JP2002511880A - アンクロッド−特異的モノクローナル抗体、抗体フラグメント、その混合物または誘導体およびそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アンクロッド−特異的モノクローナル抗体、抗体フラグメント、それらの混合物または誘導体さらにその医薬品中および診断用への使用に関する。本発明はこのような抗体、抗体フラグメント、それらの混合物または誘導体を発現する細胞にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アンクロッド−特異的モノクローナル抗体、 抗体フラグメント、その混合物または誘導体 およびそれらの使用 本発明は、アンクロッド−特異的モノクローナル抗体、抗体フラグメント、そ の混合物または誘導体、およびそれらの医薬品または診断への使用、さらに、こ のような抗体、抗体フラグメント、その混合物または誘導体から成る医薬品に関 する。 さらに、本発明は、このような抗体、抗体フラグメント、その混合物または誘 導体を発現する細胞に関する。 アンクロッド（登録商標：Ａｒｗｉｎ^(R)、Ａｒｖｉｎ^(R)）は、マライ半島に 生息するピットマムシ(Agkistrodon rhodostoma)の毒から得られる酵素である。 アンクロッドは平均分子量が約３８０００であり、抗凝血作用および凝血塊溶解 能力を有する高グリコシル化セリンプロテアーゼである。 一般的な血液凝固はトロンビンによって誘起され、この際トロンビンは、フィ ブリノーゲン分子からフィブリンペプチドＡおよびＢを切り離し、それによりフ ィブリンを形成し、フィブリンは赤血球または血小板に加え、血栓の主成分とな る（ＥＰ−Ｂ−０５５６９ ０６）。トロンビンと異なり、アンクロッドは、フィブリノーゲン分子のα（” Ａ”）鎖中のアルギニン−グリシン結合のみを切断し、フィブリノペプチドＡ、 ＡＰおよびＡＹを遊離させる（Cole等、J．Vascular．Surgery，Vol 17，1993: 288〜292）。フィブリノーゲン分子のβ（Ｂ）鎖はアンクロッドの攻撃を受けな いので遊離しない。アンクロッドが誘起するフィブリノペプチドの切離後に生成 するフラグメント（脱−”Ａ”−フィブリンモノマー）は、最終的に重合して薄 いフィラメントを形成する。得られる典型的な溶解性フィブリンは、内因性プラ スミンによる分解および／または細網内皮（＝ＲＥＳ、単球／マクロファージ系 ）により除去される。得られる分子はトロンビンの基質ではないので、天然フィ ブリンを産生するために、トロンビンによって、脱−”Ａ”−フィブリノーゲン 分子がさらに切断されることはない。 アンクロッドは、用量依存的に血中フィブリノーゲン濃度を減少させる。治療 として誘導および制御した低フィブリノーゲン血症では、血漿粘度および赤血球 の凝集傾向を低下させるので、血液の流動性が著しく向上する。これにより、狭 窄した血管を通る血液の流れをより良い状態にする。最近アンクロッドは、例え ば末梢性動脈血流の慢性障害の治療に使用されており、卒中の臨床試験第ＩＩＩ フェーズの試験中である。 アンクロッドは、有利に皮下注射する。治療は院内 で実施するか、または治療の管理に必要とされるフィブリノーゲン濃度の定期的 検査を確保する場合には、外来患者にも実施される。アンクロッドは静脈内投与 も可能だが、特殊な場合に限り病院の監視下に実施されるべきである。 アンクロッドの用量も、個人別にすべきである。アンックロッドの用量の関数 として、フィブリノーゲン濃度の変化は極めて重要である。この濃度を、血漿１ ００ｍｌあたり７０〜１００ｍｇ（＝治療範囲）まで、徐々に減少させる。フィ ブリノーゲン濃度は、治療期間中を通してこの範囲内に調整されなければならな い。血液の流動性は、この状態で申し分ない。治療は通常３〜４週間継続させる が、もし必要であれば、この期間を越えて延長することも可能である。 皮下投与の場合、初めの４日間は毎日７０I.U．（＝国際単位、１ｍｌ）を投 与し、５日以降はフィブリノーゲン濃度の変化に応じて７０〜１４０I.U.を投与 する。フィブリノーゲン濃度が治療範囲内であれば、週に２〜３回、２１０〜２ ８０I.U.を単回注入する。 静脈内注入の場合は、最初に８時間かけて体重１ｋｇあたり２〜３I.U.を投与 する。次のアンクロッド投与量は、達成されたフィブリノーゲン濃度によって決 定する。一般的には、さらに体重１ｋｇあたり１I.U.を１２時間毎にゆっくり投 与すれば十分である。 循環系におけるアクロッドの初回半減期は約３〜５ 時間であるが、濃度の減少に従って緩慢になり、一般的に、投与したアンクロッ ドの９０％が排泄されていると考えられる約４日後には、この半減期が９〜１２ 日に延長している。 ヘパリンおよびワルファリンと異なり、アンクロッドは治療中に非特異的出血 障害をほとんど起こさないが（Z.S.Latallo，”Retrospective Study on Compli cations and Adverse Effects of Treatment with Thrombin-like Enzymes‐A M ulticenter Trial”,Thromb．Haemostasis，50(1983)604〜609参照）、このよう な出血に対する特別な処置は必要かつ望ましい。 アンクロッドによる治療が禁忌なのは、例えば、出血性素質、術後および出産 後に起こる傷口からの出血の危険性、潰瘍性腸管障害、新生物、管理困難な高血 圧、急性脳梗塞および活性肺結核症、ＲＥＳ機能障害および血餅分解の障害、い わゆる高熱、重症の肝障害、明確かつ切迫したショック状態または妊娠である。 前記のように、治療期間中のフィブリノーゲン濃度の減少が緩慢であり、かつ ７０〜１００ｍｇ／ｍｌに調整されている場合には、アンクロッドによる出血の 危険性は比較的少ない。潜在的な出血傾向を伴う患者、たとえば腎結石または腎 不全の患者は、特に慎重に管理されなければならない。その他の薬物を動脈性穿 刺および筋肉内注射することは避けるべきである。同時に、ＲＥＳ−阻害剤およ び潰瘍性疾患治療薬、抗凝 血薬、抗繊維素溶解剤、血栓溶解剤および血小板凝集を阻害する薬物の投与、お よびアンクロッドの筋肉内投与にも注意が必要である。筋肉からの吸収は、一般 的に非常に速やかであるので、過剰の脱−”Ａ”−フィブリンモノマーが流出し 、血栓塞栓合併症の危険性を生じる。 予め血栓溶解剤による治療を実施せずにアンクロッドを投与した４２９例の患 者を試験したところ、出血事例の合計は、９.８％（内出血４.２％、外出血５. ６％）であった（Crit．Rev．Oncol．Hematol．15(1993)23〜33）。 近年、アンクロッド酵素活性の中和に使用されるのは、ヤギ血清から得た免疫 グロブリンの製剤を基本とする解毒薬である（Knoll AG公表、1983年6月、商標 Ａｒｗｉｎ^(R)）。ポリクローナル抗体から成るこの解毒薬は、重症出血性合併 症または事故による負傷に関してあるいは緊急外科治療が原因となって出血の危 険性が増加するような場合に使用される。アンクロッドを中和してからヒトフィ ブリノーゲン４〜５ｇを投与すべきである。予め解毒薬でアンクロッドを中和す ることなくヒトフィブリノーゲン、血漿または血液を投与すると、急性播種性凝 集を起こす危険性が生じる。 Ｓｔｏｃｋｅｒ等（Thrombosis Research,Vol．6,1975:189〜194）は、Ａｒｗ ｉｎ^(R)単独およびポリクローナル解毒薬存在下における血餅形成について調査 し 、解毒薬の効果を実証した。 ヤギから得たポリクローナル抗体の使用に加え、ＥＰ−Ｂ−０３９５３７５、 ＥＰ−Ｂ−０５５６９０６およびＢｕｒｋｈａｒｄｔ等の文献（FEBS,Vol297，N o.3,1992;297〜301）には、アンクロッド遺伝子の発現を検出するためのモノク ローナルまたはポリクローナル抗体、アンクロッドを使用して血中のフィブリノ ーゲンを検出するためのモノクローナルまたはポリクローナル抗体およびアンク ロッド抗体またはアンクロッド抗体を使用したアンクロッドの精製に関する記載 がある。 アンクロッドの解毒薬として使用されるヤギポリクローナル抗体の不利点は、 多くの抗体の混合物であること、その多くがアンクロッド−中和作用を有しない ことである。このように異種抗体が数多く存在すると急速に免疫応答が誘起され 、さらに、アンクロッド−中和能力をかなり低下させる。加えて、この解毒薬は アンクロッドに対して多様な親和性を有する抗体から成る。ポリクローナル抗体 は動物から獲得されるので、標準化が困難で、これは異なる製造バッチによって 、性質が変化することを意味する。 本発明の課題は、上記のような問題点を克服し、かつ工業的な製造が容易であ るようなアンクロッドの解毒薬を開発することである。 この課題が、アンクロッドと結合してその活性を阻 害する新規モノクローナル抗体、抗体フラグメント、それらの混合物によって達 成されることが見出され、ここでその結合親和性は１×１０^-7〜１×１０^-12Ｍ であり、in vivoにおいて、ヤギポリクローナル抗体と比べ、中和作用が少なく とも１００％向上している。 アンクロッドの解毒薬として使用されるこの新規抗体は有利に多くの向上した 特性を有する。たとえば、一つの抗体または一つの抗体サブクラスから成り、異 なる製造物間で性質が変化することのない、均一かつよく特徴づけられた製品を 製造できる。 新規抗体は、要求量に応じて生産でき、動物体内で製造しないので、製品がウ イルスまたはバクテリアによる汚染の危険性を伴わない。この新規抗体、抗体フ ラグメント、その混合物または誘導体はエピトープ特異的であり、高い結合能力 および中和作用を有する。それ故、治療には少量の投与でよい。高い結合性およ び中和能力のために、より少量で使用できると共に、この生成物の均一性は、患 者の免疫応答の危険性を著しく低下させる。種々の抗体、抗体フラグメントまた は誘導体において、ポリクローナル抗体が有するような結合および中和活性の変 動は見られない。アンクロッドの異なるエピトープに結合する種々のモノクロー ナル抗体、抗体フラグメントまたは誘導体の混合物は、アンクロッドの中和活性 を非常に効果的にする。 この新規抗体、抗体フラグメント、それらの混合物 または誘導体は、有利に１×１０^-7〜１×１０^-12範囲、更に有利に１×１０^-8 〜1×１０^-11、特に有利に１×１０^-9〜５×１０^-10Ｍの対アンクロッド結合能 を有する。 この新規解毒薬は、in vivoにおいて、ヤギポリクローナル抗体より少なくと も１００％、有利に２５０％、特に有利に５００％優れたアンクロッド−中和作 用を有する。このモノクローナル抗体は、in vitroにおいてもポリクローナル抗 体よりも明らかに強力な効果を示す。 新規モノクローナル抗体またはそのフラグメントとは、主にＩｇＭ、ＩｇＧ、 ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡのような全ての免疫グロブリンクラスまたはＩｇＧサブ クラスのような免疫グロブリンサブクラスまたはそれらの混合物を意味する。Ｉ ｇＧおよびそのサブクラス、例えばＩｇＧ₁、ＩｇＧ₂、ＩｇＧ_2a、ＩｇＧ_2b、Ｉ ｇＧ₃またはＩｇＧ_Mが有利である。ＩｇＧサブタイプＩｇＧ_1/kおよびＩｇＧ_{2b/ k} は特に有利である。前記のフラグメントは、アンクロッドに対する高結合性お よび高中和作用を有する抗原−補足的結合部位をひとつまたはふたつ有するすべ ての短縮型または修飾型抗体フラグメントであり、例えば抗体と同様でありかつ 軽鎖および重鎖から成る結合部位を有する抗体の一部分であり、たとえばＦｖ、 ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）₂フラグメント、または単鎖フラグメントである。Ｆ ｖ 、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）₂のような短縮型２本鎖フラグメントが有利である 。これらのフラグメントは、たとえば、抗体のＦｃ部をパパインまたはペプシン のような酵素で切断する酵素法、化学的酸化、または抗体遺伝子の遺伝子操作に より獲得できる。遺伝子操作した非−短縮型フラグメントを使用することが可能 かつ有利である。 この抗体またはフラグメントは、単独または混合物で使用できる。 たとえば、ハイブリドーマ細胞から、当業者に公知の方法で、遺伝子操作のた めの抗体遺伝子を単離できる。この目的のために、抗体−産生細胞を培養し、細 胞の光学濃度が十分な時にグアニジウムチオシアネートで細胞を分解し、酢酸ナ トリウムで酸化し、フェノールおよびクロロホルム／イソアミルアルコールで抽 出し、イソプロパノールで沈澱させ、エタノールで洗浄するという公知の方法で 細胞からｍＲＮＡを単離する。次いで逆転写酵素を用いてｍＲＮＡからｃＤＮＡ を合成する。合成ｃＤＮＡを、直接または位置指定突然変異誘発、挿入誘発、逆 位、欠失または塩基交換のような遺伝子操作後に、適当な動物、菌体、バクテリ アまたはウイルスベクター中へと挿入し、相当するホスト有機体中で発現させる 。遺伝子のクローニングには、バクテリアベクターまたはイーストベクター、た とえばｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８／１９、ｐＡＣＹＣ １８４、ラムダまたはイーストミューベクターが有利であり、大腸菌のようなバ クテリアまたはサッカロミセスセレビシエのようなイースト中で発現させる。 本発明はさらにこの新規抗体を合成する細胞に関する。この細胞は、上記のよ うな形質転換後の動物、菌体、バクテリア細胞またはイースト細胞である。これ らは有利にハイブリドーマ細胞またはトリオーマ細胞であり、特に有利にハイブ リドーマ細胞である。これらのハイブリドーマ細胞はアンクロッドで免疫した動 物から公知の方法で製造でき、抗体−産生Ｂ細胞の単離、アンクロッド結合性抗 体を産生する細胞の選択および続くそれらの細胞とマウス骨髄腫細胞、ヒトリン パ芽球細胞のようなヒトまたは動物細胞またはヘテロハイブリドーマ細胞(Koehl we等、Nature256,1975:496)との融合、あるいはこれらの細胞を適当なウイルス と感染させて不死化細胞にすることにより、製造する。ハイブリドーマ細胞は融 合によって製造することが有利であり、マウスのハイブリドーマ細胞が特に有利 であり、Ｍａｂ１−２、Ｍａｂ２−２９／３、Ｍａｂ３−２７を分泌し、ＤＳＭ ＡＣＣ２３１７、ＤＳＭＡＣＣ２３１８およびＤＳＭＡＣＣ２３１９という寄託 番号でＤＳＭＺ（Deutshe Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen i n Braunschweig）へ寄託されたハイブリドーマ細胞株が非常に有利である。 前記ハイブリドーマ細胞株は特に有利にＩｇＧ型の 抗体を分泌する。形成される抗体Ｍａｂ１−２、Ｍａｂ２−２９／３、Ｍａｂ３ −２７は、ＩｇＧサブタイプ、すなわちＩｇＧ_1/k、ＩｇＧ_2b/kおよびＩｇＧ_1/k である。これらの有利な抗体がアンクロッド分子の異なるエピトープと結合する ことは、抗体間での抗体の競合的結合に関する実験により示された。抗体Ｍａｂ １−２のエピトープに対する結合は特に有利であり、アンクロッド分子に対する 最高の中和作用をもたらし、その結果、酵素活性の中和には最少量の抗体で十分 である。このモノクローナル抗体は、通常出血の治療に使用され、ヤギから得ら れるポリクローナル抗体を元に、解毒薬としてＫｎｏｌｌＡＧ（Ludwigshafen） から市販されている解毒薬と比べて、顕著に優れた中和作用を有する。 ここで述べる新規モノクローナル抗体の誘導体はペプチド、抗体の抗原−結合 部位由来のペプチド類似物質および液体あるいは固体の担体と結合した抗体、フ ラグメントまたはペプチドであり、担体にはポリエチレングリコール、ガラス、 合成ポリマー、例えばポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポ リエチレンまたは天然ポリマー、例えばセルロース、セファロースあるいはアガ ロース、または共役酵素、毒素または３Ｈ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３ ２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃ１、５７Ｃ０、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、 ９０Ｙ、９９ｍＴｃ、７５ Ｓｅのような放射性または非放射性のマーカー、またはローダミン、フルオレセ イン、イソチオシアネート、藻紅素、藻青紫、フルオレスキャミン、金属キレー ト、アビジン、ストレプトアビジンまたはビオチンのような蛍光／化学発光標識 物に共有結合した抗体、フラグメントまたはペプチドがある。 この新規抗体、抗体フラグメント、その混合物および誘導体は、医薬品の製造 にそのまま使用できるし、凍結乾燥のような乾燥後、前記担体への担持後、その 他の製薬学的活性物質および補助物質との配合後に使用できる。前記の活性物質 および補助物質の例には、その他の抗体、殺菌作用または微生物静学的作用を有 する抗菌活性物質、たとえば一般的な抗生物質またはスルホンアミド、抗ガン剤 、水、緩衝液、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックス、不活担体またはその 他の非経口に適用される慣用の物質、たとえば、アミノ酸、増粘剤または糖があ る。これらの医薬品は疾患の制御、有利に凝血障害、特に有利に末梢血液系障害 、または卒中の制御に使用される。 この新規解毒薬は経口または非経口−皮下、筋肉内、静脈内または腹腔内−投 与が可能であり、筋肉内投与または静脈内投与が有利である。 この新規抗体、抗体フラグメント、その混合物または誘導体はそのままで、ま たは前記の固体や液体の担体、酵素、毒素、放射線または非放射線標識物、蛍光 ／化学発光標識物との結合後に、診断に使用できる。この時アンクロッドは、ヒ トや動物のような様々な有機体から得られた体液の大部分またはイースト、バク テリア、菌体を含む培地のような液体またはヒトや動物の培養細胞の多くで検出 される。 実施例 １. ハイブリドーマ細胞株の調整 免疫化、融合、選択および特徴付けを文献に記載される技術に基づいて実施し た（例、J.H.Peters;Monoklonale Antikoerper，Herstellung und Charakterisi erung;Springer Verlag;A.M．Campbell;Monoclonal Antibody and Immunosensor Thchnology;Elsevier出版、2〜7および8章、1991）。 架橋により酵素活性を不活化したアンクロッド１００μｇをメスのBalb／cマ ウスに腹腔内投与し、以下に示す投与計画に従って、２〜３週間の周期で免疫し た： １.ＰＢＳ１００μｌ＋フロイント完全アジュバント１００μｌ中 ２.ＰＢＳ１００μｌ＋フロイント不完全アジュバント１００μｌ中 ３〜５.ＰＢＳ２００μｌ中 最終抗体接種から３日後に脾臓を摘出し、細胞を洗浄して単離し、リンパ球を 骨髄腫瘍細胞株ＳＰ２／０−Ａｇ１４（＝ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８１）と融合 させた。この操作は、これらを５：１の割合で混合し、ＰＥＧ溶液（＝ポリエチ レングリコール溶液）１.５ｍｌと３７℃で１分間インキュベートし、ＰＢＳ（ リン酸緩衝液）と混合する（３０秒間で１ｍｌ、３０秒間で３ｍｌ、６０秒間で １６ｍｌ）ことにより実施した。洗浄工程後、細胞を選択培地[ＤＭＥＭ(＝Dulb ecco's Eagle Modified Medium、ダルベッコの修飾イーグル培地)；１０％ＦＣ Ｓ(＝fetal calf serum、ウシ胎仔血清)；１０％Condimed H1(ベーリンガーマン ハイム社製)；ＨＡＴ補足(＝ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン補足) ；ＩＴＳ補足(＝インシュリン、トランスフェリン、セレナイト補足)；ピルビン 酸；グルタミン；ストレストマイシン／ペニシリン]中、３７℃／７．５％ＣＯ₂ で培養した。 抗−アンクロッド抗体を特異的に産生するハイブリドーマを、以下のマイクロ タイタープレートを使用した特異的ＥＬＩＺＡ法により同定した： −アンクロッドまたは対照タンパク０.１ｍｌ／ウェルでマイクロタイタープレ ートをコートし、４℃で１６時間かけて特異性(１μｇ／ｍｌ ０.０５Ｍ Ｎａ ＨＣＯ₃ ｐＨ９.２)を測定する。 −１％ＢＳＡ／ＰＢＳ０.３ｍｌ／ウェルにより、２３℃で０.５〜１ｈ（ｈ＝時 間）かけて飽和する。 −ＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ^(R)２０で３回洗浄する。 −細胞培養上清（ＰＢＳ／０.１％ＢＳＡ[＝子牛血清アルブミン]／０.０５％Ｔ ｗｅｅｎ^(R)２０ ５０μｌで希釈した上清５０μｌ）と共に２３℃で２〜４ｈ インキュベートする。 −前記と同様に洗浄する。 −０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のビオチン標識抗−マウスＩｇＧ抗体０.１ｍｌ／ウ ェルと共に、２３℃で２〜４ｈインキュベートする。 −前記と同様にして洗浄する。 −０.１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中のストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ錯体０.１ ｍｌ／ウェルと共に、２３℃で０.５ｈインキュベートする。 −前記と同様にして洗浄する。 −ペルオキシダーゼ基質０.１ｍｌ／ウェルを添加する。 −２Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄０.１ｍｌ／ウェルを添加して反応を停止させる。 −４５０ｎｍでの吸光度を測定する。 ペルオキシダーゼ基質：ＴＭＢ溶液(ＤＭＳＯ中の４２ｍＭテトラメチルベン ジジン)０.１ｍｌと基質緩衝液（０.１Ｍ酢酸ナトリウム ｐＨ４.９）１０ｍｌ とを混合し、Ｈ₂Ｏ₂１４.７μｌを添加する。 抗体反応に陽性であったハイブリドーマを、サブクローニングにより単離し、 個々のクローンについて再試した。最も高い活性を示す抗体をin vitroでの中和 アッセーに使用した。この方法により大量の陽性ハイブリドーマ、すなわちアン クロッドに対する抗体を産生する細胞、を単離できた。 ２. モノクロナール抗体の製造および特徴付け モノクローナル抗体を、血清−不含の細胞培養上清から精製した。この操作は 、ＤＭＥＭ／ＨＡＴ／１０％ＦＣＳ培地からＤＭＥＭ／ＨＴ／１０％ＦＣＳおよ びＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳを経由して、血清−不含の細胞培養培地（ＨＴ＝ヒポ キサンチン、アミノプテリン）、たとえばＳＦ−３（Cytogen社製）、ＰＦＨＭ −ＩＩ（Gibco社製）、ＨＬ−１（Bio Whittaker社製）、ウルトラドーマＰＦ（ Bio Whittaker社製）またはその類似品中へ漸次的にハイブリドーマをトランス ファーすることにより実施した。続くアフィニテイークロマトグラフィーによる 精製には、プロテインＡ−セファロースおよびプロテインＧ−セファロースを使 用した。 細胞培養上清をクロマトグラフィーのカラムに担持した後、非特異的な結合タ ンパクを３ＭＮａＣｌ／１.５Ｍグリシン ｐＨ８.９で洗い流した;抗−アンク ロッド抗体反応物を５００ｍＭＮａＣｌ／０．５９％酢酸で抽出した。 抗体サブタイプを前記記載と同様のＥＬＩＺＡ法により測定したが、ここでは ビオチン標識抗−マウスＩｇＧ抗体の代わりに、以下のビオチン標識サブタイプ 特異的抗体を使用した：抗−マウスＩｇＧ₁、抗−マウスＩｇＭ、抗−マウスＩ ｇＧ_2a、抗−マウスｋ、抗−マウスＩｇＧ_2b、抗−マウスλおよび抗−マウスＩ ｇＧ₃。 単離したハイブリドーマ細胞株の抗体タイプおよびサブタイプＭａｂ１−２， Ｍａｂ２−２９／３およびＭａｂ３−２７（実施例１参照）がそれぞれＩｇＧ_{1/ k} 、ＩｇＧ_2b/kおよびＩｇＧ_1/kであることを確認した。 モノクローナル抗体の親和性不変部は、平衡透析法、免疫沈降法またはＥＬＩ ＺＡ法のような文献に記載される様々な技術により測定される（例，J.H．Peter s;Monoklonale Antikoerper，Herstellung und Charakterisierung;Springer Ve rlag;A.M．Campbell;Monoclonal Antibody and Immunosensor Technology;Verla g Elsevier，第１１章、1991）。 ＥＬＩＺＡ法（J．Immunol．Methods 77(1985)305〜319）によれば、天然アン クロッドに対して以下のような親和性を有する（表Ｉ）： 表Ｉ：アンクロッドに対するモノクローナル抗体の親和性 ３. モノクローナル抗体（＝Ｍａｂｓ）細胞培養上清 による"in vitro"でのアンクロッドの中和。 抗体の中和能力を、アンクロッド−誘導性フィブリンの濁度により定量した。 この方法は、ＢＳＡ−飽和マイクロタイタープレート中で様々な濃度比のアンク ロッドおよび抗体（細胞培養上清または精製抗体）を３７℃でインキュベートし 、次いでヒトフィブリノーゲン（１.５ｍｇ）を添加することにより実施した。 ３７℃でインキュベートした後、生成したフィブリンを３４０ｎｍ（＝光学濃度 ＝ＯＤ）で定量した。アンクロッド活性は、中和用抗体の量の増加に伴って中和 された。このことは、光学濃度（＝ＯＤ、表ＩＩ）の減少によって示された。 抗体Ｍａｂ１−２は特に効果的で、アンクロッド濃度が比較的高い場合でも完 全に中和した（表ＩＩＩ、ブランク値に対応したＯＤ）。表ＩＩのブランクは、 アンクロッド以外の全ての構成成分を含有する。どのようなアンクロッド量（５ ０、２５、および１２.５ｎｇ／ｍｌ）の場合でも、各アンクロッド抗体の添加 のない時に最高のＯＤ値が測定された（表ＩＩ）。 Ｍａｂ２−２９および３−２７は、アンクロッドに対して、Ｍａｂ１−２と同 様もしくはより優れた親和性を有するが、抗体量がアンクロッド量を上回る場合 にのみ、抗体−抗原結合による酵素活性の中和が起きた。 表ＩＩ：Ｍａｂの細胞培養上清によるアンクロッド の中和： ４．精製モノクローナル抗体による"in vitro"でのアンクロッドの中和。 フィブリン濁度分析（turbidity assay）における５０％中和値との比較によ り、精製モノクローナル抗体のin vitro中和効果を評価できた。 ５０％中和値を以下のようにして得た： ＯＤネガティブコントロール＋（ＯＤポジティブコントロール−ＯＤネガティ ブコントロール）／２ ネガティブコントロール：アンクロッド添加なし（フィブリンが形成されない） ポジティブコントロール：アンクロッド＋フィブリノーゲン（最高のフィブリン 形成） 異なる抗体／アンクロッド比はＯＤ値を変動させ、５０％中和値は以下の抗体 濃度で達成された： 選択したin vitro条件下において、５０％中和するのに必要な抗体量の比から 、モノクローナル抗体Ｍａｂ１−２がヤギポリクローナル抗体を基本とした解毒 薬と比較して、１時間プレインキューベーションした場合には少なくとも２倍有 効な、および２時間プレインキュベーションした場合には約４倍有効なファクタ ーであることが導かれた。 ５．サンドイッチＥＬＩＺＡ法によるアンクロッドの定量 以下のようなスキームに沿って、２種類の抗体を組み合わせたサンドイッチＥ ＬＩＺＡ法により、診断用、たとえば体液などのサンプル中で、アンクロッドを 測定した： ―５μｇ／ｍｌＭａｂ１−２またはＭａｂ３−２７１００μｌ／ウェルでマイク ロタイタープレートをコートする、０.０５ＭＮａＨＣＯ₃で希釈する、ｐＨ９_. ２；４℃で一晩。 ―マイクロタイタープレートをＰＢＳ／０.０５％Ｔ ｗｅｅｎ２０^(R)で洗浄する；２００μｌ／ウェル。 ―１％ＢＳＡ／ＰＢＳ３００ｍｌ／ウェルで飽和する；２３℃で０.５時間。 ―前期と同様に洗浄する。 ―ＰＢＳ／０.１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ^(R)２０中のアンクロッド５０ ｎｇ／μｌを出発物質とした２倍希釈の標準液１１個；１００μｌ／ウェル；サ ンプルは様々な希釈で同時に使用する；２３℃で２時間インキュベートする。 ―前期と同様に洗浄する。 ―Ｍａｂ２−２９と共にインキュベートする；ＰＢＳ／０.１％ＢＳＡ／０.０５ ％Ｔｗｅｅｎ^(R)２０で希釈して１μｇ／ｍｌとする；１００μｌ／ウェル；２ ３℃で２時間。 ―前期と同様に洗浄する。 ―ビオチン標識抗―マウスＩｇＧ_2bと共にインキュベートする；ＰＢＳ／０.１ ％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ^(R)２０で１：１００００に希釈する；１００μ ｌ／ウェル；２３℃２時間。 ―前期と同様に洗浄する。 ―ストレプトアビジン―ペルオキシダーゼ錯体でインキュベートする；ＰＢＳ／ ０.１％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ^(R)２０で１：１００００に希釈する；１ ００μｌ／ウェル；２３℃で０.５時間。 ―前期と同様に洗浄する。 ―ペルオキシダーゼ基質１００μｌ／ウェルを添加する：（基質緩衝液（０.１ Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４.９）１０ｍｌとＴＭＢ溶液（ＤＭＳＯ中の４２ｍＭテ トラメチルベンジジン）１００μｌとを混合し、３％Ｈ₂Ｏ₂１４.７μｌを添加 したもの）。 ―２Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄１００μｌ／ウェルを添加して反応を停止させる。 ―４５０ｎｍでの吸光度を測定する。 Ｍａｂ１−２とＭａｂ３−２７、およびそれらの組み合わせで使用したいずれ の場合においても、アンクロッドは約３０００から１００ｐｇ／ｍｌの濃度範囲 で定量かつ検出の可能なことが判明した。絶対的検出限界は、このような定量可 能域よりも低い部分である（図１）。 ６．競合ＥＬＩＺＡ法 競合ＥＬＩＺＡは、アンクロッド上のＭａｂ結合エピトープの相対的位置を特 定するために実施する。 ―１μｇ／ｍｌアンクロッド１００μｌ／ウェルでマイクロタイタープレートを コートする、０.０５ＭＮａＨＣＯ₃で希釈する、ｐＨ９.２；４℃で一晩。 ―ＰＢＳ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ^(R)２０でマイクロタイタープレートを洗浄する ；２００μｌ／ウェル。 ―１％ＢＳＡ／ＰＢＳ３００μｌ／ウェルで飽和する；２３℃で０.５時間。 ―前期と同様に洗浄する。 ―各ビオチン標識モノクローナル抗体、Ｍａｂ１−２−ビオチン、Ｍａｂ３−２ ９／３−ビオチンおよびＭａｂ３−２７−ビオチン１０ｎｇ／ｍｌを様々に混合 して、このように準備したマイクロタイタープレート中に添加し、アンクロッド と結合させ、次いで、各々に異なる抗体（Ｍａｂ１−２、Ｍｑｂ２−２９／３ま たはＭａｂ３−２７）を初期抗体に依存した様々な濃度（１μｇ／ｍｌ〜１ｎｇ ／ｍｌ）で混合し、これにより、考え得る全ての組合せで、結合部位の重複を試 験した。様々な抗体を組み合わせた混合物をＰＢＳ／０.１％ＢＳＡ／０.０５％ Ｔｗｅｅｎ^(R)２０中で２３℃で２時間インキュベートし、以下のように試験し た： ―前期と同様に洗浄する。 ―ストレプトアビジン―ペルオキシダーゼ錯体でインキュベート、ＰＢＳ／０. １％ＢＳＡ／０.０５％Ｔｗｅｅｎ^(R)２０で１：１００００に希釈する；１００ μｌ／ウェル；２３℃で０.５時間。 ―前期と同様に洗浄する。 ―ペルオキシダーゼ基質１００μｌ／ウェルを添加する：（基質緩衝液（０.１ Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ４.９）１０ｍｌとＴＭＢ溶液（ＤＭＳＯ中の４２ｍＭテ トラメチルベンジジン）１００μｌとを混合し、３％Ｈ₂Ｏ₂１４.７μｌを添加 したもの）。 ―２Ｍ Ｈ₂ＳＯ₄１００μｌ／ウェルを添加して反応 を停止させる。 ―４５０ｎｍでの吸光度を測定する。 どの抗体を組み合わせて使用してもＯＤの減少が観察されなかったことは、種 々のモノクローナル抗体がアンクロッドと結合する際に、互いに置換し合わない ことを意味する。モノクローナル抗体は、アンクロッド分子上で別々のエピトー プと結合する。それ故、ひとつ以上の抗体が同時にアンクロッドに対して相互作 用することができる。故に、必要かつ要求があれば、アンクロッドの作用を迅速 かつ最適に中和するのに、様々なモノクローナル抗体を組み合わせて使用できる 。 ４．In vivoでのアンクロッドの中和 麻酔ラットに、体重１ｋｇあたり１０ＩＵのアンクロッドを、しっぼの血管か ら３０分かけて注入投与した。アンクロッドの注入開始後１０分で、様々な試験 物質―モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはプラセボーを体重１ｋｇ あたり１ｍｌの静脈用ボーラスとして投与した。アンクロッド注入開始前、３０ 分後および６０分後に、頚動脈から血液サンプル(血液８vo1.＋０.１１Ｍクエン 酸抗凝血薬２vol.)を採取した。遠心により、クエン酸処理した血液から血漿を 得、クラウスの抗凝固法(Clauss coagulation method)によってフィブリノーゲ ン含量を測定した（予め決定した量のラットフィブリノーゲンをフィブリノーゲ ン−不含の血漿中へ添加することによってキャリブレーションプロットを得た） 。 各群（試験物質）毎に６匹のラットを使用した（表ＩＩＩ）。 表ＩＩＩ：試験物質および使用量。 表ＩＶ：様々な抗体によるフィブリノーゲン濃度の測定。 Ｍａｂ１−２を体重１ｋｇあたり１.４３５ｍｇの濃度で使用した場合、アン クロッド注入開始３０分後に、フィブリノーゲンレベルがさらに減少するのをく い止めることが可能である。ヤギポリクローナル抗体で同様の効果を得るには体 重１ｋｇあたり８.６ｍｇ必要である。すなわちＭａｂ１−２と比較しやすいよ うに、体重１ｋｇあたり１.５ｍｇ濃度とした場合には、ポリクローナル抗体を 基本とした解毒薬は何の効果も示さない（表ＩＶのコントロール参照）。 ６０分後のフィブリノーゲン濃度の結果に着目する と、試験条件下のＭａｂ１−２によるin vivoでの中和が、ポリクローナル解毒 薬と比較して約６倍優れたファクターであると言うことができる。Ｍａｂ１−２ の中和効果は、明らかに、より優れていると思われる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/573 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＵ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＧＥ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＴ，ＬＶ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 1. 結合親和性が１×１０^-7〜１×１０^-12Ｍの範囲であり、ヤギポリクロー ナル抗体と比較して少なくとも１００％向上した中和作用を有することを特徴と する、アンクロッドと結合してその活性を阻害するモノクローナル抗体、抗体フ ラグメント、それらの混合物または誘導体。 2. 抗体がＩｇＧ型である、請求項１記載のモノクローナル抗体、抗体フラグ メント、それらの混合物または誘導体。 3. 抗体がＭａｂ１−２、Ｍａｂ２−２９／３またはＭａｂ３−２７またはそ の混合物である、請求項１記載のモノクローナル抗体、抗体フラグメント、それ らの混合物または誘導体。 4. 請求項１から３までのいずれか１項記載のモノクローナル抗体、抗体フラ グメント、それらの混合物または誘導体を発現する細胞。 5. ハイブリドーマ細胞株である、請求項４記載の細胞。 6. ハイブリドーマ細胞株がＤＳＭＡＣＣ２３１７、ＤＳＭＡＣＣ２３１８お よびＤＳＭＡＣＣ２３１９である、請求項４または５記載の細胞。 7. 請求項１から３までのいずれか１項記載のモノクローナル抗体、抗体フラ グメント、それらの混合物 または誘導体から成る、医薬品。 8. 請求項１から３までのいずれか１項記載のモノクローナル抗体、抗体フラ グメント、それらの混合物または誘導体の医薬品中への使用。 9. 凝固障害の治療用組成物を製造するための、請求項１から３までのいずれ か１項記載のモノクローナル抗体、抗体フラグメント、それらの混合物または誘 導体の使用。 10．請求項１から３までのいずれかｌ項記載のモノクローナル抗体、抗体フラ グメント、それらの混合物または誘導体の、診断への使用。