KR19980701895A

KR19980701895A - 면역관련병 처치제 및 그의 탐색 방법

Info

Publication number: KR19980701895A
Application number: KR1019970705292A
Authority: KR
Inventors: 히로카주 오쿠다이라; 아키오 모리
Original assignee: 이라우치지마 가즈다카; 가부시키가이샤 간쿄가카구소고겐큐쇼
Priority date: 1995-03-08
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 1998-06-25
Also published as: WO1996027391A1

Abstract

면역 관련 질환의 성립에 밀접한 관계를 갖는 T 세포의 사이토카인 생산을 선택적으로 유전자 전사 레벨로 제어하는 약제를 탐색하고, 임상 응용에 의해 질환의 치료를 가능하게 함을 그 과제로 하여, 인간 T 세포에 있어서 사이토카인의 적어도 1종의 생산을 억제할 수 있는 마크로라이드계 항생물질을 유효 성분으로 하는 면역 관련병 처치제임을 그 해결수단으로 한다.

Description

면역 관련병 처치제 및 그의 탐색 방법

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 면역 관련병 처치제 및 그의 탐색 방법에 관한 것이며, 특히 면역 관련 질환의 성립에 밀접한 관계를 갖는 T 세포의 사이토카인 생산을 선택적으로 억제하는 물질을 탐색하고, 이것을 사용하여 면역 관련병의 처치를 가능하게 하기 위한 것이다.

또한, 본 명세서에 있어서 「IL」이란 인터로이킨을 나타낸다.

[종래의 기술]

종래, 면역 관련병(알러지 질환, 호산구성 염증성 질환, 교원병, 자기면역질환, 만성관절류마티즘 등)의 치료에는 한결같이 해열, 진통, 소염제 등을 사용하는 대중요법이나 스테로이드 호르몬 투여에 의한 치료가 행하여져 왔다. 한편, 면역 관련병에 대해서는 그 병태마다 T 세포에 의해 생산되는 여러 가지 사이토카인의 관여가 증명되어 있고, 특히 IL-2, IL-4, IL-5 및 IL-8는 밀접하고 중요한 관여가 시사되어 있다. 따라서, 그의 적어도 1종의 생산을 억제하는 것은 면역 관련병의 치료에 유효하리라고 생각된다.

그런데, 상기 T 세포 사이토카인은 원래 적당량이면 생체에 있어서 유용한 물질이므로, 그 생산이 정상으로 행해지고 있는 동안에는 굳이 생산 억제를 행할 필요성이 없고, 오히려 생산 억제는 바람직하지 않은 것이라고 말할 수 있다. 따라서, 생산이 이상하게 항진하고 있는 사이토카인의 생산은 억제하지만, 생산이 정상으로 행해지고 있는 사이토카인의 생산은 억제하지 않는, 즉 선택적 억제가 행하여지는 것이 바람직하다. 이와 같이 사이토카인 생산의 선택적 억제가 바람직한 것은 이해할 수 있으나, T 세포에 있어서의 사이토카인의 생산을 선택적으로 행한 사실은 지금까지 보고되어 있지 않고, 과연 그와 같은 사이토카인 생산의 선택적 억제가 가능한 것인지 아닌지 확실하지 않다. 더구나 그와 같은 선택적 억제를 가능하게 할 수 있는 물질의 존재 여부도 알려져 있지 않았었다.

예를 들어, 스테로이드류는 일반적으로 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-12, IL-13 등의 T 세포 사이토카인의 생산을 보편적으로 억제하는 것은 알려져 있지만, 특정한 사이토카인의 생산을 억제하는 것은 알려져 있지 않다. 덧붙여, 스테로이드류는 전신의 장기나 조직에도 골고루 작용을 미치기 때문에 과량으로 투여된 경우 당뇨병, 고혈압, 비만, 백내장, 정신장애 등 다채롭고 강력한 부작용을 일으킬 결점이 있다. 따라서, 그 투여량에 제한을 받아 충분한 양을 투여할 수 없는 사례를 종종 만난다.

또한, 사이클로스포린이나 FK506과 같은 종래 공지된 면역억제제는 T 세포에 특이적인 약제이고, 장기나 조직에 보편적으로 작용을 미치는 것은 아니므로, 스테로이드류에 비하여 그 부작용의 범위가 한정되어 있다. 그러나, 이들 물질도 T 세포가 생산하는 사이토카인, 즉 IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13 등의 생산을 일반적이고 광범위하게 억제하는 것이기 때문에 전반적인 면역 억제를 일으킨다. 따라서, 면역억제제에 의한 병태의 개선은 전반적인 면역 억제의 일환에 지나지 않는다고 생각하는 것이 타당하다.

[발명이 해결하고자 하는 과제]

본 발명은 T 세포 사이토카인 중에서도 면역 관련 질환에 대한 특히 밀접한 관여가 시사되어 있는 IL-2, IL-4, IL-5 및 IL-8을 대상으로 하고, 그 중 적어도 1종의 생산을 실질적으로 억제하며, 또한 적어도 1종의 생산을 실질적으로 억제하지 않는 물질, 특히 생산 억제를 유전자 전사의 억제에 의해 달성하는 물질을 탐색하고, 이와 같은 물질을 사용하여 면역 관련병을 처치하는 것을 기술적 과제로 한다.

[과제를 해결하는 수단]

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명자들은 인간 T 세포 클론, 인간 T 세포 하이브리도마, 인간 정상 말초혈 T 세포 등의 사이토카인 생산능을 잠재적으로 갖고 있는 인간 T 세포, 즉 사이토카인 유전자 발현형 인간 T 세포를 생육시켜, 이것에 시험 물질의 존재하에 활성화 자극을 주고, 그 배양물 중에 원하는 사이토카인이 생육되는지 아닌지를 관찰하는 방법에 의해, 광범위한 물질에 대해 탐색을 행하였다. 그 결과, 예를 들어 마크로라이드계 항생물질(그 유도체를 포함한다) 중에 특정한 사이토카인만을 선택적으로 억제하는 약물이 다수 존재하는 사실을 밝혀냈다.

즉, 본 발명은 T 세포 사이토카인 중, 특정한 사이토카인(1종만이 아니다)의 생산을 억제하고, 또한 다른 특정한 사이토카인(1종만이 아니다)의 생산을 억제하지 않는 약물의 탐색을 가능하게 한 것이다. 유전자 레벨에 있어서 그와 같은 선택적 생산 억제가 현실적으로 가능한지 아닌지는 지금까지 알려져 있지 않던 일이고, 본 발명에 의해 그와 같은 선택적 생산 억제가 가능한 것임이 비로소 확증되었다. 이 결과, 금후의 탐색은 성공을 기대하면서 이것을 진척시키는 일이 가능해진 것이고, 이 점에 있어서 본 발명의 기술적 의의는 매우 크다.

본 발명의 요지는 인간 T 세포에 있어서 그 곳에서 생산되어야 할 사이토카인 IL-2, IL-4, IL-5 및 IL-8 중 적어도 1종의 생산을 억제하고, 또한 적어도 1종의 생산을 억제하지 않는 물질을 유효성분으로 하는 면역 관련병 처치제에 있다. 이 경우의 사이토카인의 생산 억제는 인간 T 세포에 있어서의 당해 사이토카인 유전자(예를 들어 m-RNA)의 전사의 억제, 특히 전사의 이상항진의 억제에 의해 달성되는 것이다.

상기한 바와 같이, 어떤 종의 사이토카인 유전자의 전사는 억제하지만, 다른 어떤 종의 사이토카인 유전자의 전사는 억제하지 않는다고 한 선택적 억제가 현실적으로 가능한지 아닌지는 종래 알려져 있지 않던 일이고, 그 가능성을 처음으로 확증한 본 발명은 이 점에 있어서 전혀 예측할 수 없었던 새로운 사실에 기초한 것이라고 말할 수 있다.

본 발명에 있어서, 원하는 선택적 사이토카인 생산 억제능을 갖는 약물을 탐색하는 데에는 사이토카인 유전자 발현형 T 세포를 사용하여 행한다. 예를 들어, 본 발명자들은 먼저 알러지 환자 말초혈 림파구로부터 알레르겐을 인식하는 T 세포를 클론화하고 증식시키는 일에 성공하였는데, 여기에서 얻어진 T 세포 클론을 인간 T 세포 종양주와 세포 융합시켜 T 세포 하이브리도마를 수립한다. 이들 T 세포 클론, T 세포 하이브리도마, 정상말초혈 T 세포 등을 생육하는 배지에 시험물질을 첨가하고, 활성화 자극을 주어 배양하여, 배양물(예를 들어 상등액) 중에 있어서의 IL-2, IL-4, IL-5 및 또는 IL-8의 생산을 관찰한다. 그 결과로부터, 당해 시험약물이 어떤 1종의 사이토카인의 생산을 억제하고, 또한 어떤 1종의 사이토카인의 생산을 억제하지 않는 성질을 갖는지 아닌지를 결정한다. 이와 같이 하여 예를 들어, 마크로라이드계 항생물질 중에 그와 같은 선택적 제어를 나타내는 약물을 비교적 다수 발견할 수 있었다.

T 세포가 생산하는 사이토카인으로는 인터로이킨(IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8), 인터페론(IFN α, IFN β, IFN γ), 과립구 마크로파지·콜로니 자극 인자(GM-CSF), 과립구·콜로니 자극 인자(G-CSF), 마크로파지·콜로니 자극 인자(M-CSF, CSF-1), 마크로파지 유주저지 인자(MIF) 등이 알려져 있는데, 본 발명에서 특히 생산 억제 또는 비억제의 대상으로 하고 있는 것은 면역 관련 질환에 대한 관여가 깊은 IL-2, IL-4, IL-5 및 IL-8이다. 이들 이외의 사이토카인에 대해서는 그 생산에 특히 영향을 주지 않는 편이 바람직한데, 일반적으로는 그 생산에 영향을 주는가 아닌가는 면역 관련 질환 처치제를 제공한다고 하는 본 발명의 목적에서는 중요하지 않다.

IL-2, IL-4, IL-5 및 IL-8의 각각이 관여하고 있다고 일반적으로 인식되어 있는 주된 면역 관련 질환은 다음과 같다:

IL-2 : 교원병(전신성 엘리테마토데스, 다발성근염, 피부근염, 강피증, MCTD), 만성관절류마티즘 등;

IL-4 : 즉시형 과민증(화분증, 알러지성 비염, 알러지성 결막염), IgE 마스토셀 의존 과민증 등;

IL-5 : 알러지성 또는 호산구성 질환(기관지 천식, 아토피성 피부염, 화분증, 알러지성 비염, 알러지성 결막염, 고호산구 증후군, 알러지성 혈관염, 호산구성 근막증, 호산구성 폐장염, PIE 증후군) 등;

IL-8 : 포도막염, 베쳇병 등.

본 발명에 의해 이들 사이토카인 중 어느 것인가 1종의 생산을 억제하는 것이 명확해진 것은, 당해 사이토카인이 관여하고 있는 상기 면역 관련 질환의 처치에 유용하다. 본 발명에 의해 밝혀진 면역 관련 질환 처치제로는, 예를 들어 IL-2의 생산을 억제하지만 IL-4, IL-5 및 IL-8의 적어도 1종(예를 들어 IL-4와 IL-5의 양자)의 생산은 억제하지 않는 것이나, IL-5의 생산을 억제하지만 IL-2, IL-4 및 IL-8의 적어도 1종(예를 들어 IL-2와 IL-4)의 생산은 억제하지 않는 것이나, IL-4와 IL-5의 양자의 생산을 억제하지만 IL-2와 IL-8의 적어도 1종(에를 들어 IL-2)의 생산을 억제하지 않는 것이나, IL-4, IL-5 및 IL-8의 생산을 억제하지만 IL-2의 생산을 억제하지 않는 것 등이 있다.

특히 IL-5의 생산을 억제하는 약물을 예로 들어 설명하면, 이와 같은 약물은 알러지성 질환, 예를 들어 기관지 천식, 아토피성 피부염, 화분증, 알러지성 비염, 알러지성 결막염 등의 처치에 사용할 수 있다. 또한 호산구성 염증성 질환, 예를 들어 고호산구 증후군, 알러지성 혈관염, 호산구성 결막증, 호산구성 폐장염, PIE 증후군 등의 처치에도 사용할 수 있다.

본 발명에 의한 탐색의 바람직한 대상의 일례로는, 상기한 마크로라이드계 항생물질을 들 수 있다. 본 발명에 의해 밝혀진 마크로라이드계 항생물질의 사이토카인 생산 억제 능력은 마크로라이드계 항생물질이 T 세포에 있어서의 당해 사이토카인의 m-RNA의 전사, 특히 m-RNA의 전사의 이상항진을 억제하는 것에 의한 것이다.

본 명세서 중의 「마크로라이드계 항생물질」이란 말은 그 가장 넓은 의미에서 사용되고, 다원 환 락톤으로서, 많은 메틸 측쇄를 갖는 것이나 4 내지 7의 공액이중결합을 갖는 것을 포함한다(또한, 4 내지 7의 공액이중결합을 갖는 것은 「폴리엔계 항생물질」이라고 불리는 일도 있다). 또한 통상적으로 다른 그룹, 예를 들어 「마크로테트로이드계 항생물질」로 분류되어 있는 물질도 많은 메틸 측쇄를 갖는 다원 환 락톤인 점에 있어서, 본 명세서에서 말하는 「마크로라이드계 항생물질」의 범주에 포함되는 것이다.

좁은 의미의 「마크로라이드계 항생물질」로는, 오늘날 10 내지 40의 환 구성 원자로 이루어진 락톤 구조의 것이 알려져 왔으나, 대부분의 것은 12원 환, 14원 환 및 16원 환의 3종 중 어느 것인가에 속한다. 그 구체 예로는 12원 환의 것으로 메티마이신, 네오메티마이신 등을 들 수 있고, 14원 환의 것으로 엘리스로마이신, 피크로마이신, 나르보마이신, 올레안도마이신 등을 들 수 있으며, 16원 환의 것으로 로이코마이신, 스필로마이신, 로자마이신, 실라마이신, 쥬베니마이신, 델타마이신, 카르보마이신, 안고라마이신, 타이로신, 미시나마이신 등을 들 수 있다. 또한, 보통으로는 「마크로테트로이계 항생물질」로서 분류되고 있는 것의 구체 예로는 노낙틴(Nonactin), 모낙틴, 디낙틴, 트리낙틴, 테트라낙틴 등이 있다.

이들 「마크로라이드계 항생물질」은 일반적으로 방선균이나 미크로모노스폴라속 균에 의해 생산되는 것이지만, 본 발명에서는 이들 균에 의해 직접 생산된 것에 한정하지 않고, 이것을 적절히 수식한 그들의 유도체도 포함하는 것이다.

또한, 마크로라이드계 항생물질(그 유도체를 포함)에 관해서는 Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 제5판, 제A2권 494~496페이지(1985년), Biotechnology, A Comprehensive Treatise, 제4권 359~363페이지(1986년), 광천서점 출판, 前田謙二의 문헌 「의약의 개발 5권-항생물질·항균약」 10~11페이지(평성 2년), 동경대학 출판, 田中信男의 문헌 「항생물질대요-화학과 생물활성」 128~159페이지 및 250~251페이지(1992년) 등 여러 가지의 학술서에 광범위한 기재가 존재하고 있고, 그들 기재도 본 명세서의 일부로서 여기에 인용한다.

개개의 마크로라이드계 항생물질과 그에 의해 생산이 저지되는 사이토카인과의 일반적 관계는 현재로는 명확하지 않지만, 이것은 필요에 따라서 상기한 그리고 후에 상술하는 탐색법에 의해 용이하게 확인할 수 있다.

예를 들어 다음 일반식(Ⅰ)의 마크로라이드계 항생물질은 통상적으로 IL-5의 생산을 선택적으로 억제하지만, IL-2나 IL-4의 생산을 억제하지 않는다.

상기 식에서,

R₁, R₂, R₃및 R₄는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 알킬기이고, 이들은 동일하거나 각각 다를 수 있다.

바람직하게는 R₁, R₂, R₃및 R₄가 메틸기 또는 에틸기이다.

구체 예로는 노낙틴, 모낙틴, 디낙틴, 트리낙틴, 테트라낙틴 등을 들 수 있다.

또한, 예를 들어 다음 일반식(Ⅱ)의 마크로라이드계 항생물질은, 통상적으로 IL-2의 생산을 억제하지만, IL-4나 IL-5의 생산은 실질적으로 억제하지 않거나, 또는 역으로 IL-4나 IL-5의 생산을 억제하지만, IL-2 등의 생산은 실질적으로 억제하지 않는다.

상기 식에서,

R₅는 그것이 결합하는 탄소 원자와 함께 옥심화될 수 있는 카보닐기이고,

R₆및 R₇은 하이드록시기 또는 함께 -O(CH₂)₂O-, -O(C=O)O-, -NH(CH₂)₂O- 또는 NH(C=O)O-를 형성하며,

R₈은 C=O 또는 CH(O-R)(다만, R은 당(糖) 잔기 또는 아실기)이고,

R₉는 당 잔기이며,

R₁₀은 (저급)알킬화될 수 있는 하이드록시기이고, 다만 R₅가 그것이 결합하는 탄소 원자와 함께 옥심화된 카보닐기로서, R₆과 R₇이 각각 함께 -NH(CH₂)₂O- 또는 -NH(C=O)O-를 형성할 경우, 전자 중의 질소 원자와 후자 중의 질소 원자가 저급 알킬렌쇄를 통하여 연결될 수 있다.

옥심화된 카보닐기란, 예를 들어 식: C=NOR'의 기를 타나낸다. 상기 식에서, R'은 수소 원자, 치환 또는 비치환 저급알킬기, 치환 또는 비치환 아릴기, 치환 또는 비치환의 아릴저급알킬기일 수 있다.

R의 아실기로는 치환 또는 비치환의 저급알카노일기, 아릴기상에 있어서 치환 또는 비치환의 아릴(저급)알카노일기, 아릴기상에 있어서 치환 또는 비치환의 아릴아미노카보닐기 등이 예시된다. R 또는 R₉의 당 잔기는 마크로라이드계 항생물질이 통상 갖고 있는 당 잔기일 수 있고, 그 구체 예로는 D-데코사민, D-미카미노스, D-안고로사민, D-포로사민, L-메고사민, D-칼코스, D-알도가로스, 4, 6-디데옥시-D-슬레오헥소스-3-우로스, D-미시노스, 6-데옥시-D-알로스, 6-데옥시-2-O-메틸-D-알로스, L-미카로스, 클라디노스, L-올레안도로스, L-시넬로스, A, L-알카노스, 3-메틸-2, 3, 6-트리데옥시-L-슬레오헥사-2-에노피라노스 및 이들의 유도체 등을 들 수 있다.

또한, 본 명세서에 있어서 「저급」이란 용어는 통상 탄소수 8을 넘지 않는 기, 특히 5를 넘지 않는 기를 나타내고, 「아릴기」란 용어는 이항(異項)환식 방향족기(예를 들어 피리딜, 피리미딜)일 수 있으나, 통상은 페닐과 같은 탄소환식 방향족기를 나타낸다. 알킬기, 아릴기 등에 존재할 수 있는 치환기로는 예를 들어 저급 알킬, 할로겐, 하이드록시, 저급 알콕시, 니트로, 아미노, 저급 알킬아미노, 디(저급)알킬아미노, 페닐, 페닐(저급)알킬기, 페닐 저급 알케닐 등이 예시되고, 그들의 1종 도는 2종 이상일 수 있다. 치환기가 존재할 경우 그 수는 5 이하, 통상 1 내지 3이다.

상기 식(Ⅱ)의 화합물 중, 특히 R⁵가 예를 들어 식: C=NOR인 화합물은 IL-4 및 IL-5의 생산을 억제하지만, IL-2 등의 생산은 실질적으로 억제하지 않는다. 식 중 R은 아릴기(특히 페닐기)상에서 치환될 수 있는 아릴 저급 알킬기, 또는 페닐 저급 알케닐아릴기(예를 들어 스티릴페닐기)를 의미한다.

이들 물질은 방선균이나 미크로모노스폴라속 균의 배양에 의해 생산될 것일 수 있고, 또한 그와 같은 생산물에 일반적인 옥심화법, 케탈화법, 이미노케탈화법 등을 적용하여 수식함으로써 제조할 수 있다.

이하, 주로 일반식(Ⅰ)의 마크로라이드계 항생물질을 대표예로 들어 본 발명을 상세히 설명하지만, 일반식(Ⅱ)의 마크로라이드계 항생물질도 동일하게 사용할 수 있다. 또한, 현시점에서 바람직한 구체예는 노낙틴이지만, 그 측쇄의 수식형에 상당하는 모낙틴, 디낙틴, 트리낙틴, 테트라낙틴 등도 본 발명의 목적에서는 노낙틴과 동일하게 사용될 수 있다.

현재까지 알려져 있는 T 세포 특이적 면역억제제인 사이클로스포린 및 FK506은 모두 방선균에 의해 생산되는 마크로라이드계 항생물질이다. 본 발명의 처치제로서 사용하는 노낙틴, 모낙틴, 디낙틴, 트리낙틴, 테트라낙틴 등도 방선균이 생산하는 마크로라이드계 항생물질이다.

이들 중, 테트라낙틴은 인간 T 세포의 증식 및 NK 세포의 유도를 억제함이 알려져 있다[Tanouchi et. al., Immunopharmacology, 16, 25~32(1988) 참조]. 또한 항체 생산 억제 작용을 갖고, 동물 모델에 있어서 래트의 실험적 자기면역 포도망막염의 치료 효과가 보고되어 있다[Tanouchi et. al., Jph. J. Ophthalmol, 31, 218~229(1987); Shichi et. al., 미국 특허 제4843092호, Jun. 27, (1989); Tanouchi et. al., Immunology, 63, 471~475(1988) 참조].

이들 사실에 의해 노낙틴과 그 유연화합물은 장기이식에 따른 거절반응의 억제나 만성관절류마티즘, 전신성 엘리토마토데스, 사균체신염, 포도막염이나 갑상선 자기면역질환 등의 자기면역질환의 치료약으로서 특허가 신청되어 있다[Shichi et. al., 미국 특허 제4843092호, Jun. 27, (1989) 참조]. 그러나, 이상의 문헌은 소위 알러지성 질환이나 호산구성 질환의 치료약으로서 사용하는 것에 관하여, 그 개시도 시사도 없다. 또한, 본 발명의 출원 이전에 노낙틴과 그 유연화합물이 인간 T 세포에 있어서의 IL-5의 유전자 전사, mRNA 발현 및 단백 생산을 억제하는 사실도 알려져 있지 않았었다.

본 발명에 의해, 노낙틴 및 그 유연화합물이 인간 T 세포에 있어서의 인간 IL-5의 생산을 억제함이 밝혀졌다. 또한, 그 기서로서 이들 물질이 인간 T 세포에 있어서의 인간 IL-5의 유전자 전사 및 mRNA의 발현을 억제함으로써 단백(蛋白) 생산을 억제함이 나타났다.

즉, 노낙틴을 예로 들어 설명하면, 알러지 환자 말초혈액으로부터 단리, 배양한 말초혈 단핵구를 T 세포 활성화제인 콘카나바린 A(Concanavalin A)으로 자극하고, 동시에 노낙틴을 첨가한 바, 노낙틴은 용량 의존적으로 IL-5의 생산을 억제하였다(제1도). 콘카나바린 A는 T 세포를 T 세포의 항원 리셉터를 통하여 활성화하는 작용을 갖는다. 말초혈 단핵구를 콘카나바린 A로 자극한 경우, IL-5는 거의 모두 CD4⁺T 세포로부터 생산됨이 본 발명자들에 의해 증명되어 있다. 따라서, 노낙틴은 CD4⁺T 세포로부터의 IL-5 생산을 억제했다고 생각된다. 노낙틴이 직접 T 세포에 작용하는 것을 명확히 할 목적으로, 알레르겐 특이적 T 세포 클론을 수립하고, T 세포 리셉터를 통한 자극제인 고상화 항CD3 모노클로날항체를 사용하여 IL-5 고생산성의 T 세포 클론에 노낙틴을 첨가한 바, 100nM 이상의 농도에서 IL-5 생산을 완전히 억제함이 관찰되었다(제2도).

노낙틴의 IL-5 생산 억제작용이 IL-5 유전자 발현(mRNA 발현)의 억제를 통하고 있는지 아닌지를 명확히 하기 위하여 제1도와 동일한 실험을 행하고, RT-PCR(역전사 폴리머라제 연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction))법에 의해, IL-5 유전자 발현이 노낙틴에 의해 용량 의존적으로 억제되는 것을 나타냈다(제3도). 확실히, 노낙틴이 T 세포에 직접 작용하여 IL-5, mRNA의 발현을 억제하는 것은 포르볼에스테르와 Ca⁺⁺이오노포아로 자극한 T 세포의 클론으로 유도되는 IL-5 mRNA 발현을 억제함으로써 나타났다(제4도).

또한, T 세포가 생체내에 있어서 생리적 활성화 물질인 항원에 의해 활성화될 때에는, T 세포 리셉터를 통한 활성화 시그널에 의해 세포내에서 단백질 키나제 C(protein kinase C : PKC)가 활성화되고, 동시에 Ca⁺⁺유입이 발생함이 알려져 있다. 따라서, PKC를 직접 활성화하는 작용을 갖는 포르볼에스테르(PMA)와, Ca⁺⁺유입을 일으키는 Ca⁺⁺이오노포아, 예를 들어 이오노마이신(Ionomyci : IOM)과의 양자에 의해 T 세포를 항원으로 자극했을 때와 동일한 활성화를 부여할 수 있고, 많은 면역학 실험계에서 통상 사용되고 있다.

또한, IL-5의 유전자 전사에 대한 작용을 검토하기 위하여 상기의 T 세포 클론과 인간 T 세포 종양 세포주를 세포 융합하여 인간 IL-5 유전자 발현 T 세포 하이브리도마를 제작하였다. 인간 IL-5 유전자 전사 개시점의 5' 상류에 위치하는 프로모터/인핸서 영역의 DNA를 레포터 유전자인 루시페라제 유전자에 접속한 pIL-5 Luc(제6도)을 이 T 세포 하이브리도마에 일과성 트랜스펙션하여 얻어지는 유전자 전사 실험계를 사용하여, 노낙틴의 유전자 전사 억제실험을 행하였다. pIL-5 Luc이 IL-5 유전자 발현형 T 세포 하이브리도마의 세포내에 일시적으로 도입되어 PMA+10M의 자극이 가해지면, 세포내로 유도되는 IL-5 유전자 전사 장치(전사인자)가 IL-5 프로모터/인핸서 영역을 인식하고 결합하여 보다 하류에 존재하는 루시페라제 유전자를 전사하기 위하여 세포내에 루시페라제 mRNA가 출현하고, 루시페라제 단백이 신속하게 생산되어 온다. 루시페라제 mRNA는 사이토카인의 mRNA와는 달리 안정성이 항상 일정하고, mRNA로부터 단백이 합성되는 속도도 일정하므로, 노낙틴이 IL-5 유전자 프로모터/인핸서에 작용하는지 아닌지를 판정할 수 있다. 이 실험계에 있어서, 노낙틴 100nM, 1μM은 인간 IL-5 유전자 프로모터/인핸서의 기능 발현을 저해하고, IL-5 유전자의 전사를 억제함이 관찰되었다(제7도).

따라서, 노낙틴 및 그의 유연화합물은 IL-5 억제 작용을 갖는 스테로이드나 면역억제제 FK506, 사이클로스포린 A 등과 동일하게 알러지성 질환이나 호산구성 질환의 치료약으로서 유용하다.

이에 대하여 동일한 실험계를 사용하여 노낙틴의 IL-2 및 IL-4에 대한 작용을 조사한 바, 노낙틴은 IL-2 및 IL-4의 생산을 억제하지 않고(제5도), 또한 이들의 유전자 전사를 전혀 억제하지 않았다(제8도, 제9도). 따라서, 노낙틴은 감염면역 등 다른 면역계에 미치는 영향이 적은 점, 즉 면역력의 저하에 의한 이감염성이나 악성 종양 발현의 가능성 등의 사이클로스포린이나 FK506이 갖는 부작용을 회피할 수 있는 점이 기대된다. 또한 부신피질 스테로이드 약이 갖는 전술한 여러 가지 부작용을 회피한, 안심하고 임상 치료약으로서 사용할 수 있는 이점을 갖는다.

또한, 난백 알부민으로 감작한 BDF1 마우스를 사용하는 생체내 시험에 있어서, 노낙틴의 호산구 집적에 대한 영향을 시험한 바, 노낙틴은 오산구의 집적을 블록하는 것이 확인되었다(제10도). 이것은 본 발명 화합물이 호산구성 염증을 생체내에서 억제하는 것을 나타내는 것이고, 본 발명의 화합물을 알러지성 질환 및 호산구성 질환의 치료제로서 사용하는 것의 유용성을 나타내는 것이다.

일반식(Ⅰ) 및 일반식(Ⅱ)의 화합물과 같이 본 발명에 의해 적어도 1종의 사이토카인의 생산을 억제하고, 또한 적어도 1종의 사이토카인의 생산을 억제하지 않음이 명확해진 약물은, 알러지성 질환이나 호산구성 질환 등 상기한 여러 가지 면역 관련 질환의 처치에 사용할 수 있다. 이와 같은 처치제를 투여하는 데에는 이들 약물의 1종을 단독으로, 또는 2종 또는 그 이상을 조합시켜 사용한다. 그때, 그들 약물을 그대로 투여하거나, 또는 고형 또는 액상의 의약용 담체를 사용하여 과립제, 정제, 경캅셀제, 연캅셀제, 산제, 세립제, 유제, 현탁제 또는 액제 등의 제형으로 하여 경구 투여하거나, 또는 주사제로서 정맥내 투여, 근육내 투여, 피내 투여 또는 피하 투여할 수 있다. 또한, 주사제는 분말로부터 사용할 때 조제하는 방법도 있다. 한편 좌제, 점비제, 점안제 또는 흡입제의 제형으로 각각 직장, 눈, 폐의 국소 투여제로서도 사용한다. 흡입제의 경우, 수용액 또는 부분 수용액의 형태로 에어로졸로 하여 이용한다. 경구제는 또한 장용제(臟溶劑)로서 투여하는 방법도 있다.

유효성분인 약물의 담체 성분에 대한 비율은 고체 형태의 경우 0.01 중량%로부터 90중량%의 사이에서 변동한다. 적당한 고형 담체로는 유당, 덱스트린, 전분, 탄산칼슘 등을 사용한다. 제제의 조제는 통상적인 방법에 의한다.

액체 형태의 제제 즉 유제, 현탁제, 시럽제, 액제 등에 있어서 물, 알콜 및 그들의 유도체 및 오일(분별 야자유 및 낙화생유 등)을 담체로서 사용한다. 비경구 투여의 경우 담체는 올레인산에틸 및 미리스틴산이소프로필 등의 오일상 에스테르도 사용된다. 제제의 조제는 통상적인 방법에 의한다.

약물을, 허용되는 부형제에 임상 효과를 얻기 위한 필요량을 함유시켜, 액제, 연고제, 크림제 또는 로션제로 하여 국소적으로 투여할 수도 있다.

투여량은 사용할 특정한 약물, 투여의 경로, 발현한 증상의 중독도 및 치료 중인 특정한 환자에 따라 변경 가능하다. 일반적으로는 본 발명의 처치제를 1일당 0.1 내지 100㎎/㎏의 범위에서 투여하는 것이 바람직하다. 임상상의 안전 투여량은 금후 임상 안전 시험(제Ⅰ상)을 행하여 결정한다. 또한 지적 투여량, 혈액 중 농도는 유효 농도 시험(제Ⅱ상)을 행하여 결정할 수 있다.

[실시예]

이하에 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

[실시예 1 : 이낙틴의 IL-5 생산 억제]

(1) 알러지 환자 말초혈 단핵구의 IL-5 생산 억제

본 발명자들은 이미 알러지 환자 말초 T 세포의 IL-5 생산이 항진하고 있는 사실을 보고하고 있다[Mori A. et al. International Immunology 7]. 이 실험에 있어서, IL-5 생산이 분명하게 항진하고 있는 알러지 환자 몇 명으로부터 동의를 얻어 채혈을 행하고, 이하의 검토에 사용하였다.

즉, 알러지 환자의 정맥혈을 채취하고, 피콜-파큐(Ficoll-Paque) 비중원심법에 의해 말초혈 단핵구(Peripheral blood mononuclear cells : PBMC)를 분리하였다. 2×10⁶세포/웰로 AIM-V 배지(Gibco BRL 사)에 현탁하고, 24 웰 플레이트(Corning 사제)로 배양하였다. 콘카나바린 A(이후, Con A라고 한다) 10㎍/㎖를 가하여 자극하고, 동시에 노낙틴(Sigma 사제)을 첨가하였다. 48시간 배양 후, 배양 상등액을 채취하고, 특이적 IL-5 ELISA법으로 측정하였다. 얻어진 결과를 제1도에 나타낸다. 도면으로부터 명확하듯이, 노낙틴은 용량 의존적으로 IL-5의 생산을 억제하였다.

(2) 알레르겐 특이적 T 세포 클론의 IL-5 생산 억제

알러지 환자 말초혈 단핵구를 하우스더스트에 포함되는 주요한 알레르겐의 하나인 Der f Ⅱ 단백으로 항원 자극하고, 한계희석법(limiting dulution)에 의해 T 세포 클론을 수립하였다[Mori A. et al. International Archieves of Allergy and Immunology, 1995년 참조]. 항원 자극에 의해 IL-5 생산을 행하는 클론(1×10⁵세포/웰)을 96 웰 환저배양 플레이트로 배양하였다. 미리 10㎍/㎖의 항 CD3 모노클로날 항체(OKT 3 : 얀센협화사제)로 도말한 웰에 있어서, CD3 분자를 통한 자극에 의해 T 세포 클론으로부터 IL-5 생산이 보였다. 노낙틴은 100nM 이상의 농도에 있어서 IL-5 생산을 완전히 억제하였다(제2도).

[실시예 2 : 노낙틴의 IL-5 유전자 발현 억제]

(1) 알러지 환자 PBMC의 IL-5의 mRNA 발현 억제

IL-5 mRNA 발현의 검토는 역전사 폴리머라제 연쇄반응법(RT-PCR)에 의해 행하였다[Mori A. et al. International Immunology : 7 참조].

알러지 환자 말초혈로부터 상기와 같이 PBMC를 분리하여, 24 웰 플레이트(Corning 사제)에 2×10⁶세포/웰의 농도로 배양하고, Con A(10㎍/㎖)에 의해 자극하였다. 배양 개시와 동시에 노낙틴을 첨가하였다. 8시간 후, 세포를 회수하고, 펠렛에 아이소겐(I sogen, 니폰진사제)을 1㎖ 첨가하여 세포를 용해하였다. 25G 바늘이 붙은 5㎖ 주사통으로 10회 균질화하였다. 클로로포름 200㎕를 첨가하여 잘 교반한 후 13000rpm, 15분, 4℃로 원심하였다. 수층 부분을 회수하고, 이소프로필알콜 500㎕를 첨가하였다. 교반 후, -20℃로 1시간 이상 냉각하였다. 13000rpm, 15분, 4℃로 원심 후, 데칸테이션하고, 펠렛에 80% 에탄올을 가하여 세정하였다. 13000rpm, 15분, 4℃의 원심 후, 데칸테이션하고, 펠렛에 TE 버퍼(10mM 트리스-HCl, pH 8.0, 5mM EDTA) 400㎕, 3M 아세트산나트륨 용액(pH 5.3) 40㎕, 100% 에탄올 1㎖를 첨가하여 -20℃로 1시간 이상 냉각하였다. 13000rpm, 15분, 4℃ 원심 후, 데칸테이션하고, 실온에 건조 후, 펠렛을 10㎕의 증류수에 용해시켰다. 70℃로 4분 인큐베이터 후, 빙상으로 급냉하였다. 계속하여 이하의 표 1에 나타내는 RT 반응액을 9.5㎕ 가하여 42℃로 3시간 반응시켜 cDNA를 합성하였다(역전사 : Reverse transcription : RT).

[표 1]

5x 제 1 버퍼(First Buffer)4㎕

0.1M DTT1㎕

RNasin 40U/㎕1㎕

dNTPmix(10mM)1㎕

랜덤·프라이머1.5㎕

역전사 효소1㎕

반응 종료 후, 이하의 표 2에 나타내는 PCR 반응액을 작성하고, cDNA(5㎕)에 PCR 반응액을 45㎕ 첨가하였다.

[표 2]

10x PCR 반응 버퍼(Reaction Buffer)5㎕

2.5mM MgCl₂3㎕

멸균수32.6㎕

dNTPmix(10mM)2㎕

20μM 5'-IL-5 프라이머1㎕

20μM 3'-IL-5 프라이머1㎕

20μM 5'-β 액틴프라이머(actin primer)1㎕

20μM 3'-β 액틴프라이머(actin primer)1㎕

Taq 폴리머라제(5U/㎕)1㎕

또한, 경질광유(Light mineral oil : Sigma 사제)를 33㎕ 첨가하고, 이하의 표 3에 나타내는 프로토콜로 PCR법을 행하였다.

[표 3]

공정 1

2 : 3095℃

1 : 3072℃

2 : 0060℃

공정 2 - 30 사이클 반복

1 : 0095℃

1 : 3072℃

2 : 0060℃

PCR법 종료 후, 각 사이클 10㎕에 6×Type Ⅲ 색소(니폰진사제)를 2㎕ 첨가 후, 0.5×TBE 1% 아가로스겔로 전기영동을 행하였다.

양성대조로서 β-액틴을 사용하였다.

그 결과, 노낙틴은 100nM 이상의 농도에 있어서 유의하게 IL-5의 mRNA 발현을 억제하였다(제3도).

(2) 알레르겐 특이적 T 세포 클론의 IL-5 mRNA 발현 억제

실시예 1, (2)항에 기재한 Der f Ⅱ 특이적 T 세포 클론을 포르볼(phorbol) 12-미리스테이트(myristate) 13-아세테이트(acetate)(PMA) 20nM 및 이오노마이신(10M) 1μM으로 자극하고, 6시간 후 세포를 회수하였다. 노낙틴을 배양 개시와 동시에 첨가하였다. (1)항과 똑같이 RNA를 추출하고, RT-PCR법에 의해 IL-5 mRNA 발현에 대해 검토하였다. 제4도로부터 명확하듯이, 노낙틴은 양생대조로서 사용한 β-액틴의 유전자 발현에는 미치지 않고, IL-5의 mRNA 발현을 효율적으로 억제하였다.

[실시예 3 : 노낙틴의 IL-2 및 IL-4 생산에 대한 작용]

알러지 환자의 말초혈을 채취하고, 실시예 1과 동일한 방법으로 PBMC를 분리하였다. 24 웰 플레이트에서 2×10⁶세포/웰의 농도로 배양하고, Con A 10㎍/㎖에 의해 자극하였다. 동시에 노낙틴을 첨가하였다. 48시간 배양 후, 배양 상등액을 채취하고, IL-2 및 IL-4 ELISA KIT(R D System)으로 측정하였다. 노낙틴은 100nM-1μM의 범위에서 IL-2 및 IL-4의 생산을 억제하지 않았다(제5도).

[실시예 4 : 노낙틴의 인간 사이토카인 유전자 전사에 대한 억제]

(1) IL-5 유전자 전사에 대한 작용

상기의 T 세포 클론을 인간 T 세포 종양 세포주와 세포 융합함으로써, 인간 IL-5 유전자 발현 T 세포 하이브리도마를 얻었다[Mori A. et al. International Archives of Allergy and Immunology, 1995 참조].

인간 IL-5 유전자 프로모터/인핸서 영역의 약 500bp의 DNA를 레포터 유전자인 루시페라제 유전자에 접속한 pIL-5 Luc을 제작하였다(제6도). T 세포 하이브리도마 5×10⁶개를 0.5㎖ RPMI 배지(Gibco BRL 사제)에 현탁하고, pIL-5 Luc 10㎍을 250V, 800㎌의 조건으로 일렉트로포레이션법에 의해 일과성 트랜스펙션(transient transfection)하였다. 세포를 세정 후, 유도된 루시페라제 활성을 루시페라제·어세이·시스템(동양잉크사제)으로 측정하였다. 제7도에 나타내듯이, 노낙틴 100nM, 1μM은 pIL-5 Luc으로부터의 루시페라제 활성을 완전히 억제하였다. 즉, 인간 IL-5 유전자 프로모터/인핸서의 기능 발현을 저해하고, IL-5 유전자의 전사를 억제하는 작용을 나타냈다.

(2) IL-2 유전자 전사에 대한 작용

인간 IL-2 유전자 프로모터/인핸서 영역 275bp의 DNA를 루시페라제 유전자에 접속한 펙터 pIL-2 Luc을, 상기 (1)항과 동일한 방법으로 제작하였다. pIL-2 Luc 10㎍을 상기의 인간 T 세포 하이브리도마에 일렉트로포레이션법으로 트랜스펙션하고, PMA와 10M으로 48시간 자극하여, 유도된 루시페라제 활성을 측정하였다. 제8도에 명확하듯이 노낙틴 100nM은 IL-2 유전자 전사를 전혀 억제하지 않았다.

(3) IL-4 유전자 전사에 대한 작용

인간 IL-4 유전자 프로모터/인핸서 영역 270bp의 DNA를 루시페라제 유전자에 접속한 펙터 pIL-4 Luc을 제작하였다. pIL-4 Luc 10㎍을 인간 T 세포 하이브리도마에 트랜스펙션하고, PMA와 10M으로 48시간 자극하였다. 제9도에 명확하듯이, 노낙틴 100nM은 IL-4 유전자 전사를 전혀 억제하지 않았다.

이상 (1), (2), (3)으로부터 노낙틴은 알레르겐 특이적 인간 T 세포 하이브리도마의 활성화에 따라 유도되고, IL-2, IL-4 유전자 전사에는 영향을 주지 않으며, IL-5 유전자 전사를 효율적으로 억제함이 명확해졌다.

[실시예 5 : 노낙틴의 호산구 집적에 대한 생체내 억제]

6주령의 BDF₁마우스에 대하여 난백 알부민(OA) 1㎍+수산화알루미늄 겔(Alum) 1㎎을 2주 간격으로 두 번 투여하고, 감작하였다. 추가로 2주 후, 노낙틴 또는 대조로서 비히클(생리적 식염수) 2㎎/마리(100㎎/㎏)를 연속 3일간 피하주사에 의해 투여하였다. 3일째의 노낙틴 또는 비히클 투여 30분 후에 항원(생리적 식염수 중의 난백 알부민 100㎎/㎖)을 10분간 투입시켰다.

24시간 후에 기관지 폐포세정을 행하여 세포를 회수하고, 총 세포수를 카운트함과 동시에 세포 염색에 의해 분획을 해석하였다.

얻어진 결과를 제10도에 나타낸다. 제10도로부터 명확하듯이, 노낙틴은 생체내에서 IL-5 의존성의 호산구의 집적을 블록하고, 호산구 침윤을 억제함이 확인되었다.

[실시예 6 : 화합물(1)의 IL-2 생산 억제]

6주령의 BDF₁마우스에 아스카리스(Ascaris)(기생충 추출물, Sigma 사제) 100㎍을 복강내 주사하여 면역을 행한다. 동일한 면역법으로 2주 후에 재차 추가 면역하고, 그 2주 후에 비세포를 얻는다.

Con A(10㎍/㎖)으로 자극하고, 24시간 후에 상등액을 채취한다. 시험약물(화합물 1)을 자극 개시할 때부터 배양 중에 가하여 IL-2, IL-4, IL-5 생산에 대한 작용을 검토하였다. IL-2, IL-4, IL-5 생산은 각각 특이적 샌드위치 ELISA법(Genzyme 사제 키트)에 의해 행한다.

제11도에 나타내듯이, 화합물(1)은 IL-2의 생산을 억제하지만, IL-4나 IL-5의 생산은 실질적으로 억제하지 않는다. 또한, 화합물(1)의 화학식은 다음과 같다.

[실시예 7 : 화합물(2)의 IL-2 생산 억제]

6주령의 BDF₁마우스에 아스카리스(Ascaris) 100㎍을 복강내 주사하여 면역을 행한다. 동일한 면역법으로 2주 후에 재차 추가 면역하고, 그 2주 후에 비세포를 얻는다.

Con A(10㎍/㎖)으로 자극하고, 24시간 후에 상등액을 채취한다. 시험약물(화합물 2)을 자극 개시할 때부터 배양 중에 가하여 IL-2, IL-4, IL-5 생산에 대한 작용을 검토하였다. IL-2, IL-4, IL-5 생산은 각각 특이적 샌드위치 ELISA법(Genzyme 사제 키트)에 의해 행한다.

제12도에 나타내듯이, 화합물(2)은 IL-2의 생산을 억제하지만, IL-4나 IL-5의 생산은 실질적으로 억제하지 않는다. 또한, 화합물(2)의 화학식은 다음과 같다.

[실시예 8 : 화합물(3)의 IL-2 생산 억제]

Con A(10㎍/㎖)으로 자극하고, 24시간 후에 상등액을 채취한다. 시험약물(화합물 3)을 자극 개시할 때부터 배양 중에 가하여 IL-2, IL-4, IL-5 생산에 대한 작용을 검토하였다. IL-2, IL-4, IL-5 생산은 각각 특이적 샌드위치 ELISA법(Genzyme 사제 키트)에 의해 행한다.

제13도에 나타내듯이, 화합물(3)은 IL-2의 생산을 억제하지만, IL-4나 IL-5의 생산은 실질적으로 억제하지 않는다. 또한, 화합물(3)의 화학식은 다음과 같다.

[실시예 9 : 화합물(4)의 IL-2 생산 억제]

Con A(10㎍/㎖)으로 자극하고, 24시간 후에 상등액을 채취한다. 시험약물(화합물 4)을 자극 개시할 때부터 배양 중에 가하여 IL-2, IL-4, IL-5 생산에 대한 작용을 검토하였다. IL-2, IL-4, IL-5 생산은 각각 특이적 샌드위치 ELISA법(Genzyme 사제 키트)에 의해 행한다.

제14도에 나타내듯이, 화합물(4)은 IL-2의 생산을 억제하지만, IL-4나 IL-5의 생산은 실질적으로 억제하지 않는다. 또한, 화합물(4)의 화학식은 다음과 같다.

[실시예 10 : 화합물(5)의 IL-2 생산 억제]

Con A(10㎍/㎖)으로 자극하고, 24시간 후에 상등액을 채취한다. 시험약물(화합물 5)을 자극 개시할 때부터 배양 중에 가하여 IL-2, IL-4, IL-5 생산에 대한 작용을 검토하였다. IL-2, IL-4, IL-5 생산은 각각 특이적 샌드위치 ELISA법(Genzyme 사제 키트)에 의해 행한다.

제15도에 나타내듯이, 화합물(5)은 IL-2의 생산을 억제하지만, IL-4나 IL-5의 생산은 실질적으로 억제하지 않는다. 또한, 화합물(5)의 화학식은 다음과 같다.

[실시예 11 : 화합물(6)의 IL-4 및 IL-5의 생산 억제]

Con A(10㎍/㎖)으로 자극하고, 24시간 후에 상등액을 채취한다. 시험약물(화합물 6)을 자극 개시할 때부터 배양 중에 가하여 IL-2, IL-4, IL-5 생산에 대한 작용을 검토하였다. IL-2, IL-4, IL-5 생산은 각각 특이적 샌드위치 ELISA법(Genzyme 사제 키트)에 의해 행한다.

제16도에 나타내듯이, 화합물(6)(화합물 번호 : TE-323)은 IL-4 및 IL-5의 생산을 억제하지만, IL-2의 생산은 실질적으로 억제하지 않는다. 또한, 화합물(6)의 화학식은 다음과 같다.

[실시예 12 : 화합물(7)의 IL-4 및 IL-5의 생산 억제]

상기 실시예 11과 마찬가지로, IL-2, IL-4, IL-5의 생산에 대한 억제를 검토하였다.

다만, 시험약물로서 이하의 화학식으로 나타나는 화합물(7)(TE-479)을 사용하였다.

제17도에 나타내듯이, 화합물(7)은 IL-4 및 IL-5의 생산을 억제하지만, IL-2의 생산은 실질적으로 억제하지 않음이 밝혀졌다.

[실시예 13 : 화합물(8)의 IL-4 및 IL-5의 생산 억제]

다만, 시험약물로서 이하의 화학식으로 나타나는 화합물(8)(TE-760)을 사용하였다.

제18도에 나타내듯이, 화합물(7)은 IL-4 및 IL-5의 생산을 억제하지만, IL-2의 생산은 실질적으로 억제하지 않음이 밝혀졌다.

[실시예 14 : 화합물(9)의 IL-4 및 IL-5의 생산 억제]

다만, 시험약물로서 이하의 화학식으로 나타나는 화합물(9)(TE-345)를 사용하였다.

제19도에 나타내듯이, 화합물(7)은 IL-4 및 IL-5의 생산을 억제하지만, IL-2의 생산은 실질적으로 억제하지 않음이 밝혀졌다.

[발명의 효과]

본 발명에 의하면 일반식(Ⅰ) 및 일반식(Ⅱ)의 물질이 인간 IL-5 등의 인터로이킨의 유전자 전사, mRNA 발현 및 단백 생산을 억제하고, 그 때문에 소위 알러지성 질환이나 호산구성 질환 등에 대한 유용한 치료제가 된다는 것이 나타났다. 본 발명의 치료제는 부신피질 스테로이드 약과 동일한 정도나 그 이상의 임상 효과를 갖고, 또한 그 부작용을 갖지 않는 유용한 치료제가 되는 것이 기대된다.

제1도는 노낙틴에 의한 알러지 환자 말초혈 단핵구의 IL-5 생산의 억제를 나타낸다. 도면 중의 각 번호는 각각 이하의 것을 나타낸다.

1 : 무자극

2 : Con A10㎍/㎖

3 : 2+노낙틴1nM

4 : 2+노낙틴10nM

5 : 2+노낙틴100nM

6 : 2+노낙틴1μM

제2도는 노낙틴에 의한 T 세포 클론의 IL-5 생산의 억제를 나타낸다. 도면 중의 각 번호는 각각 이하의 것을 나타낸다.

1 : 무자극

2 : 항 CD3 항체 자극

3 : 2+노낙틴1nM

4 : 2+노낙틴10nM

5 : 2+노낙틴100nM

6 : 2+노낙틴1μM

제3도는 노낙틴에 의한 알러지 환자 말초혈 단핵구의 IL-5 유전자 전사의 억제를 나타내는 전기영동의 사진이다. 도면 중의 각 레인 번호는 각각 이하의 것을 나타낸다.

1 : 무자극

2 : Con A10㎍/㎖

3 : 2+노낙틴1nM

4 : 2+노낙틴100nM

5 : 2+노낙틴10nM

제4도는 노낙틴에 의한 T 세포 클론의 IL-5 유전자 전사의 억제를 나타내는 전기영동의 사진이다. 도면 중의 각 레인 번호는 각각 이하의 것을 나타낸다.

1 : 무자극

2 : PMA 20nM + 10M1μM

3 : 2+노낙틴100nM

제5도는 노낙틴의 IL-2 및 IL-4 생산에 대한 작용을 나타낸다. 도면 중의 각 번호는 각각 이하의 것을 나타낸다.

1 : 무자극

2 : Con A10㎍/㎖

3 : 2+노낙틴1μM

4 : 2+노낙틴100nM

5 : 2+노낙틴10nM

제6도는 플라스미드 pIL5 Luc 구조를 나타내는 모식도이다.

제7도는 pIL5 Luc으로부터의 루시페라제 활성의 측정에 의한 노낙틴의 IL-5 유전자 전사에 대한 작용을 나타낸다. 도면 중의 각 번호는 각각 이하의 것을 나타낸다.

1 : 무자극

2 : PMA + 10M

3 : 2+노낙틴1μM

4 : 2+노낙틴100nM

5 : 2+노낙틴10nM

제8도는 pIL2 Luc으로부터의 루시페라제 활성의 측정에 의한 노낙틴의 IL-2 유전자 전사에 대한 작용을 나타낸다. 도면 중의 각 번호는 각각 이하의 것을 나타낸다.

1 : 무자극

2 : PMA + 10M

3 : 2+노낙틴10nM

제9도는 pIL2 Luc으로부터의 루시페라제 활성의 측정에 의한 노낙틴의 IL-4 유전자 전사에 대한 작용을 나타낸다. 도면 중의 각 번호는 각각 이하의 것을 나타낸다.

1 : 무자극

2 : PMA + 10M

3 : 2+노낙틴100nM

제10도는 노낙틴의 호산구 집적에 대한 생체내 억제를 나타낸다. 도면 중의 각 번호는 각각 이하의 것을 나타낸다.

1 : 항원 없음

2 : 비히클

3 : 노낙틴

제11도는 화합물(1)이 생체내에 있어서 T 세포로부터의 IL-2의 생산을 억제하지만, IL-4나 IL-5의 생산은 실질적으로 억제하지 않음을 나타낸다.

제12도는 화합물(2)가 생체내에 있어서 T 세포로부터의 IL-2의 생산을 억제하지만, IL-4나 IL-5의 생산은 실질적으로 억제하지 않음을 나타낸다.

제13도는 화합물(3)이 생체내에 있어서 T 세포로부터의 IL-2의 생산을 억제하지만, IL-4나 IL-5의 생산은 실질적으로 억제하지 않음을 나타낸다.

제14도는 화합물(4)가 생체내에 있어서 T 세포로부터의 IL-2의 생산을 억제하지만, IL-4나 IL-5의 생산은 실질적으로 억제하지 않음을 나타낸다.

제15도는 화합물(5)가 생체내에 있어서 T 세포로부터의 IL-2의 생산을 억제하지만, IL-4나 IL-5의 생산은 실질적으로 억제하지 않음을 나타낸다.

제16도는 화합물(6)이 생체내에 있어서 T 세포로부터의 IL-4 및 IL-5의 생산을 억제하지만, IL-2의 생산은 실질적으로 억제하지 않음을 나타내는 그래프이다.

제17도는 화합물(7)이 생체내에 있어서 T 세포로부터의 IL-4 및 IL-5의 생산을 억제하지만, IL-2의 생산은 실질적으로 억제하지 않음을 나타내는 그래프이다.

제18도는 화합물(8)이 생체내에 있어서 T 세포로부터의 IL-4 및 IL-5의 생산을 억제하지만, IL-2의 생산은 실질적으로 억제하지 않음을 나타내는 그래프이다.

제19도는 화합물(9)이 생체내에 있어서 T 세포로부터의 IL-4 및 IL-5의 생산을 억제하지만, IL-2의 생산은 실질적으로 억제하지 않음을 나타내는 그래프이다.

Claims

T 세포에 있어서 사이토카인 IL-2, IL-4, IL-5 및 IL-8의 적어도 1종의 생산을 억제하고, 또한 적어도 1종의 생산을 억제하지 않는 물질을 유효성분으로 하는 면역 관련병 처치제.
제1항에 있어서, 생산의 억제가 생산이 억제되어야 할 사이토카인 유전자의 전사를 억제함으로써 행해지는 처치제.
제1항 또는 2항에 있어서, 생산이 억제되어야 할 사이토카인이 IL-2인 처치제.
제3항에 있어서, 생산이 억제되지 않는 사이토카인이 IL-4, IL-5 및 IL-8의 적어도 1종인 처치제.
제1항 또는 2항에 있어서, 생산이 억제되어야 할 사이토카인이 IL-4, IL-5 및 IL-8의 적어도 1종인 처치제.
제5항에 있어서, 생산이 억제되지 않는 사이토카인이 IL-2인 처치제.
제1항 내지 6항 중 어느 하나에 있어서, 당해 물질이 마크로라이드계 항생물질인 처치제.
제7항에 있어서, 마크로라이드계 항생물질이 10 내지 40원 락톤환 구조를 갖는 것인 처치제.
제8항에 있어서, 마크로라이드계 항생물질이 12원 락톤환 구조를 갖는 것인 처치제.
제8항에 있어서, 마크로라이드계 항생물질이 14원 락톤환 구조를 갖는 것인 처치제.
제8항에 있어서, 마크로라이드계 항생물질이 16원 락톤환 구조를 갖는 것인 처치제.
제7항에 있어서, 마크로라이드계 항생물질이 다음 일반식(Ⅰ)인 처치제:

상기 식에서,

R₁, R₂, R₃및 R₄는 각각 독립적으로 탄소수 1 내지 6의 알킬기이다.
제12항에 있어서, R₁, R₂, R₃및 R₄가 메틸 또는 에틸인 처치제.
제13항에 있어서, 마크로라이드계 항생물질이 노낙틴, 모낙틴, 디낙틴, 트리낙틴 또는 테트라낙틴인 처치제.
제7항에 있어서, 마크로라이드계 항생물질이 다음 일반식(Ⅱ)인 처치제:

상기 식에서,

R₅는 그것이 결합하는 탄소 원자와 함께 옥심화될 수 있는 카보닐기이고,

R₆및 R₇은 각각 함께 -O(CH₂)₂O-, -O(C=O)O-, -NH(CH₂)₂O- 또는 NH(C=O)O-를 형성할 수 있는 하이드록시기이며,

R₈은 C=O 또는 CH(O-R)(다만, R은 당 잔기 또는 아실기)이고,

R₉는 당 잔기이며,

R₁₀은 (저급)알킬화될 수 있는 하이드록시기이고, 다만, R₅가 그것이 결합하는 탄소 원자와 함께 옥심화된 카보닐기로서, R₆과 R₇이 각각 함께 -NH(CH₂)₂O- 또는 -NH(C=O)O-를 형성할 경우, 전자 중의 질소 원자와 후자 중의 질소 원자가 저급알킬렌쇄를 통하여 연결될 수 있다.
제15항에 있어서, 마크로라이드계 항생물질이 R₅가 식 : C=NOR(R는 아릴기상에 있어서 치환 또는 비치환 아릴 저급알킬기, 또는 페닐 저급알케닐아릴기이다)을 의미하는 상기 식(Ⅱ)의 화합물인 처치제.
제1항에 있어서, IL-2의 생산 억제에 의해 교원병, 자기면역 질환, 장기이식 등의 처치에 유용한 처치제.
제1항에 있어서, IL-4의 생산 억제에 의해 IgE 마스트셀 의존 과민증 등의 처치에 유용한 처치제.
제1항에 있어서, IL-5의 생산 억제에 의해 알러지성 또는 호산구성 질환 등의 처치에 유용한 처치제.
제1항에 있어서, IL-8의 생산 억제에 의해 호중구성 염증 등의 처치에 유용한 처치제.