KR19990029104A

KR19990029104A - Trehalose synthase protein and gene, and process for producing trehalose using the same

Info

Publication number: KR19990029104A
Application number: KR1019980002399A
Authority: KR
Inventors: 이광호; 김창겸; 이진호; 전영중; 송은경; 이세영
Original assignee: 손경식; 제일제당 주식회사
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1998-01-26
Publication date: 1999-04-26
Also published as: KR100251392B1

Abstract

본 발명은 말토오스를 트레할로오스로 전환 활성을 나타내는 신규한 트레할로오스 신테이즈 (Trehalose Synthase) 단백질, 이를 암호화한 신규한 유전자, 이 유전자를 포함한 신규한 재조합 플라스미드 및 이 플라스미드로 형질전환된 신규한 대장균에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기된 본 발명의 형질전환 대장균을 이용하여 말토오스로부터 트레할로오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.The present invention provides a novel Trehalose Synthase protein, a novel gene encoding the same, a novel recombinant plasmid containing the gene, and a plasmid transformed with maltose to trehalose. It relates to a novel E. coli. The present invention also relates to a method for preparing trehalose from maltose using the transformed Escherichia coli of the present invention described above.

Description

Trehalose synthase protein and gene, and preparation method of trehalose using same

본 발명의 목적은 말토오스로부터 트레할로오스를 제조하는 방법을 제공하는데 있다. 보다 특정적으로는, 본 발명의 목적은 말토오스를 트레할로오스로 효율적으로 전환시켜줄 수 있는 새로운 효소의 암호화 유전자를 개발하여 이를 유전공학적으로 이용하여 트레할로오스를 경제적이면서 대량으로 생산할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.It is an object of the present invention to provide a method for preparing trehalose from maltose. More specifically, an object of the present invention is to develop a gene encoding a new enzyme capable of efficiently converting maltose to trehalose and to use it genetically to produce trehalose economically and in large quantities. To provide a method.

트레할로오스는 두 분자의 포도당이 α-1,1 결합으로 이루어진 비환원성 이당류 (α-D-글루코피라노실과 α-D-글루코피라노시드)로서 세균, 효모, 식물체에 자연적으로 존재하여 동결, 건조 및 고 삼투압 조건에서 생체막을 보호하는 기능을 가지고 있다. 또한, 비환원성 당질이기 때문에 단백질, 아미노산, 기타 일반 생물제제와 화학반응(갈변화)을 하지 않는 특성을 갖고 있으며 산성에서도 안정하기 때문에 백신, 호르몬, 혈액, 항체 등의 생물제제의 안정성을 높이는 첨가제로써 사용가능하며 식품 건조시나 가공식품 제조시 방향성분(flavor compound)의 잔류량을 증가시켜주며 본래의 신선한 식품특성을 유지시켜주기 때문에 분말우유, 커피, 과일음료, 냉동쥬스 농축액 그리고 야채쥬스 등의 품질을 획기적으로 향상시켜 줄 수 있는 식품 첨가물로서 응용이 가능하다. 이와 같이 의약용, 식품용, 화장품용 등 그 잠재적 응용범위가 대단히 광범위하지만 현재까지는 경제적인 대량생산 방법이 개발되지 않아 가격이 고가이기 때문에 그 사용 용도가 대단히 제약되어 있다.Trehalose is a non-reducing disaccharide (α-D-glucopyranosyl and α-D-glucopyranoside) in which two molecules of glucose are composed of α-1,1 bonds, which are naturally present in bacteria, yeast and plants. It has the function of protecting biofilm under freezing, drying and high osmotic conditions. In addition, it is a non-reducing sugar, which does not chemically react with proteins, amino acids, and other general biologics, and is stable even in acid, so it is an additive that enhances the stability of biologics such as vaccines, hormones, blood, and antibodies. It can be used as food, dry food or processed foods. It increases the amount of flavor compound and maintains the original fresh food characteristics, so the quality of powdered milk, coffee, fruit drink, frozen juice concentrate and vegetable juice It can be applied as a food additive that can significantly improve the. As such, the potential application range of medicine, food, cosmetics, etc. is very wide, but until now economical mass production methods have not been developed, the price is high, so its use is very limited.

종래에 알려진 트레할로오스의 제조방법으로는 미생물균체를 이용하여 효모로부터 추출하여 얻는 방법(일본국특허 공개 평5-91890 및 공개 평6-145186)과 아트로박터속(T. Suzuki, Agric. Biol. Chem., 33(2), 1969), 노카디아속(일본국특허 공개 소50-154485), 마이크로코커스(일본국특허 공개 평6-319578) 및 아미노산 발효균주인 브레비박테리움속(일본국특허 공개 평5-211882)과 같은 미생물의 발효 배양액에서 트레할로오스를 분리 정제하는 방법이 있다. 또한, 포도당을 트레할로오스로 전환하는 세균의 유전자를 식물에 도입한 재조합 식물 이용 방법(M. Scher, Food Processing, April, 95∼96, 1993)등이 있으며 효소를 이용한 방법으로써 말토오스 포스포릴라아제(maltose phosphorylase)와 트레할로오스 포스포릴라아제 (trehalose phosphorylase)를 조합하여 말토오스를 트레할로오스로 변환하는 방법(일본국특허 공개 83-216695)등이 있으나 위 방법들은 모두 수율이 낮거나 공정이 번잡한 단점을 가지고 있다. 이외에 최근 발표된 효소공법으로서 말토올리고실 트레할로오스 신테이즈(maltooligosyl trehalose synthase)와 말토올리고실 트레할로오스 트레할로하이드로레이즈(maltooligosyl trehalose trehalohydrolase)를 사용하여 전분으로부터 트레할로오스를 생산하는 2 단계 효소전환공법(일본국특허 공개 평7-143876 및 EPO 628 630 A2)과 트레할로오스 신테이즈를 이용하여 말토오스로부터 트레할로오스를 직접 생산하는 1 단계 효소전환 공법(일본국특허 공개 평7-170977 및 대한민국특허 공개번호 95-3444)이 있다. 위 두 가지 트레할로오스 제조방법이 경제적인 공법이 되기 위해서는 효소 역가를 극대화하여 가장 경제적인 가격으로 반응시간 및 전이율을 증가시켜 트레할로오스를 생산하는 것이 가장 중요한 해결과제이다.Conventionally known methods for preparing trehalose are obtained by extracting from yeast using microbial cells (Japanese Patent Laid-Open Publication Nos. Hei 5-91890 and Hei 6-145186) and Atrocacter genus (T. Suzuki, Agric) Biol.Chem., 33 (2), 1969), genus Nocadia (Japanese Patent Laid-Open No. 50-154485), Micrococcus (Japanese Patent Laid-Open No. Hei 6-319578), and the genome of the fermented strain Brevibacterium There is a method for separating and purifying trehalose from a fermentation broth of microorganisms such as Japanese Patent Application Laid-open No. Hei 5-211882. In addition, there is a recombinant plant use method (M. Scher, Food Processing, April, 95-96, 1993) which introduces a gene of bacteria that converts glucose into trehalose to plants. Combination of maltose phosphorylase and trehalose phosphorylase converts maltose to trehalose (Japanese Patent Laid-Open No. 83-216695). It has a low or complicated process. In addition to the recently released enzyme technique, maltogosil trehalose synthase and maltooligosyl trehalose trehalohydrolase are used to produce trehalose from starch. A one-step enzyme conversion method for producing trehalose directly from maltose using a two-step enzyme conversion method (JP-A-7-143876 and EPO 628 630 A2) and trehalose synthase Korean Patent Publication No. Hei 7-170977 and Korean Patent Publication No. 95-3444. In order to make these two trehalose manufacturing methods economically, the most important challenge is to produce trehalose by maximizing enzyme titer and increasing reaction time and transfer rate at the most economical price.

본 발명자들은 수년간 토양으로부터 말토오스를 트레할로오스로 전환하는 능력을 가진 미생물을 선별하여 왔으며 그 중 트레할로오스 합성능이 우수하며 기존의 트레할로오스 합성 미생물과는 달리 효소 반응 부산물이 전혀 없는 미생물을 분리 동정하였다. 그 결과 형태학적 특성 및 생리학적 특성상 슈도모나스 스튜트제리종인 것으로 확인하고 이 균주를 슈도모나스 스튜트제리 CJ38로 명명하여 한국종균협회에 1997년 9월 22일에 수탁번호 KFCC-10985로 기탁하였다.The present inventors have been screening microorganisms that have the ability to convert maltose to trehalose from soil for many years, among which the trehalose synthesis ability is excellent and there is no enzymatic reaction by-product, unlike the conventional trehalose synthesis microorganisms. Microorganisms were isolated and identified. As a result, the morphological and physiological characteristics were confirmed to be Pseudomonas studgerii species, and this strain was named Pseudomonas studgeri CJ38 and deposited with the Korean spawn association on September 22, 1997 as accession number KFCC-10985.

본 발명자들은 트레할로오스 신테이즈 효소를 대량 발현하기 위하여 슈도모나스 스튜트제리 CJ38 (KFCC-10985)로부터 염색체를 분리하여 제한효소인 Sau3AI과 공지된 벡터 pUC18을 이용하여 트레할로오스 신테이즈 유전자를 클로닝하고 이 유전자의 염기서열을 분석한 결과 유전자의 염기서열 및 이로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열이 지금까지 공지되어 있는 것과는 상이한 새로운 유전자 및 단백질임을 확인하고, 그 유전자를 적절한 벡터와 숙주로서 대장균을 통해 트레할로오스 신테이즈 효소를 대량 생산할 수 있음으로써 본 발명을 완성하였다.The present inventors isolated the chromosome from Pseudomonas steg Jerry CJ38 (KFCC-10985) to express the trehalose synthase enzyme in large quantities, and used the restriction enzyme Sau3AI and the known vector pUC18 to synthesize the trehalose synthase gene. Cloning and analysis of the nucleotide sequence of this gene confirmed that the nucleotide sequence of the gene and the amino acid sequence of the protein expressed therefrom are new genes and proteins that are different from what is known so far, and that the gene is identified as an appropriate vector and host. The present invention was completed by mass production of trehalose synthase enzyme.

도 1은 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pCJ104내 4.7kb Sau3AI 절편의 DNA 염기서열 및 이로부터 발현된 본 발명에 따른 트레할로오스 신테이즈 단백질의 아미노산 서열을 보여준다.1 shows the DNA sequence of a 4.7 kb Sau3AI fragment in the recombinant plasmid pCJ104 according to the present invention and the amino acid sequence of the trehalose synthase protein according to the present invention expressed therefrom.

도 2는 본 발명에 따른 트레할로오스 신테이즈 유전자를 포함한 신규한 재조합 플라스미드 pCJ104의 작제도이다.2 is a schematic of a novel recombinant plasmid pCJ104 comprising a trehalose synthase gene according to the present invention.

도 3은 본 발명의 신규한 재조합 플라스미드 pCJ104내 4.7kb Sau3AI 절편의 제한효소 지도를 나타낸 것이다.Figure 3 shows a restriction map of 4.7 kb Sau3AI fragment in the novel recombinant plasmid pCJ104 of the present invention.

도 4는 말토오스를 함유한 맥콘키(MacConkey) 한천 배지에서 본 발명의 재조합 플라스미드 pCJ104 및 대조 플라스미드 pUC18을 각각 함유한 대장균 ATCC 35467 균주의 군락색깔을 나타낸 것이다.Figure 4 shows the colony color of the E. coli ATCC 35467 strain containing the recombinant plasmid pCJ104 and the control plasmid pUC18 of the present invention in MacConkey agar medium containing maltose, respectively.

도 5는 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pCJ122의 작제도이다.5 is a schematic of recombinant plasmid pCJ122 according to the present invention.

본 발명은 하기의 아미노산 서열을 갖는 신규한 트레할로오스 신테이즈 단백질에 관한 것이다:The present invention relates to novel trehalose synthase proteins having the following amino acid sequences:

M S I P D N T Y I E W L V S Q S M L H A A R E R S R H Y A G Q A R L W QM S I P D N T Y I E W L V S Q S M L H A A R E R S R H Y A G Q A R L W Q

R P Y A Q A R P R D A S A I A S V W F T A Y P A A I I T P E G G T V L ER P Y A Q A R P R D A S A I A S V W F T A Y P A A I I T P E G G T V L E

A L G D D R L W S A L S E L G V Q G I H N G P M K R S G G L R G R E F TA L G D D R L W S A L S E L G V Q G I H N G P M K R S G G L R G R E F T

P T I D G N F D R I S F D I D P S L G T E E Q M L Q L S R V A A A H N AP T I D G N F D R I S F D I D P S L G T E E Q M L Q L S R V A A A H N A

I V I D D I V P A H T G K G A D F R L A E M A Y G D Y P G L Y H M V E II V I D D I V P A H T G K G A D F R L A E M A Y G D Y P G L Y H M V E I

R E E D W E L L P E V P A G R D S V N L L P P V V D R L K E K H Y I V GR E E D W E L L P E V P A G R D S V N L L P P V V D R L K E K H Y I V G

Q L Q R V I F F E P G I K D T D W S V T G E V T G V D G K V R R W V Y LQ L Q R V I F F E P G I K D T D W S V T G E V T G V D G K V R R W V Y L

H Y F K E G Q P S L N W L D P T F A A Q Q L I I G D A L H A I D V T G AH Y F K E G Q P S L N W L D P T F A A Q Q L I I G D A L H A I D V T G A

R V L R L D A N G F L G V E R R A E G T A W S E G H P L S V T G N Q L LR V L R L D A N G F L G V E R R A E G T A W S E G H P L S V T G N Q L L

A G A I R K A G G F S F Q E L N L T I D D I A A M S H G G A D L S Y D FA G A I R K A G G F S F Q E L N L T I D D I A A M S H G G A D L S Y D F

I T R P A Y H H A L L T G D T E F L R M M L R E V H A F G I D P A S L II T R P A Y H H A L L T G D T E F L R M M L R E V H A F G I D P A S L I

H A L Q N H D E L T L E L V H F W T L H A Y D H Y H Y K G Q T L P G G HH A L Q N H D E L T L E L V H F W T L H A Y D H Y H Y K G Q T L P G G H

L R E H I R E E M Y E R L T G E H A P Y N L K F V T N G V S C T T A S VL R E H I R E E M Y E R L T G E H A P Y N L K F V T N G V S C T T A S V

I A A A L N I R D L D A I G P A E V E Q I Q R L H I L L V M F N A M Q PI A A A L N I R D L D A I G P A E V E Q I Q R L H I L L V M F N A M Q P

G V F A L S G W D L V G A L P L A P E Q V E H L M G D G D T R W I N R GG V F A L S G W D L V G A L P L A P E Q V E H L M G D G D T R W I N R G

G Y D L A D L A P E A S V S A E G L P K A R S L Y G S L A E Q L Q R P GG Y D L A D L A P E A S V S A E G L P K A R S L Y G S L A E Q L Q R P G

S F A C Q L K R I L S V R Q A Y D I A A S K Q I L I P D V Q A P G L L VS F A C Q L K R I L S V R Q A Y D I A A S K Q I L I P D V Q A P G L L V

M V H E L P A G K G V Q L T A L N F S A E P V S E T I C L P G V A P G PM V H E L P A G K G V Q L T A L N F S A E P V S E T I C L P G V A P G P

V V D I I H E S V E G D L T D N C E L Q I N L D P Y EV V D I I H E S V E G D L T D N C E L Q I N L D P Y E

또한, 본 발명은 하기 염기서열을 갖는 신규한 트레할로오스 신테이즈 암호화 유전자에 관한 것이다:The present invention also relates to a novel trehalose synthase coding gene having the following base sequence:

ATG AGC ATC CCA GAC AAC ACC TAT ATC GAA TGG CTG GTC AGC CAG TCC ATG CTGATG AGC ATC CCA GAC AAC ACC TAT ATC GAA TGG CTG GTC AGC CAG TCC ATG CTG

CAT GCG GCC CGC GAG CGG TCG CGT CAT TAC GCC GGC CAG GCG CGT CTC TGG CAGCAT GCG GCC CGC GAG CGG TCG CGT CAT TAC GCC GGC CAG GCG CGT CTC TGG CAG

CGG CCT TAT GCC CAG GCC CGC CCG CGC GAT GCC AGC GCC ATC GCC TCG GTG TGGCGG CCT TAT GCC CAG GCC CGC CCG CGC GAT GCC AGC GCC ATC GCC TCG GTG TGG

TTC ACC GCC TAT CCG GCG GCC ATC ATC ACG CCG GAA GGC GGC ACG GTA CTC GAGTTC ACC GCC TAT CCG GCG GCC ATC ATC ACG CCG GAA GGC GGC ACG GTA CTC GAG

GCC CTC GGC GAC GAC CGC CTC TGG AGT GCG CTC TCC GAA CTC GGC GTG CAG GGCGCC CTC GGC GAC GAC CGC CTC TGG AGT GCG CTC TCC GAA CTC GGC GTG CAG GGC

ATC CAC AAC GGG CCG ATG AAG CGT TCC GGT GGC CTG CGC GGA CGC GAG TTC ACCATC CAC AAC GGG CCG ATG AAG CGT TCC GGT GGC CTG CGC GGA CGC GAG TTC ACC

CCG ACC ATC GAC GGC AAC TTC GAC CGC ATC AGC TTC GAT ATC GAC CCG AGC CTGCCG ACC ATC GAC GGC AAC TTC GAC CGC ATC AGC TTC GAT ATC GAC CCG AGC CTG

GGG ACC GAG GAG CAG ATG CTG CAG CTC AGC CGG GTG GCC GCG GCG CAC AAC GCCGGG ACC GAG GAG CAG ATG CTG CAG CTC AGC CGG GTG GCC GCG GCG CAC AAC GCC

ATC GTC ATC GAC GAC ATC GTG CCG GCA CAC ACC GGC AAG GGT GCC GAC TTC CGCATC GTC ATC GAC GAC ATC GTG CCG GCA CAC ACC GGC AAG GGT GCC GAC TTC CGC

CTC GCG GAA ATG GCC TAT GGC GAC TAC CCC GGG CTG TAC CAC ATG GTG GAA ATCCTC GCG GAA ATG GCC TAT GGC GAC TAC CCC GGG CTG TAC CAC ATG GTG GAA ATC

CGC GAG GAG GAC TGG GAG CTG CTG CCC GAG GTG CCG GCC GGG CGT GAT TCG GTCCGC GAG GAG GAC TGG GAG CTG CTG CCC GAG GTG CCG GCC GGG CGT GAT TCG GTC

AAC CTG CTG CCG CCG GTG GTC GAC CGG CTC AAG GAA AAG CAC TAC ATC GTC GGCAAC CTG CTG CCG CCG GTG GTC GAC CGG CTC AAG GAA AAG CAC TAC ATC GTC GGC

CAG CTG CAG CGG GTG ATC TTC TTC GAG CCG GGC ATC AAG GAC ACC GAC TGG AGCCAG CTG CAG CGG GTG ATC TTC TTC GAG CCG GGC ATC AAG GAC ACC GAC TGG AGC

GTC ACC GGC GAG GTC ACC GGG GTC GAC GGC AAG GTG CGT CGC TGG GTC TAT CTGGTC ACC GGC GAG GTC ACC GGG GTC GAC GGC AAG GTG CGT CGC TGG GTC TAT CTG

CAC TAC TTC AAG GAG GGC CAG CCG TCG CTG AAC TGG CTC GAC CCG ACC TTC GCCCAC TAC TTC AAG GAG GGC CAG CCG TCG CTG AAC TGG CTC GAC CCG ACC TTC GCC

GCG CAG CAG CTG ATC ATC GGC GAT GCG CTG CAC GCC ATC GAC GTC ACC GGC GCCGCG CAG CAG CTG ATC ATC GGC GAT GCG CTG CAC GCC ATC GAC GTC ACC GGC GCC

CGG GTG CTG CGC CTG GAC GCC AAC GGC TTC CTC GGC GTG GAA CGG CGC GCC GAGCGG GTG CTG CGC CTG GAC GCC AAC GGC TTC CTC GGC GTG GAA CGG CGC GCC GAG

GGC ACG GCC TGG TCG GAG GGC CAC CCG CTG TCC GTC ACC GGC AAC CAG CTG CTCGGC ACG GCC TGG TCG GAG GGC CAC CCG CTG TCC GTC ACC GGC AAC CAG CTG CTC

GCC GGG GCG ATC CGC AAG GCC GGC GGC TTC AGC TTC CAG GAG CTG AAC CTG ACCGCC GGG GCG ATC CGC AAG GCC GGC GGC TTC AGC TTC CAG GAG CTG AAC CTG ACC

ATC GAT GAC ATC GCC GCC ATG TCC CAC GGC GGG GCC GAT CTG TCC TAC GAC TTCATC GAT GAC ATC GCC GCC ATG TCC CAC GGC GGG GCC GAT CTG TCC TAC GAC TTC

ATC ACC CGC CCG GCC TAT CAC CAT GCG TTG CTC ACC GGC GAT ACC GAA TTC CTGATC ACC CGC CCG GCC TAT CAC CAT GCG TTG CTC ACC GGC GAT ACC GAA TTC CTG

CGC ATG ATG CTG CGC GAA GTG CAC GCC TTC GGC ATC GAC CCG GCG TCA CTG ATCCGC ATG ATG CTG CGC GAA GTG CAC GCC TTC GGC ATC GAC CCG GCG TCA CTG ATC

CAT GCG CTG CAG AAC CAT GAC GAG TTG ACC CTG GAG CTG GTG CAC TTC TGG ACGCAT GCG CTG CAG AAC CAT GAC GAG TTG ACC CTG GAG CTG GTG CAC TTC TGG ACG

CTG CAC GCC TAC GAC CAT TAC CAC TAC AAG GGC CAG ACC CTG CCC GGC GGC CACCTG CAC GCC TAC GAC CAT TAC CAC TAC AAG GGC CAG ACC CTG CCC GGC GGC CAC

CTG CGC GAA CAT ATC CGC GAG GAA ATG TAC GAG CGG CTG ACC GGC GAA CAC GCGCTG CGC GAA CAT ATC CGC GAG GAA ATG TAC GAG CGG CTG ACC GGC GAA CAC GCG

CCG TAC AAC CTC AAG TTC GTC ACC AAC GGG GTG TCC TGC ACC ACC GCC AGC GTGCCG TAC AAC CTC AAG TTC GTC ACC AAC GGG GTG TCC TGC ACC ACC GCC AGC GTG

ATC GCC GCG GCG CTT AAC ATC CGT GAT CTG GAC GCC ATC GGC CCG GCC GAG GTGATC GCC GCG GCG CTT AAC ATC CGT GAT CTG GAC GCC ATC GGC CCG GCC GAG GTG

GAG CAG ATC CAG CGT CTG CAT ATC CTG CTG GTG ATG TTC AAT GCC ATG CAG CCCGAG CAG ATC CAG CGT CTG CAT ATC CTG CTG GTG ATG TTC AAT GCC ATG CAG CCC

GGC GTG TTC GCC CTC TCC GGC TGG GAT CTG GTC GGC GCC CTG CCG CTG GCG CCCGGC GTG TTC GCC CTC TCC GGC TGG GAT CTG GTC GGC GCC CTG CCG CTG GCG CCC

GAG CAG GTC GAG CAC CTG ATG GGC GAT GGC GAT ACC CGC TGG ATC AAT CGC GGCGAG CAG GTC GAG CAC CTG ATG GGC GAT GGC GAT ACC CGC TGG ATC AAT CGC GGC

GGC TAT GAC CTC GCC GAT CTG GCG CCG GAG GCG TCG GTC TCC GCC GAA GGC CTGGGC TAT GAC CTC GCC GAT CTG GCG CCG GAG GCG TCG GTC TCC GCC GAA GGC CTG

CCC AAG GCC CGC TCG CTG TAC GGC AGC CTG GCC GAG CAG CTG CAG CGG CCA GGCCCC AAG GCC CGC TCG CTG TAC GGC AGC CTG GCC GAG CAG CTG CAG CGG CCA GGC

TCC TTC GCC TGC CAG CTC AAG CGC ATC CTC AGC GTG CGC CAG GCC TAC GAC ATCTCC TTC GCC TGC CAG CTC AAG CGC ATC CTC AGC GTG CGC CAG GCC TAC GAC ATC

GCT GCC AGC AAG CAG ATC CTG ATT CCG GAT GTG CAG GCG CCG GGA CTC CTG GTGGCT GCC AGC AAG CAG ATC CTG ATT CCG GAT GTG CAG GCG CCG GGA CTC CTG GTG

ATG GTC CAC GAG CTG CCT GCC GGC AAG GGC GTG CAG CTC ACG GCA CTG AAC TTCATG GTC CAC GAG CTG CCT GCC GGC AAG GGC GTG CAG CTC ACG GCA CTG AAC TTC

AGC GCC GAG CCG GTC AGC GAG ACC ATC TGC CTG CCC GGC GTG GCG CCC GGC CCGAGC GCC GAG CCG GTC AGC GAG ACC ATC TGC CTG CCC GGC GTG GCG CCC GGC CCG

GTG GTG GAC ATC ATT CAC GAG AGT GTG GAG GGC GAC CTC ACC GAC AAC TGC GAGGTG GTG GAC ATC ATT CAC GAG AGT GTG GAG GGC GAC CTC ACC GAC AAC TGC GAG

CTG CAG ATC AAC CTC GAC CCG TAC GAG GGG CTT GCC CTG CGT GTG GTG AGC GCCCTG CAG ATC AAC CTC GAC CCG TAC GAG GGG CTT GCC CTG CGT GTG GTG AGC GCC

GCG CCG CCG GTG ATC TGA GCGCGCG CCG CCG GTG ATC TGA GCGC

본 발명은 도 1에 나타낸 4.7kb Sau3AI DNA 절편을 도 2에 도시된 바와 같이 벡터 플라스미드 pUC18에 함유하여 트레할로오스 신테이즈 단백질을 고역가로 발현하는 재조합 플라스미드 pCJ104에 관한 것이다.The present invention relates to a recombinant plasmid pCJ104 expressing trehalose synthase protein at high titer by containing the 4.7 kb Sau3AI DNA fragment shown in FIG. 1 in the vector plasmid pUC18 as shown in FIG. 2.

또한, 본 발명은 플라스미드 pCJ104로 형질전환된 대장균에 관한 것이다. 숙주로서 이. 콜라이 ATCC 35467을 사용하여 형질전환된 본 발명의 신규한 균주 이. 콜라이 ATCC 35467/pJC104는 한국종균협회에 1997년 9월 22일에 기탁되어 수탁번호 KFCC-10986을 부여받았다.The present invention also relates to E. coli transformed with plasmid pCJ104. As a host. Novel strains of the invention transformed with E. coli ATCC 35467 E. coli ATCC 35467 / pJC104 was deposited with the Korean spawn association on September 22, 1997 and was assigned accession number KFCC-10986.

또한, 본 발명은 플라스미드 pCJ104의 2.5kb BamHI-BglII DNA 절편을 벡터 플라스미드 pUC18에 함유하여 트레할로오스 신테이즈 단백질을 고역가로 발현하는 재조합 플라스미드 pCJ122에 관한 것이다.The present invention also relates to a recombinant plasmid pCJ122 containing 2.5 kb BamHI-BglII DNA fragment of plasmid pCJ104 in vector plasmid pUC18 to express trehalose synthase protein at high titer.

또한, 본 발명은 플라스미드 pCJ122로 형질전환된 대장균에 관한 것이다.The present invention also relates to Escherichia coli transformed with plasmid pCJ122.

또한, 본 발명은 상기된 플라스미드 pCJ104로 형질전환된 대장균을 배양하고 균체를 회수하며 균체를 분쇄하고 원심분리하여 상등액을 이 상등액을 직접 말토오스 용액과 반응시키거나 상기 상등액을 통상적인 정제공정을 수행하여 순수한 트레할로오스 신테이즈 효소를 분리한 후 이 효소로 말토오스 용액을 처리하여 말토오스를 트레할로오스로 전환시킴을 특징으로하여 트레할로오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention is cultured E. coli transformed with the plasmid pCJ104 described above, the cells are recovered, the cells are pulverized and centrifuged to react the supernatant directly with maltose solution or the supernatant is subjected to a conventional purification process. The present invention relates to a method for preparing trehalose, characterized by separating maltose trehalose synthase enzyme and treating maltose solution with the enzyme to convert maltose to trehalose.

또한, 본 발명은 상기된 플라스미드 pCJ122로 형질전환된 대장균을 배양하고 균체를 회수하며 균체를 분쇄하고 원심분리하여 상등액을 이 상등액을 직접 말토오스 용액과 반응시키거나 상기 상등액을 통상적인 정제공정을 수행하여 순수한 트레할로오스 신테이즈 효소를 분리한 후 이 효소로 말토오스 용액을 처리하여 말토오스를 트레할로오스로 전환시킴을 특징으로하여 트레할로오스를 제조하는 방법에 관한 것이다.In addition, the present invention is cultured E. coli transformed with the plasmid pCJ122 described above, the cells are recovered, the cells are pulverized and centrifuged to react the supernatant directly with maltose solution or the supernatant is subjected to a conventional purification process. The present invention relates to a method for preparing trehalose, characterized by separating maltose trehalose synthase enzyme and treating maltose solution with the enzyme to convert maltose to trehalose.

본 발명자들은 여러 다양한 제한효소를 사용하여 본 발명의 재조합 플라스미드 pCJ104의 유전자 제한효소 지도를 작성하였다. 현재 공지된 트레할로스 신테이즈 유전자서열은 2개(Biochim. Biophys. Acta 1996, 1290, 1-3, Biochim. Biophys. Acta 1997, 1334, 28-32)로 이들의 유전자 제한효소 지도와 비교 분석한 결과, 본 발명자들이 개발한 pCJ104가 기존에 밝혀진 제한효소 지도와는 전혀 상이한 패턴을 나타내는 것으로 밝혀졌다.The inventors have generated a gene restriction map of the recombinant plasmid pCJ104 of the present invention using several different restriction enzymes. Two known trehalose synthase sequences (Biochim. Biophys. Acta 1996, 1290, 1-3, Biochim. Biophys. Acta 1997, 1334, 28-32) were compared with their gene restriction maps. In addition, it was found that the pCJ104 developed by the present inventors exhibited a completely different pattern from the restriction enzyme map previously known.

또한, 본 발명에서 클로닝하여 얻은 트레할로오스 신테이즈 효소의 N-말단 서열과 대한민국 특허 공개번호 95-3444에 기재된 효소의 N-말단을 비교한 결과 서열의 유사성이 전혀 없는 것으로 밝혀졌으며, 게다가 공지의 미생물에서 얻은 효소의 N-말단 사이에서는 서열의 유사성이 있으나 이들 공지 효소중 어느 것도 본 발명의 효소와는 서열의 유사성이 없는 것으로 밝혀졌다. 이의 서열비교 결과는 아래 표 1에 나타낸 바와 같다.In addition, the comparison of the N-terminal sequence of the trehalose synthase enzyme obtained by cloning in the present invention with the N-terminus of the enzyme described in Korean Patent Publication No. 95-3444 revealed no similarity. Although the sequence similarity is found between the N-terminus of enzymes obtained from known microorganisms, none of these known enzymes have been found to have sequence similarity with the enzyme of the present invention. Its sequence comparison results are shown in Table 1 below.

트레할로오스 신테이즈 효소의 N-말단 서열N-terminal sequence of trehalose synthase enzyme

또한, 본 발명의 신규한 트레할로오스 신테이즈 효소는 문헌(Biochim. Biophys. Acta 1996, 1290, 1-3) 및 (Biochim. Biophys. Acta 1997, 1334, 28-32)에 기재된 효소와 전체서열을 비교해 보아도 서열의 유사성이 없음이 확인되었다.In addition, the novel trehalose synthase enzymes of the present invention include the enzymes described in Biochim. Biophys. Acta 1996, 1290, 1-3 and Biochim. Biophys. Acta 1997, 1334, 28-32. Comparing the sequences also confirmed that there was no similarity of the sequences.

본 발명에 따라 제조된 재조합 플라스미드 pCJ104 또는 pCJ122를 포함한 형질전환체를 배양하여 세포파쇄 후 효소전환 반응을 실시한 결과 모균주인 슈도모나스 스튜트제리의 트레할로오스 신테이즈 효소보다 현저하게 증폭된 효소역가를 나타내는 것으로 확인되었다.Enzyme titer significantly amplified than the trehalose synthase enzyme of the parent strain Pseudomonas studgeri as a result of culturing the transformant containing the recombinant plasmid pCJ104 or pCJ122 prepared according to the present invention and performing the enzymatic conversion reaction after cell disruption. It was confirmed to represent.

본 발명에서 사용 및 제조된 플라스미드 및 균주의 특성 및 입수방법은 하기 표 2에 나타낸 바와 같다.Properties and methods of obtaining plasmids and strains used and prepared in the present invention are shown in Table 2 below.

균주 및 플라스미드Strains and Plasmids 특성characteristic 입수방법How to get 슈도모나스스튜트제리 CJ38Pseudomonas studio jelly CJ38 트레할로오스 신테이즈 효소 함유한야생균주Wild strain containing trehalose synthase enzyme KFCC-10985KFCC-10985 대장균 NM522Escherichia coli NM522 hsd△5, △(lac^-pro) [F', Pro⁺, lacI^qZ △M15]hsdΔ5, Δ (lac ^- pro) [F ', Pro ⁺ , lacI ^q Z ΔM15] AmershamAmersham 대장균 ATCC35467Escherichia coli ATCC35467 [malP,Q::Tn5 ompBCS1 F^-araD139△(arg F^-lac) 205U169 rpsL150 relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25][malP, Q :: Tn5 ompBCS1 F ^- araD139 △ (arg F ^- lac) 205U169 rpsL150 relA1 flbB5301 deoC1 ptsF25] ATCCATCC pCJ104pCJ104 pUC18에 4.7kbSau3AI DNA 절편함유 (트 레할로오스 신테이즈 유전자), Ap^r 4.7 kb Sau 3AI DNA fragment on pUC18 (trehalose synthase gene), Ap ^r 본발명Invention pCJ121pCJ121 pUC18에 3.35kbKpnI DNA 절편함유 (트 레할로오스 신테이즈 유전자), Ap^r (OSU synthetase gene rise to bit rehal) 3.35kb Kpn I DNA fragment containing the pUC18, Ap ^r 본발명(대조군)The present invention (control group) pCJ122pCJ122 pUC18에 2.5kbBamHI-BglII DNA 절편함 유(트레할로오스 신테이즈 유전자), Ap^r 2.5 kb Bam HI- Bgl II DNA fragment in pUC18 (trehalose synthase gene), Ap ^r 본발명Invention pCJ123pCJ123 pUC18에 1.2kb BamHI-EcoRI DNA 절편함유1.2kb BamHI-EcoRI DNA fragment contained in pUC18 본발명(대조군)The present invention (control group) pUC18 및 pUC19pUC18 and pUC19 Ap^r, 2.7kbAp ^r , 2.7kb New EnglandBiolabsNew england biolabs

슈도모나스 스튜트제리의 배양시에는 영양 배지(0.3% 육즙, 0.5% 펩톤, pH 6.8)를, 대장균 배양시에는 LB배지(1% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 1% NaCl, pH 7.0)를, 전기장 충격법에 의한 형질전환 후 발현시에는 SOC배지(2% 트립톤, 0.5% 효모엑기스, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM MgSO₄, 20mM 포도당)를 각각 사용한다. 트레할로오스 생합성효소 유전자 클로닝용 배지로는 맥콘키(MacConkey) 한천배지(4% bacto MacConkey agar base, 2.0% 말토오스, pH 7.0)를 사용한다. 엠피실린은 50mg/L의 농도가 되도록 첨가한다. 전기장 충격법(electroporation)에 의한 대장균 형질전환에는 BIO-RAD사 제품의 진 펄서, 펄스조절기, 0.2cm 간극의 진 펄서 큐벳을 사용하였다. 본원에서 사용한 유전자 조작법은 주로 분자클로닝 실험 조작법(Molecular cloning; a laboratory manual, 2nd ed., Sambrook, J., E.F.Frisch, and T.Maniatis) 및 분자클로닝 기술의 지표(Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymol. vol. 152, Berger, S.L., A.R.Kimme) 등의 방법에 준하여 실시하였다.Nutritional medium (0.3% broth, 0.5% peptone, pH 6.8) was used for the culture of Pseudomonas steetgerium, LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, pH 7.0) for E. coli culture, For expression after transformation by electric field bombardment, SOC medium (2% tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl ₂ , 10 mM MgSO ₄ , 20 mM glucose) is used, respectively. MacConkey agar medium (4% bacto MacConkey agar base, 2.0% maltose, pH 7.0) is used as a media for clohaling trehalose biosynthesis genes. Empicillin is added to a concentration of 50 mg / L. E. coli transformation by electroporation was performed using a gin pulser, pulse regulator, and a 0.2 cm gap gin pulser cuvette manufactured by BIO-RAD. The genetic manipulations used herein are primarily molecular cloning; a laboratory manual, 2nd ed., Sambrook, J., EFFrisch, and T. Manatis and guide to molecular cloning techniques, methods in Enzymol.vol. 152, Berger, SL, ARKimme) and the like.

본 발명에서의 효소반응은 pH 6.0 내지 11, 바람직하게는 7.0 내지 10이 적당하며, 반응 온도는 4 내지 45℃, 바람직하게는 20 내지 40℃가 적당하다. 기질농도는 말토오스 50%까지 사용할 수 있으며, 효소는 세포 파쇄액을 사용하거나 정제하여 사용할 수 있다.The enzyme reaction in the present invention is suitable for pH 6.0 to 11, preferably 7.0 to 10, the reaction temperature is 4 to 45 ℃, preferably 20 to 40 ℃. Substrate concentration can be used up to 50% maltose, the enzyme can be used by using a cell lysate or purified.

본 발명은 하기 실시예를 통해 구체적으로 예시된다.The invention is specifically illustrated by the following examples.

실시예 1Example 1

트레할로오스 신테이즈 유전자의 클로닝 (도 2)Cloning of Trehalose Synthase Gene (FIG. 2)

(1) 슈도모나스 스튜트제리의 염색체 DNA의 분리(1) Isolation of Chromosome DNA of Pseudomonas Steutgeri

슈도모나스 스튜트제리를 초기 휴지기까지 영양배지에서 키운 뒤 원심분리하여 균체를 회수한 후 TE (10mM Tris-HCl (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0))용액으로 2회 세척하였다. 세척된 균체를 20mL의 STE 완충액 (20% 수크로즈, 10mM Tris (pH8.0), 1mM EDTA (pH8.0))에 현탁한 후 5mg/mL의 리소자임과 RNase A를 첨가하고 37℃에서 2시간동안 처리하였다. 반응이 끝난 후 SDS를 최종농도가 1% 되도록 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 최종 반응액은 동일 부피의 페놀을 4시간 동안 처리하고 원심분리하여 상등액을 얻었다. 상등액에 동일 부피의 페놀/클로로포름을 4시간동안 처리하고 원심분리하여 다시 상등액을 얻었다. 이 상등액에 5M NaCl를 최종농도가 0.1M 되도록 첨가하고 2배 부피의 무수 에탄올을 처리하고 유리막대로 염색체 DNA를 얻었다. 얻은 DNA는 70% 에탄올로 세척한 후 TE 용액에 녹이고 이후 실험에 사용하였다.Pseudomonas steet jelly was grown in nutrient medium until the initial resting period, and the cells were recovered by centrifugation and washed twice with TE (10 mM Tris-HCl (pH8.0), 1 mM EDTA (pH8.0)) solution. The washed cells were suspended in 20 mL of STE buffer (20% sucrose, 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0)), and then 5 mg / mL lysozyme and RNase A were added, followed by 2 hours at 37 ° C. Treated during. After the reaction was completed, the SDS was added to a final concentration of 1% and reacted for 30 minutes at 37 ℃. The final reaction solution was treated with the same volume of phenol for 4 hours and centrifuged to obtain a supernatant. The supernatant was treated with the same volume of phenol / chloroform for 4 hours and centrifuged to obtain a supernatant again. 5M NaCl was added to this supernatant to a final concentration of 0.1M, and treated with 2 volumes of anhydrous ethanol to obtain chromosomal DNA with a glass rod. The obtained DNA was washed with 70% ethanol and then dissolved in TE solution, which was then used for the experiment.

(2) 유전자 라이브러리(genomic library)의 제조(2) Preparation of genomic library

슈도모나스 스튜트제리로부터 분리 정제된 염색체 DNA를 제한효소인 Sau3AI으로 37℃, 15 내지 30분간 부분 절단하고, 열처리하여 이 제한효소를 불활성화 시킨 뒤, 아가로스 겔에서 전기영동하고 3∼10kb 크기의 DNA 절편을 취하였다. 이를 Gene-Clean II kit 를 사용하여 3∼10kb 크기의 DNA 절편을 얻었다. 도 2에 나타낸 바와 같이 플라스미드 pUC18을 제한효소 BamHI으로 절단하고 송아지 장 포스파타제(calf intestinal phosphatase)를 처리한 뒤, 부분 절단한 3∼10kb 크기의 DNA 절편과 혼합하고 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase)로 15℃에서 16시간 결합시킨 후 형질전환에 사용하였다. 형질전환은 아래 기술한 방법에 의해 전기장 충격법으로 행하였다. LB 배지에서 14 내지 15시간 배양한 대장균 NM522를 1L LB 배지에 초기 흡광도(600nm)가 0.07 내지 0.1 되게 접종한 뒤 흡광도가 0.8이 될 때까지 배양하였다. 이 균체를 원심분리한 후 1L의 HEPES〔N-(2-하이드록시에틸)피페라진-N-(2-에탄설폰산)〕완충용액에 현탁하고 재차 원심분리하여 다시 500mL의 차가운 멸균 탈이온 증류수에 현탁하였다. 이를 다시 원심분리한 뒤 균체를 다시 20mL 10% 글리세롤에 현탁시키고 원심분리한 후 최종 2 내지 3mL의 10% 글리세롤 용액에 현탁하여 최종 균체 농도 2∼4×1010/mL로 조정하여 사용하였다. 이 세포 현탁액을 드라이아이스/에탄올로 급속 냉동시킨 뒤 -70℃에 보관하여 약 1개월간 형질전환 빈도의 감소없이 사용할 수 있었다. 나누어 보관된 세포 현탁액 40uL를 얼음 속에서 녹인 뒤 여기에 DNA 연결 혼합액을 가해 섞은 뒤 0.2cm 간극의 진 펄서 큐벳에 넣고 축전량(capacitance) 및 전기장의 세기를 25uF 및 12.5kV/cm에 고정하고 200 내지 400Ω의 저항에서 1회의 전기장 충격을 가했다. 전기장 충격 후 즉시 1mL의 SOC 배지를 넣어 섞은 뒤 37℃에서 1시간동안 배양후 LB-암피실린 한천 배지에 도말하여 24시간 배양하고 5만개 이상의 콜로니를 얻었다. 이들 콜로니들을 LB 브로쓰에 함께 2시간동안 배양한 후 알카리 용균방법으로 DNA를 분리 정제하여 유전자 라이브러리를 제작하였다.The purified chromosomal DNA isolated from Pseudomonas steet jelly was partially digested with Sau3AI, a restriction enzyme, at 37 ° C. for 15 to 30 minutes, and heat treated to inactivate the restriction enzyme, followed by electrophoresis on an agarose gel, and a size of 3 to 10 kb. DNA fragments were taken. DNA fragments of 3 to 10kb in size were obtained using the Gene-Clean II kit. As shown in FIG. 2, plasmid pUC18 was digested with restriction enzyme BamHI, treated with calf intestinal phosphatase, mixed with partially digested 3-10 kb sized DNA fragments, and T4 DNA ligase (T4 DNA ligase). After binding for 16 hours at 15 ℃ was used for transformation. Transformation was performed by the electric field impact method by the method described below. E. coli NM522 incubated for 14 to 15 hours in LB medium was inoculated in 1 L LB medium with an initial absorbance (600 nm) of 0.07 to 0.1 and then cultured until the absorbance became 0.8. After centrifugation, the cells were suspended in 1 L of HEPES [N- (2-hydroxyethyl) piperazine-N- (2-ethanesulfonic acid)] buffer solution, and centrifuged again, followed by 500 mL of cold sterile deionized distilled water. Suspended in. After centrifugation again, the cells were again suspended in 20 mL of 10% glycerol, centrifuged, and suspended in 2 to 3 mL of 10% glycerol solution to adjust to final cell concentration of 2 to 4 × 10 10 / mL. The cell suspension was rapidly frozen with dry ice / ethanol and stored at −70 ° C. to be used for about one month without decreasing the transformation frequency. Dissolve 40uL of the suspended cell suspension in ice, add DNA-linked mixture to the mixture, place it in a 0.2cm gap gin pulser cuvette, and fix the capacitance and electric field at 25uF and 12.5kV / cm. One electric field shock was applied at a resistance of 400 ?. Immediately after the electric field impact, 1mL of SOC medium was mixed and incubated at 37 ° C for 1 hour, and then plated on LB-ampicillin agar medium for 24 hours to obtain more than 50,000 colonies. These colonies were incubated with LB broth for 2 hours, and DNA was isolated and purified by alkaline lysis to prepare a gene library.

(3) 트레할로오스 신테이즈의 유전자 클로닝(3) Gene Cloning of Trehalose Synthase

상기 제작된 유전자 라이브러리를 말토오스를 탄소원으로 이용하지 못하는 대장균 ATCC35467에 전기장충격법을 이용하여 형질전환하고 말토오스(20g/L)를 함유한 맥콘키-암피실린 한천 배지에 도말하였다. 본 클로닝 시스템은 유전자 클로닝에 의해서 슈도모나스 스튜트제리의 트레할로오스 신테이즈 유전자가 대장균에 도입되면 말토오스가 대장균내에 존재하는 트레할레이즈에 의해 포도당으로 전환된 후 대사되어 pH가 저하되면 맥콘키 한천 배지의 콜로니의 색깔이 노란색에서 붉은색으로 변화되는 점을 이용한 것이다. 이러한 원리를 이용하여 유전자 라이브러리를 대장균 ATCC35467에 형질전환시킨 후 맥콘키 한천 배지에서 붉은 색을 나타내는 콜로니를 획득하였다(도 3). 플라스미드 DNA를 분리한 결과 약 4.7kb의 DNA 단편이 함유되었음을 확인하고 플라스미드 pCJ104라 명명하였다. 효소분석을 하기위해서 대장균 ATCC35467/pUC18 (대조균주), 대장균 ATCC35467/pCJ104 및 슈도모나스 스튜트제리 CJ38 (유전자원 야생균주)를 배양하였다. 대장균의 경우 LB배지에서, 슈도모나스 스튜트제리의 경우 영양 배지에서 각각 초기 휴지기까지 세포를 키운 후 원심분리하여 균체를 분리한뒤 세포파쇄하여 효소원으로 이용하였다. 효소반응 조건은 기질농도는 20% 말토오스를, 완충액은 20mM 디에탄올아민을, pH는 8.5 내지 9.0에서, 온도는 35℃를 선택하여 실시한 후 1.0% 트리클로로아세트산을 첨가하고 원심분리하여 고압액체크로마토그라피(HPLC)로 말토오스 및 트레할로오스를 정량분석하였다. 그 결과는 하기 표 3에 나타나 있다.The prepared gene library was transformed to E. coli ATCC35467, which does not use maltose as a carbon source, using an electric field shock method, and plated on Macconki-Ampicillin agar medium containing maltose (20 g / L). This cloning system is introduced into the Escherichia coli trehalose synthase gene by cloning the gene, the maltose is converted to glucose by trehalase present in Escherichia coli, and then metabolized to decrease the pH of the McConkie agar The color of the colony of the medium is changed from yellow to red. Using this principle, the gene library was transformed into E. coli ATCC35467, and colonies showing red color were obtained in McConkie agar medium (FIG. 3). Plasmid DNA was isolated to confirm that it contained about 4.7 kb of DNA fragment and named plasmid pCJ104. Escherichia coli ATCC35467 / pUC18 (control strain), Escherichia coli ATCC35467 / pCJ104 and Pseudomonas steg Jerry CJ38 (gene source wild strain) were cultured for enzymatic analysis. In the case of Escherichia coli, cells were grown in LB medium and Pseudomonas stetger jelly in the nutrient medium until the initial resting period, followed by centrifugation to separate the cells, and cell disruption to use as an enzyme source. Enzyme reaction was carried out by selecting 20% maltose of substrate concentration, 20mM diethanolamine in buffer, pH of 8.5 to 9.0, temperature of 35 ° C, and adding 1.0% trichloroacetic acid and centrifugation Maltose and trehalose were quantified by graphigraphy (HPLC). The results are shown in Table 3 below.

효소역가분석Enzyme Activity Analysis 균주Strain 비효소활성(U^*/단백질 mg)Non-enzymatic activity (U ^* / mg of protein) 배양역가(U/배양액 ml)Culture titer (U / ml ml) 슈도모나스 스튜트제리 CJ38 (유전자원 균주)Pseudomonas Steet Jelly CJ38 (gene source strain) 0.10.1 0.0230.023 이. 콜라이ATCC35467/pUC18this. E. coli ATCC35467 / pUC18 00 00 이. 콜라이ATCC35467/pCJ104(클로닝균주)this. E. coli ATCC35467 / pCJ104 (cloning strain) 0.260.26 0.1750.175 *U=umol 트리할로스/분* U = umol trihalose / min

실시예 2Example 2

트레할로오스 신테이즈 유전자의 제한효소 지도제작 (도 4)Restriction enzyme mapping of trehalose synthase gene (FIG. 4)

통상의 방법으로 플라스미드 pCJ104를 분리한 후 여러 가지 제한효소를 이용하여 대략적인 제한효소지도를 작성하였다.After plasmid pCJ104 was isolated by a conventional method, a rough restriction map was prepared using various restriction enzymes.

pCJ104 DNA를 AatII, BamHI, BglII, EcoRI, EcoRV, KpnI, NcoI, NdeI, PstI, SacI, SacII, SalI, SmaI, SphI, XhoI등 약 20여 가지의 제한효소를 이용하여 단일절단법(single-digest procedure) 이중절단법(double-digest procedure) 또는 삼중절단법을 실시한 후 0.7% 및 1.5%의 아가로스 겔에서 각각 전기영동하고 상호 비교분석하여 대략적인 제한지도를 작성하였다(도 4).Single-digest pCJ104 DNA using about 20 restriction enzymes such as AatII, BamHI, BglII, EcoRI, EcoRV, KpnI, NcoI, NdeI, PstI, SacI, SacII, SalI, SmaI, SphI, XhoI procedure) After performing the double-digest procedure or the triple-cutting method, electrophoresis and mutual comparison were performed on 0.7% and 1.5% agarose gel, respectively, to prepare a rough restriction map (FIG. 4).

실시예 3Example 3

트레할로오스 신테이즈 유전자의 서브클로닝 및 효소분석Subcloning and Enzyme Analysis of Trehalose Synthase Gene

(1) 트레할로오스 신테이즈 유전자의 서브클로닝 (도 5)(1) Subcloning of Trehalose Synthase Gene (FIG. 5)

플라스미드 pCJ104의 4.7kb 중에서 어느 부위가 트레할로오스 신테이즈 유전자가 위치하는지를 확인하기 위해서 서브클로닝을 실시하였다. 먼저 제한효소 KpnI으로 절단하여 3.35kb 절편을 분리 정제후 벡터 pUC18/KpnI/CIP 와 연결한 후 이. 콜라이 NM522에 형질전환하여 pUC18/KpnI에 정방향으로 들어간 pCJ121을 제작하였다. 한편 제한효소 BamHI 및 BglII로 이중절단하여 2.5kb BamHI-BglII 절편을 분리, 정제한후 벡터 pUC18/BamHI/CIP에 연결한 후 이. 콜라이 NM522에 형질전환하여 pUC18/BamHI에 정방향으로 들어간 pCJ122을 제작하였다. 마지막으로, 제한효소 BamHI 및 EcoRI으로 이중절단하여 1.2kb BamHI-EcoRI 절편을 분리, 정제한 후 벡터 pUC18/BamHI/EcoRI과 연결한 후 이. 콜라이 NM522에 형질전환하여 pCJ123을 제작하였다.Subcloning was performed to identify which region of the 4.7 kb of plasmid pCJ104 is located in the trehalose synthase gene. First, the 3.35 kb fragment was cut and purified by restriction enzyme KpnI, and then linked with the vector pUC18 / KpnI / CIP. E. coli NM522 was transformed to prepare pCJ121 in the forward direction to pUC18 / KpnI. Meanwhile, 2.5kb BamHI-BglII fragment was isolated and purified by double cleavage with restriction enzymes BamHI and BglII, and then linked to vector pUC18 / BamHI / CIP. E. coli NM522 was transformed to prepare pCJ122 in the forward direction to pUC18 / BamHI. Finally, 1.2kb BamHI-EcoRI fragments were isolated and purified by double cleavage with restriction enzymes BamHI and EcoRI, followed by linkage with vector pUC18 / BamHI / EcoRI. E. coli NM522 was transformed to prepare pCJ123.

상기에서 제작한 플라스미드들을 각각 대장균 ATCC35467에 형질전환시킨 후 실시예 1의 방법에서와 같이 2.0% 말토오스를 함유한 맥콘키-암피실린 한천배지에 도말하여 콜로니의 색변화를 확인한 결과 플라스미드 pCJ121 및 pCJ122를 각각 함유한 대장균 ATCC35467은 붉은색을 나타냈지만 pCJ123을 함유한 대장균 ATCC35467은 말토오스를 분해하지 못해서 콜로니 색깔이 노란색을 나타내었다(표 4). 따라서, 도 5에서 나타낸 유전자 제한효소 지도중에서 1.2kb의 BamHI-EcoRI 절편보다는 큰 2.5kb의 BamHI-BglII 절편내에 트레할로오스 신테이즈 효소를 암호화한 유전자가 존재함을 알 수 있다.The plasmids prepared above were transformed into Escherichia coli ATCC35467, respectively, and smeared on Macconkey-Ampicillin agar medium containing 2.0% maltose as in the method of Example 1 to confirm the color change of colonies. As a result, plasmids pCJ121 and pCJ122 were respectively identified. E. coli ATCC35467 containing red color was shown, but E. coli ATCC35467 containing pCJ123 did not decompose maltose, the colony color was yellow (Table 4). Accordingly, it can be seen from the gene restriction enzyme map shown in FIG. 5 that the gene encoding trehalose synthase enzyme exists in the 2.5 kb BamHI-BglII fragment larger than the 1.2 kb BamHI-EcoRI fragment.

2.0% 말토오스를 함유한 맥콘키-암피실린 한천 배지에서의 콜로니 색 변화Colony Color Change in McConkie-Ampicillin Agar Medium Containing 2.0% Maltose 균주Strain 맥콘키-암피실린 한천+말토오스 20g/lMacconkey-Ampicillin Agar + Maltose 20g / l 이. 콜라이 ATCC35467/pCJ121this. E. coli ATCC35467 / pCJ121 붉은색 콜로니Red colony 이. 콜라이 ATCC35467/pCJ122this. E. coli ATCC35467 / pCJ122 붉은색 콜로니Red colony 이. 콜라이 ATCC35467/pCJ123this. E. coli ATCC35467 / pCJ123 노란색 콜로니Yellow colony

(2) 서브클로닝된 플라스미드를 함유한 미생물의 트레할로오스 신테이즈 효소역가분석(2) Trehalose Synthase Enzyme Activity Analysis of Microorganisms Containing Subcloned Plasmids

상기에서 제작한 재조합 대장균 ATCC35467/pCJ121, 재조합 대장균 ATCC35467/pCJ122 및 재조합 대장균 ATCC35467/pCJ123을 LB-Ap배지에서 초기 휴지기까지 배양후 원심분리하여 균체를 회수하고 적당량의 20mM 디에탄올아민 용액으로 두차례 세척한 후 적당량의 20mM 디에탄올아민 용액에 현탁하여 초음파 균체분쇄기로 균체를 분쇄하고 원심분리하여 얻어진 상등액을 효소액으로 사용하였다. 이렇게 하여 얻어진 효소액의 적당량을 트레할로오스 신테이즈 반응액(20%말토오스, 20mM 디에탄올아민, pH 8.5-9.0)에 첨가하여 35℃에서 반응시킨 뒤 1.0% 트리클로로아세트산을 첨가하고 원심분리하여 HPLC로 분석하였다. 1단위 효소 활성은 1분당 1umol의 트레할로오스를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다. 이의 결과는 표 5에 기재하였다.The recombinant Escherichia coli ATCC35467 / pCJ121, the recombinant Escherichia coli ATCC35467 / pCJ122, and the recombinant Escherichia coli ATCC35467 / pCJ123 were incubated in LB-Ap medium until the initial resting period to recover the cells by centrifugation, and washed twice with an appropriate amount of 20 mM diethanolamine solution. After the suspension was suspended in an appropriate amount of 20 mM diethanolamine solution, the supernatant obtained by pulverizing and centrifuging the cells with an ultrasonic cell grinding machine was used as the enzyme solution. The appropriate amount of the enzyme solution thus obtained was added to trehalose synthase reaction solution (20% maltose, 20 mM diethanolamine, pH 8.5-9.0), reacted at 35 ° C, and then 1.0% trichloroacetic acid was added and centrifuged. Analyzed by HPLC. One unit of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that produced 1umol of trehalose per minute. The results are shown in Table 5.

이중 효소역가분석에서 가장 강력한 효소역가를 나타내는 재조합 대장균 ATCC35467/pCJ122을 선별하여 5-L 발효조에서 표 6에 기재된 조건으로 고밀도 배양을 하였다. 그 결과 비효소활성은 LB배지에서 배양했을 때와 거의 같은 5.0 U/mg 단백질이였으며 고밀도배양에 의해서 효소의 배양역가는 30U/배양액ml로 증가하였다 (표 5). 실시예 1에서 명기한 슈도모나스 스튜트제리의 비효소활성 및 배양역가와 비교하면 재조합 대장균 ATCC35467/pCJ122는 슈도모나스 스튜트제리에 비해 비효소활성은 50배, 배양역가는 약 1300배 증가하였다.Recombinant Escherichia coli ATCC35467 / pCJ122, which showed the strongest enzyme titer in the dual enzyme titer assay, was selected and cultured in high density under the conditions shown in Table 6 in a 5-L fermenter. As a result, the non-enzymatic activity was 5.0 U / mg protein, which was almost the same as when cultured in LB medium, and the culture potency of the enzyme was increased to 30U / ml of culture medium by high density culture (Table 5). Compared with the non-enzymatic activity and culture titer of Pseudomonas studgeri described in Example 1, the recombinant E. coli ATCC35467 / pCJ122 had a 50-times non-enzyme activity and a culture titer of about 1300-fold higher than that of Pseudomonas studgeri.

서브클로닝된 플라스미드를 함유한 미생물의 트레할로오스 신테이즈 효소역가분석Trehalose Synthase Activity Analysis of Microorganisms Containing Subcloned Plasmids 균주Strain 비효소활성(U/mg 단백질)Non-enzymatic activity (U / mg protein) 5-L 발효조에서의 배양역가(U/배양액 ml)Culture titer in 5-L fermenter (U / ml ml) 이. 콜라이ATCC35467/pCJ121this. E. coli ATCC35467 / pCJ121 0.430.43 -- 이. 콜라이ATCC35467/pCJ122this. E. coli ATCC35467 / pCJ122 4.954.95 3030 이. 콜라이ATCC35467/pCJ123this. E. coli ATCC35467 / pCJ123 00 --

5-L 발효조 발효배지 및 배양조건5-L fermenter fermentation broth and culture conditions 발효배지Fermentation medium (g/l)(g / l) 배양조건Culture condition 글리세롤Glycerol 5050 pH 7.0pH 7.0 (NH₄)₂SO₄ (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 66 온도 33℃Temperature 33 ℃ KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 22 800 rpm800 rpm MgSO₄7H₂OMgSO ₄ 7H ₂ O 1One 1.0 vvm1.0 vvm 효모추출액Yeast Extract 55 미량원소Trace elements 1 ml1 ml 아미노산 (쓰레오닌, 루이신, 이소루이신, 발린, 히스티딘, 아르기닌)Amino acids (threonine, leucine, isoleucine, valine, histidine, arginine) 0.50.5

슈도모나스 스튜트제리로 유래된 본 발명의 신규한 트레할로오스 신테이즈 유전자를 갖는 본 발명의 재조합 플라스미드 및 형질전환된 대장균은 트레할로오스 신테이즈의 발현정도가 탁월함이 명백하며 이 대장균의 추출액 또는 순수하게 정제된 신규한 트레할로오스 신테이즈 효소를 이용함으로써 말토오스로부터 간편하면서도 높은 수율로 트레할로오스를 생산할 수 있음으로 본 발명이 산업적으로 유용함은 자명하다.The recombinant plasmid of the present invention and the transformed Escherichia coli having the novel trehalose synthase gene of the present invention derived from Pseudomonas Stutteri are apparent that the expression level of trehalose synthase is excellent and the extract of E. coli Alternatively, it is obvious that the present invention is industrially useful as it is possible to produce trehalose from maltose in a simple and high yield by using a novel purified pure trehalose synthase enzyme.

Claims

Trehalose synthase protein of the following amino acid sequence:

M S I P D N T Y I E W L V S Q S M L H A A R E R S R H Y A G Q A R L W Q

R P Y A Q A R P R D A S A I A S V W F T A Y P A A I I T P E G G T V L E

A L G D D R L W S A L S E L G V Q G I H N G P M K R S G G L R G R E F T

P T I D G N F D R I S F D I D P S L G T E E Q M L Q L S R V A A A H N A

I V I D D I V P A H T G K G A D F R L A E M A Y G D Y P G L Y H M V E I

R E E D W E L L P E V P A G R D S V N L L P P V V D R L K E K H Y I V G

Q L Q R V I F F E P G I K D T D W S V T G E V T G V D G K V R R W V Y L

H Y F K E G Q P S L N W L D P T F A A Q Q L I I G D A L H A I D V T G A

R V L R L D A N G F L G V E R R A E G T A W S E G H P L S V T G N Q L L

A G A I R K A G G F S F Q E L N L T I D D I A A M S H G G A D L S Y D F

I T R P A Y H H A L L T G D T E F L R M M L R E V H A F G I D P A S L I

H A L Q N H D E L T L E L V H F W T L H A Y D H Y H Y K G Q T L P G G H

L R E H I R E E M Y E R L T G E H A P Y N L K F V T N G V S C T T A S V

I A A A L N I R D L D A I G P A E V E Q I Q R L H I L L V M F N A M Q P

G V F A L S G W D L V G A L P L A P E Q V E H L M G D G D T R W I N R G

G Y D L A D L A P E A S V S A E G L P K A R S L Y G S L A E Q L Q R P G

S F A C Q L K R I L S V R Q A Y D I A A S K Q I L I P D V Q A P G L L V

M V H E L P A G K G V Q L T A L N F S A E P V S E T I C L P G V A P G P

V V D I I H E S V E G D L T D N C E L Q I N L D P Y E

Trehalose synthase coding genes of the following sequences:

ATG AGC ATC CCA GAC AAC ACC TAT ATC GAA TGG CTG GTC AGC CAG TCC ATG CTG

CAT GCG GCC CGC GAG CGG TCG CGT CAT TAC GCC GGC CAG GCG CGT CTC TGG CAG

CGG CCT TAT GCC CAG GCC CGC CCG CGC GAT GCC AGC GCC ATC GCC TCG GTG TGG

TTC ACC GCC TAT CCG GCG GCC ATC ATC ACG CCG GAA GGC GGC ACG GTA CTC GAG

GCC CTC GGC GAC GAC CGC CTC TGG AGT GCG CTC TCC GAA CTC GGC GTG CAG GGC

ATC CAC AAC GGG CCG ATG AAG CGT TCC GGT GGC CTG CGC GGA CGC GAG TTC ACC

CCG ACC ATC GAC GGC AAC TTC GAC CGC ATC AGC TTC GAT ATC GAC CCG AGC CTG

GGG ACC GAG GAG CAG ATG CTG CAG CTC AGC CGG GTG GCC GCG GCG CAC AAC GCC

ATC GTC ATC GAC GAC ATC GTG CCG GCA CAC ACC GGC AAG GGT GCC GAC TTC CGC

CTC GCG GAA ATG GCC TAT GGC GAC TAC CCC GGG CTG TAC CAC ATG GTG GAA ATC

CGC GAG GAG GAC TGG GAG CTG CTG CCC GAG GTG CCG GCC GGG CGT GAT TCG GTC

AAC CTG CTG CCG CCG GTG GTC GAC CGG CTC AAG GAA AAG CAC TAC ATC GTC GGC

CAG CTG CAG CGG GTG ATC TTC TTC GAG CCG GGC ATC AAG GAC ACC GAC TGG AGC

GTC ACC GGC GAG GTC ACC GGG GTC GAC GGC AAG GTG CGT CGC TGG GTC TAT CTG

CAC TAC TTC AAG GAG GGC CAG CCG TCG CTG AAC TGG CTC GAC CCG ACC TTC GCC

GCG CAG CAG CTG ATC ATC GGC GAT GCG CTG CAC GCC ATC GAC GTC ACC GGC GCC

CGG GTG CTG CGC CTG GAC GCC AAC GGC TTC CTC GGC GTG GAA CGG CGC GCC GAG

GGC ACG GCC TGG TCG GAG GGC CAC CCG CTG TCC GTC ACC GGC AAC CAG CTG CTC

GCC GGG GCG ATC CGC AAG GCC GGC GGC TTC AGC TTC CAG GAG CTG AAC CTG ACC

ATC GAT GAC ATC GCC GCC ATG TCC CAC GGC GGG GCC GAT CTG TCC TAC GAC TTC

ATC ACC CGC CCG GCC TAT CAC CAT GCG TTG CTC ACC GGC GAT ACC GAA TTC CTG

CGC ATG ATG CTG CGC GAA GTG CAC GCC TTC GGC ATC GAC CCG GCG TCA CTG ATC

CAT GCG CTG CAG AAC CAT GAC GAG TTG ACC CTG GAG CTG GTG CAC TTC TGG ACG

CTG CAC GCC TAC GAC CAT TAC CAC TAC AAG GGC CAG ACC CTG CCC GGC GGC CAC

CTG CGC GAA CAT ATC CGC GAG GAA ATG TAC GAG CGG CTG ACC GGC GAA CAC GCG

CCG TAC AAC CTC AAG TTC GTC ACC AAC GGG GTG TCC TGC ACC ACC GCC AGC GTG

ATC GCC GCG GCG CTT AAC ATC CGT GAT CTG GAC GCC ATC GGC CCG GCC GAG GTG

GAG CAG ATC CAG CGT CTG CAT ATC CTG CTG GTG ATG TTC AAT GCC ATG CAG CCC

GGC GTG TTC GCC CTC TCC GGC TGG GAT CTG GTC GGC GCC CTG CCG CTG GCG CCC

GAG CAG GTC GAG CAC CTG ATG GGC GAT GGC GAT ACC CGC TGG ATC AAT CGC GGC

GGC TAT GAC CTC GCC GAT CTG GCG CCG GAG GCG TCG GTC TCC GCC GAA GGC CTG

CCC AAG GCC CGC TCG CTG TAC GGC AGC CTG GCC GAG CAG CTG CAG CGG CCA GGC

TCC TTC GCC TGC CAG CTC AAG CGC ATC CTC AGC GTG CGC CAG GCC TAC GAC ATC

GCT GCC AGC AAG CAG ATC CTG ATT CCG GAT GTG CAG GCG CCG GGA CTC CTG GTG

ATG GTC CAC GAG CTG CCT GCC GGC AAG GGC GTG CAG CTC ACG GCA CTG AAC TTC

AGC GCC GAG CCG GTC AGC GAG ACC ATC TGC CTG CCC GGC GTG GCG CCC GGC CCG

GTG GTG GAC ATC ATT CAC GAG AGT GTG GAG GGC GAC CTC ACC GAC AAC TGC GAG

CTG CAG ATC AAC CTC GAC CCG TAC GAG GGG CTT GCC CTG CGT GTG GTG AGC GCC

GCG CCG CCG GTG ATC TGA GCGC

A recombinant plasmid pCJ122 containing a 2.5 kb BamHI-BglII fragment of plasmid pCJ104 in the vector plasmid pUC18 to express the trehalose synthase protein of claim 1 at high titer.

After culturing E. coli transformed with the recombinant plasmid of claim 3, the cells are recovered, the cells are pulverized and centrifuged, and the supernatant thus formed is directly reacted with maltose solution or the supernatant is subjected to a conventional purification process to obtain pure trehal. A process for producing trehalose, characterized by converting maltose to trehalose by separating malose synthase enzyme and treating the maltose solution with the enzyme.