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KR20010031140A - 정밀 형광염료 입자 및 그의 제조방법 그리고 그의 사용 - Google Patents

정밀 형광염료 입자 및 그의 제조방법 그리고 그의 사용 Download PDF

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KR20010031140A
KR20010031140A KR1020007004042A KR20007004042A KR20010031140A KR 20010031140 A KR20010031140 A KR 20010031140A KR 1020007004042 A KR1020007004042 A KR 1020007004042A KR 20007004042 A KR20007004042 A KR 20007004042A KR 20010031140 A KR20010031140 A KR 20010031140A
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South Korea
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fluorescent
polymer
dye
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챈들러반
램버트베스
램버자넷
핍스스테이스
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루미넥스 코포레이션
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Publication date
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Abstract

본 발명은 비드 또는 마이크로스피어 등을 2종이상의 형광 염료로 각종 비로 염색하여 동시에 각종 개체군의 비드의 형광 시그널을 여기시키며, 이러한 비드의 표면에 분석시약을 결합하여 하나의 샘플중 복수의 검체를 동시에 분석할 수 있다.

Description

정밀 형광염료 입자 및 그의 제조방법 그리고 그의 사용{PRECISION FLUORESCENTLY DYED PARTICLES AND METHODS OF MAKING AND USING SAME}
현재, 형광 광방사 미립자, 구상 미립체, 마이크로비드, 비드 또는 입자는 아주 일반적이며, 특히 유동 사이토메트리 방법과 조합한 수많은 적용에 유용하다. 이하, 미립자, 구상 미립체, 마이크로비드, 비드 또는 입자는 서로 바꾸어 사용될 수 있으며, 동등 의미이다. 이들 입자는 종종 하나의 형광염료로 표지된다. 일반적으로 이와 같은 입자는 모노머, 즉, 불포화 알데히드 또는 아크릴레이트를 형광염료, 예를 들면 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC) 존재하에 반응 혼합물을 중합하는 공중합법에 의해 제조된다(참조. Rembaum의 미국특허 제 4,267,234호, Margel 등의 미국특허 제 4,552,812호 및 Margel의 미국특허 제 4,677,138호).
당분야에 통상의 지식을 가진 자는 2종이상의 염료의 비를 변화하면 단일 입자중 염료의 특정 조합의 변경수를 증가시키는 데 사용할 수 있음을 인식하고 있다. 이들 특성, 즉 방사 파장 및 형광강도는 동일 샘플중 복수의 검체의 복수의 변수분석에 극히 유용하다. (a) 입자표면에 염료의 공유 부착, (b) 입자 중합중 염료의 내부 결합 및 (c) 입자가 이미 중합된 후의 염색의 3가지 멀티컬러 형광 비드의 제조 수단을 보고되어 있다.
첫째 접근의 예는 1종 또는 복수의 형광염료를 공유 부착함으로서 코팅된 형광 구상 미립체가 Cheung의 미국특허 제 5,194,300호; Schwartz의 미국특허 제 4,774,189호에 개시되어 있다. 이들 방법은 염료를 입자 내부로 결합시키는 본 발명과는 관련이 없다.
2번째 접근은 중합반응중에 첨가되며 입자체내에 무질서하게 분산되는 2종이상의 형광염료를 개시한 Schwartz의 미국특허 제 5,073,498호에서 발견될 수 있다. 그러나 이러한 입자는 단일 여기(勵起) 파장에 노출될 때, 1종의 형광 시크널이 관찰되고, 이들 입자는 단일 여기 광원을 갖는 유동 사이토메트리 장치중 복수의 변수 분설에 유용하지 않다. 미국특허 제 4,715,655호는 5개의 상이한 비율로 혼합된며, 공중합되어 입자로 된 2종의 염료를 개시하였다. 5개 개체군의 비드가 얻어질 수 있는 것으로 청구되었지만, 이들 비드는 당업자에게 통상의 지식을 가진 자가 이러한 비드를 제조 및 허용하는 것을 효과적으로 방지하면서, 형광 특성은 제공되지 않았다. 그리하여, 상기 방법은 실현 불가능한 관념적 방법에 불과하다. 더욱이 이들 2 방법은 형광염료를 중합입자에 결합시키는 본 발명과는 관련이 없다.
일련의 예정된 비율로 미리 혼합한 2종이상의 염료로 정확하에 염색하는 수단을 갖고, 이와 같은 복수 변수 적용에 사용하기 위한 일군의 염색된 마이크로스피어를 갖는 것은 당업계에 중요한 진전이 될 것이다. 염료공정에서 이러한 정확성은 통상 변화 계수로 표시되며, 이것은 형광 입자 집함의 평균 강도에 애한 표준편차의 비이다. 이러한 값을 최소화함으로서 비중첩, 현저한 염색 입자의 집합이 얻어질 수 있다. 만일 이 방법이 최소 편차내, 바람직하기로는 20% 이하, 더욱 바람직하기로는 15%, 가장 바람직하기로는 8% 이하의 내부-샘플 변화에서, 반복될 수 있고, 재생산될 수 있다면 당분야에 한층 발전될 것이다.
본 발명은 직경 100 ㎛이하의 멀티컬러의 형광염색 소립자에 관한 것이다. 본 발명은 염료 농도의 내부 샘플 편차가 실질적으로 최소화되도록 하는 방법으로 최소 2종의 형광 염료로 입자 또는 구상 미립체를 염색하는 방법을 개시한다. 구체적으로, 본 발명은 최소 2종이상의 형광 염료로 염색된 구상 미립체 및 복수의 검체를 동시에 분석하기 위하여 상기 구상 미립체를 사용하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 종래 기술을 사용하여 중합체 입자를 염색하는 순차 공정의 계통도를 나타낸다.
도 2는 본 발명을 사용하여 중합체 입자를 염색하는 순차 공정의 계통도를 나타낸다.
도 3은 종래기술을 사용하여 2색 염색 마이크로스피어의 넓은 광학 분포을 예시하는 2차원 유동 사이토메트리 차트를 나타낸다.
도 4는 본 발명을 사용하여 2색 염색 마이크로스피어의 넓은 광학 분포을 예시하는 2차원 유동 사이토메트리 차트를 나타낸다.
도 5는 종래의 방법이 Fluorescence Bead Map상에 6개이상의 멀티컬러 비드 개체군을 허용하는 것을 나타낸다.
도 6는 각 영역에 의해 규정된 경계내에 각 비드 개체집합의 형광 특성의 밀접한 분포를 나타내는 64-영역 비드 세트용 Fluorescence Bead를 나타낸다.
2종이상의 형광염료를 미리 중합된 마이크로스피어에 결합시키는 발전된 진보된 방법이 기재되어 있다. 마이크로스피어에 의해 흡수된 각 염료의 양은 정확한 강도의 2이상의 재생산 형광 시그널과 주어진 입자 개체군내에서 방출 피크를 일으키도록 정확히 제어된다. 이러한 비드의 개체군은 2종이상의 형광염료의 에정된 비 또는 비례를 갖는 것등의 각각을 뱃치식으로 염색된다. 신규하고도 진보된 방법으로 인하여, 동일 뱃치중의 입자-입자 편차는 대폭 감소되어, 광학적으로 균일하고 한정된 덩어리 내에 존재하는 선례가 없는 멀티컬러 형광 마이크로스피어를 생산하게 된다.
따라서, 광학적으로 정확히 염색되는 마이크로스피어를 함유하는 개체는 동일 샘플중 복수의 검체를 동시에 분석하는데 유용한 것을 보증한다. 다시 말하면,전술한 비드는 단일 샘플을 사용하여 단일 튜브중 동시에 측정될 수 있는 수많은 검체가 급격히 증가하므로 종래 기술에서 발견되는 염색 비드의 용도보다 많은 것을 제공한다. 본 발명 염색법에 의해 얻어지는 형광 미립자는 입자체내에 혼합되는 적어도 2개의 형광염료를 가지며, 이들중 하나는 예정된 컬러 및 강도의 복수 형광 방출광을 동시에 방출할 수 있는 특징을 갖는다. 형광 채녈 유니트로 표시되는 형광 컬러의 주어진 컬러 및 강도에 상응하는 방출 피크에 관한 개념의 조합은 일반적으로 형광 시그널로 불린다. 이들이 이들 개체군내에서 혼합되는 염료의 특정비 또는 이율은 형광 컬러와 휘도에 따른 이들 비를 할당하는 형광 맵상에 전술한 개체군의 위치를 결정하게 된다. 2종 염료, 예를 들면, 오렌지와 적색과 같이 적게 사용하거나, 64 개체의 비드와 같이 많이 사용함으로서 유동 사이토메트리 장치에 의해 인식되는 특이한 형광 특성중 미묘한 편차에 의해 각각을 분명히 할 수 있다.
적어도 2종 형광 시그널에 의해 특징되는 전술한 개체군의 비드를 임상 또는 시험 샘플중 특정 검체를 결합할 수 있는 분석 반응물과 결합할 때, 강력할 분석 기구가 얻어지며, 이것은 정성 및 정량 분석 결과를 제공할 수 잇다. 또한, 분석법은 본 발명에 의해 얻어지는 멀티 컬러 형광비들을 사용하는 것에 기초한 것을 제공한다. 샘플중 복수의 검체의 복합 분석을 달성하기 위하여, 제 3형의 형광 시그널, 즉, 녹색 형광 시그널이 제공되며, 이는 검체를 결합할 수 있는 라벨 시약중 통상 발견된다. 그리하여 본 발명은 멀티컬러 비드의 제조방법, 비드 차체, 이와 같은 복수집합의 비드 및 단일 샘플중의 복수의 검체를 분석하는 복합법을 청구한다.
중합형 마이크로스피어를 2종이상의 형광염료로 염색하는 것은 (a) 적어도 2종의 염료를 요해하는 적어도 1종의 유기 용매와 적어도 2종의 염료를 용해하는 적어도 1종의 알코올로 이루어진 용매중 적어도 2종의 형광염료를 결합하여 용매와 접촉하여 적어도 부분적으로 팽윤하나 다수의 중합성 마이트로스피어를 용해하지 않는 특징을 갖는 혼합염료액을 제공하고; (b) 복수의 중합형 마이크로스피어를 용액으로 중분히 접촉하여 복수의 중합형 마이크로스피어의 각각을 2종이상의 형광 염료로 실질적으로 균일하게 염색하는 방법이며, 여기서, 2종이상의 형광염료는 염색된 복수의 중합형 마이크로스피어의 분리 및 여기에 의해 선명한 형광 시그널이 각 염료로부터 방출되도록 선정되고, 그의 방출강도는 염색된 복수의 중합형 마이크로스피어중 염료의 양에 비례한다.
본 발명의 구체예로서 복수의 중합형 마이크로스피어를 탈수하는 것을 포함한다. 이와 같은 탈수공정은 마이크로스피어를 혼합 염료액으로 접촉하기 전에 알코올 용매로 1회이상 세정하는 것을 동반한다. 더욱 바람직한 방법으로는, 탈수공정이 마이크로스피어를 혼합염료와 접촉하기 전에 세정 마이크로스피어를 건조하거나, 마이크로스피어로부터 알코올을 증발되도록 하는 것이다.
전형적으로 염색된 복수의 중합형 마이크로스피어는 여과 또는 원심분리와 같은 당 분야에 알려진 방법에 의해 분리된다. 적어도 1종의 형광염료를 염색된 복수의 중합형 마이크로스피어의 실질적으로 모든 개체의 내부를 통해 확산되거나, 적어도 2종의 형광염료를 염색된 복수의 중합형 마이크로스피어의 실질적으로 모든 개체의 내부를 통해 확산되는 염색된 복수의 중합형 마이크로스피어를 얻는 것이 바람직하다. 더욱이 바람직하기로는 적어도 1종의 형광염료를 염색된 복수의 중합형 마이크로스피어의 실질적으로 모든 개체의 내부를 통해 확산되는 염색된 복수의 중합형 마이크로스피어를 제공함으로서 얻어지는 것이다.
본 발명의 구체적인 방법에서, 염색방법은 2종이상의 형광염료의 상이한 비율의 일련의 용액을 제조함을 특징으로 하고, 또한 더욱이 복수의 중합형 마이크로스피어를 개체군을 일련의 용개으로 접촉하여 복수의 중합형 마이크로스피어의 복수의 선명한 개체군을 제공하고, 각 개체군은 2종이상의 형광염료의 상이한 비를 갖는 것을 특징으로 하는 것이다.
2종이상의 형광염료로부터 방출되는 선명한 형광시그널은 각각 적어도 10nm, 바람직하기로는 적어도 약 30 nm, 가장 바람직하기로는 적어도 약 50 nm에 의해 각각의 파장이 상이한 것이다.
그리하여, 본 발명은 중합형 마이크로스피어의 개체군을 2종이상의 형광염료로 실질적으로 균일하게 염색하여 개체군의 각각의 마이크로스피어가 여기에 의해 2종이상의 형광염료에 상응하는 선명한 형광 방출 시그널을 나타내고, 2이상의 방출 시그널의 각각이 (i)마이크로스피어중 상응하는 염료의 양에 비례하고, (ⅱ) 개체군의 모든 성분중 변화 계수가 20%이하인 것을 나타내는 중합형 마이크로스피어를 제공하는 것이다. 특히, 바람직한 개체군은 적어도 2종의 방출 시그널의 각각의 강도가 개체군 각 성분의 변화 계수가 약 15%이하, 바람직하기로는 10%이하, 더욱 바람직하기로는 8%이하를 나타내는 것이다. 더욱 바람직한 실시예로서는 적어도 2종의 발출 시그널의 각각의 강도가 개체군 각각의 성분의 변화 계수가 8%이하인 것이다.
본 발명은 각각의 개체군이 개체군에 대해 독특한 Bluorescence Bead Map에서 방출 스펙트럼을 나타내는, 전술한 바와 같이 본 발명의 명세서에 따른 선명한 중합형 마이크로스피어 개체군의 집함을 제공한다. 구체적인 실시예에서, 이 집합은 8개이상의 선명한 중합형 마이크로스피어, 바람직하기로는 16개이상의 선명한 중합형 마이크로스피어, 더욱 바람직하기로는 24개이상의 선명한 중합형 마이크로스피어, 가장 바람직하기로는 32개이상의 선명한 중합형 마이크로스피어, 최상의 바람직하기로는 64개이상의 선명한 중합형 마이크로스피어로 이루어진 것이다. 일반적으로 이 집합은 64개이상의 선명한 중합형 마이크로스피어와 관련된 64개이상의 방출 스펙트럼사이에 실질적으로 중첩이 없는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의해 고려되는 바와 같이, 각각의 검체가 상응하는 분석 반응물에 의해 인식되는, 샘플중의 복수의 검체를 유동 사이토메트리에 동시에 검출하는 방법은 (a) 샘플을 각 개체군의 각 마이크로스피어내에 특정비로 균일하게 혼합된 2종이상의 형광염료를 갖는 균일하게 염색된 마이크로스피어의 각 개체군(이 마이크로스피어 개체군은 그의 표면에 분석 반응물을 가지며, 마이크로스피어 개체군의 반응물은 샘플중의 검체의 하나와 상호작용을 한다)과 접촉하고; (b) 검체와 특이적으로 결합하는 라벨 시약을 제공하고, 마이크로스피어를 분석하여 분석 반응물에 검체의 결합을 지시하는 라벨를 검출하고; (c) 반응물이 결합된 각 개체군의 마이크로스피어내에 특정비로 혼합된 형광 염료를 갖는 마이크로스피어의 개체군을 측정하는 것으로 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적을 후술하는 바에 의해 명백해 질 것이다.
본 발명의 개요 및 그의 구체예
최근 기구의 발달은 복수 형광 시그널을 동시에 방출할 수 있는 복수의 정밀한 염색된 마이크로스피어의 발달을 필요로 하고 있다. 본 발명은 2종이상의 스콰릭산 기재의 형광 염료를 중합체, 예를 들명 폴리스티렌 입자에 흡수시키는 기술을 기재하고 있다.
본 발명은 약 10nm∼100㎛의 직경을 갖는 폴리스티렌 마이크로스피어를 정확하게 염색하는 기술을 기재하고 있다. 염색공정의 정확성이 악영향을 받지 않으므로 입자의 크기는 본 발명에 중요한 것은 아니다. 요구조건은 입자가 수불용성이나, 적당한 용매에는 용해성을 갖는 것이다. 채용되는 염료는 근 적외선 및/또는 적외선 영역, 즉 약 1,000nm까지 확장되는 형광을 나타내는 스콰릭 산 기재 분자가 바람직하다. 자외선에서 적외선까지 영역을 확장하기 위하여 다른 염료를 사용할 수 있다. 이 방법은 높은 재생공정을 부여하여 각각 농도의 2종이상의 염료를 각각의 마이크로스피어에 균일하게 흡수시켜 마이크로스피어중에 존재하는 수많은 염료의 각각의 복수의 형광 시그널을 형성한다.
이러한 기술은 통상의 지식을 가진 자에게 일련의 멀티컬러, 독특한 형광 특성을 갖는 형광입자를 제조할 수 있게 하며, 또한 복수의 검체의 동시에 목수변수 분석을 위한 상기 입자를 사용할 수 있게 한다.
구체적 실시예의 상세한 설명
본 발명은 적어도 2종이상의 형광염료를 함유하는 신규한 중합형 비드 또는 마이크로스피어를 제공한다. 더욱이 본 발명은 비드를 예정된 비로 결합된 2종이상의 형광염료로 혼합함으로서 광학적으로 선명하고 복수의 개체군을 형성하는 개량법을 제공하는 것이다. 이들 비드 개체군은 마이크로스코피 또는 유돛 사이토메트리와 같은 시각 검출에 의해 필수적으로 중첩되지 않으므로 용이하게 구분된다. 또한 복수의 검체의 동시, 복수 변수 분석방법이 제공하여 각각의 선명한 멀티컬러 비드 개체군을 부가 분석 반응물, 즉, 항체, 항원, 핵산 프로우브를 담지하며, 이것들은 복수의 검체를 함유하는 샘플중 관심사의 특정 검체와 반응시킨다.
본 발명에서 사용되는 중합체 마이크로스피어는 직경이 0.01∼100㎛의 것을 시중에서 구입할 수 있다. 마이크로스피어가 각종 사이즈의 것이 사용될 수 있다 할지라도, 바람직하기로는 0.1∼50㎛, 더욱 바람직하기로는 1∼20㎛, 가장 바람직하기로는 3∼9㎛의 것을 사용하는 것이 좋다. 한 집합중의 비드의 사이즈를 그들의 사이즈에 따라 다른 집합와 구분하기 위하여 또는 분류하기 위하여 균일하게 또는 상이하게 할 수 있다. 미립자의 사이즈는 소위 전진 또는 작은 각도 분산광에 의해 실질적으로 유동 사이토메트리 장치에서 측정될 수 있다. 또한, 이들 집합체는 상이한 형태의 미립자에 의해 더욱 구분될 수 있다. 이들 입자의 형태는 유동 사이토메트리, 즉 고성능 분해 슬릿 스캐닝법에 의해 구분될 수 있다.
마이크로스피어의 바람직한 제조는 폴리스티렌 또는 라텍스 물질이다. 그러나, 마이크로스피어의 중합체 제조의 헝태는 특히 한정되는 것은 아니나, 브롬화 폴리스티렌, 폴리아크릴산, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아크릴아미드, 폴리아크로레인, 폴리부타디엔, 폴리비닐피리딘, 폴리비닐벤질클로라이드, 폴리비닐톨루엔, 폴리비닐리덴클로라이드, 폴리디비닐벤젠, 폴리메틸메타크릴레이트 또는 이들의 조합을 들 수 있다.
또한, 마이크로스피어는 디비닐벤젠, 에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 트리메틸롤 프로판 트리메타크릴레이트 또는 N,N'-디메틸렌-비스-아크릴아미드와 같은 가교제 또는 당분야에 알려진 다른 관능 균등제를 1∼30%을 함유할 수 있다. 바람직하기로는 마이크로스피어가 폴리스티렌으로 되고, 1∼30%의 디비닐 벤젠을 함유하는 것이다.
이 비드는 카르복실레이트, 에스테르류, 알코올류, 카르바미드류, 알데히드류, 아민류, 황의 산화물, 질소 산화물, 할로겐화물과 같은 부가 표면관능기를 가져도 좋다. 마이크로스피어 표면의 관능성은 마이크로스피어에 커플링성을 부여하여 분석 반응물을 화학결합하도록 한다. 마이크로스피어에 관능기를 부가하여, 상기 기에 더하여 카르복실산, 카르복실산 숙신이미딜 에스테르, 카르복실산 무수물, 술포닐 클로라이드, 술포닐 플루오라이드, 하이드라진 유도체, 아실 아지드, 이소시아네이트, 할로아세트아미드, 페놀류, 티올류 및 케톤류와 같은 화학적 반응성 관능기를 염료 자체에 운반할 수 있다. 이들 관능기는 분석적 반응물, 즉, 항체, 항원(헵텐), 디곡시제닌 또는 핵산 프로우브오와 같은 통상 사용되는 반응물의 부착에 유용하다. 이들은 아비딘-비오틴, 수용체-리간드, 리간드-리게이트, 엔자임-시질, 렉틴-카르보하이드레이트, 프로테인 A-이뮤노글로블린, 등과 같은 특히하고, 높은 친화성 콘쥬게이트을 형성할 수 있는 반응물을 포함한다. 유동 사이토메트리 분석을 위하여 분석적 반응물은 플루어레신(FITC) 또는 로다민과 같은 형광 태그 또는 라벨로 표지할 수 있다.
분석적 반응물은 각종 검체, 즉, 미국특허 제 5,747,349호에 개시된 O2, CO2, pH, Ca++, Na+, K+, 또는 Cl-와 반응할 수 있는 형광 리포터 분자중에성 선택할 수 있다.
적당한 용매로는 소수성 염료의 특별 클래스를 용해할 수 있는 능력에 기초로 하여 선택할 수 있다. 그들의 용매특성은 실질적으로 유사한 것이 바람직하다. 용매로는 아실 탄화수소, 지방족 탄화수소, 지환족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 복소환 탄화수소를 들 수 있으며, 이들의 말단기 또는 환이나 사슬의 결합 부위에 할로겐, 산소, 황, 질소 및/또는 인을 함유하여도 좋다. 구체적으로는 톨루엔, 크실렌, 헥산, 펜탄, 아세톤, DMSO 또는 메틸렌클로라이드를 들 수 있다. 바람직하기로는 염소화 용매, 더욱 바람직하기로는 클로로포름이 본 발명의 바람직한 염료인 염료의 스콰릭산류를 용해하는 데 사용될 수 있다.
구체예의 하나로서, 2종의 형광 스콰렌인 염료는 1,3-비스[(1,3-디히드로-1,3,3-트리메틸-2H-인돌-2-일레덴)메틸]-2,4-디히드록시-시클로부텐디일이움인 적색염료와 2-(3,5-디메틸피롤-2-일)-4-(3,5-디메틸-2H-피롤-2-일리덴)-3-히드록시-2-시클로부텐-1-온인 오렌지색 염료를 사용할 수 있다. 비드중에 존재할 때, 제 1 및 제 2염료의 몰비는 0∼10,000, 바람직하기로는 0.00001∼2,000 사이이다. 이들 2종 염료 모두 동일 흡수파장, 즉 자외선 내지 약 800nm에서 바람직하게 여기하고, 서로 적어도 10 nm, 바람직하기로는 30nm, 더욱 바람직하기로는 50nm에서 2개의 분명하고, 중첩하지 않는 파장에서 형광을 방출한다. 예를 들면, 염료 #1의 방출피크는 35이며, 염료 #2의 방출 피크는 약 630 nm이다.
스콰릭산 기재 형광 염료는 문헌 기재의 방법, 예를 들면 Sprenger et al. Angew. Chem., 79, 581(1967); Angew. Chem. 80, 541 (1968); 및 Maak et al., Angew Chem. Intern. Edit., 5,888(1966)의 방법에 의해 합성할 수 있다. 요약하면, 1 당량의 스콰릭산(1,2-디히드록시시클로부텐디온)을 2당량의 활성 화합물, 예를 들면, 피롤, 인돌 또는 아닐린과 축합하고, 반응 혼합물로부터 물이 제거되는 조건하에서 알코올과 방향족 용매(예, 벤젠)의 혼합물중에서 환류한다. 생성 염료를 수집하고, 재결정, 증류, 크로마토그래피 등과 같은 정제법으로 정제하여 제조한다. 또한, 비대칭 치환 스콰릭산 화합물은 Law et al., J. Org. Chem. 57, 3278,(1992)에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 합성할 수 있다. 이와 같은 염료를 제조하는 구체적인 방법은 당분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들면 미국특허 제 5,795,981호, 동제 5,656,750호, 동제 4,677,045호, 동제 5,237,498호 및 5,354,873호에서 발견할 수 있다. 이와 같은 염료는 활성 에스테르류, 이소티오시아네이트류, 아민류, 하이드라진류, 할로겐화물, 산, 아지드류, 알코올류, 아크릴아미드류, 할로아세트아미드류, 페놀류, 티올류, 산류, 알데히드류 및 케톤류를 함유하는 생분자 또는 폴리머에서 전형적으로 발견되는 관능기로 안정한 형광 제품을 형성할 수 있는 관능기를 함유할 수 있다.
바람직한 실시예에서, 특정 스콰릭산 염료이외에 관련 염료는 사이클로부텐디온 유도체, 치환 세파로스포린 화합물류, 불소화 스콰렌이 조성물, 대칭 및 비대칭 스콰레인류, 알킬알콕시 스콰레인류 또는 스콰리움 화합물에서 선택될 수 있다. 이들 염료중 어떤 것은 약 1000nm 이하에서 방출 스펙트럼의 범위를 효과적으로 확장할 수 있는 근 적외선 및 적외선 파장에서 형광을 낼 수 있다.
스콰레인이외에 스콰릭산으로부터 유도된 소수성 염료, 예를 들면 프탈로시아닌류 및 나프랄로사아닌류가 더 긴 파장에서 작동할 수 있도록 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 염료로서 적당한 것으로는 다른 류의 형광 색소를 사용할 수 있다. 이러한 염료로서는 3-히드록시피렌 5,8,10-트리 술폰산, 5-히드록시 트립타민, 5-히드록시 트립타민(5-HT), 액시드 푸신, 아크리딘 오렌지, 아크리딘 레드, 아크리딘 엘로우, 아크리플라빈, AFA(아크리풀라민 포일겐 SITSA), 알리자린 컴플렉손, 알리자린 레드, 알로피코시아닌, ACMA, 아미노악티노마이신 D, 아미노쿠마린, 안쓰로일스테아레이트, 아릴 또는 헤테로아릴 치환 폴리올레핀, 아스트라존 브릴리안트 레드 4G, 아스트라존 오렌지 R, 아스트라존 레드 6B, 아스트라존 엘로우 7 GLL, 아타브라인, 오로포스핀, 오로포스핀 G, BAO 9(비스아미노페닐옥사디아졸), BCECF, 베르베린 술페이트, 비스벤자미드, BOBO 1, 블란코포르 FFG 용액, 블란코포르 SW, 보디피 FQ, BOPRO 1, 블릴리안트 술포플라빈 FF, 칼시엔 블루, 칼슘 그린, 칼코플루오르 RW 용액, 칼코플루오르 화이트, 칼코플루오르 화이트 ABT 용액, 칼코플루오르 화이트 스탠다드 용액, 카르보시아닌, 카르보스티릴, 카스카드 블루, 카스카드 엘로우, 카테콜아민, 치나크린, 코리포스핀 O, 쿠마린, 쿠마린-팔로이딘, CY3.18, CY5.18, CY7, Dans(1-디메틸아미노 나팔린 5 술폰산), Dansa(디아미노 나프틸 술폰산), Dansyl NH-CH3, DAPl, 디아미노 페닐 옥시디아졸(DAO), 디메틸아미노-5-술폰산, 디피로메텐보론 디플루오라이드, 디페닐 블릴리안트 플라빈 7GFF, 도파닌, 에오신, 에리쓰로신 ITC, 에티이움 브로마이드, 유크리신, F1F(포름알데히드 인듀스트 플루오레센스), 플라조 오렌지, 플루오 3, 플루오레카민, 푸라-2. 제나크릴 블릴리안트 레드 B, 제나크릴 브릴리안트 엘로우 10GF, 제나크릴 핑크 3G, 제나크릴 엘로우 5GF, 글록살산, 글래뉼러 블루, 헤마토포로피린, 획스트 33258(DAN 결합), Indo-1, 인트라화이트 Cf 리퀴트, 로이코포르 PAF, 로이코포르 SF, 로이코포르 WS, 리사민 로다민 B200(RD200), 루시퍼 엘로우 초, 루시퍼 엘로우 VS, 마그달라 레드, 마리나 블루, 맥시론 블릴리안트 플라빈 10GFF, 맥시론 블릴리안트 플라빈 8GFF, MPS(메틸 그린 피로닌 스틸벤), 미쓰라마이신, NBD 아민, 나일 레드, 니트로벤족사이돌, 노라드레날린, 뉴클리어 패스트 레드, 뉴클리어 엘로우, 니로산 블릴리안트 플라빈 E8G, 오레곤 그린, 옥사진, 옥사졸, 옥사디아졸, 퍼시픽 블루, 파라로사닐린(Feulgen), 포르위트 AR 용액, 포르위트 BKL, 포르위트 Rev, 포르위트 겜, 포스핀 3R, 프탈로시아닌, 피코에리쓰린 R, 폴리아자인다센 폰토크롬 블루 블랙, 포르피긴, 프리뮤린, 프로시온 엘로우, 프로피이움 아이오다이드, 피로닌, 피로닌 B, 피로잘 블릴리안트 플라빈 7GF, 퀴날크린 무스타드, 로다민 B 엑스트라, 로다민 BB, 로다민 BG, 로다민 WT, 로오즈 벤갈, 세로토닌, 세브론 블릴리안트 레드 2B, 세브론 블릴리안트 레드 4G, 세브론 블릴리안트 레드 B, 세브론 오렌지, 세브론 엘로우 L, SITS(프리뮤린), SITS(스틸벤 이소티아술포닌산), 스틸벤, 스나프 1, sulphO 로다민 B Can C, 술포로다민 G Extra, 테트라사이클린, 텍사스 레드, 타아진 레드 R, 티오플라빈 S, 티오플라빈 TCN, 티오플라빈 5, 티오라이스, 티오졸 오렌지, Tonopol CBS, 새새 1, 새새 3, 트루 블루, 울트라라이트, 우라닌 B, Uvitex SFC, 크실렌 오렌지, XRITC, YO PRO 1 또는 이들의 조합을 들 수 있다. 당분야에 통상의 지식을 가진 자는 소요 방출 및 흡수 성질 그리고 그들의 소수성이 적당한 한, 이와 같은 염료를 선정하는 것은 확실히 할 수 있다. 형광 염료의 분광학적 특성은 여기 파장 및 강도가 충분히 유사하게 하여 플루오레세인 또는 로다민 유도체가 유동 사이토메트리 장치의 사용할 수 있다. 그러나, 염료는 유기 용매중에서 더 높은 용해도를 학조, 광안정성이 향상되고, 양론적 수율을 갖는 것이 바람직하다. 이들 염료를 예정된 비율로 배합하고, 마이크로스피어 비히클에 삽입하여 전체 염료의 양이 입자에 대해 0.00001∼15중량%로 된다. 그러나, 이러한 값은 상기 염료에 침착된 입자가 안정하고, 목적에 사용할 수 있는 한, 그다지 중요하지 않다.
종래 방법
종래의 방법은 단일 염료만으로 담체를 염색하는 것을 나타낸다(도 1). 그러나, 의미있는 비교의 목적과 본 발명의 요점을 일치시키기 위하여, 상기 방법은 2종의 염료를 동시에 염색하는 것이 채택되었다. Leigh B. Bangs에 의해 "Uniform Latex Particles"에 기술된 큰 폴리머 입자를 염색하는 선핵 기술을 수행하고, 이 공정의 일반적 개요가 도 1에 나타내고, 얻어진 결과가 도 3에 나타냈다. 요약하면, 프릿트 펀넬로 도포된 맴브레인상에 염색되지 않은 스톡 마이크로스피어 5㎖를 수성매질에 직접 넣음으로서 시작된다. 진공 펌프로 여지상에 놓여진 마이크로스피어를 통해 1시간 동안 공기를 공기를 빨아낸다. 그런 다음, 건조 마이크로스피어를 50㎖의 염료액에 옮기고, 도포하고, 실온에서 하룻밤 교반한다. 다음 날, 마이크로스피어를 여과하여 염료액으로부터 분리하고 염색된 입자를 진공 데시케이터에 약 4시간 농하 잔류 용매를 제거한다. 다음에 250㎖ 플라스크에 건조 염료 마이크로스피어에 트리톤 X-100과 수용액 200㎖를 가한다. 이 용액을 3시간 교반한다. 이 용액을 여과하고, 여액에서 더이상의 염료가 검출되지 않을 때까지 반복하여 세정했다. 이러한 방법으로 염색된 비드를 유동 사이토메트리로 염료 균일성을 시험했다(도 3). 3개의 각각의 기본 실험(시험 A, B 및 C), 리2 및 리3 변수(CV 또는 편지 계수)에서 비드-대-비드 편차는 정밀하게 염색된 멀티컬러 마이크로스피어에 대한 요구를 만족시키는 데 더 높고 부적합(표 1)을 용이하게 알 수 있다.
본 발명의 일반적 개요
정밀하게 염색된 멀티컬러 마이크로스피어의 적용 및 요구가 증가되므로, 전술한 방법에 대한 별법의 개발이 보장된다. 그 결과, 종래 기술의 변형이 마이크로스피어를 정밀하게 염색하는 가장 효과적인 방법으로 증명되었다. 이 방법은 종래의 기술에 비해 1/10 이하의 시간이 걸리며, 그의 정밀성을 의미있게 향상시킨다. 전술한 바와 같이, 마이크로스피어로부터 미량의 물을 모두 제거하는 것이 중요하다. 이를 달성하기 위하여 수성 매질중 보관 마이크로스피어를 진공 여과 맴브레인에 피페트로 가하고, 액체를 제거하여 버린다. 다음에, 100㎖의 린스 용매(프로판올, 메탄올, 에탄올 등의 지방족 알코올)을 마이크로스피어에 가하고, 마이크로스피어를 용액에 초음파 프로우브를 넣고, 수초동안 파워를 가하여 재현탁시킨다. 현탁액을 여과하고, 전술한 공정을 다시 반복한다. 마이크로스피어를 염색하는 것은 50 ㎖의 염료용액(후수하는 바와 같이 유기 용매중의 1종이상의 염료로 조성)을 여과 컵에 가하고 전술한 바와 같이 재현탁시킴으로서 달성된다. 현탁액을 여과 컵에 5분간 정치한 후, 50㎖의 린스 용매를 염료 현탁액에 가하고, 초음파처리한 후, 여과한다. 다시 100㎖의 린스 용매를 가하고, 재현탁한 후, 여과한다. 마지막 공정을 다시 한번 반복한다. 저장용 마이크로스피어를 제조하기 위하여, 마이크로스피어에 100㎖의 수성 매질을 첨가한 후, 초음파처리하고, 여과한다. 마지막으로 50㎖의 수성매질을 마이크로스피어에 첨가하고 초음파 처리한 후, 저장 탱크에 옮긴다.
본 발명의 특별한 실시에로서 2종의 스콰릭산 기재의 염료를 2종 염료을 클로로포름과 같이 완전히 용해시키는 적당한 염료에서 혼합한다. 이 용액에 에탄올을을 첨가하여 마이크로스피어의 습윤성을 증가시키고, 공정 의존성 및 마이크로스피어보다 낮은 최종 용매농도를 생성한다. 각 염료의 농도는 2개의 중심 파장의 가각에 목적 형과 강도의 기능으로 각 염료의 농도를 실험적으로 결정한다.
본 발명의 중요한 태양은 염색 조작전에 마이크로스피어를 조제하는 것이다. 제조업자는 종종 수성 매질중의 마이크로스피어를 공급한다. 수성 매질중에 저장되는 마이크로스피어의 표면에 유기 화합물이 침투하도록 철리하는 것을 발견하였다. 바람직하기로는 알코올과 같은 극성 용매중의 양을 마이크로스피어에 첨가하여 수성 매질과 극성 유기 용매의 약 50% 혼합물을 달성한다. 그러나, 이 비는 매질 및 용매의 화학적 및 물리적 특성에 결정되는 특별한 필요에 따라 변화시키거나 조정될 수 있다.
효율적이고 정밀한 기술은 메탄올, 에탄올, 2-프로판올, 린스와 같은 알코올을 통해 마이크로스피어를 "건조"를 포함한다. 이 공정은 마이크로스피어의 수성현탁액, 전형적으로 10% 고형분 현탁액을 원심분리하는 것에 의해 시작된다. 약 5% 고체의 알코올 용액을 진탕시키고, 초음파처리하고, 원심분리한다. 이 공정을 1회 또는 2회 더 수행한다. 과량의 알코올 펠레트로부터 경사시키고, 잔류 용매를 진공 증류한다.
0.05 g의 건조 마이크로스피어로 이루어진 시험 샘플을 염료 용액을 소망의 비율로 조정하는 것을 돕는데 사용된다. 0.05g의 건조 마이크로스피어를 2종 이1상의 염료를 함유하는 염료 혼합물 0.5㎖에 현탁한다. 10% 고체에서 마이크로스피어의 현탁액을 진탕하고, 초음파 처리하여 현탁액으로 한다. 현탁액중에서 마이크로스피어와 염료의 혼합물을 1시간 혼합한다. 1 시간후, 마이크로스피어를 원심분리기를 사용하여 1분 동안 원심분리한다. 염료 용액을 플라스크에 경사시키고, 0.05g의 마이크로스피어를 90%의 알코올, 즉 메탄올 1㎖에 재현탁시킨다. 샘플을 진창하고, 초음파처리하고, 원심분리한다. 메탄올 상층액을 경사시킨다. 90% 메탄올 린스 공정을 1회 반복한다. 마지막으로 과량의 메탄을 펠렛으로부터 경사하고, 마이크로스피어를 수성 매질중에 다시 현탁시킨다. 생성 시험 샘플을 다시 시험하여 표지된 비드의 형광활성/강도를 측정할 수 있다.
시험 샘플이 소망의 염료의 정확한 비를 갖는 염료용액을 나타낼 때, 마크로 스케일 뱃치를 수행한다. 마크로 스케일 작업의 원칙은 전술한 바와 같다. 요약하면, 25㎖의 소망의 염료 용액을 건조 마이크로스피어 25g을 함유하는 50㎖ 바이알로 옮긴다. 20% 고체에서 마이크로스피어를 진탕하고, 초음파 처리한다. 마이크로스피어가 완전히 현탁되면, 1시간 동안 혼합한다. 그런 다음, 마이크로스피어를 원심분리하여 염료용액으로부터 꺼낸다. 염료용액을 플라스크에 경사하고, 2.5g의 마이크로스피어를 90% 메탄올 50㎖에 다시 현탁한다. 린스 공정을 염료 용액의 2배량으로 하여 5% 고형분의 혼합물을 유지한다. 이 샘플을 진탕하고, 초음파처리하고 원심분리한다. 메탄올 상층액을 경사시킨다. 이 공정을 다시 한번 반복한다. 최종 메탄올 린스을 경사시킨 후, 마이크로스피어를 수성 린스로 세정한다. 수성 상층액을 경사한 후, 비드를 재현탁하고, 신선한 수성 매질중에 보관한다.
이하, 실시예로서 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
2종의 상이한 스콰릭산을 함유하는 단일 용액을 조제하였다. 하나의 염료는 적색 안료인 1,3-비스[(1,3-디히드로-1,3,3-트리메틸-2H-인돌-2-일리덴)메틸]-2,4-디히드록시-시클로부텐디일리움, 비스(내부 염)이고, 다른 염료는 오렌지 형광 염료인 2-(2,5-디메틸피롤-2-일)-4-(3,5-디메틸-2H-피롤-2-일리덴)-3-히드록시-2-시클로부텐-1-온일 수 있다. 염료 #1의 방출피크는 585nm이고, 염교 #2의 방출피크는 630nm이다. 이들 염료는 이 혁신적인 신기술에 비교되는 종래기술의 염색법을 축정하는 사용되는 측정기인 Becton Dickinson FACScan 유동 사이토메터의 2개의 형광 채널의 중앙에 해당하므로 상기의 염료를 선택했다. 그러나, 형광 채널의 선택은 상대적이고 중요하지 않다. 왜냐하면, 다른 유동 사이토메트리 장치가 다른 셋팅을 가질 수 있기 때문이다.
2종의 염색되지 않은 마이크로스피어를 조제하였다, 하나는 이 혁신적인 기술(도 2 및 도 4)를 사용하여 오렌지 및 적색 염료의 혼합물로 염색하고, 다른 하나는 종래의 기술(도 1 및 3)을 사용하여 염색했다. 샘플을 FACScan으로 측정하고, X-Y 플롯하여 각 샘플의 상대적 동질성을 나타냈다. X-축은 오렌지색 염료의 형광강도 또는 휘도를 나타내고, Y-축은 적색염료의 동일한 변수를 나타낸다. 편차의 평균 강도 및 계수가 측정된다. 종래의 방법에 의해 염색된 비드는 X-Y 면적에 널리 퍼져 있으며, 이는 오렌지와 적색 염료는 입자-대-입자로 변화하는 것을 나타낸다. 대조적으로, 본 발명 방법에 의해 염색된 비드 개체중의 편차 계수는 훨씬 적다. 각 시험, A, B 및 C중 약 10,000 비드를 Bangs 법에 의해 염색된 비드와 평행이었다(표 1).
실시예 2
상이한 형광특성을 갖는 비드의 다른 개체군을 만들기 위하여 적색/오렌지색 염료의 비를 염료의 비를 적당히 증가시켜 얻어지는 개체군을 전자의 개체군과 중첩하지 않았다. 종래의 기술은 피할 수 없는 내부-샘플 비동질성으로 인해 부적당한 염색공정이 발생하여 주어진 염색 뱃치내에서 입자-대-입자로터 불량한 분포를 형성하기 때문에 멀티컬러 비드의 복수 개체군을 제공하는 데 실패했다. 그리하여 광원으로 여기함으로서, 1종이상의 염료를 함유하는 염색 비드는 소방의 강도의 균일한 형광 시그널을 방출하는데 실패했다. 본 발명에서는 이러한 분제를 극복하고, 단지 2종의 염료의 비를 변화시킴으로서 광학적으로 선명한 비들의 64 집합군과 같이 많은 집합군으로 구축하는 것을 달성하였다. 이 실시예는 하나를 한정하는 것은 아니다. 왜냐하면 통상의 지식을 가진 자가 본 발명의 교시에 의하여 더 많거나 적은 비드 집합체를 용이하게 만들 수 있기 때문이다. 당 분야에 통상의 지식을 가진 자가 이러한 성취에 밀접한 어떠한 것도 실제 실시할 수 없음을 고려할 수 있다. 비록 이러한 결말이 가능한 것으로 이론적으로 생각될 수 있을지라도, 종래의 기술은 통상의 지식을 가진 자가 달성하는 방법을 교시하는 데 실패했다.
본 발명자는 최초로 본 발명의 실시를 저감시킬 수 있었고, 64-비드 개체군을 얻는 대표적인 실험적 결과를 도 6 및 표 2에 나타냈다. 도 5에 나타난 결과는 종래의 방법의 염색공정을 사용함으로서 멀티컬러 비드를 나타낸다. 비드-대-비드로부터 염료비의 넓은 분산을 일으키는 염색기술의 부정확성으로 인해, 플루오레센스 비드 맵상에 6개 이하의 멀티컬러 비드 개체군을 삽입할 수 있다. 대조적으로 도 6은 비드의 64 개체군을 함유하는 플루오레센스 비드 맥을 나타내며, 이는 각 영역에 의해 규정되는 경계내에서 각 비드 집합 플루오레센스 특성의 밀접한 분포를 지시한다. 각종 덩어리 사이의 엉김은 최소화된다. 대부분의 중첩은 밝은 시그널을 방출하는 비드의 응집으로 인한 것이나, 이들은 광산란에 의한 사이즈 분별에 의해 제거된다.
일반적으로 표 2로부터 일견할 수 있는 같이, 주어진 비드 개체군중의 2종 염료와 X-Y 맵상의 개체군의 위치사이의 명백한 관계이다. 각 위치는 약 470, 580, 690, 750, 800, 900 및 990 시리즈에 해당하는 선형 플루오레센스 채녈 단위로 표시되는 레드(FL3) 또는 오렌지(FL2) 염료 강도의 단위로 할당된다. 실질적 이유, 즉 비드 덩어리중 공간 한계 때문에 마지막 자리 "0"를 생략했다. 각 비드 개체군중 처음 2 자리는 오렌지색 염료(FL2)의 플루오레센스 강도를 나타내고, 마지막 2자리는 적색 염료(FL2)의 강도를 나타낸다. 형광강도는 숫자를 높을수록 증가한다. 최저 강도(4725)의 비드는 좌하 코너에 존재하고, 가장 밝은 것(9998)은 우상 코너에 존재한다. 이들이 수직으로 이동함에 따라, 비드중의 적색 및 오렌지색 염료의 양 모두가 증가한다. 이는 에너지 실질적인 양이 오렌지색 염료에서 적색염료로 이동하기 때문이다. 왼쪽에서 오른쪽으로 수평이동할 때, 적색 염료는 FL3을 꾸준히 유지하기 위하여 적색 염료는 감소되어야 한다. 이것은 오렌지색 염료 스펙트럼이 적색 영역으로 중첩되기 때문이며, 이는 FL3시그널을 증가시킴이 필요하다. 비드의 복수, 비 중첩 개체군이 이러한 방법으로 구축된다. 2개의 변수, 즉 형광색(적색 또는 오렌지색)과 색의 강도 또는 휘도(형광채녈 단위로 표시)는 얻어진 비드를 분류하여 형광시그널로 표시하는 것이 필수이다.
그리하여, 비드의 특별한 개체군은 그의 형광 특성 또는 시그널이 형광 비드맵으로 표시되는 규정된 영역내에 해당하도록 제공된다. 전형적으로, 비드의 특별 개체군내 각각의 비드의 약 80%이상은 소망의 영역에서, 바람직하로는 90%이상, 더욱 바람직하기로는 97%이상, 가장 바람직하기로는 약 99%이상내에서 형광특성을 나타내는 것이다. 각 집합의 비드를 위하여 전형적으로 특별 집합 비드내의 약 1%이하의 개체 비드는 다른, 소망하지 않는 역역, 바람직하기로는 약 05%이하, 더 바람직하기로는 0.3%이하, 가장 바람직하기로는 0.2%이하로 해당하는 형광특성을 나타낸다.
종래기술중 제한으로 인해, 각 비드 맵중에 이론적으로 어떤 수의 개체군 또는 집합이 존재하는 반면, 동시에 공존하는 6개이상의 집합체를 얻는 것은 불가능하였다. 당 분야에 명확한 멀티컬러 비드의 실시을 감소시키는 예가 존재하지 않는한, 이론적으로 이와 같은 집합군은 복수 분석(참고, Mchugh, "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes," in Methods in Cell Biology, 42, Part B, (Academic Press, 1994)에 극히 가치있는 것으로 생각될 수 있다. 각종 비율의 2종 염료를 함유하는 단지 1개 및 최대 5개의 비드 개체군이 가능하다. 그러나, 예를 들면, 미국특허 제 4,717,655호에는 상기와 같은 비드는 불가능하며, 이들 비드중 염료를 배합하는 방법은 공중합법에 의한 것이며, 이와 같은 것은 본 발명과는 관련이 없다. 대조적으로, 존재하는 방법론상의 유의한 진전으로 인하여, 본 방법론을 사용하여 16 집합체, 32 집합체, 64 집합체 또는 그이상의 비드 군을 얻을 수 있다.
예로서, 64-집합체 비드 또는 64 개체군 비드는 X-Y 플롯상 현저한 취치에 의해 서로 상이한 각 개체군이 구축되었다, 이들 위치는 필수적으로 중첩되지 않는다. 10∼20%이하 또는 그이상 비율로 분산시키는 종래의 방법과는 반대로, 본 발명 방법은 단지 0.2∼0.3% 분산을 갖는 균일한 개체군을 얻을 수 있도록 한다. 후술하는 바와 같이, 필수적으로 중첩하지 않는 개체군이란 용어는 각 개체군의 약 0.2∼0.3%만 동일한 집합의 형광 염료를 갖는 비드의 인접 덩어리에 기인하나, 상이한 비율로 혼합된 광학 패턴 또는 형광시그널을 나타내는 것을 의미한다. 이것은 종래 기술에 비해 유의한 진보이다.
실시예 3
비록 이론적으로는 유동 사이토메트리 분야에서 복합 분석능이 수많은 잇점을 제공한다 할지라도, 형광 비드의 멀티컬러, 비중첩 집합체의 충분한 변종을 얻는 것은 기술적 한계로 인해 거의 진전이 없었다. 이러한 종래 기술이 McHugh에 의해 검토되었다. 이들 방법은 수종이상의 상이한 검체를 복합 분석하는 데 만족스럽지 못하였다. 종래의 기술에서, 비드를 2종 염료로 배합하였을 때, 5개의 집합군의 비드를 얻어진다고 주장되었다(미국특허 제 4,717,655호). Bangs 법(실시예 1)을 사용하여 최대 6개의 집합체가 얻어졌으며, 이들은 여전히 복합 분석 목적에 충분하지 못하였다.
일련의 항체, 항원 또는 핵산 프로우브(이하, 이들을 총괄하여 "분석적 반응물"이라 한다)을 콜빈 등에 의해 기술된 화학 또는 물리적 흡수와 같은 종래의 방법(Colvin et al., "The Covalent Binding of Enzymes and Immunoglovulins to Hydrophilic Microspheres" in Microspheres: Medical and Biological Applications, 1-13, CRC, Boca Raton, FL, 1988; Cantarero et al., "The Adsorptive Characteristics of Proteins for Polystyrene and Their Significance in Solid-Phase Immunoassays, "Anal Biochem, 105, 375-382(1980); 및 Illum et al., "Attachment of Monoclonal Antibodies to Microspheres," Methods in Enzymol, 112, 67-84(1985) 112, 67-84(1985))의 하나에 의해 비드에 부착한다.
비드의 표면에 반응물을 결합한 후, 각 집합체를 혼합하여 각 집합체내의 비드의 알려진 양을 함유하는 푸울을 만든다. 바람직하기로는 푸울 세트를 각 집합체의 비드의 양과 동일한 양으로 제조하여 세트가 각 집합체 또는 개체군과 거의 같은 수의 비드를 함유하도록 한다. 그런 다음, 혈장 또는 플라스마와 같은 유체 샘플로 푸울을 인큐베이트하여 비드상의 항원과 반응하는 유체중의 항원의 존재를 시험한다. 이와 같은 인큐베이션은 일반적으로 비드 표면상의 항원과 유체 샘플중의 항원의 특이 반응을 촉진하는 온, pH, 이온 농도 등의 조건하에서 수행한다. 충분한 시간후, 혼합물중의 비드를 원심분리, 세정하고, 2차 항체, 예를 들면 플루오레세인 표지된 양 항사람 이뮤노글로블린과 인큐베이트한다. 2차 항체 또는 표지 시약을 결합하여 비드상의 항원에 결합한 형광 표지 항체로 한다. 세정후, 비드를 유도 사이토메터로 가공하고, 4개의 분류 변수 진행 광산란, 측면 광산란, 적색 형광 및 오렌지 형광을 측정하고, 각 비드가 속하는 집합체 또는 개체군을 동정한다. 각 비드용 녹색 형광(측정 변수)의 동시 특정은 비드가 항체에 결합되어 있는지를 결정하게 한다. 비드가 속하는 집합체가 특정 항원, 즉, 그래스 알러겐, 각종 의약 남용 물질과의 관련되기 때문에, 이들이 속하는 집합체의 기능으르 항체의 특이성이 비드에 결합되어 있는지를 용이하게 결정할 수 있다.
대체 또는 경쟁 분석
임상 실험실에서 각종 물질의 분석은 특정 리간드-라이게이트 또는 항원-항체 상호작용의 간섭에 기초로 하고 있다. 이들 분석에서는 리간드-라이게이트쌍 성분을 플루오로포르 또는 플루오로크롬으로 표지하고, 비드상에 고정시킨다. 리간드나 라이게이트인 용해성 미표지 검체를 반응 혼합물에 첨가하여 표지 성분과 고정성분의 상호작용을 경쟁적으로 저해시킨다. 어떤 성분의 쌍이 표지되고, 어떤 성분이 고정되어 있는 지는 중요하지 않다. 그러나, 어떤 분석에서는 분석 방향을 정하는 것이 기능적으로 유리하다. 이러한 타입의 분석예에서는 각 비드 집합체가 항원으로 제공하는 것이다. 그런 다음, 항원-코팅 비드를 비드 표면에 항원에 특이적인 표지 항원을 반응시킨다. 용해 검체(저해제)를 함유하는 시험 유체를 추가하는 것은 표지 항원을 용해 검체의 농도에 비례하는 비드로 대체하게 된다. 공지 검체농도의 표준곡선은 시험 샘플중 검체의 정밀한 정량을 제공한다.
핵산분석
PCR의 파워 및 감도는 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오타이드 시퀀스의 검출이 요구되는 광범위한 분석적 문제의 적용한다. PCR 기술로 주된 난점은 최종 제품, 증폭 DNA를 측정하는 방법의 장해 특성이다. 유동 사이토메트리 비드 기제의 하이브리다이제이션 분석은 유전 시퀀스의 검출을 극히 신속, 정확하게 한다. 본 발명의 바람직한 실시예로서 핵산 편이 결합된 비드를 제공하는 것이다. PCR 세품(또는 다른 DNA, cDNA 편)이 그의 능력으로 인해 검출되어 비드상의 핵산 단편과 보충 형광 DNA 프로우브사이는 하이브리다이제이션을 경쟁적으로 저해한다. 이 방법은 PCR 생산물이나 DNA 중 단일 포인트 변이를 정확하게 검출할 수 있게 한다. 복수 DNA 분석법은 특정 다형 또는 변종의 PCR 생산물 또는 다른 DNAFMF 검출하는 데 적용할 수 있으며, 당분야에 통상의 지식을 가진 가가 질병 감염과 관련된 조직 적합 대립 유전자, 유전 질병과 관련된 변종, 자기 면역질환, 또는 종양 관련 종양유전자의 돌연변이의 존재와 같은 것에 적용할 수 있음을 인식할 수 있다. 동일한 방법으로, 박테리아, 바이러스 진균, 미코플라스마, 리케차 또는 원생동물 병원균과 같은 병원체로부터의 핵산 단편 동시에 검출될 수 있다.
효소분석
또한, 본 발명은 효소, 효소 저해제 및 다른 검체물의 측정에 유용하다. 예를 들면, 비드 집합체는 형광손실에 기인하는 비드로부터 효소학적으로 분해되는 선택된 형광물질로부터 생성된다. 본 발명에서 검출되고 측정되는 효소로는 프로테아제, 글리코시다제, 뉴클레오티다제, 및 옥시도리닥타제를 들 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 선택된 결합을 끊는 효소를 측정할 수 있다. 또한, 비드 결합 기질상의 효소의 반응는 반응 혼합물중 존재하는 형광 리간들용 라이게이크을 셩성 또는 동정을 할 수 있다. 변형 기질을 갖는 비드는 형광 리간드가 새로 형성된 라이게이트로 결합하므로 형광으로 된다. 독특한 기질을 갖는 각 타입의 비드는 구별될 수 있으므로, 비드 집합체의 혼합은 각 반응 혼합물중에 동시에 여러개의 효소활성을 측정하는데 사용될 수 있다.
이들 기술을 사용하여 분석될 수 있는 검체의 샘플 또는 유체로는 플라스마, 형장, 눈물, 점액, 침, 오줌, 흉막액, 척추액, 위액, 땀, 정액, 질분비액, 궤양 및 기타 표면 발진액, 수포, 종기 및 정상, 악성 및 의심되는 조직의 생체를 포함한 조직 추출물 등을 들 수 있다.
상기 실시예는 통상의 면역진단학 및 핵산 분석을 수행하는 데 사용할 수 있다. 신약의 배합 화학 라이브러리의 고속 처리 스크리닝, 오염물의 환경 스크리닝, 약물 테스트, 식품 안정성에 관련된 조사, 농업적으로 요구되는 복합 검체의 테스트와 같은 다른 분야에의 적용도 가능하다.
본 발명은 비드 또는 마이크로스피어 등을 2종이상의 형광 염료로 각종 비로 염색하여 동시에 각종 개체군의 비드의 형광 시그널을 여기시키며, 이러한 비드의 표면에 분석시약을 결합하여 하나의 샘플중 복수의 검체를 동시에 분석할 수 있게 하는 유용한 발명이다.

Claims (40)

  1. (a) 최소 2종의 형광 염료가 용해하는 최소 1종의 유기 용매와, 적어도 2종의 염료가 덜 용해되는 최소 1종의 알코올로 이루어진 용매 혼합물에 2조이상의 형광염료를 결합하여 상기 용액과 접촉하는 복수의 중합체 마이크로스피어를 용해하지 않으나, 부분적으로 팽윤시키는 혼합 염료 용액을 제공하고,
    (b) 복수의 중합체 마이크로스피어를 상기 용핵으로 충분히 접촉하여 최소 2종이상의 형광염료를 갖는 복수의 중합체 마이크로스피어의 성분을 실질적으로 균일하게 염색함을 특징으로 하며,
    상기 형광 염료가 복수의 중합체 마이크로스피어의 염색된 복수개의 분리 및 여기에서 현저한 형광 시그널이 각 염료로부터 방충하고, 방출 시크널의 중합체 마이크로스피어의 염색된 복수개중 상기 염료의 양에 비례하는 강도로 선정되는
    2종이상의 형광 염료를 갖는 중합체 마이크로스피어의 염색방법.
  2. 제 1항에 있어서, 복수의 중합체 마이크로스피어를 탈수함을 특징으로 하는 염색방법.
  3. 제 2항에 있어서, 탈수공정이 복수의 중합체 마이크로스피어를 상기 용액과 접촉하기 전에 상기 알코올 용매로 1회이상 세정함을 특징으로 하는 염색방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 용액과 복수의 중합체 마이크로스피어를 접촉하기 전에 상기 세정된 마이크로스피어로부터 알코올 용매를 건조함을 특징으로 하는 염색방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 염색된 복수의 중합체 마이크로스피어를 여과 또는 원심분리로 분리함을 특징으로 하는 염색방법.
  6. 제 1항에 있어서, 적어도 1종이상의 형광염료를 염색된 복수의 중합체 마이크로스피어 성분의 모두의 내부를 통해 분산시킴을 특징으로 하는 염색방법.
  7. 제 1항에 있어서, 적어도 2종이상의 형광염료를 염색된 복수의 중합체 마이크로스피어 성분의 모두의 내부를 통해 분산시킴을 특징으로 하는 염색방법.
  8. 제 1항에 있어서, 적어도 1종이상의 형광염료를 염색된 복수의 중합체 마이크로스피어 성분의 모두의 내부의 일부를 통해 분산시킴을 특징으로 하는 염색방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 적어도 2종이상의 형광염료의 상이한 소망의 비를 갖는 상기 일련의 용액을 제조함을 특징으로 하는 염색방법.
  10. 제 9항에 있어서, 별도의 복수의 중합체 마이크로스피어의 개체군을 상기 일녈의 용액과 접촉하여 최소 2종이상의 염료의 상이한 소방의 비를 갖는 각각의 현저한 개체군 또는 집합체를 제공함을 특징으로 하는 염색방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 적어도 2종이상의 형광염료로부터 방출하는 현저한 형광 시그널이 각 파장이 적어도 약 10nm으로 상이한 것을 특징으로 하는 염색방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 적어도 2종이상의 형광염료로부터 방출하는 현저한 형광 시그널이 각 파장이 적어도 약 30nm으로 상이한 것을 특징으로 하는 염색방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 적어도 2종이상의 형광염료로부터 방출하는 현저한 형광 시그널이 각 파장이 적어도 약 50nm으로 상이한 것을 특징으로 하는 염색방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 현저한 형광 시그널의 적어도 하나가 오렌지색이고, 다른 하나의 방출 시그널이 적색인 것을 특징으로 하는 염색방법.
  15. 제 1항에 있어서, 적어도 2종이상의 형광 염료로부터 방출한 현저한 형광 시그널이 약 500nm 내지 약 1,000nm사이의 범위에 해당하는 파장을 나타내는 것을 특징으로 하는 염색방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 유기 용매가 아실기 함유 지방족, 지환족, 방향족, 할로겐화 또는 헤테로 탄화수소를 함유하는 것을 특징으로 하는 염색방법.
  17. 제 16항에 있어서, 유기 용매가 클로로포름, 톨루엔, 크실렌, 헥실렌, 메틸렌 클로라이드, 펜탄, 아세톤, 또는 DMSO인 것을 특징으로 하는 염색방법.
  18. 제 16항에 있어서, 유기 용매가 클로로포름, 톨루엔, 크실렌, 헥실렌, 메틸렌 클로라이드, 펜탄, 아세톤, 또는 DMSO인 것을 특징으로 하는 염색방법.
  19. 제 1항에 있어서, 알코올 용매가 2-프로판올, 메탄올, 에탄올, 이소프르판올, 부탄올, 또는 펜타놀로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 염색방법.
  20. 여기에 의해 개체군의 마이크로스피어가 적어도 2종이상의 형광염료에 상응하는 적어도 2개의 현저한 형광 방출 시그널을 나타내고, 적어도 2개의 시그널의 강도가 (i)상기 마이크로스피어에 상응하는 염료의 양에 비례하고, (ⅱ) 20%이하의 개체군의 성분중에 편차 계수를 나타내는 적어도 2개 이상의 방출시그널을 나타내는 개체군을 적어도 2개 이상의 염료로 실질적으로 균일하게 염색된 중합체 개체군.
  21. 제 20항에 있어서, 적어도 2개의 방출 시그널의 강도가 알코올 용매가 2-프로판올, 메탄올, 에탄올, 이소프르판올, 부탄올, 또는 펜타놀로 이루어진 군에서 선택된 중합체 개체군.
  22. 제 20항에 있어서, 전술한 적어도 2종 이상의 방출 시그널이 10%이상의 개체군의 성분중 편차 계수를 나타내는 중합체 개체군.
  23. 제 20항에 있어서, 전술한 적어도 2종 이상의 방출 시그널이 8%이상의 개체군의 성분중 편차 계수를 나타내는 중합체 개체군.
  24. 제 20항에 있어서, 전술한 적어도 2종 이상의 방출 시그널이 8%이하의 개체군의 성분중 편차 계수를 나타내는 중합체 개체군.
  25. 제 20항에 있어서, 전술한 적어도 2종 이상의 형광 염료가 소수성인 중합체 개체군.
  26. 제 25항에 있어서, 전술한 적어도 2종 이상의 형광 염료가 스콰릭산 기재 염료인 중합체 개체군.
  27. 제 26항에 있어서, 전술한 적어도 스콰릭산이 사이클로부탄디온 유도체 대칭 또는 비대칭 스콰레인류, 치환 세파로스포린 화합물, 불소화 스콰레닌 조성물, 알킬 알콕시 스콰레인 또는 스콰리움 화합물인 중합체 개체군.
  28. 제 26항에 있어서, 전술한 스콰릭산 기재 염료가 플루오레센트 염료 또는 유기 플루오레센트 염료로부터 선택된 중합체 개체군.
  29. 제 28항에 있어서, 적색 형광 염료가 1,3-비스[(1,3-디히드로-1,2,2-트리메릴-2H-인돌-2-일리덴)메틸)메틸]-2,4-디히드록시시클로부텐디일륨, 비스(내부염) 및 상기 형광 염료가 2-(3,5-디메틸피롤-2-일)-4-(3,5-디메틸-2H-피롤-2-일리젠)-3-히드록시-2-시클로부텐-1-온인 중합체 개체군.
  30. 제 20항에 있어서, 상기 마이크로스피어가 폴리스티렌, 브롬화 폴리스티렌, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아크릴아미드, 폴리아크로레인, 폴리디메틸실록산, 폴리부타디엔, 폴리이소프렌, 폴리우레탄, 폴리비닐아세테이트, 폴리비닐클로라이드, 폴리비닐피리딘, 폴리비닐벤질클로라이드, 폴리비닐톨루엔, 폴리비닐리덴 클로라이드, 폴리디비닐벤젠, 폴리글리시딜메타크릴레이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 또는 공중합체, 블렌드, 컴포지트 또는 그의 조합으로 부터 선택된 중합체 개체군.
  31. 제 20항에 있어서, 전술한 마이크로스피어가 적어도 상기 마이크로스피어 또는 그의 표면에 흡수되는 관는기에 공유 결합되는 분석 반응물인 중합체 개체군.
  32. 제 20항에 있어서, 전술한 마이크로스피어가 10∼100nm사이의 직경을 갖는 중합체 개체군.
  33. 각각의 개체군이 전술한 개체군에 유일한 형광 비드 맵중 방출 스펙트럼을 나타내는 제 20항에 따른 중합체 마이크로스피어의 현저한 개체군의 집합.
  34. 제 33항에 있어서, 8개 이상의 중합체 마이크로스피어의 현저한 개체군인 집합.
  35. 제 33항에 있어서, 16개 이상의 중합체 마이크로스피어의 현저한 개체군인 집합.
  36. 제 33항에 있어서, 24개 이상의 중합체 마이크로스피어의 현저한 개체군인 집합.
  37. 제 33항에 있어서, 32개 이상의 중합체 마이크로스피어의 현저한 개체군인 집합.
  38. 제 33항에 있어서, 64개 이상의 중합체 마이크로스피어의 현저한 개체군인 집합.
  39. 제 38항에 있어서, 실질적으로 64개 이상의 중합체 마이크로스피어에 관련된 64개 이상의 방출 스펙트럼사이에 중첩되지 않는 개체군인 집합.
  40. (a) 복수의 균일하게 염색된 마이크로스피어의 개체군을 샘플과 접촉시키고, 상기 마이크로스피어는 각 개체군에서 특정비로 균일하게 혼합된 최소 2종의 형광염료를 가지며, 마이크로스피어의 개체군은 그의 표면에 결합된 현저한 부석적 반응물을 가지며, 상기 반응물은 샘플중 검체와 상호 작용하며,
    (b) 검체에 특이적으로 결합하는 표지시약을 제공하여 마이크로스피어를 부석하여 검체가 분석적 반응물에 결합하는 것을 나타내는 표지를 검출하는 표지 시약을 제공하고,
    (c) 반응물이 결합된 각 개체군의 마이크로스피어내의 특정비에서 혼합된 형광염료를 갖는 마이크로스피어의 개체를 측정함을 특징으로 하는 상응하는 분석 반응물에 인식되는 상기 검출물의 각각을 검출하는 방법.
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