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KR102689262B1 - Tyr 또는 mmp1을 표적화하는 핵산을 사용한 노화 및 피부 장애의 치료 방법 - Google Patents

Tyr 또는 mmp1을 표적화하는 핵산을 사용한 노화 및 피부 장애의 치료 방법 Download PDF

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KR102689262B1
KR102689262B1 KR1020237007124A KR20237007124A KR102689262B1 KR 102689262 B1 KR102689262 B1 KR 102689262B1 KR 1020237007124 A KR1020237007124 A KR 1020237007124A KR 20237007124 A KR20237007124 A KR 20237007124A KR 102689262 B1 KR102689262 B1 KR 102689262B1
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제라드 코웬버그
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피오 파마슈티칼스 코프.
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Abstract

본 발명은 개선된 조직 및 세포 흡수 특징을 갖는 RNAi 구축물 및 피내 적용에서의 이들 화합물의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

TYR 또는 MMP1을 표적화하는 핵산을 사용한 노화 및 피부 장애의 치료 방법 {METHODS FOR TREATING AGING AND SKIN DISORDERS USING NUCLEIC ACIDS TARGETING TYR OR MMP1}
관련 출원
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2014년 9월 5일에 출원된 표제 "METHODS FOR TREATING AGING AND SKIN DISORDERS USING NUCLEIC ACIDS TARGETING TYR OR MMP1"의 미국 가출원 일련 번호 US 62/046,523, 2014년 9월 9일에 출원된 표제 "METHODS FOR TREATING AGING AND SKIN DISORDERS USING NUCLEIC ACIDS TARGETING TYR OR MMP1"의 미국 가출원 일련 번호 US 62/047,972, 및 2015년 1월 12일에 출원된 표제 "METHODS FOR TREATING AGING AND SKIN DISORDERS USING NUCLEIC ACIDS TARGETING TYR OR MMP1"의 미국 가출원 일련 번호 US 62/102,287의 이익을 주장하며, 이들 각각의 전체 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 개선된 생체내 전달 특성을 갖는 핵산 분자, 및 MMP1 또는 TYR의 발현을 감소시키기 위한 그의 용도에 관한 것이다.
상보적 올리고뉴클레오티드 서열은 유망한 치료제이며, 유전자 기능을 규명하는데 있어서 유용한 연구 도구이다. 그러나, 선행 기술의 올리고뉴클레오티드 분자는 그의 임상 개발을 저해할 수 있는 여러 문제를 겪고 있고, 이는 빈번하게는 이러한 조성물을 사용하여 생체내에서 유전자 발현 (단백질 합성 포함)의 의도하는 효율적 억제를 달성하는 것을 어렵게 한다.
주요 문제는 이들 화합물의 세포 및 조직으로의 전달이다. 통상적인 이중-가닥 RNAi 화합물, 19-29개의 염기 길이는 대략 1.5 x 10-15 nm 크기의 고도로 음으로-하전된 견고한 나선을 형성한다. 이러한 막대형 분자는 세포막을 통과할 수 없으며, 그 결과 시험관내 및 생체내 둘 다에서 매우 제한된 효능을 갖는다. 그 결과, 모든 통상적인 RNAi 화합물은 그의 조직 분포 및 세포 흡수를 촉진하는 일부 종류의 전달 비히클을 필요로 한다. 이는 RNAi 기술의 주요 한계인 것으로 고려된다.
올리고뉴클레오티드에 화학적 변형을 가하여 그의 세포 흡수 특성을 개선시키려는 이전의 시도가 존재해왔다. 하나의 이러한 변형은 올리고뉴클레오티드에 콜레스테롤 분자를 부착시키는 것이었다. 이러한 접근법에 대한 최초 보고는 1989년에 레트싱어(Letsinger) 등에 의한 것이었다. 후속적으로, ISIS 파마슈티칼스, 인크.(ISIS Pharmaceuticals, Inc.) (캘리포니아주 칼스배드)는 올리고뉴클레오티드에 콜레스테롤 분자를 부착시키는 보다 진보된 기술에 대해 보고하였다 (Manoharan, 1992).
90년대 후반에 siRNA의 발견과 함께, 그의 전달 프로파일을 증진시키기 위한 유사한 유형의 변형이 이들 분자에 대해 시도되었다. 약간 변형된 siRNA (Soutschek, 2004) 및 고도로 변형된 siRNA (Wolfrum, 2007)에 접합된 콜레스테롤 분자가 문헌에 출현하였다. 또한, 문헌 [Yamada et al., 2008]은 siRNA의 콜레스테롤 매개 흡수를 추가로 개선시키는 진보된 링커 화학물질의 사용에 대해 보고하였다. 이러한 모든 노력에도 불구하고, 이들 유형의 화합물의 흡수는 생물학적 유체의 존재 하에 억제되어 생체내 유전자 침묵에 있어서 고도로 제한된 효능을 생성함으로써, 임상 세팅에서 이들 화합물의 적용성을 제한하였다.
본 발명의 측면은 피부 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 (MMP1), 티로시나제 (TYR) 또는 프로스타글란딘-엔도퍼옥시드 신타제 2 (PTGS2)를 코딩하는 유전자에 대해 지시된 핵산 분자의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 피부 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 이중 가닥 핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역을 포함하는 단리된 이중 가닥 핵산 분자이며, 여기서 이중 가닥인 분자의 영역은 8-15개의 뉴클레오티드 길이이고, 여기서 가이드 가닥은 4-12개의 뉴클레오티드 길이인 단일 가닥 영역을 함유하고, 여기서 가이드 가닥의 단일 가닥 영역은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 포스포로티오에이트 변형을 함유하고, 여기서 단리된 이중 가닥 핵산 분자의 뉴클레오티드 중 적어도 40%는 변형된다.
일부 실시양태에서, 단리된 이중 가닥 핵산 분자는 단리된 이중 가닥 핵산 분자에 부착된 소수성 접합체를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 피부 장애는 피부 광 노화 또는 여드름 반흔형성이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 MMP1을 코딩하는 유전자에 대해 지시된다. 일부 실시양태에서, 피부 장애는 피부 과다색소침착, 기미 또는 피부 흑색점이다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 TYR을 코딩하는 유전자에 대해 지시된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 RNAi 작용 메카니즘을 통해 유전자 발현을 침묵시킨다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 국소 전달을 위해 제제화된 조성물 중에 존재한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 피부에의 전달을 위해 제제화된 조성물 중에 존재한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 피내 주사를 위해 제제화된 조성물 중에 존재한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 피내 주사 후 분자의 연장 방출을 위해 제제화된 조성물 중에 존재한다.
일부 실시양태에서, 상이한 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 지시된 2종 이상의 핵산 분자가 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 동일한 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 지시된 2종 이상의 핵산 분자가 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 뉴클레오티드로 구성되고, 뉴클레오티드 중 적어도 30%는 화학적으로 변형된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 적어도 1개의 변형된 백본 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 적어도 1개의 포스포로티오에이트 연결을 함유한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 뉴클레오티드로 구성되고, 뉴클레오티드 중 적어도 1개는 2'OMe 또는 2'플루오로로부터 선택된 2' 화학적 변형을 함유한다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 1회 투여된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 1회 초과 투여된다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 1 또는 표 2 내의 서열의 적어도 12개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 1 및 2에 제시된 바와 같은 MMP1-2, MMP1-7, MMP1-8, MMP1-23, MMP1-35 및 MMP1-36으로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 3 또는 표 4 내의 서열의 적어도 12개의 인접 뉴클레오티드에 대해 지시된다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 3 및 4에 제시된 바와 같은 TYR-5, TYR-8, TYR-13, TYR-14, TYR-15, TYR-20, TYR-32, TYR-33 및 TYR-34로부터 선택된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 피부 장애는 만성 궤양 (정맥 궤양), 괴저 (비브리오 및 클로스트리디움) 및 수포성 피부 장애 (예를 들어, 스티븐스-존슨 등)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 피부 장애는 켈로이드이다.
본 발명의 측면은 표 1-4 내의 서열로부터 선택된 서열에 대해 지시된, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자는 sd-rxRNA이다.
본 발명의 측면은 표 1-4 내의 서열로부터 선택된 서열의 적어도 12개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 서열에 대해 지시된, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자는 sd-rxRNA이다.
본 발명의 측면은 표 1-4 내의 서열로부터 선택된 서열의 적어도 12개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자는 sd-rxRNA이다.
일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 소수성으로 변형된다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 1개 이상의 소수성 접합체에 연결된다.
본 발명의 측면은 본원에 기재된 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자 중 임의의 것을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자는 MMP1-2, MMP1-7, MMP1-8, MMP1-23, MMP1-35, MMP1-36, TYR-5, TYR-8, TYR-13, TYR-14, TYR-15, TYR-20, TYR-32, TYR-33 및 TYR-34로부터 선택된 서열을 포함한다.
본 발명의 측면은 결핵, 관절염 (골 및 류마티스), 각막 미란, 치주염, 자궁내막암, 또는 자궁내막증의 치료를 필요로 하는 대상체에게 매트릭스 메탈로프로테이나제-1 (MMP1)을 코딩하는 유전자에 대해 지시된 핵산 분자의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 결핵, 관절염 (골 및 류마티스), 각막 미란, 치주염, 자궁내막암, 또는 자궁내막증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 5 또는 표 6 내의 서열로부터 선택된 서열의 적어도 12개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 5 또는 표 6 내의 서열로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 5 내의 서열로부터 선택된 센스 가닥 서열 및 표 6 내의 서열로부터 선택된 안티센스 가닥 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 7 또는 표 8 내의 서열로부터 선택된 서열의 적어도 12개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 7 또는 표 8 내의 서열로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 표 7 내의 서열로부터 선택된 센스 가닥 서열 및 표 8 내의 서열로부터 선택된 안티센스 가닥 서열을 포함한다.
본 발명의 측면은 표 5-8 내의 서열로부터 선택된 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자는 sd-rxRNA이다.
본 발명의 측면은 표 5-8 내의 서열로부터 선택된 서열의 적어도 12개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자는 sd-rxRNA이다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 소수성으로 변형된다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 1개 이상의 소수성 접합체에 연결된다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자는 MMP-1에 대해 지시되고,
i) 센스 가닥 서열은 표 5에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호(SEQ ID NO): 167, 171 및 172로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 6에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 196, 197, 198, 199 및 200으로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
ii) 센스 가닥 서열은 표 5에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 173 및 179로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 6에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 202, 203, 204, 205, 206, 207 및 208로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
iii) 센스 가닥 서열은 표 5에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 180, 184 및 185로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 6에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 209, 210, 211, 212 및 213으로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
iv) 센스 가닥 서열은 표 5에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 186 및 190으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 6에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 215, 216, 217, 218 및 219로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
v) 센스 가닥 서열은 표 5에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 191 및 195로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 6에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 220, 221, 222, 223 및 224로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자는 TYR에 대해 지시되고,
i) 센스 가닥 서열은 표 7에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 225, 229 및 230으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 8에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 264, 265, 266, 267 및 268로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
ii) 센스 가닥 서열은 표 7에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 231 및 235로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 8에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 270, 271, 272, 273 및 274로 이루어진 군으로부터 선택되거나,
iii) 센스 가닥 서열은 표 7에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 236, 240 및 241로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 8에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 275, 276, 277, 278 및 279로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
iv) 센스 가닥 서열은 표 7에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 242, 246 및 247로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 8에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 281, 282, 283, 284 및 285로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
v) 센스 가닥 서열은 표 7에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 248 및 252로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 8에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 287, 288, 289, 290 및 291로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
vi) 센스 가닥 서열은 표 7에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 253 및 257로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 8에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 292, 293, 294, 295 및 296으로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
vii) 센스 가닥 서열은 표 7에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 258, 262 및 263으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 안티센스 가닥 서열은 표 8에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 297, 298, 299, 300 및 301로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 측면은 색소성 망막염, 애디슨병, 신경모세포종, 교모세포종 또는 파킨슨병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 티로시나제 (TYR)를 코딩하는 유전자에 대해 지시된 핵산 분자의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 색소성 망막염, 애디슨병, 신경모세포종, 교모세포종 또는 파킨슨병을 치료하는 방법에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 핵산 분자는 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 이중 가닥 핵산 분자이다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역을 포함하는 단리된 이중 가닥 핵산 분자이며, 여기서 이중 가닥인 분자의 영역은 8-15개의 뉴클레오티드 길이이고, 여기서 가이드 가닥은 4-12개의 뉴클레오티드 길이인 단일 가닥 영역을 함유하고, 여기서 가이드 가닥의 단일 가닥 영역은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 포스포로티오에이트 변형을 함유하고, 여기서 단리된 이중 가닥 핵산 분자의 뉴클레오티드 중 적어도 40%는 변형된다. 일부 실시양태에서, 단리된 이중 가닥 핵산 분자는 단리된 이중 가닥 핵산 분자에 부착된 소수성 접합체를 추가로 포함한다.
본 발명의 각각의 제한은 본 발명의 다양한 실시양태를 포괄할 수 있다. 따라서, 어느 하나의 요소 또는 요소의 조합을 수반하는 본 발명의 각각의 제한은 본 발명의 각각의 측면에 포함될 수 있는 것으로 예상된다. 본 발명은 그의 적용에서 하기 기재에 제시되거나 도면에 예시된 성분의 구축 및 배열의 세부사항으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태일 수 있고, 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다.
첨부 도면은 일정한 비례로 도시된 것으로 의도되지 않는다. 도면에서 다양한 형상으로 예시된 각각의 동일하거나 거의 동일한 성분은 같은 숫자에 의해 나타내어진다. 명확화를 위해, 모든 성분이 모든 도면에서 표지되지 않을 수 있다. 하기 도면에서:
도 1a-1c는 MMP1-표적화 sd-rxRNA의 확인을 제시한다. 표 1 및 2 내의 MMP1-표적화 sd-rxRNA는 HT-1080 세포에서 시험관내 표적 유전자 mRNA 수준을 유의하게 감소시킨다. 각각의 샘플의 경우에, 1μM은 좌측에 제시되고, 0.1μM은 우측에 제시된다.
도 2a-2b는 HT-1080 세포에서의 MMP1-표적화 sd-rxRNA 용량 반응을 제시한다. 0.01μM-1.0 μM 범위의 농도에 의한 처리를 제시한다. 도 2a에서, 각각의 샘플의 경우에, 그래프 상의 막대의 순서는 1μM, 0.5μM, 0.1μM, 0.05μM, 0.025μM 및 0.01μM에 상응한다. 도 2b에서, 그래프 상의 막대의 순서는 1μM, 0.5μM, 0.1μM, 0.05μM 및 0.01μM에 상응한다.
도 3은 TYR-표적화 sd-rxRNA의 확인을 제시한다. 표 3 및 4 내의 TYR-표적화 sd-rxRNA는 SK-MEL-5 세포에서 시험관내 표적 유전자 mRNA 수준을 유의하게 감소시킨다.
도 4는 SK-MEL-5 세포에서의 TYR-표적화 sd-rxRNA 용량 반응을 제시한다. 0.01μM-1.0 μM 범위의 농도에 의한 처리를 제시한다. 각각의 샘플의 경우에, 그래프 상의 막대의 순서는 1μM, 0.5μM, 0.1μM, 0.05μM, 0.025μM 및 0.01μM에 상응한다.
도 5a 및 도 5b는 화학적 최적화에 의해 개선된 MMP-1 및 TYR 화합물 효력을 제시한다. 각각의 샘플의 경우에, 그래프 상의 막대의 순서는 0.01μM, 0.025μM, 0.1μM, 0.5μM 및 1.0μM에 상응한다.
도 6a 및 도 6b는 MMP1 mRNA의 감소가 MMP1 효소 활성의 용량-의존성 감소를 발생시킨다는 것을 제시한다. 도 6a는 HT-1080 세포를 MMP1-표적화 sd-rxRNA MMP1-23으로 처리한 경우에 MMP1 mRNA 수준의 용량-의존성 감소가 관찰되었다는 것을 제시한다. 도 6b는 HT-1080 세포를 MMP1-표적화 sd-rxRNA MMP1-23으로 처리한 경우에 MMP1 효소 활성에서 용량-의존성 감소가 관찰되었다는 것을 제시한다.
도 7a 및 도 7b는 MMP1-표적화 sd-rxRNA 화합물이 시험관내 A549 폐 암종 세포의 감소된 이동 속도를 발생시킨다는 것을 제시한다. 도 7a는 A549 비소세포 폐 암종 세포주에서의 스크래치 이동 검정을 제시한다. 도 7b는 MMP1-표적화 sd-rxRNA, 비-표적화 대조군 (NTC)으로 처리된 배양물, 또는 비처리 대조군 (UTC)에서의 세포를 제시한다. 스크래치 검정에서 감소된 이동은 sd-rxRNA 처리의 결과로서 MMP1 감소로 인한 암 세포의 침습 속성에서의 감소를 나타낼 수 있다.
도 8은 TYR-표적화 sd-rxRNA 화합물이 시험관내 색소침착의 시각적 감소를 발생시킨다는 것을 제시한다. 멜라닌세포를 함유하는 멜라노덤(MelanoDerm)™ 3차원 표피 배양 모델을 사용하였다. 배양 배지에 첨가된 TYR-표적화 sd-rxRNA와 함께 14일 배양을 사용하였다.
본원에 사용된 "핵산 분자"는 sd-rxRNA, rxRNAori, 올리고뉴클레오티드, ASO, siRNA, shRNA, miRNA, ncRNA, cp-lasiRNA, aiRNA, BMT-101, RXI-109, EXC-001, 단일-가닥 핵산 분자, 이중-가닥 핵산 분자, RNA 및 DNA를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 화학적으로 변형된 핵산 분자, 예컨대 화학적으로 변형된 올리고뉴클레오티드이다.
sd-rxRNA 분자
본 발명의 측면은 sd-rxRNA 분자에 관한 것이다. 본원에 사용된 "sd-rxRNA" 또는 "sd-rxRNA 분자"는 2014년 8월 5일에 승인된 표제 "REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS"의 미국 특허 번호 8,796,443 및 2009년 9월 22일에 출원된 표제 "REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS"의 PCT 공개 번호 WO2010/033247 (출원 번호 PCT/US2009/005247)에 기재되고 이로부터 참조로 포함되는 바와 같은 자기-전달 RNA 분자를 지칭한다. 간략하게, sd-rxRNA (sd-rxRNA나노로도 지칭됨)는 최소 16개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 가이드 가닥 및 8-18개의 뉴클레오티드 길이의 패신저 가닥을 포함하는 단리된 비대칭 이중 가닥 핵산 분자이며, 여기서 이중 가닥 핵산 분자는 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역을 갖고, 단일 가닥 영역은 4-12개의 뉴클레오티드 길이를 가지며 적어도 3개의 뉴클레오티드 백본 변형을 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 이중 가닥 핵산 분자는 평활인 1개의 말단을 갖거나, 또는 1 또는 2개의 뉴클레오티드 오버행을 포함한다. sd-rxRNA 분자는 화학적 변형을 통해, 및 일부 경우에 소수성 접합체의 부착을 통해 최적화될 수 있다.
일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 가이드 가닥 및 패신저 가닥을 포함하는 단리된 이중 가닥 핵산 분자를 포함하고, 여기서 이중 가닥인 분자의 영역은 8-15개의 뉴클레오티드 길이이고, 여기서 가이드 가닥은 4-12개의 뉴클레오티드 길이인 단일 가닥 영역을 함유하고, 여기서 가이드 가닥의 단일 가닥 영역은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 포스포로티오에이트 변형을 함유하고, 여기서 이중 가닥 핵산의 뉴클레오티드 중 적어도 40%는 변형된다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 본원에서 단리된 이중 가닥 또는 듀플렉스 핵산, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드, 나노 분자, 나노 RNA, sd-rxRNA나노, sd-rxRNA 또는 본 발명의 RNA 분자로 지칭된다.
sd-rxRNA는 통상적인 siRNA와 비교하여 세포에 의해 훨씬 더 효과적으로 수용된다. 이들 분자는 표적 유전자 발현을 침묵시키는데 고도로 효율적이고, 이전에 기재된 RNAi 분자에 비해 혈청의 존재 하에서의 높은 활성, 효율적인 자기 전달, 매우 다양한 링커와의 상용성, 및 독성과 연관된 화학적 변형의 존재 감소 또는 완전한 부재를 포함한 유의한 이점을 제공한다.
단일-가닥 폴리뉴클레오티드와 대조적으로, 듀플렉스 폴리뉴클레오티드는 전통적으로 견고한 구조 및 막 수송을 어렵게 하는 다수의 음전하를 갖고 있기 때문에 세포로의 전달이 어려웠다. 그러나, sd-rxRNA는 부분적으로 이중-가닥이지만, 생체내에서 단일-가닥으로 인식됨에 따라 세포막을 가로질러 효율적으로 전달될 수 있다. 그 결과, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 많은 경우에 자기 전달될 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 통상적인 RNAi 작용제와 유사한 방식으로 제제화될 수 있거나, 또는 단독으로 (또는 비-전달 유형 담체와 함께) 세포 또는 대상체로 전달되어 자기 전달되도록 할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 분자의 한 부분은 통상적인 RNA 듀플렉스와 유사하고 분자의 제2 부분은 단일 가닥인 자기 전달 비대칭 이중-가닥 RNA 분자가 제공된다.
일부 측면에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 이중 가닥 영역, 및 5개의 뉴클레오티드 이상의 특이적 화학적 변형 패턴의 단일 가닥 영역을 포함하는 비대칭 구조의 조합을 갖고, 친지성 또는 소수성 분자에 접합된다. 이러한 부류의 RNAi 유사 화합물은 시험관내 및 생체내에서 우수한 효능을 갖는다. 단일 가닥 영역에 적용된 포스포로티오에이트 변형과 조합된 견고한 듀플렉스 영역의 크기의 감소는 관찰된 우수한 효능에 기여하는 것으로 여겨진다.
피부에 sd-rxRNA를 효과적으로 투여하고 유전자 발현을 침묵시키는 방법은 2014년 3월 4일에 승인된 표제 "RNA INTERFERENCE IN SKIN INDICATIONS"의 미국 특허 번호 8,664,189, 2013년 4월 4일에 출원된 표제 "RNA INTERFERENCE IN DERMAL AND FIBROTIC INDICATIONS"의 미국 특허 공개 번호 US2014/0113950, 2009년 9월 22일에 출원된 표제 "RNA INTERFERENCE IN SKIN INDICATIONS"의 PCT 공개 번호 WO 2010/033246, 및 2011년 3월 24일에 출원된 표제 "RNA INTERFERENCE IN DERMAL AND FIBROTIC INDICATIONS"의 PCT 공개 번호 WO2011/119887에서 입증된 바 있다. 상기 언급된 특허 및 공개 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US2014/0113950의 도 42는 RXI-109 (CTGF-표적화 sd-rxRNA)의 2회 피내 주사 후에 생체내 (래트 피부) RXI-109의 피내 주사에 따른 CTGF 침묵을 입증한다. 제시된 데이터는 래트 진피의 절제 상처 모델을 사용한 연구로부터의 것이다. RXI-109의 2회 피내 주사 후에, CTGF vs. 비-표적화 대조군의 침묵이 적어도 5일 동안 지속되었다. CTGF mRNA의 감소는 용량 의존성이었다: 용량 매칭 비-표적화 대조군과 비교하여 300 및 600 μg의 경우에 각각 51 및 67%. 방법: RXI-109 또는 비-표적화 대조군 (NTC)을 피내 주사 (200 uL 주사당 300 또는 600 ug)에 의해 제1일 및 제3일에 래트의 배면 상 4개의 부위에 각각 투여하였다. 제2 투여 (제3일) ~30분 후에 각각의 주사 부위에 4 mm 절제 상처를 만들었다. 상처 부위 및 주위 조직을 포괄하는 말단 생검 샘플을 제8일에 수거하였다. RNA를 단리하고, qPCR에 의한 유전자 발현 분석에 적용하였다. 데이터를 TATA 박스 결합 단백질 (TBP) 하우스키핑 유전자의 수준에 대해 정규화하고, 1.0으로 설정된 PBS 비히클 대조군에 관해 그래프화하였다. 오차 막대는 개별 생검 샘플 사이의 표준 편차를 나타낸다. RXI-109-처리군 vs 용량-매칭 비-표적화 대조군에 대한 P 값은 600 μg의 경우에 ** p <0.001, 300 μg의 경우에 * p <0.01이었다.
본원에 개시된 sd-rxRNA 분자는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 번호 US2014/0113950에 개시된 sd-rxRNA 분자와 동일한 방식으로 피부에 투여될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
매트릭스 메탈로프로테이나제
일부 측면에서, 본 개시내용은 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)를 표적화하는 핵산, 예컨대 sd-rxRNA의 용도에 관한 것이다. 본원에 사용된 "매트릭스 메탈로프로테이나제"는 콜라겐, 젤라틴, 피브로넥틴, 라미닌, 콜레스테롤 술페이트, 아그레칸, 피브리노겐 및 피브린을 포함하나 이에 제한되지는 않는 세포외 매트릭스 단백질을 분해할 수 있는 아연-의존성 엔도펩티다제를 지칭한다. MMP는 여러 세포 행동, 예를 들어 세포 증식, 세포 이동, 세포 분화, 혈관신생, 아폽토시스 및 면역 기능과 연결되어 왔다. 여러 유전자는 MMP1, MMP2, MMP3, MMP7, MMP8, MMP9, MMP10, MMP11, MMP12, MMP13, MMP14, MMP15, MMP16, MMP17, MMP19, MMP20, MMP21, MMP23A/B, MMP24, MMP25, MMP26, MMP27 및 MMP28을 포함하나 이에 제한되지는 않는 MMP를 코딩한다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 간질 콜라겐을 분해 또는 파괴하는 MMP를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 간질 콜라겐은 콜라겐 I, 콜라겐 II 및/또는 콜라겐 III이다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다.
티로시나제
일부 측면에서, 본 개시내용은 티로시나제를 표적화하는 핵산, 예컨대 sd-rxRNA의 용도에 관한 것이다. 본원에 사용된 "티로시나제"는 멜라닌 생산, 티로신의 히드록실화, 및 도파에서 도파퀴논으로의 산화에 대한 속도 제한 단계를 제어하는 옥시다제를 지칭한다. 티로시나제는 TYR 유전자에 의해 코딩된다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 TYR을 표적화한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 RNAi 화합물은 듀플렉스 영역 (8-15개의 염기 길이의, 효율적인 RISC 진입을 위해 요구됨) 및 4-12개의 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 영역을 포함하는 비대칭 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 듀플렉스 영역은 13 또는 14개의 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 6 또는 7개의 뉴클레오티드 단일 가닥 영역이 바람직하다. 또한, 새로운 RNAi 화합물의 단일 가닥 영역은 2-12개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결 (포스포로티오에이트 변형으로 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 6-8개의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결이 바람직하다. 추가로, 본 발명의 RNAi 화합물은 또한, 안정성을 제공하고 RISC 진입에 상용성인, 고유한 화학적 변형 패턴을 포함한다. 이들 요소의 조합은 시험관내 및 생체내 RNAi 시약의 전달에 고도로 유용한 예상외의 특성을 발생시킨다.
안정성을 제공하고 RISC 진입에 상용성인 화학적 변형 패턴은 센스 또는 패신저 가닥 뿐만 아니라 안티센스 또는 가이드 가닥에 대한 변형을 포함한다. 예를 들어, 패신저 가닥은, 안정성이 확인되고 활성을 간섭하지 않는 임의의 화학 물질로 변형될 수 있다. 이러한 변형은 2' 리보 변형 (O-메틸, 2' F, 2 데옥시 및 다른 것) 및 포스포로티오에이트 변형과 같은 백본 변형을 포함한다. 패신저 가닥에서의 바람직한 화학적 변형 패턴은 패신저 가닥 내의 C 및 U 뉴클레오티드의 O메틸 변형을 포함하거나, 또는 대안적으로 패신저 가닥이 완전히 O메틸 변형될 수 있다.
예를 들어, 가이드 가닥은 또한 RISC 진입을 간섭하지 않으면서 안정성이 확인된 임의의 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 가이드 가닥에서의 바람직한 화학적 변형 패턴은 2' F 변형된 대다수의 C 및 U 뉴클레오티드 및 인산화된 5' 말단을 포함한다. 가이드 가닥에서의 또 다른 바람직한 화학적 변형 패턴은 위치 1의 2'O메틸 변형 및 위치 11-18에서의 C/U 및 5' 말단 화학적 인산화를 포함한다. 가이드 가닥에서의 또 다른 바람직한 화학적 변형 패턴은 위치 1의 2'O메틸 변형 및 위치 11-18에서의 C/U 및 5' 말단 화학적 인산화 및 위치 2-10에서의 C/U의 2'F 변형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 패신저 가닥 및/또는 가이드 가닥은 적어도 1개의 5-메틸 C 또는 U 변형을 함유한다.
일부 실시양태에서, sd-rxRNA 내 뉴클레오티드 중 적어도 30%가 변형된다. 예를 들어, sd-rxRNA 내 뉴클레오티드 중 적어도 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 변형된다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA 내 뉴클레오티드 중 100%가 변형된다.
상기 기재된 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 화학적 변형 패턴은 널리 허용되고, 비대칭 RNAi 화합물의 효능을 실제로 개선시켰다. 일부 실시양태에서, 기재된 성분 (가이드 가닥 안정화, 포스포로티오에이트 스트레치, 센스 가닥 안정화 및 소수성 접합체) 중 임의의 것의 제거, 또는 일부 경우에 크기의 증가는 준최적 효능, 및 일부 경우에 효능의 완전한 상실을 야기한다. 요소의 조합은 HeLa 세포와 같은 세포로의 수동 전달 후에도 완전히 활성인 화합물의 개발을 발생시킨다.
일부 경우에, sd-rxRNA는 신규 유형의 화학을 사용하여 화합물의 소수성을 개선시킴으로써 추가로 개선될 수 있다. 예를 들어, 1종의 화학은 소수성 염기 변형을 사용하는 것과 관련된다. 변형이 염기의 분배 계수의 증가를 발생시키는 한, 임의의 위치의 임의의 염기가 변형될 수 있다. 변형 화학을 위한 바람직한 위치는 피리미딘의 위치 4 및 5이다. 이들 위치의 주요 이점은 (a) 합성이 용이하고 (b) RISC 복합체 로딩 및 표적 인식에 필수적인 염기-쌍형성 및 A형 나선 형성의 간섭이 결여되어 있다는 것이다. 다중 데옥시 우리딘이 전체 화합물 효능을 간섭하지 않으면서 존재하는 sd-rxRNA 화합물의 버전을 사용하였다. 또한, 소수성 접합체의 구조를 최적화하여 조직 분포 및 세포 흡수에서 주요 개선을 얻을 수 있었다. 일부 바람직한 실시양태에서, 스테롤의 구조를 변형하여 C17 부착 쇄를 변경 (증가/감소)시켰다. 이러한 유형의 변형은 세포 흡수에서의 유의한 증가 및 생체내 조직 흡수 특성의 개선을 발생시킨다.
본 발명에 따라 제제화된 dsRNA는 또한 rxRNAori를 포함한다. rxRNAori는 2009년 2월 11일에 출원된 표제 "MODIFIED RNAI POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF"의 PCT 공개 번호 WO2009/102427 (출원 번호 PCT/US2009/000852) 및 2010년 11월 1일에 출원된 표제 "MODIFIED RNAI POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF"의 미국 특허 공개 번호 2011/0039914에 기재되고 이로부터 참조로 포함되는 RNA 분자의 부류를 지칭한다.
일부 실시양태에서, rxRNAori 분자는 5'-말단 및 3'-말단을 갖는 센스 가닥 (여기서 센스 가닥은 2'-변형된 리보스 당에 의해 고도로 변형되고, 여기서 센스 가닥의 중심 부분의 3-6개의 뉴클레오티드는 2'-변형된 리보스 당에 의해 변형되지 않음), 및 센스 가닥 및 표적 유전자의 mRNA에 혼성화하는 5'-말단 및 3'-말단을 갖는 안티센스 가닥을 포함하는, 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 12-35개의 뉴클레오티드 길이의 이중-가닥 RNA (dsRNA) 구축물을 포함하며, 여기서 dsRNA는 표적 유전자의 발현을 서열-의존성 방식으로 억제한다.
rxRNAori는 본원에 기재된 변형 중 임의의 것을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, rxRNAori 내 뉴클레오티드 중 적어도 30%가 변형된다. 예를 들어, rxRNAori 내 뉴클레오티드 중 적어도 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%가 변형된다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA 내 뉴클레오티드 중 100%가 변형된다. 일부 실시양태에서, 단지 rxRNAori의 패신저 가닥만이 변형을 함유한다.
본 발명은 그의 적용에서 하기 기재에 제시되거나 도면에 예시된 성분의 구축 및 배열의 세부사항으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태일 수 있고, 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 어구 및 용어는 기재를 위한 것이고, 제한하는 것으로서 간주되어서는 안된다. 본원에서 "포함한", "포함하는" 또는 "갖는", "함유하는", "수반하는" 및 그의 변형의 사용은 이전에 열거된 항목 및 그의 등가물, 뿐만 아니라 추가의 항목을 포괄하는 것으로 의도된다.
따라서, 본 발명의 측면은 가이드 (안티센스) 가닥 및 패신저 (센스) 가닥을 포함하는 단리된 이중 가닥 핵산 분자에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "이중-가닥"은, 뉴클레오모노머의 적어도 일부가 상보적이고 수소 결합하여 이중-가닥 영역을 형성한 1종 이상의 핵산 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 가이드 가닥의 길이는 16-29개의 뉴클레오티드 길이 범위이다. 특정 실시양태에서, 가이드 가닥은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 또는 29개의 뉴클레오티드 길이이다. 가이드 가닥은 표적 유전자에 대해 상보성을 갖는다. 가이드 가닥과 표적 유전자 사이의 상보성은 가이드 가닥의 임의의 부분에 걸쳐 존재할 수 있다. 본원에 사용된 상보성은 완전한 성보성이거나, 또는 가이드 가닥이 RNAi를 매개하는 표적에 대해 충분히 상보성인 한 덜 완전한 상보성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 상보성은 가이드 가닥과 표적 사이에서 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만의 미스매치를 지칭한다. 완전한 상보성은 100% 상보성을 지칭한다. 따라서, 본 발명은 유전자 돌연변이, 균주 다형성 또는 진화상 분기로 인해 예상될 수 있는 서열 변동을 용인할 수 있는 이점을 갖는다. 예를 들어, 또한 표적 서열에 비해 삽입, 결실 및 단일 점 돌연변이를 갖는 siRNA 서열이 억제에 대해 효과적인 것으로 밝혀진 바 있다. 또한, siRNA의 모든 위치가 표적 인식에 동등하게 기여하는 것은 아니다. siRNA의 중심에서의 미스매치가 가장 결정적이며, 본질적으로 표적 RNA 절단을 없앤다. 중심의 상류 또는 안티센스 가닥을 참조하여 절단 부위의 상류의 미스매치는 허용되지만, 표적 RNA 절단을 유의하게 감소시킨다. 중심 또는 안티센스 가닥을 참조하여 절단 부위의 하류, 바람직하게는 안티센스 가닥의 3' 말단 주변에 위치한, 예를 들어 안티센스 가닥의 3' 말단으로부터 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 뉴클레오티드의 미스매치는 허용되고, 표적 RNA 절단을 단지 약간만 감소시킨다.
어떠한 특정한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 일부 실시양태에서, 가이드 가닥은 적어도 16개의 뉴클레오티드 길이이고, RISC 내 아르고나우트 단백질을 고정시킨다. 일부 실시양태에서, 가이드 가닥이 RISC에 로딩되는 경우에, 이는 규정된 시드 영역을 갖고, 가이드 가닥의 위치 10-11의 맞은 편에서 표적 mRNA 절단이 일어난다. 일부 실시양태에서, 가이드 가닥의 5' 말단은 인산화되거나 인산화될 수 있다. 본원에 기재된 핵산 분자는 최소 촉발 RNA로 지칭될 수 있다.
일부 실시양태에서, 패신저 가닥의 길이는 8-15개의 뉴클레오티드 길이 범위이다. 특정 실시양태에서, 패신저 가닥은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 뉴클레오티드 길이이다. 패신저 가닥은 가이드 가닥에 대해 상보성을 갖는다. 패신저 가닥과 가이드 가닥 사이의 상보성은 패신저 또는 가이드 가닥의 임의의 부분에 걸쳐 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자의 이중 가닥 영역 내에서 가이드 및 패신저 가닥 사이에 100% 상보성이 존재한다.
본 발명의 측면은 최소의 이중 가닥 영역을 갖는 이중 가닥 핵산 분자에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥인 분자의 영역은 8-15개의 뉴클레오티드 길이 범위이다. 특정 실시양태에서, 이중 가닥인 분자의 영역은 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 뉴클레오티드 길이이다. 특정 실시양태에서, 이중 가닥 영역은 13 또는 14개의 뉴클레오티드 길이이다. 가이드 및 패신저 가닥 사이에 100% 상보성이 존재할 수 있거나, 또는 가이드 및 패신저 가닥 사이에 1개 이상의 미스매치가 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중 가닥 분자의 한 말단에서, 분자는 평활 말단이거나 또는 1개의 뉴클레오티드 오버행을 갖는다. 일부 실시양태에서, 분자의 단일 가닥 영역은 4-12개의 뉴클레오티드 길이이다. 예를 들어, 단일 가닥 영역은 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 그러나, 특정 실시양태에서, 단일 가닥 영역은 또한 4개 미만 또는 12개 초과의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 특정 실시양태에서, 단일 가닥 영역은 적어도 6 또는 적어도 7개의 뉴클레오티드 길이이다.
본 발명과 연관된 RNAi 구축물은 -13 kkal/mol 미만의 열역학적 안정성 (ΔG)을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 열역학적 안정성 (ΔG)은 -20 kkal/mol 미만이다. 일부 실시양태에서, (ΔG)가 -21 kkal/mol 미만이 되는 경우에 효능의 손실이 존재한다. 일부 실시양태에서, -13 kkal/mol을 초과하는 (ΔG) 값이 본 발명의 측면과 상용성이다. 어떠한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 일부 실시양태에서 비교적 더 높은 (ΔG) 값을 갖는 분자는 비교적 더 높은 농도에서 활성이 될 수 있는 반면에, 비교적 더 낮은 (ΔG) 값을 갖는 분자는 비교적 더 낮은 농도에서 활성이 될 수 있다. 일부 실시양태에서, (ΔG) 값은 -9 kkcal/mol 초과일 수 있다. 거의 동일한 설계이지만 보다 낮은 열역학적 안정성을 갖는 분자가 불활성인 것으로 입증된 바 있기 때문에 (Rana et al., 2004), 최소 이중 가닥 영역을 함유하는 본 발명과 연관된 RNAi 구축물에 의해 매개되는 유전자 침묵 효과는 예상외의 것이다.
어떠한 이론에 얽매이는 것을 원하지는 않지만, 본원에 기재된 결과는, dsRNA 또는 dsDNA의 8-10 bp의 스트레치가 RISC의 단백질 성분 또는 RISC의 보조-인자에 의해 구조적으로 인식될 것임을 시사한다. 추가로, 단백질 성분에 의해 감지될 수 있고/거나 이러한 성분과 상호작용하기에 충분히 안정할 수 있어서 아르고나우트 단백질에 로딩될 수 있는 촉발 화합물에 대해 자유 에너지 요건이 존재한다. 최적의 열역학이 존재하고, 바람직하게는 적어도 8개의 뉴클레오티드인 이중 가닥 부분이 존재하는 경우에, 듀플렉스는 인식되어 RNAi 기구로 로딩될 것이다.
일부 실시양태에서, 열역학적 안정성은 LNA 염기의 사용을 통해 증가된다. 일부 실시양태에서, 추가의 화학적 변형이 도입된다. 화학적 변형의 여러 비제한적 예는 5' 포스페이트, 2'-O-메틸, 2'-O-에틸, 2'-플루오로, 리보티미딘, C-5 프로피닐-dC (pdC) 및 C-5 프로피닐-dU (pdU); C-5 프로피닐-C (pC) 및 C-5 프로피닐-U (pU); 5-메틸 C, 5-메틸 U, 5-메틸 dC, 5-메틸 dU 메톡시, (2,6-디아미노퓨린), 5'-디메톡시트리틸-N4-에틸-2'-데옥시시티딘 및 MGB (작은 홈 결합제)를 포함한다. 1종 초과의 화학적 변형이 동일한 분자 내에서 조합될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
본 발명과 연관된 분자는 증가된 효력 및/또는 감소된 독성을 위해 최적화된다. 예를 들어, 가이드 및/또는 패신저 가닥의 뉴클레오티드 길이, 및/또는 가이드 및/또는 패신저 가닥 내 포스포로티오에이트 변형의 수는 일부 측면에서 RNA 분자의 효력에 영향을 미칠 수 있는 한편, 2'-플루오로 (2'F) 변형을 2'-O-메틸 (2'OMe) 변형으로 대체하는 것은 일부 측면에서 분자의 독성에 영향을 미칠 수 있다. 구체적으로, 분자의 2'F 함량의 감소는 분자의 독성을 감소시킬 것으로 예측된다. 또한, RNA 분자 내 포스포로티오에이트 변형의 수는 분자의 세포로의 흡수, 예를 들어 분자의 세포로의 수동 흡수의 효율에 영향을 미칠 수 있다. 본원에 기재된 분자의 바람직한 실시양태는 2'F 변형을 갖지 않지만, 세포 흡수 및 조직 침투에서의 동등한 효능을 특징으로 한다. 이러한 분자는 선행 기술, 예컨대 2'F의 광범위한 사용에 의해 고도로 변형된 문헌 [Accell and Wolfrum]에 기재된 분자에 비해 유의한 개선을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 가이드 가닥은 대략 18-19개의 뉴클레오티드 길이이고, 대략 2-14개의 포스페이트 변형을 갖는다. 예를 들어, 가이드 가닥은 포스페이트-변형된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14개 또는 14개 초과의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 가이드 가닥은 RISC 진입을 간섭하지 않으면서 증가된 안정성을 부여하는 1종 이상의 변형을 함유할 수 있다. 포스페이트 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드는 3' 말단, 5' 말단에 있거나 또는 가이드 가닥 전반에 걸쳐 퍼져있을 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 가닥의 3' 말단의 10개의 뉴클레오티드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오티드를 함유한다. 또한, 가이드 가닥은 2'F 및/또는 2'OMe 변형을 함유할 수 있고, 이는 분자 전반에 걸쳐 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 가닥의 위치 1의 뉴클레오티드 (가이드 가닥의 가장 마지막 5' 위치의 뉴클레오티드)가 2'OMe 변형되고/거나 인산화된다. 가이드 가닥 내 C 및 U 뉴클레오티드가 2'F 변형될 수 있다. 예를 들어, 19 nt 가이드 가닥의 위치 2-10 (또는 상이한 길이의 가이드 가닥에서의 상응하는 위치)의 C 및 U 뉴클레오티드가 2'F 변형될 수 있다. 또한, 가이드 가닥 내 C 및 U 뉴클레오티드는 2'OMe 변형될 수 있다. 예를 들어, 19 nt 가이드 가닥의 위치 11-18 (또는 상이한 길이의 가이드 가닥에서의 상응하는 위치)의 C 및 U 뉴클레오티드가 2'OMe 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 가이드 가닥의 가장 마지막 3' 말단의 뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 특정 실시양태에서, 가이드 가닥 내 대부분의 C 및 U는 2'F 변형되고, 가이드 가닥의 5' 말단은 인산화된다. 다른 실시양태에서, 위치 1, 및 위치 11-18의 C 또는 U는 2'OMe 변형되고, 가이드 가닥의 5' 말단은 인산화된다. 다른 실시양태에서, 위치 1, 및 위치 11-18의 C 또는 U는 2'OMe 변형되고, 가이드 가닥의 5' 말단은 인산화되며, 위치 2-10의 C 또는 U는 2'F 변형된다.
일부 측면에서, 최적의 패신저 가닥은 대략 11-14개의 뉴클레오티드 길이이다. 패신저 가닥은 증가된 안정성을 부여하는 변형을 함유할 수 있다. 패신저 가닥 내 1개 이상의 뉴클레오티드는 2'OMe 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 패신저 가닥 내 C 및/또는 U 뉴클레오티드 중 1개 이상이 2'OMe 변형되거나, 또는 패신저 가닥 내 모든 C 및 U 뉴클레오티드가 2'OMe 변형된다. 특정 실시양태에서, 패신저 가닥 내 모든 뉴클레오티드가 2'OMe 변형된다. 패신저 가닥 상의 뉴클레오티드 중 1개 이상은 또한 포스페이트-변형, 예컨대 포스포로티오에이트 변형될 수 있다. 또한, 패신저 가닥은 2' 리보, 2'F 및 2 데옥시 변형, 또는 이들의 임의의 조합을 함유할 수 있다. 가이드 및 패신저 가닥 둘 다에 대한 화학적 변형 패턴은 널리 허용될 수 있고, 화학적 변형의 조합은 RNA 분자의 증가된 효능 및 자기-전달을 발생시킬 수 있다.
본 발명의 측면은, RNAi를 위해 이전에 사용되어온 분자와 비교하여, 이중 가닥 영역에 비해 연장된 단일-가닥 영역을 갖는 RNAi 구축물에 관한 것이다. 분자의 단일 가닥 영역을 변형시켜 세포 흡수 또는 유전자 침묵을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 영역의 포스포로티오에이트 변형은 세포 흡수 및/또는 유전자 침묵에 영향을 미친다. 포스포로티오에이트 변형된 가이드 가닥의 영역은 분자의 단일 가닥 및 이중 가닥 영역 둘 모두 내의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 가닥 영역은 2-12개의 포스포로티오에이트 변형을 포함한다. 예를 들어, 단일 가닥 영역은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 포스포로티오에이트 변형을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단일 가닥 영역은 6-8개의 포스포로티오에이트 변형을 함유한다.
또한, 본 발명과 연관된 분자는 세포 흡수에 대해 최적화된다. 본원에 기재된 RNA 분자에서, 가이드 및/또는 패신저 가닥은 접합체에 부착될 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합체는 소수성이다. 소수성 접합체는 분배 계수가 10 초과인 소분자일 수 있다. 접합체는 스테롤-유형 분자, 예컨대 콜레스테롤, 또는 C17에 부착된 증가된 길이의 다중탄소 쇄를 갖는 분자일 수 있고, 접합체의 존재는 지질 형질감염 시약의 존재 또는 부재 하에 RNA 분자가 세포 내로 수용되는 능력에 영향을 미칠 수 있다. 접합체는 소수성 링커를 통해 패신저 또는 가이드 가닥에 부착될 수 있다. 일부 실시양태에서, 소수성 링커는 5-12C 길이이고/거나 히드록시피롤리딘-기반이다. 일부 실시양태에서, 소수성 접합체는 패신저 가닥에 부착되고, 패신저 및/또는 가이드 가닥의 CU 잔기는 변형된다. 일부 실시양태에서, 패신저 가닥 및/또는 가이드 가닥 상의 CU 잔기 중 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%가 변형된다. 일부 측면에서, 본 발명과 연관된 분자는 자기-전달된다 (sd). 본원에 사용된 "자기-전달"은 형질감염 시약과 같은 추가의 전달 비히클에 대한 필요 없이 분자가 세포 내로 전달되는 능력을 지칭한다.
본 발명의 측면은 RNAi에서의 사용을 위해 분자를 선택하는 것에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 8-15개의 뉴클레오티드의 이중 가닥 영역을 갖는 분자가 RNAi에서의 사용을 위해 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 분자는 그의 열역학적 안정성 (ΔG)에 기초하여 선택된다. 일부 실시양태에서, -13 kkal/mol 미만의 (ΔG)를 갖는 분자가 선택될 것이다. 예를 들어, (ΔG) 값은 -13, -14, -15, -16, -17, -18, -19, -21, -22 또는 -22 kkal/mol 미만일 수 있다. 다른 실시양태에서, (ΔG) 값은 -13 kkal/mol 초과일 수 있다. 예를 들어, (ΔG) 값은 -12, -11, -10, -9, -8, -7 또는 -7 kkal/mol 초과일 수 있다. ΔG는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 계산될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 일부 실시양태에서, ΔG는 엠폴드(Mfold) 인터넷 사이트 (mfold.bioinfo.rpi.edu/cgi-bin/rna-form1.cgi)를 통해 이용가능한 엠폴드를 사용하여 계산된다. ΔG를 계산하는 방법은 하기 문헌에 기재되어 있으며, 이로부터 참조로 포함된다: 문헌 [Zuker, M. (2003) Nucleic Acids Res., 31(13):3406-15; Mathews, D. H., Sabina, J., Zuker, M. and Turner, D. H. (1999) J. Mol. Biol. 288:911-940; Mathews, D. H., Disney, M. D., Childs, J. L., Schroeder, S. J., Zuker, M., and Turner, D. H. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. 101:7287-7292; Duan, S., Mathews, D. H., and Turner, D. H. (2006) Biochemistry 45:9819-9832; Wuchty, S., Fontana, W., Hofacker, I. L., and Schuster, P. (1999) Biopolymers 49:145-165].
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 5'- 및/또는 3'-말단 오버행을 함유한다. 폴리뉴클레오티드의 한 말단 상의 뉴클레오티드 오버행의 수 및/또는 서열은 폴리뉴클레오티드의 다른 말단과 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 실시양태에서, 오버행 뉴클레오티드 중 1개 이상은 화학적 변형(들), 예컨대 포스포로티오에이트 또는 2'-OMe 변형을 함유할 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 변형되지 않는다. 다른 실시양태에서, 적어도 1개의 뉴클레오티드는 변형된다. 추가 실시양태에서, 변형은 가이드 서열의 5'-말단으로부터의 제2 뉴클레오티드에서의 2'-H 또는 2'-변형된 리보스 당을 포함한다. "제2 뉴클레오티드"는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단으로부터 제2 뉴클레오티드로 정의된다.
본원에 사용된 "2'-변형된 리보스 당"은 2'-OH 기를 갖지 않는 리보스 당을 포함한다. "2'-변형된 리보스 당"은 2'-데옥시리보스 (변형되지 않은 정규 DNA 뉴클레오티드에서 발견됨)를 포함하지 않는다. 예를 들어, 2'-변형된 리보스 당은 2'-O-알킬 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드 또는 그의 조합일 수 있다.
특정 실시양태에서, 2'-변형된 뉴클레오티드는 피리미딘 뉴클레오티드 (예를 들어, C/U)이다. 2'-O-알킬 뉴클레오티드의 예는 2'-O-메틸 뉴클레오티드 또는 2'-O-알릴 뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 언급된 5'-말단 변형을 갖는 본 발명의 sd-rxRNA 폴리뉴클레오티드는 명시된 5'-말단 변형을 갖지 않는 유사한 구축물과 비교할 경우 유의하게 (예를 들어, 적어도 약 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 그 초과) 덜한 "오프-타겟" 유전자 침묵을 나타내어, RNAi 시약 또는 치료제의 전체 특이성을 크게 개선시킨다.
본원에 사용된 "오프-타켓" 유전자 침묵은, 예를 들어 안티센스 (가이드) 서열과 비의도 표적 mRNA 서열 사이의 허위 서열 상동성으로 인한 비의도 유전자 침묵을 지칭한다.
본 발명의 이러한 측면에 따라, 특정 가이드 가닥 변형은 RNAi 활성을 유의하게 감소시키지 않으면서 (또는 RNAi 활성의 감소가 전혀 없이) 뉴클레아제 안정성을 추가로 증가시키고/거나 인터페론 유도를 낮춘다.
일부 실시양태에서, 5'-스템 서열은 폴리뉴클레오티드의 5'-말단 상의 제2 뉴클레오티드에서 2'-변형된 리보스 당, 예컨대 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 일부 실시양태에서 다른 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않는다. 이러한 변형을 갖는 헤어핀 구조는 상기 위치에서 2'-O-메틸 변형을 갖지 않는 유사한 구축물과 비교하여 증진된 표적 특이성 또는 감소된 오프-타켓 침묵을 가질 수 있다.
특정한 5'-스템 서열 및 3'-스템 서열 변형의 특정 조합은, 표적 유전자 발현을 억제하는 증진된 능력, 증진된 혈청 안정성 및/또는 증가된 표적 특이성 등에 의해 일부 증명된 바와 같이 추가의 예상외의 이점을 발생시킬 수 있다.
특정 실시양태에서, 가이드 가닥은 가이드 가닥의 5'-말단 상의 제2 뉴클레오티드에서 2'-O-메틸 변형 뉴클레오티드를 포함하고, 다른 변형된 뉴클레오티드를 갖지 않는다.
다른 측면에서, 본 발명의 sd-rxRNA 구조는 마이크로RNA 메카니즘에 의한 서열-의존성 유전자 침묵을 매개한다. 본원에 사용된 용어 "마이크로RNA" ("miRNA")는 또한 관련 기술분야에서 "소형 일시적 RNA" ("stRNA")로도 언급되고, (예를 들어, 바이러스, 포유동물 또는 식물 게놈에 의해) 유전적으로 코딩되고 RNA 침묵을 지시 또는 매개할 수 있는 소형 (10-50개의 뉴클레오티드) RNA를 지칭한다. "miRNA 장애"는 miRNA의 이상 발현 또는 활성을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 지칭할 것이다.
마이크로RNA는 마우스, 유충류 및 포유동물에서 중요 경로, 예컨대 발생 및 암에서 표적 유전자를 하향-조절하는데 수반된다. 마이크로RNA 메카니즘을 통한 유전자 침묵은 miRNA 및 그의 표적 메신저 RNA (mRNA)의 특이적이지만 불완전한 염기-쌍형성에 의해 달성된다. 표적 mRNA 발현의 마이크로RNA-매개된 하향-조절에는 다양한 메카니즘이 사용될 수 있다.
miRNA는 식물 및 동물의 발생 중에 전사 후 또는 번역 수준에서 유전자 발현을 조절할 수 있는 대략 22개의 뉴클레오티드의 비코딩 RNA이다. miRNA의 하나의 통상의 특색은 이들이 모두 pre-miRNA로 불리는 대략 70개의 뉴클레오티드 전구체 RNA 스템-루프로부터 대개는 다이서, RNase III-유형 효소 또는 그의 상동체에 의해 절단된다는 것이다. 자연 발생 miRNA는 생체내 내인성 유전자에 의해 발현되고, 다이서 또는 다른 RNAse에 의해 헤어핀 또는 스템-루프 전구체 (pre-miRNA 또는 pri-miRNA)로부터 프로세싱된다. miRNA는 생체내에서 일시적으로 이중-가닥 듀플렉스로 존재할 수 있지만, 오직 1개의 가닥이 RISC 복합체에 의해 포획되어 유전자 침묵을 지시한다.
일부 실시양태에서, 세포 흡수에 효과적이고 miRNA 활성을 억제하는 sd-rxRNA 화합물의 버전이 기재되어 있다. 본질적으로, 화합물은 RISC 진입 버전과 유사하지만, 대형 가닥 화학적 변형 패턴이 절단을 차단하고 RISC 작용의 효과적인 억제제로서 작용하는 방식으로 최적화된다. 예를 들어, 화합물은 이전에 기재된 PS 함량으로 완전히 또는 거의 O메틸 변형될 수 있다. 이러한 유형의 화합물의 경우, 5' 인산화가 필수적이지 않다. 세포 흡수 및 효율적인 RISC 로딩을 촉진한다는 점에서 이중 가닥 영역의 존재가 바람직하다.
서열-특이적 조절자로서 소형 RNA를 사용하는 또 다른 경로는 RNA 간섭 (RNAi) 경로이며, 이는 세포 내 이중-가닥 RNA (dsRNA)의 존재에 대한 진화적으로 보존된 반응이다. dsRNA는 다이서에 의해 ~20-염기쌍 (bp) 듀플렉스의 소형-간섭 RNA (siRNA)로 절단된다. 이들 소형 RNA는 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)라 불리는 다중단백질 이펙터 복합체로 어셈블리된다. 이어서, siRNA는 완전한 상보성을 갖는 표적 mRNA의 절단을 가이드한다.
생물발생, 단백질 복합체 및 기능의 일부 측면은 siRNA 경로와 miRNA 경로 사이에 공유된다. 대상 단일-가닥 폴리뉴클레오티드는 siRNA 메카니즘에서의 dsRNA 또는 miRNA 메카니즘에서의 마이크로RNA를 모방할 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 RNAi 구축물은 동일한 서열을 갖는 변형되지 않은 RNAi 구축물과 비교하여 혈청 및/또는 뇌 척수액에서 개선된 안정성을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, RNAi 구축물의 구조는 인간, 마우스 및 다른 설치류, 및 다른 비-인간 포유동물로부터의 1차 세포를 포함한 포유동물 1차 세포와 같은 1차 세포에서 인터페론 반응을 유도하지 않는다. 특정 실시양태에서, RNAi 구축물은 또한 무척추동물 유기체에서 표적 유전자의 발현을 억제하는데 사용될 수 있다.
생체내에서 대상 구축물의 안정성을 추가로 증가시키기 위해, 헤어핀 구조의 3'-말단을 보호기(들)로 차단할 수 있다. 예를 들어, 역전된 뉴클레오티드, 역전된 무염기성 모이어티 또는 아미노-말단 변형된 뉴클레오티드와 같은 보호기를 사용할 수 있다. 역전된 뉴클레오티드는 역전된 데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 역전된 무염기성 모이어티는 역전된 데옥시무염기성 모이어티, 예컨대 3',3'-연결된 또는 5',5'-연결된 데옥시무염기성 모이어티를 포함할 수 있다.
본 발명의 RNAi 구축물은 표적 유전자(들)에 의해 코딩되는 임의의 표적 단백질의 합성을 억제할 수 있다. 본 발명은 시험관내 또는 생체내 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법을 포함한다. 이로서, 본 발명의 RNAi 구축물은 표적 유전자의 과다발현을 특징으로 하는 질환을 갖는 환자를 치료하는데 유용하다.
표적 유전자는 세포에 대해 내인성 또는 외인성 (예를 들어, 바이러스에 의해 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 세포 내로 도입됨)일 수 있다. 이러한 방법은 표적 유전자의 발현을 억제하기에 충분한 양의 RNA를 세포 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다. 예로서, 이러한 RNA 분자는, 조성물이 표적 유전자의 발현을 억제하도록 표적 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 가이드 가닥을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 핵산을 발현하는 벡터, 및 이러한 벡터 또는 핵산을 포함하는 세포에 관한 것이다. 상기 세포는 생체내 또는 배양물 내 포유동물 세포, 예컨대 인간 세포일 수 있다.
본 발명은 추가로 대상 RNAi 구축물, 및 제약상 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내, 예를 들어 배양물 내 포유동물 세포, 예컨대 배양물 내 인간 세포에서 수행될 수 있다.
표적 세포 (예를 들어, 포유동물 세포)는 전달 시약, 예컨대 지질 (예를 들어, 양이온성 지질) 또는 리포솜의 존재 하에 접촉될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 포유동물 세포를 대상 RNAi 구축물을 발현하는 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명의 한 측면에서, 약 16개 내지 약 30개의 뉴클레오티드 크기 범위의 제1 폴리뉴클레오티드; 약 26개 내지 약 46개의 뉴클레오티드 크기 범위의 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 보다 긴 듀플렉스 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드 (안티센스 가닥)는 제2 폴리뉴클레오티드 (센스 가닥) 및 표적 유전자 둘 다에 상보적이고, 여기서 둘 다의 폴리뉴클레오티드는 듀플렉스를 형성하고, 여기서 제1 폴리뉴클레오티드는 6개의 염기 길이보다 긴 단일 가닥 영역을 함유하며 대안적인 화학적 변형 패턴으로 변형되고/거나 세포 전달을 용이하게 하는 접합체 모이어티를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 패신저 가닥의 뉴클레오티드 중 약 40% 내지 약 90%, 가이드 가닥의 뉴클레오티드 중 약 40% 내지 약 90%, 및 제1 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥 영역의 뉴클레오티드 중 약 40% 내지 약 90%는 화학적으로 변형된 뉴클레오티드이다.
한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 듀플렉스에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드, 예컨대 상기에서 상세하게 논의된 바와 같은 것일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 2' F 변형된 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 변형된 및 2'데옥시 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 뉴클레오티드 염기의 "소수성 변형"으로 인한 것이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트이다. 추가의 특정한 실시양태에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 2'-O-메틸, 2'데옥시, 소수성 변형 및 포스포로티오에이트의 조합이다. 이러한 군의 변형은 리보스 고리, 백본 및 뉴클레오티드의 변형을 지칭하는 것이므로, 일부 변형된 뉴클레오티드가 모든 3가지 변형 유형의 조합을 보유하는 것이 가능하다.
또 다른 실시양태에서, 화학적 변형은 듀플렉스의 다양한 영역의 도처에서 동일하지 않다. 특정한 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드 (패신저 가닥)는 다양한 위치에서 다수의 다양한 화학적 변형을 갖는다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 경우에, 뉴클레오티드 중 최대 90%가 화학적으로 변형되고/거나 도입된 미스매치를 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드의 화학적 변형은 우리딘 및 시토신의 5' 위치 변형 (4-피리딜, 2-피리딜, 인돌릴, 페닐 (C6H5OH); 트립토파닐 ((C8H6N)CH2CH(NH2)CO), 이소부틸, 부틸, 아미노벤질; 페닐; 나프틸 등)을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 여기서 화학적 변형은 뉴클레오티드의 염기 쌍형성 능력을 변경시킬 수 있다. 가이드 가닥의 경우에, 본 발명의 이러한 측면의 중요한 특색은 안티센스의 5' 말단에 대한 화학적 변형의 위치 및 순서이다. 예를 들어, 가이드 가닥의 5' 말단의 화학적 인산화는 통상적으로 효능에 유익하다. 센스 가닥의 시드 영역 (5' 말단에 대해 위치 2-7)에서의 O-메틸 변형은 일반적으로 널리 허용되지 않는 반면에, 2'F 및 데옥시는 널리 허용된다. 가이드 가닥의 중앙 부분 및 가이드 가닥의 3' 말단은 적용되는 화학적 변형의 유형에 있어 보다 허용성이다. 데옥시 변형은 가이드 가닥의 3' 말단에서 허용되지 않는다.
본 발명의 이러한 측면의 고유한 특색은 염기에 대한 소수성 변형의 사용을 수반한다. 한 실시양태에서, 소수성 변형은 바람직하게는 가이드 가닥의 5' 말단 근처에 위치하며, 다른 실시양태에서 이는 가이드 가닥의 중간에 국재화되고, 다른 실시양태에서 이는 가이드 가닥의 3' 말단에 국재화되며, 또 다른 실시양태에서 이는 폴리뉴클레오티드의 전체 길이에 걸쳐 분포한다. 동일한 유형의 패턴이 듀플렉스의 패신저 가닥에 적용될 수 있다.
분자의 다른 부분은 단일 가닥 영역이다. 단일 가닥 영역은 7 내지 40개의 뉴클레오티드 범위인 것으로 예상된다.
한 실시양태에서, 제1 폴리뉴클레오티드의 단일 가닥 영역은 40% 내지 90% 소수성 염기 변형, 40%-90% 포스포로티오에이트, 40%-90% 리보스 모이어티의 변형 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 변형을 함유한다.
RISC 복합체에 로딩되는 가이드 가닥 (제1 폴리뉴클레오티드)의 효율은 고도로 변형된 폴리뉴클레오티드로 인해 변경될 수 있고, 따라서 한 실시양태에서, 듀플렉스 폴리뉴클레오티드는 효율적인 가이드 가닥 로딩을 촉진하기 위해 가이드 가닥 (제1 폴리뉴클레오티드) 상의 뉴클레오티드 9, 11, 12, 13 또는 14 및 센스 가닥 (제2 폴리뉴클레오티드) 상의 대향하는 뉴클레오티드 사이에 미스매치를 포함한다.
본 발명의 보다 상세한 측면은 하기 섹션에 기재되어 있다.
듀플렉스 특징
본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 2개의 개별적인 상보적 핵산 가닥에 의해 형성될 수 있다. 듀플렉스 형성은 표적 유전자를 함유하는 세포의 내부 또는 외부에서 일어날 수 있다.
본원에 사용된 용어 "듀플렉스"는 상보적 서열에 수소 결합된 이중-가닥 핵산 분자(들)의 영역을 포함한다. 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 표적 유전자에 대해 센스인 뉴클레오티드 서열 및 표적 유전자에 대해 안티센스인 상보적 서열을 포함할 수 있다. 센스 및 안티센스 뉴클레오티드 서열은 표적 유전자 서열에 상응하고, 예를 들어 표적 유전자 억제를 달성하기 위해 표적 유전자 서열과 동일하거나 충분히 동일하다 (예를 들어, 약 적어도 약 98% 동일, 96% 동일, 94%, 90% 동일, 85% 동일 또는 80% 동일함).
특정 실시양태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 그의 전장에 걸쳐 이중-가닥이고, 즉 분자의 어느 한 말단에 오버행 단일-가닥 서열을 갖지 않는, 즉 평활-말단이다. 다른 실시양태에서, 개별 핵산 분자는 상이한 길이일 수 있다. 다시 말해서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 그의 전체 길이에 걸쳐 이중-가닥이 아니다. 예를 들어, 2개의 개별 핵산 분자를 사용하는 경우에, 분자 중 1개, 예를 들어 안티센스 서열을 포함하는 제1 분자는 이에 혼성화한 제2 분자보다 길 수 있다 (분자의 일부가 단일-가닥으로 남음). 마찬가지로, 단일 핵산 분자를 사용하는 경우에, 분자의 일부가 어느 한 말단에서 단일-가닥으로 남을 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 미스매치 및/또는 루프 또는 돌출을 함유하지만, 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 70%에 걸쳐 이중-가닥이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 80%에 걸쳐 이중-가닥이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 90%-95%에 걸쳐 이중-가닥이다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 길이의 적어도 약 96%-98%에 걸쳐 이중-가닥이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 이중-가닥 올리고뉴클레오티드는 적어도 또는 최대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 미스매치를 함유한다.
변형
본 발명의 뉴클레오티드는 당 모이어티, 포스포디에스테르 연결 및/또는 염기를 포함한 다양한 위치에서 변형될 수 있다.
일부 실시양태에서, 뉴클레오시드의 염기 모이어티가 변형될 수 있다. 예를 들어, 피리미딘 염기는 피리미딘 고리의 2, 3, 4, 5 및/또는 6 위치에서 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 시토신의 엑소시클릭 아민이 변형될 수 있다. 또한, 퓨린 염기가 변형될 수 있다. 예를 들어, 퓨린 염기는 1, 2, 3, 6, 7 또는 8 위치에서 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아데닌의 엑소시클릭 아민이 변형될 수 있다. 일부 경우에, 염기 모이어티의 고리에서 질소 원자가 또 다른 원자, 예컨대 탄소로 치환될 수 있다. 염기 모이어티에 대한 변형은 임의의 적합한 변형일 수 있다. 변형의 예는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 염기 변형은 알킬화 퓨린 또는 피리미딘, 아실화 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 헤테로사이클을 포함한다.
일부 실시양태에서, 피리미딘은 5 위치에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 피리미딘의 5 위치는 알킬 기, 알키닐 기, 알케닐 기, 아실 기 또는 그의 치환된 유도체로 변형될 수 있다. 다른 예에서, 피리미딘의 5 위치는 히드록실 기 또는 알콕실 기, 또는 그의 치환된 유도체로 변형될 수 있다. 또한, 피리미딘의 N4 위치는 알킬화될 수 있다. 추가의 예에서, 피리미딘 5-6 결합은 포화될 수 있고/거나, 피리미딘 고리 내 질소 원자가 탄소 원자로 치환될 수 있고/거나, O2 및 O4 원자가 황 원자로 치환될 수 있다. 다른 변형도 또한 가능하다는 것을 이해해야 한다.
다른 예에서, 퓨린의 N7 위치 및/또는 N2 및/또는 N3 위치가 알킬 기 또는 그의 치환된 유도체로 변형될 수 있다. 추가의 예에서, 제3 고리는 퓨린 비시클릭 고리계에 융합될 수 있고/거나 퓨린 고리계 내 질소 원자는 탄소 원자로 치환될 수 있다. 다른 변형도 또한 가능하다는 것을 이해해야 한다.
5 위치에서 변형된 피리미딘의 비제한적 예는 미국 특허 5591843, 미국 특허 7,205,297, 미국 특허 6,432,963, 및 미국 특허 6,020,483에 개시되어 있고; N4 위치에서 변형된 피리미딘의 비제한적 예는 미국 특허 5,580,731에 개시되어 있고; 8 위치에서 변형된 퓨린의 비제한적 예는 미국 특허 6,355,787 및 미국 특허 5,580,972에 개시되어 있고; N6 위치에서 변형된 퓨린의 비제한적 예는 미국 특허 4,853,386, 미국 특허 5,789,416, 및 미국 특허 7,041,824에 개시되어 있고; 2 위치에서 변형된 퓨린의 비제한적 예는 미국 특허 4,201,860 및 미국 특허 5,587,469에 개시되어 있고, 이는 모두 본원에 참조로 포함된다.
변형된 염기의 비제한적 예는 N4,N4-에타노시토신, 7-데아자크산토신, 7-데아자구아노신, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸 우라실, 디히드로우라실, 이노신, N6-이소펜테닐-아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸 우라실, 5-메톡시 아미노메틸-2-티오우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 슈도우라실, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 2-티오시토신 및 2,6-디아미노퓨린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 염기 모이어티는 퓨린 또는 피리미딘 이외의 다른 헤테로시클릭 염기일 수 있다. 헤테로시클릭 염기는 임의로 변형 및/또는 치환될 수 있다.
당 모이어티는 천연, 비변형 당, 예를 들어 모노사카라이드 (예컨대, 펜토스, 예를 들어 리보스, 데옥시리보스), 변형된 당 및 당 유사체를 포함한다. 일반적으로, 뉴클레오모노머, 특히 당 모이어티의 가능한 변형은, 예를 들어 히드록실 기 중 1개 이상의 할로겐, 헤테로원자, 지방족 기로의 대체, 또는 히드록실 기의 에테르, 아민, 티올 등으로서의 관능화를 포함한다.
변형된 뉴클레오모노머의 특히 유용한 하나의 군은 2'-O-메틸 뉴클레오티드이다. 이러한 2'-O-메틸 뉴클레오티드는 "메틸화된" 것으로 언급될 수 있으며, 상응하는 뉴클레오티드는 비메틸화된 뉴클레오티드로부터 알킬화 후에 생성되거나 또는 메틸화된 뉴클레오티드 시약으로부터 직접 생성될 수 있다. 변형된 뉴클레오모노머는 비변형된 뉴클레오모노머와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 메틸화된 및 비메틸화된 뉴클레오모노머 둘 다를 함유할 수 있다.
일부 예시적인 변형된 뉴클레오모노머는 당- 또는 백본-변형된 리보뉴클레오티드를 포함한다. 변형된 리보뉴클레오티드는 (자연 발생 염기 대신) 비-자연 발생 염기, 예컨대 5'-위치에서 변형된 우리딘 또는 시티딘, 예를 들어 5'-(2-아미노)프로필 우리딘 및 5'-브로모 우리딘; 8-위치에서 변형된 아데노신 및 구아노신, 예를 들어 8-브로모 구아노신; 데아자 뉴클레오티드, 예를 들어 7-데아자-아데노신; 및 N-알킬화된 뉴클레오티드, 예를 들어 N6-메틸 아데노신을 함유할 수 있다. 또한, 당-변형된 리보뉴클레오티드는 H, 알콕시 (또는 OR), R 또는 알킬, 할로겐, SH, SR, 아미노 (예컨대, NH2, NHR, NR2), 또는 CN 기 (여기서, R은 저급 알킬, 알케닐 또는 알키닐임)로 대체된 2'-OH 기를 가질 수 있다.
또한, 변형된 리보뉴클레오티드는 변형된 기에 의해 대체된 인접 리보뉴클레오티드에 연결된 포스포디에스테르 기, 예를 들어 포스포로티오에이트 기를 가질 수 있다. 보다 일반적으로, 다양한 뉴클레오티드 변형이 조합될 수 있다.
안티센스 (가이드) 가닥이 표적 유전자 (또는 유전자들)의 적어도 일부와 실질적으로 동일할 수 있지만, 적어도 염기 쌍형성 특성과 관련하여, 서열은 예를 들어 표적 유전자의 표현형의 발현을 억제하는데 유용하도록 완전히 동일할 필요는 없다. 일반적으로, 보다 높은 상동성이 보다 짧은 안티센스 유전자의 사용을 보완하는데 사용될 수 있다. 일부 경우에, 안티센스 가닥은 일반적으로 (안티센스 배향이지만) 표적 유전자와 실질적으로 동일할 것이다.
또한, 2'-O-메틸 변형된 RNA의 사용이 세포 스트레스 반응을 최소화하는 것이 바람직한 환경에서 유익할 수 있다. 2'-O-메틸 뉴클레오모노머를 갖는 RNA는 비변형된 RNA를 인식하는 것으로 생각되는 세포 기구에 의해 인식될 수 없다. 2'-O-메틸화된 또는 부분적으로 2'-O-메틸화된 RNA의 사용은 표적 RNA 억제를 유지하면서 이중-가닥 핵산에 대한 인터페론 반응을 회피할 수 있다. 이는, 예를 들어 인터페론 반응을 유도하는 짧은 RNAi (예를 들어, siRNA) 서열 및 인터페론 반응을 유도할 수 있는 보다 긴 RNAi 서열 둘 다에서 인터페론 또는 다른 세포 스트레스 반응을 회피하는데 유용할 수 있다.
전체적으로, 변형된 당은 D-리보스, 2'-O-알킬 (2'-O-메틸 및 2'-O-에틸 포함), 즉, 2'-알콕시, 2'-아미노, 2'-S-알킬, 2'-할로 (2'-플루오로 포함), 2'-메톡시에톡시, 2'-알릴옥시 (-OCH2CH=CH2), 2'-프로파르길, 2'-프로필, 에티닐, 에테닐, 프로페닐 및 시아노 등을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 당 모이어티는 헥소스일 수 있고, 문헌 [Augustyns, K., et al., Nucl. Acids. Res. 18:4711 (1992)]에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 내로 혼입될 수 있다. 예시적인 뉴클레오모노머는 예를 들어 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 5,849,902에서 찾아볼 수 있다.
구체적 관능기 및 화학 용어의 정의는 하기에서 보다 상세히 기재된다. 본 발명의 목적상, 화학 원소는 원소 주기율표, CAS 버전, 문헌 [Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed.] 표지 뒷면에 따라 확인되며, 구체적 관능기는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 정의된다. 추가로, 유기 화학, 뿐만 아니라 구체적 관능성 모이어티 및 반응성의 일반 원리는 문헌 [Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999]에 기재되어 있으며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본 발명의 특정 화합물은 특정한 기하 또는 입체이성질체 형태로 존재할 수 있다. 본 발명은 시스- 및 트랜스-이성질체, R- 및 S-거울상이성질체, 부분입체이성질체, (D)-이성질체, (L)-이성질체, 그의 라세미 혼합물, 및 그의 다른 혼합물을 포함한 모든 이러한 화합물이 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려한다. 추가의 비대칭 탄소 원자가 알킬 기와 같은 치환기에 존재할 수 있다. 모든 이러한 이성질체 뿐만 아니라 그의 혼합물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
임의의 다양한 이성질체 비를 함유하는 이성질체 혼합물이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 단지 2종의 이성질체만을 조합하는 경우에, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20, 90:10, 95:5, 96:4, 97:3, 98:2, 99:1, 또는 100:0 이성질체 비를 함유하는 혼합물이 본 발명에 의해 모두 고려된다. 보다 복잡한 이성질체 혼합물에 대해 유사한 비가 고려된다는 점을 관련 기술분야의 통상의 기술자는 용이하게 인식할 것이다.
예를 들어, 본 발명의 화합물의 특정한 거울상이성질체가 요구되는 경우에, 이는 비대칭 합성 또는 키랄 보조체를 이용한 유도에 의해 제조될 수 있고, 여기서 생성된 부분입체이성질체 혼합물을 분리하고 보조기를 절단하여 순수한 목적하는 거울상이성질체를 제공한다. 대안적으로, 분자가 염기성 관능기, 예컨대 아미노, 또는 산성 관능기, 예컨대 카르복실을 함유하는 경우에, 적절한 광학-활성 산 또는 염기를 사용하여 부분입체이성질체 염을 형성한 후, 이에 따라 형성된 부분입체이성질체를 관련 기술분야에 널리 공지된 분별 결정화 또는 크로마토그래피 방법으로 분할하고, 이어서 순수한 거울상이성질체를 회수한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 3' 및 5' 말단을 포함한다 (원형 올리고뉴클레오티드의 경우는 제외). 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 3' 및 5' 말단은, 예를 들어 3' 또는 5' 연결을 변형시켜 뉴클레아제로부터 실질적으로 보호될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,849,902 및 WO 98/13526). 예를 들어, 올리고뉴클레오티드는 "차단기"를 포함함으로써 저항성이 생길 수 있다. 본원에 사용된 용어 "차단기"는 합성의 경우에 보호기 또는 커플링기로서 올리고뉴클레오티드 또는 뉴클레오모노머에 부착될 수 있는 (예를 들어, OH 기 이외의) 치환기 (예를 들어, FITC, 프로필 (CH2-CH2-CH3), 글리콜 (-O-CH2-CH2-O-) 포스페이트 (PO3 2-), 수소 포스포네이트 또는 포스포르아미다이트)를 지칭한다. 또한, "차단기"는 올리고뉴클레오티드의 5' 및 3' 말단을 보호하는 "말단 차단기" 또는 "엑소뉴클레아제 차단기", 예컨대 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드 엑소뉴클레아제 저항성 구조를 포함한다.
예시적인 말단-차단기는 캡 구조 (예를 들어, 7-메틸구아노신 캡), 역전된 뉴클레오모노머, 예를 들어 3'-3' 또는 5'-5' 말단 역전 (예를 들어, 문헌 [Ortiagao et al. 1992. Antisense Res. Dev. 2:129] 참조), 메틸포스포네이트, 포스포르아미다이트, 비-뉴클레오티드 기 (예를 들어, 비-뉴클레오티드 링커, 아미노 링커, 접합체) 등을 포함한다. 3' 말단 뉴클레오모노머는 변형된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 3' 말단 뉴클레오모노머는 올리고뉴클레오티드의 3'-엑소뉴클레아제 분해를 막는 차단기에 의해 임의로 치환될 수 있는 3'-O를 포함한다. 예를 들어, 3'-히드록실은 3'→3' 뉴클레오티드간 연결을 통해 뉴클레오티드로 에스테르화될 수 있다. 예를 들어, 알킬옥시 라디칼은 메톡시, 에톡시 또는 이소프로폭시, 및 바람직하게는 에톡시일 수 있다. 임의로, 3' 말단에서 3'→3' 연결된 뉴클레오티드는 치환 연결에 의해 연결될 수 있다. 뉴클레아제 분해를 감소시키기 위해, 5' 가장 마지막 3'→5' 연결은 변형된 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 또는 P-알콕시포스포트리에스테르 연결일 수 있다. 바람직하게는, 2개의 5' 가장 마지막 3'→5' 연결이 변형된 연결이다. 임의로, 5' 말단 히드록시 모이어티는 인 함유 모이어티, 예를 들어 포스페이트, 포스포로티오에이트 또는 P-에톡시포스페이트로 에스테르화될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 바와 같은 합성 방법이 다양한 보호기를 사용한다는 것을 인식할 것이다. 본원에 사용된 용어 "보호기"는 특정한 관능성 모이어티, 예를 들어 O, S 또는 N을 일시적으로 차단하여 반응이 다관능성 화합물의 또 다른 반응성 부위에서 선택적으로 수행될 수 있도록 하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 보호기는 양호한 수율로 선택적으로 반응하여 계획된 반응에 대해 안정한 보호된 기질을 제공하고; 보호기는 용이하게 이용가능한, 바람직하게는 다른 관능기를 공격하지 않는 비-독성 시약에 의해 양호한 수율로 선택적으로 제거될 수 있어야 하며; 보호기는 용이하게 분리가능한 유도체를 (보다 바람직하게는 신규 입체생성 중심의 생성 없이) 형성하고; 보호기는 최소의 추가의 관능성을 가져 추가 반응 부위를 회피한다. 본원에 상술된 바와 같이, 산소, 황, 질소 및 탄소 보호기가 사용될 수 있다. 히드록실 보호기는 메틸, 메톡실메틸 (MOM), 메틸티오메틸 (MTM), t-부틸티오메틸, (페닐디메틸실릴)메톡시메틸 (SMOM), 벤질옥시메틸 (BOM), p-메톡시벤질옥시메틸 (PMBM), (4-메톡시페녹시)메틸 (p-AOM), 구아이아콜메틸 (GUM), t-부톡시메틸, 4-펜테닐옥시메틸 (POM), 실록시메틸, 2-메톡시에톡시메틸 (MEM), 2,2,2-트리클로로에톡시메틸, 비스(2-클로로에톡시)메틸, 2-(트리메틸실릴)에톡시메틸 (SEMOR), 테트라히드로피라닐 (THP), 3-브로모테트라히드로피라닐, 테트라히드로티오피라닐, 1-메톡시시클로헥실, 4-메톡시테트라히드로피라닐 (MTHP), 4-메톡시테트라히드로티오피라닐, 4-메톡시테트라히드로티오피라닐 S,S-디옥시드, 1-[(2-클로로-4-메틸)페닐]-4-메톡시피페리딘-4-일 (CTMP), 1,4-디옥산-2-일, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오푸라닐, 2,3,3a,4,5,6,7,7a-옥타히드로-7,8,8-트리메틸-4,7-메타노벤조푸란-2-일, 1-에톡시에틸, 1-(2-클로로에톡시)에틸, 1-메틸-1-메톡시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시에틸, 1-메틸-1-벤질옥시-2-플루오로에틸, 2,2,2-트리클로로에틸, 2-트리메틸실릴에틸, 2-(페닐셀레닐)에틸, t-부틸, 알릴, p-클로로페닐, p-메톡시페닐, 2,4-디니트로페닐, 벤질, p-메톡시벤질, 3,4-디메톡시벤질, o-니트로벤질, p-니트로벤질, p-할로벤질, 2,6-디클로로벤질, p-시아노벤질, p-페닐벤질, 2-피콜릴, 4-피콜릴, 3-메틸-2-피콜릴 N-옥시도, 디페닐메틸, p,p'-디니트로벤즈히드릴, 5-디벤조수베릴, 트리페닐메틸, α-나프틸디페닐메틸, p-메톡시페닐디페닐메틸, 디(p-메톡시페닐)페닐메틸, 트리(p-메톡시페닐)메틸, 4-(4'-브로모펜아실옥시페닐)디페닐메틸, 4,4',4"-트리스(4,5-디클로로프탈이미도페닐)메틸, 4,4',4"-트리스(레불리노일옥시페닐)메틸, 4,4',4"-트리스(벤조일옥시페닐)메틸, 3-(이미다졸-1-일)비스(4',4"-디메톡시페닐)메틸, 1,1-비스(4-메톡시페닐)-1'-피레닐메틸, 9-안트릴, 9-(9-페닐)크산테닐, 9-(9-페닐-10-옥소)안트릴, 1,3-벤조디티올란-2-일, 벤즈이소티아졸릴 S,S-디옥시도, 트리메틸실릴 (TMS), 트리에틸실릴 (TES), 트리이소프로필실릴 (TIPS), 디메틸이소프로필실릴 (IPDMS), 디에틸이소프로필실릴 (DEIPS), 디메틸테실실릴, t-부틸디메틸실릴 (TBDMS), t-부틸디페닐실릴 (TBDPS), 트리벤질실릴, 트리-p-크실릴실릴, 트리페닐실릴, 디페닐메틸실릴 (DPMS), t-부틸메톡시페닐실릴 (TBMPS), 포르메이트, 벤조포르메이트, 아세테이트, 클로로아세테이트, 디클로로아세테이트, 트리클로로아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 메톡시아세테이트, 트리페닐메톡시아세테이트, 페녹시아세테이트, p-클로로페녹시아세테이트, 3-페닐프로피오네이트, 4-옥소펜타노에이트 (레불리네이트), 4,4-(에틸렌디티오)펜타노에이트 (레불리노일디티오아세탈), 피발로에이트, 아다만토에이트, 크로토네이트, 4-메톡시크로토네이트, 벤조에이트, p-페닐벤조에이트, 2,4,6-트리메틸벤조에이트 (메시토에이트), 알킬 메틸 카르보네이트, 9-플루오레닐메틸 카르보네이트 (Fmoc), 알킬 에틸 카르보네이트, 알킬 2,2,2-트리클로로에틸 카르보네이트 (Troc), 2-(트리메틸실릴)에틸 카르보네이트 (TMSEC), 2-(페닐술포닐) 에틸 카르보네이트 (Psec), 2-(트리페닐포스포니오) 에틸 카르보네이트 (Peoc), 알킬 이소부틸 카르보네이트, 알킬 비닐 카르보네이트 알킬 알릴 카르보네이트, 알킬 p-니트로페닐 카르보네이트, 알킬 벤질 카르보네이트, 알킬 p-메톡시벤질 카르보네이트, 알킬 3,4-디메톡시벤질 카르보네이트, 알킬 o-니트로벤질 카르보네이트, 알킬 p-니트로벤질 카르보네이트, 알킬 S-벤질 티오카르보네이트, 4-에톡시-1-나프틸 카르보네이트, 메틸 디티오카르보네이트, 2-아이오도벤조에이트, 4-아지도부티레이트, 4-니트로-4-메틸펜타노에이트, o-(디브로모메틸)벤조에이트, 2-포르밀벤젠술포네이트, 2-(메틸티오메톡시)에틸, 4-(메틸티오메톡시)부티레이트, 2-(메틸티오메톡시메틸)벤조에이트, 2,6-디클로로-4-메틸페녹시아세테이트, 2,6-디클로로-4-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)페녹시아세테이트, 2,4-비스(1,1-디메틸프로필)페녹시아세테이트, 클로로디페닐아세테이트, 이소부티레이트, 모노숙시노에이트, (E)-2-메틸-2-부테노에이트, o-(메톡시카르보닐)벤조에이트, α-나프토에이트, 니트레이트, 알킬 N,N,N',N'-테트라메틸포스포로디아미데이트, 알킬 N-페닐카르바메이트, 보레이트, 디메틸포스피노티오일, 알킬 2,4-디니트로페닐술페네이트, 술페이트, 메탄술포네이트 (메실레이트), 벤질술포네이트 및 토실레이트 (Ts)를 포함한다. 1,2- 또는 1,3-디올을 보호하기 위한 보호기는 메틸렌 아세탈, 에틸리덴 아세탈, 1-t-부틸에틸리덴 케탈, 1-페닐에틸리덴 케탈, (4-메톡시페닐)에틸리덴 아세탈, 2,2,2-트리클로로에틸리덴 아세탈, 아세토니드, 시클로펜틸리덴 케탈, 시클로헥실리덴 케탈, 시클로헵틸리덴 케탈, 벤질리덴 아세탈, p-메톡시벤질리덴 아세탈, 2,4-디메톡시벤질리덴 케탈, 3,4-디메톡시벤질리덴 아세탈, 2-니트로벤질리덴 아세탈, 메톡시메틸렌 아세탈, 에톡시메틸렌 아세탈, 디메톡시메틸렌 오르토 에스테르, 1-메톡시에틸리덴 오르토 에스테르, 1-에톡시에틸리덴 오르토 에스테르, 1,2-디메톡시에틸리덴 오르토 에스테르, α-메톡시벤질리덴 오르토 에스테르, 1-(N,N-디메틸아미노)에틸리덴 유도체, α-(N,N'-디메틸아미노)벤질리덴 유도체, 2-옥사시클로펜틸리덴 오르토 에스테르, 디-t-부틸실릴렌기 (DTBS), 1,3-(1,1,3,3-테트라이소프로필디실록사닐리덴) 유도체 (TIPDS), 테트라-t-부톡시디실록산-1,3-디일리덴 유도체 (TBDS), 시클릭 카르보네이트, 시클릭 보로네이트, 에틸 보로네이트 및 페닐 보로네이트를 포함한다. 아미노-보호기는 메틸 카르바메이트, 에틸 카르바메이트, 9-플루오레닐메틸 카르바메이트 (Fmoc), 9-(2-술포)플루오레닐메틸 카르바메이트, 9-(2,7-디브로모)플루오레닐메틸 카르바메이트, 2,7-디-t-부틸-[9-(10,10-디옥소-10,10,10,10-테트라히드로티오크산틸)]메틸 카르바메이트 (DBD-Tmoc), 4-메톡시페나실 카르바메이트 (Phenoc), 2,2,2-트리클로로에틸 카르바메이트 (Troc), 2-트리메틸실릴에틸 카르바메이트 (Teoc), 2-페닐에틸 카르바메이트 (hZ), 1-(1-아다만틸)-1-메틸에틸 카르바메이트 (Adpoc), 1,1-디메틸-2-할로에틸 카르바메이트, 1,1-디메틸-2,2-디브로모에틸 카르바메이트 (DB-t-BOC), 1,1-디메틸-2,2,2-트리클로로에틸 카르바메이트 (TCBOC), 1-메틸-1-(4-비페닐릴)에틸 카르바메이트 (Bpoc), 1-(3,5-디-t-부틸페닐)-1-메틸에틸 카르바메이트 (t-Bumeoc), 2-(2'- 및 4'-피리딜)에틸 카르바메이트 (Pyoc), 2-(N,N-디시클로헥실카르복스아미도)에틸 카르바메이트, t-부틸 카르바메이트 (BOC), 1-아다만틸 카르바메이트 (Adoc), 비닐 카르바메이트 (Voc), 알릴 카르바메이트 (Alloc), 1-이소프로필알릴 카르바메이트 (Ipaoc), 신나밀 카르바메이트 (Coc), 4-니트로신나밀 카르바메이트 (Noc), 8-퀴놀릴 카르바메이트, N-히드록시피페리디닐 카르바메이트, 알킬디티오 카르바메이트, 벤질 카르바메이트 (Cbz), p-메톡시벤질 카르바메이트 (Moz), p-니트로벤질 카르바메이트, p-브로모벤질 카르바메이트, p-클로로벤질 카르바메이트, 2,4-디클로로벤질 카르바메이트, 4-메틸술피닐벤질 카르바메이트 (Msz), 9-안트릴메틸 카르바메이트, 디페닐메틸 카르바메이트, 2-메틸티오에틸 카르바메이트, 2-메틸술포닐에틸 카르바메이트, 2-(p-톨루엔술포닐)에틸 카르바메이트, [2-(1,3-디티아닐)]메틸 카르바메이트 (Dmoc), 4-메틸티오페닐 카르바메이트 (Mtpc), 2,4-디메틸티오페닐 카르바메이트 (Bmpc), 2-포스포니오에틸 카르바메이트 (Peoc), 2-트리페닐포스포니오이소프로필 카르바메이트 (Ppoc), 1,1-디메틸-2-시아노에틸 카르바메이트, m-클로로-p-아실옥시벤질 카르바메이트, p-(디히드록시보릴)벤질 카르바메이트, 5-벤즈이속사졸릴메틸 카르바메이트, 2-(트리플루오로메틸)-6-크로모닐메틸 카르바메이트 (Tcroc), m-니트로페닐 카르바메이트, 3,5-디메톡시벤질 카르바메이트, o-니트로벤질 카르바메이트, 3,4-디메톡시-6-니트로벤질 카르바메이트, 페닐(o-니트로페닐)메틸 카르바메이트, 페노티아지닐-(10)-카르보닐 유도체, N'-p-톨루엔술포닐아미노카르보닐 유도체, N'-페닐아미노티오카르보닐 유도체, t-아밀 카르바메이트, S-벤질 티오카르바메이트, p-시아노벤질 카르바메이트, 시클로부틸 카르바메이트, 시클로헥실 카르바메이트, 시클로펜틸 카르바메이트, 시클로프로필메틸 카르바메이트, p-데실옥시벤질 카르바메이트, 2,2-디메톡시카르보닐비닐 카르바메이트, o-(N,N-디메틸카르복스아미도)벤질 카르바메이트, 1,1-디메틸-3-(N,N-디메틸카르복스아미도)프로필 카르바메이트, 1,1-디메틸프로피닐 카르바메이트, 디(2-피리딜)메틸 카르바메이트, 2-푸라닐메틸 카르바메이트, 2-아이오도에틸 카르바메이트, 이소보르닐 카르바메이트, 이소부틸 카르바메이트, 이소니코티닐 카르바메이트, p-(p'-메톡시페닐아조)벤질 카르바메이트, 1-메틸시클로부탈 카르바메이트, 1-메틸시클로헥실 카르바메이트, 1-메틸-1-시클로프로필메틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(3,5-디메톡시페닐)에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(p-페닐아조페닐)에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-페닐에틸 카르바메이트, 1-메틸-1-(4-피리딜)에틸 카르바메이트, 페닐 카르바메이트, p-(페닐아조)벤질 카르바메이트, 2,4,6-트리-t-부틸페닐 카르바메이트, 4-(트리메틸암모늄)벤질 카르바메이트, 2,4,6-트리메틸벤질 카르바메이트, 포름아미드, 아세트아미드, 클로로아세트아미드, 트리클로로아세트아미드, 트리플루오로아세트아미드, 페닐아세트아미드, 3-페닐프로판아미드, 피콜린아미드, 3-피리딜카르복스아미드, N-벤조일페닐알라닐 유도체, 벤즈아미드, p-페닐벤즈아미드, o-니트로페닐아세트아미드, o-니트로페녹시아세트아미드, 아세토아세트아미드, (N'-디티오벤질옥시카르보닐아미노)아세트아미드, 3-(p-히드록시페닐)프로판아미드, 3-(o-니트로페닐)프로판아미드, 2-메틸-2-(o-니트로페녹시)프로판아미드, 2-메틸-2-(o-페닐아조페녹시)프로판아미드, 4-클로로부탄아미드, 3-메틸-3-니트로부탄아미드, o-니트로신나미드, N-아세틸메티오닌 유도체, o-니트로벤즈아미드, o-(벤조일옥시메틸)벤즈아미드, 4,5-디페닐-3-옥사졸린-2-온, N-프탈이미드, N-디티아술신이미드 (Dts), N-2,3-디페닐말레이미드, N-2,5-디메틸피롤, N-1,1,4,4-테트라메틸디실릴아자시클로펜탄 부가물 (STABASE), 5-치환된 1,3-디메틸-1,3,5-트리아자시클로헥산-2-온, 5-치환된 1,3-디벤질-1,3,5-트리아자시클로헥산-2-온, 1-치환된 3,5-디니트로-4-피리돈, N-메틸아민, N-알릴아민, N-[2-(트리메틸실릴)에톡시]메틸아민 (SEM), N-3-아세톡시프로필아민, N-(1-이소프로필-4-니트로-2-옥소-3-피롤린-3-일)아민, 4급 암모늄 염, N-벤질아민, N-디(4-메톡시페닐)메틸아민, N-5-디벤조수베릴아민, N-트리페닐메틸아민 (Tr), N-[(4-메톡시페닐)디페닐메틸]아민 (MMTr), N-9-페닐플루오레닐아민 (PhF), N-2,7-디클로로-9-플루오레닐메틸렌아민, N-페로세닐메틸아미노 (Fcm), N-2-피콜릴아미노 N'-옥시드, N-1,1-디메틸티오메틸렌아민, N-벤질리덴아민, N-p-메톡시벤질리덴아민, N-디페닐메틸렌아민, N-[(2-피리딜)메시틸]메틸렌아민, N-(N',N'-디메틸아미노메틸렌)아민, N,N'-이소프로필리덴디아민, N-p-니트로벤질리덴아민, N-살리실리덴아민, N-5-클로로살리실리덴아민, N-(5-클로로-2-히드록시페닐)페닐메틸렌아민, N-시클로헥실리덴아민, N-(5,5-디메틸-3-옥소-1-시클로헥세닐)아민, N-보란 유도체, N-디페닐보린산 유도체, N-[페닐(펜타카르보닐크로뮴- 또는 텅스텐)카르보닐]아민, N-구리 킬레이트, N-아연 킬레이트, N-니트로아민, N-니트로소아민, 아민 N-옥시드, 디페닐포스핀아미드 (Dpp), 디메틸티오포스핀아미드 (Mpt), 디페닐티오포스핀아미드 (Ppt), 디알킬 포스포르아미데이트, 디벤질 포스포르아미데이트, 디페닐 포스포르아미데이트, 벤젠술펜아미드, o-니트로벤젠술펜아미드 (Nps), 2,4-디니트로벤젠술펜아미드, 펜타클로로벤젠술펜아미드, 2-니트로-4-메톡시벤젠술펜아미드, 트리페닐메틸술펜아미드, 3-니트로피리딘술펜아미드 (Npys), p-톨루엔술폰아미드 (Ts), 벤젠술폰아미드, 2,3,6,-트리메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mtr), 2,4,6-트리메톡시벤젠술폰아미드 (Mtb), 2,6-디메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Pme), 2,3,5,6-테트라메틸-4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mte), 4-메톡시벤젠술폰아미드 (Mbs), 2,4,6-트리메틸벤젠술폰아미드 (Mts), 2,6-디메톡시-4-메틸벤젠술폰아미드 (iMds), 2,2,5,7,8-펜타메틸크로만-6-술폰아미드 (Pmc), 메탄술폰아미드 (Ms), β-트리메틸실릴에탄술폰아미드 (SES), 9-안트라센술폰아미드, 4-(4',8'-디메톡시나프틸메틸)벤젠술폰아미드 (DNMBS), 벤질술폰아미드, 트리플루오로메틸술폰아미드 및 페나실술폰아미드를 포함한다. 예시적인 보호기는 본원에서 상술된다. 그러나, 본 발명은 이들 보호기로 제한되는 것으로 의도되지 않고; 오히려 다양한 추가의 동등한 보호기가 상기 기준을 사용하여 용이하게 확인될 수 있고 본 발명의 방법에 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 추가로, 다양한 보호기는 문헌 [Protective Groups in Organic Synthesis, Third Ed. Greene, T.W. and Wuts, P.G., Eds., John Wiley & Sons, New York: 1999]에 기재되어 있고, 그 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
본원에 기재된 바와 같은 화합물은 임의의 수의 치환기 또는 관능성 모이어티로 치환될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 일반적으로, 용어 "치환된" (용어 "임의로"가 선행되는지 여부에 관계없이) 및 본 발명의 화학식에 함유된 치환기는, 주어진 구조에서의 수소 라디칼의 명시된 치환기의 라디칼로의 대체를 지칭한다. 임의의 주어진 구조에서 1개 초과의 위치가 명시된 기로부터 선택된 1개 초과의 치환기로 치환될 수 있는 경우에, 치환기는 모든 위치에서 동일 또는 상이할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "치환된"은 유기 화합물의 모든 허용가능한 치환기를 포함하는 것으로 고려된다. 넓은 측면에서, 허용가능한 치환기는 유기 화합물의 비-시클릭 및 시클릭, 분지형 및 비분지형, 카르보시클릭 및 헤테로시클릭, 방향족 및 비방향족 치환기를 포함한다. 질소와 같은 헤테로원자는 수소 치환기 및/또는 헤테로원자의 원자가를 만족시키는 본원에 기재된 유기 화합물의 임의의 허용가능한 치환기를 가질 수 있다. 게다가, 본 발명은 유기 화합물의 허용가능한 치환기에 의해 어떠한 방식으로도 제한되지 않는 것으로 의도된다. 본 발명에 의해 고려되는 치환기 및 가변기의 조합은 바람직하게는, 예를 들어 감염성 질환 또는 증식성 장애의 치료에 유용한 안정한 화합물의 형성을 발생시키는 조합이다. 본원에 사용된 용어 "안정한"은 바람직하게는, 화합물의 제조가 가능하도록 충분한 안정성을 보유하며, 검출되기에 충분한 시간 및 바람직하게는 본원에 상세하게 설명된 목적에 유용하기에 충분한 시간 동안 화합물의 완전성을 유지하는 화합물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "지방족"은, 1개 이상의 관능기로 임의로 치환된, 포화 및 불포화 둘 다의 직쇄 (즉, 비분지형), 분지형, 비-시클릭, 시클릭 또는 폴리시클릭 지방족 탄화수소를 포함한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 본원에서 "지방족"은 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 및 시클로알키닐 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 의도된다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "알킬"은 직쇄형, 분지형 및 시클릭 알킬 기를 포함한다. 유사한 관례가 "알케닐", "알키닐" 등과 같은 다른 일반 용어에 적용된다. 게다가, 본원에 사용된 용어 "알킬", "알케닐", "알키닐" 등은 치환 및 비치환된 기 둘 다를 포괄한다. 특정 실시양태에서, 본원에 사용된 "저급 알킬"은 1-6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기 (시클릭, 비-시클릭, 치환, 비치환, 분지형 또는 비분지형)를 나타내는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알킬, 알케닐 및 알키닐 기는 1-20개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 특정의 다른 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알킬, 알케닐 및 알키닐기는 1-10개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알킬, 알케닐 및 알키닐 기는 1-8개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알킬, 알케닐 및 알키닐기는 1-6개의 지방족 탄소 원자를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명에 사용된 알킬, 알케닐 및 알키닐기는 1-4개의 탄소 원자를 함유한다. 따라서, 예시적인 지방족 기는, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, 시클로프로필, -CH2-시클로프로필, 비닐, 알릴, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 시클로부틸, -CH2-시클로부틸, n-펜틸, sec-펜틸, 이소펜틸, tert-펜틸, 시클로펜틸, -CH2-시클로펜틸, n-헥실, sec-헥실, 시클로헥실, -CH2-시클로헥실 모이어티 등을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 이는 다시 1개 이상의 치환기를 보유할 수 있다. 알케닐 기는 예를 들어 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 1-메틸-2-부텐-1-일 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대표적인 알키닐 기는 에티닐, 2-프로피닐 (프로파르길), 1-프로피닐 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명 화합물의 상기 기재된 지방족 (및 다른) 모이어티의 치환기의 일부 예는 지방족; 헤테로지방족; 아릴; 헤테로아릴; 아릴알킬; 헤테로아릴알킬; 알콕시; 아릴옥시; 헤테로알콕시; 헤테로아릴옥시; 알킬티오; 아릴티오; 헤테로알킬티오; 헤테로아릴티오; -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCl2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx); -CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx를 포함하나 이에 제한되지는 않고, 여기서 각 경우의 Rx는 독립적으로 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 여기서 상기 및 본원에 기재된 임의의 지방족, 헤테로지방족, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬 치환기는 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형, 시클릭 또는 비-시클릭일 수 있고, 여기서 상기 및 본원에 기재된 임의의 아릴 또는 헤테로아릴 치환기는 치환 또는 비치환될 수 있다. 일반적으로 적용가능한 치환기의 추가의 예는 본원에 기재된 구체적 실시양태에 의해 예시된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로지방족"은, 예를 들어 탄소 원자 대신 1개 이상의 산소, 황, 질소, 인 또는 규소 원자를 함유하는 지방족 모이어티를 지칭한다. 헤테로지방족 모이어티는 분지형, 비분지형, 시클릭 또는 비-시클릭일 수 있고, 포화 및 불포화 헤테로사이클, 예컨대 모르폴리노, 피롤리디닐 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 헤테로지방족 모이어티는, 그의 수소 원자 중 1개 이상이 지방족; 헤테로지방족; 아릴; 헤테로아릴; 아릴알킬; 헤테로아릴알킬; 알콕시; 아릴옥시; 헤테로알콕시; 헤테로아릴옥시; 알킬티오; 아릴티오; 헤테로알킬티오; 헤테로아릴티오; -F; -Cl; -Br; -I; -OH; -NO2; -CN; -CF3; -CH2CF3; -CHCl2; -CH2OH; -CH2CH2OH; -CH2NH2; -CH2SO2CH3; -C(O)Rx; -CO2(Rx); -CON(Rx)2; -OC(O)Rx; -OCO2Rx; -OCON(Rx)2; -N(Rx)2; -S(O)2Rx; -NRx(CO)Rx를 포함하나 이에 제한되지는 않은 1개 이상의 모이어티에 의해 독립적으로 대체됨으로써 치환되고, 여기서 각 경우의 Rx는 독립적으로 지방족, 헤테로지방족, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬을 포함하나 이에 제한되지는 않고, 여기서 상기 및 본원에 기재된 임의의 지방족, 헤테로지방족, 아릴알킬 또는 헤테로아릴알킬 치환기는 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형, 시클릭 또는 비-시클릭일 수 있고, 여기서 상기 및 본원에 기재된 임의의 아릴 또는 헤테로아릴 치환기는 치환 또는 비치환될 수 있다. 일반적으로 적용가능한 치환기의 추가의 예는 본원에 기재된 구체적 실시양태에 의해 예시된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "할로" 및 "할로겐"은 플루오린, 염소, 브로민 및 아이오딘으로부터 선택된 원자를 지칭한다.
용어 "알킬"은 직쇄 알킬 기 (예를 들어, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실 등), 분지쇄 알킬 기 (이소프로필, tert-부틸, 이소부틸 등), 시클로알킬 (지환족) 기 (시클로프로필, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸), 알킬 치환된 시클로알킬 기 및 시클로알킬 치환된 알킬 기를 포함한 포화 지방족 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 그의 백본에 6개 이하의 탄소 원자 (예를 들어, 직쇄의 경우에 C1-C6, 분지쇄의 경우에 C3-C6), 보다 바람직하게는 4개 이하의 탄소 원자를 갖는다. 마찬가지로, 바람직한 시클로알킬은 그의 고리 구조에 3-8개의 탄소 원자를, 보다 바람직하게는 고리 구조에 5 또는 6개의 탄소를 갖는다. 용어 C1-C6은 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 기를 포함한다.
더욱이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 알킬은 "비치환된 알킬" 및 "치환된 알킬" 둘 다를 포함하고, 이들 중 후자는 탄화수소 백본의 1개 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 독립적으로 선택된 치환기를 갖는 알킬 모이어티를 지칭한다. 이러한 치환기는, 예를 들어 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노 (알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다. 시클로알킬은, 예를 들어 상기 기재된 치환기로 추가로 치환될 수 있다. "알킬아릴" 또는 "아릴알킬" 모이어티는 아릴 (예를 들어, 페닐메틸 (벤질))로 치환된 알킬이다. 용어 "알킬"은 또한 천연 및 비천연 아미노산의 측쇄를 포함한다. 용어 "n-알킬"은 직쇄 (즉, 비분지형) 비치환된 알킬 기를 의미한다.
용어 "알케닐"은, 상기 기재된 알킬에 대해 길이 및 가능한 치환 면에서 유사하지만 적어도 1개의 이중 결합을 함유하는 불포화 지방족 기를 포함한다. 예를 들어, 용어 "알케닐"은 직쇄 알케닐 기 (예를 들어, 에틸레닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐, 헵테닐, 옥테닐, 노네닐, 데세닐 등), 분지쇄 알케닐 기, 시클로알케닐 (지환족) 기 (시클로프로페닐, 시클로펜테닐, 시클로헥세닐, 시클로헵테닐, 시클로옥테닐), 알킬 또는 알케닐 치환된 시클로알케닐 기, 및 시클로알킬 또는 시클로알케닐 치환된 알케닐 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 직쇄 또는 분지쇄 알케닐 기는 그의 백본에 6개 이하의 탄소 원자 (예를 들어, 직쇄의 경우에 C2-C6, 분지쇄의 경우에 C3-C6)를 갖는다. 마찬가지로, 시클로알케닐 기는 그의 고리 구조에 3-8개의 탄소 원자를, 보다 바람직하게는 고리 구조에 5 또는 6개의 탄소를 갖는다. 용어 C2-C6은 2 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알케닐 기를 포함한다.
더욱이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 알케닐은 "비치환된 알케닐" 및 "치환된 알케닐" 둘 다를 포함하고, 이들 중 후자는 탄화수소 백본의 1개 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 독립적으로 선택된 치환기를 갖는 알케닐 모이어티를 지칭한다. 이러한 치환기는, 예를 들어 알킬 기, 알키닐 기, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노 (알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다.
용어 "알키닐"은, 상기 기재된 알킬에 대해 길이 및 가능한 치환 면에서 유사하지만 적어도 1개의 삼중 결합을 함유하는 불포화 지방족 기를 포함한다. 예를 들어, 용어 "알키닐"은 직쇄 알키닐 기 (예를 들어, 에티닐, 프로피닐, 부티닐, 펜티닐, 헥시닐, 헵티닐, 옥티닐, 노니닐, 데시닐 등), 분지쇄 알키닐 기, 및 시클로알킬 또는 시클로알케닐 치환된 알키닐 기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 직쇄 또는 분지쇄 알키닐 기는 그의 백본에 6개 이하의 탄소 원자 (예를 들어, 직쇄의 경우에 C2-C6, 분지쇄의 경우에 C3-C6)를 갖는다. 용어 C2-C6은 2 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알키닐 기를 포함한다.
더욱이, 달리 명시되지 않는 한, 용어 알키닐은 "비치환된 알키닐" 및 "치환된 알키닐" 둘 다를 포함하고, 이들 중 후자는 탄화수소 백본의 1개 이상의 탄소 상의 수소를 대체하는 독립적으로 선택된 치환기를 갖는 알키닐 모이어티를 지칭한다. 이러한 치환기는, 예를 들어 알킬 기, 알키닐 기, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노 (알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티를 포함할 수 있다.
탄소의 수가 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 "저급 알킬"은, 상기 정의된 바와 같지만 그의 백본 구조에 1 내지 5개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 의미한다. "저급 알케닐" 및 "저급 알키닐"은 예를 들어, 2-5개의 탄소 원자의 쇄 길이를 갖는다.
용어 "알콕시"는 산소 원자에 공유 연결된, 치환 및 비치환된 알킬, 알케닐 및 알키닐 기를 포함한다. 알콕시 기의 예는 메톡시, 에톡시, 이소프로필옥시, 프로폭시, 부톡시 및 펜톡시 기를 포함한다. 치환된 알콕시 기의 예는 할로겐화 알콕시 기를 포함한다. 알콕시 기는 독립적으로 선택된 기, 예컨대 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노 (알킬 아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노 (알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬 술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴 또는 방향족 또는 헤테로방향족 모이어티로 치환될 수 있다. 할로겐 치환된 알콕시 기의 예는 플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 트리플루오로메톡시, 클로로메톡시, 디클로로메톡시, 트리클로로메톡시 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "헤테로원자"는 탄소 또는 수소 이외의 임의의 원소의 원자를 포함한다. 바람직한 헤테로원자는 질소, 산소, 황 및 인이다.
용어 "히드록시" 또는 "히드록실"은 -OH 또는 -O- (적절한 반대이온과 함께)를 갖는 기를 포함한다.
용어 "할로겐"은 플루오린, 브로민, 염소, 아이오딘 등을 포함한다. 용어 "퍼할로겐화"는 일반적으로, 모든 수소가 할로겐 원자에 의해 대체된 모이어티를 지칭한다.
용어 "치환된"은, 모이어티 상에 위치할 수 있으며 분자가 그것이 의도하는 기능을 수행하게 하는 독립적으로 선택된 치환기를 포함한다. 치환기의 예는 알킬, 알케닐, 알키닐, 아릴, (CR'R")0-3NR'R", (CR'R")0-3CN, NO2, 할로겐, (CR'R")0-3C(할로겐)3, (CR'R")0-3CH(할로겐)2, (CR'R")0-3CH2(할로겐), (CR'R")0-3CONR'R", (CR'R")0-3S(O)1-2NR'R", (CR'R")0-3CHO, (CR'R")0-3O(CR'R")0-3H, (CR'R")0-3S(O)0-2R', (CR'R")0-3O(CR'R")0-3H, (CR'R")0-3COR', (CR'R")0-3CO2R', 또는 (CR'R")0-3OR' 기를 포함하며, 여기서 각각의 R'및 R"는 각각 독립적으로 수소, C1-C5 알킬, C2-C5 알케닐, C2-C5 알키닐 또는 아릴 기이거나, 또는 R' 및 R"는 함께 벤질리덴 기 또는 -(CH2)2O(CH2)2- 기이다.
용어 "아민" 또는 "아미노"는 질소 원자가 적어도 1개의 탄소 또는 헤테로원자에 공유 결합된 화합물 또는 모이어티를 포함한다. 용어 "알킬 아미노"는 질소가 적어도 1개의 추가의 알킬 기에 결합된 기 및 화합물을 포함한다. 용어 "디알킬 아미노"는 질소 원자가 적어도 2개의 추가의 알킬 기에 결합된 기를 포함한다.
용어 "에테르"는 2개의 상이한 탄소 원자 또는 헤테로원자에 결합된 산소를 함유하는 화합물 또는 모이어티를 포함한다. 예를 들어, 상기 용어는 또 다른 알킬 기에 공유 결합된 산소 원자에 공유 결합된 알킬, 알케닐 또는 알키닐 기를 지칭하는 "알콕시알킬"을 포함한다.
용어 "폴리뉴클레오티드", "뉴클레오티드 서열", "핵산", "핵산 분자", "핵산 서열" 및 "올리고뉴클레오티드"는 2개 이상의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 또는 그의 유도체 또는 변형된 버전일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 염기 모이어티, 당 모이어티 또는 포스페이트 백본에서 변형되어, 예를 들어 분자의 안정성, 그의 혼성화 파라미터 등을 개선시킬 수 있다. 폴리뉴클레오티드는, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 하이포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록실메틸) 우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실퀘오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실퀘오신, 5'-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 와이부톡소신, 슈도우라실, 퀘오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산, 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필) 우라실 및 2,6-디아미노퓨린을 포함하나 이에 제한되지는 않는 군으로부터 선택된 변형된 염기 모이어티를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 당 모이어티 (예를 들어, 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 2'-O-메틸시티딘, 아라비노스 및 헥소스) 및/또는 변형된 포스페이트 모이어티 (예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 유전자 정보 (세포 기구에 의해 사용되는 정보 포함)를 운반하여 단백질 및 효소를 생성한다. 이들 용어는 이중- 또는 단일-가닥 게놈 및 cDNA, RNA, 임의의 합성 및 유전자 조작된 폴리뉴클레오티드, 및 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 둘 다를 포함한다. 이는 단일- 및 이중-가닥 분자, 즉 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 하이브리드, 뿐만 아니라 염기를 아미노산 백본에 접합시켜 형성된 "단백질 핵산" (PNA)을 포함한다.
용어 "염기"는 공지된 퓨린 및 피리미딘 헤테로시클릭 염기, 데아자퓨린, 및 그의 유사체 (헤테로시클릭 치환된 유사체, 예를 들어 아미노에톡시 페녹사진 포함), 유도체 (예를 들어, 1-알킬-, 1-알케닐-, 헤테로방향족- 및 1-알키닐 유도체) 및 호변이성질체를 포함한다. 퓨린의 예는 아데닌, 구아닌, 이노신, 디아미노퓨린 및 크산틴, 및 그의 유사체 (예를 들어, 8-옥소-N6-메틸아데닌 또는 7-디아자크산틴) 및 유도체를 포함한다. 피리미딘은 예를 들어 티민, 우라실 및 시토신, 및 그의 유사체 (예를 들어, 5-메틸시토신, 5-메틸우라실, 5-(1-프로피닐)우라실, 5-(1-프로피닐)시토신 및 4,4-에타노시토신)를 포함한다. 적합한 염기의 다른 예는 비-퓨리닐 및 비-피리미디닐 염기, 예컨대 2-아미노피리딘 및 트리아진을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오모노머는 RNA 뉴클레오티드이다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오모노머는 변형된 RNA 뉴클레오티드이다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 RNA 뉴클레오티드를 함유한다.
용어 "뉴클레오시드"는 당 모이어티, 바람직하게는 리보스 또는 데옥시리보스에 공유 부착된 염기를 포함한다. 바람직한 뉴클레오시드의 예는 리보뉴클레오시드 및 데옥시리보뉴클레오시드를 포함한다. 뉴클레오시드는, 아미노산, 또는 유리 카르복실 기, 유리 아미노 기 또는 보호기를 포함할 수 있는 아미노산 유사체에 연결된 염기를 또한 포함한다. 적합한 보호기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (문헌 [P. G. M. Wuts and T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", 2nd Ed., Wiley-Interscience, New York, 1999] 참조).
용어 "뉴클레오티드"는 포스페이트 기 또는 포스페이트 유사체를 추가로 포함하는 뉴클레오시드를 포함한다.
핵산 분자는 세포로의 분자의 표적화 및/또는 전달을 위해 소수성 모이어티와 회합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 소수성 모이어티는 링커를 통해 핵산 분자와 회합된다. 특정 실시양태에서, 회합은 비공유 상호작용을 통한다. 다른 실시양태에서, 회합은 공유 결합을 통한다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 링커는 핵산을 소수성 모이어티와 회합시키는데 사용될 수 있다. 관련 기술분야에 공지된 링커는 본원에 참조로 포함되는 공개된 국제 PCT 출원 WO 92/03464, WO 95/23162, WO 2008/021157, WO 2009/021157, WO 2009/134487, WO 2009/126933, 미국 특허 출원 공개 2005/0107325, 미국 특허 5,414,077, 미국 특허 5,419,966, 미국 특허 5,512,667, 미국 특허 5,646,126, 및 미국 특허 5,652,359에 기재되어 있다. 링커는 다중-원자 링커에 대한 공유 결합만큼 간단할 수 있다. 링커는 시클릭 또는 비-시클릭일 수 있다. 링커는 임의로 치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 핵산으로부터 절단될 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 생리학적 조건 하에 가수분해될 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 효소 (예를 들어, 에스테라제 또는 포스포디에스테라제)에 의해 절단될 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커는 핵산을 소수성 모이어티로부터 분리하기 위한 스페이서 요소를 포함한다. 스페이서 요소는 1 내지 30개의 탄소 또는 헤테로원자를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 링커 및/또는 스페이서 요소는 양성자화가능한 관능기를 포함한다. 이러한 양성자화가능한 관능기는 핵산 분자의 엔도솜 탈출을 촉진할 수 있다. 또한, 양성자화가능한 관능기는 세포로의 핵산의 전달을 보조하여, 예를 들어 분자의 전체적인 전하를 중성화할 수 있다. 다른 실시양태에서, 링커 및/또는 스페이서 요소는 생물학적으로 불활성이다 (즉, 이는 생성된 핵산 분자에 생물학적 활성 또는 기능을 부여하지 않음).
특정 실시양태에서, 링커 및 소수성 모이어티를 갖는 핵산 분자는 본원에 기재된 화학식을 갖는다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00001
여기서,
X는 N 또는 CH이고;
A는 결합; 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 지방족; 또는 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족이고;
R1은 소수성 모이어티이고;
R2는 수소; 산소-보호기; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 아실; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 아릴; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로아릴이고;
R3은 핵산이다.
특정 실시양태에서, 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00002
특정 실시양태에서, 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00003
특정 실시양태에서, 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00004
특정 실시양태에서, 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00005
특정 실시양태에서, X는 N이다. 특정 실시양태에서, X는 CH이다.
특정 실시양태에서, A는 결합이다. 특정 실시양태에서, A는 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 지방족이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환, 분지형 또는 비분지형 지방족이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환, 비분지형 지방족이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환, 비분지형 알킬이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환, 비분지형 C1-20 알킬이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환, 비분지형 C1-12 알킬이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환, 비분지형 C1-10 알킬이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환, 비분지형 C1-8 알킬이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환, 비분지형 C1-6 알킬이다. 특정 실시양태에서, A는 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족이다. 특정 실시양태에서, A는 비-시클릭, 치환, 비분지형 헤테로지방족이다.
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00006
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00007
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00008
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00009
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00010
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00011
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00012
여기서,
각 경우에 R은 독립적으로 천연 또는 비천연 아미노산의 측쇄이고;
n은 1 내지 20의 정수이다. 특정 실시양태에서, A는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00013
특정 실시양태에서, 각 경우에 R은 독립적으로 천연 아미노산의 측쇄이다. 특정 실시양태에서, n은 1 내지 15의 정수이다. 특정 실시양태에서, n은 1 내지 10의 정수이다. 특정 실시양태에서, n은 1 내지 5의 정수이다.
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00014
여기서, n은 1 내지 20의 정수이다. 특정 실시양태에서, A는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00015
특정 실시양태에서, n은 1 내지 15의 정수이다. 특정 실시양태에서, n은 1 내지 10의 정수이다. 특정 실시양태에서, n은 1 내지 5의 정수이다.
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00016
여기서, n은 1 내지 20의 정수이다. 특정 실시양태에서, A는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00017
특정 실시양태에서, n은 1 내지 15의 정수이다. 특정 실시양태에서, n은 1 내지 10의 정수이다. 특정 실시양태에서, n은 1 내지 5의 정수이다.
특정 실시양태에서, 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00018
여기서, X, R1, R2, 및 R3은 본원에 정의된 바와 같고;
A'는 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 지방족; 또는 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족이다.
특정 실시양태에서, A'는 하기 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00019
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00020
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식 중 하나를 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00021
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00022
특정 실시양태에서, A는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00023
특정 실시양태에서, R1은 스테로이드이다. 특정 실시양태에서, R1은 콜레스테롤이다. 특정 실시양태에서, R1은 친지성 비타민이다. 특정 실시양태에서, R1은 비타민 A이다. 특정 실시양태에서, R1은 비타민 E이다.
특정 실시양태에서, R1은 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00024
여기서, RA는 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 지방족; 또는 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족이다.
특정 실시양태에서, R1은 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00025
특정 실시양태에서, R1은 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00026
특정 실시양태에서, R1은 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00027
특정 실시양태에서, R1은 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00028
특정 실시양태에서, R1은 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00029
특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00030
여기서,
X는 N 또는 CH이고;
A는 결합; 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 지방족; 또는 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족이고;
R1은 소수성 모이어티이고;
R2는 수소; 산소-보호기; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 아실; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 아릴; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로아릴이고;
R3은 핵산이다.
특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00031
여기서,
X는 N 또는 CH이고;
A는 결합; 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 지방족; 또는 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족이고;
R1은 소수성 모이어티이고;
R2는 수소; 산소-보호기; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 아실; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 아릴; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로아릴이고;
R3은 핵산이다.
특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00032
여기서,
X는 N 또는 CH이고;
A는 결합; 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 지방족; 또는 치환 또는 비치환, 시클릭 또는 비-시클릭, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족이고;
R1은 소수성 모이어티이고;
R2는 수소; 산소-보호기; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 지방족; 시클릭 또는 비-시클릭, 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로지방족; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 아실; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 아릴; 치환 또는 비치환, 분지형 또는 비분지형 헤테로아릴이고;
R3은 핵산이다. 특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00033
특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00034
특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00035
여기서, R3은 핵산이다.
특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00036
여기서, R3은 핵산이고;
n은 1 내지 20의 정수이다.
특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00037
특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00038
특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00039
특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00040
특정 실시양태에서, 핵산 분자는 하기 화학식을 갖는다:
Figure 112023023085625-pat00041
본원에 사용된 용어 "연결"은 뉴클레오모노머에 인접하여 공유 커플링된, 자연 발생 비변형된 포스포디에스테르 모이어티 (-O-(PO2-)-O-)를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "치환기 연결"은 뉴클레오모노머에 인접하여 공유 커플링된, 천연 포스포디에스테르 기의 임의의 유사체 또는 유도체를 포함한다. 치환기 연결은 포스포디에스테르 유사체, 예를 들어 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 및 P-에티옥시포스포디에스테르, P-에톡시포스포디에스테르, P-알킬옥시포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 및 인 무함유 연결, 예를 들어 아세탈 및 아미드를 포함한다. 이러한 치환기 연결은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Bjergarde et al. 1991. Nucleic Acids Res. 19:5843; Caruthers et al. 1991. Nucleosides Nucleotides. 10:47]). 특정 실시양태에서, 비가수분해가능한 연결, 예컨대 포스포로티오에이트 연결이 바람직하다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 소수성으로 변형된 뉴클레오티드 또는 "소수성 변형"을 포함한다. 본원에 사용된 "소수성 변형"은, (1) 염기의 전체적인 소수성이 유의하게 증가되고/거나 (2) 염기가 규칙적인 왓슨-크릭 상호작용에 가까운 상호작용을 여전히 형성할 수 있도록 변형된 염기를 지칭한다. 염기 변형의 여러 비제한적 예는 5-위치 우리딘 및 시티딘 변형, 예컨대 페닐, 4-피리딜, 2-피리딜, 인돌릴, 및 이소부틸, 페닐 (C6H5OH); 트립토파닐 (C8H6N)CH2CH(NH2)CO), 이소부틸, 부틸, 아미노벤질; 페닐; 및 나프틸을 포함한다.
sd-rxRNA의 말단 (3' 또는 5' 말단), 루프 영역 또는 임의의 다른 부분에 부착될 수 있는 또 다른 유형의 접합체는 스테롤, 스테롤 유형 분자, 펩티드, 소분자, 단백질 등을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, sdrxRNA는 1개 초과의 접합체 (동일 또는 상이한 화학적 속성)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 접합체는 콜레스테롤이다.
표적 유전자 특이성을 증가시키거나 또는 오프-타겟 침묵 효과를 감소시키는 또 다른 방법은 가이드 서열의 제2의 5'-말단 뉴클레오티드에 상응하는 위치에 2'-변형 (예컨대, 2'-O 메틸 변형)을 도입하는 것이다. 이는 이러한 2'-변형을 다이서-저항성 헤어핀 구조에 위치하도록 하여, 오프-타겟 침묵을 덜 갖거나 전혀 갖지 않는 보다 양호한 RNAi 구축물의 설계를 가능하게 한다.
한 실시양태에서, 본 발명의 헤어핀 폴리뉴클레오티드는 DNA인 하나의 핵산 부분 및 RNA인 하나의 핵산 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 안티센스 (가이드) 서열은 RNA-유사 및 DNA-유사 영역을 포함하는 "키메라 올리고뉴클레오티드"일 수 있다.
용어 "RNase H 활성화 영역"은 올리고뉴클레오티드가 결합하는 표적 RNA 가닥을 RNase H를 동원하여 절단시킬 수 있는 올리고뉴클레오티드의 영역, 예를 들어 키메라 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 전형적으로, RNase 활성화 영역은 DNA 또는 DNA-유사 뉴클레오모노머의 최소 코어 (적어도 약 3-5개, 전형적으로 약 3-12개, 보다 전형적으로는 약 5-12개, 보다 바람직하게는 약 5-10개의 인접 뉴클레오모노머)를 함유한다. (예를 들어, 미국 특허 번호 5,849,902 참조). 바람직하게는, RNase H 활성화 영역은 약 9개의 인접 데옥시리보스 함유 뉴클레오모노머를 포함한다.
용어 "비-활성화 영역"은 RNase H를 동원 또는 활성화시키지 않는, 안티센스 서열의 영역, 예를 들어 키메라 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 비-활성화 영역은 포스포로티오에이트 DNA를 포함하지 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 적어도 1개의 비-활성화 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 비-활성화 영역은 뉴클레아제에 대해 안정화될 수 있거나, 또는 표적에 상보적이 되어 표적 핵산 분자와 수소 결합 (올리고뉴클레오티드에 의해 결합됨)을 형성함으로써 표적에 대한 특이성을 제공할 수 있다.
한 실시양태에서, 인접 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부는 치환기 연결, 예를 들어 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된다.
특정 실시양태에서, 가이드 서열 (2'-변형되거나 또는 변형되지 않음)을 넘어 대부분의 또는 모든 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 연결에 의해 연결된다. 이러한 구축물은 혈청 단백질에 대한 그의 보다 높은 친화도로 인해 개선된 약동학을 갖는 경향이 있다. 폴리뉴클레오티드의 비-가이드 서열 부분에서의 포스포로티오에이트 연결은 일반적으로, 일단 가이드 가닥이 RISC로 로딩되면 가이드 가닥 활성을 방해하지 않는다.
본 발명의 안티센스 (가이드) 서열은 "모르폴리노 올리고뉴클레오티드"를 포함할 수 있다. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드는 비-이온성이며, RNase H-비의존성 메카니즘에 의해 기능한다. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 4가지 유전자 염기 (아데닌, 시토신, 구아닌 및 티민/우라실) 각각은 6-원 모르폴린 고리에 연결된다. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 비-이온성 포스포로디아미데이트 서브유닛간 연결에 의해 4종의 상이한 서브유닛 유형을 연결하는 것에 의해 생성된다. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제에 대한 완전한 저항성 (Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1996. 6:267); 예측가능한 표적화 (Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141); 세포에서의 신뢰가능한 활성 (Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:63); 탁월한 서열 특이성 (Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:151); 최소의 비-안티센스 활성 (Biochemica Biophysica Acta. 1999. 1489:141); 및 간단한 삼투성 또는 스크레이프 전달 (Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:291)을 포함한 많은 이점을 갖는다. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드는 고용량에서의 그의 비-독성으로 인해 또한 바람직하다. 모르폴리노 올리고뉴클레오티드의 제조에 대한 논의는 문헌 [Antisense & Nucl. Acid Drug Dev. 1997. 7:187]에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기재된 데이터에 기초하여, 본원에 기재된 화학적 변형은 RISC로의 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 로딩을 촉진하는 것으로 여겨진다. 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 RISC로의 로딩 및 유전자 침묵의 유도에서 활성인 것으로 제시된 바 있다. 그러나, 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 경우에 활성의 수준은 듀플렉스 폴리뉴클레오티드와 비교하여 2 내지 4 자릿수 더 낮은 것으로 보인다.
본 발명은, (a) 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 안정성을 유의하게 증가시키고, (b) RISC 복합체로의 폴리뉴클레오티드의 효율적인 로딩을 촉진하고, (c) 세포에 의한 단일 가닥 뉴클레오티드의 흡수를 개선시킬 수 있는 화학적 변형 패턴에 대한 기재를 제공한다. 화학적 변형 패턴은 리보스, 백본, 소수성 뉴클레오시드 및 접합체 유형의 변형의 조합을 포함할 수 있다. 또한, 일부 실시양태에서, 단일 폴리뉴클레오티드의 5' 말단은 화학적으로 인산화될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 RISC 억제 폴리뉴클레오티드의 기능성을 개선시키는 화학적 변형 패턴에 대한 기재를 제공한다. 단일 가닥 폴리뉴클레오티드는 사전로딩된 RISC 복합체의 활성을 기질 경쟁 메카니즘을 통해 억제하는 것으로 제시된 바 있다. 통상적으로 안타고머라 불리는 이러한 유형의 분자의 경우에, 활성은 통상적으로 고농도를 필요로 하며, 생체내 전달은 매우 효과적이지 않다. 본 발명은 (a) 단일 가닥 폴리뉴클레오티드의 안정성을 유의하게 증가시키고/거나, (b) RISC에 의해 폴리뉴클레오티드를 기질로서 효율적으로 인식하는 것을 촉진하고/거나, (c) 세포에 의한 단일 가닥 뉴클레오티드의 흡수를 개선시킬 수 있는 화학적 변형 패턴에 대한 기재를 제공한다. 화학적 변형 패턴은 리보스, 백본, 소수성 뉴클레오시드 및 접합체 유형의 변형의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에 의해 제공된 변형은 모든 폴리뉴클레오티드에 적용가능하다. 이는 단일 가닥 RISC 진입 폴리뉴클레오티드, 단일 가닥 RISC 억제 폴리뉴클레오티드, 가변 길이 (15-40 bp)의 통상적인 듀플렉스 폴리뉴클레오티드, 비대칭 듀플렉스 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 5' 말단, 리보스, 백본 및 소수성 뉴클레오시드 변형을 포함한 매우 다양한 화학적 변형 패턴으로 변형될 수 있다.
합성
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어 효소적 합성 및/또는 화학적 합성을 사용하여 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 시험관내 (예를 들어, 효소적 합성 및 화학적 합성을 사용하여) 또는 생체내 (관련 기술분야에 널리 공지되어 있는 재조합 DNA 기술을 사용하여) 합성될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 화학적 합성은 변형된 폴리뉴클레오티드의 경우에 사용된다. 선형 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 용액 또는 고체 상 기술에 의해 달성될 수 있다. 바람직하게는, 합성은 고체 상 방법에 의한다. 올리고뉴클레오티드는 포스포르아미다이트, 포스파이트 트리에스테르, H-포스포네이트 및 포스포트리에스테르 방법을 포함한 여러 상이한 합성 절차 중 임의의 것에 의해, 전형적으로 자동화된 합성 방법에 의해 제조될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 합성 프로토콜은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 5,830,653; WO 98/13526; 문헌 [Stec et al. 1984. J. Am. Chem. Soc. 106:6077; Stec et al. 1985. J. Org. Chem. 50:3908; Stec et al. J. Chromatog. 1985. 326:263; LaPlanche et al. 1986. Nucl. Acid. Res. 1986. 14:9081; Fasman G. D., 1989. Practical Handbook of Biochemistry and Molecular Biology. 1989. CRC Press, Boca Raton, Fla.; Lamone. 1993. Biochem. Soc. Trans. 21:1]; 미국 특허 번호 5,013,830; 미국 특허 번호 5,214,135; 미국 특허 번호 5,525,719; 문헌 [Kawasaki et al. 1993. J. Med. Chem. 36:831]; WO 92/03568; 미국 특허 번호 5,276,019; 및 미국 특허 번호 5,264,423에서 찾아볼 수 있다.
선택되는 합성 방법은 목적하는 올리고뉴클레오티드의 길이에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 선택은 통상의 기술자의 기술 내에서 이루어진다. 예를 들어, 포스포르아미다이트 및 포스파이트 트리에스테르 방법은 175개 이상의 뉴클레오티드를 갖는 올리고뉴클레오티드를 생성할 수 있는 반면에, H-포스포네이트 방법은 100개 미만의 뉴클레오티드의 올리고뉴클레오티드의 경우에 잘 작용한다. 변형된 염기가 올리고뉴클레오티드 내로 혼입되는 경우에, 특히 변형된 포스포디에스테르 연결이 사용되는 경우에, 합성 절차는 필요한 경우에 공지된 절차에 따라 변경된다. 이와 관련하여, 문헌 [Uhlmann et al. (1990, Chemical Reviews 90:543-584)]은 변형된 염기 및 변형된 포스포디에스테르 연결을 갖는 올리고뉴클레오티드의 제조에 대한 참조를 제공하며, 이에 대한 절차를 약술한다. 올리고뉴클레오티드를 제조하는 것에 대한 다른 예시적인 방법은 문헌 [Sonveaux. 1994. "Protecting Groups in Oligonucleotide Synthesis"; Agrawal. Methods in Molecular Biology 26:1]에 교시되어 있다. 예시적인 합성 방법은 또한 문헌 ["Oligonucleotide Synthesis - A Practical Approach" (Gait, M. J. IRL Press at Oxford University Press. 1984)]에 교시되어 있다. 또한, 규정된 서열 (변형된 뉴클레오티드를 갖는 일부 서열 포함)의 선형 올리고뉴클레오티드는 여러 상업적 공급원으로부터 용이하게 입수가능하다.
올리고뉴클레오티드는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 또는 겔 크로마토그래피 및 고압 액체 크로마토그래피를 포함한 다수의 크로마토그래피 방법 중 임의의 것에 의해 정제될 수 있다. 뉴클레오티드 서열, 특히 비변형된 뉴클레오티드 서열을 확인하기 위해, 막삼(Maxam) 및 길버트(Gilbert) 서열분석, 생어(Sanger) 서열분석, 모세관 전기영동 서열분석, 이동 스팟 서열분석 절차를 포함한 임의의 공지된 절차에 의해 또는 하이본드(Hybond) 페이퍼에 결합된 올리고뉴클레오티드의 선택적인 화학적 분해를 사용함으로써, 올리고뉴클레오티드를 DNA 서열분석에 적용할 수 있다. 또한, 짧은 올리고뉴클레오티드의 서열은 레이저 탈착 질량 분광분석법에 의해 또는 고속 원자 충격에 의해 분석될 수 있다 (McNeal, et al., 1982, J. Am. Chem. Soc. 104:976; Viari, et al., 1987, Biomed. Environ. Mass Spectrom. 14:83; Grotjahn et al., 1982, Nuc. Acid Res. 10:4671). 서열분석 방법은 또한 RNA 올리고뉴클레오티드에 대해서도 이용가능하다.
합성된 올리고뉴클레오티드의 품질은, 예를 들어 문헌 [Bergot and Egan. 1992. J. Chrom. 599:35]의 방법을 사용하여 모세관 전기영동 및 변성 강음이온 HPLC (SAX-HPLC)에 의해 올리고뉴클레오티드를 시험함으로써 검증될 수 있다.
다른 예시적인 합성 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (DN Glover Ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M J Gait Ed, 1984; Nucleic Acid Hybridisation (B D Hames and S J Higgins eds. 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); 또는 연속간행물, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)] 참조).
특정 실시양태에서, 대상 RNAi 구축물 또는 적어도 그의 부분은 대상 구축물을 코딩하는 발현 벡터로부터 전사된다. 관련 기술분야에서 인식되는 임의의 벡터가 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 전사된 RNAi 구축물은 목적하는 변형 (예컨대, 비변형된 센스 가닥을 변형된 것으로 대체하는 것 등)이 수행되기 전에, 단리 및 정제될 수 있다.
전달/담체
세포에 의한 올리고뉴클레오티드의 흡수
올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 조성물은 1종 이상의 세포 또는 세포 용해물과 접촉되고 (즉, 그와 접촉되도록 함, 본원에서 그에 투여 또는 전달되는 것으로도 지칭됨), 그에 의해 흡수된다. 용어 "세포"는 원핵 및 진핵 세포, 바람직하게는 척추동물 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 조성물은 인간 세포와 접촉된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 조성물은 시험관내에서, 예를 들어 시험 튜브 또는 배양 접시 내에서 (그리고 이들은 대상체 내로 도입될 수 있거나 또는 도입되지 않을 수 있음) 또는 생체내에서, 예를 들어 포유동물 대상체와 같은 대상체 내에서 세포와 접촉될 수 있다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 국소로 또는 전기천공을 통해 투여된다. 올리고뉴클레오티드는 세포내이입에 의해 느린 속도로 세포에 의해 흡수되지만, 세포내이입된 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 격리되며, 예를 들어 표적 핵산 분자로의 혼성화를 위해서는 이용가능하지 않다. 한 실시양태에서, 세포 흡수는 전기천공 또는 인산칼슘 침전에 의해 용이해질 수 있다. 그러나, 이러한 절차는 시험관내 또는 생체외 실시양태의 경우에만 유용하고, 편리하지 않으며, 일부 경우에 세포 독성과 연관된다.
또 다른 실시양태에서, 세포로의 올리고뉴클레오티드의 전달은, 인산칼슘, DMSO, 글리세롤 또는 덱스트란, 전기천공을 포함한 관련 기술분야에서 인식되는 적합한 방법에 의해, 또는 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 양이온성, 음이온성 또는 중성 지질 조성물 또는 리포솜을 사용한 형질감염에 의해 증진될 수 있다 (예를 들어, WO 90/14074; WO 91/16024; WO 91/17424; 미국 특허 번호 4,897,355; 문헌 [Bergan et al. 1993. Nucleic Acids Research. 21:3567] 참조). 또한, 올리고뉴클레오티드의 증진된 전달은 벡터 (예를 들어, 문헌 [Shi, Y. 2003. Trends Genet 2003 Jan. 19:9; Reichhart J M et al. Genesis. 2002. 34(1-2):1604, Yu et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:6047; Sui et al. 2002. Proc. Natl. Acad Sci. USA 99:5515] 참조), 바이러스, 폴리아민 또는 다가양이온 접합체 (폴리리신, 프로타민, 또는 Ni, N12-비스 (에틸) 스페르민과 같은 화합물을 사용함)를 사용하는 것에 의해 매개될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Bartzatt, R. et al.1989. Biotechnol. Appl. Biochem. 11:133; Wagner E. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. 88:4255] 참조).
특정 실시양태에서, 본 발명의 sd-rxRNA는 2010년 3월 4일에 출원된 표제 "Formulations and Methods for Targeted Delivery to Phagocyte Cells"의 미국 가출원 번호 61/310,611에 기재되어 있고 이로부터 참조로 포함되는, GeRP (글루칸 캡슐화된 RNA 로딩된 입자)로 지칭되는 다양한 베타-글루칸 함유 입자를 사용하여 전달될 수 있다. 이러한 입자는 또한 미국 특허 공개 US 2005/0281781 A1, 및 US 2010/0040656, 및 PCT 공개 WO 2006/007372, 및 WO 2007/050643에 기재되어 있고 이로부터 참조로 포함된다. sd-rxRNA 분자는 소수성으로 변형될 수 있으며, 임의로 지질 및/또는 친양쪽성 펩티드와 회합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 베타-글루칸 입자는 효모로부터 유래된다. 특정 실시양태에서, 페이로드 포획 분자는 중합체, 예컨대 적어도 약 1000 Da, 10,000 Da, 50,000 Da, 100 kDa, 500 kDa 등의 분자량을 갖는 것이다. 바람직한 중합체는 (제한 없이) 양이온성 중합체, 키토산 또는 PEI (폴리에틸렌이민) 등을 포함한다.
글루칸 입자는 진균 세포벽, 예컨대 효모 세포벽의 불용성 성분으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 효모는 베이커 효모이다. 효모-유래 글루칸 분자는 β-(1,3)-글루칸, β-(1,6)-글루칸, 만난 및 키틴 중 1종 이상을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 글루칸 입자는 중공 효모 세포벽을 포함함으로써, 그 내부에서 RNA 분자와 같은 분자와 복합체화되거나 또는 이를 캡슐화할 수 있는, 세포와 유사한 3차원 구조를 유지한다. 효모 세포벽 입자의 사용과 연관된 일부 이점은 성분의 이용가능성, 그의 생분해성 속성 및 식세포에 표적화되는 그의 능력이다.
일부 실시양태에서, 글루칸 입자는, 예를 들어 베이커 효모 (플라이슈만(Fleischmann))를 1M NaOH/pH 4.0 H2O로 추출하는 것에 의해 불용성 성분을 세포벽으로부터 추출하고, 이어서 세척 및 건조시킴으로써 제조될 수 있다. 효모 세포벽 입자의 제조 방법은 미국 특허 4,810,646, 4,992,540, 5,082,936, 5,028,703, 5,032,401, 5,322,841, 5,401,727, 5,504,079, 5,607,677, 5,968,811, 6,242,594, 6,444,448, 6,476,003, 미국 특허 공개 2003/0216346, 2004/0014715 및 2010/0040656, 및 PCT 공개 출원 WO02/12348에서 논의되어 있고 이로부터 참조로 포함된다.
글루칸 입자를 제조하기 위한 프로토콜은 또한 하기 문헌 [Soto and Ostroff (2008), "Characterization of multilayered nanoparticles encapsulated in yeast cell wall particles for DNA delivery." Bioconjug Chem 19(4):840-8; Soto and Ostroff (2007), "Oral Macrophage Mediated Gene Delivery System," Nanotech, Volume 2, Chapter 5 ("Drug Delivery"), pages 378-381; and Li et al. (2007), "Yeast glucan particles activate murine resident macrophages to secrete proinflammatory cytokines via MyD88- and Syk kinase-dependent pathways." Clinical Immunology 124(2):170-181]에 기재되어 있고 이로부터 참조로 포함된다.
글루칸 함유 입자, 예컨대 효모 세포벽 입자는 또한 상업적으로 입수할 수 있다. 여러 비제한적 예는, 바이오리진(Biorigin) (브라질 상파울루)으로부터의 뉴트리셀(Nutricell) MOS 55, SAF-만난 (SAF 아그리(SAF Agri), 미네소타주 미네아폴리스), 뉴트렉스(Nutrex) (센시엔트 테크놀로지스(Sensient Technologies), 위스콘신주 밀워키), 알칼리-추출 입자, 예컨대 뉴트리셉츠(Nutricepts) (뉴트리셉츠 인크.(Nutricepts Inc.), 미네소타주 번스빌) 및 ASA 바이오테크(ASA Biotech)에 의해 제조된 것, 바이오폴리머 엔지니어링(Biopolymer Engineering)으로부터의 산-추출 WGP 입자, 및 유기 용매-추출 입자, 예컨대 알파-베타 테크놀로지, 인크.(Alpha-beta Technology, Inc.) (매사추세츠주 우스터)로부터의 아주백스(Adjuvax)™ 및 노보젠(Novogen) (코네티컷주 스탬포드)으로부터의 마이크로미립자 글루칸을 포함한다.
글루칸 입자, 예컨대 효모 세포벽 입자는 제조 및/또는 추출 방법에 따라 다양한 수준의 순도를 가질 수 있다. 일부 경우에, 입자는 세포내 성분 및/또는 세포벽의 외부 만노단백질 층을 제거하기 위해 알칼리-추출되거나, 산-추출되거나 또는 유기 용매-추출된다. 이러한 프로토콜은 50% - 90% 범위의 글루칸 (w/w) 함량을 갖는 입자를 생성할 수 있다. 일부 경우에, 보다 낮은 글루칸 w/w 함량을 의미하는 보다 낮은 순도의 입자가 바람직할 수 있는 반면, 다른 실시양태에서는 보다 높은 글루칸 w/w 함량을 의미하는 보다 높은 순도의 입자가 바람직할 수 있다.
글루칸 입자, 예컨대 효모 세포벽 입자는 천연 지질 함량을 가질 수 있다. 예를 들어, 입자는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% 또는 20% w/w 초과의 지질을 함유할 수 있다. 실시예 섹션에서, 2종의 글루칸 입자 배치의 유효성을 시험하였다: YGP SAF 및 YGP SAF + L (천연 지질 함유). 일부 경우에, 천연 지질의 존재는 RNA 분자의 복합체화 또는 포획에 도움이 될 수 있다.
글루칸 함유 입자는 전형적으로 대략 2-4 마이크로미터의 직경을 갖지만, 2 마이크로미터 미만 또는 4 마이크로미터 초과의 직경을 갖는 입자도 또한 본 발명의 측면과 상용성이다.
전달되는 RNA 분자(들)는 글루칸 입자의 쉘 내에 복합체화되거나 또는 "포획"된다. 입자의 쉘 또는 RNA 성분은, 문헌 [Soto and Ostroff (2008) Bioconjug Chem 19:840]에 기재되어 있고 이로부터 참조로 포함되는 바와 같이, 시각화를 위해 표지될 수 있다. GeRP의 로딩 방법은 하기에 추가로 논의된다.
올리고뉴클레오티드의 흡수를 위한 최적의 프로토콜은 인자의 수에 따라 달라질 것이며, 가장 중요한 것은 사용되는 세포의 유형일 것이다. 흡수에 중요한 다른 인자는 올리고뉴클레오티드의 속성 및 농도, 세포의 전면생장률, 세포 배양의 유형 (예를 들어, 현탁 배양 또는 플레이팅) 및 세포가 성장하는 배지의 유형을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
캡슐화제
캡슐화제는 소포 내의 올리고뉴클레오티드를 포획한다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 담체 또는 비히클, 예를 들어 리포솜 또는 미셀과 회합될 수 있지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식될 바와 같이 다른 담체가 사용될 수 있다. 리포솜은 생물학적 막과 유사한 구조를 갖는 지질 이중층으로 이루어진 소포이다. 이러한 담체는 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수 또는 표적화를 용이하게 하거나, 올리고뉴클레오티드의 약동학적 또는 독성학적 특성을 개선시키는데 사용된다.
또한, 예를 들어 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 활성 성분이 함유된 제약 조성물이 지질 층에 부착된 수성 동심 층으로 이루어진 소체에 분산되거나 다양하게 존재하는, 리포솜 내에 캡슐화되어 투여될 수 있다. 용해도에 따라, 올리고뉴클레오티드는 수성 층 및 지질 층 둘 다에, 또는 일반적으로 리포솜 현탁액으로 불리는 것에 존재할 수 있다. 일반적으로 독점적인 것은 아니지만, 소수성 층은 인지질, 예컨대 레시틴 및 스핑고미엘린, 스테로이드, 예컨대 콜레스테롤, 다소 이온성인 계면활성제, 예컨대 디아세틸포스페이트, 스테아릴아민 또는 포스파티드산, 또는 소수성 속성을 갖는 다른 물질을 포함한다. 리포솜의 직경은 일반적으로 약 15 nm 내지 약 5 마이크로미터의 범위이다.
약물 전달 비히클로서 리포솜을 사용하는 것은 여러 이점을 제공한다. 리포솜은 세포내 안정성을 증가시키고, 흡수 효율을 증가시키고, 생물학적 활성을 개선시킨다. 리포솜은 세포 막을 구성하는 지질과 유사한 방식으로 배열된 지질로 이루어진 중공 구형 소포이다. 이들은 수용성 화합물을 포획하기 위한 내부 수성 공간을 갖고, 0.05 내지 수 마이크로미터 직경 크기의 범위를 갖는다. 여러 연구는, 리포솜은 핵산을 세포로 전달할 수 있고 핵산은 생물학적으로 활성인 상태로 유지된다는 것을 제시한 바 있다. 예를 들어, 원래는 연구 도구로서 설계된 지질 전달 비히클, 예컨대 리포펙틴(Lipofectin) 또는 리포펙타민(LIPOFECTAMINE)™ 2000은 무손상 핵산 분자를 세포에 전달할 수 있다.
리포솜을 사용하는 특정 이점은, 이들이 비-독성이며 조성물 내에서 생분해성인 점; 긴 순환 반감기를 나타내는 점; 및 인식 분자가 조직으로의 표적화를 위해 그의 표면에 용이하게 부착될 수 있다는 점을 포함한다. 마지막으로, 리포솜-기반 제약을 액체 현탁액 또는 동결건조된 생성물로 비용-효과적으로 제조하는 것은, 허용가능한 약물 전달 시스템으로서의 본 기술의 실현가능성을 입증하였다.
일부 측면에서, 본 발명과 연관된 제제는, 자연 발생 또는 화학적 합성 또는 변형된 포화 및 불포화 지방산 잔기 부류에 대해 선택될 수 있다. 지방산은 트리글리세리드, 디글리세리드 또는 개별 지방산의 형태로 존재할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 비경구 영양을 위한 약리학에 현재 사용되는 지방산 및/또는 지방 에멀젼의 널리-검증된 혼합물의 사용이 사용될 수 있다.
리포솜 기반 제제는 올리고뉴클레오티드 전달을 위해 광범위하게 사용된다. 그러나, 상업적으로 입수가능한 지질 또는 리포솜 제제의 대부분은 적어도 1개의 양으로 하전된 지질 (양이온성 지질)을 함유한다. 이러한 양으로 하전된 지질의 존재는, 높은 정도의 올리고뉴클레오티드 로딩을 수득하고 리포솜 융합생성 특성을 증진시키기 위해 필수적인 것으로 여겨진다. 최적의 양으로 하전된 지질 화학을 확인하기 위한 여러 방법이 수행되고 공개된 바 있다. 그러나, 양이온성 지질을 함유하는 상업적으로 입수가능한 리포솜 제제는 높은 수준의 독성을 특징으로 한다. 생체내 제한된 치료 지수는, 양으로 하전된 지질을 함유하는 리포솜 제제는 RNA 침묵의 달성에 요구되는 농도보다 약간 더 높은 농도에서만 독성 (즉, 간 효소에서의 상승)과 연관된다는 것을 밝혀내었다.
본 발명과 연관된 핵산은 소수성으로 변형될 수 있고, 중성 나노수송체 내에 포괄될 수 있다. 중성 나노수송체에 대한 추가의 기재는, 2009년 9월 22일에 출원된 표제 "Neutral Nanotransporters"의 PCT 출원 PCT/US2009/005251로부터 참조로 포함된다. 이러한 입자는 비하전된 지질 혼합물로의 정량적 올리고뉴클레오티드 혼입을 가능하게 한다. 이러한 중성 나노수송체 조성물에서 양이온성 지질의 독성 수준의 결여는 중요한 특색이다.
PCT/US2009/005251에서 입증된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 양이온성 지질이 없는 지질 혼합물에 효과적으로 혼입될 수 있으며, 이러한 조성물은 기능적인 방식으로, 치료적 올리고뉴클레오티드를 세포로 효과적으로 전달할 수 있다. 예를 들어, 지방 혼합물이 포스파티딜콜린 기반 지방산 및 콜레스테롤과 같은 스테롤로 구성된 경우에, 높은 수준의 활성이 관찰되었다. 예를 들어, 한 바람직한 중성 지방 혼합물 제제는 적어도 20%의 DOPC 또는 DSPC 및 적어도 20%의 스테롤, 예컨대 콜레스테롤로 구성된다. 1:5만큼 낮은 지질 대 올리고뉴클레오티드 비도 비 하전된 제제에서 올리고뉴클레오티드의 완전한 캡슐화를 얻기에 충분한 것으로 제시되었다.
중성 나노수송체 조성물은 중성 지방 제제로의 올리고뉴클레오티드의 효율적인 로딩을 가능하게 한다. 조성물은, 분자의 소수성이 증가되도록 하는 방식으로 (예를 들어, 소수성 분자가 올리고뉴클레오티드 말단 또는 비-말단 뉴클레오티드, 염기, 당 또는 백본 상의 소수성 분자에 (공유 또는 비공유) 부착됨) 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 변형된 올리고뉴클레오티드는 중성 지방 제제 (예를 들어, 적어도 25%의 콜레스테롤 및 25%의 DOPC 또는 그의 유사체를 함유함)와 혼합된다. 화물 분자, 예컨대 또 다른 지질이 조성물에 또한 포함될 수 있다. 제제의 일부가 올리고뉴클레오티드 그 자체로 구축된 이러한 조성물은 중성 지질 입자 내 올리고뉴클레오티드의 효율적인 캡슐화를 가능하게 한다.
일부 측면에서, 바람직한 제제와의 소수성 올리고뉴클레오티드의 복합체화에 따라, 50 내지 140 nm 크기 범위의 안정한 입자가 형성될 수 있다. 제제 그 자체가 전형적으로 소형 입자를 형성하기보다는 오히려 응집체를 형성하며, 소수성 변형된 올리고뉴클레오티드의 첨가 시 50-120 nm의 안정한 입자로 변형된다는 것을 언급하는 것은 흥미롭다.
본 발명의 중성 나노수송체 조성물은 소수성으로 변형된 폴리뉴클레오티드, 중성 지방 혼합물, 및 임의로 화물 분자를 포함한다. 본원에 사용된 "소수성으로 변형된 폴리뉴클레오티드"는, 폴리뉴클레오티드를 변형 전의 폴리뉴클레오티드보다 더 소수성이 되도록 하는 적어도 1개의 변형을 갖는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 (즉, sd-rxRNA)이다. 변형은 소수성 분자를 폴리뉴클레오티드에 (공유 또는 비공유) 부착시켜 달성될 수 있다. 일부 경우에, 소수성 분자는 친지성 기이거나 또는 이를 포함한다.
용어 "친지성 기"는 물에 대한 그의 친화도보다 지질에 대해 더 높은 친화도를 갖는 기를 의미한다. 친지성 기의 예는 콜레스테롤, 콜레스테릴 또는 변형된 콜레스테릴 잔기, 아다만틴, 디히드로테스테론, 장쇄 알킬, 장쇄 알케닐, 장쇄 알키닐, 올레일-리토콜산, 콜렌산, 올레오일-콜렌산, 팔미틸, 헵타데실, 미리스틸, 담즙산, 콜산 또는 타우로콜산, 데옥시콜레이트, 올레일 리토콜산, 올레오일 콜렌산, 당지질, 인지질, 스핑고지질, 이소프레노이드, 예컨대 스테로이드, 비타민, 예컨대 비타민 E, 포화 또는 불포화 지방산, 지방산 에스테르, 예컨대 트리글리세리드, 피렌, 포르피린, 텍사피린, 아다만탄, 아크리딘, 비오틴, 쿠마린, 플루오레세인, 로다민, 텍사스-레드, 디곡시게닌, 디메톡시트리틸, t-부틸디메틸실릴, t-부틸디페닐실릴, 시아닌 염료 (예를 들어, Cy3 또는 Cy5), 훽스트(Hoechst) 33258 염료, 프소랄렌 또는 이부프로펜을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 콜레스테롤 모이어티는 환원될 수 있거나 (예를 들어, 콜레스탄에서와 같이) 또는 (예를 들어, 할로겐에 의해) 치환될 수 있다. 1개의 분자에서 상이한 친지성 기들의 조합이 또한 가능하다.
소수성 분자는 폴리뉴클레오티드의 다양한 위치에 부착될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 소수성 분자는 폴리뉴클레오티드의 말단 잔기, 예컨대 폴리뉴클레오티드의 3' 또는 5'-말단에 연결될 수 있다. 대안적으로, 내부 뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드의 분지 상의 뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 소수성 분자는, 예를 들어 뉴클레오티드의 2'-위치에 부착될 수 있다. 소수성 분자는 또한 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드의 헤테로시클릭 염기, 당 또는 백본에 연결될 수 있다.
소수성 분자는 링커 모이어티에 의해 폴리뉴클레오티드에 연결될 수 있다. 임의로, 링커 모이어티는 비-뉴클레오티드 링커 모이어티이다. 비-뉴클레오티드 링커는 예를 들어, 무염기성 잔기 (디스페이서(dSpacer)), 올리고에틸렌글리콜, 예컨대 트리에틸렌글리콜 (스페이서 9) 또는 헥사에틸렌글리콜 (스페이서 18), 또는 알칸-디올, 예컨대 부탄디올이다. 스페이서 단위는 바람직하게는 포스포디에스테르 또는 포스포로티오에이트 결합에 의해 연결된다. 링커 단위는 분자에서 1회만 나타날 수 있거나 또는 예를 들어 포스포디에스테르, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 또는 아미드 연결을 통해 수회 혼입될 수 있다.
전형적인 접합 프로토콜은 서열의 1개 이상의 위치에 아미노링커를 보유하는 폴리뉴클레오티드의 합성을 수반하지만, 링커는 요구되지 않는다. 이어서, 아미노 기는 적절한 커플링 또는 활성화 시약을 사용하여, 접합되는 분자와 반응된다. 접합 반응은 여전히 고체 지지체에 결합된 폴리뉴클레오티드, 또는 용액 상에서 폴리뉴클레오티드의 후속 절단에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, 변형된 폴리뉴클레오티드를 HPLC에 의해 정제하여 순수한 물질을 생성한다.
일부 실시양태에서, 소수성 분자는 스테롤 유형 접합체, 피토스테롤 접합체, 콜레스테롤 접합체, 변경된 측쇄 길이를 갖는 스테롤 유형 접합체, 지방산 접합체, 임의의 다른 소수성 기 접합체 및/또는 내부 뉴클레오시드의 소수성 변형체이며, 이는 미셀로 혼입되기에 충분한 소수성을 제공한다.
본 발명의 목적상, 용어 "스테롤"은 A-고리의 3-위치에 히드록실 기를 갖는, 스테로이드의 하위군인 스테로이드 알콜을 지칭한다. 이들은 HMG-CoA 리덕타제 경로를 통해 아세틸-조효소 A로부터 합성된 양친매성 지질이다. 전체적인 분자는 매우 편평하다. A 고리 상의 히드록실 기는 극성이다. 지방족 쇄의 나머지는 비극성이다. 통상적으로 스테롤은 위치 17에 8 탄소 쇄를 갖는 것으로 간주된다.
본 발명의 목적상, 용어 "스테롤 유형 분자"는 스테롤과 구조가 유사한 스테로이드 알콜을 지칭한다. 주요 차이는 고리의 구조 및 측쇄에 부착된 위치 21에서의 탄소의 수이다.
본 발명의 목적상, 용어 "피토스테롤" (식물 스테롤로도 불림)은 식물에서 자연 발생하는 피토케미칼인, 스테로이드 알콜의 군이다. 200가지 초과의 상이한 피토스테롤이 공지되어 있다.
본 발명의 목적상, 용어 "스테롤 측쇄"는 스테롤-유형 분자의 위치 17에 부착된 측쇄의 화학적 조성을 지칭한다. 표준 정의에서, 스테롤은 위치 17에 8 탄소 쇄를 보유하는 4 고리 구조로 제한된다. 본 발명에서, 통상적인 것보다 더 길고 짧은 측쇄를 갖는 스테롤 유형 분자가 기재된다. 측쇄는 분지형이거나 또는 이중 백본을 함유할 수 있다.
따라서, 본 발명에 유용한 스테롤은, 예를 들어 콜레스테롤 뿐만 아니라 위치 17에 2-7개 또는 9개 초과의 탄소의 측쇄가 부착된 고유한 스테롤을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 다중탄소 꼬리의 길이는 5 내지 9개의 탄소로 다양하다. 이러한 접합체는 특히 간으로의 전달에 있어서 유의하게 양호한 생체내 효능을 가질 수 있다. 이러한 유형의 분자는 통상적인 콜레스테롤에 접합된 올리고뉴클레오티드보다 5 내지 9배 더 낮은 농도에서 작용할 것으로 예상된다.
대안적으로, 폴리뉴클레오티드는 소수성 분자로서 기능하는 단백질, 펩티드 또는 양으로 하전된 화학물질에 결합될 수 있다. 단백질은 프로타민, dsRNA 결합 도메인 및 아르기닌 풍부 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예시적인 양으로 하전된 화학물질은 스페르민, 스페르미딘, 카다베린 및 푸트레신을 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 소수성 분자 접합체는 폴리뉴클레오티드의 최적의 화학적 변형 패턴 (본원에 상세하게 기재된 바와 같음) (소수성 변형, 포스포로티오에이트 변형 및 2' 리보 변형을 함유하나 이에 제한되지는 않음)과 조합되는 경우에도 보다 높은 효능을 나타낼 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 스테롤 유형 분자는 자연 발생 피토스테롤일 수 있다. 다중탄소 쇄는 9개보다 더 길 수 있고, 선형, 분지형일 수 있고/거나 이중 결합을 함유할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 접합체를 함유하는 일부 피토스테롤은 다양한 조직으로의 폴리뉴클레오티드의 전달에 있어서 유의하게 보다 강력하고 활성일 수 있다. 일부 피토스테롤은 조직 선호도를 나타낼 수 있고, 이에 따라 특정한 조직에 특이적으로 RNAi를 전달하는 방법으로서 사용될 수 있다.
소수성으로 변형된 폴리뉴클레오티드는 중성 지방 혼합물과 혼합되어 미셀을 형성한다. 중성 지방산 혼합물은, 소수성으로 변형된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미셀을 형성할 수 있는 생리학적 pH 또는 그 근처에서 알짜 중성 또는 약간 알짜 음전하를 갖는 지방의 혼합물이다. 본 발명의 목적상, 용어 "미셀"은 비하전된 지방산과 인지질의 혼합물에 의해 형성된 소형 나노입자를 지칭한다. 중성 지방 혼합물은, 독성을 유발하지 않는 양으로 존재하는 한, 양이온성 지질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 중성 지방 혼합물은 양이온성 지질을 함유하지 않는다. 양이온성 지질을 함유하지 않는 혼합물은 1% 미만 및 바람직하게는 0%의 총 지질 (양이온성 지질)을 갖는 혼합물이다. 용어 "양이온성 지질"은 생리학적 pH 또는 그 근처에서 알짜 양전하를 갖는 지질 및 합성 지질을 포함한다. 용어 "음이온성 지질"은 생리학적 pH 또는 그 근처에서 알짜 음전하를 갖는 지질 및 합성 지질을 포함한다.
중성 지방은, 강력하지만 비공유 인력 (예를 들어, 정전기적, 반 데르 발스, 파이-적층 등의 상호작용)에 의해 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 결합한다.
중성 지방 혼합물은, 자연 발생 또는 화학적 합성 또는 변형된 포화 및 불포화 지방산 잔기 부류로부터 선택된 제제를 포함할 수 있다. 지방산은 트리글리세리드, 디글리세리드 또는 개별 지방산의 형태로 존재할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 비경구 영양을 위한 약리학에 현재 사용되는 지방산 및/또는 지방 에멀젼의 널리-입증된 혼합물의 사용이 사용될 수 있다.
중성 지방 혼합물은 바람직하게는 콜린 기반 지방산 및 스테롤의 혼합물이다. 콜린 기반 지방산은, 예를 들어 합성 포스포콜린 유도체, 예컨대 DDPC, DLPC, DMPC, DPPC, DSPC, DOPC, POPC, 및 DEPC를 포함한다. DOPC (화학물질 등록 번호 4235-95-4)는 디올레오일포스파티딜콜린 (디엘라이도일포스파티딜콜린, 디올레오일-PC, 디올레오일포스포콜린, 디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 디올레일포스파티딜콜린으로도 공지됨)이다. DSPC (화학물질 등록 번호 816-94-4)는 디스테아로일포스파티딜콜린 (1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린으로도 공지됨)이다.
중성 지방 혼합물에서 스테롤은, 예를 들어 콜레스테롤일 수 있다. 중성 지방 혼합물은 완전히 콜린 기반 지방산 및 스테롤로 이루어질 수 있거나 또는 임의로 화물 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 중성 지방 혼합물은 적어도 20% 또는 25%의 지방산 및 20% 또는 25%의 스테롤을 가질 수 있다.
본 발명의 목적상, 용어 "지방산"은 지방산의 통상적인 기재에 관한 것이다. 이들은 개별 엔티티로서 또는 2- 및 트리글리세리드의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 목적상, 용어 "지방 에멀젼"은, 식이로 충분한 지방을 얻을 수 없는 대상체에게 정맥내로 제공된 안전한 지방 제제를 지칭한다. 이는 대두 오일 (또는 다른 자연 발생 오일) 및 난 인지질의 에멀젼이다. 지방 에멀젼은 일부 불용성 마취제 제제를 위해 사용된다. 이러한 개시내용에서, 지방 에멀젼은 인트라리피드(Intralipid), 리포신(Liposyn), 뉴트리리피드(Nutrilipid)와 같이 상업적으로 입수가능한 제제, 변형된 상업적 제제 (이들은 특정한 지방산이 풍부하거나 또는 지방산 및 인지질의 완전 신생-제제화 조합물임)의 일부일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 조성물과 접촉되는 세포는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물 및 지질, 예를 들어 상기 기재된 지질 또는 지질 조성물 중 하나를 포함하는 혼합물과 약 12시간 내지 약 24시간 동안 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 조성물과 접촉되는 세포는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물 및 지질, 예를 들어 상기 기재된 지질 또는 지질 조성물 중 하나를 포함하는 혼합물과 약 1 내지 약 5일 동안 접촉된다. 한 실시양태에서, 세포는 지질 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물과 약 3 내지 약 30일만큼 오래 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 지질을 포함하는 혼합물은 세포와 적어도 약 5 내지 약 20일 동안 접촉된 상태로 둔다. 또 다른 실시양태에서, 지질을 포함하는 혼합물은 세포와 적어도 약 7 내지 약 15일 동안 접촉된 상태로 둔다.
제제 중 50%-60%는 임의로, 임의의 다른 지질 또는 분자일 수 있다. 이러한 지질 또는 분자는 본원에서 화물 지질 또는 화물 분자로서 지칭된다. 화물 분자는 인트라리피드, 소분자, 융합생성 펩티드 또는 지질, 또는 세포 흡수, 엔도솜 방출 또는 조직 분포 특성을 변경시키기 위해 첨가될 수 있는 다른 소분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이러한 특성이 바람직한 경우에, 화물 분자를 용인하는 능력은 이들 입자의 특성의 조정에 중요하다. 예를 들어, 일부 조직 특이적 대사물질의 존재는 조직 분포 프로파일을 극적으로 변경시킬 수 있다. 예를 들어, 다양한 포화도를 갖는 보다 짧거나 보다 긴 지방 쇄가 풍부한 인트라리피드 유형 제제의 사용은 이러한 유형의 제제의 조직 분포 프로파일 (및 이들의 로딩)에 영향을 미친다.
본 발명에 따른 유용한 화물 지질의 예는 융합생성 지질이다. 예를 들어, 쯔비터이온성 지질 DOPE (화학물질 등록 번호 4004-5-1, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민)는 바람직한 화물 지질이다.
인트라리피드는, 정제된 대두 오일 90 g, 정제된 난 인지질 12 g, 글리세롤 무수물 22 g, 1000 mL가 될 때까지의 적당량의 주사용수를 함유하는 이러한 1000 mL 조성으로 구성될 수 있다. pH는 수산화나트륨을 사용하여 대략 pH 8로 조정된다. 에너지 함량/L: 4.6 MJ (190 kcal). 오스몰랄농도 (대략): 300 mOsm/kg 물. 또 다른 실시양태에서, 지방 에멀젼은 주사용수 중 5% 홍화 오일, 5% 대두 오일, 유화제로서 첨가되는 1.2% 이하의 난 포스파티드 및 2.5% 글리세린을 함유하는 리포신이다. 이는 또한 pH 조정을 위해 수산화나트륨을 함유할 수 있다. pH 8.0 (6.0 - 9.0). 리포신은 276 m Osmol/리터 (실제값)의 오스몰농도를 갖는다.
화물 지질의 동일성, 양 및 비에서의 변동은 이들 화합물의 세포 흡수 및 조직 분포 특징에 영향을 미친다. 예를 들어, 지질 꼬리의 길이 및 포화가능성 수준은 간, 폐, 지방 및 심근세포로의 상이한 흡수에 영향을 미칠 것이다. 비타민 또는 상이한 형태의 스테롤과 같은 특수한 소수성 분자의 첨가는 특정한 화합물의 대사에 수반되는 특수한 조직에 대한 분포를 선호할 수 있다. 일부 실시양태에서, 비타민 A 또는 E가 사용된다. 상이한 올리고뉴클레오티드 농도에서 복합체가 형성되며, 농도가 더 높을수록 보다 효율적인 복합체 형성에 유리하다.
또 다른 실시양태에서, 지방 에멀젼은 지질의 혼합물을 기반으로 한다. 이러한 지질은 천연 화합물, 화학적으로 합성된 화합물, 정제된 지방산 또는 임의의 다른 지질을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 지방 에멀젼의 조성물은 전적으로 인공적이다. 특정한 실시양태에서, 지방 에멀젼은 70% 초과의 리놀레산이다. 또 다른 특정한 실시양태에서, 지방 에멀젼은 적어도 1%의 카르디올리핀이다. 리놀레산 (LA)은 불포화 오메가-6 지방산이다. 이는 18-탄소 쇄 및 2개의 시스 이중 결합을 갖는 카르복실산으로 이루어진 무색 액체이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 지방 에멀젼의 조성의 변경은 소수성으로 변형된 폴리뉴클레오티드의 조직 분포를 변경시키기 위한 방식으로서 사용된다. 이러한 방법론은 특정한 조직으로의 폴리뉴클레오티드의 특이적 전달을 제공한다.
또 다른 실시양태에서, 화물 분자의 지방 에멀젼은 70% 초과의 리놀레산 (C18H32O2) 및/또는 카르디올리핀을 함유한다.
인트라리피드와 같은 지방 에멀젼은 이전에 일부 비-수용성 약물 (예컨대, 디프리반(Diprivan)으로서 재-제제화된 프로포폴)을 위한 전달 제제로서 사용된 바 있다. 본 발명의 고유한 특색은, (a) 변형된 폴리뉴클레오티드를 소수성 화합물(들)과 조합하여 지방 미셀에 혼입될 수 있도록 하는 개념 및 (b) 이를 지방 에멀젼과 혼합하여 가역적 담체를 제공하는 것을 포함한다. 혈류로의 주사 후, 미셀은 통상적으로 알부민, HDL, LDL 및 다른 것을 포함한 혈청 단백질에 결합한다. 이러한 결합은 가역적이며, 결국 지방은 세포에 의해 흡수된다. 이어서, 미셀의 일부로서 혼입된 폴리뉴클레오티드는 세포의 표면에 인접하여 전달될 것이다. 그 후, 세포 흡수는 스테롤 유형 전달을 포함하나 이에 제한되지는 않는 가변 메카니즘을 통해 일어날 수 있다.
착화제
착화제는 강력하지만 비공유 인력 (예를 들어, 정전기, 반 데르 발스, 파이-적층 등의 상호작용)에 의해 본 발명의 올리고뉴클레오티드에 결합한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 착화제와 복합체화시켜 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수를 증가시킬 수 있다. 착화제의 예는 양이온성 지질을 포함한다. 양이온성 지질을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달할 수 있다. 그러나, 상기 논의된 것과 같이, 양이온성 지질 무함유 제제가 일부 실시양태에서 바람직하다.
용어 "양이온성 지질"은 극성 및 비극성 도메인 둘 다를 갖는 지질 및 합성 지질을 포함하며, 이는 생리학적 pH 또는 그 근처에서 양으로 하전되는 것이 가능하고, 다가음이온, 예컨대 핵산에 결합하고, 세포에의 핵산의 전달을 용이하게 한다. 일반적으로, 양이온성 지질은 아민, 아미드 또는 그의 유도체의 포화 및 불포화 알킬 및 지환족 에테르 및 에스테르를 포함한다. 양이온성 지질의 직쇄 및 분지형 알킬 및 알케닐 기는 예를 들어 1 내지 약 25개의 탄소 원자를 함유할 수 있다. 바람직한 직쇄 또는 분지형 알킬 또는 알켄 기는 6개 이상의 탄소 원자를 갖는다. 지환족 기는 콜레스테롤 및 다른 스테로이드 기를 포함한다. 양이온성 지질은 예를 들어 Cl-, Br-, I-, F-, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 술페이트, 니트라이트 및 니트레이트를 포함한 다양한 반대이온 (음이온)으로 제조될 수 있다.
양이온성 지질의 예는 폴리에틸렌이민, 폴리아미도아민 (PAMAM) 별형 덴드리머, 리포펙틴 (DOTMA 및 DOPE의 조합물), 리포펙타제, 리포펙타민™ (예를 들어, 리포펙타민™ 2000), DOPE, 시토펙틴 (길리아드 사이언시스(Gilead Sciences), 캘리포니아주 포스터 시티), 및 유펙틴 (JBL, 캘리포니아주 샌 루이스 오비스포)을 포함한다. 예시적인 양이온성 리포솜은 N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA), N-[1-(2,3-디올레올옥시)-프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸술페이트 (DOTAP), 3β-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카르바모일]콜레스테롤 (DC-Chol), 2,3,-디올레일옥시-N-[2(스페르민카르복스아미도)에틸]-N,N-디메틸-1-프로판아미늄 트리플루오로아세테이트 (DOSPA), 1,2-디미리스틸옥시프로필-3-디메틸-히드록시에틸 브로민화암모늄; 및 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDAB)로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 양이온성 지질 N-(1-(2,3-디올레일옥시)프로필)-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드 (DOTMA)는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 안티센스 효과를 1000-배 증가시키는 것으로 발견되었다. (Vlassov et al., 1994, Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108). 또한, 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 폴리 (L-리신) 또는 아비딘과 복합체화될 수 있으며, 지질은 이 혼합물에 포함되거나 (예를 들어, 스테릴-폴리 (L-리신)) 또는 포함되지 않을 수 있다.
양이온성 지질은 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하기 위하여 관련 기술분야에서 사용되어 왔다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,855,910; 5,851,548; 5,830,430; 5,780,053; 5,767,099; 문헌 [Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:3176; Hope et al. 1998. Molecular Membrane Biology 15:1] 참조). 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 흡수를 용이하게 하기 위해 사용될 수 있는 다른 지질 조성물을 청구된 방법과 함께 사용할 수 있다. 상기 열거된 것에 더하여, 다른 지질 조성물이 또한 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 번호 4,235,871; 미국 특허 번호 4,501,728; 4,837,028; 4,737,323에 교시된 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 지질 조성물은 올리고뉴클레오티드의 지질-매개 형질감염을 증진시키기 위한 작용제, 예를 들어 바이러스 단백질을 추가로 포함할 수 있다 (Kamata, et al., 1994. Nucl. Acids. Res. 22:536). 또 다른 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 5,736,392에서 교시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드, 펩티드 및 지질을 포함하는 조성물의 일부로서 세포와 접촉된다. 또한, 혈청 저항성인 개선된 지질이 기재되어 있다 (Lewis, et al., 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. 93:3176). 양이온성 지질 및 다른 착화제는 세포내이입을 통해 세포로 운반되는 올리고뉴클레오티드의 수를 증가시키는 작용을 한다.
또 다른 실시양태에서, N-치환된 글리신 올리고뉴클레오티드 (펩토이드)를 사용하여 올리고뉴클레오티드의 흡수를 최적화시킬 수 있다. 펩토이드는 형질감염을 위한 양이온성 지질-유사 화합물을 생성하는데 사용되어 왔다 (Murphy, et al., 1998. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:1517). 펩토이드는 표준 방법을 사용하여 합성할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Zuckermann, R. N., et al. 1992. J. Am. Chem. Soc. 114:10646; Zuckermann, R. N., et al. 1992. Int. J. Peptide Protein Res. 40:497]). 또한, 양이온성 지질 및 펩토이드의 조합인 립토이드를 사용하여 대상 올리고뉴클레오티드의 흡수를 최적화시킬 수 있다 (Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345). 립토이드는 펩토이드 올리고뉴클레오티드의 정교화 및 아미노 말단 하위단량체와 지질의 그의 아미노 기를 통한 커플링에 의해 합성될 수 있다 (Hunag, et al., 1998. Chemistry and Biology. 5:345).
고도로 활성인 양이온성 지질을 생성하기 위해 양으로 하전된 아미노산을 사용할 수 있다는 것이 관련 기술분야에 공지되어 있다 (Lewis et al. 1996. Proc. Natl. Acad. Sci. US.A. 93:3176). 한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 조성물은 친지성 모이어티에 연결된 수많은 아르기닌, 리신, 히스티딘 또는 오르니틴 잔기를 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,777,153 참조).
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 조성물은 약 1 내지 약 4개의 염기성 잔기를 갖는 펩티드를 포함한다. 이러한 염기성 잔기는 예를 들어 펩티드의 아미노 말단, C-말단, 또는 내부 영역에 위치할 수 있다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 글리신 (비극성으로 간주될 수도 있음), 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 갖는 아미노산 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 염기성 아미노산을 제외하고, 펩티드의 다른 잔기의 대부분 또는 모두는 비-염기성 아미노산, 예를 들어 리신, 아르기닌 또는 히스티딘 이외의 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 긴 중성 측쇄를 갖는 우세한 중성 아미노산이 사용된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 조성물은 1개 이상의 감마 카르복시글루탐산 잔기 또는 γ-Gla 잔기를 갖는 천연 또는 합성 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 감마 카르복시글루탐산 잔기는 폴리펩티드가 서로 및 막 표면에 결합하게 할 수 있다. 다시 말해서, 접촉하게 되는 막에 관계없이 RNAi 구축물이 점착하는 것을 돕는 일반적인 전달 양식으로서 일련의 γ-Gla를 갖는 폴리펩티드가 사용될 수 있다. 이는 적어도 RNAi 구축물이 혈류로부터 소거되는 것을 늦추고, 표적으로 돌아갈 기회를 증진시킬 수 있다.
감마 카르복시글루탐산 잔기는 천연 단백질에 존재할 수 있다 (예를 들어, 프로트롬빈은 10개 γ-Gla 잔기를 가짐). 대안적으로, 이들은 예를 들어 비타민 K-의존성 카르복실라제를 사용한 카르복실화에 의해, 정제되거나 재조합적으로 생성되거나 또는 화학적으로 합성된 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 감마 카르복시글루탐산 잔기는 연속적 또는 비-연속적일 수 있으며, 폴리펩티드에서의 이러한 감마 카르복시글루탐산 잔기의 총 수 및 위치를 조절/미세 조정하여 다양한 수준의 폴리펩티드의 "점착성"을 달성할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 조성물과 접촉되는 세포는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물 및 지질, 예를 들어 상기 기재된 지질 또는 지질 조성물 중 하나를 포함하는 혼합물과 약 12시간 내지 약 24시간 동안 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 조성물과 접촉되는 세포는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물 및 지질, 예를 들어 상기 기재된 지질 또는 지질 조성물 중 하나를 포함하는 혼합물과 약 1 내지 약 5일 동안 접촉된다. 한 실시양태에서, 세포는 지질 및 올리고뉴클레오티드를 포함하는 혼합물과 약 3 내지 약 30일만큼 오래 접촉된다. 또 다른 실시양태에서, 지질을 포함하는 혼합물은 세포와 적어도 약 5 내지 약 20일 동안 접촉된 상태로 놓인다. 또 다른 실시양태에서, 지질을 포함하는 혼합물은 세포와 적어도 약 7 내지 약 15일 동안 접촉된 상태로 놓인다.
예를 들어, 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 조성물은 세포와 본원에 기재된 것과 같은 장기간 인큐베이션 기간 동안 지질, 예컨대 시토펙틴 CS 또는 GSV (글렌 리서치(Glen Research)로부터 입수가능함; 버지니아주 스털링), GS3815, GS2888의 존재 하에 접촉될 수 있다.
한 실시양태에서, 지질 및 올리고뉴클레오티드 조성물을 포함하는 혼합물과의 세포의 인큐베이션은 세포의 생존율을 감소시키지 않는다. 바람직하게는, 형질감염 기간 후에, 세포는 실질적으로 생존가능하다. 한 실시양태에서, 형질감염 후에, 세포는 적어도 약 70% 내지 적어도 약 100% 생존가능하다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 적어도 약 80% 내지 적어도 약 95% 생존가능하다. 또 다른 실시양태에서, 세포는 적어도 약 85% 내지 적어도 약 90% 생존가능하다.
한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는, 올리고뉴클레오티드를 수송하는 펩티드 서열 (본원에서 "수송 펩티드"로 지칭됨)을 세포에 부착시킴으로써 변형된다. 한 실시양태에서, 조성물은 단백질을 코딩하는 표적 핵산 분자에 상보적인 올리고뉴클레오티드 및 공유 부착된 수송 펩티드를 포함한다.
용어 "수송 펩티드"는 세포에의 올리고뉴클레오티드의 수송을 용이하게 하는 아미노산 서열을 포함한다. 세포에 연결되는 모이어티의 수송을 용이하게 하는 예시적인 펩티드는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 HIV TAT 전사 인자, 락토페린, 포진 VP22 단백질 및 섬유모세포 성장 인자 2를 포함한다 (Pooga et al. 1998. Nature Biotechnology. 16:857; 및 Derossi et al. 1998. Trends in Cell Biology. 8:84; Elliott and O'Hare. 1997. Cell 88:223).
올리고뉴클레오티드는 공지된 기술을 사용하여 수송 펩티드에 부착될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Prochiantz, A. 1996. Curr. Opin. Neurobiol. 6:629; Derossi et al. 1998. Trends Cell Biol. 8:84; Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253), Vives et al. 1997. J. Biol. Chem. 272:16010]). 예를 들어, 한 실시양태에서, 활성화된 티올 기를 보유하는 올리고뉴클레오티드는 그 티올 기를 통해 수송 펩티드에 존재하는 시스테인 (예를 들어, 문헌 [Derossi et al. 1998. Trends Cell Biol. 8:84; Prochiantz. 1996. Current Opinion in Neurobiol. 6:629; Allinquant et al. 1995. J Cell Biol. 128:919]에 교시된 바와 같은 안테나페디아 호메오도메인의 제2 및 제3 나선 사이의 β 턴에 존재하는 시스테인)에 연결된다. 또 다른 실시양태에서, Boc-Cys-(Npys)OH 기가 최종 (N-말단) 아미노산으로서 수송 펩티드에 커플링될 수 있고, SH 기를 보유하는 올리고뉴클레오티드가 펩티드에 커플링될 수 있다 (Troy et al. 1996. J. Neurosci. 16:253).
한 실시양태에서, 연결기는 뉴클레오모노머에 부착될 수 있고, 수송 펩티드는 링커에 공유 부착될 수 있다. 한 실시양태에서, 링커는 수송 펩티드에 대한 둘 다의 부착 부위로서 기능할 수 있고, 뉴클라아제에 대한 안정성을 제공할 수 있다. 적합한 링커의 예는 치환 또는 비치환 C1-C20 알킬 쇄, C2-C20 알케닐 쇄, C2-C20 알키닐 쇄, 펩티드 및 헤테로원자 (예를 들어, S, O, NH 등)를 포함한다. 다른 예시적인 링커는 이관능성 가교제, 예컨대 술포숙신이미딜-4-(말레이미도페닐)-부티레이트 (SMPB)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Smith et al. Biochem J 1991.276: 417-2] 참조).
한 실시양태에서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 분자 접합체로서 합성되며, 이는 유전자를 세포로 전달하기 위한 수용체-매개 세포내이입 메카니즘을 사용한다 (예를 들어, 문헌 [Bunnell et al. 1992. Somatic Cell and Molecular Genetics. 18:559] 및 그에 인용된 참고문헌 참조).
표적화제
올리고뉴클레오티드의 전달은 또한 세포 수용체에의 올리고뉴클레오티드의 표적화에 의해 개선될 수 있다. 표적화 모이어티는 올리고뉴클레오티드에 접합되거나 또는 올리고뉴클레오티드에 연결된 담체 기 (즉, 폴리(L-리신) 또는 리포솜)에 부착될 수 있다. 이러한 방법은 특정한 수용체-매개 세포내이입을 나타내는 세포에 잘 적합하다.
예를 들어, 6-포스포만노실화 단백질에 대한 올리고뉴클레오티드 접합체는 유리 올리고뉴클레오티드보다 만노스 6-포스페이트 특이적 수용체를 발현하는 세포에 의해 20-배 더 효율적으로 내재화된다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 생분해성 링커를 사용하여 세포 수용체에 대한 리간드에 커플링될 수 있다. 또 다른 예에서, 전달 구축물은 비오티닐화 올리고뉴클레오티드와 견고한 복합체를 형성하는 만노실화 스트렙타비딘이다. 만노실화 스트렙타비딘은 비오티닐화 올리고뉴클레오티드의 내재화를 20-배 증가시키는 것으로 발견되었다. (Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108).
또한, 특이적 리간드가 폴리리신-기반 전달 시스템의 폴리리신 성분에 접합될 수 있다. 예를 들어, 트랜스페린-폴리리신, 아데노바이러스-폴리리신 및 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 HA-2 N-말단 융합생성 펩티드-폴리리신 접합체는 진핵 세포에서 수용체-매개 DNA 전달을 매우 증진시킨다. 폐포 대식세포에서의 폴리(L-리신)에 접합된 만노실화 당단백질을 사용하여 올리고뉴클레오티드의 세포 흡수를 증진시킨다. 문헌 [Liang et al. 1999. Pharmazie 54:559-566].
악성 세포가 필수 영양소, 예컨대 폴산 및 트랜스페린에 대한 증가된 필요를 갖기 때문에, 이러한 영양소를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 암성 세포에 표적화시킬 수 있다. 예를 들어, 폴산이 폴리(L-리신) 증진된 올리고뉴클레오티드에 연결된 경우에 전골수구성 백혈병 (HL-60) 세포 및 인간 흑색종 (M-14) 세포에서 흡수가 관찰된다. 문헌 [Ginobbi et al. 1997. Anticancer Res. 17:29]. 또 다른 예에서, 말레일화 소 혈청 알부민, 폴산, 또는 제2철 프로토포르피린 IX로 코팅된 리포솜은 뮤린 대식세포, KB 세포 및 2.2.15 인간 간세포암 세포에서 올리고뉴클레오티드의 증진된 세포 흡수를 나타낸다. 문헌 [Liang et al. 1999. Pharmazie 54:559-566].
리포솜은 간, 비장 및 세망내피계에서 자연적으로 축적된다 (소위, 수동 표적화). 다양한 리간드, 예컨대 항체와 리포솜의 커플링에 의한 것은 단백질 A이며, 이는 특정한 세포 집단에 활발히 표적화될 수 있다. 예를 들어, 단백질 A-보유 리포솜을 H-2K 특이적 항체로 사전처리할 수 있으며, 이는 L 세포 상에서 발현된 마우스 주요 조직적합성 복합체-코딩된 H-2K 단백질에 표적화된다. (Vlassov et al. 1994. Biochimica et Biophysica Acta 1197:95-108).
RNAi 시약의 다른 시험관내 및/또는 생체내 전달은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이를 사용하여 대상 RNAi 구축물을 전달할 수 있다. 예를 들어, 몇 가지만 언급하여, 미국 특허 출원 공개 20080152661, 20080112916, 20080107694, 20080038296, 20070231392, 20060240093, 20060178327, 20060008910, 20050265957, 20050064595, 20050042227, 20050037496, 20050026286, 20040162235, 20040072785, 20040063654, 20030157030, WO 2008/036825, WO04/065601, 및 AU2004206255B2를 참조한다 (모두 참조로 포함됨).
치료 적응증
일부 측면에서, 본 개시내용은 질환과 연관된 유전자를 표적화하기 위한 sd-rxRNA의 용도에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 질환과 연관된 유전자는 매트릭스 메탈로프로테이나제를 코딩한다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 메탈로프로테이나제는 매트릭스 메탈로프로테이나제 1 (MMP1)이다. MMP1을 표적화하는 sd-rxRNA에 의해 치료될 수 있는 질환의 비제한적 예는 피부 장애, 관절염 (골 및 류마티스), 여드름 반흔형성, 만성 궤양 (정맥 궤양), 괴저 (비브리오 및 클로스트리디움), 각막 미란, 치주염, 수포성 피부 장애 (예를 들어, 스티븐스-존슨 등), 피부 광 노화 (광 손상 포함), 자궁내막암 및 자궁내막증을 포함한다.
일부 실시양태에서, MMP를 표적화하는 sd-rxRNA는 골관절염을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다. 골관절염 (퇴행성 관절염 또는 퇴행성 관절 질환으로도 공지됨), 만성 상태는 관절 내 연골이 시간의 경과에 따라 마멸되는 경우에 발생하고, 이는 관절의 통증 및 잠재적으로 감소된 이동성을 발생시킨다. 골관절염은 미국에서 2천5백만명 초과의 사람에게 영향을 미치고, 관절염의 가장 흔한 형태이다. (문헌 [Iannone F1, Lapadula G., Aging Clin Exp Res. 2003 Oct;15(5):364-72], 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, MMP1을 표적화하는 sd-rxRNA는 류마티스 관절염을 치료하는데 사용될 수 있다. 류마티스 관절염은 소관절의 만성 염증을 야기하는 자가면역 장애이다. 류마티스 관절염은 미국에서 1백만명 초과의 사람에게 영향을 미친다.
일부 실시양태에서, MMP를 표적화하는 sd-rxRNA는 여드름 반흔형성을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다. 여드름은 청소년들 사이에서 고도로 보편적이고, 일부 경우에 여드름 병변은 반흔형성 (위축성 또는 비대성)을 야기할 수 있다. 병변의 치유는 3 단계로 일어나고, 마지막은 ECM의 재형성이다. MMP는 이 단계에서 요구되고, 상처 치유의 이 단계에서의 MMP의 과다발현은 반흔형성을 발생시킬 수 있다. (문헌 [Fabbrocini, Annunziata, Monfrecola, Dermatology Research and Practice Volume 2010 (2010), Article ID 893080], 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, MMP를 표적화하는 sd-rxRNA는 만성 궤양을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다. 정맥 궤양 (정체 궤양, 정맥류성 궤양 또는 하퇴 궤양)은 미국 인구의 ~ 1%에게 영향을 미치고, 하지 궤양의 가장 흔한 형태이다. 정맥 부전증 및 정맥 고혈압은 궤양 형성의 1차 메카니즘인 것으로 여겨진다. 특정 실시양태에서, sd-rxRNA는 만성 정맥 궤양을 치료하는데 사용된다. (문헌 [Collins L and Seraj S, Am Fam Physician. 2010 Apr 15;81(8):989-996], 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, MMP를 표적화하는 sd-rxRNA는 괴저를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다. 상당한 조직의 괴사인 괴저는 외상, 혈관 장애 또는 감염 (비브리오 또는 클로스트리디움)으로 인한 이환 조직으로의 감소된 혈류에 의해 유발된다. 콜라게나제는 가스 괴저의 확산에 있어서 공지된 병독성 인자이다.
일부 실시양태에서, MMP를 표적화하는 sd-rxRNA는 각막 미란을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다. 각막 미란 또는 재발성 각막 미란은 각막의 외부 층, 상피가 보우만층, 기저막으로부터 탈착된 경우에 일어나며, 이는 각막 신경의 노출을 발생시킨다. 각막 미란은 외상 또는 각막 장애에 의해 유발될 수 있다. 콜라게나제는 각막 미란을 앓고 있는 환자에서 상향-조절되는 것으로 밝혀진 바 있다. (문헌 [Ramamurthi, S, Rahman, MQ, Dutton, GN and Ramaesh K, Eye (2006) 20, 635-644]; 2005년 7월 15일 온라인에서 공개됨, 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, MMP를 표적화하는 sd-rxRNA는 치주염을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다. 치주염 (농루)은 잇몸의 감염으로 인해 유발되고, 만성 염증 질환을 야기하며, 치료하지 않고 두면 치아를 지지하는 골의 손실을 발생시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, MMP를 표적화하는 sd-rxRNA는 수포성 피부 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다. 수포성 피부 장애의 비제한적 예는 스티븐스-존슨 증후군 및 독성 표피 괴사용해를 포함한다. 스티븐 존슨 증후군 및 독성 표피 괴사용해에서, 표피 (피부의 외부 층)는 약물에 대한 반응 또는 박테리아 감염으로 인해 진피로부터 탈착된다.
일부 실시양태에서, MMP를 표적화하는 sd-rxRNA는 피부 광노화를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다. 피부의 광노화는 진피 내 콜라겐 피브릴을 손상시키는 자외선 A (UVA)에의 반복적 노출에 의해 발생한다. 이러한 손상은 영향을 받은 피부의 부적절한 복구를 야기하여 주름 및/또는 가죽같은 피부를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, MMP를 표적화하는 sd-rxRNA는 자궁내막암을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다. 자궁내막암은 자궁의 자궁내막 (자궁의 내부 내층)에서 기원한다. MMP1은 자궁내막암에서 상향-조절되는 것으로 밝혀졌고, 이는 암종의 발생 및/또는 발병기전에서 역할을 한다는 것을 시사하였다. (문헌 [Nishioka et al., Cancer Science, June 2000, Volume 91, Issue 6, pages 612-615], 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, MMP를 표적화하는 sd-rxRNA는 자궁내막증을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다. 자궁내막증은 자궁내막 (자궁의 내부 내층)이 자궁 외부로 성장하는 상태이다. MMP1은 자궁내막 병변에서 상향-조절되는 것으로 밝혀졌고, 이는 상기 단백질이 자궁내막증의 발병기전에 수반된다는 것을 시사한다. (문헌 [Lass et al., Hum. Reprod., June 2005, 20(6): 1695-1701], 본원에 참조로 포함됨).
일부 실시양태에서, MMP를 표적화하는 sd-rxRNA는 결핵을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 MMP1을 표적화한다. 결핵은 미코박테리아 (가장 통상적으로 미코박테리움 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis))에 의해 유발되는 감염성 질환으로, 이는 조직, 가장 통상적으로는 폐의 파괴를 발생시킨다 (폐결핵). 전세계 인구의 1/3 초과가 결핵에 감염된 바 있는 것으로 여겨진다. (문헌 [Dye et al. Science., 2010;328(5980):856-861], 본원에 참조로 포함됨.) 콜라게나제는 결핵에 걸린 환자에서 상향조절되는 것으로 제시된 바 있다. (Elkington et al., Volume 121, Issue 5 (May 2, 2011) J Clin Invest. 2011;121(5):1827-1833. doi:10.1172/JCI45666.)
일부 실시양태에서, 질환과 연관된 유전자는 티로시나제 (TYR)를 코딩한다. TYR을 표적화하는 sd-rxRNA를 사용하여 치료될 수 있는 질환의 비제한적 예는 피부 색소침착 장애 (예를 들어, 멜라닌과다증, 염증후 과다색소침착, 기미, 일광 흑색점), 주근깨 및 흑색점 (다발성 흑색점 증후군), 색소성 망막염, 애디슨병, 신경모세포종, 교모세포종, 파킨슨병 및 켈로이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, TYR을 표적화하는 sd-rxRNA는 피부 과다색소침착을 치료하는데 사용될 수 있다. 과다색소침착, 피부 영역의 흑화는 증가된 멜라닌 수준, 변경된 멜라닌세포 밀도, 또는 둘 다로 인해 발생한다. 티로시나제는 멜라닌 생합성 경로의 속도 제한 단계를 촉매하는 것을 담당하는 효소이다. 특정 실시양태에서, sd-rxRNA는 피부 과다색소침착을 치료하는데 사용된다. 일부 실시양태에서 sd-rxRNA는 TYR을 표적화한다. 일부 실시양태에서, TYR을 표적화하는 sd-rxRNA는 멜라닌과다증을 치료하는데 사용될 수 있다. 멜라닌과다증은 멜라닌의 증가된 수준과 연관된 피부의 흑화이다.
일부 실시양태에서, TYR을 표적화하는 sd-rxRNA는 염증성 과다색소침착을 치료하는데 사용될 수 있다. 피부의 염증성 과다색소침착은 염증 또는 피부 손상의 발생 후에 야기될 수 있다. 피부의 염증 또는 손상은 멜라닌세포를 발생시켜 멜라닌의 생산을 증가시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, TYR을 표적화하는 sd-rxRNA는 기미를 치료하는데 사용될 수 있다. 기미 (임신한 여성에서 간반으로도 지칭됨)는 전세계 수백만의 사람에게 영향을 미치고 그 중 90%는 여성인, 과다색소침착의 후천성 형태이다. 기미의 원인은 자외선 노출, 임신, 호르몬 대체 요법 및 산아 제한 환제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 기미의 발병기전은 공지되어 있지 않지만, 활성 멜라닌세포의 증가가 존재한다는 것이 가설화된다. (문헌 [Vashi, NA, British Journal of Dermatology, 2013, 169, 41-56], 본원에 참조로 포함됨). 특정 실시양태에서, sd-rxRNA는 기미를 치료하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 티로시나제를 표적화한다.
일부 실시양태에서, TYR을 표적화하는 sd-rxRNA는 일광 흑색점을 치료하는데 사용될 수 있다. 일광-유발 주근깨로도 공지되어 있는 일광 흑색점은 일광 및/또는 자외선에의 반복적 노출에 의해 유발되는 과다색소침착된 병변이다. 반복적 노출은 돌연변이를 유발하여, 이는 영향을 받은 영역에서 멜라닌 생산의 증가를 발생시킨다.
일부 실시양태에서, TYR을 표적화하는 sd-rxRNA는 색소성 망막염을 치료하는데 사용될 수 있다. 색소성 망막염은 여러 공지된 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발된 유전성 망막 변성 질환이다. 특정 실시양태에서, sd-rxRNA는 색소성 망막염을 치료하는데 사용된다. (문헌 [Hartong, Lancet 2006, 368, 1795], 본원에 참조로 포함됨). 일부 실시양태에서, sd-rxRNA는 TYR을 표적화한다.
일부 실시양태에서, TYR을 표적화하는 sd-rxRNA는 애디슨병을 치료하는데 사용될 수 있다. 애디슨병 (만성 부신 기능부전, 저코르티솔증 및 부신저하증으로도 공지됨)은 글루코코르티코이드, 안드로겐 및 알도스테론의 감소된 수준을 발생시키는 만성 내분비 장애이다. 스테로이드의 수준에서의 감소는 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 및 멜라닌세포 자극 호르몬 (MSH)의 수준에서의 증가를 발생시키고, 이는 멜라닌세포의 활성화 및 멜라닌의 생산을 발생시킨다.
일부 실시양태에서, TYR을 표적화하는 sd-rxRNA는 파킨슨병을 치료하는데 사용될 수 있다. 파킨슨병은 뇌의 영역으로부터 뉴런의 점진적인 손실을 발생시키는 신경변성 질환이다.
일부 실시양태에서, TYR을 표적화하는 sd-rxRNA는 켈로이드를 치료하는데 사용될 수 있다. 켈로이드는 원래의 피부 손상을 넘어 확장된 반흔이다. 켈로이드는 퇴행되지 않는 특히 공격적인 피부 반흔의 형태이다. 켈로이드 반흔은 부풀어오르고, 불규칙 형상이고, 색상이 분홍 내지 암적색이고, 원래의 상처의 경계를 넘어 특징적으로 확장된다. 켈로이드는 통상적으로 압통 또는 통증성이고, 매우 가려울 수 있다. 켈로이드가 보다 진한 피부색의 개체에서 보다 보편적이고 종종 가족성이지만, 켈로이드는 모든 피부 유형의 사람에게서 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, TYR을 표적화하는 sd-rxRNA는 신경모세포종을 치료하는데 사용될 수 있다. 영아에서 가장 흔한 두개외 고형 종양인 신경모세포종 종양은 교감 신경계의 신경모세포에서 기원한다. 가족성 신경모세포종은 여러 공지된 유전자에서의 돌연변이에 의해 유발된다. 일부 실시양태에서, TYR을 표적화하는 sd-rxRNA는 교모세포종을 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, TYR과 연관된 질환은 신생물이다. 일부 경우에, sd-rxRNA는 신생물 또는 신생물성 조직에 대해 표적화되고, 신생물과 연관된 상태 또는 장애의 적어도 1종의 증상을 완화시키는데 사용된다. 신생물은 세포의 비정상적 증식을 지칭하고, 종종 조직의 비정상적 덩이 (즉, 신생물)를 발생시킨다. 신생물은 양성, 전암성 (예를 들어, 계내 암종), 또는 악성 (암성)일 수 있다. 양성 신생물은 암으로 변형되지 않은 자궁 유섬유종 및 멜라닌세포 모반 (즉, 피부 점)을 포함한다. 잠재적으로 악성 또는 전암성 신생물은, 주위 조직을 침습하지는 않지만 오히려 그의 정상 환경에서 증식하는 암종의 초기 형태인 계내 암종을 포함한다. 악성 신생물은 통상적으로 암으로 지칭되고, 이들은 주위 조직을 침습하여 파괴시키고, 전이를 형성할 수 있고, 마침내는 숙주에 치명적일 수 있다.
일부 경우에, sd-rxRNA는 상피 기원의 신생물 또는 신생물성 세포에 대해 표적화된다. 상피 세포는 내피와 이어진 혈관, 림프관, 및 심장 내부 및 중피와 이어진 흉부 및 복강을 제외하고, 신체의 전체 표면을 덮고 신체의 대부분의 중공 구조와 이어진 1개 이상의 층 내에 존재한다.
상피 신생물은 양성 및 전암성 상피 종양, 예컨대 유방 섬유선종 및 결장 선종, 및 악성 상피 종양을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 악성 상피 종양은 암종으로도 지칭되는 원발성 종양, 및 상피 기원의 전이로도 지칭되는 속발성 종양을 포함한다. 암종은 선방 암종, 선방상 암종, 폐포 선암종 (선낭 암종, 선근상피종, 사상 암종 및 원주종으로도 불림), 암종 선종증, 선암종, 부신 피질의 암종, 폐포 암종, 폐포 세포 암종 (세기관지 암종, 폐포 세포 종양 및 폐 선종증으로도 불림), 기저 세포 암종, 기저세포성 암종 (기저암, 또는 기저세포암, 및 모기질 암종으로도 불림), 기저세포양 암종, 기저편평세포 암종, 유방 암종, 기관지폐포 암종, 세기관지 암종, 기관지원성 암종, 대뇌양 암종, 담관세포 암종 (담관종 및 담관암종으로도 불림), 융모막 암종, 콜로이드 암종, 면포 암종, 자궁체부 암종, 사상 암종, 흉갑 암종, 피부 암종, 원통 암종, 원통 세포 암종, 관 암종, 경성 암종, 배아성 암종, 뇌양 암종, 안구외 암종, 표피양 암종, 상피 선양 암종, 궤양성 암종, 섬유성 암종, 젤라틴양 암종, 젤라틴성 암종, 거대 세포 암종, 거대세포성, 선상 암종, 과립막 세포 암종, 모기질 암종, 혈액양 암종, 간세포성 암종 (간세포암, 악성 간세포암 및 간암종으로도 불림), 휘르틀레 세포 암종, 유리질 암종, 부신양 암종, 영아 배아성 암종, 계내 암종, 표피내 암종, 상피내 암종, 크롬페허 암종, 쿨치스키-세포 암종, 렌즈세포 암종, 렌즈세포성 암종, 지방종성 암종, 림프상피 암종, 유선염성 암종, 수질성 암종, 수질 암종, 흑색증 암종, 멜라닌 암종, 점액성 암종, 점액 암종, 점액세포 암종, 점액표피양 암종, 점막 암종, 점액 암종, 점액종성 암종, 비인두 암종, 흑색 암종, 귀리 세포 암종, 골화성 암종, 유골 암종, 난소 암종, 유두상 암종, 문맥주위 암종, 침습전 암종, 전립선 암종, 신장의 신세포 암종 (신장의 선암종 및 부신양 암종으로도 불림), 예비 세포 암종, 육종양 암종, 육유양 암종, 경암종, 음낭 암종, 인환 세포 암종, 단순 암종, 소세포 암종, 감자양 암종, 타원 세포 암종, 방추 세포 암종, 해면체 암종, 편평 암종, 편평 세포 암종, 스트링 암종, 모세혈관확장 암종, 모세혈관확장성 암종, 이행 세포 암종, 결절 암종, 결절성 암종, 사마귀양 암종, 빌로숨 암종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 경우에, sd-rxRNA는 중간엽 기원의 신생물 또는 신생물성 세포, 예를 들어 육종을 형성하는 신생물성 세포에 대해 표적화된다. 육종은 골 및 연부 조직에서 발생하는 드문 중간엽 신생물이다. 지방육종 (점액양 지방육종 및 다형성 지방육종 포함), 평활근육종, 횡문근육종, 악성 말초 신경초 종양 (악성 슈반세포종, 신경섬유육종 또는 신경원성 육종으로도 불림), 유잉 종양 (골의 유잉 육종, 골외 [비-골] 유잉 육종 및 원시 신경외배엽 종양 [PNET] 포함), 활막 육종, 맥관육종, 혈관육종, 림프관육종, 카포시 육종, 혈관내피종, 섬유육종, 데스모이드 종양 (공격성 섬유종증으로도 불림), 융기성 피부섬유육종 (DFSP), 악성 섬유성 조직구종 (MFH), 혈관주위세포종, 악성 중간엽종, 폐포 연부 육종, 상피양 육종, 투명 세포 육종, 결합조직형성 소세포 종양, 위장 기질 종양 (GIST) (GI 기질 육종으로도 공지됨), 골육종 (골원성 육종으로도 공지됨)-골격 및 골격외, 및 연골육종을 포함한 상이한 유형의 육종이 인식되어 있다.
또 다른 경우에, sd-rxRNA는 멜라닌세포 기원의 신생물 또는 신생물성 세포를 표적화한다. 흑색종은 피부 및 다른 기관의 멜라닌세포계로부터 발생한 종양이다. 흑색종의 예는 악성 흑자 흑색증, 표재 확산성 흑색종, 결절성 흑색종 및 말단 흑자 흑색종을 포함한다.
또 다른 경우에, sd-rxRNA는 담도암, 자궁내막암, 식도암, 위암, 상피내 신생물, 예컨대 보웬병 및 파제트병, 간암, 구강암, 예컨대 편평 세포 암종, 육종, 예컨대 섬유육종 및 골육종, 피부암, 예컨대 흑색종, 카포시 육종, 고환암, 예컨대 배세포 종양 (정상피종, 비-정상피종 (기형종, 융모막암종)), 기질 종양 및 배 세포 종양, 갑상선암, 예컨대 갑상선 선암종 및 수질성 암종, 및 신암, 예컨대 선암종 및 윌름스 종양에서 발견되는 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 악성 신생물 또는 신생물성 세포를 표적화한다.
다른 경우에, sd-rxRNA는 골, 근육 또는 결합 조직에서 기원한 신생물 또는 신생물성 세포를 표적화한다. 신생물성 세포는 골 및 결합 조직의 원발성 종양 (예를 들면, 육종)에서 발견될 수 있다.
일부 경우에, sd-rxRNA는, 예를 들어 바늘 및 시린지를 사용한 주사에 의해 신생물에 직접 전달된다. 신생물 내로의 주사는 전신 부위에의 전달은 최소화하면서 대량의 sd-rxRNA가 표적 세포에 직접 전달되게 한다. 신생물 내로의 직접 주사에 의해, sd-rxRNA에 의한 RNA 간섭을 촉진하기 위한 유효량은 적어도 상당한 부피의 신생물 전반에 분포된다. 일부 경우에, sd-rxRNA의 전달은 신생물 내로의 단일 주사를 필요로 한다. 다른 경우에, sd-rxRNA의 전달은 신생물의 전체 덩이에 sd-rxRNA에 의한 RNA 간섭을 촉진하기 위한 유효량이 투입되도록 신생물의 개별 영역 내로의 다중 주사를 필요로 한다. 미국 특허 번호 5,162,115 및 5,051,257, 및 문헌 [Livraghi et al., Tumori 72 (1986), pp. 81-87]을 참조하고, 이들 각각은 본원에 참조로 포함된다.
전달되는 sd-rxRNA의 총 용량, 농도, 부피, 및 전달 속도는 주어진 신생물 유형, 크기 및 아키텍처에 대해 최적화될 수 있다. RNA 간섭의 구역은 이들 파라미터를 최적화함으로써 제어될 수 있다. 신생물 내로 전달되는 sd-rxRNA의 부피 및 농도는 종양 전반에 걸쳐 RNA 간섭을 촉진하기에 충분해야한다. 주사 횟수 및 신생물 아키텍처에 관한 그의 배치에 따라, 신생물 부피보다 작거나, 신생물 부피보다 크거나, 또는 신생물 부피와 대략 동등한 총 sd-rxRNA 부피를 투여하는 것이 유용할 수 있다.
일부 경우에, sd-rxRNA는 이식형 장치를 사용하여 신생물에 직접 전달된다.
일부 경우에 신생물 내로의 sd-rxRNA 주사는 초음파 유도에 동반될 수 있다.
다른 경우에, sd-rxRNA는 전신으로, 예를 들어 정맥내로, 동맥내로, 근육내로 또는 피하로 투여된다.
일부 실시양태에서, 신생물에 대해 표적화된 sd-rxRNA는 증식성 유전자, 또는 다른 조직에서보다 신생물성 조직에서 더 높은 수준으로 발현되는 유전자를 표적화한다. 본원에 언급된 "증식성 유전자"는 세포의 증가된 성장 또는 복제 속도를 직접적으로 또는 간접적으로 촉진하여 신생물 또는 신생물성 세포의 형성을 발생시키는 임의의 유전자일 수 있다. 증식성 유전자의 발현/기능으로부터 발생한 증가된 성장 또는 복제 속도는 유사한 기관의 비-신생물성 조직의 성장 또는 복제 속도와 관련된다 (예를 들어, 피부의 신생물 v. 비-신생물성 피부). 증식성 유전자, 또는 다른 조직에서보다 신생물성 조직에서 더 높은 수준으로 발현되는 유전자의 여러 비제한적 예는 VEGF/VEGFR, HER2, PDGF/PDGFR, HDAC, MET, c-kit, CDK, FLT-1, IGF/IGFR, FGF/FGFR, Ras/Raf, Abl, Bcl-2, Src, mTOR, PKC, MAPK, BIRC5, FAS, HIF1A, CDH16, MYC, HRAS, 및 CTNNB1을 포함한다.
혈관 내피 성장 인자 (VEGF)는 PDGF/VEGF 성장 인자 패밀리의 구성원이고, 종종 디술피드 연결된 동종이량체로서 발견되는 단백질을 코딩한다. 이러한 단백질은, 특히 내피 세포에 대해 작용하고, 증가된 혈관 투과성 매개, 혈관신생, 혈관생성 및 내피 세포 성장 유도, 세포 이동 촉진, 및 아폽토시스 억제를 포함한 다양한 효과를 갖는 글리코실화 미토겐이다. 이러한 단백질의 상승된 수준은 크로우-푸카세 증후군으로도 공지된 POEMS 증후군과 연관된다. 이러한 유전자에서의 돌연변이는 증식성 및 비증식성 당뇨병성 망막병증과 연관되어 왔다. 대안적으로, 자유 분비 또는 세포-회합 이소형을 코딩하는 스플라이싱된 전사체 변이체가 특징화된 바 있고, 이는 본 발명의 sd-rxRNA에 의해 표적화될 수 있다. 또한, 제1 AUG의 상류이고 이와 인-프레임인 비-AUG (CUG) 번역 출발 부위의 사용에 대한 증거가 존재하며, 이는 추가의 이소형을 발생시킨다. 인간 VEGFA의 전사체 변이체의 대표적인 예는 진뱅크(Genbank) 수탁 번호 NM_001025366.2이다. 그의 상응하는 단백질은 진뱅크 수탁 번호 NP_001020537.2이다.
혈소판-유래 성장 인자 (PDGFA/PDGFB)는 혈소판-유래 성장 인자 패밀리의 구성원이다. 이러한 패밀리의 4종의 구성원은 중간엽 기원의 세포에 대한 유사분열촉진 인자이고, 8개의 시스테인 모티프를 특징으로 한다. PDGF 유전자 산물은 동종이량체로서 또는 혈소판-유래 성장 인자 베타 폴리펩티드와의 이종이량체로서 존재할 수 있으며, 여기서 이량체는 디술피드 결합에 의해 연결된다. 녹아웃 마우스를 사용한 연구는 핍지교세포, 폐포 평활근 세포 및 고환 내 라이디히 세포에서 세포 결함을 제시한 바 있고; 녹아웃 마우스는 배로서 또는 출생 직후에 사망한다. PDGF에 대해 2종의 스플라이스 변이체가 확인된 바 있고, 이는 본 발명의 sd-rxRNA에 의해 표적화될 수 있다. 인간 PDGF 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_002607.5 및 NM_011057.3이다. 그의 상응하는 단백질은 각각 진뱅크 수탁 번호 NP_002598.4 및 NP_03187.2이다. PDGF는 그의 수용체, PDGFR에 결합한다. 인간 PDGFR 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_006206.4이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_006197.1이다.
인간 표피 성장 인자 2 (HER2, 또한 HER-2, NEU, NGL, TKR1, CD340, MLN 19, 및 ERBB2로도 지칭됨)는 수용체 티로신 키나제의 표피 성장 인자 (EGF) 수용체 패밀리의 구성원을 코딩한다. 이 단백질은 그 자신의 어떠한 리간드 결합 도메인도 갖지 않고, 따라서 성장 인자에 결합할 수 없다. 그러나, 이는 다른 리간드-결합된 EGF 수용체 패밀리 구성원에 밀착 결합하여 이종이량체를 형성하여, 리간드 결합을 안정화시키고, 미토겐-활성화된 단백질 키나제 및 포스파티딜이노시톨-3 키나제를 수반하는 것과 같은 하류 신호전달 경로의 키나제-매개 활성화를 증진시킨다. 이소형 a의 아미노산 위치 654 및 655 (이소형 b의 위치 624 및 625)에서의 대립유전자 변이가 보고된 바 있고, 가장 통상의 대립유전자는 Ile654/Ile655이다. 이러한 유전자의 증폭 및/또는 과다발현이 유방 및 난소 종양을 포함한 수많은 암에서 보고된 바 있다. 대안적 스플라이싱은 여러 추가의 전사체 변이체를 발생시키고, 일부는 상이한 이소형을 코딩한다. 각각의 전사체 변이체는 본 발명의 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. HER2의 전사체 변이체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_004448.2이다. 그의 상응하는 단백질은 진뱅크 수탁 번호 NP_004439.2이다.
히스톤 데아세틸라제 1 (HDAC1)은 히스톤 데아세틸라제/acuc/알파 패밀리에 속하고, 히스톤 데아세틸라제 복합체의 성분이다. 이는 망막모세포종 종양-억제 단백질과 상호작용하고, 이러한 복합체는 세포 증식 및 분화의 제어에서 핵심 요소이다. 전이-연관 단백질-2와 함께, 이는 p53을 탈아세틸화하고, 세포 성장 및 아폽토시스에 대한 그의 효과를 조정한다. 일부 경우에, sd-rxRNA는 HDAC1, 망막모세포종 종양-억제 단백질, 및/또는 전이-연관 단백질-2를 표적화할 수 있다. 다른 경우에, sd-rxRNA는 p53을 표적화할 수 있다. 인간 HDAC1 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_004964.2이고, 그의 상응하는 단백질은 진뱅크 수탁 번호 NP_004955.2이다.
Met 원종양유전자 (MET)는 간세포 성장 인자 수용체이고, 티로신-키나제 활성을 코딩한다. 1차 단일 쇄 전구체 단백질은 번역-후 절단되어 알파 및 베타 서브유닛을 생산하고, 이는 디술피드 연결되어 성숙 수용체를 형성한다. MET 유전자에서의 다양한 돌연변이는 유두상 신세포 암종과 연관된다. 상이한 이소형을 코딩하는 2종의 전사체 변이체가 이 유전자에 대해 발견된 바 있고, 이들 각각은 sd-rxRNA에 의해 표적화될 수 있다. 인간 MET 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_000245.2이고, 그의 상응하는 단백질은 진뱅크 수탁 번호 NP_000236.2이다.
V-kit 하디-주커만 4 고양이 육종 바이러스 종양유전자 (KIT, 또한 PBT, SCFR, C-Kit, 또는 CD117로도 지칭됨)는 원종양유전자 c-kit의 인간 상동체를 코딩한다. C-kit는 고양이 육종 바이러스 종양유전자 v-kit의 세포 상동체로서 최초로 확인되었다. 이러한 단백질은 MGF (비만 세포 성장 인자, 또한 줄기 세포 인자로도 공지됨)에 대한 유형 3 막횡단 수용체이다. 이러한 유전자에서의 돌연변이는 위장 기질 종양, 비만 세포 질환, 급성 골수 백혈병, 및 부분백피증과 연관된다. 상이한 이소형을 코딩하는 다중 전사체 변이체가 이 유전자에 대해 발견된 바 있고, 이들 각각은 sd-rxRNA에 의해 표적화될 수 있다. 인간 KIT 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_000222.2이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_000213.1이다.
시클린-의존성 키나제 (CDK)는 진핵 세포의 세포 주기 제어에서 본질적인 역할을 하고, 인산화되어 CDK-활성화 키나제 (CAK)에 의해 활성화된다. CAK는 CDK7 (MIM 601955), 시클린 H (CCNH; MIM 601953), 및 MAT1을 포함하는 멀티서브유닛 단백질이다. MAT1 ('메나제 아 트로아-1'의 경우)은 CAK 복합체의 어셈블리에 수반된다. 인간 CDK 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_001177963.1이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_001171434.1이다.
Fms-관련 티로신 키나제 1 (FLT-1, 또한 FLT, VEGFR1, FLT1로도 지칭됨)은 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR) 패밀리의 구성원을 코딩한다. VEGFR 패밀리 구성원은 7개의 이뮤노글로불린 (Ig)-유사 도메인을 갖는 세포외 리간드-결합 영역, 막횡단 절편, 및 세포질 도메인 내의 티로신 키나제 (TK) 도메인을 함유하는 수용체 티로신 키나제 (RTK)이다. 이 단백질은 VEGFR-A, VEGFR-B 및 태반 성장 인자에 결합하고, 혈관신생 및 혈관생성에서 중요한 역할을 한다. 이러한 수용체의 발현은 혈관 내피 세포, 태반 영양막 세포, 및 말초 혈액 단핵구에서 발견된다. 상이한 이소형을 코딩하는 다중 전사체 변이체가 이 유전자에 대해 발견된 바 있다. 이소형은 전장 막횡단 수용체 이소형 및 단축된 가용성 이소형을 포함한다. 가용성 이소형은 전자간증의 발병과 연관된다. FLT-1의 각각의 전사체 변이체는 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 FLT-1 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_001159920.1이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_00115392.1이다.
인슐린-유사 성장 인자 (IGF)는 인슐린과 기능 및 구조면에서 유사하고, 성장 및 발생을 매개하는데 수반되는 단백질의 패밀리의 구성원이다. 예를 들어 IGFI 단백질은 전구체로부터 프로세싱되고, 특정 수용체에 의해 결합되고, 분비된다. 이러한 유전자에서의 결함은 인슐린-유사 성장 인자 I 결핍의 원인이다. 상이한 이소형을 코딩하는 여러 전사체 변이체가 이들 유전자에 대해 발견된 바 있고, 이들 각각은 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 IGF 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_000618.3이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_000609.1이다.
섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리 구성원은 광범위한 유사분열촉진 및 세포 생존 활성을 보유하고, 배아 발생, 세포 성장, 형태발생, 조직 복구, 종양 성장, 및 침습을 포함한 다양한 생물학적 과정에 수반된다. 예를 들어 FGF1은 내피 세포 이동 및 증식의 조절자로서 뿐만 아니라 혈관신생 인자로서 기능한다. 이는 시험관내에서 다양한 중배엽- 및 신경외배엽-유래 세포에 대해 미토겐으로서 역할을 하고, 따라서 기관발생에 수반되는 것으로 생각된다. 여러 FGF의 별개의 이소형을 코딩하는 대안적으로 스플라이싱된 전사체 변이체가 보고된 바 있고, 이들 각각은 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 FGF1 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_000800.3이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_000791.1이다.
구성원들 사이에서 및 진화에 걸쳐 고도로 보존된 아미노산 서열을 갖는 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGFR) 패밀리 구성원은 그의 리간드 친화도 및 조직 분포에서 서로 상이하다. 전장 대표적인 단백질은 3개의 이뮤노글로불린-유사 도메인으로 구성된 세포외 영역, 단일 소수성 막-관통 절편 및 세포질 티로신 키나제 도메인으로 이루어진다. 단백질의 세포외 부분은 섬유모세포 성장 인자와 상호작용하여, 하류 신호의 캐스케이드를 시행시켜, 궁극적으로는 유사분열촉진 및 분화에 영향을 미친다. 예를 들어 FGFR1은 산성 및 염기성 섬유모세포 성장 인자 둘 다에 결합하고, 사지 유도에 수반된다. 이러한 유전자에서의 돌연변이는 파이퍼 증후군, 잭슨-바이스 증후군, 앤틀리-빅슬러 증후군, 골공동성 이형성증, 및 상염색체 우성 칼만 증후군 2와 연관되어 왔다. FGFR1을 수반하는 염색체 이상은 줄기 세포 골수증식성 장애 및 줄기 세포 백혈병 림프종 증후군과 연관된다. FGFR1 패밀리 구성원의 상이한 단백질 이소형을 코딩하는 대안적으로 스플라이싱된 변이체가 기재되어 있고, 이들 각각은 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 FGFR1의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_001174063.1이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_001167534.1이다.
Ras 서브패밀리 (래트 육종(RAt Sarcoma)의 약어)는 세포 신호 전달에 수반되는 작은 GTPase의 단백질 서브패밀리이고, 또한 그러한 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 서브패밀리를 지정하는데 사용된다. Ras 신호전달의 활성화는 세포 성장, 분화 및 생존을 일으킨다. Ras는 모두 구조면에서 관련되고 다양한 세포 행동을 조절하는 단백질의 Ras 슈퍼패밀리의 원형 구성원이다. Ras는 세포의 외부로부터 핵으로 신호를 소통하기 때문에, ras 유전자에서의 돌연변이는 세포외 신호의 부재 하에서도 이를 영구적으로 활성화시킬 수 있고, 세포 내에서 부적절한 전송을 유발할 수 있다. 이들 신호는 세포 성장 및 분열을 발생시키기 때문에, 조절이상 Ras 신호전달은 궁극적으로 종양발생 및 암으로 이어질 수 있다. Ras에서의 활성화 돌연변이는 모든 인간 종양의 20-25%에서, 및 특정 종양 유형에서는 최대 90% 발견된다.
포유동물 ras 유전자 패밀리로부터의 KRAS, 키르스텐 ras 종양유전자 상동체는 작은 GTPase 슈퍼패밀리의 구성원인 단백질을 코딩한다. 단일 아미노산 치환은 활성화 돌연변이의 원인이 된다. 그 결과 형질전환 단백질은 폐 선암종, 점액성 선종, 췌장의 관 암종 및 결장직장 암종을 포함한 다양한 악성종양에 연루된다. 대안적 스플라이싱은 C-말단 영역에서 상이한 2종의 이소형을 코딩하는 변이체를 발생시킨다. 각각의 KRAS 유전자 변이체는 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 KRAS 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_004985.3이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_04976.2이다.
포유동물 ras 유전자 패밀리로부터의 HRAS, v-HA-ras 하비 래트 육종 바이러스 종양유전자 상동체는 탈- 및 재-팔미토일화의 연속 주기를 거치는 단백질을 코딩하며, 이는 형질 막과 골지체 사이에서 그의 신속한 교환을 조절한다. 이러한 유전자에서의 돌연변이는 출생전 단계에서 증가된 속도, 출생후 단계에서의 성장 결핍, 종양 형성에 대한 소인, 정신 지체, 피부 및 근골격 이상, 특유의 안면 외관, 및 심혈관 이상을 특징으로 하는 질환인 코스텔로 증후군을 유발한다. 이러한 유전자에서의 결함은 방광암, 여포성 갑상선암 및 경구 편평 세포 암종을 포함한 다양한 암과 연루된다. 상이한 이소형을 코딩하는 다중 전사체 변이체가 이러한 유전자에 대해 확인된 바 있다. 각각의 전사체 변이체는 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 HRAS 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_001130442.1이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_001123914.1이다.
원종양유전자 c-RAF 또는 단순히 c-Raf로도 공지되어 있는 RAF 원종양유전자 세린/트레오닌-단백질 키나제는 인간에서 RAF1 유전자에 의해 코딩된 효소이다. c-Raf 단백질은 MAPK/ERK 신호 전달 경로에서 단백질 키나제 캐스케이드의 일부로서 기능한다. c-Raf는 세린/트레오닌-특이적 단백질 키나제의 Raf 키나제 패밀리의 구성원이고, 직접 결합하는 막 회합된 GTPase의 Ras 슈퍼패밀리의 하류에서 기능하는 MAP 키나제 키나제 키나제 (MAP3K)이다. 일단 활성화되면, Raf-1은 이중 특이성 단백질 키나제 MEK1 및 MEK2를 인산화시켜 활성화할 수 있고, 이는 차례로 세린/트레오닌-특이적 단백질 키나제 ERK1 및 ERK2를 인산화시켜 활성화한다. 활성화된 ERK는 세포 생리학의 다면발현성 이펙터이고, 세포 분열 주기, 아폽토시스, 세포 분화 및 세포 이동에 수반되는 유전자 발현의 제어에서 중요한 역할을 한다. c-Raf (RAF1), MEK1, MEK2, ERK1, 및 ERK2 중 임의의 1종 이상은 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 RAF1 전사체의 대표적인 예는 NM_002880.3이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_00287.1이다.
미토겐-활성화된 단백질 키나제 1 (MAPK1) (또한 ERK, p38, p40, p41, ERK2, ERT1, MAPK2, PRKM1, PRKM2, P42MAPK, 또는 p41mapk로도 지칭됨)은 MAP 키나제 패밀리의 구성원을 코딩한다. 세포외 신호-조절 키나제 (ERK)로도 공지되어 있는 MAP 키나제는 다중 생화학적 신호를 위한 통합 지점으로서 작용하고, 매우 다양한 세포 과정, 예컨대 증식, 분화, 전사 조절 및 발생에 수반된다. 이러한 키나제의 활성화는 상류 키나제에 의한 그의 인산화를 필요로 한다. 활성화되면, 이러한 키나제는 자극된 세포의 핵으로 전위하고, 여기서 이는 핵 표적을 인산화한다. 동일한 단백질을 코딩하지만 UTR에서 상이한 2종의 대안적으로 스플라이싱된 전사체 변이체가 이러한 유전자에 대해 보고된 바 있다. MAPK1의 각각의 전사체 변이체는 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 MAPK1 전사체의 대표적인 예는 NM_002745.4이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_002736.3이다.
C-abl 종양유전자 1, 비-수용체 티로신 키나제 (ABL1)는 세포 분화, 세포 분열, 세포 부착, 및 스트레스 반응의 과정에 연루되어 온 세포질 및 핵 단백질 티로신 키나제를 코딩한다. c-Abl 단백질의 활성은 그의 SH3 도메인에 의해 음성적으로 조절되고, SH3 도메인의 결실은 ABL1을 종양유전자로 변화시킨다. t(9;22) 전위는 만성 골수 백혈병의 많은 경우에 존재하는 BCR (MIM:151410) 및 ABL1 유전자의 헤드-투-테일 융합을 발생시킨다. 편재적으로 발현된 ABL1 티로신 키나제의 DNA-결합 활성은 CDC2-매개 인산화에 의해 조절되고, 이는 ABL1에 대한 세포 주기 기능을 시사한다. ABL1 유전자는 대안적으로 스플라이싱된 제1 엑손이 통상의 엑손 2-11로 스플라이싱된 6- 또는 7-kb mRNA 전사체로서 발현된다. ABL1의 각각의 전사체 변이체는 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 ABL1 전사체의 대표적인 예는 진뱅크 수탁 번호 NM_005057.4이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_005148.2이다.
B-세포 CLL/림프종 2 (Bcl-2)는 림프구와 같은 일부 세포의 아폽토시스 사멸을 차단하는 내재성 외부 미토콘드리아막 단백질을 코딩한다. BCL2의 구성적 발현은, 예컨대 BCL2의 Ig 중쇄 유전자좌로의 전위의 경우에, 여포성 림프종의 원인인 것으로 생각된다. 대안적 스플라이싱에 의해 생산된 2종의 전사체 변이체는 그의 C-말단 단부에서 상이하고, 이들 각각은 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 Bcl-2 전사체의 대표적인 예는 NM_000633.2이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_00624.2이다.
V-src 육종 바이러스 종양유전자 상동체 (SRC)는 라우스 육종 바이러스의 v-src 유전자와 고도로 유사하다. 이러한 원종양유전자는 배아 발생 및 세포 성장의 조절에서 역할을 할 수 있다. 이러한 유전자에 의해 코딩된 단백질은 티로신-단백질 키나제로, 그의 활성은 c-SRC 키나제에 의한 인산화에 의해 억제될 수 있다. 이러한 유전자에서의 돌연변이는 결장암의 악성 진행에 수반될 수 있다. 동일한 단백질을 코딩하는 2종의 전사체 변이체가 이러한 유전자에 대해 발견된 바 있고, 이들 각각은 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 SRC 전사체의 대표적인 예는 NM_005417.3이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_005408.1이다.
라파마이신의 기계론적 표적 (세린/트레오닌 키나제) (mTOR)은 포스파티딜이노시톨 키나제-관련 키나제의 패밀리에 속하는 단백질을 코딩한다. 이들 키나제는 스트레스, 예컨대 DNA 손상 및 영양 고갈에 대한 세포성 반응을 매개한다. 이러한 단백질은 세포-주기 정지 및 FKBP12-라파마이신 복합체의 면역억제 효과를 위한 표적으로서의 역할을 한다. 인간 mTOR 전사체의 대표적인 예는 NM_004958.3이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_004949.1이다.
단백질 키나제 C (PKC)는 다른 단백질 상의 세린 및 트레오닌 아미노산 잔기의 히드록실 기의 인산화를 통해 이들 단백질의 기능을 제어하는데 수반되는 효소의 패밀리를 코딩한다. PKC 효소는 차례로 디아실글리세롤 또는 Ca2+의 농도에서의 증가와 같은 신호에 의해 활성화된다. 따라서 PKC 효소는 여러 신호 전달 캐스케이드에서 중요한 역할을 한다. PKC 패밀리는 약 10종의 동종효소로 이루어진다. 이들은 그의 제2 메신저 요건에 기초하여 3종: 통상적인 (또는 전형적인), 신규, 및 비정형 서브패밀리로 나뉘어진다. 통상적인 (c)PKC는 이소형 α, βI, βII, 및 γ를 함유한다. 이들은 활성화를 위해 Ca2+, 디아실글리세롤 (DAG), 및 인지질, 예컨대 포스파티딜세린을 필요로 한다. 신규 (n)PKC는 δ, ε, η, 및 θ 이소형을 포함하고, 활성화를 위해 DAG는 필요로 하지만 Ca2+는 필요로 하지 않는다. 따라서, 통상적인 및 신규 PKC는 포스포리파제 C와 동일한 신호 전달 경로를 통해 활성화된다. 다른 한편으로는, 비정형 (a)PKC (단백질 키나제 Mζ 및 ι / λ 이소형 포함)는 활성화를 위해 Ca2+도 디아실글리세롤도 필요로 하지 않는다. 용어 "단백질 키나제 C"는 이소형의 전체 패밀리를 지칭한다. 통상적인, 신규 및 비정형 PKC 유전자 중 임의의 1종 이상은 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 PKC 전사체의 대표적인 예는 NM_005400.2이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_005391.1이다.
바큘로바이러스 IAP 반복부 함유 5 (BIRC5) (또한 API4 또는 EPR-1로도 지칭됨)는 아폽토시스 세포 사멸을 방지하는 음성 조절 단백질을 코딩하는 아폽토시스 억제제 (IAP) 유전자 패밀리의 구성원이다. IAP 패밀리 구성원은 통상적으로 다중 바큘로바이러스 IAP 반복부 (BIR) 도메인을 함유하지만, 이러한 유전자는 오직 단일 BIR 도메인만을 갖는 단백질을 코딩한다. 코딩된 단백질은 또한 C-말단 RING 손가락 도메인이 결여되어 있다. 유전자 발현은 태아 발생 동안 및 대부분의 종양에서 높지만, 성체 조직에서는 낮다. 안티센스 전사체는 이러한 유전자의 발현의 조절에 수반된다. 별개의 이소형을 코딩하는 적어도 4종의 전사체 변이체가 이러한 유전자에 대해 발견된 바 있고, 이들 각각은 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 BIRC5 전사체의 대표적인 예는 NM_001012270.1이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_001012270.1이다.
Fas (TNF 수용체 슈퍼패밀리, 구성원 6) (FAS, 또한 APT1, CD95, FAS1, APO-1, FASTM, ALPS1A, 또는 TNFRSF6으로도 지칭됨)는 TNF-수용체 슈퍼패밀리의 구성원을 코딩한다. 이러한 수용체는 사멸 도메인을 함유한다. 이는 프로그램화된 세포 사멸의 생리학적 조절에서 중추적 역할을 한다는 것이 제시된 바 있고, 다양한 악성종양 및 면역계 질환의 발병기전에 연루되어 왔다. 이러한 수용체와 그의 리간드의 상호작용은 Fas-연관 사멸 도메인 단백질 (FADD), 카스파제 8, 및 카스파제 10을 포함하는 사멸-유도 신호전달 복합체가 형성되게 한다. 복합체 내 카스파제의 자가단백질분해 프로세싱은 하류 카스파제 캐스케이드를 촉발하고, 이는 아폽토시스를 발생시킨다. 이러한 수용체는 또한 NF-카파B, MAPK3/ERK1, 및 MAPK8/JNK를 활성화시키는 것으로 제시된 바 있고, 정상 이배체 섬유모세포 및 T 세포에서 증식성 신호를 전달하는데 수반되는 것으로 발견되었다. 여러 대안적으로 스플라이싱된 전사체 변이체가 기재되어 있고, 이들 중 일부는 넌센스-매개 mRNA 붕괴 (NMD)를 위한 후보이다. 막횡단 도메인이 결여된 이소형은 전장 이소형에 의해 매개되는 아폽토시스를 음성적으로 조절할 수 있다. 각각의 전사체 변이체는 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 일부 경우에, sd-rxRNA 표적은 FADD, 카스파제 8, 및/또는 카스파제 10이다. 다른 경우에, sd-rxRNA 표적은 NF-카파B, MAPK3/ERK1 및/또는 MAPK8/JNK이다. 인간 BIRC5 전사체의 대표적인 예는 NM_001012270.1이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_001012270.1이다.
저산소증 유도성 인자 1, 알파 서브유닛 (HIF1A)은 저산소증에 대한 세포 및 전신 항상성 반응에서 본질적인 역할을 하는, 감소된 산소 분압 하에 배양된 포유동물 세포에서 발견된 전사 인자이다. HIF1은 알파 서브유닛 및 베타 서브유닛으로 구성된 이종이량체이다. 베타 서브유닛은 아릴 탄화수소 수용체 핵 전위체 (ARNT)로서 확인된 바 있다. 이러한 유전자는 HIF-1의 알파 서브유닛을 코딩한다. 이러한 유전자의 천연 안티센스 전사체 (aHIF)의 과다발현은 비유두상 신암종과 연관된 것으로 제시된 바 있다. 상이한 이소형을 코딩하는 2종의 대안적 전사체가 확인된 바 있다. 각각의 전사체 변이체 및/또는 천연 안티센스 전사체는 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 HIF1A 전사체의 대표적인 예는 NM_001530.3이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_001521.1이다.
카드헤린 16, KSP-카드헤린 (CDH16)은 카드헤린 슈퍼패밀리의 구성원, 칼슘-의존성, 막-연관 당단백질을 코딩하는 유전자이다. 카드헤린 유전자의 이전에 확인된 클러스터를 염색체 16q22.1 상에 맵핑하면, 유전자는 슈퍼패밀리 구성원 CDH1, CDH3, CDH5, CDH8 및 CDH11과 함께 국재화된다. 단백질은 6개의 카드헤린 도메인을 함유하는 세포외 도메인, 막횡단 영역, 및 말단절단된 세포질 도메인으로 이루어지지만, 대부분의 전형적 카드헤린의 전형적인 프로서열 및 트리펩티드 HAV 부착 인식 서열은 결여되어 있다. 발현은 신장에서 독점적이고, 여기서 단백질은 동형 세포 인식의 주요 매개자로서 기능하여 조직 발생의 형태발생 방향에서 역할을 한다. 별개의 이소형을 코딩하는 대안적으로 스플라이싱된 전사체 변이체가 확인된 바 있고, 이들 각각은 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 CDH16 전사체의 대표적인 예는 NM_004062.3이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_004053.1이다.
카테닌 (카드헤린-연관 단백질), 베타 1 (CTNNB1)은 부착 연접 (AJ)을 구성하는 단백질의 복합체의 일부인 단백질을 코딩한다. AJ는 세포 성장 및 세포 사이의 부착을 조절함으로써 상피 세포 층의 생성 및 유지를 위해 필요하다. 코딩된 단백질은 또한 액틴 세포골격을 고정하고, 상피 시트가 완성되면 세포가 분열을 정지하도록 하는 접촉 억제 신호를 전송하는 것을 담당할 수 있다. 이러한 단백질은 결장의 선종성 폴립증에서 돌연변이된 APC 유전자의 생성물에 결합한다. 이러한 유전자에서의 돌연변이는 결장직장암 (CRC), 모기질세포종 (PTR), 수모세포종 (MDB), 및 난소암의 원인이다. 동일한 단백질을 코딩하는 3종의 전사체 변이체가 이러한 유전자에 대해 발견된 바 있고, 이들 각각은 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 CTNNB1 전사체의 대표적인 예는 NM_001098209.1이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_001091679.1이다.
V-myc 골수구종증 바이러스 종양유전자 상동체 (MYC)는 세포 주기 진행, 아폽토시스 및 세포 형질전환에서 역할을 하는 다중기능적 핵 인단백질을 코딩한다. 이는 특이적 표적 유전자의 전사를 조절하는 전사 인자로서 기능한다. 이러한 유전자의 돌연변이, 과다발현, 재배열 및 전위는 버킷 림프종을 포함한 다양한 조혈 종양, 백혈병 및 림프종과 연관되어 왔다. 상류, 인-프레임 비-AUG (CUG) 및 하류 AUG 출발 부위로부터의 대안적 번역 개시가 별개의 N-말단을 갖는 2종의 이소형의 생산을 발생시킨다는 것을 제시하는 증거가 존재한다. 비-AUG 개시된 단백질의 합성은 버킷 림프종에서 억제되고, 이는 이러한 유전자의 정상 기능에서의 중요성을 시사한다. 돌연변이체 변이체를 포함한 각각의 전사체 변이체는 sd-rxRNA의 표적일 수 있다. 인간 MYC 전사체의 대표적인 예는 NM_002467.4이고, 그의 상응하는 단백질은 NP_002458.2이다.
투여
올리고뉴클레오티드의 투여 또는 전달의 최적 과정은 목적하는 결과 및/또는 치료될 대상체에 따라 달라질 수 있다. 본원에 사용된 "투여"는 세포를 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 것을 지칭하며, 이는 시험관내 또는 생체내에서 수행될 수 있다. 과도한 실험 없이, 예를 들어 RNA 안정성의 판독 또는 치료 반응에 의해 측정되는 것과 같이, 올리고뉴클레오티드의 투여량을 조정하여 표적 핵산 분자로부터 번역된 단백질의 발현을 최적으로 감소시킬 수 있다.
예를 들어, 핵산 표적에 의해 코딩된 단백질의 발현을 측정하여 투여 요법이 그에 따라 조정될 필요가 있는지 여부를 결정할 수 있다. 또한, 세포 내에서 또는 세포에 의해 생성된 RNA 또는 단백질 수준에서의 증가 또는 감소를 임의의 관련 기술분야에서 인식되는 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 전사가 감소되었는지 여부를 결정하여, 표적 RNA의 절단의 유도에서의 올리고뉴클레오티드의 유효성을 결정할 수 있다.
임의의 상기 기재된 올리고뉴클레오티드 조성물은 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체와 함께 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "제약상 허용되는 담체"는 적절한 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 제약 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 사용은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 활성 성분과 비상용성인 임의의 통상적인 매질 또는 작용제를 제외하고, 이를 치료 조성물에서 사용할 수 있다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
비경구 투여를 위해, 올리고뉴클레오티드는 리포솜 또는 폴리에틸렌 글리콜로 변형된 리포솜 내에 혼입되거나 또는 양이온성 지질과 혼합될 수 있다. 리포솜에의 추가의 물질, 예를 들어 특이적 표적 세포에서 발견되는 막 단백질에 대해 반응성인 항체의 혼입은 특이적 세포 유형에의 올리고뉴클레오티드의 표적화를 도울 수 있다.
생체내 적용과 관련하여, 본 발명의 제제를 선택된 투여 경로에 적합화된 다양한 형태로, 예를 들어 비경구로, 경구로 또는 복강내로 환자에게 투여할 수 있다. 비경구 투여가 바람직하고, 이는 하기 경로에 의한 투여를 포함한다: 정맥내; 근육내; 세포사이; 동맥내; 피하; 안구내; 활막내; 경피를 포함한 경상피; 흡입을 통한 폐; 안과적; 설하 및 협측; 안과적인 것을 포함한 국소로; 피부; 안구; 직장; 및 취입을 통한 비강 흡입. 바람직한 실시양태에서, sd-rxRNA 분자는 피내 주사에 의해 또는 피하로 투여된다.
비경구 투여를 위한 제약 제제는 수용성 또는 수분산성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 또한, 적절한 유성 주사 현탁액으로서의 활성 화합물의 현탁액을 투여할 수 있다. 적합한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일, 예를 들어 참깨 오일 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시킬 수 있는 물질을 함유할 수 있고, 예를 들어 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 포함하고, 임의로 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 액체 용액, 바람직하게는 생리학상 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액 또는 링거액 중에 제제화될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 고체 형태로 제제화되고, 사용 직전에 재용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조 형태가 또한 본 발명에 포함된다.
국소 투여를 위한 제약 제제는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적제, 스프레이, 좌제, 액체 및 분말을 포함한다. 또한 통상적인 제약 담체, 수성, 분말, 또는 유성 베이스, 또는 증점제를 국소 투여를 위한 제약 제제에서 사용할 수 있다.
경구 투여를 위한 제약 제제는 분말 또는 과립, 물 또는 비-수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 사쉐 또는 정제를 포함한다. 또한, 증점제, 향미제, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제를 경구 투여를 위한 제약 제제에서 사용할 수 있다.
경점막 또는 경피 투여를 위해, 투과되는 장벽에 적절한 침투제가 제제에서 사용된다. 이러한 침투제는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 경점막 투여를 위한 담즙 염 및 푸시드산 유도체 및 세제를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이를 통해 또는 좌제의 사용을 통해 이루어질 수 있다. 경구 투여를 위해, 올리고뉴클레오티드는 통상적인 경구 투여 형태, 예컨대 캡슐, 정제 및 토닉으로 제제화된다. 국소 투여를 위해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 관련 기술분야에 공지된 것과 같은 연고, 살브, 겔 또는 크림으로 제제화된다.
약물 전달 비히클은 예를 들어 시험관내, 전신 또는 국소 투여를 위해 선택될 수 있다. 이들 비히클은 느린 방출 저장소로서의 역할을 하거나 또는 그의 내용물을 표적 세포에 직접 전달하도록 설계될 수 있다. 일부 직접 전달 약물 비히클의 사용의 이점은 흡수당 다중 분자가 전달된다는 것이다. 이러한 비히클은 다르게는 혈류로부터 신속하게 소거될 약물의 순환 반감기를 증가시키는 것으로 제시된 바 있다. 이러한 카테고리에 속하는 이러한 특수화된 약물 전달 비히클의 일부 예는 리포솜, 히드로겔, 시클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐 및 생체접착성 마이크로구체이다.
기재된 올리고뉴클레오티드는 대상체에게 전신 투여될 수 있다. 전신 흡수는 약물의 혈류에의 진입, 이어서 전신을 통한 분배를 지칭한다. 전신 흡수로 이어지는 투여 경로는 정맥내, 피하, 복강내 및 비강내를 포함한다. 각각의 이러한 투여 경로는 올리고뉴클레오티드를 접근가능한 이환 세포에 전달한다. 피하 투여에 따라, 치료제는 국부 림프절로 배수되고, 림프망을 통해 순환으로 진행한다. 순환으로의 진입 속도는 분자량 또는 크기의 함수인 것으로 제시된 바 있다. 리포솜 또는 다른 약물 담체의 사용은 올리고뉴클레오티드를 림프절에 국재화한다. 올리고뉴클레오티드는 세포 내로 확산되도록 변형될 수 있거나 또는 리포솜은 비변형 또는 변형된 올리고뉴클레오티드 중 하나의 세포에의 전달에 직접 참여할 수 있다.
선택된 전달 방법은 세포에의 진입을 발생시킬 것이다. 일부 실시양태에서, 바람직한 전달 방법은 리포솜 (10-400 nm), 히드로겔, 제어 방출 중합체, 및 다른 제약상 적용가능한 비히클, 및 미세주사 또는 전기천공을 포함한다 (생체외 치료의 경우).
본 발명의 제약 제제는 에멀젼으로 제조 및 제제화될 수 있다. 통상적으로, 에멀젼은 직경이 통상적으로 0.1 μm를 초과하는 액적 형태로 또 다른 것에 분산된 하나의 액체의 불균질 시스템이다. 본 발명의 에멀젼은 부형제, 예컨대 유화제를 함유할 수 있고, 필요에 따라 또한 안정화제, 염료, 지방, 오일, 왁스, 지방산, 지방 알콜, 지방 에스테르, 함습제, 친수성 콜로이드, 보존제 및 항산화제가 에멀젼 중에 존재할 수 있다. 이들 부형제는 수성 상, 유성 상 어느 하나 중의 용액으로서, 또는 그 자체가 별개의 상으로 존재할 수 있다.
본 발명의 에멀젼 제제에 사용될 수 있는 자연 발생 유화제의 예는 라놀린, 밀랍, 포스파티드, 레시틴 및 아카시아를 포함한다. 또한, 미분된 고체는 특히 계면활성제와 조합되어 및 점성 제제에서 우수한 유화제로서 사용되어 왔다. 유화제로서 사용될 수 있는 미분된 고체의 예는 극성 무기 고체, 예컨대 중금속 히드록시드, 비팽윤 점토, 예컨대 벤토나이트, 아타풀자이트, 헥토라이트, 카올린, 몬모릴로나이트, 콜로이드성 규산알루미늄 및 콜로이드성 규산알루미늄마그네슘, 안료 및 비극성 고체, 예컨대 탄소 또는 글리세릴 트리스테아레이트를 포함한다.
에멀젼 제제에 포함될 수 있는 보존제의 예는 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 4급 암모늄 염, 벤즈알코늄 클로라이드, p-히드록시벤조산의 에스테르 및 붕산을 포함한다. 에멀젼 제제에 포함될 수 있는 항산화제의 예는 자유 라디칼 스캐빈저, 예컨대 토코페롤, 알킬 갈레이트, 부틸화 히드록시아니솔, 부틸화 히드록시톨루엔, 또는 환원제, 예컨대 아스코르브산 및 메타중아황산나트륨, 및 항산화 상승작용제, 예컨대 시트르산, 타르타르산, 및 레시틴을 포함한다.
한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드의 조성물은 마이크로에멀젼으로 제제화된다. 마이크로에멀젼은 물, 오일 및 친양쪽성 시스템이고, 이는 단일의 광학적으로 등방성이며 열역학적으로 안정한 액체 용액이다. 전형적으로, 마이크로에멀젼은 먼저 오일을 수성 계면활성제 용액에 분산시킨 다음, 충분한 양의 제4 성분, 일반적으로 중간 쇄-길이 알콜을 첨가하여 투명한 시스템을 형성함으로써 제조된다.
마이크로에멀젼의 제조에 사용될 수 있는 계면활성제는 이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 브리즈 96, 폴리옥시에틸렌 올레일 에테르, 폴리글리세롤 지방산 에스테르, 테트라글리세롤 모노라우레이트 (ML310), 테트라글리세롤 모노올레에이트 (MO310), 헥사글리세롤 모노올레에이트 (PO310), 헥사글리세롤 펜타올레에이트 (PO500), 데카글리세롤 모노카프레이트 (MCA750), 데카글리세롤 모노올레에이트 (MO750), 데카글리세롤 세스퀴올레에이트 (S0750), 데카글리세롤 데카올레에이트 (DA0750)를 단독으로 또는 보조계면활성제와 조합하여 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 보조계면활성제, 통상적으로 단쇄 알콜, 예컨대 에탄올, 1-프로판올 및 1-부탄올은 계면활성제 필름에의 침투, 및 그로 인해 계면활성제 분자 사이에 생성된 공극 공간으로 인한 무질서 필름의 생성에 의해 계면 유동성을 증가시키는 역할을 한다.
그러나, 마이크로에멀젼은 보조계면활성제의 사용 없이 제조될 수 있고, 무알콜 자기-에멀젼화 마이크로에멀젼 시스템이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 수성 상은 물, 약물의 수용액, 글리세롤, PEG300, PEG400, 폴리글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 에틸렌 글리콜의 유도체일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 오일 상은 카프텍스(Captex) 300, 카프텍스 355, 카프물(Capmul) MCM, 지방산 에스테르, 중쇄 (C8-C12) 모노, 디 및 트리-글리세리드, 폴리옥시에틸화 글리세릴 지방산 에스테르, 지방 알콜, 폴리글리콜화 글리세리드, 포화 폴리글리콜화 C8-C10 글리세리드, 식물성 오일 및 실리콘 오일과 같은 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
특히, 마이크로에멀젼은 약물 가용화 및 증진된 약물 흡수의 관점에서 관심 대상이다. 지질 기반 마이크로에멀젼 (오일/물 및 물/오일 둘 다)는 약물의 경구 생체이용률을 증진시키는 것으로 제안된 바 있다.
마이크로에멀젼은 개선된 약물 가용화, 효소적 가수분해로부터 약물의 보호, 막 유동성 및 투과성에서의 계면활성제-유도된 변경으로 인한 약물 흡수의 가능한 증진, 제조의 용이성, 고체 투여 형태에 비해 경구 투여의 용이성, 개선된 임상 효력, 및 감소된 독성을 제공한다 (Constantinides et al., Pharmaceutical Research, 1994, 11:1385; Ho et al., J. Pharm. Sci., 1996, 85:138-143). 또한, 마이크로에멀젼은 화장품 및 제약 용도 둘 다에서 활성 성분의 경피 전달에 효과적이다. 본 발명의 마이크로에멀젼 조성물 및 제제는 위장관으로부터 올리고뉴클레오티드의 증가된 전신 흡수를 용이하게 할 뿐만 아니라, 위장관, 질, 협강 및 다른 투여 영역 내의 올리고뉴클레오티드의 국부 세포 흡수를 개선시킬 것으로 예상된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 다양한 침투 증진제를 사용하여 핵산, 특히 올리고뉴클레오티드의 동물의 피부에의 효율적인 전달에 영향을 미친다. 통과되는 막을 침투 증진제로 처리하는 경우에 심지어 비-친지성 약물도 세포 막을 통과할 수 있다. 세포 막을 통한 비-친지성 약물의 확산을 증가시키는 것에 더하여, 침투 증진제는 또한 친지성 약물의 투과성을 증진시키는 작용을 한다.
본 발명에 사용될 수 있는 5가지 카테고리의 침투 증진제는 계면활성제, 지방산, 담즙 염, 킬레이트화제 및 비-킬레이트화 비-계면활성제를 포함한다. 투여되는 올리고뉴클레오티드의 침투를 증진시키기 위해 사용될 수 있는 다른 작용제는 글리콜, 예컨대 에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 피롤, 예컨대 2-15 피롤, 아존, 및 테르펜, 예컨대 리모넨, 및 멘톤을 포함한다.
또한, 특히 지질 제제에서 올리고뉴클레오티드는 의료 장치, 예를 들어 카테터, 예컨대 혈관성형술 풍선 카테터를 양이온성 지질 제제로 코팅하는 것에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 의료 장치를 지질 제제 또는 지질 제제 및 적합한 용매, 예를 들어 수성계 완충제, 수성 용매, 에탄올, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름 등의 혼합물에 침지시켜 코팅을 달성할 수 있다. 제제의 양이 장치의 표면에 자연적으로 부착될 것이고, 이는 후속적으로 환자에게 적절하게 투여된다. 대안적으로, 지질 제제의 동결건조된 혼합물은 장치의 표면에 특이적으로 결합될 수 있다. 이러한 결합 기술은 예를 들어 문헌 [K. Ishihara et al., Journal of Biomedical Materials Research, Vol. 27, pp. 1309-1314 (1993)]에 기재되어 있고, 그의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
투여되는 유용한 투여량 및 특정한 투여 방식은 세포 유형, 생체내 용도, 연령, 체중, 및 치료되는 특정한 동물 및 그의 영역, 특정한 올리고뉴클레오티드 및 사용되는 전달 방법, 고려되는 치료 또는 진단 용도, 및 제제의 형태, 예를 들어 현탁액, 에멀젼, 미셀 또는 리포솜과 같은 인자에 따라 달라질 것이고, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이다. 전형적으로, 투여량은 보다 낮은 수준에서 투여되며, 목적하는 효과가 달성될 때까지 증가된다. 지질을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 전달하는 경우에, 투여되는 지질 화합물의 양은 달라질 수 있고, 일반적으로 투여되는 올리고뉴클레오티드 작용제의 양에 의존한다. 예를 들어, 지질 화합물 대 올리고뉴클레오티드 작용제의 중량비는 바람직하게는 약 1:1 내지 약 15:1이고, 보다 바람직하게는 중량비는 약 5:1 내지 약 10:1이다. 일반적으로, 투여되는 양이온성 지질 화합물의 양은 약 0.1 밀리그램 (mg) 내지 약 1 그램 (g)으로 달라질 것이다. 보다 많은 양 및 보다 적은 양이 사용될 수 있지만, 일반적인 지침으로서 전형적으로 환자 체중 킬로그램당 각각 약 0.1 mg 내지 약 10 mg의 특정한 올리고뉴클레오티드 작용제, 및 약 1 mg 내지 약 100 mg의 지질 조성물이 투여된다.
본 발명의 작용제는 제약상 투여에 적합한 생물학적으로 상용성인 형태로 대상체에 투여되거나 또는 세포와 접촉된다. "투여에 적합한 생물학적으로 상용성인 형태"는 임의의 독성 효과보다 올리고뉴클레오티드의 치료 효과가 더 큰 형태로 올리고뉴클레오티드가 투여된다는 것을 의미한다. 한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드가 대상체에 투여될 수 있다. 대상체의 예는 포유동물, 예를 들어 인간 및 다른 영장류; 소, 돼지, 말 및 농장 (농업용) 동물; 개, 고양이 및 다른 가정용 애완동물; 마우스, 래트 및 트랜스제닉 비-인간 동물을 포함한다.
활성 양의 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 투여는 목적하는 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 기간에서 효과적인 양으로 정의된다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드의 활성 양은 세포의 유형, 사용되는 올리고뉴클레오티드, 및 생체내 용도, 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 도출하는 올리고뉴클레오티드의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 세포 내 올리고뉴클레오티드의 치료 수준의 확립은 흡수 및 유출 또는 분해 속도에 의존한다. 분해 정도를 감소시키는 것은 올리고뉴클레오티드의 세포내 반감기를 연장시킨다. 따라서, 예를 들어 포스페이트 백본의 변형을 갖는 화학적으로-변형된 올리고뉴클레오티드는 다양한 투여를 필요로 할 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 정확한 투여량 및 투여되는 용량의 횟수는 실험적으로 및 임상 시험에서 생성된 데이터에 의존할 것이다. 여러 인자, 예컨대 목적하는 효과, 전달 비히클, 질환 적응증, 및 투여 경로는 투여량에 영향을 미칠 것이다. 투여량은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정되며, 대상 제약 조성물로 제제화될 수 있다. 바람직하게는, 치료 지속기간은 적어도 질환 증상의 과정을 통해 연장될 것이다.
투여 요법을 조정하여 최적의 치료 반응을 제공할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드를 반복적으로 투여할 수 있으며, 예를 들어 여러 용량을 매일 투여하거나, 또는 용량을 치료 상황의 위급성에 의해 제시되는 바와 같이 비례적으로 감소시킬 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 올리고뉴클레오티드가 세포에 투여되는지 대상체에 투여되는지에 관계없이 대상 올리고뉴클레오티드의 적절한 투여 용량 및 스케줄을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
예컨대 피내 주사 또는 피하 전달을 통한 sd-rxRNA의 투여는 투여 요법의 시험을 통해 최적화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 투여가 충분하다. 투여된 sd-rxRNA의 효과를 추가로 연장시키기 위해, sd-rxRNA를 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 친숙할 느린 방출 제제 또는 장치로 투여할 수 있다. sd-rxRNA 화합물의 소수성 속성은 광범위한 중합체의 사용을 가능하게 할 수 있으며, 그 중 일부는 통상적인 올리고뉴클레오티드 전달과는 상용가능하지 않다.
다른 실시양태에서, sd-rxRNA는 다수회 투여된다. 일부 경우에, 이는 매일, 1주 2회, 매주, 2주마다, 3주마다, 매월, 2개월마다, 3개월마다, 4개월마다, 5개월마다, 6개월마다 또는 6개월 미만마다의 빈도로 투여된다. 일부 경우에, 이는 1일, 1주, 1개월 및/또는 1년에 다수회 투여된다. 예를 들어, 이는 대략 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간 또는 12시간 초과마다 투여될 수 있다. 이는 1일에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10회 또는 10회 초과 투여될 수 있다.
본 발명의 측면은 대상체에의 sd-rxRNA 분자의 투여에 관한 것이다. 일부 경우에, 대상체는 환자이며, sd-rxRNA 분자의 투여는 의사 사무실에서의 sd-rxRNA 분자의 투여를 수반한다.
일부 실시양태에서, 1개 초과의 sd-rxRNA 분자가 동시에 투여된다. 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10종 또는 10종 초과의 상이한 sd-rxRNA 분자를 함유하는 조성물이 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 조성물은 2 또는 3종의 상이한 sd-rxRNA 분자를 포함한다. 조성물이 1종 초과의 sd-rxRNA를 포함하는 경우에, 조성물 내의 sd-rxRNA 분자는 동일한 유전자 또는 상이한 유전자에 대해 지시될 수 있다.
일부 경우에, 피하 투여에 의해 전달되는 sd-rxRNA의 유효량은 적어도 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 mg/kg 또는 100 mg/kg 초과이며, 임의의 중간값을 포함한다.
일부 경우에, 피내 주사를 통해 전달되는 sd-rxRNA의 유효량은 적어도 대략 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 μg 또는 950 μg 초과이며, 임의의 중간값을 포함한다.
본원에 기재된 방법을 통해 투여되는 sd-rxRNA 분자는 피부 내의 모든 세포 유형에 효과적으로 표적화된다.
핵산을 도입하는 물리적 방법은 핵산을 함유하는 용액의 주사, 핵산에 의해 피복된 입자에 의한 충격, 핵산 용액 중 세포 또는 유기체의 침지, 또는 핵산의 존재 하의 세포 막의 전기천공을 포함한다. 바이러스 입자로 패키징된 바이러스 구축물은 발현 구축물의 세포에의 효율적인 도입 및 발현 구축물에 의해 코딩된 핵산의 전사 둘 다를 달성할 것이다. 핵산을 세포에 도입하기 위한 관련 기술분야에 공지된 다른 방법, 예컨대 지질-매개 담체 수송, 화학물질-매개 수송, 예컨대 인산칼슘 등이 사용될 수 있다. 따라서, 하기 활동 중 1종 이상을 수행하는 성분과 함께 핵산을 도입할 수 있다: 세포에 의한 핵산 흡수를 증진시킴, 단일 가닥의 어닐링을 억제함, 단일 가닥을 안정화시킴, 또는 달리 표적 유전자의 억제를 증가시킴.
핵산은 세포에 직접 도입되거나 (즉, 세포내), 또는 공동, 간질 공간 내로, 유기체의 순환 내로 세포외 도입되거나, 경구로 도입되거나, 또는 세포 또는 유기체를 핵산을 함유하는 용액에 담그는 것에 의해 도입될 수 있다. 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프계, 및 뇌척수액이 핵산이 도입될 수 있는 부위이다.
표적 유전자를 갖는 세포는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있거나 그 안에 함유되어 있을 수 있다. 유기체는 식물, 동물, 원충, 박테리아, 바이러스 또는 진균일 수 있다. 식물은 단자엽, 쌍자엽 또는 겉씨식물일 수 있고, 동물은 척추동물 또는 무척추동물일 수 있다. 바람직한 미생물은 농업 또는 산업적으로 사용되는 것이고, 식물 또는 동물에 병원성인 것이다.
대안적으로, 본 발명의 siRNA를 코딩하는 벡터, 예를 들어 트랜스진으로 관련 기술분야에서 인지되는 기술을 사용하여 숙주 세포 또는 트랜스제닉 동물을 조작할 수 있다.
본 발명의 작용제 (또는 그를 코딩하는 벡터 또는 트랜스진)에 대한 추가의 바람직한 용도는 진핵 세포 또는 진핵 비-인간 유기체, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 유기체, 및 가장 바람직하게는 인간 세포, 예를 들어 세포주, 예컨대 HeLa 또는 293, 또는 설치류, 예를 들어 래트 및 마우스에서 수행되는 기능적 분석이다. 표적-특이적 RNA 간섭을 지시하기 위해 표적 mRNA 서열에 충분히 상보적인 적합한 프라이밍제/RNAi 작용제를 투여함으로써, 특이적 녹아웃 또는 녹다운 표현형을 표적 세포, 예를 들어 세포 배양물 또는 표적 유기체에서 수득할 수 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 대상은 적어도 1개의 내인성 표적 유전자의 완전한 또는 적어도 부분적으로 결손된 발현을 포함하는 표적 유전자-특이적 녹아웃 또는 녹다운 표현형을 나타내는 진핵 세포 또는 진핵 비-인간 유기체이며, 여기서 상기 세포 또는 유기체는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제를 코딩하는 DNA를 포함하는 적어도 1개의 벡터로 형질감염된다. 본 발명이 RNAi 작용제의 특이성으로 인해 여러 상이한 내인성 유전자의 표적-특이적 녹아웃 또는 녹다운을 가능하게 한다는 점에 주목해야 한다.
세포 또는 비-인간 유기체, 특히 인간 세포 또는 비-인간 포유동물의 유전자-특이적 녹아웃 또는 녹다운 표현형을 분석 절차, 예를 들어 복잡한 생리학적 과정의 기능 및/또는 표현형 분석, 예컨대 유전자 발현 프로파일 및/또는 프로테옴의 분석에 사용할 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 기반 칩을 사용한 고처리량 방법에 의해 분석을 수행한다.
치료 용도
유전자 발현의 억제에 의해, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 조성물을 사용하여 단백질의 발현을 수반하는 임의의 질환을 치료할 수 있다. 단지 예로서, 올리고뉴클레오티드 조성물에 의해 치료될 수 있는 질환의 예는 암, 망막병증, 자가면역 질환, 염증성 질환 (즉, ICAM-1 관련 장애, 건선, 궤양성 대장염, 크론병), 바이러스성 질환 (즉, HIV, C형 간염), miRNA 장애 및 심혈관 질환을 포함한다.
한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드를 사용한 세포의 시험관내 처리를 대상체로부터 제거된 세포의 생체외 요법을 위해 (예를 들어, 백혈병 또는 바이러스 감염의 치료를 위해), 또는 대상체에서 유래되지 않았지만 대상체에게 투여될 세포의 처리를 위해 (예를 들어, 대상체에 이식될 세포 상에서의 이식 항원 발현을 제거하기 위해) 사용할 수 있다. 또한, 세포의 시험관내 처리는 비-치료 세팅에서, 예를 들어 유전자 기능의 평가, 유전자 조절 및 단백질 합성의 연구, 또는 유전자 발현 또는 단백질 합성을 조정하기 위해 설계된 올리고뉴클레오티드에 대해 이루어진 개선의 평가를 위해 사용할 수 있다. 세포의 생체내 처리는 단백질의 발현의 억제가 바람직한 특정 임상 세팅에서 유용할 수 있다. 안티센스 치료가 적합한 것으로 보고되어 있는 수많은 의학적 상태 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,830,653 참조), 뿐만 아니라 호흡기 세포융합 바이러스 감염 (WO 95/22,553), 인플루엔자 바이러스 (WO 94/23,028), 및 악성종양 (WO 94/08,003)이 존재한다. 안티센스 서열의 임상 용도의 다른 예는 예를 들어 문헌 [Glaser. 1996. Genetic Engineering News 16:1]에 검토되어 있다. 올리고뉴클레오티드에 의한 절단을 위한 예시적인 표적은 예를 들어 만성 골수성 백혈병에서 발견되는 단백질 키나제 Ca, ICAM-1, c-raf 키나제, p53, c-myb 및 bcr/abl 융합 유전자를 포함한다.
대상 핵산은 RNAi 경로를 갖는 임의의 동물, 예컨대 인간, 비-인간 영장류, 비-인간 포유동물, 비-인간 척추동물, 설치류 (마우스, 래트, 햄스터, 토끼 등), 가정용 가축 동물, 애완동물 (고양이, 개 등), 크세노푸스(Xenopus), 어류, 곤충 (드로소필라(Drosophila) 등) 및 유충류 (씨. 엘레간스(C. elegans)) 등에서의 RNAi-기반 요법에 사용될 수 있다.
본 발명은 대상체에게 치료제 (예를 들어, RNAi 작용제, 또는 이를 코딩하는 벡터 또는 트랜스진)를 투여하여 대상체에서 비정상적이거나 원치않는 표적 유전자 발현 또는 활성과 연관된 질환 또는 상태를 예방하기 위한 방법을 제공한다. 적절한 경우에, 대상체를 먼저 프라이밍제로 처리하여 후속 RNAi 요법에 보다 반응성이 되도록 한다. 비정상적이거나 원치않는 표적 유전자 발현 또는 활성에 의해 유발되거나 또는 그가 기여하는 질환에 대한 위험성이 있는 대상체는 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 진단 또는 예후 검정 중 임의의 것 또는 그의 조합에 의해 확인될 수 있다. 예방제의 투여는 표적 유전자 이상의 특징인 증상의 징후 전에 행하여, 질환 또는 장애가 예방되거나 또는 대안적으로 그의 진행이 지연되도록 할 수 있다. 표적 유전자 이상의 유형에 따라, 예를 들어 표적 유전자, 표적 유전자 효능제 또는 표적 유전자 길항제를 대상체의 치료에 사용할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 목적을 위한 표적 유전자 발현, 단백질 발현 또는 활성을 조정하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 예시적 실시양태에서, 본 발명의 조정 방법은 표적 유전자를 발현할 수 있는 세포를 표적 유전자 또는 단백질에 특이적인 (예를 들어, 상기 유전자에 의해 코딩되는 mRNA에 특이적이거나 상기 단백질의 아미노산 서열을 특정하는) 본 발명의 치료제와 접촉시켜, 표적 단백질의 발현 또는 그의 활성 중 1종 이상이 조정되도록 하는 것을 수반한다. 이들 조정 방법은 시험관내 (예를 들어, 세포를 작용제와 함께 배양하는 것에 의해), 생체내 (예를 들어, 작용제를 대상체에 투여하는 것에 의해) 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 전형적으로, 대상체를 먼저 프라이밍제로 처리하여, 후속 RNAi 요법에 보다 반응성이 되도록 한다. 따라서, 본 발명은 표적 유전자 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 비정상적이거나 원치않는 발현 또는 활성을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 앓고 있는 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 표적 유전자 활성의 억제는 표적 유전자가 비정상적으로 비조절되고/거나 감소된 표적 유전자 활성이 유익한 효과를 가질 수 있는 상황에서 바람직하다.
본 발명의 치료제를 개체에게 투여하여 비정상적이거나 원치않는 표적 유전자 활성과 연관된 장애를 치료 (예방적으로 또는 치유적으로)할 수 있다. 이러한 치료와 관련하여, 약리유전체학 (즉, 개체의 유전자형과 외래 화합물 또는 약물에 대한 그 개체의 반응 사이의 관계의 연구)을 고려할 수 있다. 치료제의 대사에서의 차이는 약리학적 활성 약물의 용량 및 혈액 농도 사이의 관계를 변경시켜 심각한 독성 또는 치료 실패를 발생시킬 수 있다. 따라서, 의사 또는 임상의는 치료제를 투여할지 여부를 결정하는 것, 뿐만 아니라 투여량 및/또는 치료의 치료 요법을 치료제와 맞추는데 있어서 관련 약리유전체학 연구에서 수득한 지식을 적용하는 것을 고려할 수 있다. 약리유전체학은 변경된 약물 배치로 인한 약물에 대한 반응에서의 임상적으로 유의한 유전성 변동 및 영향을 받은 인간에서의 비정상적인 작용을 다룬다. 예를 들어, 문헌 [Eichelbaum, M. et al. (1996) Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 23(10-11): 983-985 and Linder, M. W. et al. (1997) Clin. Chem. 43(2):254-266]을 참조한다.
피부 적응증에서의 RNAi
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 분자 또는 핵산 분자를 포함하는 조성물은 손상된 피부를 사전치료하거나, 치료하거나 또는 예방하기 위해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 "손상된 피부"는 정상 피부와는 구별되는 특징을 나타내는 피부를 지칭한다. 손상된 피부는 피부과정 상태와 함께 발생할 수 있다. 피부과정 상태의 여러 비제한적 예는 장미증, 일반 여드름, 지루성 피부염, 입주위 피부염, 여드름모양 발진, 일과성 극세포해리성 피부병 및 속립성 괴사성 여드름을 포함한다. 일부 경우에, 손상된 피부는 상처 및/또는 반흔 조직을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 발명과 연관된 방법 및 조성물을 사용하여 상처 치유, 반흔형성의 예방, 감소 또는 억제, 및/또는 상처의 재상피화의 촉진을 촉진할 수 있다.
대상체는 대상체의 피부가 손상되기 전에 본 발명과 연관된 분자로 사전치료되거나 예방적으로 치료될 수 있다. 본원에 사용된 "사전치료" 또는 "예방적 치료"는 피부가 손상되기 전에 피부에의 핵산의 투여를 지칭한다. 예를 들어, 대상체는 피부가 손상되기 15분, 30분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 24시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 또는 8일 초과 전에 사전치료될 수 있다. 다른 실시양태에서, 대상체는 피부가 손상되기 직전에 및/또는 피부가 손상되는 것과 동시에 및/또는 피부가 손상된 후에 본 발명과 연관된 분자로 치료될 수 있다. 일부 실시양태에서, 피부는 의료 절차, 예컨대 선택적 수술을 포함한 수술을 통해 손상된다. 특정 실시양태에서, 방법 및 조성물은 손상될 위험이 있는 것으로 여겨지는 피부의 영역에 적용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험을 초과하지 않는 실험을 사용하여 투여 타이밍을 최적화할 수 있는 것으로 이해될 것이다.
일부 측면에서, 본 발명과 연관된 방법은 손상된 피부의 치유를 촉진하기 위해 적용될 수 있다. 투여는 손상된 피부가 이미 부분적으로 치유된 경우라도 손상된 피부가 치유될 때까지 임의의 시점에서 이루어질 수 있다. 투여 타이밍은 손상된 피부의 속성, 손상된 피부 내의 훼손 정도, 및 손상된 영역의 크기를 포함한 여러 인자에 따라 다를 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 피부가 손상된 직후에, 또는 피부가 손상되고 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간, 24시간, 48시간, 또는 48시간 초과 후에 이루어질 수 있다. 본 발명의 방법 및 조성물은 필요하다면 1회 이상 투여될 수 있다. 예를 들어 일부 실시양태에서, 조성물은 매일 또는 1일에 2회 투여될 수 있다. 일부 경우에, 조성물은 손상된 피부의 형성 전 및 후 둘 다에 투여될 수 있다.
본 발명과 연관된 조성물은 임의의 적합한 경로로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여는 손상된 피부의 영역에서 국부로 이루어진다. 예를 들어, 조성물은 피내 주사에 의해 투여될 수 있다. 피내 주사를 위한 조성물은 주사액을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 피내 주사는 손상된 피부의 영역 주위에서 또는 피부가 손상될 가능성이 있는 부위에서 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 또한 국소 형태, 예컨대 크림 또는 연고로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조성물의 투여는 손상된 피부의 최초 치료 또는 사전치료의 일부를 구성하지만, 다른 실시양태에서 이러한 조성물의 투여는 손상된 피부의 영역에 대한 추적 관리를 구성한다.
적용되는 조성물 또는 의약의 적절한 양은 많은 상이한 인자에 따라 달라질 수 있고, 상용 실험을 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 고려될 수 있는 여러 비제한적 인자는 작용제의 생물학적 활성 및 생체이용률, 작용제의 속성, 투여 방식, 반감기 및 치료될 대상체의 특징을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명과 연관된 핵산 분자는 또한 폐 섬유증, 간 경변증, 경피증 및 사구체신염, 폐 섬유증, 간 섬유증, 피부 섬유증, 근육 섬유증, 방사선 섬유증, 신장 섬유증, 증식성 유리체망막병증, 및 자궁 섬유증을 포함한 섬유화 장애의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 핵산 분자의 치료 유효량은 손상된 피부의 형성의 예방, 및/또는 손상된 피부의 상태의 개선에 충분한 양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 손상된 피부의 상태의 개선은 상처 치유의 촉진, 및/또는 반흔형성의 억제, 및/또는 상피 재생의 촉진에 상응할 수 있다. 일부 경우에, 손상된 피부의 형성의 예방 및/또는 손상된 피부의 상태의 개선의 정도는 예를 들어 의사 또는 임상의에 의해 결정될 수 있다.
일부 경우에, 손상된 피부의 형성의 예방 및/또는 손상된 피부의 상태의 개선을 위한 본 발명과 연관된 핵산 분자의 능력은 피부에 의해 나타나는 특성을 참조하여 측정될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 특성은 상피화 속도 및/또는 대등한 시점에 대조 피부와 비교하여 손상된 피부의 영역의 감소된 크기를 포함할 수 있다.
본원에 사용된, 예를 들어 외과적 절차 전의 손상된 피부의 형성의 예방, 및/또는 예를 들어 외과적 절차 후의 손상된 피부의 상태의 개선은 대조 샘플에서 일어나는 치유 속도와 비교하여 손상된 피부에서의 치유 속도에서의 임의의 증가를 포괄할 수 있다. 일부 경우에, 손상된 피부의 상태는 치료된 피부 및 대조 피부에서 달성된 재상피화 속도의 비교, 또는 대등한 시점에서 손상된 피부의 치료된 영역 및 대조 영역의 상대적 영역의 비교와 관련하여 평가될 수 있다. 일부 측면에서, 손상된 피부의 형성을 예방하거나 손상된 피부의 치유를 촉진하는 분자는 투여 시 손상된 피부의 영역이 대등한 시점에서의 대조군과 비교하여 증가된 재상피화 속도 및/또는 손상된 피부의 크기의 감소를 나타내도록 하는 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 손상된 피부의 치유는 대조군에서 일어나는 속도보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 초과의 치유 속도를 발생시킬 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명과 연관된 방법 및 조성물로 치료될 대상체는 의료 절차, 예컨대 수술을 받을 예정이거나, 받고 있거나 또는 받았던 대상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 결함이 있거나, 지연되거나 또는 달리 손상된 재상피화 (예컨대 노인에서의 피부 상처)의 경향이 있을 수 있다. 상처 치유가 지연 또는 달리 손상된 재상피화와 연관되는 상태 또는 장애의 다른 비제한적 예는 당뇨병을 앓는 환자, 다제약요법을 받는 환자, 폐경후 여성, 압력 손상에 감수성인 환자, 정맥 질환을 갖는 환자, 임상적으로 비만인 환자, 화학요법을 받는 환자, 방사선요법을 받는 환자, 스테로이드 치료를 받는 환자, 및 면역손상된 환자를 포함한다. 일부 경우에, 결함이 있는 재상피화 반응은 상처 부위에서의 감염, 및 만성 상처, 예컨대 궤양의 형성에 기여할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명과 연관된 방법은 만성 상처, 예컨대 궤양에서 손상된 피부의 재상피화를 촉진할 수 있으며, 또한 상처 치유와 연관된 반흔형성을 억제할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명과 연관된 방법은 만성 상처로 발전되는 손상된 상처 치유의 소인이 있는 환자에서의 급성 상처로 손상된 피부의 예방 또는 치료에 적용된다. 다른 측면에서, 본 발명과 연관된 방법은 일반적인 임상 상황에서의 사용을 위한, 반흔형성을 예방하거나, 감소시키거나 또는 억제하면서 손상된 피부의 가속화된 치유의 촉진에 적용된다. 일부 측면에서, 이는 외과적 절개의 치료를 수반할 수 있고, 이러한 방법의 적용은 이러한 치유 시 달리 일어날 수 있는 반흔형성의 예방, 감소 또는 억제를 생성할 수 있다. 이러한 치료는 반흔을 덜 뚜렷하게 하며 보다 정상인 피부 구조의 재생을 나타내도록 할 수 있다. 다른 실시양태에서, 치료되는 손상된 피부는 외과적 절개에 의해 유발된 손상된 피부가 아니다. 손상된 피부는 재상피화 및 치유를 촉진하기 위한 계속된 관리 및 계속된 의약의 적용이 이루어질 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명과 연관된 방법은 또한 이식 절차와 연관된 손상된 피부의 치료에 사용될 수 있다. 이는 이식편 공여 부위 및/또는 이식편 수용 부위에서의 치료를 수반할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이식편은 피부, 인공 피부 또는 피부 대체물을 수반할 수 있다. 또한, 본 발명과 연관된 방법은 상피 재생을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 사용된, 상피 재생의 촉진은 대조-치료된 또는 비치료된 상피에서 일어나는 재생과 비교하여 상피 재생의 속도에서의 임의의 증가를 포괄한다. 일부 경우에, 달성된 상피 재생의 속도는 관련 기술분야에 공지된 임의의 적합한 상피 재생 모델을 사용하여 대조-치료된 또는 비치료된 상피에서 일어나는 것과 비교될 수 있다. 상피 재생의 촉진은 문맥상 효과적인 재상피화의 유도에 사용될 수 있으며, 여기서 재상피화 반응은 손상되거나, 억제되거나, 지연되거나 또는 달리 결함이 있다. 또한, 상피 재생의 촉진을 행하여 상피 훼손을 겪는 환자에서의 결함 또는 정상 상피 재생 반응의 속도를 가속화할 수 있다.
재상피화 반응이 결함이 있을 수 있는 일부 경우는 천포창, 헤일리-헤일리 질환 (가족성 양성 천포창), 독성 표피 괴사용해 (TEN)/라이엘(Lyell) 증후군, 수포성 표피박리증, 피부 리슈마니아증 및 광선 각화증과 같은 상태를 포함한다. 폐의 결함 재상피화는 특발성 폐 섬유증 (IPF) 또는 간질성 폐 질환과 연관될 수 있다. 안구의 결함 재상피화는 부분적인 윤부 줄기 세포 결핍 또는 각막 미란과 같은 상태와 연관될 수 있다. 위장관 또는 결장의 결함 재상피화는 만성 치열 (항문 열구), 궤양성 결장염 또는 크론병, 및 다른 염증성 장 장애와 같은 상태와 연관될 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명과 연관된 방법을 사용하여 반흔형성과 연관된 손상된 피부를 예방하거나, 감소시키거나 또는 달리 억제한다. 이는 신체 내의 임의의 부위, 및 피부, 눈, 신경, 건, 인대, 근육 및 구강 (입술 및 구개 포함), 뿐만 아니라 내부 기관 (예컨대, 간, 심장, 뇌, 복강, 골반강, 흉강, 장 및 생식 조직)을 포함한 임의의 조직 또는 기관에 적용될 수 있다. 피부에서, 치료는 콜라겐 섬유의 형태학 및 편성을 변화시킬 수 있고, 반흔이 덜 시각적이게 하고 주위 피부와 조화되도록 할 수 있다. 본원에 사용된, 반흔형성의 예방, 감소 또는 억제는 대조-치료된 또는 비치료된 상처에서 일어나는 반흔형성의 수준과 비교하여 반흔형성에서의 임의의 정도의 예방, 감소 또는 억제를 포괄한다.
손상된 피부, 예컨대 피부 반흔형성과 연관된 손상된 피부의 예방, 감소 또는 억제는 현미경 및/또는 육안 특징을 참조하여 평가 및/또는 측정될 수 있다. 육안 특징은 피부의 색, 높이, 표면 텍스쳐 및 강성을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 피부의 색, 높이, 표면 텍스쳐 및 강성이 치료 후에 비치료된 대조군보다 정상 피부와 보다 근접하게 유사해진 경우에, 손상된 피부의 예방, 감소 또는 억제가 입증될 수 있다. 손상된 피부의 현미경 평가는 세포외 매트릭스 (ECM) 섬유의 두께 및/또는 배향 및/또는 조성, 및 손상된 피부의 세포충실성과 같은 특징을 시험하는 것을 수반할 수 있다. 일부 경우에, 세포외 매트릭스 (ECM) 섬유의 두께 및/또는 배향 및/또는 조성, 및/또는 손상된 피부의 세포충실성이 치료 후에 비치료된 대조군보다 정상 피부와 보다 근접하게 유사해진 경우에, 손상된 피부의 예방, 감소 또는 억제가 입증될 수 있다.
일부 측면에서, 본 발명과 연관된 방법은 적어도 부분적으로 손상된 피부의 미용 외관의 개선에 기여하기 위한 미용 목적을 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명과 연관된 방법을 사용하여 손상된 피부, 예컨대 신체의 관절을 덮는 상처의 반흔형성을 예방하거나, 감소시키거나 또는 억제할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명과 연관된 방법을 사용하여 가속화된 상처 치유를 촉진하고/거나, 수축 반흔의 형성의 증가된 위험이 있는 상처 및/또는 높은 피부 긴장 부위에 위치한 상처의 반흔형성을 예방, 감소 또는 억제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명과 연관된 방법은 정상 반흔형성보다 더 현저한 유해 효과를 가질 수 있는 병리학적 반흔형성, 예컨대 비대성 반흔 및 켈로이드의 증가된 위험이 있는 경우에 손상된 피부의 치유의 촉진에 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 손상된 피부의 가속화된 치유의 촉진, 및/또는 반흔형성의 예방, 감소 또는 억제를 위한 본원에 기재된 방법은 병리학적 반흔의 외과적 교정에 의해 생성된 손상된 피부에 적용된다.
본 발명의 측면은 화상 손상에 의해 유발된 손상된 피부에 적용될 수 있다. 화상 손상에 반응하여 이루어지는 치유는 비대성 반흔의 형성을 포함한 유해한 반흔형성을 발생시킬 수 있다. 본 발명과 연관된 방법은 상피 층에 대한 훼손, 예컨대 상피가 훼손된 피부에 대한 손상을 수반하는 모든 손상의 치료에 적용될 수 있다. 상피 조직에 대한 손상의 다른 비제한적 예는 호흡기 상피, 소화기 상피, 또는 내부 조직 또는 기관 주위의 상피를 수반하는 손상을 포함한다.
간 섬유증을 치료하기 위한 RNAi
일부 실시양태에서, 본 발명과 연관된 방법을 사용하여 간 섬유증을 치료한다. 간 섬유증은 콜라겐을 포함한 세포외 매트릭스 단백질의 과도한 축적이며, 대부분의 유형의 만성 간 질환에서 일어난다. 이는 손상에 대한 간의 반응을 나타내는 반흔형성 과정이다. 진행성 간 섬유증은 간경변증, 간부전 및 문맥 고혈압을 야기하며, 종종 간 이식을 필요로 한다. 피부 및 다른 기관이 콜라겐 및 다른 매트릭스 구성성분의 침착을 통해 상처를 치유하는 것과 동일한 방식으로, 간은 새로운 콜라겐의 침착을 통해 손상을 복구한다. 골수 기원의 활성화된 간 성상 세포, 문맥 섬유모세포 및 근섬유모세포는 손상된 간에서의 주요 콜라겐-생성 세포인 것으로 확인된 바 있다. 이들 세포는 섬유발생 시토카인, 예컨대 TGF-β1, 안지오텐신 II 및 렙틴에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법은 섬유발생 세포의 축적의 억제 및/또는 세포외 매트릭스 단백질의 침착의 예방을 목적으로 한다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되고, 이는 어떠한 방식으로든 추가로 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌 (문헌 참고문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시 계류 특허 출원 포함)의 전체 내용은 명백하게 본원에 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: MMP1-표적화 sd-rxRNA의 확인
MMP1을 표적화하는 sd-rxRNA를 설계하고, 합성하고, 시험관내 스크리닝하여, sd-rxRNA가 표적 유전자 mRNA 수준을 감소시키는 능력을 결정하였다. sd-rxRNA를 HT-1080 세포 (인간 섬유육종 세포주, 10,000개 세포/웰, 96 웰 플레이트)에서 활성에 대해 시험하였다. HT-1080 세포를 무혈청 배지에서 다양한 농도의 MMP1-표적화 sd-rxRNA 또는 비-표적화 대조군 (NTC) 패널로 처리하였다. 시험된 농도는 1 및 0.1 μM이었다. 비-표적화 대조군 sd-rxRNA (NTC)는 MMP1-표적화 sd-rxRNA와 유사한 구조를 갖고, 둘 다의 가닥에 걸쳐 유사한 안정화 변형을 함유한다. 투여 48시간 후, 세포를 용해시키고, 유전자-특이적 프로브 (아피메트릭스(Affymetrix))를 사용하여 퀀티진(Quantigene) 분지형 DNA 검정에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 mRNA 수준을 결정하였다. 도 1a-1c는 표 1 및 2에서 발견되는 MMP1-표적화 sd-rxRNA가 HT-1080 세포에서 시험관내 표적 유전자 mRNA 수준을 유의하게 감소시킨다는 것을 입증한다. 데이터를 하우스 키핑 유전자 (PPIB)에 대해 정규화하고, 비-표적화 대조군과 관련하여 그래프화하였다. 오차 막대는 생물학적 삼중값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
인간 MMP1 서열은 하기 열거된 진뱅크 수탁 번호 NM_002421.3에 의해 나타내어진다:
Figure 112023023085625-pat00042
Figure 112023023085625-pat00043
표 1: MMP1 센스 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure 112023023085625-pat00044
Figure 112023023085625-pat00045
o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸; Chl: 콜레스테롤.
표 2: MMP1 안티센스 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure 112023023085625-pat00046
Figure 112023023085625-pat00047
Figure 112023023085625-pat00048
o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸.
실시예 2: HT-1080 세포에서의 MMP1 표적화 sd-rxRNA의 용량 반응 분석
MMP1-표적화 sd-rxRNA를 시험관내 용량 반응 연구에서 시험하였다. sd-rxRNA를 HT-1080 세포 (인간 섬유육종 세포주, 10,000개 세포/웰, 96 웰 플레이트)에서 활성에 대해 시험하였다. HT-1080 세포를 무혈청 배지에서 다양한 농도의 MMP1-표적화 sd-rxRNA 또는 비-표적화 대조군 (NTC)으로 처리하였다. 시험된 농도는 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.025 및 0.01 μM이었다. 비-표적화 대조군 sd-rxRNA (NTC)는 MMP1-표적화 sd-rxRNA와 유사한 구조를 갖고, 둘 다의 가닥에 걸쳐 유사한 안정화 변형을 함유한다. 투여 48시간 후, 세포를 용해시키고, 유전자-특이적 프로브 (아피메트릭스)를 사용하여 퀀티진 분지형 DNA 검정에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 mRNA 수준을 결정하였다. 도 2a-2b는 HT-1080 세포에서 시험관내 리드 MMP1-표적화 sd-rxRNA의 용량 반응 분석을 입증한다. 데이터를 하우스 키핑 유전자 (PPIB)에 대해 정규화하고, 비-표적화 대조군과 관련하여 그래프화하였다. 오차 막대는 생물학적 삼중값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
실시예 3: TYR-표적화 sd-rxRNA의 확인
TYR을 표적화하는 sd-rxRNA를 설계하고, 합성하고, 시험관내 스크리닝하여, sd-rxRNA가 표적 유전자 mRNA 수준을 감소시키는 능력을 결정하였다. sd-rxRNA를 SK-MEL-5 세포 (인간 흑색종 세포주, 10,000개 세포/웰, 96 웰 플레이트)에서 활성에 대해 시험하였다. SK-MEL-5 세포를 무혈청 배지에서 다양한 농도의 TYR-표적화 sd-rxRNA 또는 비-표적화 대조군 (NTC) 패널로 처리하였다. 시험된 농도는 1 및 0.1 μM이었다. 비-표적화 대조군 sd-rxRNA (NTC)는 TYR-표적화 sd-rxRNA와 유사한 구조를 갖고, 둘 다의 가닥에 걸쳐 유사한 안정화 변형을 함유한다. 투여 48시간 후, 세포를 용해시키고, 유전자-특이적 택맨 프로브 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))를 사용하여 qPCR에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 mRNA 수준을 결정하였다. 도 3은 표 3 및 4에서 발견되는 TYR-표적화 sd-rxRNA가 SK-MEL-5 세포에서 시험관내 표적 유전자 mRNA 수준을 유의하게 감소시킨다는 것을 입증한다. 데이터를 하우스 키핑 유전자 (PPIB)에 대해 정규화하고, 비-표적화 대조군과 관련하여 그래프화하였다. 오차 막대는 생물학적 이중값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
인간 TYR 서열은 하기 열거된 진뱅크 수탁 번호 NM_000372.4에 의해 나타내어진다:
Figure 112023023085625-pat00049
Figure 112023023085625-pat00050
표 3: TYR 센스 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure 112023023085625-pat00051
Figure 112023023085625-pat00052
o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸; Chl: 콜레스테롤.
표 4: TYR 안티센스 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure 112023023085625-pat00053
Figure 112023023085625-pat00054
Figure 112023023085625-pat00055
Figure 112023023085625-pat00056
o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸.
실시예 4: SK-MEL-5 세포에서의 MMP1 표적화 sd-rxRNA의 용량 반응 분석
TYR-표적화 sd-rxRNA를 시험관내 용량 반응 연구에서 시험하였다. sd-rxRNA를 SK-MEL-5 세포 (인간 흑색종 세포주, 10,000개 세포/웰, 96 웰 플레이트)에서 활성에 대해 시험하였다. SK-MEL-5 세포를 무혈청 배지에서 다양한 농도의 TYR-표적화 sd-rxRNA 또는 비-표적화 대조군 (NTC) 패널로 처리하였다. 시험된 농도는 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.05 및 0.01 μM이었다. 비-표적화 대조군 sd-rxRNA (NTC)는 TYR-표적화 sd-rxRNA와 유사한 구조를 갖고, 둘 다의 가닥에 걸쳐 유사한 안정화 변형을 함유한다. 투여 48시간 후, 세포를 용해시키고, 유전자-특이적 택맨 프로브 (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 qPCR에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 mRNA 수준을 결정하였다. 도 4는 SK-MEL-5 세포에서 시험관내 리드 TYR-표적화 sd-rxRNA의 용량 반응 분석을 입증한다. 데이터를 하우스 키핑 유전자 (PPIB)에 대해 정규화하고, 비-표적화 대조군과 관련하여 그래프화하였다. 오차 막대는 생물학적 삼중값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
실시예 5: 최적화된 MMP1 및 TYR 표적화 sd-rxRNA의 용량 반응 분석
원래의 및 최적화된 MMP1-표적화 sd-rxRNA (최적화된 서열은 표 5 및 6에 제시됨)를 시험관내 용량 반응 연구에서 시험하였다. sd-rxRNA를 HT-1080 세포 (인간 섬유육종 세포주, 10,000개 세포/웰, 96 웰 플레이트)에서 활성에 대해 시험하였다. HT-1080 세포를 무혈청 배지에서 다양한 농도의 MMP1-표적화 sd-rxRNA 또는 비-표적화 대조군 (#21803)으로 처리하였다. 시험된 농도는 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.025 및 0.01 μM이었다. 비-표적화 대조군 sd-rxRNA (#21803)는 MMP1-표적화 sd-rxRNA와 유사한 구조를 갖고, 둘 다의 가닥에 걸쳐 유사한 안정화 변형을 함유한다. 투여 48시간 후, 세포를 용해시키고, 유전자-특이적 프로브 (아피메트릭스, 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하여 퀀티진 분지형 DNA 검정에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 mRNA 수준을 결정하였다. 도 5a는 HT-1080 세포에서 시험관내 리드 MMP1-표적화 sd-rxRNA의 용량 반응 분석을 입증한다. 데이터를 하우스 키핑 유전자 (TBP)에 대해 정규화하고, 비-표적화 대조군과 관련하여 그래프화하였다. 오차 막대는 생물학적 삼중값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
원래의 및 최적화된 TYR-표적화 sd-rxRNA (최적화된 서열은 표 7 및 8에 제시됨)를 시험관내 용량 반응 연구에서 시험하였다. sd-rxRNA를 SK-MEL-5 세포 (인간 흑색종 세포주, 10,000개 세포/웰, 96 웰 플레이트)에서 활성에 대해 시험하였다. SK-MEL-5 세포를 무혈청 배지에서 다양한 농도의 TYR-표적화 sd-rxRNA 또는 비-표적화 대조군 (#21803) 패널로 처리하였다. 시험된 농도는 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.05 및 0.01 μM이었다. 비-표적화 대조군 sd-rxRNA (#21803)는 TYR-표적화 sd-rxRNA와 유사한 구조를 갖고, 둘 다의 가닥에 걸쳐 유사한 안정화 변형을 함유한다. 투여 48시간 후, 세포를 용해시키고, 유전자-특이적 택맨 프로브 (어플라이드 바이오시스템즈, 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 qPCR에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 mRNA 수준을 결정하였다. 도 5b는 SK-MEL-5 세포에서 시험관내 리드 TYR-표적화 sd-rxRNA의 용량 반응 분석을 입증한다. 데이터를 하우스 키핑 유전자 (PPIB)에 대해 정규화하고, 비-표적화 대조군과 관련하여 그래프화하였다. 오차 막대는 생물학적 삼중값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
표 5: 최적화된 MMP-1 센스 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure 112023023085625-pat00057
Figure 112023023085625-pat00058
Figure 112023023085625-pat00059
o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸. X = 5 메틸 C 및 Y = 5 메틸 U
표 6: 최적화된 MMP-1 안티센스 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure 112023023085625-pat00060
Figure 112023023085625-pat00061
o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸. X = 5 메틸 C 및 Y = 5 메틸 U
표 7: 최적화된 TYR 센스 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure 112023023085625-pat00062
Figure 112023023085625-pat00063
Figure 112023023085625-pat00064
o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸. X = 5 메틸 C 및 Y = 5 메틸 U
표 8: 최적화된 TYR 안티센스 가닥 올리고뉴클레오티드
Figure 112023023085625-pat00065
Figure 112023023085625-pat00066
Figure 112023023085625-pat00067
o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸. X = 5 메틸 C 및 Y = 5 메틸 U
실시예 6: HT-1080 세포에서 티로시나제 농도에 대한 MMP1 표적화 sd-rxRNA의 용량 반응 효과
티로시나제 단백질 발현에 대한 MMP1-표적화 sd-rxRNA의 효과를 시험관내 용량 반응 연구에서 시험하였다. sd-rxRNA를 HT-1080 세포 (인간 섬유육종 세포주, 100,000개 세포/웰, 96 웰 플레이트)에서 활성에 대해 시험하였다. HT-1080 세포를 무혈청 배지에서 다양한 농도의 MMP1-표적화 sd-rxRNA 또는 비-표적화 대조군 (#21803)으로 처리하였다. 시험된 농도는 1, 0.5, 및 0.1μM이었다. 비-표적화 대조군 sd-rxRNA (#21803)는 MMP1-표적화 sd-rxRNA와 유사한 구조를 갖고, 둘 다의 가닥에 걸쳐 유사한 안정화 변형을 함유한다. 투여 72시간 후, 세포로부터 조건화 배지를 수집하고, 풀링하고, 농축시키고, 센소라이트(SensoLyte)® 플러스 520 MMP-1 검정 키트, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행되는 악템라 효소 검정 (아나스펙(AnaSpec), 캘리포니아주 프리몬트)을 사용하여 단백질 수준을 결정하였다. 도 6은 HT-1080 세포에서 시험관내 MMP1-표적화 sd-rxRNA에 의한 처리 후의 MMP-1 농도에서의 용량 반응 감소를 입증한다. 농도는 표준 곡선을 기반으로 하여 계산하였고, 비-표적화 대조군과 관련하여 정규화 및 그래프화하였다. 오차 막대는 기술적 이중값의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
실시예 7: MMP1 표적화 sd-rxRNA로 처리된 세포는 비처리 또는 NTC 처리된 세포와 비교하여 더 느린 속도로 이동하였다
스크래치 상처 치유 검정에서 A549 (비소세포 폐암) 세포가 이동한 거리를 측정하였다 (도 7a 및 7b). A549 세포를 MMP1-표적화 sd-rxRNA로 형질감염시키고 (100,000개 세포/웰, 24 웰 PLL 코팅 플레이트) 48시간 후에 스크래치 상처를 생성하였다. MMP1-표적화 또는 비-표적화 대조군 sd-rxRNA에 의한 A549 세포의 형질감염 (100,000개 세포/웰, 24 웰 PLL 코팅 플레이트) 48시간 후, 200 uL 피펫 팁을 사용하여 웰의 중심을 가로질러 단층을 통과하여 스크래치 상처를 만들었다. 초기 스크래치를 만든 후 및 스크래치 후 24시간 및 48시간째에 세포를 관찰하고 영상화하였다. 스크래치의 폭을 스팟 어드밴스드 이미징 소프트웨어 (스팟 이미징 솔루션즈(Spot Imaging Solutions), 미시간주 스털링 헤이츠)를 사용하여 계산하였다. 세포 이동의 거리는 시점 0에 스크래치의 평균 폭으로부터 주어진 시점에서의 스크래치의 평균 폭을 차감하여 계산하였다. 도 7b에서 오차 막대는 생물학적 삼중값 (영상당 3개의 측정치, 스크래치당 3개의 영상, 처리당 3개의 웰)의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다.
실시예 8: 3차원 표피 모델에서 TYR-표적화 sd-rxRNA 화합물은 색소침착에서의 시각적 감소를 발생시킨다
제조업체의 프로토콜에 따라 격일마다 배지 교체하는 14일 동안, 배양 배지에서 멜라노덤™ (매트텍(MatTek)) 조직을 최적화된 sd-rxRNA 화합물 5uM로 처리하였다. 14일 후, 광 현미경검사를 사용하여 조직을 시각화한 다음, 포르말린 고정하고, 파라핀 포매하였다 (도 8). 횡단면을 절단하고, 폰타나-마송 염색을 수행하여 멜라닌을 확인하였다 (도 8). TYR 표적화 sd-rxRNA로 처리된 조직은 표피의 구조는 유지하는 한편 조직에서 보다 소수의 멜라닌세포 및 더 적은 멜라닌을 가졌다.
등가물
관련 기술분야의 통상의 기술자는 상용 실험을 초과하지 않는 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 실시양태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
특허 문서를 포함한 본원에 개시된 모든 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 본 출원은 2009년 9월 22일에 출원된 표제 "REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS"의 PCT 공개 번호 WO2010/033247 (출원 번호 PCT/US2009/005247), 2012년 2월 16일에 US 2012/0040459로서 공개되고 2014년 8월 5일에 허여된 표제 "REDUCED SIZE SELF-DELIVERING RNAI COMPOUNDS"의 미국 특허 번호 8,796,443, 2009년 2월 11일에 출원된 표제 "MODIFIED RNAI POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF"의 PCT 공개 번호 WO2009/102427 (출원 번호 PCT/US2009/000852) 및 2011년 2월 17일에 공개된 표제 "MODIFIED RNAI POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF"의 미국 특허 공개 번호 2011/0039914, 2011년 3월 24일에 출원된 표제 RNA INTERFERENCE IN DERMAL AND FIBROTIC INDICATIONS의 PCT 공개 번호 WO 2011/119887 (출원 번호 PCT/US2011/029867), 및 2011년 9월 29일에 US 2011/0237648로서 공개되고 2014년 3월 4일에 허여된 표제 "RNA INTERFERENCE IN DERMAL AND FIBROTIC INDICATIONS"의 미국 특허 번호 8,664,189의 모든 도면 및 명세서의 모든 부분 (서열 목록 또는 아미노산 / 폴리뉴클레오티드 서열 포함)을 포함한 그 전체 내용을 참조로 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> RXi Pharmaceuticals Corporation <120> METHODS FOR TREATING AGING AND SKIN DISORDERS USING NUCLEIC ACIDS TARGETING TYR OR MMP1 <130> R0659.70026WO00 <150> US 62/102,287 <151> 2015-01-12 <150> US 62/047,972 <151> 2014-09-09 <150> US 62/046,523 <151> 2014-09-05 <160> 302 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2081 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agcatgagtc agacagcctc tggctttctg gaagggcaag gactctatat atacagaggg 60 agcttcctag ctgggatatt ggagcagcaa gaggctggga agccatcact taccttgcac 120 tgagaaagaa gacaaaggcc agtatgcaca gctttcctcc actgctgctg ctgctgttct 180 ggggtgtggt gtctcacagc ttcccagcga ctctagaaac acaagagcaa gatgtggact 240 tagtccagaa atacctggaa aaatactaca acctgaagaa tgatgggagg caagttgaaa 300 agcggagaaa tagtggccca gtggttgaaa aattgaagca aatgcaggaa ttctttgggc 360 tgaaagtgac tgggaaacca gatgctgaaa ccctgaaggt gatgaagcag cccagatgtg 420 gagtgcctga tgtggctcag tttgtcctca ctgaggggaa ccctcgctgg gagcaaacac 480 atctgaccta caggattgaa aattacacgc cagatttgcc aagagcagat gtggaccatg 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ctgtgtctcc tctaagaacc tgatggagaa 180 ggaatgctgt ccaccgtgga gcggggacag gagtccctgt ggccagcttt caggcagagg 240 ttcctgtcag aatatccttc tgtccaatgc accacttggg cctcaatttc ccttcacagg 300 ggtggatgac cgggagtcgt ggccttccgt cttttataat aggacctgcc agtgctctgg 360 caacttcatg ggattcaact gtggaaactg caagtttggc ttttggggac caaactgcac 420 agagagacga ctcttggtga gaagaaacat cttcgatttg agtgccccag agaaggacaa 480 attttttgcc tacctcactt tagcaaagca taccatcagc tcagactatg tcatccccat 540 agggacctat ggccaaatga aaaatggatc aacacccatg tttaacgaca tcaatattta 600 tgacctcttt gtctggatgc attattatgt gtcaatggat gcactgcttg ggggatctga 660 aatctggaga gacattgatt ttgcccatga agcaccagct tttctgcctt ggcatagact 720 cttcttgttg cggtgggaac aagaaatcca gaagctgaca ggagatgaaa acttcactat 780 tccatattgg gactggcggg atgcagaaaa gtgtgacatt tgcacagatg agtacatggg 840 aggtcagcac cccacaaatc ctaacttact cagcccagca tcattcttct cctcttggca 900 gattgtctgt agccgattgg aggagtacaa cagccatcag tctttatgca atggaacgcc 960 cgagggacct ttacggcgta atcctggaaa ccatgacaaa tccagaaccc caaggctccc 1020 ctcttcagct gatgtagaat tttgcctgag tttgacccaa tatgaatctg gttccatgga 1080 taaagctgcc aatttcagct ttagaaatac actggaagga tttgctagtc cacttactgg 1140 gatagcggat gcctctcaaa gcagcatgca caatgccttg cacatctata tgaatggaac 1200 aatgtcccag gtacagggat ctgccaacga tcctatcttc cttcttcacc atgcatttgt 1260 tgacagtatt tttgagcagt ggctccgaag gcaccgtcct cttcaagaag tttatccaga 1320 agccaatgca cccattggac ataaccggga atcctacatg gttcctttta taccactgta 1380 cagaaatggt gatttcttta tttcatccaa agatctgggc tatgactata gctatctaca 1440 agattcagac ccagactctt ttcaagacta cattaagtcc tatttggaac aagcgagtcg 1500 gatctggtca tggctccttg gggcggcgat ggtaggggcc gtcctcactg ccctgctggc 1560 agggcttgtg agcttgctgt gtcgtcacaa gagaaagcag cttcctgaag aaaagcagcc 1620 actcctcatg gagaaagagg attaccacag cttgtatcag agccatttat aaaaggctta 1680 ggcaatagag tagggccaaa aagcctgacc tcactctaac tcaaagtaat gtccaggttc 1740 ccagagaata tctgctggta tttttctgta aagaccattt gcaaaattgt aacctaatac 1800 aaagtgtagc cttcttccaa ctcaggtaga acacacctgt ctttgtcttg ctgttttcac 1860 tcagcccttt taacattttc ccctaagccc atatgtctaa ggaaaggatg ctatttggta 1920 atgaggaact gttatttgta tgtgaattaa agtgctctta ttttaaaaaa ttgaaataat 1980 tttgattttt gccttctgat tatttaaaga tctatatatg ttttattggc cccttcttta 2040 ttttaataaa acagtgagaa atctaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2082 <210> 85 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 85 uauaauagga cca 13 <210> 86 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 86 auaauaggac cua 13 <210> 87 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 87 uaauaggacc uga 13 <210> 88 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 88 ucacuuuagc aaa 13 <210> 89 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 89 cacuuuagca aaa 13 <210> 90 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 90 uggccaaaug aaa 13 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Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 124 cagagccauu uaa 13 <210> 125 <211> 13 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 125 agagccauuu aua 13 <210> 126 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 126 ugguccuauu auaaaagac 19 <210> 127 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 127 uagguccuau uauaaaaga 19 <210> 128 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 128 ucagguccua uuauaaaag 19 <210> 129 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 129 uuugcuaaag ugagguagg 19 <210> 130 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 130 uuuugcuaaa gugagguag 19 <210> 131 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 131 uuucauuugg ccauagguc 19 <210> 132 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial 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<222> (4)..(4) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (9)..(9) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5 methyl U <400> 284 nannnannng ngnaaangu 19 <210> 285 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 285 uacucaucug ugcaaaugu 19 <210> 286 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 286 uacucaucug ugcaaaugu 19 <210> 287 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 287 uccaagagga gaagaauga 19 <210> 288 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 288 uccaagagga gaagaauga 19 <210> 289 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5 methyl U <400> 289 nnnaagagga gaagaanga 19 <210> 290 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5 methyl U <400> 290 nnnaagagga gaagaanga 19 <210> 291 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 291 uccaagagga gaagaauga 19 <210> 292 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 292 ucuagcaaau ccuuccagu 19 <210> 293 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 293 ucuagcaaau ccuuccagu 19 <210> 294 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is 5 methyl C <400> 294 nnnagnaaan nnnnnnagu 19 <210> 295 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (15)..(16) <223> n is 5 methyl C <400> 295 nnnagnaaan nnnnnnagu 19 <210> 296 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 296 ucuagcaaau ccuuccagu 19 <210> 297 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 297 uauuguucca uucauauag 19 <210> 298 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 298 uauuguucca uucauauag 19 <210> 299 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5 methyl U <400> 299 nanngnnnna nnnananag 19 <210> 300 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (6)..(7) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (11)..(12) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n is 5 methyl C <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n is 5 methyl U <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> n is 5 methyl U <400> 300 nanngnnnna nnnananag 19 <210> 301 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 301 uauuguucca uucauauag 19 <210> 302 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 302 uauuguucca uucauauag 19

Claims (58)

  1. (i) 서열식별번호: 37, 38, 78 및 79로부터 선택된 서열의 적어도 12개의 인접 뉴클레오티드를 포함하거나; 또는
    (ii) 서열식별번호: 37, 38, 78 및 79로부터 선택된 서열을 포함하는,
    화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자이며,
    화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자는 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역을 포함하고, 이중 가닥인 분자의 영역은 8 내지 15개의 뉴클레오티드 길이이고, 가이드 가닥은 4 내지 12개의 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 영역을 함유하고, 가이드 가닥의 단일 가닥 영역은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 포스포로티오에이트 변형을 함유하고, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자의 뉴클레오티드의 적어도 40%는 변형된 것인, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자.
  2. 제1항에 있어서, 핵산 분자가 MMP1-35 및 MMP1-36으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자.
  3. (i) 서열식별번호: 186 및 215로부터 선택되거나; 또는
    (ii) 서열식별번호: 186 및 215로부터 선택된 서열의 적어도 12개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는,
    화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자이며,
    화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자는 이중 가닥 영역 및 단일 가닥 영역을 포함하고, 이중 가닥인 분자의 영역은 8 내지 15개의 뉴클레오티드 길이이고, 가이드 가닥은 4 내지 12개의 뉴클레오티드 길이의 단일 가닥 영역을 함유하고, 가이드 가닥의 단일 가닥 영역은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 포스포로티오에이트 변형을 함유하고, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자의 뉴클레오티드의 적어도 40%는 변형된 것인, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 소수성으로 변형되거나, 하나 이상의 소수성 접합체에 연결되거나, 또는 소수성으로 변형되고 하나 이상의 소수성 접합체에 연결되는, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자.
  5. 제3항에 있어서, MMP-1에 대해 지시된 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자이며, 여기서 센스 가닥은 표 5에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 186의 서열이고, 안티센스 가닥은 표 6에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 215의 서열인 것인, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자:
    표 5: 최적화된 MMP-1 센스 가닥 올리고뉴클레오티드



    o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸. X = 5 메틸 C 및 Y = 5 메틸 U
    표 6: 최적화된 MMP-1 안티센스 가닥 올리고뉴클레오티드


    o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸. X = 5 메틸 C 및 Y = 5 메틸 U.
  6. 제4항에 있어서, MMP-1에 대해 지시된 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자이며, 여기서 센스 가닥은 표 5에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 186의 서열이고, 안티센스 가닥은 표 6에 제시된 변형을 포함하는 서열식별번호: 215의 서열인 것인, 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자:
    표 5: 최적화된 MMP-1 센스 가닥 올리고뉴클레오티드
    Figure 112024044031260-pat00082



    o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸. X = 5 메틸 C 및 Y = 5 메틸 U;
    표 6: 최적화된 MMP-1 안티센스 가닥 올리고뉴클레오티드


    o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸. X = 5 메틸 C 및 Y = 5 메틸 U.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자를 포함하는, 피부 장애를 치료하는데 사용하기 위한 조성물이며, 여기서 핵산 분자는 치료 유효량으로 투여되는 것인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 피부 장애가 피부 광 노화, 여드름 반흔형성, 피부 과다색소침착, 기미, 피부 흑색점, 만성 궤양, 괴저, 수포성 피부 장애 또는 켈로이드인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 만성 궤양이 정맥 궤양을 포함하거나, 괴저가 비브리오 또는 클로스트리디움을 포함하거나, 또는 수포성 피부 장애가 스티븐스-존슨을 포함하는 것인, 조성물.
  10. 제7항에 있어서,
    (i) 국소 전달을 위해 제제화되거나;
    (ii) 피부 전달을 위해 제제화되거나;
    (iii) 피내 주사를 위해 제제화되거나; 또는
    (iv) 피내 주사 후 분자의 연장 방출을 위해 제제화되는
    조성물.
  11. 제7항에 있어서, 핵산 분자가 뉴클레오티드로 구성되고, 뉴클레오티드의 적어도 1개가 2'OMe 또는 2'플루오로로부터 선택되는 2' 화학적 변형을 함유하는 것인 조성물.
  12. 제7항에 있어서, 핵산 분자가 표 1 및 표 2에 제시된 바와 같은 MMP1-35 및 MMP1-36으로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 조성물:
    표 1: MMP1 센스 가닥 올리고뉴클레오티드


    o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸; Chl: 콜레스테롤;
    표 2: MMP1 안티센스 가닥 올리고뉴클레오티드



    o: 포스포디에스테르; s: 포스포로티오에이트; P: 5' 인산화; 0: 2'-OH; f: 2'-플루오로; m: 2' O-메틸.
  13. 제7항에 있어서, 핵산 분자가 소수성으로 변형되거나, 하나 이상의 소수성 접합체에 연결되거나, 또는 소수성으로 변형되고 하나 이상의 소수성 접합체에 연결된 것인, 조성물.
  14. 제3항의 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자를 포함하는, 결핵, 관절염, 각막 미란, 치주염, 자궁내막암 또는 자궁내막증을 치료하는데 사용하기 위한 조성물이며, 여기서 핵산 분자는 치료 유효량으로 투여되는 것인, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 관절염이 골관절염 또는 류마티스 관절염인, 조성물.
  16. 제14항에 있어서, 단리된 이중 가닥 핵산 분자가 단리된 이중 가닥 핵산 분자에 부착된 소수성 접합체를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  17. 제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  18. 제4항의 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자를 포함하는 조성물.
  19. 제6항의 화학적으로 변형된 이중 가닥 핵산 분자를 포함하는 조성물.
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