 스플라이싱 변이체, 또는 이의 단편 또는 유도체 (예: NRG1 폴리펩티드 결합 제제 또는 수용체)와 상호작용하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터가 사용된다. 적절한 조건 (예: 클론테크의 Matchmarker^TM에서 사용되는 것과 같은 교배 조건)에서 제 1 벡터 및 제 2 벡터를 함유하는 효모의 인큐베이션은 대상 마커를 발현하는 콜로니의 동정을 가능케한다. 상기 콜로니를 조사하여 NRG1 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체와 상호작용하는 폴리펩티드를 동정한다. 상기 폴리펩티드는 상기에 기술된 바와 같이 NRG1 폴리펩티드의 발현의 활성을 변경하는 제제로서 유용하다.

본 발명의 상기 분석 방법의 일 이상의 구체예에서, 분석법의 자동화를 수용하고, 폴리펩티드의 하나 또는 둘의 비복합 형태로부터 복합된 형태의 분리를 용이하게 하기 위하여, 고체 지지물에 NRG1 폴리펩티드, NRG1 결합 제제 또는 분석의 다른 구성 요소를 고정하는 것이 바람직하다. 시험 제제와 폴리펩티드의 결합 또는 시험 제제의 존재 또는 부재하의 결합 제제와 폴리펩티드의 상호작용은 반응제를 함유하기에 적절한 임의의 용기에서 수행된다. 상기 용기의 예는 극소량 플레이트 (microtitre plate), 시험 튜브 및 마이크로-센트리퓨즈 튜브 (micro-centrifuge tube)를 포함한다. 일 구체예에서, NRG1 결합 제제 또는 NRG1 폴리펩티드가 매트릭스 또는 다른 고체 지지물에 결합하는 것을 가능하게 하는 도메인을첨가하는 융합 단백질 (예: 글루타티온-S-트랜스퍼라아제 융합 단백질)을 제공한다.

다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자의 발현의 조절제 (modulator)를 NRG1 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 함유하는 세포, 세포 용해질 또는 용액을 시험 제제와 접촉시키고, 세포, 세포 용해질 또는 용액내의 적절한 mRNA 또는 폴리펩티드 (예: 스플라이싱 변이체)의 발현을 결정하는 방법으로 동정한다. 시험 제제의 존재하의 적절한 mRNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준을 시험 제제의 부재하의 mRNA 또는 폴리펩티드의 발현 수준과 비교한다. 다음에, 시험 제제를 상기 비교에 기초하여 발현의 조절제로서 동정한다. 예를 들어, mRNA 또는 폴리펩티드의 발현이 시험 제제의 부재시보다 존재시에 더 적은 (통계적으로 중요한 정도로 적은) 경우에 시험 제제를 mRNA 또는 폴리펩티드 발현의 자극제 또는 증강제로서 동정한다. 선택적으로, mRNA 또는 폴리펩티드의 발현이 시험 제제가 존재하지 않는 경우보다 존재하는 경우에 더 적은 (통계학적으로 중요한 정도로 더 적은) 경우에, 시험 제제를 mRNA 또는 폴리펩티드 발현의 억제제로서 동정한다. 세포내의 mRNA 또는 폴리펩티드 발현 수준은 mRNA 또는 폴리펩티드를 검출하기 위한 본원에서 기술된 방법에 의해 결정된다.

상기 발명은 또한 상기 기술된 스크리닝 분석법에 의해 동정된 신규한 제제에 관한 것이다. 따라서, 적절한 동물 모델에서 본원에 기술된 바와 같이 동정된 제제를 사용하는 것은 또한 본 발명의 범위에 속한다. 예를 들어, 상기에서 기술된 바와 같이 동정된 제제 (예: 조절 제제, 안티센스 핵산 분자, 특이적 항체, 또는 폴리펩티드-결합 제제)는 상기 제제로 치료 효능, 독성 또는 부작용을 결정하기 위하여 동물 모델에서 사용된다. 선택적으로, 본원에서 기술된 바와 같이 동정된 제제는 상기 제제의 작용 기전을 결정하기 위하여 동물 모델에서 사용된다. 또한, 본 발명은 본원에서 기술된 바와 같이, 치료를 위한 상기 기술된 스크리닝 분석법에 의해 동정된 신규한 제제의 용도에 관한 것이다. 또한, 본원에서 기술된 바와 같이 동정된 제제는, 폴리펩티드 또는 유전자 (또는 폴리펩티드 또는 유전자를 포함하는 세포)를 본원에서 기술된 바와 같이 동정된 제제와 접촉시킴에 의해 뉴레굴린 1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 활성을 변경하거나 뉴레굴린 1에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 활성을 변경하기 위하여 사용된다.

약제학적 조성물

또한, 본 발명은 본원에서 기술된 핵산, 특히 본원에서 기술된 폴리펩티드를 엔코딩하는 뉴클레오티드; 본원에서 기술된 폴리펩티드 (예: SEQ ID NO: 2-5 또는 10-38 및/또는 NRG1에 의해 엔코딩된 다른 스플라이싱 변이체); 및/또는 본원에서 기술된 NRG1 발현 및/또는 NRG1 폴리펩티드 활성을 변경하는 제제를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 폴리펩티드, 단백질 (예: NRG1 수용체), 단편, 융합 단백질 또는 이의 전구 약물 또는 본 발명의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 또는 핵산 구조물 (벡터), NRG1 폴리펩티드 활성을 변경하는 제제, 뉴레굴린 1 유전자 발현을 변경하는 제제 또는 NRG1 결합 제제 또는 결합 상대물이 약제학적 조성물을 제조하기 위하여 생리적으로 허용되는 운바체 또는 부형제와 제형된다. 운반체 및 조성물은 멸균상태이다. 제형은 투여 방법에 적합하게 해야한다.

약제학적으로 허용되는 적절한 운반체는 물, 염용액 (예: NaCl), 식염수, 완충 식염수, 알코올, 글리세롤, 에탄올, 아라비아 고무, 채소 오일, 벤질 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 젖당과 같은 탄화 수소, 아밀로오스 또는 전분, 덱스트로오스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 규산, 점성 파라핀, 방향 오일, 지방산 에스테르, 히드록시메틸셀루로오스, 폴리비닐 피롤리돈 등, 및 이의 배합물을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 요망되는 경우에, 약제학적 제조물은 활성 제제와 불리하게 반응하지 않는, 삼투압, 완충작용, 착색, 풍미에 영향을 주는, 윤활제, 보존제, 안정화제, 습윤 제제, 유화제, 염 등과 같은 보조 제제 및/또는 방향족 물질 등과 혼합될 수 있다.

요망되는 경우에, 조성물은 또한 습윤 또는 유화 제제 또는 pH 완충 제제의 소량을 함유한다. 조성물은 액상 용액, 현탁액, 에멀젼, 타블렛, 알약, 캡슐, 지효성 제형 또는 분말이다. 조성물은 통상적인 결합제 및 트리글리세리드와 같은 운반체를 함유하는 좌약으로서 제형될 수 있다. 경구 제형은 약제학적 등급의 마니톨, 젖당, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 폴리비닐 피롤리돈, 사카린 나트륨, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등과 같은 표준 운반체를 포함한다.

상기 조성물의 도입 방법은 피내, 근내, 복강내, 안내, 정맥내, 피하, 국소, 경구 및 비강을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 적절한 도입 방법은 또한 유전자 치료법 (상기 기술된 바와 같음), 충전용 또는 생분해성 장치, 입자 가속 장치 ("유전자 총") 및 지효성 중합 장치를 포함한다. 또한, 본 발명의 약제학적조성물은 다른 제제와 함께 조합 치료법의 일부로서 투여된다.

조성물은 사람에 투여하기에 적절한 약제학적 조성물로서 일반적인 방법에 따라 제형된다. 예를 들어, 정맥내 투여를 위한 조성물은 일반적으로 멸균 등장 완충액중의 용액이다. 필요한 경우에, 조성물은 또한 주사 부위의 통증을 완화하기 위하여 용해 제제 및 국소 마취제를 포함한다. 일반적으로, 성분은 단위 투여 형태, 예를 들어 활성 제제의 양을 표시하는 앰플 또는 사케트 (sachette)와 같은 밀봉 용기중에 건조된 동결건조 분말 또는 수분 제거 농축물로서 분리되거나 함께 혼합되어 공급된다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우에, 이는 약제학적 등급의 멸균수, 식염수 또는 덱스트로오스/물을 함유하는 주입 바틀로 투여된다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우에, 성분이 투여전에 혼합되도록 주사용 멸균수 앰플 또는 식염수가 제공된다.

국소적 적용을 위하여, 국소적 적용과 양립가능한 운반체를 포함하고, 바람직하게는 물 보다 더 큰 유동적인 점성을 가지는 비분무형태, 점성 내지 반-고체 또는 고체 형태가 적용된다. 적절한 제형은 용액, 현탁액, 에멀젼, 크림, 연고, 분말, 관장제, 로션, 솔 (sol), 도포제, 납고 (salve), 에어로졸 등을 포함하나, 이에 한정되지 않고, 요망되는 경우에, 멸균되거나, 보존제, 안정화제, 습윤 제제, 완충액 또는 삼투압에 영향을 주는 염 등와 같은 보조 제제와 혼합된다. 제제가 화장용 제형으로 혼합될 수 있다. 국소적 적용을 위하여, 활성 제제를 바람직하게는 고체 또는 액체 불활성 운반체 물질과 혼합하여 스퀴지 바틀 (squeeze bottle)로 포장되거나 압축된 휘발성, 일반적으로 기체 추진제, 예를 들어 압축 공기와 혼합되어 포장된 분무형 에어로졸 제조물이다.

본원에서 기술된 제제는 중성 또는 염 형태로서 제형된다. 약제학적으로 허용되는 염은 연산, 인산, 아세트산 옥살산, 타르타르 산 등으로부터 유래된 것들과 같은 유리 아미노기를 가지는 형태, 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유래된 것들과 같은 유리 카르복시산을 가지는 형태를 포함한다.

제제는 치료적 유효량으로 투여된다. 특정 질환 또는 상태의 치료에 대한 제제의 치료적 유효량은 질환 또는 상태의 성질에 따라 다르고, 표준 임상 기술에 의해 결정된다. 또한, 체외 또는 체내 분석법이 적절한 투여 범위를 특정하는 것을 돕기 위하여 선택적으로 적용된다. 제형에 적용되는 정확한 투여량은 투여 경로, 정신분열증 증상의 심각성에 따라 다르고, 의사의 판단 및 각 환자의 환경에 따라 결정된다. 유효량은 체외 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 투여량-반응 커브에 의하여 추정된다.

본 발명은 또한 본 발명의 약제학적 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 (pack) 또는 키트를 제공한다. 선택적으로, 상기 약물은 약제학적 또는 생물학적 생산물의 제조, 사용 또는 판매를 조절하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 고지와 관련되고, 상기 고지는 사람에게 투여하기 위한 판매용의 제조, 사용 기관에 의한 승인을 반영하낟. 팩 또는 키트는 약물 투여의 순서 (예: 분리되어, 연속적으로 또는 동시에), 투여 방법에 관한 정보를 라벨링한다. 팩 및 키트는 또한 환자에게 치료를 받을 것을 환기시키는 수단을 포함한다. 팩 및 키트는 조합 치료의 1회 단위 투여량이거나, 다수의 단위 투여량이다. 특히, 제제는 한 개의 바이얼 또는 타블렛으로 임의의 조합으로 함께 혼합되어 분리된다. 발포제 팩 또는 다른 조제 수단으로 합쳐진 제제가 바람직하다. 본 발명의 목적을 위하여 단위 투여량은 각 제제의 개개의 약동학에 따른 투여량을 의미하고 표준 시간 코스로 FDA 승인 투여량으로 투여된다.

치료 방법

본 발명은 또한 NRG1 치료 제제를 사용하는 정신분열증의 치료 (예방 및/또는 치료) 방법에 관한 것이다. "NRG1 치료 제제"는 상기 기술된 바와 같이 NRG1 폴리펩티드 활성 및/또는 뉴레굴린 1 유전자 발현을 변경하는 (예: 증가 또는 억제), 정신분열증의 치료에 사용되는 제제 (예: NRG1 작용 물질 또는 길항 물질)이다. NRG1 치료 제제는 다양한 수단 예를 들어, 추가적인 NRG1 폴리펩티드를 제공하거나 NRG1의 전자 또는 번역을 상향 조절하거나; NRG1 폴리펩티드의 번역후 프로세싱을 변경하거나; NRG1 스플라이싱 변이체의 전사를 변경하거나; NRG1 폴리펩티드 활성을 방해하거나 (예: NRG1 폴리펩티드의 결합에 의함) 또는 NRG1의 전사 또는 번역을 하향 조절함에 의해 NRG1 폴리펩티드 활성 또는 유전자 발현을 변경한다. NRG1 치료 제제의 대표적인 예는 하기를 포함한다:

본원에 기술된 핵산 또는 이의 단편 또는 유도체, 특히 본원에 기술된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산 및 상기 핵산 (예: 유전자, cDNA, 및/또는 mRNA, 예를 들어, NRG1 폴리펩티드 또는 이의 활성 단편 또는 유도체를 엔코딩하는 핵산 또는 올리고뉴클레오티드; 예를 들어, SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2-5 또는 10-38 중의 임의의 하나 또는 이의 단편 또는 유도체를 엔코딩하는 핵산)을 포함하는 벡터;

본원에서 기술된 폴리펩티드 (예: SEQ ID NO: 2-5 또는 10-38 중 하나 이상, 및/또는 NRG1에 의해 엔코딩된 다른 스플라이싱 변이체 또는 이의 단편 또는 유도체);

다른 폴리펩티드 (예: NRG1 수용체, 예를 들어, ErbB2, ErbB3, ErbB4, 및 ErbB2/ErbB4, ErbB2/ErbB3 및 ErbB3/ErbB4의 헤테로다이머를 포함하는 erB 수용체); NRG1 결합 제제; 펩티도미메틱; 융합 단백질 또는 이의 전구 약물; 항체 (예: 상기에 기술된 변이체 NRG1 폴리펩티드에 대한 항체, 또는 비변이체 NRG1 폴리펩티드에 대한 항체, NRG1에 의해 엔코딩된 특정 스플라이싱 변이체); 리보자임; 다른 저분자;

및 뉴레굴린 1 유전자 발현 또는 폴리펩티드 활성을 변경하거나 (예: 증강 또는 감소), NRG1 폴리펩티드의 번역후 프로세싱을 변경하거나, NRG1 스플라이싱 변이체의 전사를 조절하는 (예: 어떤 스플라이싱변이체가 발현되는지에 영향을 주거나 발현되는 각 스플라이싱 변이체의 양에 영향을 주는 제제) 다른 제제.

바람직한 구체예에서, NRG1 치료 제제는 하나 이상의 NRG1 폴리펩티드를 엔코딩하는 (예: SEQ ID NO: 2-5 또는 10-38 중에 하나 이상 또는 이의 단편 또는 유도체를 엔코딩하는) 핵산이고; 다른 바람직한 구체예에서, NRG1 치료 제제는 NRG1 조절 영역과 같은 단편을 포함하는 (예: SEQ ID NO: 1의 단편 또는 이의 유도체를 포함하는) 핵산이고; 또 다른 바람직한 구체예에서 NRG1 치료 제제는 NRG1 조절 영역 및 하나 이상의 NRG1 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 유도체를 엔코딩하는 핵산 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하는 핵산이다.

요망되는 경우, 하나 이상의 NRG1 치료 제제가 최근에 사용된다.

핵산인 NRG1 치료 제제는 정신분열증의 치료에 사용된다. 본원에서 사용된 용어, "치료"는 질환과 관련된 증상을 개선하는 것뿐만 아니라, 질환의 발병을 막거나 지연시키고, 질환 증상의 심각성 또는 빈도를 완화하는데 관한 것이다. 치료법은 개체의 NRG1 폴리펩티드의 활성을 변경 (예: 억제 또는 증강), 대체 또는 보충하도록 설계된다. 예를 들어, NRG1 치료 제제는 뉴레굴린 1 유전자 또는 NRG1의 특이적 스플라이싱 변이체의 발현 또는 유용성을 상향 조절하거나 증가시키거나, 반대로, 뉴레굴린 1 유전자 또는 NRG1의 특이적 스플라이싱 변이체의 발현 또는 유용성을 하향 조절하거나 감소시키기 위하여 투여된다. 천연 NRG1 또는 특정 스플라이싱 변이체의 발현 또는 유용성을 상향조절하거나 증가시키는 것은 결손 유전자 또는 다른 스플라이싱 변이체의 발현 또는 활성을 방해하거나 보상하고; 천연 NRG1 또는 특정 스플라이싱 변이체의 발현 또는 유용성을 하향 조절하거나 감소시키는 것은 결손 유전자 또는 특정 스플라이싱 변이체의 발현 또는 활성을 최소화하여, 결손 유전자 또는 특정 스플라이싱 변이체의 영향을 최소화한다.

NRG1 치료 제제는 치료적 유효량 (예: 질병과 관련된 증상을 개선하고/거나, 질환의 발병을 막거나 지연하고/거나 질병의 증상의 심각성 또는 빈도를 완화함)으로 투여된다. 특정 개체의 질환이나 상태의 치료에 치료적으로 효과적인 양은 질환의 증상 또는 심각성에 따라 다르고, 표준 임상 기술에 따라 결정된다. 또한, 체내 또는 체외 분석은 선택적으로 최적의 투여량 범위를 동정하는데 적용된다.제형에 적용되는 정확한 투여량은 또한 투여 경로 및 질병 또는 질환의 심각성에 대라 다르고, 의사 및 각 환자의 상황에 따라 결정된다. 유효량은 체외 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유래된 투여량-반응 커브로부터 추정된다.

일 구체예에서, 본 발명의 핵산 (예: SEQ ID NO: 1과 같은 NRG1 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산; 또는 SEQ ID NO: 2-5 또는 10-38 중 어느 하나를 엔코딩하는 핵산과 같은, NRG1 폴리펩티드 또는 스플라이싱 변이체 또는 이의 유도체 또는 단편을 엔코딩하는 다른 핵산)이 단독으로 또는 상기에 기술된 약제학적 조성물중에서 사용된다. 예를 들어, NRG1 또는 NRG1 폴리펩티드를 엔코딩하는 cDNA가 단독으로 또는 벡터내에 포함되어 세포로 도입되어 (체외 또는 체내에서) 그 세포가 천연 NRG1 폴리펩티드를 생산한다. 필요한 경우에, 유전자 또는 cDNA, 또는 유전자 또는 cDNA를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포가 질병에 걸린 개체로 도입된다 (또는 재도입된다). 이와 같이, 사실상 천연 NRG1 발현 또는 활성이 부족하거나, 돌연변이체 NRG1 발현 및 활성을 가지거나, 질환-관련된 NRG1 스플라이싱 변이체의 발현을 가지는 세포가 NRG1 폴리펩티드 또는 NRG1 폴리펩티드의 활성 단편 (또는 NRG1 폴리펩티드의 다른 변이체)을 발현하도록 조작된다. 바람직한 구체예에서, NRG1 폴리펩티드 또는 이의 활성 단편 또는 유도체를 엔코딩하는 핵산은 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터로 도입되고, 벡터는 동물의 적절한 세포로 도입된다. 바이러스 또는 비바이러스 전달 시스템을 포함하는 다른 유전자 전달 시스템이 사용된다. 선택적으로, 비바이러스 유전자 전달 방법, 예를 들어 인산 칼슘 공동 침강 반응; 기계적 방법 (예: 미세주입); 리포솜을 통한 막 융합 매개 전달; 또는 직접적인DNA 흡수가 사용된다.

선택적으로, 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 핵산; 본 발명의 핵산에 상보적인 핵산; 또는 핵산의 일부 (예: 상기에 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드)가 "안티 센스" 치료법에 사용되고, 여기서 NRG1의 mRNA 및/또는 게놈 DNA핵산에 특이적으로 혼성화하는 핵산 (예: 올리고뉴클레오티드)이 본래 자리에 (in situ) 투여되거나 발생된다. mRNA 및/또는 DNA에 특이적으로 혼성화하는 안티센스 핵산은 예를 들어, 번역 및/또는 전사를 억제함에 의해서 NRG1 폴리펩티드 등의 발현을 억제한다. 안티센스 핵산의 결합은 통상적인 염기쌍 상보성에 의하거나, 예를 들어 DNA 쌍의 결합의 경우에, 이중 나선의 깊은 홈 (major groove)의 특이적 상호 작용을 통해서 이루어진다.

본 발명의 안티센스 구조물은 예를 들어 상기에 기술된 발현 플라스미드로서 전달된다. 플라스미드가 세포 안에서 전사되는 경우에, 이는 NRG1 폴리펩티드를 엔코딩하는 mRNA 및/또는 DNA의 일부에 상보적인 RNA를 생산한다. 선택적으로, 안티센스 구조물은 탈체 상태로 (ex vivo) 발생되어 세포로 도입되는 올리고뉴클레오티드이고; 다음에, NRG1의 mRNA 및/또는 게놈 DNA로 혼성화함에 의하여 발현을 억제한다. 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 탐침은 내인성 뉴클리아제, 예를 들어, 엑소뉴클리아제 및/또는 엔도뉴클리아제에 저항성을 가지는 수식된 올리고뉴클레오티드이이서 체내에서 안정하게 된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용되는 예의 핵산 분자는 DNA의 포스포라미데이트, 포스포티오에이트 및 메틸포스포네이트 유사체이다 (참고 문헌: 미국 특허 제 5,176,996호; 제 5,264,564호; 및 제5,256,775호). 또한, 안티센스 치료법에 유용한 올리고머를 제작하는 일반적인 접근법은 예를 들어 문헌 (Van der Krol et al., Biotechnique 6: 958-976, 1988 및 Stein et al., Cancer Res 48: 2659-2668, 1988)에 기술되어 있다. 안티센스 DNA에 대하여, 예를 들어, NRG1 서열의 -10 및 +10 영역 사이의 번역 개시 위치로부터 유래된 올리고디옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.

안티센스 치료를 수행하기 위하여, NRG1을 엔코딩하는 mRNA에 상보적인 올리고뉴클레오티드 (mRNA, cDNA 또는 DNA)를 설계한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 NRG1 mRNA 전사물 (transpcrit)과 결합하여 번역을 막는다. 바람직하기는 하나, 절대적인 상보성은 필요치 않다. 본원에서 언급된, RNA의 일부에 대한 "상보적인" 서열은 서열이 RNA와 혼성화할 수 있는 충분한 상보성을 가지는 것을 의미하고, 이중-나선 안티센스 핵산의 경우에, 이중 DNA의 단일 가닥이 시험되거나 삼중 형성이 분석된다. 혼성화 가능성은 상기에 상세히 기술된 바와 같이, 안티센스 핵산의 상보성의 정도 및 길이 둘 모두에 따라 다르다. 일반적으로 혼성화하는 핵산의 길이가 길수록, RNA와 불일치하는 염기가 많을 수록 안정한 이중 (또는 경우에 따라 삼중)을 형성한다. 당업자는 표준 방법의 사용을 사용하여 허용가능한 정도의 불일치를 확인한다.

안티센스 치료법에 사용되는 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가달인, DNA, RNA, 또는 키메라 혼합물 또는 이의 유도체 또는 수식된 이형이다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 분자의 안정성, 혼성화 등을 개선하기 위하여 염기 부분, 당 부분 또는 포스페이트 주사슬에서 수식된다. 올리고뉴클레오티드는 펩티드와 같은 다른 추가된 기 (예: 체내에서 숙주 세포 수용체를 표적하기 위한 것), 또는 세포 막 (참고 문헌: Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6553-6556, 1989; Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 648-652, 1987; 국제 출원 공개 번호 제 88/09810호) 또는 혈뇌 장벽 (참고 문헌: 국제 출원 공개 번호 제 89/10134호)을 통한 이동을 용이하게 하는 제제, 또는 혼성화-유발 절단 제제 (참고 문헌: Krol et al., Biotechnique 6: 958-976, 1998) 또는 DNA 삽입 제제 (참고 문헌: Zon, Pharm. Res. 5: 539-549, 1988)를 포함한다. 이 때문에, 올리고뉴클레오티드는 다른 분자 (예: 펩티드, 혼성화 유발 교차 결합 제제, 이동 제제, 혼성화-유발 절단 제제)에 결합된다.

안티센스 분자는 체내에서 NRG1을 발현하는 세포에 전달된다. 많은 방법이 안티센스 DNA 또는 RNA를 세포에 전달하는데 사용된다; 예를 들어, 안티센스 분자가 조직 위치에 직접 주입되거나, 원하는 세포를 표적하기 위해 설계된 수식된 안티센스 분자(표적 세포 표면에서 발현된 수용체 또는 항원과 특이적으로 결합하는 펩티드 또는 항체에 연결된 안티센스)가 전신적으로 투여된다. 선택적으로, 바람직한 구체예에서, 재조합 DNA 구조물이 사용되고, 여기서 안티센스 올리고뉴클레오티드는 강한 프로모터 (예: pol Ⅲ 또는 pol Ⅱ)의 조절하에 놓인다. 환자에서 표적 세포를 트랜스펙션하기 위한 구조물의 사용은 내인성 NRG1 전사물과 상보적인 염기 쌍을 형성하는 충분한 양의 단일 가닥 RNA의 전사하게 하고, 이에 의하여 NRG1 mRNA의 번역을 방지한다. 예를 들어, 벡터는 체내에 도입되어 세포에 의해 흡수되고 안티센스 RNA의 전사를 지시한다. 상기 벡터는 원하는 안티센스 RNA를생산하기 위하여 전사되는 한, 에피솜으로 남아 있거나 염색체로 삽입된다. 상기 벡터는 상기에서 기술된 본 기술분야의 재조합 DNA 기술 방법 표준에 의해 제조된다. 예를 들어, 플라스미드, 코스미드, YAC 또는 바이러스 벡터를 사용하여 조직 위치에 직접 도입되는 재조합 DNA 구조물을 제조한다. 선택적으로, 원하는 조직에 선택적으로 감염된 바이러스 벡터가 사용되고, 이 경우에, 투여는 다른 경로 (예: 전신적)에 의해 수행된다.

내인성 NRG1 발현을 또한 표적 상동 재조합을 사용하여 NRG1 또는 이의 프로모터를 "노킹 아웃 (knocking out)"시키거나 불활성화함에 의해서 감소시킨다 (참고 문헌: Smithies et al., Nature 317: 230-234, 1985; Thomas & Capecchi, Cell 51: 503-512, 1987; Thompson et al., Cell 5: 313-321, 1989). 예를 들어, 돌연변이체, 내인성 NRG1 (NRG1의 코딩 영역 또는 조절 영역)에 상동성을 가지는 DNA의 측부에 서는 비기능성 NRG1 (또는 완전히 관련되지 않은 DNA 서열)이, 체내에서 NRG1을 발현하는 세포를 트랜스펙션하기 위하여 선별 마커 및/또는 음성 선별 마커가 있거나 없이 사용된다. DNA 구조물의 삽입은 표적 상동 재조합을 통하여 NRG1의 불활성화를 유도한다. 재조합 DNA 구조물은 상기에 기술된 바와 같이 적절한 벡터를 사용하여 체내에서 원하는 위치에 직접 투여되거나 표적된다. 선택적으로, 비돌연변이체 NRG1의 발현은 유사한 방법을 사용하여 증가된다: 표적 상동 재조합은, 상기에 기술된 바와 같이 세포내 돌연변이체 NRG1을 대신하여 비돌연변이체, 기능성 NRG1 (예: SEQ ID NO: 1을 가지는 유전자) 또는 이의 일부를 포함하는 DNA 구조물을 삽입하기 위하여 사용된다. 다른 구체예에서, 표적 상동 재조합은 세포내에 존재하는 것과 다른 NRG1 폴리펩티드 변이체를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 구조물을 삽입하기 위하여 사용된다.

선택적으로, 내인성 NRG1 발현은 신체내 표적 세포의 NRG1의 전사를 막는 삼중 나선 구조를 형성하도록, NRG1의 조절 영역 [예: NRG1 프로모터 및/또는 인핸서 (enhancer)]에 상보적인 디옥시뉴클레오티드 서열을 표적함에 의해 감소된다 (참고 문헌: Helene, C., Anticancer Drug Des. 6(6): 569-84, 1991; Helene, C., et al, Ann. N.Y. Acad, Sci. 660: 27-36, 1992; 및 Maher, L.J., Bioassay 14(12): 807-15, 1992). 마찬가지로, 상기에서 기술된 안티센스 구조물은 하나의 NRG1 단백질의 정상적인 생물학적 활성을 상쇄함에 의해 조직의 조작 예를 들어, 조직 분화, 체내 또는 탈체 조직 배양에 사용된다. 또한, 안티센스 기술 (예: 안티센스 분자의 미세주입, 또는 그 전사물이 NRG1 mRNA 또는 유전자 서열에 관하여 안티 센스인 플라스미드의 트랜스펙션)이 발달 단계의 NRG1의 역활 및 어른 조직의 NRG1의 정상 세포 기능을 연구하기 위하여 사용된다. 상기 기술은 세포 배양에서 사용되고, 형질전환 동물을 만드는데도 사용된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 본원에 기술된 바와 같이 다른 NRG1 치료 제제가 정신분열증의 치료 또는 예방에 사용된다. 치료 제제가 상기 기술된 바와 같이 조성물로 또는 단독으로 전달된다. 이들은 전신적으로 투여되거나 특정 조직에 표적된다. 치료 제제는 화학 합성; 재조합 생산; 체내 생산 (예: 형질전환 동물, 예를 들어 Meade et al의 미국 특허 제 4,873,316호)을 포함하는 다양한 수단에 의하여 생산되고, 본원에 기술된 바와 같이 표준 수단을 사용하여 단리된다.

임의의 상기 치료 방법의 조합 (예: 돌연변이체 NRG1 mRNA을 표적하는 안티센스 치료와 함께 비돌연변이 NRG1 폴리펩티드의 투여; NRG1에 의해 엔코딩된 제 2 스플라이싱 변이체를 표적하는 안티센스 치료와 함께 NRG1에 의해 엔코딩된 제 1 스플라이싱 변이체의 투여)이 또한 사용된다.

본 발명은 하기의 제한되지 않은 실시예에 의해서 추가로 설명된다. 본원에 인용된 모든 문헌의 내용은 전체가 참고 문헌으로 본원에 통합된다.

정신분열증 환자 집단에 연관된 유전자의 동정

아이슬란드의 정신분열증 환자의 수명은 남성 0.6% 및 여성 0.9%로 다른 나라에서 관찰된 바와 유사하였다. 7명의 정신과의사의 한 팀이 환자를 진단하고, 그 전에 진단한 환자의 진단을 확인하고 시료를 수집하기 위하여 고용되었다. 각 정신과의사는 정신분열증 및 정신 질환을 위한 스케쥴, 라이프타임 버젼 (SDAS-L)을 사용하여 인터뷰하였다 (참고 문헌: Endicott, J. 및 Spitzer, R.L., Arch. Gen. Psychiary 35: 837, 1978). SADS-L 인터뷰의 정보는 리서치 진단 기준 (RDC)및 정신 질환의 진단 및 통계 매뉴얼 (3판) (DMS Ⅲ-R)에 따라 모든 경우를 분류하는데 사용되었다. 또한, 정신병을 위한 작업 기준 OPCRIT 체크리스트가 정신병에 대한 복합 접근을 용이하게 하기 위하여 사용되었다 (참고 문헌: McGuffin, P. et al., Arch. Gen Psychiatry 48(8): 764-70, 1991).

BAC 콘티그 (contig)의 제작

대상 영역을 위한 BAC (박테리아 인공 염색체) 콘티그를 RPCI11 사람 BAC 라이브러리를 사용하여 생산하였다 (참고 문헌: Pieter deJong, Roswell Park). BAC를 영역내의 마이크로세틀라이트 마커 (microsatelite marker) 및 입수 가능한 STS 마커를 사용하여 혼성화하여 동정하고, BAC 및 서열로부터 설계된 마커를 사용하여 연속적으로 혼성화하였다. 혼성화 결과를 확인하고 BAC의 순서를 영역내 모든 유효한 마커를 사용하여 PCR에 의해 결정하였다. 주된 목적은 마이크로세틀라이트 마커를 높은 해상도로 그 순서를 규명하는 것이다.

신규한 마이크로세틀라이트 마커 조사

BAC를 샷건 (shotgun)으로 클로닝하고 멤브레인에 격자상으로 배치하였다. 마이크로세틀라이트 반복구를 함유하는 클론을 마이크로세틀라이트 반복 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 탐침으로 하이브리화하여 동정하였다. 양성 클론을 시퀀싱에 의하여 분석하고, 마이크로세틀라이트를 증폭하기 위하여 프라이머를 설계하였다.

DNA 시퀀싱

대상 영역의 최소 틸링 패쓰 (tilling path)를 포괄하는, 9개의 BAC를 샷건 클로닝 및 시퀀싱에 의하여 분석하였다. 다이 터미네이터 (dye terminator) (ABI PRISM BigDye^TM) 화학법을 형광 자동화 DNA 시퀀싱을 위하여 사용하였다. ABI 프리즘 377 서열을 사용하여 결과를 수집하고, 폴리프레드 소프트웨어 (Polyphred software)와 조합하여 프레드/프랍/콘세드 소프트웨어 (Pfred/Phrap/Consed software)가 서열을 정리하기 위하여 사용되었다.

서열 데이타베이스내 엑손의 조사

DNA 및 단백질 데이타베이스의 BLAST 정렬에 의하여 엑손/유전자를 조사하였다.

cDNA 라이브러리내 신규한 엑손의 조사

3' 및 5' RACE (cDNA 말단의 고속 중폭) 둘 모두를 클론텍 레보러토리 아이엔씨의 마라톤-레디TM cDNA 및 디코드 제네틱스가 만든 cDNA 라이브러리를 사용하여 수행하였다.

엑손 예상 기구를 사용한 신규한 엑손의 조사

유전자 마이너 소프트웨어 (디코드 제네틱스)를 사용하여 엑손이 본 발명자들의 1.5 Mb 서열내 어느 위치에 있는지를 예상하는데 사용하였다. 상기 cDNA 라이브러리의 후보 엑손을 증폭시키기 위한 프라이머를 설계하여 터치 다운 PCR을 수행하고, 생산물을 시퀀싱에 의하여 검증하였다.

트랩핑 (trapping) 엑손

엑손을 라이브 테크놀로지의 엑손 트랩핑 키트를 사용하여 "트랩핑"하였다. 탐침을 cDNA 라이브러리의 상기 후보 엑손을 증폭시키기 위하여 설계하여 터치 다운 PCR을 수행하고, 생산물을 시퀀싱에 의해 검증하였다.

게놈-와이드 스캔 (Genom-wide scan)

6회의 감수분열 미만으로 관련된 환자, 260명의 환자 및 334명의 관련 친척의 시료를 950 마이크로세틀라이트 마커의 마커 세트를 사용하여 유전자형 분석하였다. 한 유전자좌, 8p21-8p11을 추가 150 마커를 추적조사하여 재검사하였다.260 환자 및 이의 친척에 더해 게놈 와이드 스캔에서 132명의 환자 및 147명의 환자에 대해 8p21-11 유전자좌에 대한 150 마이크로세틀라이트 마커를 사용하여 유전자형을 분석하였다.

통계적 분석

알레그로 소프트웨어로 연관 분석을 수행하였다. 도 1에 대립 CS 환자 가계도를 사용한 어렐-쉐어링 모델에 대한 결과를 도시하였다 (158 환자, 환자간 5 감수 분열의 최대거리).

예상 정신분열증 유전자좌의 물리적인 맵핑 (mapping) (8p21-11상의 유전자좌)

3 근처에서 최대 LOD 값을 가지는, 발견된 가장 중요한 유전자좌를 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 사용하여 물리적으로 맵핑하였다. 처음에 유전자좌는 약 30 cM으로 넓었다. 상기 영역의 작은 분획만이 약 5Mb 의 염기의 총 누적 값으로 종전에 시퀀싱되었다. 상기 영역의 마커의 공개된 순서가 정확하지 않고, 본 영역에서 공지된 다형성 마커의 대부분이 방사선 하이브리드로 맵핑되지 않았다. BAC 맵의 주요한 목적은 상기 영역의 모든 다형성 마커의 고해상능의 순서 규명 (100 내지 150kb)을 달성하고 신규한 다형성 마커를 조사하는 것이다.

상기 영역으로부터 프라이머로 BAC 라이브러리를 스크리닝함에 의하여 3000 BAC를 혼성화 및 PCR 방법으로 검색하였다. 콘티그 맵핑을 수행하였다; 940개의 상기 클론을 PCR 및 혼성화의 콘티그에 의하여 할당하였다. 또한, 252 추가 BAC를 핑거프린팅 분석에 기초한 콘티그에 할당하였다 (총 1192 BAC 클론을 콘티그에 할당하였다). 마커 순서를 교정한 후에 최대 LOD 값이 3.1이었다 (도 1). BAC 콘티그에 의해서 포괄된 30cM BAC 영역의 534 마커의 순서를 결정하였다. 물리적인 맵은 다형성 마이크로세틀라이트 마커 및 STS 마커의 순서 규명 및 배치를 가능하게 하였다. BAC를 BAC 콘티그로부터 서브클로닝하고 혼성화에 의하여 신규한 마이크로세틀라이트를 조사하였다. 시료를 평균적으로 유전자좌를 통과하는 매 0.17cM마다 다형성 마이크로세틀라이트 마커를 사용하여 유전자형 분석하였다. 마이크로세틀라이트를 부록 Ⅱ에 도시하였다.

물리적 맵핑의 결과로서, 유전자좌는 약 20cM으로 범위가 좁아졌다. 상기 20cM 영역은 4개의 큰 콘티그, 각각 2-10 Mb로 채어졌다. 주요 피크는 7cM 및 한 개의 BAC 콘티그에 존재하는 상기 영역에 결쳐 연장되었다. 4 개의 콘티그는 상기 콘티그의 방사선 하이브리드 맵핑된 마커, 효모 인공 염색체 (YAC) 맵의 결과 및 가족내의 일배체형 (haprotype)을 비교한 결과에 기초하여 정확하게 순서를 규명하였다. 마커 순서가 교정되었기 때문에, 조밀하게 맵핑된 마커는 보다 더 정확한 일배체형을 재구축하고, 가족간에 실질적으로 겹치는 위험 일배체형을 조사하기 위하여 사용된 수 있다.

위험 (at-risk) 일배체형의 동정

유전자좌 8p21-11

조밀하게 맵핑된 마커에 대한 유전자형을 사용하여, 환자의 일배체형을 구축하고, 각 개별적인 가족내의 3 이상의 환자에 의하여 수행된 후보 위험 일배체형을 동정하였다. 가족간에 상기 후보 일배체형을 비교하여, 상기 일배체형이 실질적으로 겹치는지를 찾아내었다 (도 2). 환자에서 발견된 일배체형의 중심 (D8S1810, 0.3 Mb의 텔로미어인 6개의 마커)이 환자의 10%에서 발견되었다 (조사된 746 염색체 중에 37). 도 2에 위험 일배체형의 일부를 가지는 44 환자 일배체형을 도시하였다. 도 3에 시퀀싱된 BAC의 순서 및 유전자좌 8p12의 위험 일배체형에 대한 경계의 개요를 도시하였다.

연관 및 일배체형 분석의 결과는, 유전자, 뉴레굴린 1 (NRG1) 및 신규한 유전자 뉴레굴린-1-관련 유전자 1 (NRG1AG1)의 엑손을 가지는, 8p12의 1.5Mb 시그먼트에 존재하는 질환-감수성 유전자의 존재를 강력히 제시한다. 뉴레굴린-1-관련 유전자 1 (NRG1AG1)에 대한 유전자는 "사람 정신분열증 유전자"란 명칭의 미국 특허 출원 제 09/515,715호 (대리인 번호 2345.2005-000)에 기술되어 있고, 동시에 본 출원으로 출원되고 전체가 참고문헌을 본원에 통합된다.

후보 영역의 서열

유전자좌 8p12

8p12상의 BAC 콘티그의 1.5Mb의 시퀀싱 결과 후보 일배체형은 가족간에 실질적인 중복을 나타냈다. 상기 서열은 하나의 콘티그내에 존재하고 매우 흥미있는 후보 유전자인 뉴레굴린 1 (NRG1)을 가졌다.

유전자 동정

유전자좌 8p12

뉴레굴린 1은 많은 스플라이싱 형태가 연구되어 특성이 잘 규명된 유전자이다. 엑손의 설명, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 및 엑손을 도 4에 도시하였다.뉴레굴린 1에 대한 신규한 엑손 및 스플라이싱 변이체는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함에 의해 동정되었다. 유전자 및 스플라이싱 변이체를 부록 I에 도시하였다.

뉴레굴린 1 관련 유전자 1은 신규한 유전자이고 공지된 단백질 서열은 이 신규한 유전자에 비교적 상동성을 보이지 않았다. 엑손의 설명, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 및 결손 및 삽입을 부록 Ⅱ에 도시하였다. 상기 유전자가 뉴레굴린 유전자내에 존재하고 위험 하프로이드에 의해 정의된 1.5Mb내에 위치하기 때문에, 정신분열증에 대한 강력한 후보 유전자이다.

뉴레굴린 1 (NRG1)

뉴레굴린 1 (ARIA, GGF2 및 헤레굴린이라고도 칭함)은 단일 유전자의 선택적인 RNA 스플라이싱으로 나타나는 폴리펩티드 인자의 군이다 (참고 문헌: Fischbach, G.D., Rosen, K.M., Annu. Rev. Neurosci. 20: 429-258, 1997; Orr-Urtreger, A., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 1746-1750, 1993; Corfas, G., et al., Neuron 14(1): 103-15, 1995; Meyer, D. et al., Development 124(18): 3575-86, 1997). 뉴레굴린 1의 기본 구조는 N-터미날 영역, 면역글로불린 (Ig) 모티브, 글라이코실화-풍부 스페이서 도메인, EGF-유사 도메인 및 세포질 테일을 포함한다 (참고 문헌: Fischbach, G.D., Rosen, K.M., Annu. Rev. Neurosci. 20: 429-258, 1997; Loeb, J.A. et al., Development 126(4): 781-91, 1999; Meyer, D. et al., Development 124(18): 3575-86, 1997). 본원에서 처음으로 설명된 뉴레굴린 1의 전체 유전자 서열을 SEQ ID NO: 1에 도시하였다. 스플라이싱 변이체는 다양한 폴리펩티드 서열 예를 들어, SEQ ID NO: 2 내지 SEQ ID NO:5 및 SEQ ID NO: 10 내지 SEQ ID NO: 38 (단, SEQ ID NO: 2, 5, 10, 38은 제외함)을 가지는 서열을 만든다. 부록 Ⅲ은 스플라이싱 변이체의 표를 나타낸다. 부록 Ⅲ의 표는 cDNA 라이브러리를 스크리닝함에 의해서 발견된 8개의 신규한 변이체를 포함한다. 발견된 클론의 하나, 클론 OG-49-2 (부록 Ⅲ)은 종래에 공지된 클론과 다르다. 이는 공지된 N-터미날 영역, 크링글 유사 도메인 및 3' 말단에 ALU 엑손을 가진다. 상기 클론은 모든 공지된 뉴레굴린 클론처럼 EGF 유사 도메인을 가지지 않는다.

뉴레굴린은 많은 조직, 특히 중추 신경계에서 발현된다 (참고 문헌: Corfas, G. et al., Neuron 14(1): 103-115, 1995). 뉴레굴린 1 유전자는, G-단백질 시그날링 캐스캐이드의 구성 요소의 유도, 상피 증식 인자 수용체 및 GABA 수용체 서브유닛의 활성화 및 AChR 유전자 발현의 활성화에서의, NMDA 수용체의 발현의 역활을 포함하여, 많은 이유로 정신분열증과 관련된 것으로 생각된다. 뉴레굴린 1의 상기 활성의 각각은 하기에 간략히 논의된다.

뉴레굴린은 NMDA 수용체 서브유닛의 발현에 포함된다 (참고 문헌: Mohn, A.R. et al., Cell 98(4): 427-36, 1999). NMDA 수용체는 NR1 서브유닛 및 발달상 및 영역상으로 조절된 NR 2 서브유닛 (A 내지 D)으로 구성된다. 정상적인 수의 NR1의 단지 5%만을 발현하는 유전적으로 조작된 돌연변이체 (마우스)는 정신분열증 증상을 보였고, 이는 지금까지의 최상의 정신분열증의 설치류 모델일 것이다.

뉴레굴린은 AChR 유전자 발현의 잠재적인 활성제이다. 근육에서 아세틸콜린 수용체의 mRNA 발현을 포함하는 것으로 알려진 신경 시그날은 뉴레굴린 (NRG)을 포함한다. 뉴레굴린은 SH2 도메인 단백질 SCH의 요구 및 후속적으로 Ras/Raf, MAPK 캐스케이드를 활성화하는 것을 포함하여, erbB 수용체 티로신 키나아제와 결합하여 활성화함에 의하여 AChR 발현을 증가시킨다 (참고 문헌: Lindstrom, J., Mol., Neurobiol. 15(2): 193-222, 1997). AChR의 병원체 역활은 돌연변이 내지 자가면역 반응에 이르는 기전 및 근육 약화 내지 간질, 정신 질환, 니코틴 중독에 이르는 징후 및 증상을 포함하는 많은 질병에서 발견되고 있다. 정신분열증의 도파민 가설은 이것이 과다 도파민에 의한 것임을 제시한다. 일부 유사한 증상은 글로타민 수용체 및 AChR에 대한 채널 차단 물질로서 기능하는 PCB와 같은 약물에 의해 유발된다. 정신분열증의 높은 비율은 과도한 담배 사용자이다. 이들은 자가 약물을 시도하고 있는 것이 제안되어 왔다. 뉴레굴린 유전자의 돌연변이는 AChR 유전자의 발현 및 질병을 유발하는 기전을 변경한다.

뉴레굴린의 하나의 중요한 기능은 세포 증식 및 분화를 조절하는 것을 돕는 수용체의 ErbB와의 상호작용이다. 예를 들어, 뉴레굴린은 상피 증식 인자 수용체 ErbB3 및 ErbB4를 활성화한다 (참고 문헌: Zhu, X. et al., EMBO J. 14(23): 5842-8, 1995; Kornblum, HI et al., Dev. Neurosci. 22(1-2): 15-24, 2000). 발달중인 신경계의 NRG1 및 ErbB의 발현은 신경 능성 연관의 세포 운명 결정, 증식 및 생존의 조절을 포함하는 신경계 발달중의 이의 역활을 의미한다. 최근 증거는 ErbB3 및 ErbB4가 CNS의 발달에 중요한 역활을 함을 제시한다. 정신분열증의 원인에 대한 일부 이론은 질병이 결손 뇌 발달에 의해 유발됨을 가정하고, 정신분열증의 신경 발달 이상의 존재를 지지하는 연구들이 있다 (참고 문헌: Kornblum, H. I. etal., Dev. Neurosci. 22(1-2): 16-24, 2000).

뉴레굴린은 GABA(A) 수용체 베타2 서브유닛의 발현을 유도한다. 서브유닛 발현의 상기 증가는 기능적 GABA(A) 수용체의 증가와 양립한다 (참고 문헌: Rieff, H.I. et al., J. Neurosci 19(24): 10757-66, 1999). 하나의 가설은 정신분열증의 병리생리가 사람 전전두엽 피질내의 GABA 전달의 기능장애와 관련된다는 것이다. 등외측 전전두엽 피질의 기능장애는 정신분열증의 병리생리의 중심적인 특징인 것으로 보이고, 상기 기능장애는 감마 아미노부틸산 (GABA) 신경전달물질의 변경과 관련된다.

NRG 시그날링 경로의 활성화는 G-단백질 시그날링 캐스캐이드의 발현을 유도한다 (참고 문헌: Fu, A.K. et al., Mol. Cell Neurosci. 14(3): 241-53, 2000). 대사향성 (metabotropic) 글루타메이트 수용체는 글루타메이트 전달의 다방면에서의 이의 친화성의 관점에서 지난 10년에 걸쳐 상당한 관심을 끌어왔다. 상기 G-단백질-결합된 수용체 군의 분자생물학, 약물학, 의약 화학의 진보는 국소 빈혈 및 정신분열증과 같은 뇌 질환 및 질병에서 서브타임-선택적인 조절제를 치료적으로 사용할 수 있는 기회를 가져왔다 (참고 문헌: Richardsons-Burns, S.M. et al., Biol. Psychiatry 47(1): 22-8, 2000).

유전자를 엑손이 위험 하프로이드에 의해 규정된 1.5 Mb 서열의 어느 위치에 위치하는지를 예상하여 동정하였다. 프러이머를 설계하고 cDNA 라이브러리 (뇌)를 스크리닝하였다.

돌연변이 분석

뉴레굴린 (8p12)

뉴레굴린 1 유전자의 모든 26 엑손 (180명의 환자 및 180명의 대조 개체)을 돌연변이에 대해 스크리닝하였다. 단백질의 아미노산을 변경하는 4개의 SNP 및 5' 및 3' 비번역 영역에서 검출되는 4개의 SNP를 포함하여 많은 SNP를 엑손에서 발견하였다 (도 4 및 부록 Ⅱ). 인트론 내의 SNP를 조사하였다. 수백개의 SNP가 후보 위험 하프로이드에 의해 동정된 1.5Mb 영역내에서 검출되었다. SNP, 결손 및 삽입을 부록 Ⅱ에 도시하였다.

박테리아 인공 클론 (BAC)

BAC 클론, R-217N4, R-29H12, R-450K14, R-478B14, R-420M9, R-22F19, R-72H22, R-244L21, R-225C17, R-317J8 및 R-541C15를 RCP111 사람 BAC 라이브러리 (Peter deJong, Roswell Park)로부터 얻었다. 상용된 벡터는 pBACe 3.6이다. 상기 클론을 LB/클로람페니콜 (25 ㎍/㎖)/글리세롤 (7.5%)를 함유하는 94 웰 미량역가 플레이트로 피킹 (picking)하고, 단일 콜로니를 시퀀싱을 통해 양성으로 동정한 후에 -80℃에 저장하였다. 다음에, 상기 클론을 적절한 항생제, 클로람페니콜 (25 ㎍/㎖)/ 슈크로오스 5%를 함유한 LB 한천 플레이트에 스트리킹 (streaking)하였다.

뉴레굴린 1에 대한 cDNA 클론-신규한 스플라이싱 변이체

PCR-RACE 생산물 (뉴레굴린 1)을 pCRⅡ-TOPO 벡터 (인트로젠)에 삽입하였다. cDNA 클론은 ACF-6_30_8848, OG-49-2, OG-AIR-75, ACF-68, ACF-69, ACF-6_29_8848, ACF-6_28_8847 및 ACF-2_11_8847이었다. 상기 클론을 LB/앰피실린 (100 ㎍/㎖)/글리세롤 (7.5%)를 함유하는 94 웰 미량역가 플레이트로 피킹(picking)하고, 단일 콜로니를 시퀀싱을 통해 양성으로 동정한 후에 -80℃에 저장하였다. 다음에, 상기 클론을 적절한 항생제, 앰피실린 (100 ㎍/㎖) 또는 가나마이신 (50 ㎍/㎖)을 함유한 LB 한천 플레이트에 스트리킹 (streaking)하였다.

본 발명을 이의 바람직한 구체예를 참조하여 상세하게 도시하고 기술하였으나, 하기 청구항에 의해 정의된 발명의 내용 및 범위를 벗어나지 않고 형태와 상세면에 있어 다양한 변화가 가능함을 당업자는 이해한다.

Claims (58)

1. 뉴레굴린 1 유전자를 포함하는 단리된 핵산 분자, 또는 이의 단편 또는 변이체.
2. 제 1항에 있어서, 뉴레굴린 1 유전자가 SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드 서열을 가짐을 특징으로 하는 단리된 핵산 분자.
3. SEQ ID NO: 2 내지 5 및 10 내지 38로 구성되는 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산.
4. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 1의 상보서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자.
5. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 1의 상보서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열과 매우 엄격한 조건하에서 혼성화하는 단리된 핵산 분자.
6. SEQ ID NO: 2 내지 5 및 10 내지 38로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열과 매우 엄격한 조건하에서 혼성화하는 단리된 핵산 분자.
7. 매우 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 1의 상보서열로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 2 핵산 분자와 시료를 접촉시키는 단계를 포함하는, 시료내 제 1 핵산 분자의 존재의 분석 방법.
8. 조절 서열에 작동가능하게 연결된 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 1의 상보서열 및 SEQ ID NO: 2 내지 5의 임의의 하나를 엔코딩하는 핵산으로부터 선택된 단리된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
9. 제 8항에 따른 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포.
10. 핵산 분자를 발현시키기에 적절한 조건하에서 제 9항에 따른 재조합 숙주 세포를 배양시키는 단계를 포함하여, 단리된 핵산 분자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드를 생성시키는 방법.
11. SEQ ID NO: 2 내지 5 및 10 내지 38로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지는, 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 단리된 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 변이체.
12. 제 11항에 있어서, 뉴레굴린 1 유전자가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 1의상보서열을 가짐을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
13. SEQ ID NO: 2 내지 5 및 10 내지 38로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 약 90% 초과의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 폴리펩티드.
14. 제 11항에 따른 단리된 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질.
15. SEQ ID NO: 2 내지 5 및 10 내지 38로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열과 선택적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
16. 시료를 엔코딩된 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 포함하여, 제 11항에 따른 단리된 핵산 분자에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 존재를 검정하는 방법.
17. 뉴레굴린 1 유전자내의 다형성을 검출하는 단계를 포함하는 개체의 정신분열증에 대한 감수성을 진단하는 방법으로서, 유전자내의 다형성의 존재가 정신분열증에 대한 감수성을 의미하는 방법.
18. 대조 시료내 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 발현 또는 조성물과 비교하여, 시험 시료내 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 발현 또는 조성물의 변경을 검출하는 단계를 포함하는 정신분열증에 대한 감수성을 진단하는 방법으로서, 시험 시료내 폴리펩티드의 발현 또는 조성물의 존재가 정신분열증에 대한 감수성을 의미하는 방법.
19. 제 18항에 있어서, 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 발현 또는 조성물의 변경이, 대조 시료에서 발현된 스플라이싱 변이체 폴리펩티드와 다른 시험 시료내 스플라이싱 변이체 폴리펩티드의 발현을 포함함을 특징으로 하는 방법.
20. a) 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 단편을 시험 대상인 제제와 접촉시키는 단계;

    b) 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 단편의 활성 수준을 분석하는 단계;

    c) 상기 활성 수준과 제제의 부재하의 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 단편의 활성 수준을 비교하는 단계를 포함하는 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 활성을 변경하는 제제를 동정하는 방법으로서,

    제제의 존재하의 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 단편의 활성 수준이 제제의 부재하의 수준과 통계학적으로 중요한 양만큼 다른 경우에, 제제가 폴리펩티드의 활성을 변경하는 제제인 방법.
21. 제 20항에 따른 방법에 따라 동정될 수 있는, 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 활성을 변경하는 제제.
22. 제제가 뉴레굴린 1 수용체; 뉴레굴린 1 결합 제제; 펩티도미메틱 (peptidomimetic); 융합 단백질; 전구 약물; 항체; 리보자임으로 구성된 군으로부터 선택된, 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 활성을 변경하는 제제.
23. 제 22항의 제제와 폴리펩티드를 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 활성을 변경하는 방법.
24. a) 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 단편 및 결합 제제를 시험 대상인 제제와 접촉시키는 단계;

    b) 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 단편과 결합 제제의 상호작용을 분석하는 단계;

    c) 제제의 부재하의 결합 제제와 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 단편의 상호작용의 수준을 비교하는 단계를 포함하는, 뉴레굴린 1 결합 제제와 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 상호작용을 변경하는 제제를 동정하는 방법으로서,

    제제의 존재하의 폴리펩티드 또는 이의 유도체 또는 단편의 상호작용의 수준이 제제의 부재하의 수준과 통계학적으로 중요한 양만큼 다른 경우에, 제제가 폴리펩티드와 결합제제의 상호작용을 변경하는 제제인 방법.
25. 제 24항에 따른 방법에 따라 동정될 수 있는 뉴레굴린 1 결합 제제와 뉴레굴린 1 폴리펩티드의 상호작용을 변경하는 제제.
26. 뉴레굴린 1 수용체; 제 2 뉴레굴린 1 결합 제제; 펩티도미메틱; 융합 단백질; 전구 약물; 항체; 및 리보자임으로 구성된 군으로부터 선택된, 제 1 뉴레굴린 1 결합 제제와 뉴레굴린 1 폴리펩티드의 상호작용을 변경하는 제제.
27. 제 26항에 따른 제제와 뉴레굴린 1 폴리펩티드 및/또는 뉴레굴린 1 결합 제제를 접촉시키는 단계를 포함하는, 뉴레굴린 1 폴리펩티드와 뉴레굴린 1 결합 제제의 상호작용을 변경하는 방법.
28. a) 제 1항에 따른 핵산 또는 이의 유도체 또는 단편을 함유하는 용액을 시험 대상인 제제와 접촉시키는 단계;

    b) 핵산 또는 이의 유도체 또는 단편의 발현 수준을 분석하는 단계; 및

    c) 상기 발현 수준을 제제의 부재하의 핵산 또는 이의 유도체 또는 단편의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하는 제제를 동정하는 방법으로서,

    제제의 존재시의 뉴클레오티드, 이의 유도체 또는 단편의 발현 수준이 제제의 부재시의 발현과 통계적학적으로 중요한 정도의 양만큼 다른 경우에, 제제가 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하는 제제인 방법.
29. 제 28항에 따른 방법에 따라 동정될 수 있는 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하는 제제.
30. a) 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 뉴레굴린 1 유전자의 포로모터 영역을 포함하는 핵산을 함유하는 용액과 시험 대상인 제제를 접촉시키는 단계;

    b) 리포터 유전자의 발현 수준을 분석하는 단계; 및

    c) 상기 발현 수준을 제제의 부재시의 리포터 유전자의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하는 제제를 동정하는 방법으로서,

    제제의 존재하의 리포터 유전자의 발현 수준이 제제의 부재하의 발현 수준과 통계학적으로 중요한 정도의 양만큼 다른 경우에, 제제가 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하는 제제인 방법.
31. 제 30항에 따른 방법에 따라 동정될 수 있는 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하는 제제.
32. a) 제 1항에 따른 핵산 또는 이의 유도체 또는 단편을 함유하는 용액을 시험 대상인 제제와 접촉시키는 단계;

    b) 핵산, 유도체 또는 단편의 발현을 분석하는 단계; 및

    c) 상기 발현을 제제의 부재하의 핵산, 유도체 또는 단편의 발현과 비교하는 단계를 포함하는, 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하는 제제를 동정하는 방법으로서,

    제제의 존재하의 뉴클레오티드, 유도체 또는 단편의 발현이 제제의 부재하의 발현과 통계학적으로 중요한 정도의 양만큼 다른 경우에, 제제가 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하는 제제인 방법.
33. 제 32항에 있어서, 제제의 존재하의 뉴클레오티드, 유도체 또는 단편의 발현이 제제의 부재하의 하나 이상의 스플라이싱 변이체의 발현과 종류 또는 양적으로 다른 하나 이상의 스플라이싱 변이체의 발현을 포함하는 방법.
34. 제 34항에 따른 방법에 따라 동정될 수 있는 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하는 제제.
35. 뉴레굴린 1 유전자에 대한 안티센스 핵산; 뉴레굴린 1 폴리펩티드; 뉴레굴린 1 수용체; 뉴레굴린 1 결합 제제, 펩티도미메틱; 융합 단백질; 이의 전구 약물; 항체 및 리보자임으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하는 제제.
36. 뉴레굴린 1 유전자를 함유하는 세포를 제 35항에 따른 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 뉴레굴린 1 유전자의 발현을 변경하는 방법.
37. DNA 결합 도메인 및 뉴레굴린 1 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산, 스플라이싱 변이체 또는 이의 유도체 또는 단편을 포함하는 제 1 벡터 및 전사 활성화 도메인을 엔코딩하는 핵산 및 시험 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산을 포함하는 제 2 벡터를 사용하여 2-효모 하이브리드 시스템을 적용하는 단계를 포함하는 뉴레굴린 1 폴리펩티드와 상호작용하는 폴리펩티드를 동정하는 방법으로서,

    전사 활성이 2-효모 하이브리드 시스템에서 일어나는 경우에, 시험 폴리펩티드가 뉴레굴린 1 폴리펩티드와 상호작용하는 폴리펩티드인 방법.
38. 뉴레굴린 1 유전자 또는 이의 단편 또는 유도체; 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드; 뉴레굴린 1 수용체; 뉴레굴린 1 결합 제제; 펩티도미메틱; 융합 단백질; 전구 약물; 항체; 뉴레굴린 1 유전자 발현을 변경하는 제제; 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 활성을 변경하는 제제; 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 번역후 프로세싱을 변경하는 제제; 뉴레굴린 1 폴리펩티드와 뉴레굴린 1 결합 제제의 상호작용을 변경하는 제제; 뉴레굴린 1 유전자에 의해 엔코딩된 스플라이싱 변이체의 전사를 변경하는 제제; 및 리보자임으로구성된 군으로부터 선택된 뉴레굴린 1 치료 제제.
39. 제 38항에 따른 뉴레굴린 1 치료 제제를 포함하는 약제학적 조성물.
40. 제 39항에 있어서, 뉴레굴린 1 치료 제제가 뉴레굴린 1 유전자 또는 이의 단편 또는 유도체를 포함하는 단리된 핵산 분자임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
41. 제 39항에 있어서, 뉴레굴린 1 치료 제제가 SEQ ID NO: 2 내지 5 및 10 내지 38로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
42. 제 39항에 있어서, 뉴레굴린 1 치료 제제가 ErbB2, ErbB3, ErbB4, ErbB2/ErbB4의 헤테로다이머, ErbB2/ErbB3의 헤테로다이머 및 ErbB3/ErbB4dml 헤테로다이머로 구성된 군으로부터 선택된 뉴레굴린 1 수용체임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
43. 뉴레굴린 1 치료 제제를 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 정신분열증을 치료하는 방법.
44. 제 43항에 있어서, 뉴레굴린 1 치료 제제가 뉴레굴린 1 작용물질임을 특징으로 하는 방법.
45. 제 43항에 있어서, 뉴레굴린 1 치료 제제가 뉴레굴린 1 길항물질임을 특징으로 하는 방법.
46. 외인성 뉴레굴린 1 유전자 및 뉴레굴린 1 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산으로 구성된 군으로부터 선택된 핵산을 포함하는 형질전환 동물.
47. a) 혼성화에 적절한 조건하에서, 뉴레굴린 1 핵산의 서열의 일부의 상보서열과 일 부분 이상으로 동일한 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산과 시료를 접촉시키는 단계; 및

    b) 뉴레굴린 1 핵산 및 뉴레굴린 1 핵산의 서열의 일부의 상보서열과 일 부분 이상으로 동일한 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산간에 혼성화가 일어나느지 여부를 분석하는 단계를 포함하는, 뉴레굴린 1 핵산의 존재에 대하여 시료를 검정하는 방법.
48. 제 47항에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 뉴레굴린 1 핵산의 서열의 일부의 상보서열과 완전히 동일함을 특징으로 하는 방법.
49. 제 47항에 있어서, 뉴레굴린 1 핵산의 일부분 이상의 증폭 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
50. 제 47항에 있어서, 연속적인 뉴클레오티드 서열이 100이하의 뉴클레오티드 길이이고, a) SEQ ID NO: 1의 뉴클레오티드의 연속적인 서열과 80% 이상 동일하거나; b) SEQ ID NO: 1의 연속적인 뉴클레오티드 서열의 상보서열과 80% 이상 동일하거나; 또는 c) 뉴레굴린 1 핵산에 선택적으로 혼성화할 수 있음을 특징으로 하는 방법.
51. 뉴레굴린 1 핵산의 뉴클레오티드 서열의 일부의 상보서열과 일 부분이상으로 동일한 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 포함하는, 뉴레굴린 1 뉴클레오티드의 존재에 대해서 시료를 검정하는 시약.
52. 제 51항에 있어서, 핵산이 뉴레굴린 1 핵산의 뉴클레오티드 서열의 일부의 상보서열에 완전히 동일한 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산임을 특징으로 하는 시약.
53. a) 뉴레굴린 1 핵산의 뉴클레오티드 서열의 일부의 상보서열과 일부분 이상으로 동일한 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 라벨링된 핵산; 및

    b) 라벨을 검출하는 시약을 별개의 용기에 포함하는 뉴레굴린 1 핵산의 존재에 대해서 시료를 검정하는 시약 키트.
54. 제 53항에 있어서, 라벨링된 핵산이 뉴레굴린 1 핵산의 뉴클레오티드 서열의 일부의 상보서열과 완전히 동일한 연속적인 뉴클레오티드 서열임을 특징으로 하는 시약 키트.
55. 뉴레굴린 1 핵산의 뉴클레오티드 서열 일부의 상보서열과 일부분 이상으로 동일하고 프라이머 신장을 위한 조건하에서 유지되는 경우에 뉴레굴린 1 핵산을 위한 프라이머로서 작용하는 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 핵산을 포함하는, 뉴레굴린 1 핵산의 존재에 대하여 시료를 검정하는 시약 키트.
56. 100 이하의 뉴클레오티드 길이를 가지고, a) SEQ ID NO: 1의 연속적인 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일하거나, b) SEQ ID NO: 1의 연속적인 뉴클레오티드 서열의 상보서열과 80% 이상 동일하거나, c) 뉴레굴린 1 핵산과 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산의, 뉴레굴린 1 핵산의 존재에 대한 시료 검정용 용도.
57. 100 이하의 뉴클레오티드 길이를 가지고, a) SEQ ID NO: 1의 연속적인 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일하거나, b) SEQ ID NO: 1의 연속적인 뉴클레오티드 서열의 상보서열과 80% 이상 동일하거나, c) 뉴레굴린 1 핵산과 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산의, SEQ ID NO: 1과 하나 이상의 뉴클레오티드 차이를 가지는 뉴레굴린 1 핵산의 존재에 대한 시료 검정용 용도.
58. 100 이하의 뉴클레오티드 길이를 가지고, a) SEQ ID NO: 1의 연속적인 뉴클레오티드 서열과 80% 이상 동일하거나, b) SEQ ID NO: 1의 연속적인 뉴클레오티드 서열의 상보서열과 80% 이상 동일하거나, c) 뉴레굴린 1 핵산과 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산의, 정신분열증에 대한 감수성 진단용 용도.