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KR102624471B1 - 가스 충전된 미세소포 - Google Patents

가스 충전된 미세소포 Download PDF

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KR102624471B1
KR102624471B1 KR1020217037784A KR20217037784A KR102624471B1 KR 102624471 B1 KR102624471 B1 KR 102624471B1 KR 1020217037784 A KR1020217037784 A KR 1020217037784A KR 20217037784 A KR20217037784 A KR 20217037784A KR 102624471 B1 KR102624471 B1 KR 102624471B1
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microvesicles
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gas
freeze
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KR1020217037784A
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필립 부사트
사미르 체르카위
데이빗 라자루스
에릭 알레만
미셸 슈나이더
크리스티안 기요트
Original Assignee
브라코 스위스 에스.에이.
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Publication date
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Abstract

다이스테아로일-포스파티딜콜린 (DSPC), 다이팔미토일포스파티딜에탄올아민-PEG5000 (DPPE-PEG5000) 및 팔미트산을 유리한 각각의 몰비로 포함하고 있는, 특히 안정적인 가스 충전된 미세소포를 제조하기 위한 지질 제제. 제제는 특히 초음파를 사용한 치료적 적용에 유용하다.

Description

가스 충전된 미세소포
본 발명은 가스 충전된 미세소포(gas-filled microvesicles)의 새로운 제제, 그것의 제조 방법 및 그러한 미세소포의 용도에 관한 것이다.
최근의 조영제의 빠른 개발로 많은 상이한 조성물 및 제제가 생성되었고, 그것들은 인간 또는 동물 신체의 장기 및 조직의 조영 증강 이미징에서뿐만 아니라 그것의 치료적 치료에서 유용하다.
조영 증강 초음파 이미징 ("CEUS" 이미징)에 특히 유용한 조영제의 부류에는 수성 매질에 분산된 나노- 및/또는 마이크로 미터 크기의 기포의 현탁액이 포함될 수 있다. 가스는 전형적으로, 예를 들어, 유화제, 오일, 증점제 또는 당을 포함하고 있는 필름층에 포획되거나 캡슐화된다. 이들 안정화된 기포 (적합한 생리 용액에 분산되어 있음)는 일반적으로 기술분야에서 전형적으로 그것의 제조에 사용된 안정화 물질에 따라 다양한 용어로 언급된다; 이들 용어로는, 예를 들어, "마이크로스피어", "마이크로버블", "마이크로캡슐" 또는 "마이크로벌룬"을 들 수 있고, 본원에서 전반적으로 "가스 충전된 미세소포" (또는 "미세소포")로 언급된다.
초음파 조영제 ("USCA")는 다양한 제조 방법에 따라 제조될 수 있다. 이들 방법 중 하나 (예컨대 WO94/09829 참고)는 유기 용매 중의 양친매성 물질 (예컨대 인지질 및/또는 지방산) 및 동결 건조 보호 화합물 (예컨대 폴리에틸렌글리콜)의 용해를 수반하며; 얻어진 혼합물은 그런 후, 전형적으로 바이알에 충전된 후 동결 건조가 수행되어 용매가 제거되고 동결 건조 제품이 얻어진다. 또 다른 방법 (예컨대 WO2004/069284 참고)은 물 및 물과 섞이지 않는 유기 용매와의 마이크로에멀션의 제조를 수반하며, 상기 에멀션은 양친매성 물질 및 동결 건조 보호 화합물을 포함한다. 그런 후 에멀션은 동결 건조 단계가 수행되어 (바이알에 분배되었을 때) 물 및 용매가 제거된다.
바닥에 분말 형태의 동결 건조된 고체 생성물을 함유하고 있는 바이알의 상부 공간(headspace)은 그런 후 적합한 가스 (예컨대 불화 가스)로 충전되고 마지막으로 보관을 위해 밀봉된다. 사용 전에, 적합한 액체 (예컨대 식염수)를 바이알에 도입하고 바이알을 부드럽게 흔들어 동결 건조 제품을 용해시킴으로써 마이크로버블의 수성 현탁액이 쉽게 제조된다.
상기 방법에 따라 제조될 수 있는 상업적으로 이용 가능한 USCA는 Bracco사로부터의 SonoVue® (또는 미국에서의 Lumason®)이다.
출원인은 이제 안정적인 가스 충전된 미세소포를 제조하는 데 특히 적합한, 1,2-다이스테아로일-sn-글리세포-3-포스포콜린 (DSPC, 또한 다이스테아로일포스파티딜콜린으로서도 표시됨), 1,2-다이팔미토일-sn-글리세포-3-포스포에탄올아민-PEG5000 (DPPE-PEG5000, 또한 다이팔미토일포스파티딜에탄올아민-PEG500으로도 표시됨) 및 팔미트산의 조합을 유리한 상대적 몰비로 포함하고 있는 새로운 제제를 발견하였다. 제제는 초음파를 이용한 치료 적용에 사용하기에 특히 유용하다.
Schneider 등 (2011)은 문헌: "BR38, a New Ultrasound Blood Pool Agent". Inv. Radiology, Vol. 46, Number 8, 486-494에서, 이미징 초음파 조영제로서 사용하기 위한, DSPC, DPPE-MPEG5000 및 팔미트산을 포함하는 동결 건조된 조성물의 재구성에 의해 얻어진 인지질-안정화된 마이크로버블의 현탁액을 개시한다.
발명은 지질 구성요소 (a) 1,2-다이스테아로일-sn-글리세포-3-포스포콜린 (DSPC), (b) 5000 g/mol (DPPE-PEG5000)의 분자량을 가지는 폴리에틸렌 글리콜과 콘쥬게이션된 1,2-다이팔미토일-sn-글리세포-3-포스포에탄올아민 및 (c) 팔미트산의 혼합물을 포함하는 가스 충전된 미세소포에 관한 것이며, 여기서 상기 지질 구성요소는 65-85/4-10/12-22의 각각의 상대적 몰비 (a/b/c)로 존재한다. 바람직하게 몰비는 70-80/5-9/15-21이고 보다 바람직하게는 약 72-76/6-8/16-20이며, 특히 바람직하게는 각각의 몰비는 74 (+/- 1)/7.5 (+/- 0.5)/18.5(+/-1)이다.
다른 측면은 동결 건조 보호 화합물, 바람직하게 PEG4000과 혼합된, 상기 각각의 몰비로 상기 액체 구성요소를 포함하고 있는, 동결 건조된 제제 형태의 그러한 가스 충전된 미세소포의 전구체에 관한 것이다. 동결 건조 보호 화합물의 양과 관련하여 3가지 지질 구성요소의 총량은 0.08 중량% 내지 0.75 중량%, 바람직하게 0.10% 내지 0.50%, 보다 바람직하게 0.12% 내지 0.45%의 임의의 범위일 수 있다.
구체예에서, 3가지 지질 구성요소의 혼합물은 동결 건조 보호 화합물의 총량과 관련하여 0.08 중량% 내지 0.3 중량%, 보다 바람직하게 약 0.10 중량% 내지 0.20 중량%, 보다 더 바람직하게 0.12 중량% 내지 0.18 중량%의 양이며, 특히 바람직한 것은 동결 건조 보호 화합물과 관련하여 약 0.16% (중량/중량)의 양이다.
다른 구체예에서, 상기 3가지 지질 구성요소의 혼합물은 동결 건조 보호 화합물의 총량과 관련하여 0.3 중량% 이상 내지 0.5 중량%, 바람직하게 0.35 중량% 내지 0.45 중량%, 보다 바람직하게 0.38 중량% 내지 0.40 중량%의 양으로 존재한다.
또 다른 측면은 생리적으로 허용되는 가스, 바람직하게 퍼플루오로부탄 (C4F10)과 접촉된, 보다 바람직하게 질소와 혼합된 (예컨대 35/65 부피/부피) 상기 동결 건조된 제제를 포함하는 밀봉된 바이알에 관한 것이다.
도 1은 실시예 3에서 논의된 것과 같이, 세척된 가스 충전된 미세소포의 현탁액 중의 DPPE-PEG5000의 양과 비교된, 천연 가스 충전된 미세소포의 현탁액 중의 DPPE-PEG5000의 상대적인 양을 도시한다.
본원에서 사용되는 바 용어 "DSPC"는 1,2-다이스테아로일-sn-글리세포-3-포스포콜린 (또한 "다이스테아로일포스파티딜콜린"으로서 식별됨)을 나타내는 한편, 용어 DPPE-PEG5000은 5000 g/mol의 분자량을 가지는 폴리에틸렌 글리콜에 콘쥬게이션된 1,2-다이팔미토일-sn-글리세포-3-포스포에탄올아민 (또한 "다이팔미토일포스파티딜에탄올아민"으로서 식별됨), 보다 구체적으로 메톡시 종결된 PEG 유도체 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜 5000)-1,2-다이팔미토일-sn-글리세포-3-포스포에탄올아민 또는 1,2-다이팔미토일-sn-글리세포-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-5000] (DPPE-MPEG5000)을 나타낸다.
본 출원인은 예상치 못하게 DSPC, DPPE-PEG 및 팔미트산을 포함하는 조성물의 지질 구성요소의 각각의 몰비를 적절하게 조정함으로써, 다른 것들 중에서도 압력에 대한 저항 면에서 개선된 특성을 가진 가스 충전된 미세소포를 제조하는 것이 가능한 것을 발견하였다.
실시예에서 상세하게 예시되는 바, 본 출원인은 특히 개선된 특성 (압력에 대한 더 높은 저항)이 (다른 두 구성요소와 관련하여) 적어도 8%, 바람직하게 적어도 12%, 보다 바람직하게 적어도 15% 및 보다 더 바람직하게 16%를 초과하는, 그러나 22% 이하, 보다 바람직하게 20% 이하, 보다 더 바람직하게 20% 미만의 몰량의 팔미트산을 포함하는 조성물을 가진 가스 충전된 미세소포에 부여되는 것을 발견하였다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 양은 18.5% (+/-1), 보다 바람직하게 18.5% (+/-0.5)이다.
나아가, 또한 실시예에서 상세하게 예시되는 바, 본 출원인은 제제에 포함된 DPPE-PEG의 양의 증가가 개선된 특성, 예컨대 크기 분포 (감소된 DV50 및 DN 값이 특징임) 및 적은 양의 큰 미세소포 (8 μm보다 큰 크기를 가진 버블의 수로서 표시됨)를 갖는 미세소포를 얻는 것을 가능하게 하는 것을 관찰하였다. 반대로, 출원인은 또한 8%보다 높은 몰량의 DPPE-PEG5000이 자주, 형성된 미세소포의 안정화 층에 효과적으로 포함되지 못하는 것을 관찰하였다. 나아가, 출원인에 의해 관찰된 바, 과도한 양의 DPPE-PEG5000을 포함하는 제제는 큰 미세소포의 증가하는 양의 큰 미세소포를 갖는 미세소포를 초래할 수 있다. 따라서, 출원인은 DPPE-PEG5000의 상대적인 몰량 (다른 두 구성요소와 관련하여)이 적어도 4%, 바람직하게 적어도 5%, 보다 바람직하게 적어도 6% 및 보다 더 바람직하게 6%를 초과하는, 그러나 10% 이하, 바람직하게 9% 이하, 보다 바람직하게 8% 이하 및 보다 더 바람직하게 8% 미만이어야 하는 것으로 측정하였다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 양은 7.4% (+/-0.5), 보다 바람직하게 7.4% (+/-0.4)이다.
DSPC와 관련하여, 출원인은 다른 두 구성요소와 관련하여 그것의 상대적인 몰량이, 또한 상기 예시된 상대적인 비율을 고려할 때, 적어도 65%, 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 72% 및 보다 더 바람직하게 72%를 초과하는, 그러나 85% 이하, 바람직하게 80% 이하, 보다 바람직하게 76% 이하 및 보다 더 바람직하게 76% 미만이어야 하는 것을 발견하였다. 특히 바람직한 구체예에서, 상기 양은 74% (+/-1), 보다 바람직하게 74% (+/-0.8)이다.
발명의 바람직한 구체예는 65-85/4-10/8-22 (상대적인 % 몰량으로 표시되며, 총량은 100%임)의 각각의 몰량으로 DSPC/DPPE-PEG/팔미트산을 포함하는 조성물이다. 바람직하게 몰량은 70-80/5-8/12-21이며 보다 바람직하게 약 72-76/6-9/15-20이고, 특히 바람직하게 몰비는 74 (+/- 1)/7.5 (+/- 0.5)/18.5(+/-1)이다.
상기 제제는 일반적으로 본원에 예시된 동결 건조 과정에 따라 동결 건조된 제품으로서 제조된다. 동결 건조된 제품은 적합한 동결 건조 보호 화합물, 바람직하게 PEG4000을 포함한다. 출원인에 의해 관찰된 바, 3가지 지질 구성요소와 관련하여 동결 건조 보호 화합물 (특히 PEG4000)의 양은 상대적으로 높아야 한다. 특히, 동결 건조 보호 화합물의 양과 관련하여 3가지 지질 구성요소의 총량은 0.08 중량% 내지 0.75 중량%, 바람직하게 0.10 중량% 내지 0.50 중량%, 보다 바람직하게 0.12 중량% 내지 0.45 중량%로 달라질 수 있다. 출원인에 의해 관찰된 바, 동결 건조 보호 화합물의 이런 상대적으로 높은 양은 특히 WO2004/069284에 개시된 제조 방법에 따라 제조될 때, 구성요소의 동결 건조된 덩어리에서 제제의 구성요소의 적절하게 균질한 분산을 허용한다.
구체예에 따르면, 제제의 3가지 지질 구성요소의 총 중량은 동결 건조 보호 화합물의 총량과 관련하여 0.08 중량% 내지 0.3 중량%, 바람직하게 약 0.10 중량% 내지 0.20 중량%, 보다 바람직하게 0.12 중량% 내지 0.18 중량%, 보다 더 바람직하게 약 0.16 중량%이다.
또 다른 구체예에 따르면, 제제의 3가지 지질 구성요소의 총 중량은 동결 건조 보호 화합물의 총량과 관련하여 0.30 중량% 이상 내지 0.50 중량%, 바람직하게 0.35 중량% 내지 0.45 중량%, 보다 바람직하게 0.38 중량% 내지 0.40 중량%이다.
출원인에 의해 관찰된 바, 이 후자의 구체예는 특히 가스 충전된 미세소포의 고도로 농축된 현탁액을 제조하는 데 유용하며, 그것은 더 높은 양의 미세소포가 투여되는 것이 바람직할 수 있는 특정 치료적 적용에 유용할 수 있다. 사실, 주입된 미세소포의 더 높은 양은 특정 현탁액의 투여된 부피를 증가시킴으로써 달성될 수 있는 한편, 그럼에도 불구하고 더 높은 농도의 미세소포를 갖는 현탁액의 상대적으로 감소된 부피를 투여하는 것이 보다 바람직할 수 있다. 원리대로, 현탁액 중의 더 높은 양의 가스 충전된 미세소포는 재구성될 동결 건조되 조제물 중의 지질의 상대적인 양을 증가시킴으로써 달성될 수 있다. 또한, 동결 건조된 제품을 재구성하기 위한 액체의 부피를 일정하게 유지함으로써, 그러한 더 높은 양의 지질은 재구성된 현탁액 중의 미세소포의 더 높은 농도를 초래할 것이다. 그러나, 출원인에 의해 관찰된 바, 단순히 (재구성될 동결 건조된 제품 중의) 지질 구성요소의 양을 증가시키는 것은 최종 재구성된 현탁액에서 반드시 상응하게 더 높은 수의 미세소포를 초래하지 않을 수 있다. 실제로, 출원인은 제제 중의 지질 구성요소의 양과 관련하여 최적화된 양의 미세소포 수가 동결 건조 화합물의 양과 관련하여 그러한 지질의 양을 적절하게 균형을 맞춤으로써 얻어질 수 있는 것을 관찰하였다. 그러므로 특히 유리한 결과는 제제의 3가지 지질 구성요소의 총 중량이 동결 건조 보호 화합물의 총량과 관련하여 0.30 중량% 이상 내지 0.50 중량%, 바람직하게 0.35 중량% 내지 0.45 중량%, 보다 바람직하게 0.38 중량% 내지 0.40 중량%일 때 얻어질 수 있다. 특정 구체예에 따르면, 제제의 3가지 지질 구성요소의 총 중량은 1000 μg 내지 1300 μg, 바람직하게 1050 μg 내지 1250 μg, 보다 바람직하게 1100 μg 내지 1200 μg으로 달라질 수 있는 한편, 동결 건조 보호 화합물 (PEG4000)의 총 중량은 225 mg 내지 375 mg, 바람직하게 250 내지 350 mg 및 보다 더 바람직하게 275 mg 내지 325 mg으로 달라질 수 있다.
본원에서 사용되는 바, DN은 미세소포 집단의 수에서 평균 직경인 한편, DV50은 상기 미세소포 집단의 부피의 평균 직경이며, 집단에 함유된 총 가스의 절반이 DV50보다 작은 직경을 갖는 미세소포에 존재하는 것을 나타낸다. DV50/DN의 비율은 집단의 다중분산도에 대한 일반적인 지표를 제공한다: 전형적으로, DV50/DN 비율이 낮을수록, 크기 분포는 더 좁아진다. DV50, DN (뿐만 아니라 미세포의 총 수 또는 8 μm보다 큰 미세소포의 수와 같은 다른 파라미터)의 상기 값은 쿨터 카운터(Coulter counter) (예컨대 측정 범위가 0.7 내지 20 μm인, 30 μm 구멍이 장착된 쿨터 카운터 멀티사이저 3 장치)를 사용한 측정에 의해 얻어질 수 있다.
동결 건조 보호 화합물
본원에서 정의되는 바, 동결 건조 보호 화합물은 동결보호 및/또는 한랭보호 효과를 갖는 화합물이다. 적합한 동결 건조 보호 화합물로는, 예를 들어, 탄수화물, 예컨대 단당, 이당 또는 다당, 예컨대, 수크로스, 말토스, 트레할로스, 글루코스, 락토스, 갈락토스, 라피노스, 사이클로덱스트린, 덱사트란, 키토산 및 그것의 유도체 (예컨대 카르복시메틸 키토산, 트라이메틸 키토산); 폴리올, 예컨대 소르비톨, 만니톨 또는 자일리톨과 같은 당 알코올; 또는 친수성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (예컨대 PEG2000, PEG4000 또는 PEG8000) 또는 폴리프로필렌 글리콜과 같은 폴리옥시알킬렌 글리콜을 들 수 있다. 구체예에 따르면 상기 동결 건조 보호 화합물은 폴리에틸렌 글리콜, 바람직하게 PEG4000이다. 본원에서 사용되는 PEG4000은 기술분야의 일반적인 의미를 가지며, 약 4000 g/몰, 일반적으로 상기 값 주위의 +/- 10%의 편차를 가지는 분자량을 가지는 폴리에틸렌 글리콜을 나타낸다.
가스 충전된 미세소포의 제조
가스 충전된 미세소포의 현탁액을 제조하기에 적합한 방법은 생리적으로 허용되는 가스의 존재 하에, 상기 미세소포를 안정화시킬 수 있는 (예컨대 액체-가스 계면에서 안정화 층을 형성함으로써) 지질 구성요소를 포함하는 동결 건조된 제품을 수성 담체로 재구성하는 단계를 포함한다.
동결 건조된 제품은 전형적으로 상기 지질 구성요소 및 동결 건조 보호 화합물을 포함하는 액체 혼합물을 적합한 용매에서 동결 건조시킴으로써 얻어진다.
동결 건조 과정이 진행되는 액체 혼합물은 예컨대 WO2004/069284에서 개시된, 기술분야에서 알려져 있는 방법에 따라 얻어질 수 있다.
WO2004/069284에 개시된 과정에 따르면, 지질 구성요소를 포함하는 조성물은, 바람직하게 동결 건조 보호 화합물과 혼합되어 있는, 물과 혼합할 수 없는 유기 용매와 물의 에멀션에 교반 하에 분산될 수 있다. 바람직하게, DSPC 및 팔미트산을 포함하는 유기 용매가 먼저 제조된 후 DPPE-PEG5000 및 동결 건조 보호 화합물을 포함하는 수성 용액과 함께 유화된다.
적합한 물과 혼합할 수 없는 유기 용매로는, 예를 들어, 분지형 또는 선형 알칸, 알켄, 사이클로-알칸 (예컨대 사이클로옥탄), 방향족 탄화수소, 알킬 에테르, 케톤, 할로겐화된 탄화수소, 과불화된 탄화수소 또는 그것들의 혼합물을 들 수 있다.
에멀션은 수성 매질 및 용매를 지질 구성요소 및 동결 건조 보호 화합물의 존재 하에, 예를 들어, 초음파처리, 진동, 고압 균질화, 미세혼합, 막 유화, 고속 교반 또는 고전단 혼합과 같은 기술분야에 알려져 있는 임의의 적절한 에멀션 생성 기법을 적용함으로써 얻어질 수 있다. 동결 건조 보호 화합물은 에멀션의 형성 전 또는 후에, 예컨대 그러한 동결 건조 보호 화합물을 포함하는 수성 용액으로서 첨가될 수 있다. 그렇게 얻어진, 지질 구성요소에 의해 둘러싸이고 안정화된 용매의 미세방울을 함유하는 마이크로에멀션은 그런 후 동결 건조된 물질을 얻기 위한 종래 기법에 따라 동결 건조되고, 그것은 나중에 가스 충전된 미세소포의 현탁액을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
동결 건조 과정에 대해, 지질 구성요소 및 동결 건조 보호 화합물을 함유한 에멀션 (예컨대 앞서 예시된 제조 과정에 따라 얻어짐)은 전형적으로, 동결 건조기에 로딩되는 유리 바이알 (예컨대 다양한 크기의 DIN/ISO 8362 크림프 바이알)에 샘플링된다. 그러나 출원인에 의해 관찰된 바, 동결 건조된 마이크로에멀션의 과도한 부피를 바이알에 넣는 것은 동결 건조 과정 중에 바이알에 균열을 유발할 수 있다. 그러므로, 예를 들어, DIN 8R 바이알 (대략 11.5 mL의 부피)이 2 mL 미만의 마이크로에멀션, 바람직하게 1.5 mL 이하의 부피의 마이크로에멀션으로 채워지는 것이 바람직하다. 그러한 상대적으로 낮은 부피는 필연적으로 바이알에 도입될 수 있는 지질 구성요소의 총량을 제한하며, 결과적으로 동결 건조된 제품의 재구성시 얻을 수 있는 가스 충전된 미세소포의 수가 제한된다. 그러므로, 만약 단일 바이알에 더 많은 양의 미세소포가 있어야 한다면, 더 큰 용량의 바이알이 사용되어야 한다. 예를 들어, DIN20R 바이알 (약 25 mL의 용량을 가짐)이 최대 4 mL, 바람직하게 3 mL 이하의 마이크로에멀션으로 채워질 수 있고, 동결 건조 과정 중에 균열이 생기지 않는다.
동결 건조 과정은 일반적으로 혼합물의 액체(들)를 동결시키기 위해 바이알들이 신속하게 심층 냉각되고 (예컨대 -35℃ 내지 -70℃의 온도에서) 그런 후 진공 (예컨대 0.1-0.8 mbar)이 적용되는 초기 단계를 포함하고; 일차 건조 중에, 냉동된 액체(들) (예컨대 물 및/또는 용매)의 실질적인 전체, 전형적으로 액체의 총량의 약 95%, 바람직하게는 최대 약 99%가 승화에 의해 제거된다. 일차 건조 후에, 잔류 액체 (가능한 간질수(interstitial water) 포함)는 추가로 전형적으로 실온보다 높은 온도에서, 진공 하에 (바람직하게 일차 건조 중에 적용된 동일한 진공을 유지함으로써) 수행되는 이차 건조 중에 제거될 수 있다. 이차 건조 중의 온도는 바람직하게 35℃를 넘지 않는다. 이차 건조는 액체(들)의 잔류 함량이 원하는 최소값, 예컨대 잔류 동결 건조된 제품의 총 질량과 관련하여 3 중량% 미만 (바람직하게는 1 중량% 미만)의 물, 또는 예컨대 잔류 용매(들)에 대해 0.01 중량% 미만, 바람직하게는 0.08 중량% 미만에 도달할 때 중단될 수 있다.
동결 건조 과정의 완료 (즉 가열 및 진공 제거의 중단) 후에, 동결 건조된 제품은 추가적인 열적 처치 단계가 진행될 수 있다. 바람직하게 열적 처치는 동결 건조된 제품이 함유되어 있는 바이알의 상부 공간을 적합한 생리적으로 허용되는 가스로 포화시킨 후 바이알을 (예컨대 고무, 예컨대 부틸 고무, 스톱퍼로) 마개를 막고 (예컨대 금속, 예컨대 알루미늄, 크림프 밀봉으로) 밀봉한 후에, 밀봉된 바이알에 대해 수행된다. 이 경우에, 바이알은 바람직하게 동결 건조기로부터 제거되어 열적 처치에 적합한 오븐에 도입된다. 대안으로, 그러한 열적 처치는 개방 바이알 (바람직하게 동결 건조기 안에 유지됨)에서 수행될 수 있고, 그런 후 가스로 포화되고 마개로 막아지고/밀봉된다.
적합한 생리적으로 허용되는 가스의 예로는, 예를 들어, 선택적으로 공기 또는 질소와 혼합된 SF6, C3F8, C4F10과 같은 불화 가스를 들 수 있다.
구체예에서, 가스 SF6은 상기 정의된 것과 같이, DSPC, DPPG 및 팔미트산을 포함하는 양친매성 물질의 혼합물과 함께 사용된다.
바람직하게, C4F10, 또는 C4F10과 질소의 혼합물이, 상기 정의된 것과 같이, DSPC, DPPE-PEG5000 및 팔미트산을 포함하는 지질 혼합물과 함께 사용된다.
출원인에 의해 관찰된 바, 동결 건조된 제품의 상기 추가적인 열처리는 놀랍게도, 그러한 열처리가 진행되지 않은 동결 건조된 제품으로부터 얻어진 현탁액과 관련하여, 동결 건조된 제품의 재구성시 얻어진 가스 충전된 미세소포의 현탁액의 특징의 개선을 초래한다.
출원인은 특히 그러한 처리가 얻어진 미세소포의 압력에 대한 증가된 저항을 초래하는 것을 관찰하였다.
동결 건조된 제품은 바람직하게 35℃보다 높은 온도 (예컨대 36℃), 보다 바람직하게는 38℃ 이상의 온도에서 가열된다. 열처리의 최대 온도는 일반적으로 동결 건조된 제품에 포함된 물질에 따라 달라진다. 예를 들어, 그러한 온도는 동결 건조된 제품의 질량의 대부분 (전형적으로 미세소포의 안정화 층을 형성하는 활성 구성요소의 중량의 50 내지 600배 이상)을 형성하는 구성요소인 동결 건조 첨가제로서 사용된 물질의 융점보다 낮아야 한다. 예를 들어, PEG4000은 53-58℃의 용융 온도를 가진다. 구체예에 따르면, 가열 온도는 바람직하게 50℃ 이하이다. 열처리에 바람직한 온도는 38℃ 내지 45℃이다.
열처리 기간은 일반적으로 처리 온도에 따라 달라진다; 전형적으로, 온도가 높을수록, 가열 기간은 더 짧아진다. 만약 너무 장시간 동안 과도한 온도가 적용되면 가스 충전된 미세소포 엔벨로프 (특히 인지질)를 형성하는 물질이 분해 반응을 진행할 수 있기 때문에 (재구성된 미세소포의 특징에 부정적 결과를 미칠 수 있음), 열처리 기간은 불필요하게 연장되지 않아야 한다. 약 8시간의 처리 기간이 충분할 수 있지만 (특히 45℃보다 높은 온도, 예컨대 48℃와 조합하여), 열처리 기간은 바람직하게 12시간 동안, 최대 예컨대 20시간 동안, 보다 바람직하게는 14 내지 18시간 동안 수행된다. 특별한 경우에 더 긴 기간이 적용될 수 있지만 (특히 45℃ 미만, 바람직하게 42℃ 미만의 온도와 조합되어), 출원인은 최종 가스 충전된 미세소포의 특징이 더 이상 개선되지 않는다면 단지 약간만 개선되는 것을 관찰하였고; 그러한 증가된 기간은 그러므로 대부분의 경우에 불필요하며 일반적으로 산업적 규모에서의 제조 경제의 관점에서 불편하다.
열적 처치는 상기 정의된 지질 구성요소와 동결 건조 보호 화합물의 혼합물을 포함하는 동결 건조된 제품을 재구성함으로써 얻어진 가스 충전된 미세소포의 특징을 개선하는 데 특히 효과적인 것으로 증명되었다. 바람직하게, 상기 동결 건조된 제품은 약 36℃ 내지 45℃의 온도, 특히 약 39℃ (+/- 3℃)의 온도에서 적어도 8시간 동안, 바람직하게 약 15시간 (+/- 5시간) 동안 가열된다.
상기에서 언급된 것과 같이, 동결 건조된 제품의 열적 처치는 가스 충전된 미세소포의 압력에 대한 증가된 저항을 초래한다. 유리하게, 압력에 대한 저항이 증가된 미세소포는 일반적으로 주입된 후 혈류에서 증가된 시간 지속성을 나타낸다.
가스 충전된 미세소포의 압력에 대한 저항은 경험적 매개변수 "Pc50" 또는 "임계 압력"을 측정함으로써 평가될 수 있다.
실험 부분에서 상세하게 설명되는 것과 같이, 가스 충전된 미세소포의 현탁액의 Pc50은 미세소포의 현탁액의 흡광도가 대기압에서 측정된 대기압의 흡광도의 절반으로 떨어지는 적용된 과압 (대기압과 관련하여)의 값을 식별하며, 상기 적용된 과압은 초기 값 (대기압에서의)과 관련하여 미세소포의 집단의 실질적인 감소를 초래한다. 실제로, 미세소포의 현탁액의 흡광도의 감소는 가스 충전된 미세소포의 초기 집단의 감소와 관련됨으로써, 초기에 유백색 현탁액 (고농도의 미세소포)은 증가하는 압력 하에서 점점 더 투명해진다 (미세소포의 붕괴로 인해 농도 감소함). Pc50 값이 높을수록, 미세소포의 압력에 대한 저항은 더 높아진다. 초음파 진단 적용의 경우, 적어도 12 kPa (약 90 mmHg), 바람직하게 적어도 13 kPa (약 100 mmHg), 보다 바람직하게 적어도 14 kPa (105 mmHg)의 최소 Pc50 값이 가스 충전된 미세소포에 대해 바람직하다. 초음파 치료 적용의 경우, 일반적으로 혈류에서 더 긴 지속 시간이 필요하며, 적어도 55 kPa (약 412 mmHg), 바람직하게 적어도 70 kPa (약 525 mmHg), 보다 바람직하게 적어도 80 kPa (약 600 mmHg)의 최소 Pc50 값이 바람직하지만, 더 높은 값의 Pc50이 훨씬 더 바람직하다.
전형적으로, 동결 건조된 제품의 열적 처치는 그러한 열적 처치를 받지 않은 동결 건조된 제품으로부터 얻어진 재구성된 현탁액의 Pc50과 관련하여, 적어도 5 kPa, 바람직하게 적어도 8 kPa 및 보다 바람직하게 적어도 10 kPa의 미세소포의 재구성된 현탁액의 Pc50이 증가되는 것을 허용한다. 그러한 Pc50의 증가는 최대 15 kPa일 수 있고 일부 구체예에서는 최대 25 kPa까지일 수 있다.
특히, 본원에 정의되고 상기 정의된 것과 같이 열적 처치를 받은 동결 건조된 제품으로부터 재구성된 미세소포 현탁액은 적어도 75 kPa, 바람직하게 적어도 80 kPa 및 보다 바람직하게 적어도 90 kPa, 최대 예컨대 110 kPa, 바람직하게 최대 105 kPa의 Pc50 값을 가진다.
가스 충전된 미세소포의 현탁액
그런 후 가스 충전된 미세소포의 현탁액은 동결 건조된 제품을 생리적으로 허용되는 (수성) 담체로, 부드러운 교반 하에 재구성함으로써 제조될 수 있다. 적합한 생리적으로 허용되는 (수성) 담체로는, 예를 들어, 선택적으로 부형제 또는 pH 조절제, 오스몰 농도 조정제, 보조제, 점도 향상제와 같은 첨가제를 함유한 주입용 물, 식염수 또는 글루코스 용액을 들 수 있다.
제약학적 키트, 투여 및 사용 방법
동결 건조된 제품을 함유한 바이알은 바람직하게 주사에 의한 투여를 위해, 유리하게 2 구성요소 진단 및/또는 치료 키트에 포장될 수 있다. 키트는 바람직하게 동결 건조된 제품을 함유한 바이알 및 재구성을 위한 생리적으로 허용되는 수성 담체를 함유한 제2 용기 (예컨대 주사기 배럴)를 포함한다. 구체예에서, 바이알은 약 50 내지 약 150 mg의 동결 건조된 제품을 함유한 DIN8R 유리 바이알 (또는 동등물)이고; 바람직하게, 동결 건조 화합물과 관련하여 지질 구성요소의 양은 0.10 중량% 내지 0.30 중량%이다. 다른 구체예에서, 바이알은 약 250 내지 350 mg의 동결 건조된 제품을 함유한 DIN20R 바이알 (또는 동등물)이며; 바람직하게, 동결 건조 화합물과 관련하여 지질 구성요소의 양은 0.30 중량% 이상 내지 0.50 중량%이다. 재구성을 위한 수성 담체의 부피는 전형적으로 약 5 mL이다. 특정 치료적 적용의 경우, DIN20R 바이알에서 동결 건조된 제품의 재구성으로부터 얻어진 현탁액은 지속적인 현탁액의 투여를 위해 일정 부피 (예컨대 50 mL)의 주사에 대해 생리적으로 허용되는 액체 (예컨대 식염수)와 혼합될 수 있다.
본 발명의 미세소포는 특히 초음파를 포함한, 다양한 진단 및/또는 치료 기법에 사용될 수 있다.
치료 기법은 초음파 및 가스 충전된 미세소포 자체의 조합된 사용 (예컨대 초음파 매개 혈전 용해, 고강도 집속 초음파 절제, 혈액-뇌 장벽 투과, 면역조절, 신경변조, 방사선감작에서) 또는 치료제와 조합된 조합 사용 (즉, 예컨대 종양 치료, 유전자 치료법, 감염성 질환 치료법, 대사 질환 치료법, 만성 질환 치료법, 퇴행성 질환 치료법, 염증성 질환 치료법, 면역학적 또는 자가면역 질환 치료법에서 또는 백신으로서의 용도에서, 예컨대 선택된 부위 또는 조직으로의 약물 또는 생체활성 화합물의 전달을 위한 초음파 매개 전달)을 포함하는 환자의 임의의 치료 방법을 포함하며, 그로써 가스 충전된 미세소포의 존재는 치료 효과 자체를 제공할 수 있거나 또는 자체적으로 또는 다양한 물리적 방법 (예컨대 초음파 매개 전달을 포함함)에 의한 특정 활성화시에, 예컨대 시험관내에서 및/또는 생체내에서 생물학적 효과를 발휘하거나 발휘하는 것을 담당함으로써, 적용된 초음파의 치료 효과를 향상시킬 수 있다.
발명에 따르는 미세소포는 전형적으로 예컨대 그것의 각각의 조성, 치료 중인 대상체의 유형, 치료될 조직 또는 장기 및/또는 적용된 치료 방법에 따라, 환자의 kg당 약 0.01 내지 약 5.0 μL의 가스의 농도로 치료 목적에 대해 투여될 수 있다.
구체예에서 상기 초음파 치료적 치료 방법은:
(i) 발명의 과정에 따라 얻어진 동결 건조된 제품의 재구성에 의해 얻어진 가스 충전된 미세소포의 현탁액을 환자에게 투여하는 단계;
(ii) 치료적 치료를 받은 상기 환자에서 관심의 영역을 확인하는 단계로, 상기 관심의 영역은 상기 가스 충전된 미세소포의 현탁액을 포함하고 있는 것인 단계; 및
(iii) 상기 관심 영역을 치료적으로 치료하기 위해 초음파 빔을 적용하는 단계
를 포함하며,
그로써 상기 초음파 치료적 치료는 상기 관심 영역에서 상기 가스 충전된 미세소포의 현탁액의 존재에 의해 향상된다.
상기 미세소포의 현탁액은 바람직하게 적어도 84 kPa, 보다 바람직하게 적어도 88 kPa, 보다 더 바람직하게 적어도 90 kPa, 최대 약 예컨대 105 kPa의 Pc50 값을 가진다.
다음의 실시예가 발명을 추가로 예시하는 것에 도움이 될 것이다.
실시예
물질
DSPC: 1,2-다이스테아로일-sn-글리세포-3-포스포콜린 (다이스테아로일포스파티딜콜린)
DPPE-PEG5000: 1,2-다이팔미토일-sn-글리세포-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-5000] (암모늄 염)
PEG4000 = 폴리에틸렌 글리콜 (MW=4000 g/mol)
압력 저항 (Pc50)의 측정
가스 충전된 미세소포의 압력에 대한 저항을 자체 개발한 압력 네펠로미터(nephelometer)를 사용하여 평가하였다. 간단히 설명하면, 미세소포 현탁액을 분광광도계 샘플 셀 (기밀하고 가압 시스템에 연결되어 있음)에 도입하였다. 셀의 샘플에 적용된 압력을 약 4 mmHg/초 (533 Pa/초)의 속도로 대기압 (760 mmHg, 101.3 kPa)으로부터 2 바의 압력 (2280 mmHg, 303.9 kPa)까지 선형으로 증가시키면서 현탁액의 광학 밀도 (700 nm에서의 흡광도)를 계속해서 기록한다.
각각의 현탁액을 특성화하는 Pc50 매개변수 ("임계 압력", kPa로 표시됨)는 미세소포 현탁액의 흡광도가 그것의 초기 값의 절반으로 떨어지는 과압 (대기압과 관련하여)을 식별한다.
가스 충전된 미세소포의 매개변수의 측정
크기 분포 매개변수 (Dv50 및 Dn, μm로 표시됨), 미세소포의 수 (입자/mL 현탁액으로 표시됨) 및 8 μm보다 큰 직경을 가진 미세소포의 백분율 (입자의 총량에 대해 입자의 백분율로서 표시됨)을 측정 범위가 0.7 내지 20 μm인, 30 μm 구멍이 장착된 쿨터 카운터 멀티사이저 (Coulter Counter Multisizer) 3 장치를 사용하여 측정하였다. 50 μL의 마이크로버블 샘플을 실온에서 100 ml의 식염수로 희석하여 측정 3분 전에 평형화하였다.
실시예 1
미세소포를 함유한 DSPC/팔미트산/DPPE-PEG의 제조
(a) 25 mg의 DSPC/팔미트산 혼합물 (80/20 몰비)을 사이클로옥탄 (4 mL)에, 70℃에서 5분 동안 용해시킨다.
(b) 별도로, DPPE-PEG5000 (16.7 mg, 총 지질 구성요소의 몰량과 관련하여 7.4% 몰)을 증류수 (1 mL)에 70℃에서 용해시키고 거기에 증류수 (49 mL) 중의 10% (중량/중량) PEG4000 용액을 첨가하였다.
(c) 수성 및 유기 상을 유화시켰다 (Megatron MT3000, 10'000 rpm, 3.5분). 에멀션을 100 mL 플라스크 (Duran)에 회수한 후, 80℃에서 1시간 동안 가열하고 최종적으로 실온으로 냉각시켰다 (약 1시간).
(d) 그런 후 에멀션을 상기 10% PEG4000 용액으로 5배 희석하고 (즉, 216 mL의 10% PEG4000 용액을 54 mL의 에멀션에 첨가함) DIN8R 바이알에 샘플링하였다 (0.75 mL/바이알).
에멀션 중의 상대적인 DSPC/팔미트산/DPPE-PEG5000 몰비는 약 74/18.5/7.5였다. PEG4000의 총량과 관련하여 3가지 구성요소의 총 중량은 약 0.16%이다.
바이알을 진공 하에 -50℃에서 냉각시킨 후 동결건조시키고, 이어서 실시예 1에서 기술한 것과 같이, 물 및 용매가 완전히 제거될 때까지 (0.5 중량% 미만) 실온보다 높은 온도에서 이차 건조시켰다. 동결 건조 과정이 끝났을 때, 바이알의 상부 공간을 C4F10/N2의 35/65 혼합물로 포화시키고 바이알의 마개를 막고 밀봉하였다.
그런 후 바이알을 38℃에서 16시간 동안 가열하였다.
그런 후 바이알 중의 생성물을 사용 전에 부드럽게 흔들면서 식염수에 재분산시켰다 (5 mL/바이알).
실시예 2
상이한 농도의 팔미트산의 영향
DSPC와 관련하여 팔미트산의 상대적인 몰량을 조정함으로써 (즉 각각 0, 10, 20, 40 및 60), 동일한 양의 DPPE-PEG5000을 유지하면서 실시예 1을 반복하였다. 이것은 최종 제제에서 약 0%, 9.3%, 18.5%, 37.1% 및 55.6%의 팔미트산의 상대적인 몰량에 상응한다.
결과를 하기 표 1에 기록하는데, 10 내지 20의 팔미트산의 양이 특히 압력 저항, 미세소포의 수 및 크기 분포의 측면에서 개선된 특성을 가진 미세소포를 제공하는 것을 보여준다. 모든 특징을 고려할 때, DSPC에 대해 약 20% w/r의 팔미트산의 몰량을 가진 제제가 특히 바람직하다.
Effect of 팔미트산 몰량의 영향 (DSPC에 대한 w/r)
Amt 팔미트산 Dv50
(μm)		 Dn
(μm)		 Nb Mv/mL Pc50
(kPa)
0 4.04 1.53 1.72E+08 68.39
10 3.86 1.47 1.97E+08 75.86
20 3.86 1.50 1.98E+08 75.59
40 4.07 1.53 1.90E+08 63.59
60 3.66 1.49 1.81E+08 58.93
실시예 3
상이한 농도의 DPPE-PEG5000의 영향
DPPE-PEG5000의 몰량을 변화시키고 (지질 구성요소의 총 몰량과 관련하여 0, 1%, 3%, 7.4%, 12%), DSPC/팔미트산의 동일한 양 및 비율을 유지함으로써 실시예 1을 반복하였다.
결과를 표 2에 예시하며, 약 7.4%의 양의 DPPE-PEG5000이 8 마이크론보다 큰 (Nb Mv > 8 μm), 뿐만 아니라 더 좁은 분포의 직경을 갖는 미세소포의 감소된 수를 가진 조제물을 제공하는 것을 보여준다.
상이한 양의 DPPE-PEG5000
DPPE-PEG5000의 농도
몰%		 Dv50
(μm)		 Dn
(μm)		 Nb Mv>8 μm (%)
0 10.28 1.26 0.517
1 3.99 1.42 0.100
3 3.94 1.50 0.102
7.4 3.65 1.48 0.060
12 3.65 1.47 0.079
상기 조제물 (천연 미세소포)을 그런 후에 2회의 세척 단계를 수행하여 미세소포의 안정화 층을 형성하지 않는 구성요소를 제거하였다. 도 1로부터 유추할 수 있는 바, DPPE-PEG5000의 양은 실질적으로 천연 현탁액에서 및 7.4%의 농도까지의 세척된 현탁액에서 유사하지만 (DPPE-PEG가 원하는 몰량에서 미세소포의 안정화 층으로 포함된 것을 나타냄), 더 높은 농도에서 세척된 현탁액 중의 DPPE-PEG5000의 양은 천연 현탁액에서의 그것보다 훨씬 더 낮으며, 이것은 안정화 층이 실질적으로, 7.4%와 관련하여 훨씬 더 많은 양으로 DPPE-PEG5000를 포함할 수 없음을 나타낸다. 이런 이유로, 너무 과도한, 예컨대 10%보다 많은 양은 바람직하지 않으며 9% 이하, 바람직하게 8% 이하의 양이 바람직하다.
실시예 4
상이한 양의 PEG4000의 영향
실시예 1을 반복하지만, 단계 (d)에서 에멀션의 5배 희석에 사용한 PEG4000 용액을 상이한 농도로, 즉 2 중량%, 5 중량%, 10 중량%, 15 중량% 및 20 중량%로 사용하였다; 그러므로 PEG4000의 양과 관련하여 지질 구성요소의 총 중량은 각각 약 0.77%, 0.31%, 0.16%, 0.10% 및 0.08%였다.
결과를 표 3에 예시하며, 동결 건조 전 에멀션의 5배 희석을 위해 2 중량%보다 높은 또는 20 중량% 미만의 농도로 PEG4000 용액을 사용한 것이 (PEG4000의 총량과 관련하여 3가지 구성요소의 총 중량이 0.77% 미만 및 0.08%보다 높은 조성물이 생성됨) 특히 유리한 특징 (예컨대 상대적으로 좁은 크기 분포, 개선된 압력 저항 및 특히 더 낮은 수의 큰 크기의 미세소포)을 가진 가스 충전된 미세소포의 현탁액을 제공한다.
상이한 양의 PEG4000
PEG4000 용액의 농도
(중량%)		 Dv50
(μm)		 Dn
(μm)		 Nb Mv >8 μm
(%)		 Pc50
(kPa)
2 3.90 1.35 0.084 66.26
5 4.00 1.50 0.082 76.13
10 3.78 1.53 0.065 79.06
15 3.75 1.51 0.076 79.86
20 3.92 1.49 0.120 76.66
실시예 5
에멀션 희석의 영향
실시예 1을 반복하였지만, 단계 (d)에서 에멀션의 희석을 변경시켰다. 제1 배치에서, 에멀션을 희석 없이 바이알에서 샘플링하였다 (이 경우 PEG4000의 양과 관련하여 지질 구성요소의 총 중량은 0.78%였다). 제2 배치에서, 에멀션을 2배 희석하고 (54 mL 에멀션 + 54 mL PEG4000 10% 용액) 그런 후 바이알에 샘플링하였다 (이 경우 PEG4000의 양과 관련하여 지질 구성요소의 총 중량은 0.39 %였음). 이들 2개의 배치를 실시예 1의 조제물과 비교하였고, 이때 에멀션은 5배 희석되었다 (이 경우 PEG4000의 양과 관련하여 지질 구성요소의 총 중량은 0.16 %였다). 결과를 표 4에 예시한다.
PEG4000 10% 용액에서 에멀션 희석의 영향
희석 Dv50
(μm)		 Dn
(μm)		 Nb Mv >8 μm (%) Pc50
(kPa)
없음 4.86 1.51 0.207 79.99
2배 3.79 1.47 0.059 88.12
5배 3.78 1.53 0.065 79.06
표 4의 데이터로부터 유추할 수 있는 바, 동결 건조 전에 10% (중량/중량) PEG4000 용액으로 에멀션을 2배 희석하여 얻어진 조제물 (PEG4000의 양과 관련하여 지질 구성요소의 총 중량은 0.39%임)은 희석이 없거나 (지질의 양 0.78%) 또는 5배 희석된 (지질의 양 0.16%) 조제물과 관련하여 개선된 특성을 가진 가스 충전된 미세소포의 현탁액을 제공한다. 나아가, 지질 구성요소의 g당 미세소포의 수는 2배 희석 조제물의 경우에 9.48·106이었던 한편, 희석이 없는 조제물의 경우 불과 6.68 ·106이었거나 5배 희석 조제물의 경우 7.76 ·106이었다; 이들 결과는 지질 구성요소 대비 PEG4000의 비율을 적합하게 균형을 이룸으로써 결정된 양의 지질 구성요소에 의해 형성될 수 있는 미세소포의 수를 최적화하는 것이 가능한 것을 보여준다.
실시예 6
파일럿 규모 제조
실시예 1을 파일럿 규모로 반복하였고 (물질의 양은 실험실 규모 실험의 양의 약 50배임), 단계 (d)를 10% (중량/중량) PEG4000 용액으로 에멀션을 2배 희석하여 수행한 것이 차이였다.
바이알당 약 300 mg의 총량의 PEG4000 및 지질 구성요소의 약 0.39 중량%의 각각의 양에 대해, 최종 에멀션을 DIN20R 유리 바이알에 샘플링하였디 (3 mL 에멀션/바이알).
동결 건조 및 식염수에서의 재구성 후, 다음의 결과를 측정하였다:
미세소포의 총 수: 13·109
미세소포의 수/g 지질: 1.12·107
Dv50 (μm): 3.7
Dn (μm): 1.48
Nb Mv > 8 μm (%): 0.06
실시예 7
동결 건조된 제품 (7a-7h)의 제조
WO2004/069284의 작업 실시예에서 설명된 과정을 사용하여 각각이 동결 건조된 제품을 함유하는 여러 바이알로 이루어진 8개의 상이한 배치 (7a-7h)를 제조하였다.
간단히 설명하면, 약 90 mg/L의 DSPC, 7 mg/L의 팔미트산, 60 mg/L의 DPPE-PEG5000 (약 75/18/7의 몰비) 및 100 g/L의 PEG4000을 함유하는 사이클로옥탄과 물의 에멀션 (약 1.5/100 부피/부피)을 제조하고 (Megatron MT3000, Kinematica; 10'000 rpm, 3.5분) DIN8R 바이알 (약 1 mL/바이알)로 샘플링한다.
바이알을 진공 하에 -50℃에서 냉각시킨 후 동결건조시키고, 이어서 실시예 1에서 기술한 것과 같이 물 및 용매가 완전히 제거될 때까지 (0.5 중량% 미만) 실온보다 높은 온도에서 이차 건조를 하였다. 동결 건조 과정이 끝났을 때, 바이알의 상부 공간을 35/65의 C4F10/N2 혼합물로 포화시키고 바이알의 마개를 닫고 밀봉하였다.
상이한 배치 (7a 내지 7h)를 후속 열처리 실험에 사용하였다.
실시예 8
실시예 7에 따라 제조된 배치에 미치는 열처리의 영향
실시예 7에 따라 제조한 다양한 배치 (7a-7h)의 바이알에 대해 상이한 열처리를 하여 가스 충전된 미세소포의 재구성된 현탁액의 특징에 미치는 영향을 관찰하였다.
실험 8.1
배치 7a의 바이알을 40℃ 또는 45℃의 가열 온도에 16시간 동안 노출시키거나 가열하지 않았다. 바이알의 제품을 그런 후 5 ml의 식염수로 재구성하고 현탁액 중의 미세소포의 특징을 측정하였다. 결과를 하기 표 5에 기록한다.
배치 7a
16시간 동안 열 처리 Pc50 (kPa)
평균 값
가열 없음 66.1
40℃ 84.8
45℃ 78.8
상기 데이터로부터 유추할 수 있는 바, 압력 저항의 실질적인 증가를 또한 실시예 7의 과정을 따라 제조한 배치에 대한 열처리시에 얻는다.
실험 8.2
배치 7b의 바이알을 16 내지 88시간 범위의 시간 동안 40℃의 가열 온도에 노출시키거나, 또는 가열하지 않았다. 그런 후 바이알 중의 제품을 5 ml의 식염수로 재구성하고 현탁액 중의 미세소포의 특징을 측정하였다. 결과를 하기 표 6에 기록한다.
배치 7b
가열 시간
T=40℃ 		Pc50 (kPa)
평균 값
가열 없음 82.1
16시간 99.0
40시간 103.6
64시간 98.6
88시간 102.5
상기 데이터로부터 유추할 수 있는 바, 압력 저항의 실질적인 증가를 40℃에서의 열처리시에 얻는다. 16시간의 처리 기간이 일반적으로, 또한 미세소포의 다른 특징에 미치는 더 긴 열적 처치에 의해 유발된 가능한 부정적 영향 (예컨대 재구성된 현탁액 중의 더 큰 크기의 미세소포의 증가)을 피하는 데에도 충분한 것으로 여겨진다.
실험 8.3
배치 7c-7g의 바이알을 16시간의 기간 동안 40℃의 가열 온도에 노출시키거나, 또는 가열하지 않았다. 그런 후 바이알 중의 제품을 5 mL의 식염수로 재구성하고 현탁액 중의 미세소포의 특징을 측정하였다. 결과를 하기 표 5에 기록한다.
Figure 112021133569273-pct00001
상기 표로부터 유추할 수 있는 바, 다양한 배치로부터 재구성된 미세소포의 현탁액에 대해 15 kPa 이상 또는 그 이상 및 최대 약 25 kPa의 압력 저항의 증가가 동결 건조된 제품의 열처리 후에 얻어진다.
실험 8.4
배치 7h의 바이알을 2 내지 24시간 범위의 시간 동안 38℃에서 열처리하였다. 그런 후 바이알 중의 제품을 5 mL의 식염수로 재구성하고 현탁액 중의 미세소포의 특징을 측정하였다. 결과를 하기 표 6에 기록한다.
Figure 112021133569273-pct00002
상기 표로부터 유추할 수 있는 바, 재구성된 현탁액 중의 미세소포의 증가하는 압력 저항이, 동결 건조된 물질을 증가하는 시간, 최대 8-12시간 동안 38℃에서 열처리할 때 얻어진다. 물질의 추가 가열 (16 또는 24시간)은 실질적으로 압력 저항을 추가로 증가시키지 않는다.

Claims (20)

  1. 가스 충전된 미세소포를 제조하기 위한 동결 건조된 제제로서,
    다음의 지질 구성요소: (a) 다이스테아로일-포스파티딜콜린 (DSPC), (b) 5000 g/mol의 분자량을 가지는 폴리에틸렌글리콜과 콘쥬게이션된 다이팔미토일포스파티딜-에탄올아민 (DPPE-PEG5000) 및 (c) 팔미트산의 혼합물을 포함하며; 상기 지질 구성요소는 65 내지 85/4 내지 10/8 내지 22의 각각의 몰량 a/b/c/로 존재하고,
    제제는 폴리에틸렌 글리콜 4000 g/mol (PEG4000)를 추가로 포함하며 지질 구성요소의 혼합물은 PEG4000의 중량과 관련하여 0.3% 이상 내지 0.5%의 중량을 가지는, 동결 건조된 제제.
  2. 제1항에 있어서, 상기 각각의 몰량은 70-80/5-8/12-21인 것을 특징으로 하는 동결 건조된 제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 각각의 몰량은 72-76/6-9/15-20인 것을 특징으로 하는 동결 건조된 제제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 각각의 몰량은 74 (+/- 1)/7.5 (+/- 0.5)/18.5 (+/-1)인 것을 특징으로 하는 동결 건조된 제제.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중량은 0.35 중량% 내지 0.45 중량%인 것을 특징으로 하는 동결 건조된 제제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 중량은 0.38 중량% 내지 0.40 중량%인 것을 특징으로 하는 동결 건조된 제제.
  7. 가스 충전된 미세소포의 현탁액으로서, 상기 미세소포는 지질 구성요소 DSPC, DPPE-PEG 및 팔미트산의 혼합물을 65-85/4-10/8-22의 각각의 몰량으로 포함하고, 상기 현탁액은 폴리에틸렌 글리콜 4000 g/mol (PEG4000)를 추가로 포함하며; 지질 구성요소의 혼합물은 PEG4000의 중량과 관련하여 0.3% 이상 내지 0.5%의 중량을 가지는, 미세소포의 현탁액.
  8. 제7항에 있어서, 상기 각각의 몰량은 70-80/5-8/12-21인 것을 특징으로 하는 현탁액.
  9. 제7항에 있어서, 상기 각각의 몰량은 72-76/6-9/15-20인 것을 특징으로 하는 현탁액.
  10. 제7항에 있어서, 상기 각각의 몰량은 74 (+/- 1)/7.5 (+/- 0.5)/18.5 (+/-1)인 것을 특징으로 하는 현탁액.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 구성요소의 혼합물은 PEG4000의 중량과 관련하여 0.35% 내지 0.45%의 중량을 가지는 것을 특징으로 하는 현탁액.
  12. 제11항에 있어서, 상기 중량은 0.38% 내지 0.40%인 것을 특징으로 하는 현탁액.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따르는 동결 건조된 제제를 250 mg 내지 350 mg으로 포함하는 밀봉된 바이알.
  14. 제5항에 따르는 동결 건조된 제제를 250 mg 내지 350 mg으로 포함하는 밀봉된 바이알.
  15. 제6항에 따르는 동결 건조된 제제를 250 mg 내지 350 mg으로 포함하는 밀봉된 바이알.
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