KR20010021649A

KR20010021649A - 앤크로드 특이적 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의혼합물 또는 유도체 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20010021649A
Application number: KR1020007000207A
Authority: KR
Inventors: 토마스 수브코브스키; 빌프리트 호른베르거
Original assignee: 스타르크, 카르크; 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1997-07-10
Filing date: 1998-06-23
Publication date: 2001-03-15
Also published as: US6365155B1; CN1262690A; WO1999002564A2; CA2295218A1; CZ200057A3; AU748841B2; NO20000079L; CZ297216B6; BR9810574A; ZA986064B; NO20000079D0; WO1999002564A3; DE19729544A1; JP2002511880A; AU8540698A; EP1000087A2; IL133224A0

Abstract

본 발명은 앤크로드 특이적 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체, 및 제약 제제 또는 진단에 있어서의 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 항체, 항체 단편 및 그의 혼합물 또는 유도체를 발현하는 세포에 관한 것이다.

Description

앤크로드 특이적 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체 및 그의 용도{Ancrod Specific Monoclonal Antibodies, Antibody Fragments, Mixtures or Derivatives Thereof and Use of The Same}

본 발명은 앤크로드 특이적 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체, 및 제약 제제 또는 진단에 있어서의 그의 용도, 및 이들 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체를 포함하는 제약 제제에 관한 것이다.

본 발명은 또한 이들 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체를 발현하는 세포에 관한 것이다.

앤크로드 [상품명: 아르윈 (Arwin, 등록상표), 아르빈 (Arvin, 등록상표)]는 말레이시아 살모사 (Agkistrodon rhodostoma) 독액으로부터 얻은 효소이다. 그것은 평균 MW가 약 38000이며, 항응고성 및 혈괴를 용해시키는 능력을 갖는 고도로 글리코실화된 세린 프로테아제이다.

혈액의 정상적인 응고는 피브리노겐 분자로부터 피브리노펩티드 A 및 B를 제거하고, 따라서 예를 들면 적혈구 또는 혈소판 이외에 크롬빈의 주요 성분인 피브린의 형성을 유도하는 트롬빈에 의해 수행된다 (유럽 특허 공고 제0 556 906호). 트롬빈과 대조적으로, 앤크로드는 피브리노겐 분자의 α ("A") 사슬 내의 아르기닌-글리신 결합만을 분해하여 피브리노펩티드 A, AP 및 AY를 유리시킨다 [Cole et al., J. Vascular. Surgery, Vol 17, 1993: 288-292]. 피브리노겐 분자의 β("B") 사슬은 앤크로드에 의해 공격되지 않으므로 유리되지 않는다. 앤크로드에 의해 야기되는 피브리노펩티드의 제거 후에 형성된 단편 ("A"-피브린 제거 단량체)는 최종적으로 얇은 필라멘트로 중합될 수 있다. 형성된 부정형 가용성 피브린은 내인성 플라스민에 의해 용해되고(되거나) 세망내피계 (= RES, 단핵세포/대식세포계)에 의해 제거된다. 천연 피브린을 제공하기 위한 트롬빈에 의한 "A"-피브리노겐 제거 분자의 분해는 형성된 분자가 트롬빈 기질이 아니기 때문에 더 이상 일어나지 않는다.

앤크로드는 혈중 피브리노겐 농도의 투여량 의존성 감소를 일으킨다. 치료학적으로 유도되고 조절되는 섬유소원감소증은 혈액의 유동 특성이 결정적으로 개선되는 한 혈장 점성 및 적혈구가 응집하는 경향을 감소시킨다. 이것은 협착 혈관을 통한 더 많은 혈류를 위한 조건을 제공한다. 앤크로드는 통상적으로 예를 들면 말초 동맥 혈류의 만성 장애를 치료하는데 이용되며, 졸중의 임상적 III기 연구에 이용되고 있다.

앤크로드는 피하 주사되는 것이 유리하다. 처치는 병원에서 일어날 수 있거나, 또는 모니터하는데 필요한 피브리노겐 농도를 정기적으로 체크하는 경우 치료는 외래환자를 기준으로 해서도 확인된다. 앤크로드를 정맥내 투여하는 것이 가능하지만, 예외적인 경우와 병원에서의 진찰중에서만 이루어져야 한다.

앤크로드의 투약량 판정은 또한 개별화되어야 한다. 앤크로드 투여량의 함수로서의 피브리노겐 농도의 거동은 결정적으로 중요하다. 그것은 혈장 100 ㎖ 당 70 내지 100 ㎎ (= 치료 범위)으로 서서히 감소되어야 한다. 피브리노겐 농도는 처치 기간 내내 이 범위내로만 조정되어야 한다. 혈액의 유동 특성은 이 조건하에서 만족된다. 치료는 통상적으로 3 내지 4주 지속되지만, 필요시에 이 기간 이상으로 연장될 수 있다.

피하 투여시에, 처음 4일 내에 매일 70 I.U. (= 국제 단위, 1 ㎖)가 제공되고, 5일째부터 피브리노겐 농도의 거동에 따라서 70 -140 I.U.가 제공된다. 피브리노겐 농도가 치료 범위내에 있는 경우, 210 - 280 I.U.의 1회 주사가 1 주일에 2 내지 3회 제공된다.

정맥내 주입시에, 초기에 체중 ㎏ 당 2 - 3 I.U.가 8시간 동안 제공된다. 앤크로드의 이후의 투약량 판정은 그때의 피브리노겐 농도에 좌우된다. 일반적으로 12시간 마다 체중 ㎏ 당 추가의 1 I.U.를 서서히 주사하는 것이 충분하다.

혈행 중의 앤크로드의 초기의 반감기는 약 3 내지 5 시간이지만, 약 4일 후에 일반적으로 이 시간내에 투여된 앤크로드의 90%가 제거되는 정도로 농도가 떨어질때 감속되어 반감기는 9 내지 12일로 연장된다.

앤크로드가 예를 들면 처치 중의 비특이적 출혈의 문제점이 보다 적다는 점에서 헤파린 및 와르파린과 대비되긴 하지만 [Z.S. Latallo, "Retrospective Study on Complications and Adverse Effects of Treatment with Thrombin-Like Enzymes - A Multicenter Trial", Thromb. Haemostasis, 50 (1983) 604-609], 그러한 출혈의 특이적 처치가 필요하며 바람직하다.

앤크로드를 사용한 처치에 있어서 금기는 예를 들면 출혈 소질, 수술 및 분만 후의 외상과 관련된 출혈의 위험, 궤양성 장 질환, 신생물, 조절하기 힘든 고혈압증, 급성 뇌경색 및 활동성 폐결핵, 예를 들면 고열, 심각한 간 질환 상태, 쇼크 또는 임신의 현성 및 초기 상태에서의 RES의 기능장해 및 혈병 붕괴의 장애이다.

상기한 바와 같이, 앤크로드에 의한 출혈의 위험은 피브리노겐 농도가 서서히 감소되고 치료 기간 중에 100 ㎖ 당 70 내지 100 ㎎으로 조정될 때 비교적 낮다. 신장 결석 또는 신부전의 경우에 잠재적인 출혈 경향이 있는 환자는 특별히 주의깊게 관찰되어야 한다. 다른 약제의 근육내 주사 및 동맥 천자는 피해야 한다. RES 차단 및 궤양유발성 약제, 항응고제, 항섬유소용해제, 혈전용해제, 혈소판 응집을 억제하는 약제의 동시 투여시에, 또한 앤크로드의 근육내 투여시에 주의가 필요하다. 근육 축적질로부터의 흡수는 일반적으로 너무 빨리 일어나서 너무 많은 "A"-피브린 제거 단량체가 흘러가고 혈전색전 합병증의 위험이 있다.

이전의 혈전용해 치료 없이 앤크로드를 투여한 429명의 환자에 대한 연구 (Crit. Rev. Oncol. Hematol. 15 (1993) 23-33)에서 전체 출혈율은 9.8%였다 (4.2% 장 출혈; 5.6% 외부 출혈).

앤크로드의 효소 활성을 중화하는데 통상적으로 사용되는 것은 염소 혈청으로부터 얻은 면역글로불린 제제를 기재로 한 해독제 (Knoll AG publication, June 1983, Arwin (등록상표))이다. 폴리클로날 항체를 포함하는 이 해독제는 예를 들면 사고 외상과 관련된 심각한 출혈 합병증 또는 증가된 출혈 위험의 경우에, 또는 갑작스럽게 하게되는 수술 때문에 사용된다. 앤크로드의 중화는 인간 피브리노겐 4 내지 5 g의 투여 이후에 이루어져야 한다. 인간 피브리노겐, 혈장 또는 혈액이 해독제에 의한 앤크로드의 사전 중화 없이 투여되는 경우, 급성 전이된 응고의 위험이 있다.

스톡커 등 (Stocker et al.)(Thrombosis Research, Vol. 6, 1975: 189-194)은 아르윈 (Arwin)(등록상표) 만의 존재하에 또한 폴리클로날 해독제의 존재하에서의 혈전형성을 연구하였으며 그들은 해독제 효과를 입증할 수 있었다.

염소로부터 얻은 폴리클로날 항체의 이용 이외에도, 유럽 특허 공고 제0 395 375호, 유럽 특허 공고 제0 556 906호 및 부르크하르트 (Burkhardt) 등 (FEBS, Vol 297, No. 3, 1992: 297-301)은 앤크로드 유전자의 발현을 검측하기 위해, 앤크로드 및 앤크로드 항체를 이용한 혈액 중의 피브리노겐을 검출하기 위해 또는 항체를 이용한 앤크로드의 정제를 위해 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 기재하고 있다.

앤크로드 해독제로서 사용되는 염소 폴리클로날 항체의 단점은 예를 들면 그들이 항체의 혼합물로 이루어졌고, 그들 중 많은 것이 앤크로드 중화 효과를 갖지 않는다는 점이다. 이러한 다수의 다른 항체는 신속한 면역 반응을 유발할 수 있고, 또한 비교적 낮은 앤크로드 중화 능력을 유도한다. 또한, 해독제는 앤크로드에 대해 가변 친화도를 갖는 항체를 함유한다. 폴리클로날 항체는 그들이 동물로 얻어지기 때문에 어렵게 표정(標定)되며, 이는 다른 생성 배치에서 변동이 있다는 것을 의미한다.

본 발명의 목적은 상기 단점을 갖지 않으며 공업적으로 쉽게 생산되는 앤크로드에 대한 해독제를 개발하는 것이다.

본 발명자는 이 목적이 앤크로드에 결합하고 그의 활성을 억제하며, 결합 친화도가 1 x 10^-7내지 1 x 10^-12M이고, 중화 효과가 생체내에서 염소 폴리클로날 항체에 비해 100% 이상 개선된, 신규 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체에 의해 달성됨을 발견하였다.

앤크로드 해독제로서 유리하게 사용되는 신규 항체는 많은 개선된 특성을 갖는다. 예를 들면, 그것은 다른 생성 배치 사이에서 변동을 나타내지 않는 한 항체 또는 한 항체 아류를 포함하는 균질의 잘 특징화된 생성물을 형성한다. 그것은 소정량으로 생성될 수 있으며, 그러한 생성은 동물에서 생성되지 않기 때문에 바이러스 또는 세균 오염의 위험을 수반하지 않는다. 신규 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체는 에피토프 특이적이며 높은 결합 및 중화 활성을 나타낸다. 그러므로, 그것은 처치를 위해 소량으로 투여될 수 있다. 높은 결합 및 중화 활성으로 인한 소량 사용과 함께 생성물의 균질도는 환자에서의 면역 반응의 위험을 뚜렷하게 감소시킨다. 폴리클로날 항체에 의한 것과 유사한 결합 및 중화 활성의 변동은 각종 항체, 항체 단편 또는 유도체 내에서 일어나지 않는다. 앤크로드의 다른 에피토프에 대한 결합 활성을 갖는 다른 모노클로날 항체, 항체 단편 또는 유도체의 혼합은 다른 에피토프가 매우 효율적으로 중화되는 것을 가능하게 한다.

신규 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체는 유리하게는 1 x 10^-7내지 1 x 10^-12M, 바람직하게는 1 x 10^-8내지 1 x 10^-11M, 특히 바람직하게는 1 x 10^-9내지 5 x 10^-10M의 앤크로드에 대한 결합 친화도를 갖는다.

신규 해독제는 염소 폴리클로날 항체에 비해 100% 이상, 250%까지, 특히 바람직하게는 500% 까지 개선된, 생체내에서의 앤크로드 중화 효과를 갖는다. 모노클로날 항체는 또한 시험관내에서 폴리클로날 항체 보다 뚜렷하게 더 양호한 효과를 나타낸다.

신규 모노클로날 항체 또는 그의 단편은 원칙적으로 IgM, IgG, IgD, IgE, IgA 또는 그의 아류, 예를 들면 IgG 아류 또는 그의 혼합물과 같은 모든 면역글로불린 부류를 의미한다. IgG 및 그의 아류, 예를 들면 IgG₁, IgG₂, IgG_2a, IgG_2b, IgG₃또는 IgG_M이 바람직하다. IgG 아형 IgG₁/κ 및 IgG_2b/κ가 특히 바람직하다. 언급될 수 있는 단편은 항체에 상응하는 결합 부위를 갖는 항체의 일부와 같은, 앤크로드에 대한 높은 결합 및 중화 활성을 나타내는 1 또는 2개의 항원-상보적 결합 부위를 갖는 모든 절단된 또는 변형된 항체 단편으로서, 이는 경쇄 및 중쇄에 의해 형성되며, 예를 들면 Fv, Fab 또는 F(ab)'₂단편, 또는 단일 가닥 단편이다. 절단된 이중 가닥 단편, 예를 들면 Fv, Fab 또는 F(ab)'₂가 바람직하다. 이 단편은 예를 들면 파파인 또는 펩신과 같은 효소에 의해 항체의 Fc 부분을 제거하는 효소적 수단에 의해, 화학적 산화에 의해 또는 항체 유전자의 유전공학적 조작에 의해 얻어질 수 있다. 또한, 유전자 조작된, 비절단된 단편을 이용하는 것이 가능하고 유리하다.

항체 또는 단편은 단독으로 또는 혼합물로 사용될 수 있다.

유전자 조작을 위한 항체 유전자는 예를 들면 하이브리도마 (hybridoma) 세포로부터 당업계의 숙련인에게 공지된 방법으로 분리될 수 있다. 이 목적을 위하여, 항체 생성 세포를 배양하고, 세포의 광학 밀도가 충분할 때, 세포를 구아니듐 티오시아네이트로 용해시키고, 아세트산 나트륨으로 산성화시키고, 페놀, 클로로포름/이소아밀 알코올로 추출하고, 이소프로판올로 침전시키고 에탄올로 세척함으로써 공지된 방법으로 mRNA를 세포로부터 분리된다. 그후에, cDNA를 역전사효소를 이용하여 mRNA로부터 합성한다. 합성된 cDNA는 직접 또는 유전자 조작 후에, 예를 들면 부위 지정된 돌연변이유발 (site-directed mutagenesis), 적합한 동물, 진균류, 세균 또는 바이러스 벡터로의 삽입, 역위, 결실 또는 염기 교환을 도입하여 삽입시키고 적절한 숙주 생물에서 발현시킬 수 있다. 유전자의 클로닝 및 이. 콜리와 같은 세균에서 또는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모에서의 발현을 위한 pBR322, pUC18/19, pACYC184, 람다 또는 효모 mu 벡터와 같은 세균 또는 효모 벡터가 바람직하다.

본 발명은 또한 신규 항체를 합성하는 세포에 관한 것이다. 이것은 상기한 바와 같은 형질전환 후의 동물, 진균류, 세균 세포 또는 효모 세포일 수 있다. 그것은 유리하게는 하이브리도마 세포 또는 트리오마 (trioma) 세포, 바람직하게는 하이브리도마 세포이다. 이 하이브리도마 세포는 예를 들면 공지된 방법으로 동물을 앤크로드로 면역화시키고, 그의 항체 생성 B 세포를 분리하고, 이들 세포를 앤크로드 결합 항체에 대해 선별하고, 이후에 이 세포를, 예를 들면 인간 또는 동물, 예를 들면 생쥐 골수종 세포, 인간 임포블라스토이드 세포 또는 헤테로하이브리도마 세포에 융합시키거나 (Koehler et al., Nature 256, 1975: 496) 또는 이 세포를 적절한 바이러스로 감염시킴으로써 생성되어 불멸의 세포를 제공할 수 있다. 융합에 의해 생성된 하이브리도마 세포주가 바람직하며, 생쥐 하이브리도마 세포주가 특히 바람직하고, 항체 MAb 1-2, MAb 2-29/3 또는 MAb 3-27을 분비하고 DSMZ (Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig)에 DSM ACC2317, DSM ACC2318 및 DSM ACC2319로 기탁된 하이브리도마 세포주가 아주 특히 바람직하다.

상기 하이브리도마 세포주는 IgG 형의 특히 바람직한 항체를 분비한다. 형성되는 항체 MAb 1-2, MAb 2-29/3 및 MAb 3-27은 IgG 아형 IgG₁/κ, IgG_2b/κ 및 IgG₁/κ의 것이다. 이러한 바람직한 항체는 그들간의 항체의 경쟁 결합에 대한 시험에 의해 밝혀진 바와 같이 앤크로드 분자의 다른 에피토프에 결합한다. 특히 바람직한 항체 MAb 1-2의 그의 에피토프에 대한 결합의 결과 앤크로드 분자의 가장 광범위한 중화가 일어나며, 따라서 효소 효과를 중화시키는데 최소량의 항체가 필요하다. 모노클로날 항체는 출혈을 치료하는데 통상적으로 이용되며 염소로부터 얻어서 크놀 아게 (Knoll AG; Ludwigshafen)에 의해 해독제로서 판매되는 폴리클로날 항체를 기재로 한 해독제 보다 분명하게 더 큰 중화 효과를 나타낸다.

본원에 언급될 수 있는 신규 모노클로날 항체의 유도체는 펩티드, 항체의 항원 결합 영역으로부터 유래된 펩티드 유사체, 및 고상 또는 액상 담체, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜, 유리, 합성 중합체, 예를 들면 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 또는 천연 중합체, 예를 들면 셀룰로오스, 세파로오스 또는 아가로오스, 또는 효소, 독소 또는 방사성 또는 비방사성 마커, 예를 들면 3H, 123I, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 55Fe, 59Fe, 90Y, 99mTc, 75Se와의 콘쥬게이트에 결합된 항체, 단편 또는 펩티드, 또는 형광/화학발광 라벨, 예를 들면 로다민, 플루오레스세인, 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 피코시아닌, 플루오레스사민, 금속 킬레이트, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 비오틴에 공유 결합된 항체, 단편 또는 펩티드이다.

신규 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체는 직접, 건조, 예를 들면 동결 건조 후에, 상기 담체로의 부착 후에 또는 제약 제제를 생성하기 위한 다른 제약 활성 및 보조 물질과의 배합 후에 이용될 수 있다. 언급될 수 있는 활성 및 보조 물질의 예는 다른 항체, 살균 또는 미생물 신진대사 작용을 가진 항균 활성 물질, 예를 들면 일반적으로 항생물질 또는 술폰아미드, 항암제, 물, 완충액, 염수, 알코올, 지방, 왁스, 불활성 비히클 또는 비경구 제품에 통상적인 다른 물질, 예를 들면 아미노산, 증점제 또는 당이다 . 이들 제약 제제는 질병을 억제하는데, 바람직하게는 응고 장애, 유리하게는 말초 혈액계의 장해를 억제하는데, 또는 졸중을 위해 사용된다.

신규 해독제는 경구 또는 비경구 - 피하, 근육내, 정맥내 또는 복강내 - 투여될 수 있으며, 근육내 또는 정맥내 투여가 바람직하다.

신규 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체는 상기한 바와 같이 진단하는데 직접 또는 고상 또는 액상 담체, 효소, 독소, 방사성 또는 비방사성 표지에 또는 형광/화학발광 표지에 결합한 후에 이용될 수 있다. 이 경우에, 앤크로드는 각종 생물, 예를 들면 인간 또는 동물로부터의 각종 체액 또는 각종 액체, 예를 들면 효모, 세균, 진균류 또는 인간 또는 동물 세포 배양액으로부터의 배지에서 검출될 수 있다.

1. 하이브리도마 세포주의 제조

면역화, 융합, 선택 및 특징화는 문헌 (J.H. Peters; Monoklonale Antikorper, Herstellung und Charakterisierung; Springer Verlag; A.M. Campbell; Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology; published by Elsevier, chapters 2 to 7 and 8, 1991)에 기재된 기술에 의해 실시하였다.

암컷 Balb/c 생쥐를 가교결합에 의해 효소 활성에 대해 불활성화된 앤크로드 100 ㎍으로 다음 투여 계획에 따라 2-3주 주기적 간격으로 복강내로 면역화시켰다.

1. PBS 100 ㎕ + 완전 프로인트 보조액 100 ㎕ 중

2. PBS 100 ㎕ + 불완전 프로인트 보조액 100 ㎕ 중

3-5. PBS 200 ㎕ 중

최종 항원 투여한지 3일 후에, 비장을 제거하고, 세포를 세척하고, 분리하고, 임파구를 골수종 세포주 SP2/0-Ag14 (=ATCC CRL 1581)에 융합시켰다. 융합은 그것을 5:1의 비로 혼합하고, PEG 용액 (= 폴리에틸렌 글리콜 용액) 1.5 ㎖와 함께 37 ℃에서 1분 동안 인큐베이션시키고, PBS (= 인산염 완충 염수)(30초 동안 1 ㎖, 30초 동안 3 ㎖, 60초 동안 16 ㎖)와 혼합하여 실시하였다. 세척 단계 후에, 세포를 선택 배지 [DMEM (= 둘베코 변형 이글 배지); 10% FCS (=태아 소 혈청); 10% 콘디메드 H1 (Boehringer Mannheim); HAT 보충 (= 하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 보충); ITS 보충 (= 인슐린, 트랜스페린, 셀레나이트 보충); 피루베이트; 글루타민; 스트렙토마이신/페니실린]에서 37 ℃/7.5% CO₂에서 배양시켰다.

항-앤크로드 항체를 특이적으로 분비하는 하이브리도마를 마이크로타이터 플레이트에서 특이적 ELISA에 의해 다음과 같이 동정하였다.

- 앤크로드 또는 참고 단백질 0.1 ㎖/웰로 마이크로타이터 플레이트를 피복하여 4 ℃에서 16 시간 동안 특이성 (1 ㎍/㎖의 0.05M NaHCO₃pH 9.2)을 확인함

- 23 ℃에서 0.5 내지 1 시간 동안 1% BSA/PBS 0.3 ㎖/웰로 포화시킴

- PBS/0.05% 트윈 (등록상표) 20으로 3회 세척함

- 세포 배양 상등액 (50 ㎕의 PBS/0.1% BSA (소 혈청 알부민)/0.05% 트윈 (등록상표) 20으로 희석한 50 ㎕)과 함께 23 ℃에서 2 내지 4 시간 동안 인큐베이션시킴

- 상기한 바와 같이 세척함

- 0.1% BSA/PBS 중의 비오티닐화 항-생쥐 IgG 항체 0.1 ㎖/웰과 함께 23 ℃에서 2 내지 4 시간 동안 인큐베이션시킴

- 상기한 바와 같이 세척함

- 0.1% BSA/PBS 중의 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 복합체 0.1 ㎖/웰과 함께 23 ℃에서 0.5 시간 동안 인큐베이션시킴

- 상기한 바와 같이 세척함

- 퍼옥시다아제 기질 0.1 ㎖/웰

- 2M H₂SO₄0.1 ㎖/웰로 반응을 중지시킴

- 450 nm에서 흡수도를 측정함

퍼옥시다아제 기질: TMB 용액 (DMSO 중의 42 mM 테트라메틸벤지딘) 0.1 ㎖ 및 기질 완충액 (0.1M 아세트산 나트륨 pH 4.9) 10 ㎖를 혼합하고 그후에 H₂O₂14.7 ㎕를 첨가함.

양성 항체 반응을 나타내는 하이브리도마를 서브클로닝시켜 분리하고 개개의 클론을 재시험하였다. 최고 반응성을 가진 항체를 시험관내 중화 분석에 이용하였다. 이런 식으로 다수의 양성 하이브리도마, 즉 앤크로드에 대한 항체를 생성하는 세포를 분리할 수 있었다.

2. 모노클로날 항체의 생성 및 특징화

모노클로날 항체를 무혈청 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 이 정제는 DMEM/HT/10% FCS 및 DMEM/10% FCS를 통해 DMEM/HAT/10% FCS 배지로부터 단계식으로 무혈청 세포 배지 (HT = 하이포크산틴, 아미노프테린), 예를 들면 SF-3 (Cytogen), PFHM-II (Gibco), HL-1 (Bio Whittaker), Ultra Doma PF (Bio Whittaker) 등으로 하이브리도마를 이입시켜 실시하였다. 단백질 A-세파로오스 및 단백질 G-세파로오스를 친화도 크로마토그래피에 의한 이후의 정제에 사용하였다.

세포 배양 상등액을 크로마토그래피 컬럼 상에 로딩시킨 후에, 비특이적으로 결합된 단백질을 3M NaCl/0.5M 글리신, pH 8.9으로 세척하고; 항-앤크로드 항체 반응성을 500 mM NaCl/0.59% 아세트산으로 용출시켰다.

상기한 것과 유사하지만 비오티닐화 항-생쥐 IgG 항체 대신에 다음의 비오티닐화 아형-특이적 항체: 항-생쥐 IgG₁, 항-생쥐 IgM, 항-생쥐 IgG_2a, 항-생쥐 κ, 항-생쥐 IgG_2b, 항-생쥐 λ 및 항-생쥐 IgG₃을 이용하는 ELISA로 항체 아형을 측정하였다.

분리된 하이브리도마 세포주의 항체 형 및 아형 MAb 1-2, MAb 2-29/3 및 MAb 3-27 (실시예 1 참조)을 각각 다음과 같이 IgG₁/κ, IgG_2b/κ 및 IgG₁/κ로 확인하였다.

모노클로날 항체의 친화도 상수는 문헌에 기재된 각종 기술, 예를 들면 평형 투석, 면역침전 또는 ELISA에 의해 결정하였다 (예를 들면, J.H. Peters; Monoklonale Antikorper, Herstellung und Charakterisierung; Springer Verlag; A.M. Campbell; Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology; Verlag Elsevier, chapter 11, 1991)

ELISA 방법 (J. Immunol. Methods 77 (1985) 305-319)은 천연 앤크로드에 대해 다음과 같은 친화도를 나타내었다 (표 I 참조).

앤크로드에 대한 모노클로날 항체의 친화도

하이브리도마/항체	k_D
Mab 1-2	1.7 * 10^-9
Mab 2-29/3	3.1 * 10^-9
Mab 3-27	4.4 * 10^-10

3. 모노클로날 항체 (= MAb) 세포 배양 상등액에 의한 앤크로드의 "시험관내" 중화

항체의 중화 능력을 앤크로드 유도된 피브린 혼탁도에 의해 정량화하였다. 앤크로드 및 항체 (세포 배양 상등액 또는 정제된 항체)를 BSA-포화된 마이크로타이터 플레이트에서 각종 농도비로 37 ℃에서 인큐베이션시키고, 그후에 인간 피브리노겐 (1.5 ㎎)을 첨가하여 실시하였다. 37 ℃에서 인큐베이션시킨 후에, 생성된 피브린을 340 nm에서 정량화하였다 (광학 밀도 = OD).

앤크로드 활성은 증가된 중화 항체의 양으로서 중화될 수 있었다. 이는 감소된 광학 밀도에 의해 밝혀졌다 (=OD, 표 II).

항체 MAb 1-2는 특히 효과적이며 비교적 높은 앤크로드 농도에서도 완전한 중화를 일으켰다 (표 II, OD는 블랭크에 해당함). 표 II 내의 블랭크는 앤크로드 앤크로드 이외의 모든 성분을 함유하였다. 최고 OD 값은 각종 모노클로날 항체의 첨가 없이 앤크로드 투여량이 다양한 각 경우 (앤크로드 50, 25 및 12.5 ng/㎖)에서 측정하였다.

MAbs 2-29 및 3-27은 MAb 1-2의 것과 같이 양호한 또는 그 보다 더 양호한 앤크로드에 대한 친화도를 갖지만 (표 I), 항체-항원 결합은 앤크로드의 양에 비해 더높은 항체 투여량으로만 효소 활성의 중화가 일어나게 한다.

MAb의 세포 배양 상등액에 의한 앤크로드의 중화

혼합물	광학 밀도 (=OD)
블랭크	0.268
앤크로드 50 ng/㎖	1.45
앤크로드 50 ng/㎖ + MAb 1-2	0.254
앤크로드 50 ng/㎖ + MAb 2-29	1.354
앤크로드 50 ng/㎖ + MAb 3-27	1.133
앤크로드 25 ng/㎖	0.939
앤크로드 25 ng/㎖ + MAb 1-2	0.238
앤크로드 25 ng/㎖ + MAb 2-29	0.333
앤크로드 25 ng/㎖ + MAb 3-27	0.422
앤크로드 12.5 ng/㎖	0.67
앤크로드 12.5 ng/㎖ + MAb 1-2	0.229
앤크로드 12.5 ng/㎖ + MAb 2-29	0.281
앤크로드 12.5 ng/㎖ + MAb 3-27	0.261

4. 정제된 모노클로날 항체에 의한 앤크로드의 "시험관내" 중화

피브린 혼탁도 분석에서 50% 중화값을 비교함으로써 정제된 모노클로날 항체의 시험관내 중화 효능을 평가할 수 있었다.

50% 중화 값을 다음과 같이 얻었다:

OD 음성 대조군 + (OD 양성 대조군 - OD 음성 대조군)/2

음성 대조군: 첨가된 앤크로드 없음 (피브린 형성되지 않음)

양성 대조군: 앤크로드 + 피브리노겐 (최대 피브린 형성)

다른 항체/앤크로드 비는 가변 OD 값을 나타내었고 50% 중화점은 다음 항체 농도에 의해 도달하였다:

	MAb 1-2	폴리클로날 항체	폴리클로날 Ab/MAb 비
1시간 동안 예비 인큐베이션
앤크로드 1.25 ng	310 ng	625 ng	2.0
앤크로드 2.5 ng	350 ng	800 ng	2.3
2시간 동안 예비 인큐베이션
앤크로드 1.25 ng	80 ng	310 ng	3.9
앤크로드 2.5 ng	150 ng	650 ng	4.3

선택된 시험관내 조건하에서 모노클로날 항체 MAb 1-2가 1시간 동안의 예비 인큐베이션에 의해 염소 폴리클로날 항체를 기재로 한 해독제 보다 적어도 2배까지 또한 2시간 동안의 예비 인큐베이션에 의해 약 4배 까지 더 양호하다는 것을 50% 중화에 필요한 항체의 양의 비로부터 추론할 수 있었다.

5. 샌드위치 ELISA에 의한 앤크로드의 정량화

다음 계획에 나타낸 바와 같이 2개의 항체의 배합물에 의한 샌드위치 ELISA에 의해 진단 목적을 위한 샘플, 예를 들면 각종 체액에서 앤크로드를 측정하였다.

- 0.05M NaHCO₃, pH 9.2에 희석된, 100 ㎕/웰 중의 5 ㎍/㎖의 MAb 1-2 또는 MAb 3-27로 마이크로타이터 플레이트를 피복함; 4 ℃에서 밤새

- 마이크로타이터 플레이트를 PBS/0.05% 트윈 (등록상표) 20으로 세척함; 200 ㎕/웰

- 1% BSA/PBS 300 ㎖/웰로 포화시킴; 23 ℃에서 0.5 시간

- 상기한 바와 같이 세척함

- PBS/0.1% BSA/0.05% 트윈 (등록상표) 20 중의 50 ng/㎖로 시작한 앤크로드의 1 리터 표준 2배 희석; 100 ㎕/웰; 그 샘플을 각종 희석액에서 동시에 이용함; 23 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시킴

- 상기한 바와 같이 세척함

- MAb 2-29와 함께 인큐베이션시킴; PBS/0.1% BSA/0.05% 트윈 (등록상표) 20 중에 희석된 1 ㎍/㎖; 100 ㎕/웰; 23 ℃에서 2 시간

- 상기한 바와 같이 세척함

- 비오티닐화 항-생쥐 IgG_2b와 함께 인큐베이션시킴; PBS/0.1% BSA/0.05% 트윈 (등록상표) 20 중에 1:10000 희석됨; 100 ㎕/웰; 23 ℃에서 2 시간

- 상기한 바와 같이 세척함

- PBS/0.1% BSA/0.05% 트윈 (등록상표) 20 중에 1:10000 희석된 스트렙타비딘-퍼옥시다아제 복합체와 함께 인큐베이션시킴; 100 ㎕/웰; 23 ℃에서 0.5 시간

- 상기한 바와 같이 세척함

- 퍼옥시다아제 기질 100 ㎕/웰을 첨가함: (기질 완충액 (0.1M 아세트산 나트륨, pH 4.9) 10 ㎖와 TMB 용액 (DMSO 중의 42 mM 테트라메틸벤지딘) 100 ㎕를 혼합하고 3% H₂O₂14.7 ㎕를 첨가함)

- 2M H₂SO₄100 ㎕/웰로 반응을 중지시킴

- 450 nm에서 흡수도를 측정함

앤크로드는 모노클로날 항체 MAb 1-2 및 MAb 3-27 및 사용된 배합물에 의해 약 3000 내지 100 pg/㎖의 농도 범위로 정량화가능하고 검출가능함이 분명해졌다. 절대 검출 한계는 정량화가능한 값 미만이다 (도 1).

6. 경쟁 ELISA

경쟁 ELISA를 실시하여 앤크로드 상의 MAb 결합 에피토프의 상대 위치를 특징화하였다:

- 0.05M NaHCO₃, pH 9.2에 희석된, 100 ㎕/웰 중의 앤크로드 1 ㎍/㎖로 마이크로타이터 플레이트를 피복함; 4 ℃에서 밤새

- 1% BSA/PBS 300 ㎕/웰로 포화시킴; 23 ℃에서 0.5 시간

- 상기한 바와 같이 세척함

- 비오티닐화 모노클로날 항체 MAb 1-2-비오틴, MAb 2-29/3-비오틴 및 MAb 3-27-비오틴 각각 10 ng/㎖를 이렇게 제조된 마이크로타이터 플레이트 중의 각종 혼합물에 놓고, 앤크로드에 결합시키고, 그후에 각 경우에서 다른 항체 (MAb 1-2, MAb 2-29/3 또는 MAb 3-27)을 초기 항체에 따라서 혼합물에 각종 농도 (1 ㎍/㎖ - 1 ng/㎖)로 첨가하여 모든 가능한 항체 배합물을 그의 결합 부위의 가능한 중복에 대해 시험하였다. 각종 항체 배합물과 혼합물을 PBS/0.1% BSA/0.05% 트윈 (등록상표) 20 중에서 23 ℃에서 2 시간 동안 인큐베이션시키고 다음과 같이 처리함:

- 상기한 바와 같이 세척함

- 퍼옥시다아제 기질 100 ㎕/웰을 첨가함: (기질 완충액 (0.1M 아세트산 나트륨, pH 4.9) 10 ㎖와 TMB 용액 (DMSO 중의 42 mM 테트라메틸벤지딘) 100 ㎖를 혼합하고 3% H₂O₂14.7 ㎕를 첨가함)

- 2M H₂SO₄100 ㎕/웰로 반응을 중지시킴

- 450 nm에서 흡수도를 측정함

이용된 항체 배합물 어디에서도 OD의 감소가 관찰되지 않았으며, 이는 각종 모노클로날 항체가 앤크로드에 대한 결합시에 서로 치환되지 않았음을 의미한다. 그들은 앤크로드 분자 상의 다른 에피토프에 결합한다. 그러므로, 하나를 초과하는 항체가 앤크로드와 동시에 상호작용할 수가 있다. 그러므로, 각종 신규 모노클로날 항체는 필요시에 앤크로드의 효과의 신속한 최적의 중화를 위해 배합물로 사용될 수 있다.

4. 앤크로드의 생체내 중화

앤크로드를 마취된 쥐의 꼬리 정맥에 체중 ㎏ 당 10 IU로 30분 동안 주입하여 투여하였다. 앤크로드를 주입하기 시작한 지 10분 후에, 각종 시험 물질 - 모노클로날, 폴리클로날 항체 또는 위약 -을 체중 ㎏ 당 1 ㎖의 정맥내 거환약으로서 투여하였다. 혈액 샘플 (혈액 8 vol. + 0.11 M 시트르산염 항응고제 2 vol.)을 앤크로드 주입 전 및 주입한 지 30분 및 60분 후에 경동맥으로부터 채혈하였다. 혈장을 원심분리에 의해 시트르산염 첨가 혈액으로부터 얻고, 피브리노겐 함량을 클라우스 (Clauss) 응고 방법 (피브리노겐 유리 쥐 혈장에 한정량의 쥐 피브리노겐을 첨가함으로써 얻어진 검량 플롯)에 의해 확인하였다.

6마리의 쥐를 각 (시험 물질) 군에 사용하였다 (표 III).

사용된 시험 물질 및 양

MAb 1-2	(체중 ㎏ 당 1.435 ㎎)
폴리클로날 Ab	(체중 ㎏ 당 8.6 ㎎; 해독제 배치 A009)
폴리클로날 Ab	(체중 ㎏ 당 1.5 ㎎; 해독제 배치 A009)

각종 항체에 의한 피브리노겐 농도의 측정

시간 [분]	피브리노겐 농도 [㎎/dl]
시간 [분]	앤크로드 +대조군	앤크로드 +MAb 1-2	앤크로드 +폴리클로날 Ab 8.6 ㎎/㎏	앤크로드 +폴리클로날 AK 1.5 ㎎/㎏
0	289.7	263.4	292.4	281.8
30	63.8	155.9	129.0	91.5
60	32.1	152.7	164.0	55.8

체중 ㎏ 당 1.435 ㎎의 농도로 이용된 MAb 1-2가 앤크로드 주입을 시작한 지 30분 후에 피브리노겐 농도의 더 이상의 저하를 중지시킬 수 있었음이 분명해졌다. 염소 폴리클로날 항체에 의해 동일한 효과를 얻기 위해서는 체중 ㎏ 당 8.6 ㎎이 필요하다. 체중 ㎏ 당 1.5 ㎎의 농도, 즉 MAb 1-2의 농도와 비교할 만한 농도에서, 폴리클로날 항체를 기재로 한 해독제는 효과를 나타내지 않았다 (표 IV 중의 대조군 참조).

60분 후의 피브리노겐 농도를 기초로 MAb 1-2에 의한 시험 조건하에서의 생체내 중화가 폴리클로날 해독제에 의한 것 보다 약 6배 더 양호하였음을 추론할 수 있었다. MAb 1-2의 중화 효과가 더 큰 것으로 추정된다.

Claims

결합 친화도가 1 x 10^-7내지 1 x 10^-12M이고, 중화 효과가 염소 폴리클로날 항체에 비해 100% 이상 개선된, 앤크로드에 결합하고 그의 활성을 억제하는 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체.
제1항에 있어서, 항체가 IgG 형인 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체.
제1항 또는 2항에 있어서, 항체 MAb 1-2, MAb 2-29/3 또는 MAb 3-27 또는 그의 혼합물인 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체를 발현하는 세포.
제4항에 있어서, 하이브리도마 세포주로부터 얻은 세포.
제4항 또는 5항에 있어서, 하이브리도마 세포주가 DSM ACC2317, DSM ACC2318 및 DSM ACC2319인 세포.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체를 포함하는 제약 제제.
제약 제제에 있어서 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체의 용도.
응고 장애 치료용 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체의 용도.
진단에 있어서 제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 따른 모노클로날 항체, 항체 단편, 그의 혼합물 또는 유도체의 용도.