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JP4635046B2 - 哺乳類の細胞における遺伝子発現を調節するための、二本鎖ｒｎａまたは二本鎖ハイブリッド核酸の送達を増強するための方法および組成物 - Google Patents

哺乳類の細胞における遺伝子発現を調節するための、二本鎖ｒｎａまたは二本鎖ハイブリッド核酸の送達を増強するための方法および組成物 Download PDF

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Description

ＲＮＡ干渉は、標的ｍＲＮＡの一部分と配列の相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＤＮＡ）により惹起される、細胞における配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングの過程である。ｄｓＲＮＡの細胞内への導入は、このｄｓＲＮＡと同じ配列を共有する内在するＲＮＡの破壊をもたらす。ｄｓＲＮＡ分子は、ダイサーと呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩファミリーのヌクレアーゼにより、１９−２３ヌクレオチド（ｎｔ）長である短い干渉(short-interfering)ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に開裂される。ｓｉＲＮＡは多成分のヌクレアーゼコンプレックス（ＲＩＳＣ、ＲＮＡ誘発型サイレンシングコンプレックス(RNA-induced silencing complex)中に組み込まれ、このコンプレックスがｍＲＮＡとｓｉＲＮＡとの相同性により基質のｍＲＮＡを同定し、結合し、標的ｍＲＮＡを破壊する。哺乳類の細胞において、３０塩基対より長いｄｓＲＮＡは、通常インターフェロンにより誘発されるｄｓＲＮＡ依存性キナーゼであるＰＫＲ、および２’−５’−オリゴアデニレート合成酵素を活性化し得る。合成ｓｉＲＮＡはその小さなサイズのために、インターフェロンの応答の活性化を回避している。活性化されたＰＫＲは、翻訳因子である真核生物の開始因子２α（ｅＩＦ２α）のリン酸化により全般的な翻訳を阻害し、一方２’−５’−オリゴアデニレート合成酵素はＲＮａｓｅＬの活性化を介して、非特異的なｍＲＮＡの分解を引き起こす。
長いｄｓＲＮＡの非特異的な効果とは対照的に、ｓｉＲＮＡは哺乳類のシステムにおいて選択的な遺伝子サイレンシングを仲介することができる。短いループおよび１９から２７塩基対のステム構造を有するヘアピンＲＮＡもまた、二本鎖ステムの配列と相同である遺伝子の発現を選択的にサイレンシングする。哺乳類の細胞は、短いヘアピンＲＮＡをｓｉＲＮＡに変換して、選択的な遺伝子サイレンシングを仲介することができる。
ＲＩＳＣは、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な配列を有する一本鎖ＲＮＡの開裂を仲介する。標的ＲＮＡの開裂は、ｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖に相補的な領域の中央部で起こる。
複数の研究から、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二本鎖は、２ヌクレオチドの３’ 突出型を含有する時に最も活性であることが示された。さらにｓｉＲＮＡ鎖の一方または双方を、２’−デオキシ（２’−Ｈ）ヌクレオチドまたは２’−Ｏ−メチルヌクレオチドで完全に置換すると、ＲＮＡｉ活性が完全に失われるのに対して、３’ 末端ｓｉＲＮＡの突出するヌクレオチドのデオキシヌクレオチド（２’−Ｈ）での置換は、許容されることが示された。
複数の研究から、２ヌクレオチドの３’ 突出を有する２１マーのｓｉＲＮＡ二本鎖の３’ 突出部分の、デオキシリボヌクレオチドでの置換は、ＲＮＡｉ活性へのマイナスの効果を持たないことが示された。デオキシリボヌクレオチドによるｓｉＲＮＡの各末端上の４ヌクレオチドまでの置換は充分に許容されるのに対して、デオキシリボヌクレオチドによる完全な置換は、ＲＮＡｉの不活性化に至ることが報告された。
ＲＮＡ干渉は、特異的な遺伝子産物の発現を低減するための有望な手段として明らかになってきており、そのためウイルス感染、癌、自己免疫疾患、およびｍＲＮＡ発現のダウンレギュレーションによる治療を受け入れられるその他の疾患および状態を治療するための治療薬の開発に有用であると思われる。しかし、特異的な組織および細胞を標的とする治療に関するものを含む、治療ツールとしてのｓｉＲＮＡをデザイン、生成、製剤化、送達、および使用するためのさらなるツールおよび方法に関する当該分野における重要な必要性は残されたままである。
発明の例示としての態様の説明
本発明は、コレステロール部分と複合体化した二本鎖核酸を提供して、選択された標的細胞または組織内への核酸の送達を促進することによりこれらの必要性を満たし、さらなる目的および利点をも満足させる。特に本発明は、哺乳動物の所望の組織内への二本鎖ＲＮＡのトランスフェクションが行われるように、哺乳動物に二本鎖リボ核酸を投与するための方法および組成物に照準を合わせている。ある種の態様において、二本鎖ＲＮＡは３０またはそれより少ないヌクレオチドを有し、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。
ｓｉＲＮＡのセンス鎖および/またはアンチセンス鎖の選択された末端で、ｓｉＲＮＡにコレステロール部分を選択的に複合体化することで、標的ｍＲＮＡのサイレンシングを増加することが、驚くことに発見された。例えば以下のｓｉＲＮＡ/コレステロール部分のコンストラクト：
１．センス鎖の５’ 末端およびアンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そして他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
２．アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
３．センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
４．センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
５．センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；および
６．アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト
は、複合体化したコレステロールを有していないｓｉＲＮＡと比較して、標的ｍＲＮＡのサイレンシング効果を増加する。
このように上に列記したコンストラクト、並びに、ｄｓ核酸がセンス鎖がＤＮＡ分子であるｓｉハイブリッド（ｓｉＨｙｂｒｉｄ）であるコンストラクトも、本発明の態様である。
以下のコンストラクト：
１．センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
２．アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
３．センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
４．センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
５．センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてセンス鎖の３’ 末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
６．センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてアンチセンス鎖の５’ 末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
７．センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてアンチセンス鎖の３’ 末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
８．センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてセンス鎖の５’ 末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクト；
９．センス鎖の５’ 末端の１つのコレステロール部分、センス鎖の３’ 末端の１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端の１つのコレステロール部分、そしてアンチセンス鎖の５’ 末端の１つのコレステロールを有するｓｉＲＮＡコンストラクト
は、その末端のいずれにも連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡと比較して、標的ｍＲＮＡのサイレンシングが順次減少することを示した。
（定義）
本明細書において使用する場合“逆方向反復”という用語は、反復が転写される場合にセンスエレメントおよびアンチセンスエレメントが二本鎖ｓｉＲＮＡを形成することができるように位置した、それらエレメントを包含する１つの核酸配列をいう。逆方向反復は所望により、反復の２つのエレメントの間にリンカーまたは非相同な配列、例えば自ら開裂するリボザイムを含んでもよい。逆方向反復のエレメントは、二本鎖ＲＮＡを形成するのに十分な長さを有する。典型的には逆方向反復の各エレメントは、約１５から約１００ヌクレオチド長、好ましくは約２０−３０塩基のヌクレオチド、好ましくは約２０−２５ヌクレオチド長、例えば２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。
“サイレンシング”は、細胞内の標的とした遺伝子発現の阻害を通しての部分的または完全な機能の喪失をいい、“ノックダウン”といってもよい。検討する環境および生物学的問題に依存して、部分的に遺伝子発現を低減することが好ましいかもしれない。あるいはできる限り多くの遺伝子発現を低減することが、好ましいこともあるだろう。サイレンシングの程度は、当該分野において公知のいかなる方法により決定してもよく、それら方法のいくつかは、国際特許第ＷＯ９９/３２６１９号にまとめられている。アッセイに依存して、遺伝子発現の定量化は、阻害の様々な量、例えば１０％、３３％、５０％、９０％または９９％より大きいという検出を可能にする。
“標的遺伝子の発現を阻害すること”という表現は、標的遺伝子の遺伝子サイレンシングを惹起する本発明のｓｉＲＮＡの能力をいう。遺伝子サイレンシングの程度を調べるため、特定のコンストラクトを発現する培養中の対象有機体または細胞のサンプルまたはアッセイを、コンストラクトを発現しないコントロールのサンプルと比較する。コントロールのサンプル（コンストラクトを発現しない）を、相対値１００％とする。標的遺伝子の発現の阻害は、コントロールと比較しての検査値が、約９０％、好ましくは５０％、より好ましくは２５−０％である場合に達成される。適切なアッセイには、例えば当業者に公知の技術、例えばドットブロット、ノーザンブロット、in situハイブリダイゼーション、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降法、酵素機能法、ならびに当業者に公知の表現型のアッセイを用いての、タンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの検査を含む。
“核酸”は、一本鎖または二本鎖の形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。この用語は、合成された、天然に生成される、および天然には生成されない、基準の核酸と類似の結合特性を有する、そして基準のヌクレオチドと類似の様式で代謝される、公知のヌクレオチド類似体または修飾された骨格残基または連結を含有する核酸を包括的に含む。そのような類似体の例として非限定的に、ホスホロチオネート、ホスホロアミデート、ホスホン酸メチル、キラルのメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）を含む。
“大きな二本鎖ＲＮＡ”は、約４０塩基対（ｂｐ）より大きい、例えば１００ｂｐより大きい、またはより特定すれば３００ｂｐより大きいサイズを有するあらゆる二本鎖ＲＮＡをいう。大きなｄｓＲＮＡの配列は、ｍＲＮＡのセグメントまたはｍＲＮＡ全体を表してよい。大きなｄｓＲＮＡの最大のサイズは、本明細書においては限定されない。二本鎖ＲＮＡは、修飾がリン酸糖骨格またはヌクレオシドにあってよい修飾された塩基を含んでよい。そのような修飾は、窒素もしくはイオウのヘテロ原子、または当該分野において公知のあらゆる他の修飾を含んでよい。
二本鎖の構造は、ヘアピンＲＮＡまたはミクロＲＮＡについて起こるような自己相補的(self-complementary)ＲＮＡ鎖により、または２つの別個の相補的ＲＮＡ鎖のアニーリングにより形成されてよい。
“オーバーラップ”は、２つのＲＮＡフラグメントが、一本鎖上に複数のヌクレオチドが重複する配列を有する場合をいい、その場合複数のヌクレオチドの数は、２−５ヌクレオチド程度のわずかなもの、または５−１０ヌクレオチドだけまたはそれより多くである。
“１つまたはそれより多くのｄｓＲＮＡ”は、配列の塩基が互いに異なるｄｓＲＮＡをいう。
“標的遺伝子または標的ｍＲＮＡ”は、対象のあらゆる遺伝子またはｍＲＮＡをいう。遺伝学によりまたはシーケンシングにより予め同定されたいずれの遺伝子も標的とされ得る。標的遺伝子または標的ｍＲＮＡは、発生遺伝子および調節遺伝子、ならびに代謝遺伝子または構造遺伝子または酵素をコードする遺伝子を含むことができる。標的遺伝子は、表原型が調べられている細胞において、または表原型の特徴に直接的または間接的に影響を与える様式で有機体において発現されてよい。標的遺伝子は、内在するものでも外来のものでもよい。そのような細胞は、生殖体含む、成体または胎仔期もしくは胎生期の動物または植物の体内のあらゆる細胞、あるいは不死の細胞株もしくは初代細胞培養において産生されるようなあらゆる単離細胞を含む。
本明細書および添付の請求項において、“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”の単数形は、文脈で明確に他に記述していなければ複数の表示を含む。
“ｓｉＲＮＡ”は、哺乳類の細胞において毒性でない短い二本鎖ＲＮＡである、小さな干渉(small interfering)ＲＮＡを意味する。長さは２１から２３ｂｐ長に限定されない。毒性を示さない限り、ｓｉＲＮＡの長さにおいて特定の限定はない。“ｓｉＲＮＡ”は、例えば１５から４９ｂｐ、好ましくは１５から３５ｂｐ、そしてより好ましくは２１から３０ｂｐの長さであることができる。あるいは発現されるｓｉＲＮＡの最終的な転写産物の二本鎖ＲＮＡ部分は、例えば１５から４９ｂｐ、好ましくは１５から３５ｂｐ、そしてより好ましくは２１から３０ｂｐの長さであることができる。２本のＲＮＡ鎖がペアを組むｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ部分は、相補的なペアのものに限定されず、ミスマッチ（対応するヌクレオチドが相補的でない）、バルジ（一本鎖上の対応する相補的ヌクレオチドにおける欠損）等によるペアでない部分を含有してよい。ペアでない部分は、それらがｓｉＲＮＡの形成の妨げとならない程度まで含有することができる。本明細書において使用する “バルジ”は、好ましくは１から２のペアでないヌクレオチドを包含し、そして２本のＲＮＡ鎖がペアを組むｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域は、好ましくは１から７、より好ましくは１から５のバルジを含有する。加えて本明細書において使用する“ミスマッチ”は、２本のＲＮＡ鎖がペアを組むｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域に、好ましくは１から７、より好ましくは１から５個を含有する。好ましいミスマッチにおいて、ヌクレオチドの１つはグアニンであり、他はウラシルである。そのようなミスマッチは、センスＲＮＡをコードするＤＮＡにおけるＣからＴへ、ＧからＡへ、またはそれらの混合の変異によるが、特にそれらに限定されない。さらに本発明において、２本のＲＮＡ鎖がペアを組むｓｉＲＮＡの二本鎖ＲＮＡ領域は、バルジおよびミスマッチの双方を含有してよく、それらは合計して好ましくは１から７、より好ましくは１から５個である。
ｓｉＲＮＡの末端構造は、ｓｉＲＮＡがそのＲＮＡｉ効果により標的遺伝子の発現をサイレンシングすることができる限り、平滑または付着（突出）のいずれでもよい。付着（突出）末端の構造はTuschlら（同文献）により報告されたような３’ 突出型のみに限定されず、５’ 突出構造もそれがＲＮＡｉ効果を誘発することができる限り含めてよい。加えて、突出するヌクレオチドの数は、報告された２または３に限定されず、突出型がＲＮＡｉ効果を誘発することができる限りいかなる数であることもできる。例えば突出型は１から８、または２から４のヌクレオチドであってよい。本明細書において、付着末端構造を有するｓｉＲＮＡの全体の長さは、ペア形成する二本鎖部分の長さおよび両末端の突出している一本鎖を包含してのペアの長さの合計として表す。例えば１９ｂｐの二本鎖ＲＮＡ部分が両末端に４ヌクレオチドの突出を伴う場合、全体の長さは２３ｂｐとして表す。さらにこの突出配列は標的遺伝子に対して低い特異性を有するため、標的遺伝子配列に対して必ずしも相補的（アンチセンス）または同一（センス）でなくてよい。さらにｓｉＲＮＡが標的遺伝子におけるその遺伝子サイレンシング効果を維持することができる限り、ｓｉＲＮＡは、例えばその１つの末端の突出部分に低分子量のＲＮＡ（天然のＲＮＡ分子 例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡもしくはウイルスＲＮＡでも、または人工的なＲＮＡ分子であってもよい）を包含してよい。
加えて“ｓｉＲＮＡ”の末端構造は、必ずしも上に記載したように両末端で切断された構造でなくてもよく、二本鎖ＲＮＡの一方の末端にリンカーＲＮＡが接続するステム−ループ構造を有していてもよい。二本鎖ＲＮＡ領域（ステム−ループ部分）の長さは、例えば１５から４９ｂｐ、好ましくは１５−３５ｂｐ、そしてより好ましくは２１から３０ｂｐの長さである。あるいは発現されるｓｉＲＮＡの最終的な転写産物である二本鎖ＲＮＡ領域の長さは、例えば１５から４９ｂｐ、好ましくは１５から３５ｂｐ、そしてより好ましくは２１から３０ｂｐの長さである。さらにリンカーがステム部分のペア形成を妨げないような長さを有する限り、その長さに特定の限定はない。例えばステム部分の安定なペア形成、およびステム部分をコードするＤＮＡ間の組換えの抑制のため、リンカー部分はクローバーリーフｔＲＮＡ構造を有してもよい。リンカーがステム部分のペア形成を妨げる長さを有している場合でさえ、例えばイントロンが前駆体ＲＮＡから成熟ＲＮＡへのプロセシングの間に切断され、それによりステム部分のペア形成を可能にするようなイントロンを含むようにリンカー部分を構成することは可能である。ステム−ループｓｉＲＮＡの場合、ループ構造を持たないＲＮＡのいずれかの末端（頭部または尾部）が、低分子量のＲＮＡを有してもよい。上に記載したようにこの低分子量のＲＮＡは、天然のＲＮＡ分子 例えばｔＲＮＡ、ｒＲＮＡもしくはウイルスのＲＮＡでも、または人工的なＲＮＡ分子であってよい
“アンチセンスＲＮＡ”は、標的遺伝子ｍＲＮＡに相補的な配列を有し、そして標的遺伝子ｍＲＮＡとの結合によりＲＮＡｉを誘発すると考えられるＲＮＡである。“センスＲＮＡ”は、アンチセンスＲＮＡと相補的な、そしてその相補的なアンチセンスＲＮＡとアニーリングしてｓｉＲＮＡを形成する配列を有する。これらのアンチセンスＲＮＡおよびセンスＲＮＡは、ＲＮＡ合成機を用いて従来法により合成されている。
本明細書で使用する場合、“ＲＮＡｉコンストラクト”という用語は、小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ヘアピンＲＮＡ、およびin vivo で開裂されてｓｉＲＮＡを形成することのできるその他のＲＮＡ種を含むために、本明細書を通して使用する一般的用語である。本明細書においてＲＮＡｉコンストラクトはまた、細胞内でｄｓＲＮＡまたはヘアピンＲＮＡを形成する転写物、および/またはin vivoでｓｉＲＮＡを産生することのできる転写物を生じることのできる発現ベクター（ＲＮＡｉ発現ベクターともいう）を含む。所望によりｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの一本鎖または二本鎖を含む。
ｓｉハイブリッド分子は、ｓｉＲＮＡと類似の機能を有する二本鎖核酸である。二本鎖ＲＮＡ分子の代わりに、ｓｉハイブリッドはＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖から成る。好ましくはこのＲＮＡ鎖が、標的ｍＲＮＡに結合する鎖であるアンチセンス鎖である。ＤＮＡ鎖およびＲＮＡ鎖のハイブリダイゼーションにより作成されるｓｉハイブリッドは、ハイブリダイゼーションする相補的な部分、および好ましくは少なくとも１つの３’ 突出末端を有する。
コレステロール部分は、コレステロール分子、ステロール、または以下の化合物、すなわちコレステロール、コレスタノール、エルゴステロール、スチマスタノール(stimastanol)、スチグマステロール、メチルリトコール酸、コルチゾール、コルチコステロン、Δ５−プレグネノロン、プロジェステロン、デオキシコルチコステロン、１７−ＯＨ−プレグネノロン、１７−ＯＨ−プロジェステロン、１１−ジオキシコルチゾール、デヒドロエピアンドロステロン、デヒドロエピアンドロステロンスルフェート、アンドロステンジオン、アルドステロン、１８−ヒドロキシコルチコステロン、テトラヒドロコルチゾール、テトラヒドロコルチゾン、コルチゾン、プレドニソン、６α−メチルプレジソン(predison)、９α−フルオロ−１６α−ヒドロキシプレドニソロン、９α−フルオロ−１６α−メチルプレドニソロン、９α−フルオロコルチゾール、テストステロン、ジヒドロテストステロン、アンドロステンジオール、アンドロステンジオン、アンドロステンジオン、３α，５α−アンドロスタンジオール、エストロン、エストラジオール、エストロゲン、スペルミジンコレステロールカルバメート、Ｎ４−スペルミジンコレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミジンコレステリルカルバメート二ＨＣｌ塩、Ｎ４−スペルミジン−７デヒドロコレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミンコレステリルカルバメート、Ｎ，Ｎビス（３−アミノプロピル）コレステリルカルバメート、Ｎ，Ｎビス（６−アミノヘキシル）コレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミジンジヒドロコレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミジンリトコリックカルバメートメチルエステル、Ｎ１，Ｎ８−ビス（３−アミノプロピル−Ｎ４−スペルミジンジコレステリルカルバメート、Ｎ（Ｎ４−３アミノプロピルスペルミジン）コレステリルカルバメート、Ｎ，Ｎ−ビス（４−アミノブチル）コレステリルカルバメート、Ｎ４−スペルミジンコレステリル尿素、Ｎ４−スペルミンコレステリル尿素、Ｎ４−スペルミジンジヒドロコレステリル尿素、Ｎ４−スペルミンジヒドロコレステリル尿素、Ｎ，Ｎ−ビス（Ｎ'−３−アミノプロピル−Ｎ”４−アミノブチル）コレステリルカルバメート、Ｎ４スペルミジンコレステリルカルボキサミド、およびＮ−[Ｎ１，Ｎ４，Ｎ８−トリス（３−アミノプロピル）スペルミジン]コレステリルカルバメート、ルミステロール、コール酸、デソキシコール酸、ケノデソキシコール酸、およびリトコール酸、ならびにそれらの誘導体（米国特許第６，３３１，５２４号を参照のこと）を含むコレステロールから誘導されたあらゆる化合物である。
以下の例示としてのコレステロール−ＲＮＡコンストラクトは、本発明の様々な態様を説明する：すなわち
１．センス鎖の５’ 末端およびアンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そして他の末端にはコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドのコンストラクト；
２．アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖またはｓｉハイブリッド鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドのコンストラクト；
３．センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖またはｓｉハイブリッド鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドのコンストラクト；
４．センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖またはｓｉハイブリッド鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドのコンストラクト；
５．センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖またはｓｉハイブリッド鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドのコンストラクト；および
６．アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖またはｓｉハイブリッド鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドのコンストラクト、が挙げられる。
本発明のより詳細な態様において、コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドは、哺乳類の細胞内へのコレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドの送達を高めるためにさらに有効である、１つまたはそれより多くの第２の送達増強物質と共に製剤化(配合）する、またはそれらとの組み合わせ投与の方法で送達する。典型的には第２の送達増強物質（１つまたは複数）は、標的の哺乳類の細胞の原形質膜を通って、そして細胞質内への、コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドの送達を促進するために有効である。標的細胞は、遺伝子発現の制御のため細胞内への、コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドの送達が所望される、あらゆる細胞であってよい。本文脈における例示としての標的細胞として、肺の肺胞細胞またはその他の気道細胞、皮膚細胞、肝細胞、腎細胞、膵細胞、内皮細胞、有核血液細胞（例えばリンパ球、単球、マクロファージ、または樹状細胞）、筋細胞（例えば心筋細胞または平滑筋細胞）、乳腺細胞、末梢神経系または中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞、胃または腸管の細胞、腫瘍細胞、および本発明の方法および組成物に従っての治療目的に関する遺伝子発現制御を受け入れられるその他の細胞を含む。
１つの例示としての態様において、コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドを、粘膜上皮細胞、例えば鼻粘膜上皮細胞への送達のため標的に向かわせる。
本発明のこれらおよび関連する側面の範囲内において、第２の送達増強物質（１つまたは複数）は以下の１つまたはあらゆる組み合わせから選択してよい：すなわち
（ａ）凝集阻害剤；
（ｂ）電荷修飾剤；
（ｃ）ｐＨコントロール剤；
（ｄ）分解酵素阻害剤；
（ｅ）粘膜溶解剤または粘膜清浄剤；
（ｆ）ciliostatic agent（繊毛静止剤）；
（ｇ）膜透過増強物質であって、（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉｉ）リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム、もしくは担体、（ｉｖ）アルコール、（ｖ）エナミン、（ｖｉ）ＮＯ供与化合物、（ｖｉｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉｉ）小さな疎水性透過増強物質、（ｉｘ）サリチル酸ナトリウムもしくはサリチル酸誘導体、（ｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘｉ）シクロデキストリンもしくはベータ−シクロデキストリン誘導体、（ｘｉｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉｉ）キレート剤、（ｘｉｖ）アミノ酸もしくはその塩、（ｘｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸もしくはその塩、（ｘｖｉ）選択された膜成分の分解酵素（enzyme degradative to a selected membrane component）、（ｘｖｉｉ）脂肪酸合成の阻害剤、または（ｘｖｉｉｉ）コレステロール合成の阻害薬；あるいは（ｘｉｘ）（ｇ）（ｉ）−（ｘｉｘ）に列挙した膜透過増強物質のあらゆる組み合わせ、より選択されるもの；
（ｈ）送達増強ペプチド；
（ｉ）血管拡張剤；
（ｊ）選択的輸送増強物質；および
（ｋ）送達を安定化するビヒクル、担体、支持体、またはコレステロール複合体化したｓｉＲＮＡもしくはｓｉハイブリッドを共に効率的に組み合わせ、会合し、含有し、カプセル化し、または結合して、増強された送達のためのｓｉＲＮＡもしくはｓｉハイブリッドの安定化をもたらすコンプレックスを形成する種、が挙げられる。
本発明の付加的な側面において、送達増強物質（１つまたは複数）は、（ａ）−（ｋ）に列挙した前述の送達増強物質のいずか１つ、またはそれらの２つもしくはそれより多くのあらゆる組み合わせを包含し、そしてコレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドの送達増強物質との製剤は、コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドによる遺伝子制御のため、標的細胞の細胞質内へのコレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドの増加した送達を提供する。
前述の第２の送達増強物質のいずれか１つまたはあらゆる組み合わせを、本明細書において記載したようなコレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドを包含する医薬組成物に添加して、第２の送達増強物質（１つまたは複数）を含まないコレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドの細胞内への送達と比較して、より高い送達の増強を提供するコンビナトリアル製剤を得てよい。
本発明の組み合わせ投与の方法の範囲内において、コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドは、組み合わせ投与のプロトコルにおいて１つまたはそれより多くの第２の送達増強物質と組み合わせて、標的の細胞、組織、または個体に投与する。これらの組み合わせ投与の方法の範囲内において、コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドは、以下の物質のいずれか１つまたはあらゆる組み合わせより同様に選択してよい第２の送達増強物質（１つまたは複数）の投与前、投与時、投与後に、第２の送達増強物質（１つまたは複数）と同一の細胞、組織、または個体に投与する。そのような物質として：
（ａ）凝集阻害剤；
（ｂ）電荷修飾剤；
（ｃ）ｐＨコントロール剤；
（ｄ）分解酵素阻害剤；
（ｅ）粘膜溶解剤または粘膜清浄剤；
（ｆ）ciliostatic agent；
（ｇ）以下より選択される膜透過増強物質、すなわち（ｉ）界面活性剤、（ｉｉ）胆汁酸塩、（ｉｉｉ）リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム、もしくは担体、（ｉｖ）アルコール、（ｖ）エナミン、（ｖｉ）ＮＯ供与化合物、（ｖｉｉ）長鎖両親媒性分子、（ｖｉｉｉ）小さな疎水性透過増強物質、（ｉｘ）サリチル酸ナトリウムもしくはサリチル酸誘導体、（ｘ）アセト酢酸のグリセロールエステル、（ｘｉ）シクロデキストリンもしくはベータ−シクロデキストリン誘導体、（ｘｉｉ）中鎖脂肪酸、（ｘｉｉｉ）キレート剤、（ｘｉｖ）アミノ酸もしくはその塩、（ｘｖ）Ｎ−アセチルアミノ酸もしくはその塩、（ｘｖｉ）選択された膜成分の分解酵素、（ｘｖｉｉ）脂肪酸合成の阻害剤、または（ｘｖｉｉｉ）コレステロール合成の阻害薬；あるいは（ｘｉｘ）（ｇ）（ｉ）−（ｘｉｘ）に列挙した膜透過増強物質のあらゆる組み合わせ；
（ｈ）送達増強ペプチド；
（ｉ）血管拡張剤；
（ｊ）選択的輸送増強物質；および
（ｋ）送達を安定化するビヒクル、担体、支持体、またはコレステロール複合体化したｓｉＲＮＡもしくはｓｉハイブリッドを効率的に組み合わせ、会合し、含有し、カプセル化し、もしくは結合して、増強された送達のためのｓｉＲＮＡもしくはｓｉハイブリッドの安定化をもたらすコンプレックスを形成する種、が挙げられる。コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッド、および第２の送達増強物質（１つまたは複数）との組み合わせ投与は、標的細胞の細胞質内へのコレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドの増加した取り込み、典型的には遺伝子制御の増強（例えばｍＲＮＡの翻訳のノックダウンを増加し、それにより標的細胞内の１つまたはそれより多くの選択されたタンパク質（１つまたは複数）、例えばＴＮＦ−αの発現を低減する）を提供する。
本発明の範囲内において使用するための、第２の送達増強物質に関連するさらなる詳細な記載は、例えば米国仮特許出願：２００４年９月２１に提出された第６０／６１２，１２１号；２００５年４月１日に提出された第６０／６６７，８３５号；２００４年９月２１日に提出された第６０／６１２，２８５号；２００５年４月１日に提出された第６０／６６７，８７１号；２００４年９月２７日に提出された第６０／６１３，４１６号；および２００５年４月１日に提出された第６０／６６７，８３３号において提供されており、各文献を本明細書において参照として援用する。
本発明の例示としての態様の範囲内において、送達増強ペプチドを第２の送達増強物質として使用する。送達増強ペプチドを、コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドと共に複合体化、コンビナトリアルにより製剤化、または組み合わせて投与して、コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドの細胞内への取り込みを増強し、それにより達成される遺伝子制御を改善してよい。本文脈における送達増強ペプチドは、天然または合成の、治療的または予防的に活性なペプチド（２つまたはそれより多くの共有結合により連結したアミノ酸から成る）、タンパク質、ペプチドまたはタンパク質のフラグメント、ペプチドまたはタンパク質の類似体、ペプチドまたはタンパク質のミメテッィク、および活性なペプチドまたはタンパク質の化学的に修飾された誘導体または塩を含んでよい。したがって本明細書において使用する場合“送達増強ペプチド”という用語はしばしば、これらの活性な種のすべて、すなわちペプチドおよびタンパク質、ペプチドおよびタンパク質のフラグメント、ペプチドおよびタンパク質の類似体、ペプチドおよびタンパク質のミメテッィク、ならびに活性なペプチドまたはタンパク質の化学的に修飾された誘導体および塩を包括的に含むことを意図するものとする。しばしばこの送達増強ペプチドは、天然に発生するまたはネイティブな（例えば野生型、天然に発生する変異体、または対立遺伝子のバリアントの）ペプチドまたはタンパク質の配列（例えば天然に発生する “細胞透過ペプチド”またはネイティブタンパク質のペプチドフラグメント、例えば密着結合(tight junction)タンパク質）内の、アミノ酸の部分的な置換、付加、または欠失により容易に得られる変異タンパク質を包含する。加えて天然のペプチドまたはタンパク質の生物学的に活性なフラグメントも含む。そのような変異体の誘導体およびフラグメントは、対応するネイティブなペプチドまたはタンパク質の所望の細胞透過活性またはその他の送達増強活性を実質的に保持する。糖鎖を有するペプチドまたはタンパク質の場合、これらの糖鎖の種の変化により特徴付けられる生物学的に活性なバリアントもまた、本発明の範囲内に含む。
本発明の方法および組成物の範囲内で使用するための送達を増強するペプチド、タンパク質、類似体およびミメテッィクを、コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドと共に複合体化または製剤化して、送達を増強するペプチド、タンパク質、類似体またはミメテッィクの送達増強の有効量（すなわちコレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドの細胞内への送達を検出可能レベルで増強するのに充分なペプチドの量）を含む医薬組成物を得てよい。
本発明の方法および組成物の範囲内において使用するための例示としての送達増強ペプチドは、以下のペプチド：
Figure 0004635046
もしくはその活性なフラグメント、それらの変異タンパク質、複合体、またはコンプレックスのいずれか１つまたはあらゆる組み合わせを含む。
本発明の送達増強ペプチドはさらに、例えば対象のペプチドの電荷、膜透過能、半減期、分解の潜在性、反応性（例えば複合体を形成する）、免疫原性、またはその他の所望の特性を修飾するための、当該分野において公知の多様な修飾を含んでよい。本文脈における例示としての修飾された送達増強ペプチドは、例えば１つまたはそれより多くの選択されたアミノ末端またはカルボキシ末端の化学的修飾を組み込むことにより修飾されたペプチドを含んでよい。例えばアミノ末端および/またはカルボキシ末端のアミド基、ＢｒＡｃ基、またはマレイミド基を、表１に示した修飾された送達増強ペプチドにて例示するように含んでよい。
Figure 0004635046
列記したペプチドに関して表１に示した＋および−の記号は、――経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ）におけるペプチドを介しての電荷の測定により決定した場合の――上皮単層を通っての透過を増強するペプチドの活性に関する。＋記号は、対象のペプチドがマクロ分子の上皮透過を増強することを示す。透過増強活性を示したペプチドは、本明細書における方法に従って検査および選択して、遺伝子制御を増強するための標的細胞の細胞質への、コレステロール複合体化したｓｉＲＮＡまたはｓｉハイブリッドの送達の増強に関する、それらの有用性を決定することができる。
上の開示は本発明を全般的に記載しているが、これをさらに以下の実施例により例示する。これらの実施例は単に説明を目的として記載しており、本発明の範囲を限定する意図はない。本明細書において特定の用語および値を使用したが、そのような用語および値も同様に、例示としてであって本発明の範囲を限定するものではないことと理解されたい。
実施例１
コレステリル標識ｓｉＲＮＡの合成および精製
（未修飾ｓｉＲＮＡの合成）
未修飾ｓｉＲＮＡは、固相オリゴヌクレオチド合成に関する一般的な方法に従って合成した。合成は３’ から５’ の方向に進めた[current protocols in nucleic acid chemistry, chapter 3]。最初のステップは、モノヌクレオシド/モノヌクレオチドを、不溶性固体支持体の表面に共有結合により付着させることを伴う。本明細書において記載するすべての未修飾ｓｉＲＮＡは、ＣＰＧ−結合デオキシチミジン（Glen Research, Sterling VAより購入）を用いて開始して合成した。チミジンヌクレオシドは、塩基に不安定なリンカーを用いて３’ ヒドロキシル基を通して固体支持体に共有結合により付着されている。ヌクレオシドの末端保護基（ジメトキシトリチル、ＤＭＴ）をはずした後、ＤＮＡ鎖の伸長を進めることができるようになる。この脱保護で、次のヌクレオチドユニットが付加することのできるフリーの５’−ＯＨ基を暴露させる。過剰の試薬を使用して、できるだけ多くの固定したヌクレオチド上でカップリング反応を起こさせる。カップリング反応後、過剰の試薬を洗い流す。続いて非延長部位を防御するためのキャッピングステップ、および酸化ステップの反応を行う。その後末端保護基の除去および鎖の延長のプロセスを、異なる塩基を用いて所望の配列が組み立てられるまで繰り返す。一部またはすべての保護基は所望によりはずしてよく、その後支持体との共有結合を加水分解して生成物を放出させる。保護基の除去は、濃縮アンモニア：エタノールの３：１の混合液にて行った。いかなる残存する保護基も除去した後、オリゴヌクレオチドは精製および使用の準備が整う。
ＲＮＡ合成は、標準的なホスホラミダイト化学を用いて、Applied Biosystems 3400により行った。対応するビルディングブロックである、５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ベンゾイルアデノシン−２’−Ｏ−(t-ブチルジメチルシリル)−３’−[(２−シアノエチル)-(Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル)]−ホスホラミダイト（Ｂｚ−Ａ−ＣＥホスホラミダイト) (Ｉ)，５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−ジメチルホルムアミジン−グアノシン、２’−Ｏ−(t-ブチルジメチルシリル)−３’−[(２−シアノエチル)-(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル)]−ホスホラミダイト(ｄｍｆ−Ｇ−ＣＥホスホラミダイト) (ＩＩ)、５’−ジメトキシトリチル−Ｎ−アセチルシチジン−２’−Ｏ−(t-ブチルジメチルシリル)−３’−[(２−シアノエチル)-(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル)]−ホスホラミダイト(Ａｃ−Ｃ−ＣＥホスホラミダイト) (ＩＩＩ)、５−ジメトキシトリチルウリジン−２’−Ｏ−(t-ブチルジメチルシリル)−３’−[(２−シアノエチル)-(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル)]−ホスホラミダイト(Ｕ−ＣＥホスホラミダイト) (ＩＶ)、および５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシチミジン−３’−[(２−シアノエチル)-(Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル)]−ホスホラミダイト(Ｖ)は、Glen Research Inc. (Sterling VA)より購入した。未修飾配列に関して合成は、０．２から１．０μｍｏｌスケールのデオキシチミジン（ＶＩ）を結合したコントロールされた多孔質ガラス（Controlled Pore glass、ＣＰＧ）(Applied Biosystems, Foster City, CA)上で開始した。他の試薬および溶媒は、Glen Research (Sterling, VA)および/またはApplied Biosystems (Foster City, CA)より購入した。
Figure 0004635046
（３’−コレステリル標識ｓｉＲＮＡの合成）
３’−コレステリル標識ｓｉＲＮＡの合成は、修飾した支持体の方法を用いて行った。この方法において、新規に修飾した固相合成支持体を、ａｃｈ３'−レポーター基または複合体用に調製しなければならない。オリゴヌクレオチドの３' 末端にコレステリル基を付着するものに関する固相支持体は、市販により入手できる。３’−コレステリル標識オリゴヌクレオチドの合成は、１−ジメトキシトリチルオキシ−３−Ｏ−(Ｎ−コレステリル−３−アミノプロピル)−トリエチレングリコール−グリセリル−２−Ｏ−スクシノイル−長鎖アルキルアミノ−ＣＰＧ (ＶＩＩ、Glen Research, Sterling VA)を用いて達成した。次にデザインした２１ヌクレオチド配列を、この修飾した固体支持体上で、本明細書において上に記載したようなＲＮＡ合成に関する標準的なホスホラミダイトのプロトコルを用いて組み立てた。
（５’−コレステリル標識ｓｉＲＮＡの合成）
固体支持体に固定された５’ 末端にフリーのヒドロキシ基を有する保護されたオリゴヌクレオチドは、本明細書において上に記載したいずれかの方法を用いての固相合成により容易に得てよい。その後５’ 末端のヒドロキシルをホスホラミダイトを用いて反応させることができる。ヒドロキシルの官能性を有する分子からしばしば得られるホスホラミダイトは、酸化および脱保護の後、官能基またはリガンドを鎖に直接導入することを可能にする。ｓｉＲＮＡ分子の５’ 末端に組み込まれたコレステリル基のため、ジメトキシトリチルオキシ−３−Ｏ−(Ｎ−コレステリル−３−アミノプロピル)−トリエチレングリコール−グリセリル−２−Ｏ−(２−シアノエチル)−(Ｎ，Ｎ，−ジイソプロピル)−ホスホラミダイト（ＶＩＩＩ）をGlen Research (Sterling, VA)より購入した。最後のヌクレオシド/ヌクレオチドが組み込まれた後、ｓｉＲＮＡの固体支持体合成の間に、５’−ジメトキシトリチル保護基を開裂し、延長された鎖にＶＩＩＩをカップリングさせた。
Figure 0004635046
Figure 0004635046
（３’ および５’−ジコレステリル標識ｓｉＲＮＡの合成）
３’ および５’−ジコレステリル標識ｓｉＲＮＡの合成は、上に記載した方法を組み合わせて達成した。そのような分子の合成は、“修飾した固体支持体”としてＶＩＩを用いて開始し、伸長および５’−コレステリル部分の組み込みは、上に記載したように行った。
実施例２
コレステロールにより増強されたｓｉＲＮＡの取り込み、およびベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの発現のサイレンシング
（９Ｌ/ＬａｃＺ細胞のトランスフェクション：）
第０日：
ａ）Ｔ７５フラスコから飽和９Ｌ/ＬａｃＺ培養液を取り、１０ｍｌ 完全培地（ＤＭＥＭ、１ｘＰＳ、１ｘピルビン酸ナトリウム、１ｘＮＥＡＡ）中で細胞を引き離し、希釈する。
ｂ）さらに細胞を１：１５に希釈し、各９６ウェル中に１００μｌ播種する。これによりトランスフェクションのための翌日には５０％コンフルエンスの細胞が得られるはずである。忘れずに端のウェルは空とし、２５０μｌ 水で満たし、インキュベータ内でプレートを重ねないこと。
ｃ）３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータで一晩インキュベーションする。
第１日：
ａ）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ中のトランスフェクション混合液(complex)、各ウェル５０μｌを調製する。
ｂ）プレート中の培地を一度に捨て、２００μｌ ＰＢＳまたはＯｐｔｉ−ＭＥＭで一度各ウェルを洗浄する。
ｃ）逆さにしてプレートが完全に乾くようにティッシュに吸わせる。
ｄ）トランスフェクション混合液（５０μｌ/ウェル）を各ウェルに加え、端のウェル中にはウェルの乾燥を予防するため２５０μｌの水を加える。
ｅ）３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータで少なくとも３時間インキュベーションする。
ｆ）トランスフェクション混合液を一度に捨て、１００μｌ 完全培地（ＤＭＥＭ、１ｘＰＳ、１ｘピルビン酸ナトリウム、１ｘＮＥＡＡ）を代わりに加える。
（９６ウェルフォーマットにおけるβ−Ｇａｌ/ＢＣＡアッセイ）
[細胞の溶菌]
ａ）培地を一度に捨て、２００μｌ ＰＢＳで一度洗浄し、逆さにしてプレートが乾くように吸わせる。
ｂ）β−Ｇａｌキットの３０μｌ 溶菌バッファーを各ウェルに加える。
ｃ）細胞を２回凍結−解凍して、溶菌液を作成する。
[β−Ｇａｌアッセイ]
ａ）アッセイ混合液（５０μｌ １ｘバッファー、１７μｌ ＯＮＰＧ、各ウェル）を調製する
ｂ）新しいプレートを取り、各ウェルに６５μｌ アッセイ混合液を加える。
ｃ）各ウェルに１０μｌ 細胞溶菌液を加える。バックグラウンドの活性を差し引くためブランクのウェルがなければならない。
ｄ）３７℃で約２０分間インキュベーションする。すべてのＯＮＰＧを使い切って、高レベルの発現に偏ってしまう長時間のインキュベーションは避ける。
ｅ）１００μｌ 反応停止溶液を加える。
ｆ）４２０ｎｍでＯＤを測定する。
[ＢＣＡアッセイ]
ａ）ＢＳＡスタンダード（１ウェル当り１５０μｌ）を調製する。各々のポイントは各プレート上でダブルで測定しなければならない。
ｂ）１４５μｌ 水を各ウェルに入れ、細胞溶菌液 ５μｌを各ウェルに加える。
ｃ）使用直前にアッセイ試薬（Ａ：Ｂ：Ｃ：２５：２４：１）を調製、混合する。
ｄ）アッセイ試薬 １５０μｌを各ウェルに加える。
ｅ）３７℃で約２０分間インキュベーションする。
ｆ）５６２ｎｍでＯＤを測定する。
（ＦＩＴＣ／ＦＡＭ複合体化ｓｉＲＮＡのフローサイトメトリー測定）
ａ）トランスフェクション後、少なくとも３時間細胞をインキュベーションする。
ｂ）２００μｌ ＰＢＳで洗浄する。
ｃ）１５μｌ ＴＥで細胞を引き離し、３７℃でインキュベーションする。
ｄ）５つのウェルを、３０μｌ ＦＡＣＳ溶液（０．５％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）にて再度懸濁する。
ｅ）５つのウェルすべてを試験管中に合わせる。
ｆ）ＰＩ ５μｌを各チューブ中に加える。
ｇ）ＢＤ ＦＡＣスキャン装置を用いて製造元の説明書に従って、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting、ＦＣＡＳ)により細胞を分析する。
結果
（ｓｉＲＮＡのコレステロール複合）
９Ｌ／ベータ−ｇａｌ細胞においてリポフェクタミン(Invitrogen)を用いて、基準のｓｉＲＮＡまたはコレステロール複合体化ｓｉＲＮＡのいずれかにて、トランスフェクションを行った。ｓｉＲＮＡは、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡを特異的にノックダウンするようにデザインしたものであり、活性はコントロール（リポフェクタミンのみによりトランスフェクションした細胞）からのベータ−ｇａｌ活性のパーセントとして表す。
１．コレステロール複合体化ｓｉＲＮＡのｓｉＲＮＡ配列および構造の情報
Figure 0004635046
（コレステロール複合体化ｓｉＲＮＡの呼称）
Ａ．基準のセンス鎖またはアンチセンス鎖
Ｂ．５’ 末端を標識したセンス鎖
Ｃ．３’ 末端を標識したセンス鎖
Ｄ．両末端を標識したセンス鎖
Ｅ．５’ 末端を標識したアンチセンス鎖
Ｆ．３’ 末端を標識したアンチセンス鎖
Ｇ．両末端を標識したアンチセンス鎖
Figure 0004635046
Figure 0004635046
Figure 0004635046
上の表１は、上に記載したセンス鎖およびアンチセンス鎖を用いて作成したｓｉＲＮＡコンストラクトを用いての、トランスフェクションおよびｍＲＮＡサイレンシングの実験の結果を提供する。トランスフェクションおよびサイレンシングのアッセイの結果は、本発明の例示としてのｓｉＲＮＡのコレステロールにより増強された送達を示し、コレステロール複合体化ｓｉＲＮＡによるベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを実証する。“活性（コントロールに対する％）”は、トランスフェクション後に残存するベータ−ガラクトシダーゼ活性を示す。パーセントの値が低い程、ｓｉＲＮＡの効能が高い。２つの文字は二本鎖ｓｉＲＮＡを表す。したがって例示したコンストラクトのＢＥ、ＡＦ、ＢＡ、ＣＡ、ＣＦ、およびＡＥは、本発明のコレステロール複合体化ｄｓＲＮＡの性質および活性の代表例である。これらのコンストラクトは、対応する非複合体化ｓｉＲＮＡより高いサイレンシングの効能を示す。ｓｉＲＮＡコンストラクトのＣＥ、ＡＧ、ＢＦ、ＤＡ、ＢＧ、ＤＦ、ＤＥ、ＣＧおよびＤＧは、非複合体化ｓｉＲＮＡコンストラクトＡＡより低い効能を示した。
ＡＡは、センスＲＮＡ鎖またはアンチセンスＲＮＡ鎖のいずれの末端にも複合体化したコレステロールを伴わないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の２３．１２％が残るような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。
ＢＥは、センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、およびアンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡの他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の１０．２７％しか残らないような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。この結果は、非複合体化ｓｉＲＮＡより予想外にまさっている。
ＡＦは、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の１１．９９％しか残らないような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。この結果は、非複合体化ｓｉＲＮＡより予想外にまさっている。
ＢＡは、センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の１２．０９％しか残らないような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。この結果は、非複合体化ｓｉＲＮＡより予想外にまさっている。
ＣＡは、センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の１６．１８％しか残らないような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。この結果は、非複合体化ｓｉＲＮＡより予想外にまさっている。
ＣＦは、センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、およびアンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の１６．７６％しか残らないような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。この結果は、非複合体化ｓｉＲＮＡより予想外にまさっている。
ＡＥは、アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の１９．０２％しか残らないような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。この結果は、非複合体化ｓｉＲＮＡより予想外にまさっている。
以下に列記するコンストラクトは、対応する非複合体化ｓｉＲＮＡについて決定されたものより、ベータ−ガラクトシダーゼレポーターのサイレンシングのより低い能力を示した。
ＣＥは、センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の２７．６２％が残っているような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。このサイレンシング効果は、対応する非複合体化ｓｉＲＮＡについて観察された値より低かった。
ＡＧは、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の２９．８７％が残っているような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。このサイレンシング効果は、対応する非複合体化ｓｉＲＮＡについて観察された値より低かった。
ＢＦは、センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の３２．０２％が残っているような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。このサイレンシング効果は、対応する非複合体化ｓｉＲＮＡについて観察された値より低かった。
ＤＡは、センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてｓｉＲＮＡ鎖の他の末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の３３．９９％が残っているような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。このサイレンシング効果は、対応する非複合体化ｓｉＲＮＡについて観察された値より低かった。
ＢＧは、センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてセンス鎖の３’ 末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の４６．３９％が残っているような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。このサイレンシング効果は、対応する非複合体化ｓｉＲＮＡについて観察された値より低かった。
ＤＦは、センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてアンチセンス鎖の５’ 末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の６５．４０％が残っているような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。このサイレンシング効果は、対応する非複合体化ｓｉＲＮＡについて観察された値より低かった。
ＤＥは、センス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、そしてアンチセンス鎖の３’ 末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の７７．１２％が残っているような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。このサイレンシング効果は、対応する非複合体化ｓｉＲＮＡについて観察された値より低かった。
ＢＧは、センス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端に連結した１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の５’ 末端に連結した１つのコレステロール部分を有し、センス鎖の５’ 末端には連結したコレステロール部分を有していないｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の７７．８０％が残っているような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。このサイレンシング効果は、対応する非複合体化ｓｉＲＮＡについて観察された値より低かった。
ＤＧは、センス鎖の５’ 末端の１つのコレステロール部分、センス鎖の３’ 末端の１つのコレステロール部分、アンチセンス鎖の３’ 末端の１つのコレステロール部分、およびアンチセンス鎖の５’ 末端の１つのコレステロール部分を有するｓｉＲＮＡコンストラクトである。このコンストラクトを細胞内にトランスフェクションした結果、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡの活性の９８．８４％が残っているような、ベータ−ガラクトシダーゼｍＲＮＡのサイレンシングを得た。このサイレンシング効果は、対応する非複合体化ｓｉＲＮＡについて観察された値より低かった。
実施例３
コレステロールにより増強されたｓｉＲＮＡの取り込みの血清による阻害、および付加的な送達増強物質によるコレステロールによる取り込みの増強の救済
（ヒト単球の単離および精製）
健康なドナー由来のヒト鮮血をGolden West Biologicals (Temecula, CA)より購入した。単球を単離するため、血液サンプルを受け取った後直ちにＰＢＳで１：１の比率で希釈した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をFicoll (Amersham, CA, USA)勾配により最初に全血から単離した。次にMiltenyi ＣＤ１４ポジティブ選択キット(MILTENYI BIOTEC GmbH, Germany)を用いて製造元の説明書に従って、ＰＢＭＣからさらに単球を精製した。単球の純度は、抗ＣＤ１４抗体 (BD Biosciences, CA)を用いて染色したフローサイトメトリーにより判定したところ、９５％より高かった。誘発およびノックダウンのアッセイの前に、精製ヒト単球を完全培地中で一晩維持した。
（フローサイトメトリー）
蛍光抗体法（Fluorescsncs activated cell sorting、ＦＡＣＳ）分析は、Beckman Coulter FC500 細胞分析装置(Fullerton, CA)を用いて行った。この装置を、使用する蛍光プローブ(ｓｉＲＮＡについてはＦＡＭまたはＣｙ５、そしてＣＤ１４についてはＦＩＴＣおよびＰＥ)に従って調整した。ヨウ化プロピジウム(Fluka, St Lois, MO)およびアネキシンＶ(R&D systems, Minneapolis, MN)を、細胞の生存度および細胞毒性に関する指示薬として使用した。
ｓｉＲＮＡの取り込みの分析のため、細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンで処理（付着した細胞のみ）した後、フローサイトメトリーにより分析した。上に記載したＢＡをデザインしたｓｉＲＮＡの取り込みについてはまた、細胞内のＣｙ５またはＦＡＭの蛍光の強度により測定し、そして細胞の生存度は、ヨウ化プロピジウムまたはアネキシンＶ−ＰＥを加えることにより評価した。蛍光標識ｓｉＲＮＡの膜挿入からの細胞への取り込みを識別するため、トリパンブルーを使用して細胞膜表面上の蛍光を消去した。
Figure 0004635046
表２のデータは、血清の存在が、本発明に従ってのコレステロール部分と複合体化したｓｉＲＮＡの細胞への取り込みを有意に低減することを示した。血清はまた、例示としての送達増強ペプチドであるＰＮ７３：
Figure 0004635046
の存在下における非複合体化ｓｉＲＮＡの取り込みもまた阻害するが、コレステロール複合体化ｓｉＲＮＡに対して認められた阻害よりその程度は低かった。
図１および２は、透過性ペプチド送達増強物質であるＰＮ７３を含むコンプレックス中の本発明に従ってのコレステロール複合体化ｓｉＲＮＡ（コレステロールｓｉＲＮＡ＋ＰＮ７３）の細胞への取り込み、およびＰＮ７３を含むコンプレックス中の非複合体化ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ＋ＰＮ７３）の取り込みにおける、５％血清の効果を示す。これらおよび関連する取り込みのアッセイのため、コレステロール複合体化ｓｉＲＮＡ/ＰＮ７３ッコンプレックスおよびｓｉＲＮＡ/ＰＮ７３コンプレックスを、固定濃度または多様な濃度で加えた血清を含む上に記載したようなＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地 (Invitrogen)中のヒト単球内にトランスフェクションした。コレステロールおよびコンプレックスの双方に関するｓｉＲＮＡの最終濃度は０．２μＭであった。取り込みの効率および平均蛍光強度を、フローサイトメトリーにより評価した。図１および２に示した細胞への取り込みの値は、固定した５％血清濃度の存在下においてＰＮ７３濃度を変化させて決定した。
図３および４は、フローサイトメトリーにより決定した場合の、第２の送達増強物質であるリポフェクタミンの存在下または不在下におけるコレステロール複合体化ｓｉＲＮＡの細胞への取り込みにおける、様々な濃度の血清の効果を示す。
前述の研究は、ｓｉＲＮＡのコレステロール複合がそれらの細胞への取り込みを有意に増強することができることを実証する。しかしコレステロール複合体化ｓｉＲＮＡの取り込みは、血清の存在により実質的に減少、または抹消さえされ得る。これはコレステロール部分の血清タンパク質との結合――標的細胞に入るコレステロールと結合したｓｉＲＮＡの能力を阻害すること――によると思われる。選択された送達増強物質であるリポフェクタミンの存在下において、コレステロール−ｓｉＲＮＡの取り込みにおけるこの血清の阻害効果を、効率的に減少することができる。加えて、透過性ペプチドＰＮ７３により例示した、異なる種類の送達増強物質の存在もまた、血清により妨げられたｓｉＲＮＡの送達の救済を仲介することができる。より具体的には、コレステロール部分と複合体化したｓｉＲＮＡを包含する送達製剤への透過性ペプチドの添加が、コレステロール−ｓｉＲＮＡの取り込みにおける血清の阻害効果を、用量に依存する様式で低減する。この発見は、ｓｉＲＮＡとのコレステロール複合体のみではｓｉＲＮＡの送達を最適化しないと思われるが、リポフェクタミンおよびＰＮ７３を含むがこれに限定されない付加的な送達増強物質が、in vitro およびin vivoにおける哺乳類の細胞および組織へのｓｉＲＮＡの送達をさらに増強することができることを指摘する。
前述の本発明は、理解を明確にする目的で実施例という方法により詳細に記載してきたが、非限定的な説明という方法により提示する添付の請求項の範囲内において、ある種の変更および修飾を行ってよいことは、当業者には明らかであろう。本文脈において様々な公開および他の参考文献を、記載の簡略化のため前述の開示の範囲内で引用した。これらの各参考文献を、すべての目的に関してその全内容において本明細書にて参照として援用する。しかし本明細書において考察した多様な公開は、それらの開示が本出願の提出日に先行することに対してのみ援用するのであって、本発明者らは、先行する発明の価値によりそのような開示に先行する権利を保有することを明記する。
図１は、送達増強物質（透過性ペプチドであるＰＮ７３を包含する）を含むコンプレックス中のコレステロール複合体化ｓｉＲＮＡの細胞への取り込みにおける血清の効果、およびＰＮ７３を含むコンプレックス中の非複合体化ｓｉＲＮＡにおける血清の効果を――取り込みのパーセントとして表して――示す。 図２は、ＰＮ７３を含むコンプレックス中のコレステロール複合体化ｓｉＲＮＡの細胞への取り込みにおける血清の効果、およびＰＮ７３を含むコンプレックス中の非複合体化ｓｉＲＮＡにおける血清の効果を――平均蛍光強度（ＭＦＩ）として表して――示す。 図３は、第２の送達増強物質であるリポフェクタミンの存在下または不在下でのコレステロール複合体化ｓｉＲＮＡの細胞への取り込みにおける血清の濃度増加の効果を――取り込みのパーセントとして表して――示す。 図４は、第２の送達増強物質であるリポフェクタミンの存在下または不在下でのコレステロール複合体化ｓｉＲＮＡの細胞への取り込みにおける血清の濃度増加の効果を――ＭＦＩとして表して――示す。

Claims (6)

  1. 配列番号１１のアミノ酸配列を含むペプチド。
  2. アミド基、ＢｒＡｃ基、及びマレイミド基からなる群から選択される一つ又はそれ以上のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端の化学的修飾により修飾されたペプチドである、請求項１のペプチド。
  3. 配列番号１１のアミノ酸配列からなるペプチド、若しくはその化学的に修飾された誘導体であって該化学的修飾はアミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミド基、ＢｒＡｃ基、またはマレイミド基である誘導体、並びに核酸を含む、核酸の細胞内への送達を増強するために使用される組成物。
  4. 核酸が二本鎖の核酸である、請求項３の組成物。
  5. 核酸がＲＮＡ及び／又はＤＮＡを含む、請求項３の組成物。
  6. ペプチドが、核酸と共に配合されている、又は核酸に結合している、請求項３の組成物。
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