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KR102605543B1 - 메티오닌-생산 효모 - Google Patents

메티오닌-생산 효모 Download PDF

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KR102605543B1
KR102605543B1 KR1020207004034A KR20207004034A KR102605543B1 KR 102605543 B1 KR102605543 B1 KR 102605543B1 KR 1020207004034 A KR1020207004034 A KR 1020207004034A KR 20207004034 A KR20207004034 A KR 20207004034A KR 102605543 B1 KR102605543 B1 KR 102605543B1
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아디쎄오 프랑스 에스에이에스
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Abstract

본 발명은 메티오닌 및/또는 그 유도체의 생물-생산 분야에 관한 것이며, 보다 상세하게는 MeSH 또는 MeSNa와 같은 환원된 황 소스로부터 메티오닌 및/또는 그 유도체의 생물-생산 분야에 관한 것이다. 본 발명자들은 모 효모와 비교해 메티오닌 및/또는 그 유도체의 생산력이 증가된 유전자 변형된 효모를 구상하였다.

Description

메티오닌-생산 효모
본 발명은 메티오닌 및/또는 그 유도체의 생물-생산 (bio-production) 분야에 관한 것이며, 보다 상세하게는 MeSH 또는 MeSNa와 같은 환원된 황 소스로부터 메티오닌 및/또는 그 유도체의 생물-생산 분야에 관한 것이다.
메티오닌은 황-함유 단백질성 아미노산 2종 중 하나로서, 인간을 제외한 포유류 및 인간 등의 살아있는 수많은 유기체의 대사에 필수 성분이다. 메티오닌은 피부, 털 (hair feather) 및 손발톱에서 각각 콜라겐 또는 케라틴과 같은 구조 단백질에 주로 존재한다. 약 5%의 가장 높은 메티오닌 함량은 알부민, 특히 계란 알부민 (egg albumin)에서 확인할 수 있다.
대부분의 식물, 진균 및 박테리아는 탄수화물, 유기 또는 무기 질소 및 황 소스로부터 메티오닌을 합성할 수 있다. 그러나, 인간을 비롯한 동물은 외부로부터 공급되는 메티오닌 소스에 의존한다. 유기 농법, 특히 가금류 및 돼지 사육시, 메티오닌은 가금류 및 새끼 돼지에서 각각 첫번째 및 세번째 제한 아미노산으로 간주되어, 메티오닌 공급이 중요하다. 메티오닌 생산물 대부분이 가축 생산에서 동물 사료로 사용된다. 오늘날, 메티오닌은 주로 메틸 머캅탄, 아크롤레인 및 시안화수소로부터 화학 합성을 통해 제조된다. 화학적으로 제조된 메티오닌이 대부분의 용도로 사용될 수 있다. 그러나, 화석 자원의 감소와 보다 강력한 환경적 제약 (예, 유해 중간체 및 폐기물) 현실로 인해, 천연 자원을 이용한 대안적이고 보다 지속가능한 공정에 대한 관심이 점점 많은 생기고 있다. 나아가, 여러가지 산업적인 이용을 위한 비용-절감성 메티오닌 소스에 대해 종합적인 연구가 이루어지고 있다.
메티오닌은, 5-모노치환된 히단토인 유도체, O-숙시닐-L-호모세린 또는 O-아세틸호모세린와 같은 전구체 화합물로부터, 효소 변환 또는 발효에 의한 비-합성 공정으로도 제조할 수 있다. 그러나, 이들 전구체는 대개 화학적으로 합성되거나 또는 제1 단계에서 발효에 통해 생산하여야 하므로, 화학 합성 공정 이상의 실질적인 산업적 또는 경제적 이점은 없다. 발효 방법을 통해 메티오닌을 생산 및 정제하는 방법에 대한 예시적인 구현예는 미국 특허 출원 US 2012/0190084 및 미국 특허 출원 US 2007/0122888에 개시되어 있다.
천연 소스로부터 발효에 의한 메티오닌 생산이 상기한 문제들을 해결할 수 있다. 적절한 조건에서 아미노산을 과다 생산할 수 있는 박테리아 및 효모들이 다수 존재한다. 그러나, L-메티오닌 합성은 조절하기 매우 복잡하여, 오직 수종의 균주에서만 메티오닌을 적정량으로 생산할 수 있다. 즉, 발효 공정에 의한 메티오닌 생산의 주된 문제는 여러가지 피드백 저해가 존재하는 매우 복잡한 메티오닌 생합성에 있다 (Becker et al., 2012, Current opinion in Biotechnology, Vol. 23(5): 718-726). 또 다른 문제는 황 소스인데, 이는 일반적으로 무기 설페이트로 공급받아 메티오닌에까지 전달될 수 있기 전에 상당히 환원된다. 모든 경우에, 후보 메티오닌 생산 유기체는 해당 생산 균주로서 확정되기 전에 수차례의 돌연변이 및 선별 과정을 거쳐야 한다. 자발적인 돌연변이 또는 화학적-유발성 돌연변이 유발 후 선별된 메티오닌-생산 후보 미생물의 예들은 미국 특허 출원 US 4,439,525 및 Halasz et al. (1996, Periodica Polytechnica Ser. Chem. Engl., Vol. 40(1-2) : 53-78)에 기술되어 있다.
메티오닌과 같은 필수 아미노산을 박테리아 및 효모의 생합성 경로를 통해 생산하기 위해서는, NADPH 형태의 상당한 수준의 환원력 (reducing power)이 요구된다. 그러나, 이들 미생물, 특히 효모에서 글루코스 대사의 주 경로는 당분해 및 이후의 발효로서, 이 경로는 NADH만 생산한다. 미생물에서 NADPH/NADH 균형을 유지하는 것이, 비록 복잡하더라도, 살아있는 재조합 미생물을 수득하는 동시에 메티오닌의 생물-생산을 최적화하기 위해서는, 필수적이다.
공지된 주된 박테리아 아미노산 생산 균주는 그람-양성의, 통성 혐기성, 비-병원성 토양 미생물인, 코리네박테리움 글루타니쿰 (C. glutanicum)이다. 코리네박테리움 글루타니쿰은 풍미 강화제인 L-글루타메이트 및 식품 첨가제 L-라이신의 공업적인 대량 생산에 이용된다. 코리네박테리움 글루타니쿰을 발효시켜, 특히 박테리아 배양 배지에 환원된 황을 공급함으로써, 메티오닌을 생산하는 다양한 시도들이 시도되어 왔다.
다른 개선된 전략에 따르면, 후보 미생물의 유전자 조작을 통한, 주로 박테리아 유기체 E. coli 및 코리네박테리움 글루타니쿰의 유전자 조작을 통한, 발효에 의한 메티오닌 생산 증가도 연구되었다. 이러한 예는 PCT 특허 WO 02/18613, WO 2007/077041, WO 2009/043372, WO 2012/090021, WO 2013/001055, WO 2013/190343, US 특허 US 2009/0298135 및 US 2013/0183727뿐 아니라 Park et al. (2007, Metab Eng, Vol. 9(4): 327-336)에 기술되어 있다.
당해 기술 분야에서는 또 다른 메티오닌 생산 방법이 여전히 요구되고 있다.
이에, 본 발명은, 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모로서, 상기 재조합 효모의 게놈에서,
(A) 아스파르테이트 세미-알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산 및/또는 코엔자임으로서 NAD 및/또는 NADP를 이용할 수 있는 아스파르테이트 세미-알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이, 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있고;
(B) 아스파르토키나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있고;
(C) (i) a) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 MET2를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나; 및/또는
호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나,
b) 메티오닌 신타제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나; 및/또는
(ii) a) 호모세린 키나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있고, 및
b) O-포스포-L-호모세린 (OHPS) 의존적인 메티오닌 신타제 활성이 개선된 시스타티오닌 γ-신타제 (cystathionine γ-synthase) 1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있는, 재조합 효모에 관한 것이다.
언급된 실시예들에 예시된 바와 같이, 본 발명의 재조합 효모는 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 생산성 증가를 나타낸다.
이러한 유익한 특성은 이하 설명한 추가적인 변형을 가진 효모를 재조합함으로써 추가로 강화할 수 있다.
메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모는, 따라서, 후술한 바와 같이, 메티오닌 및/또는 하나 이상의 그 유도체를 생산하는 방법에 사용하거나, 또는 메티오닌 및/또는 그 유도체를 생산하기 위해 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 아래 단계들을 포함하는 메티오닌 및/또는 하나 이상의 그 유도체의 생산 방법에 관한 것이다:
(a) 본 발명에 따른 재조합 효모를 배양 배지, 바람직하게는 MeSH, MeSNa 및/또는 MeSMe를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
(b) 배양 배지에서 메티오닌 및/또는 하나 이상의 그 유도체를 회수하는 단계.
특정 구현예에서, 배양 배지는 적어도 탄소원, 바람직하게는 글루코스 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원을 포함한다.
본 발명의 다른 과제는 메티오닌 및/또는 그 유도체, 특히 메티오닌 및/또는 2-하이드록시-4-(메틸티오)부탄산 (HMB) 및/또는 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB), 바람직하게는 메티오닌 및/또는 2-하이드록시-4-(메틸티오)부탄산 (HMB)을 생산하기 위한 본 발명에 따른 재조합 효모의 용도이다.
메티오닌 유도체는 메티오닌의 변형 후 수득되는 화합물이다. 이에, 본 발명에서, 메티오닌의 유도체를 수득하기 위해, 먼저 메티오닌을 생산한 다음 하나 이상의 추가적인 단계를 통해 메티오닌을 한가지 유도체, 특히 본원에 기술된 한가지 유도체로 변환하는 것이 필수적이다.
본 발명자들은, 미생물 모 균주, 특히 모 효모와 비교해, 메티오닌 및/또는 그 유도체의 생산력이 증가된, 유전자 변형된 미생물, 특히 유전자 변형된 효모를 구상하였다.
이들 유전자 변형된 미생물은 유전자 변형된 효모를 비롯하여 본 명세서 전체에서 설명된다.
정의
본원에서, 용어 "미생물"은 인공적으로 변형되지 않은 효모를 지칭한다. 미생물은, 외래 유전자 인자를 발현할 미생물 "어셉터"에 통합시킬 유전 인자를 제공하거나, 또는 유전자 구축 또는 단백질 발현에 툴로서 사용되는 경우, "도너"일 수 있다. 본 발명의 미생물은 메티오닌의 생합성의 유전자를 발현하는 효모들 중에서 선택된다.
본원에서, 용어 "재조합 미생물" 또는 "유전자 변형된 미생물" 또는 "재조합 효모" 또는 "유전자 변형된 효모"는 유전자 변형되거나 또는 유전자 조작된 효모를 지칭한다. 이들 용어에 대한 일반적인 의미에 따르면, 본 발명의 미생물은 자연에서 발견되지 않으며, 자연에서 발견되는 등가의 미생물로부터 유전 인자의 도입 또는 결손 또는 변형에 의해 변형된 것을 의미한다. 또한, 이는 특이적인 돌연변이 유발 및 특정 선택압에서의 진화 (evolution)를 조합함으로써 새로운 대사 경로의 개발 및 진화에 의해 변형할 수 있다 (예, WO　2004/076659 참조).
이들 유전자가 숙주 미생물에서의 발현을 허용하는 모든 인자들과 함께 미생물에 도입된다면, 미생물은 외인성 유전자를 발현하도록 변형될 수 있다. 미생물은 내인성 유전자의 발현 수준을 조절하도록 변형될 수 있다. 효모와 같은 미생물의, 외인성 DNA를 이용한, 변형 또는 "형질전환"은 당해 기술 분야의 당업자들에게 통례적인 일이다. 특히, 본 발명에 따른 미생물의 유전자 변형, 보다 구체적으로는 본원에 정의된 유전자 변형(들)은, DiCarlo et al. (Nucl. Acids Res., vol. 41, No. 7, 2013: 4336-4343)에 기술된 바와 같이, CRISPR-Cas 시스템을 사용해 수행할 수 있다.
용어 "내인성 유전자"는, 야생형 균주에서 임의의 유전자 변형하기 전에, 미생물에 존재하는 유전자를 의미한다. 내인성 유전자는, 내인성 조절 인자와 더불어 또는 내인성 조절 인자를 치환하기 위해, 이종의 서열을 도입하거나, 또는 염색체 또는 플라스미드에 하나 이상의 보충 카피 수 (supplementary copies)로 도입함으로써, 과다 발현시킬 수 있다. 내인성 유전자의 조절로 유전자 산물의 활성을 상향 조절 및/또는 강화할 수 있거나, 또는 다른 예로, 내인성 유전자 산물의 활성을 하향 조절 및/또는 약화시킬 수 있다. 내인성 유전자의 발현을 강화하기 위한 다른 방법은 염색체 또는 플라스미드에 하나 이상의 보충 카피 수로 도입하는 방법이다.
용어 "외인성 유전자"는, 유전자가 당해 기술 분야의 당업자들에게 널리 공지된 수단에 의해 미생물에 도입되지만, 그 유전자가 야생형 미생물에서는 자연적으로 생성되지 않는 것을 의미한다. 이들 유전자가, 숙주 미생물에서의 발현을 허용하는 모든 인자와 더불어 미생물에 도입된다면, 그 미생물은 외인성 유전자를 발현할 수 있다. 미생물에 외인성 DNA의 형질전환은 당해 기술 분야의 당업자들에게 통례적인 일이다. 외인성 유전자는 숙주 염색체에 삽입되거나, 또는 플라스미드 또는 벡터로부터 염색체 외에서 발현될 수 있다. 복제 오리진 및 세포에서의 카피 수 측면에서 다양한, 여러가지 플라스미드들이 당해 기술 분야에 모두 공지되어 있다. 외인성 유전자의 서열은 숙주 미생물에서 발현되도록 수정될 수 있다. 실제, 당해 기술 분야의 당업자라면, 유추된 단백질을 변형시키지 않으면서, 코돈 용법 편향성과 특정 코돈 용법에 맞게 핵산 서열을 개조하는 방법을 알고 있다.
용어 "이종의 유전자"는, 유전자를 발현하는 수여체 미생물과는 다른 미생물 종으로부터 유래한 유전자를 의미한다. 이는 미생물에서 자연적으로 생기지 않는 유전자를 지칭한다.
본 출원에서, 모든 유전자는 일반명 및 뉴클레오티드 서열, 그리고 이의 아미노산 서열과 함께 언급된다. 공지된 유전자에 대해 등재 번호로 나타낸 설명을 이용해, 당해 기술 분야의 당업자는 다른 유기체, 박테리아 균주, 효모, 진균, 포유류, 식물 등에서 동일한 유전자를 확인할 수 있다. 이러한 통례적인 작업은, 유익하게는, 다른 미생물로부터 유래된 유전자들과 유전자 정렬을 수행하고; 축중 (degenerated) 프로브를 설계하여 다른 유기체에서 대응되는 유전자를 클로닝함으로써, 결정할 수 있는 컨센서스 서열을 이용하여 이루어진다.
당해 기술 분야의 당업자는, 내인성 유전자의 발현을 조절, 특히 상향 조절 또는 하향 조절하기 위한 여러가지 수단을 알고 있다. 예를 들어, 내인성 유전자의 발현을 강화하기 위한 방법은 염색체 또는 플라스미드에 유전자를 하나 이상의 보충 카피로 도입하는 것이다.
다른 방법은 유전자의 내인성 프로모터를 더 강한 프로모터로 치환하는 것이다. 이러한 프로모터는 동종 또는 이종일 수 있다. 본 발명에서 특히 흥미로운 프로모터는 본 명세서 도처에서 보다 상세히 기술된다.
핵산 발현 구조체는 5' 및/또는 3' 인자 서열 및/또는 선택 마커를 더 포함할 수 있다.
용어 "과다 발현"은, 유전자 또는 효소의 발현이 비-변형 미생물과 비교해 증가되는 것을 의미한다. 효소의 발현 증가는 이 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시킴으로써 달성된다. 유전자의 발현 증가는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 모든 기법으로 수행할 수 있다. 이와 관련하여, 과다 발현시키고자 하는 핵산의 상류에 강한 프로모터 확립, 또는 프로모터, 특히 강한 프로모터와 종결인자 사이에 핵산의 복수의 카피로의 도입을 들 수 있다.
용어 "과소 발현 (underexpression)"은, 유전자 또는 효소의 발현이 비-변형 미생물과 비교해 감소되는 것을 의미한다. 효소의 발현 감소는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 낮춤으로써 달성된다. 유전자의 발현 감소는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 모든 기법으로 수행할 수 있다. 이와 관련하여, 과소 발현시키고자 하는 핵산의 상류에 약한 프로모터 확립을 특히 들 수 있다. 또한, 세포에서 모 효소보다 더 빨리 분해되는 효소의 변이체 또는 모 효소보다 활성이 낮은 효소의 변이체를 코딩하는 핵산을 구현하는 방법을 들 수 있다. 모 효소보다 빨리 분해되는 모 효소의 변이체는 degron-태깅된 효소를 포함한다. 또한, 대상 유전자의 전사 활성자의 발현 감소도 들 수 있다.
용어 "유도성 프로모터"는, 하기 조건에서, 프로모터의 활성이 유도되는, 즉 증가되는 프로모터를 정의하기 위해 사용된다:
- 하나 이상의 특정 대사산물(들)의 존재시, 배지 내 대사산물의 농도가 높을수록 프로모터 활성이 더 강해짐; 또는
- 하나 이상의 대사산물(들)가 낮은 농도로 존재하거나 또는 부재시. 이러한 대사산물은, 대사산물 수준 증가가 프로모터의 활성을 유도하는 것과는 다른 것이다.
용어 "억제성 프로모터"는, 하기 조건에서 활성이 억제되는, 즉 감소되는 프로모터를 정의하기 위해 사용된다:
- 하나 이상의 특정 대사산물(들)의 존재시, 배지내 대사산물의 농도가 높을수록 프로모터의 활성은 약해짐; 또는
- 하나 이상의 대사산물(들)이 낮은 농도로 존재하거나 또는 부재시. 이러한 대사산물은, 대사산물의 수준 증가시 프로모터의 활성을 억제하는 것과는 다른 것이다. 대사산물의 농도가 낮을수록 프로모터 활성이 약해진다.
본원에서, "degron-태깅된" 효소는, (i) 유비퀴틴-독립적인 분해 또는 (ii) 유비퀴틴-의존적인 분해일 수 있는 효소의 분해를 유발하는 파괴 신호로서 사용되는 부가된 단백질-분해 신호 아미노산 서열을 포함하는 효소를 의미한다. 이러한 부가된 단백질-분해 신호는, 당해 기술 분야에서 "degron"으로 언급되며, 파괴 신호로서 사용되는 아미노산 서열을 포함하며, 이러한 아미노산 서열은 타겟화된 단백질 분해를 유발하는 운반성 분해 신호 (transferrable degradation signal)로 구성된다. Degron은 널리 알려진 N-말단 법칙에 따라 타겟 단백질 분해를 유발하는 이동성 N-말단 아미노산인 "N-degron"을 포함한다 (Bachmair et al., 1986, Science, Vol. 234 (4773): 179-186). N-degron의 불안정한 특성은, 아세틸화 또는 아르기닐화 변형되어 유비퀴틴화 및 분해로 이어지는 경향이 있는, 이의 첫번째 아미노산으로 인한 것이다. 일반적으로, degron은 타겟화된 단백질 분해를 위해서는 2 이상의 성분을 필요로 한다: (i) 폴리-유비퀴틴 태그와 같은 분해 인지 태그, 및 (ii) 분해 인지 태그에 바로 인접한 비-구조화된 아미노산 서열 (unstructured amino acid sequence). 단백질의 degron-태깅, 특히 효소의 degron-태깅과 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 Yu et al. (2015, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 36: 199-204), Cho et al. (2010, Genes & Development, Vol. 24: 438-442), 또는 Fortmann et al. (2015, J Mol Biol, Vol. 427 (17): 2748-2756), Ravid et al. (2008, Nat Rev Mol Cell Biol, Vol. 9(9): 679-690) 및 Hochstrasser (1996, Annu Rev Genet, Vol. 30 : 405-439)를 참조할 수 있다.
효소의 "활성"은 용어 "기능"과 상호 호환적으로 사용되며, 본 발명의 맥락에서 원하는 반응을 촉매하는 효소의 능력을 의미한다.
효소의 "활성 감소" 또는 "활성 약화 (attenuated activity)"라는 용어는, 아미노산 서열의 돌연변이에 의해 수득되는 단백질의 특이적인 촉매 활성 감소 및/또는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 의해 또는 동족 해당 유전자의 결손에 의해 또는 단백질의 degron-태깅에 의해 수득되는 세포내 단백질의 농도 감소를 의미한다.
효소의 "활성 강화"라는 용어는 효소의 특이적인 촉매 활성 증가 및/또는 예를 들어 효소를 코딩하는 유전자의 과다활성에 의해 수득되는 세포내 효소의 양적/이용가능성 증가를 의미한다.
용어 "코딩하는" 또는 "코딩"은 폴리뉴클레오티드가 전사 및 번역 기전을 통해 아미노산 서열을 만드는 프로세스를 지칭한다.
본원에서 고려되는 효소(들)를 코딩하는 유전자(들)는 외인성 또는 내인성일 수 있다.
유전자의 "약화"는 유전자가 비-변형 미생물보다 낮은 수준으로 발현되는 것을 의미한다. 약화는 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 수단 및 방법에 의해 달성할 수 있으며, 상동적인 재조합에 의해 달성되는 유전자 결손, 외부 인자의 약한 프로모터 하에 유전자 또는 유전자 발현 삽입에 의한 유전자 약화를 포함한다. 당해 기술 분야의 당업자는 다양한 세기를 가진 여러가지 프로모터 또는 약한 유전자 발현을 위해 사용되는 프로모터를 알 것이다.
본 발명에서 수행되는 방법은, 바람직하게는, 이종의 뉴클레오티드 서열을 염색체 상의 특정 위치에 안정적으로 도입하기 위한, 또는 유전자 변형된 미생물 세포에서 하나 이상의 타겟 유전자의 기능적 파괴를 위한, 하나 이상의 염색체 삽입 구조체를 사용하여야 한다. 일부 구현예에서, 타겟 유전자의 파괴는 관련된 기능성 단백질의 발현을 방지한다. 일부 구현예에서, 타겟 유전자의 파괴시 파괴된 유전자로부터 비-기능성 단백질이 발현된다.
본 발명의 실시에서 변형시킬 수 있는 염색체 삽입 구조체의 파라미터로는, 비-제한적으로, 상동적인 서열의 길이; 상동적인 서열의 뉴클레오티드 서열; 삽입 서열의 길이; 삽입 서열의 뉴클레오티드; 및 타겟 유전자 좌의 뉴클레오티드 등이 있다. 일부 구현예에서, 각각의 상동적인 서열의 길이에 대한 유효 범위는 20 내지 5,000 bp (base pair), 바람직하게는 50 내지 100 bp이다. 특정 구현예에서, 각각의 상동적인 서열의 길이는 약 50 bp이다. 유전자 타겟팅에 필요한 상동체의 길이에 대한 더 많은 정보는, D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)을 참조한다.
일부 구현예에서, (a) 전술한 DNA 구조체(들)를 삽입하고자 하는 파괴되는 유전자(들)는 유익하게는 형질전환된 미생물 세포를 선별하는데 사용가능한 하나 이상의 선별 마커를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 이러한 선별 마커(들)는 본 발명에 따른 DNA 구조체에 포함된다.
일부 구현예에서, 선별 마커는 항생제 내성 마커이다. 항생제 내성 마커에 대한 예로는, 비-제한적으로, NAT1, AURl-C, HPH, DSDA, KAN<R> 및 SH BLE 유전자 산물 등이 있다. 스트렙토마이세스 노르세이 (S. noursei) 유래의 NAT 1 유전자 산물은 노르세오트리신 (nourseothricin) 내성을 부여하고; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 AURl-C 유전자 산물은 오레오바시딘 (Auerobasidin)(AbA) 내성을 부여하고; 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia) 유래의 HPH 유전자 산물은 히그로마이신 B 내성을 부여하고; 에셰리키아 콜라이 (E. coli) 유래의 DSDA 유전자 산물은 D-세린 및 단독 질소원을 사용해 세포를 플레이트 배양할 수 있게 하며; Tn903 트랜스포존의 KAN<R> 유전자는 G418 내성을 부여하고; 스크렙토알로테이쿠스 힌두스타누스 (Streptoalloteichus hindustanus) 유래의 SH BLE 유전자 산물은 제오신 (Zeocin) (블레오마이신 (bleomycin)) 내성을 부여한다.
일부 구현예에서, 항생제 내성 마커는, 본 발명의 유전자 변형된 미생물 세포를 분리한 후, 제거된다. 당해 기술 분야의 당업자는 특정 유전자 측면에서 적합한 마커를 선택할 수 있다.
일부 구현예에서, 선별 마커는 유전자 변형된 미생물 세포에서 영양요구성 (auxotrophy) (예, 영양상의 영양 요구성 (nutritional auxotrophy))을 구제 (rescue)한다. 이러한 구현예에서, 미생물 모 세포는, 하나 이상의 영양분 (영양요구성 표현형)이 첨가되지 않은 배지에서 미생물 모 세포를 생장시킬 수 없게 만드는, 예를 들어, 효모에서 HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET 15, TRP1, ADE2 및 URA3 유전자 산물과 같이, 아미노산 또는 뉴클레오티드 생합성 경로에서 기능하는 하나 이상의 유전자 산물의 기능성 파괴를 포함한다. 이후, 파괴된 유전자 산물의 기능성 카피 (NB:　유전자의 기능성 카피는 클루베로마이세스, 칸디다 등과 같은 관련 종으로부터 기원할 수 있음)를 코딩하는 염색체 삽입으로 미생물 모 세포를 형질전환함으로써 영양요구성 표현형을 회복시킬 수 있으며, 구축된 유전자 변형된 미생물 세포는 미생물 모 세포의 영양요구성 표현형의 소실을 토대로 선별할 수 있다.
프로모터 서열, 코딩 서열 (예, 효소 코딩 서열) 또는 종결인자 서열을 포함하는 각각의 핵산 서열에 대한 참조 서열들이 본원에 기술된다. 본원은 또한 참조 핵산 서열에 대해 특정한 핵산 동일성 %를 가진 핵산 서열을 포함한다.
대상 아미노산 서열 각각에 대한 참조 서열이 본원에 기술된다. 본원은 또한 참조 아미노산 서열에 대해 특정한 아미노산 동일성 %를 가진 아미노산 서열 (예, 효소 아미노산 서열)을 포함한다.
명백한 이유로, 본원의 전체 내용에서, 고려되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 동일성 각각에 해당되는 구체적인 아미노산 서열 또는 구체적인 핵산 서열은, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 단백질 (또는 효소)의 수득으로 또한 이어져야 한다. 본원에서, 핵산 서열 2종 또는 아미노산 2종 간의 "동일성 %"는 비교 창을 통해 최적으로 정렬된 서열을 비교함으로써 결정된다.
비교 창에서 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 일부는, 따라서, 2종의 서열 간의 최적의 정렬을 달성하기 위해, (부가 또는 결손을 포함하지 않는) 참조 서열과 비교해 부가 또는 결손 (예, 갭)을 포함할 수 있다.
동일성 %는, 양쪽 비교 서열에서 참조될 수 있는, 뉴클레오베이스 (nucleic base) 또는 아미노산 잔기가 동일한 위치의 개수를 결정한 다음, 양쪽 뉴클레오베이스 또는 양쪽 아미노산 잔기 간에 동일하게 관찰될 수 있는 위치 개수를 비교 창에서의 총 위치 개수로 나눈 다음 이에 100을 곱하여, 2종의 서열 간의 뉴클레오티드 동일성 % 또는 2종의 서열 간의 아미노산 동일성 %를 구할 수 있다.
서열 최적 정렬의 비교는 공지된 알고리즘을 사용해 컴퓨터에서 수행할 수 있다.
가장 바람직하게는, 서열 동일성%는 다음과 같이 파라미터가 설정된 CLUSTAL W 소프트웨어 (버전 1.82)로 결정한다: (1) CPU MODE=ClustalW mp; (2) ALIGNMENT="full"; (3) OUTPUT FORMAT="aln w/numbers"; (4) OUTPUT ORDER="aligned"; (5) COLOR ALIGNMENT="no"; (6) KTUP (word size)="default"; (7) WINDOW LENGTH="default"; (8) SCORE TYPE="percent"; (9) TOPDIAG="default"; (10) PAIRGAP="default"; (11) PHYLOGENETIC TREE/TREE TYPE="none"; (12) MATRIX="default"; (13) GAP OPEN="default"; (14) END GAPS="default"; (15) GAP EXTENSION="default"; (16) GAP DISTANCES="default"; (17) TREE TYPE="cladogram" 및 (18) TREE GRAP DISTANCES="hide".
"발효" 또는 "배양"은, 일반적으로, 하나 이상의 단순 탄소원을 포함하며, 필요에 따라 공동-기질을 포함하는, 배양 중인 미생물에 맞게 조정된 적절한 배양 배지를 사용해 발효기에서 이루어진다.
본원에 언급되는 미생물은 옥살로아세테이트로부터 생산물을 생산하기 위한 발효 배지에서 배양할 수 있다. 메티노닌의 최대 생산을 위해, 생산 숙주로서 사용되는 미생물 균주는 바람직하게는 높은 수준의 탄수화물 이용성을 가진다. 이러한 특징은 돌연변이 유발 및 선별, 유전자 조작에 의해 부여될 수 있거나, 또는 천연적일 수 있다. 본 발명의 세포에 대한 발효 배지 또는 "배양 배지"는 글루코스를 적어도 약 10 g/L로 함유할 수 있다. 추가적인 탄소 기질로는, 비-제한적으로, 프럭토스, 만노스, 자일로스 및 아라비노스와 같은 단당류; 락토스, 말토스, 갈락토스 또는 슈크로스와 같은 올리고당; 전분 또는 셀룰로스와 같은 다당류 또는 이들의 혼합물, 그리고 치즈 유청, 옥수수 침지액 (permeate cornsteep liquor), 사탕무 당밀 및 보리 맥아 등이 있을 수 있다. 그외 탄소 기질로 글리세롤을 포함할 수 있다.
그래서, 본 발명에서 이용되는 탄소원은 매우 다양한 탄소 함유 기질을 포함할 수 있으며, 유기체의 선택에 의해서만 제한되는 것으로, 고려된다.
전술한 모든 탄소 기질 및 이들의 혼합물은 본 발명에 적합한 것으로 보이지만, 바람직한 기질은 글루코스, 프럭토스 및 슈크로스, 또는 C5 당을 이용하도록 변형된 미생물의 경우에는, 이들과 자일로스 및/또는 아라비노스와 같은 C5 당과의 혼합물이며, 보다 구체적으로는 글루코스이다.
바람직한 탄소 기질은 글루코스이다.
발효 배지는, 적절한 탄소원 외에도, 원하는 산물을 생산하는데 필요한 효소 경로를 촉진하고 배양물을 증식시키기에 적합한, 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된, 적절한 미네랄, 염, 조인자, 완충제 및 기타 성분을 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명에 따른 재조합 미생물의 배양에 적합한 추가적인 유전자 변형도 고려될 수 있다.
용어 "호기성 조건"은 배양 배지에서 호기성 또는 편성 혐기성 미생물이 최종 전자 어셉터로서 2-산소를 이용하는데 충분한 수준의 산소 농도를 의미한다.
"미세호기 조건 (microaerobic condition)"은 산소의 농도가 공기 중의 농도 보다 낮은, 즉 산소의 농도가 최대 6% 02인 배양 배지를 의미한다.
"적절한 배양 배지"는 탄소원 또는 탄소 기질, 질소원, 예를 들어, 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 우레아, 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 나이트레이트 및 암모늄 포스페이트; 인원, 예를 들어, 모노포타슘 포스페이트 또는 다이포타슘 포스페이트; 미량 원소 (예, 금속 염), 예를 들어, 마그네슘 염, 코발트 염 및/또는 망간 염; 뿐 아니라 아미노산, 비타민, 증식 프로모터 등과 같은 성장인자 등의, 세포의 유지 및/또는 증식에 필수적인 또는 유익한 영양원을 포함하는 배지 (예, 무균, 액체 배지)를 지칭한다. 본 발명에 따르면, 용어 "탄소원" 또는 "탄소 기질" 또는 "탄소 소스"는 헥소스 (예, 글루코스, 갈락토스 또는 락토스), 펜토스, 단당류, 올리고당, 이당류 (예, 슈크로스, 셀로바이오스 또는 말토스), 당밀, 전분 또는 이의 유도체, 셀룰로스, 헤미셀룰로스 및 이들의 조합 등의, 미생물의 정상적인 증식을 뒷받침하기 위해 당해 기술 분야의 당업자들에 의해 사용될 수 있는, 임의 탄소 소스를 지칭한다.
본 발명에서, "메티오닌 유도체"는 본 발명에 따른 메티오닌을 생산하는 미생물, 특히 본 발명에 따라 메티오닌을 생산하는 효모에서 천연적으로 및/또는 인공적으로 존재하는 효소에 의한 변형 후 메티오닌으로부터 수득될 수 있는 화합물이다.
이러한 메티오닌 유도체의 예는, 예를 들어 2-하이드록시-4-(메틸티오)부탄산 (HMB) 또는 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB)일 수 있다.
본 발명에 따라 도입되는 유전자 변형에 대한 일반적인 특징
- 유전자들은 상호 비-배타적인 2가지 타입의 변형에 의해 과다 발현된다:
· 강한 프로모터의 통제 하에 유전자 배치; 및/또는
· 고려되는 유전자를 복수의 카피로 삽입.
- 모든 게놈 변형은 공지된 유전자 조작 기법에 의해 효모에 삽입된다:
- 본 발명에 따른 효모 게놈에 도입된 유전자 구조체에 함유된 연속적인 유전자들은 하기 구조를 가진다:
Prom1-ORF1-term1-ORF2-gene2-term2 - .../... -Promn-ORFn-termn, 여기서:
- Prom1은 코딩 서열 ORF1의 발현을 조절하는 서열이고,
- ORF1은 원하는 단백질 PROT1, 특히 원하는 효소 PROT1을 코딩하는 핵산 서열이고,
- Term1은 신규 합성된 mRNA에서 전사 복합체로부터 mRNA를 분리하는 과정을 촉진하는 신호를 제공함으로써 전사 종결을 매개하는 전사 종결인자 서열이고, 및
- "1", "2", .../... "n"은 동일한 ORF (오픈 리딩 프래임), 프로모터 또는 종결인자를 나타내거나 또는 나타내지 않을 수 있다. 유전자들의 순서는 중요하지 않다. "n"은 일반적으로 5-20 범위의 정수이다. 이러한 구조체는 통제된 위치에서 하나의 효모 염색체에 삽입된다. 일부 구현예에서, 삽입부가 삽입되는 구조체의 기능 또는 수득되는 유전자 변형된 효모의 생존성에 모두 필수적인 것은 아니다.
- 효모가 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애일 경우, 효모 게놈에 도입되되 사카로마이세스 세레비지애가 아닌 다른 유기체로부터 기원하는 유전자들은, 일반적으로, "트랜스코딩 (transcoding)"되며 (일반적으로, "코돈 최적화되며"), 이는 유전자들을 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시키기 위한 최적 코돈 용법을 사용해 합성하는 것을 의미한다. 사카로마이세스 세레비지애 유래 일부 유전자의 뉴클레오티드 서열 (단백질 서열은 아님)은 유전자의 내인성 카피와의 재조합이 최소화되도록 변형된다 ("트랜스코딩됨")
- 유전자는 효모 유전자 조작에서 사용되는 표준 절차를 통해 결손될 수 있다. 일부 구현예에서, 결손시키고자 하는 유전자는 전술한 유전자 구조체들 중 하나를 도입하여 끊거나 (interrupting) 또는 다른 예로, 결손시키고자 하는 유전자를 짧은 뉴클레오티드 가닥으로 치환한다.
- 유전자 발현의 하향 조절은 유전자의 내인성 카피를 파괴하고, 이를 약한 프로모터의 통제 하에 놓인 ORF 카피로 치환함으로써, 달성할 수 있다. 약한 프로모터의 리스트 및 서열들은 본원의 도처에 기술되어 있다.
- 유전자는, 유전자의 내인성 카피를 (필요에 따라) 결손시키고, 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 ORF의 새로운 카피를 배치함으로써, "유도성 또는 억제성"이 될 수 있다. 유도성 또는 억제성 프로모터는, 환경 조건 또는 외부 자극 변동시, 활성이 조절 및 통제, 즉 증가 또는 감소되는 프로모터이다. 유도 또는 억제는 인공적으로 통제될 수 있으며, 이는 대상 유기체에서 자연적으로 발견되지 않는 화학적 화합물, 빛, 산소 농도, 열 또는 저온 (cold)과 같은 비생물학적 요인에 의한 유도 또는 억제를 포함한다. 유도성 또는 억제성 프로모터의 리스트 및 서열은 본원의 도처에 기술되어 있다.
- 본원의 도처에 이미 언급된 바와 같이, 단백질은 Yu et al. 2015, (Current Opinion in Biotechnology, Vol. 36: 199-204)에 언급된 "degron" 기술에 의한 탈안정화를 통해 과소 발현시킬 수 있다. 간략하게는, 이 기법은 변형할 타겟팅 변형을 단백질 서열에 도입하는 것으로 이루어진다. N-말단 법칙으로 알려진 원칙에 따라 처음 2개의 아미노산, 또는 전체 단백질을 유비퀴틴-프로테아좀 분해 경로로 타겟팅하는 더 큰 서열로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 효모
본 발명자들은, 메티오닌 및/또는 그 유도체의 생산 능력이 증가된, 재조합 미생물, 특히 재조합 효모를 구상하였다.
본 발명은, 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체 생산이 증가된 재조합 효모에 관한 것으로, 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체 생산 증가는 유전자 조작 방법에 의해 게놈에 도입된 복수의 변형을 통해 달성된다.
본 발명은, 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모로서, 상기 효모의 게놈에서
(A) 아스파르테이트 세미-알데하이드 데하이드로게나제 HOM2를 코딩하는 하나 이상의 핵산, 및/또는 코엔자임으로서 NAD 및/또는 NADP를 이용할 수 있는 아스파르테이트 세미-알데하이드 데하이드로게나제 HOM2를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있고;
(B) 아스파르토키나제 HOM3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있고;
(C) (i) a) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 MET2를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나; 및/또는
호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있고; 및
b) 메티오닌 신타제 MET17을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나;
및/또는
(ii) a) 호모세린 키나제 THR1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있고, 및
b) O-포스포-L-호모세린 (OHPS) 의존적인 메티오닌 신타제 활성이 개선된, 시스타티오닌 γ-신타제 1 CGS1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이, 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있는, 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 관한 것이다.
본 발명자들은, 효모 세포에 의한 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 생산 증가가 효모 세포의 게놈에 복수의 유전자 변형을 도입함으로써 달성될 수 있다는 것을 알게 되었다. 본원에 충분히 기술된 바와 같이, 이러한 복수의 유전자 변형은 특정 유전자의 과다 발현, 기타 특정 유전자의 통제된 발현 (controlled expression) 및 추가의 다른 유전자의 억제 또는 결손을 포함한다.
효모 세포에 의한 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체 생산 증가는, 후속적인 인공 변형된 대사 경로를 주로 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체를 생산하는 쪽으로 향하게 하고 동시에 제조되는 유전자 변형된 효모 세포의 최적 생존을 유지하면서, 옥살로아세테이트의 대사을 최적화함으로써, 본 발명자들에 의해 달성되었다.
장기간의 연구를 통해, 본 발명자들은, 효모 세포에 의한 다량의 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체 생산이, 옥살로아세테이트에서 순차적인 중간 대사산물인 포스포-아스파르틸, 아스파르틸-세미알데하이드 및 호모세린으로의 변환을 높이고, 부가적으로, 호모세린의 메티오닌으로의 변환을 강화함으로써, 특히 제조되는 재조합 효모 세포의 양호한 생존성을 허용하는 레독스 상태를 유지하면서도, 달성된다는 것을 알게 되었다. 마지막 포인트가 중요한 사항이며, 이것이 연구 활동에서 본 발명자에게 중요한 과제이었다.
본 발명에 따라 제시된 해법은, 예측치 못하게도, 보다 적은 환원력의 사용, NADPH가 아닌 NADH 형태의 환원력의 사용 및/또는 NADPH 대신 NADP 생산을 통해, 메티오닌-생산 경로 중에 효모 세포에서 실행가능한 NADH/NADPH 평형을 유지할 수 있게 한다.
본 명세서에 상세히 기술된 바와 같이, 제조되는 재조합 효모 세포는, (I) 아스파르테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제-코딩 유전자 ( HOM2)의 과다 발현 및/또는 통제된 발현을 달성하고, (II) 아스파르토키나제-코딩 유전자 ( HOM3 )의 통제된 발현을 달성하도록, 유전자 변형된다.
나아가, 본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 일부 구현예에서, 효모는 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 생산에서 중간 대사산물 아스파르틸-세미알데하이드를 최적으로 사용하기 위한 유전자 변형을 추가로 포함하며, 이러한 추가적인 유전자 변형은 (i) 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자 ( MET2 ; METX ) 및 (ii) 메티오닌 신타제 ( MET17)의 과다 발현을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 일부 구현예에서, 효모는 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 생산에서 중간 대사산물 아스파르틸-세미알데하이드를 최적으로 사용하기 위한 또 다른 추가적인 유전자 변형을 포함하며, 이러한 추가적인 유전자 변형은 (i) 호모세린 키나제-코딩 유전자 ( THR1)의 과다 발현 및 (ii) O-포스포-L-호모세린 (OHPS) 의존적인 메티오닌 신타제 활성이 개선된 시스타티오닌 γ-신타제 1 (CGS1)의 과다 발현을 포함한다.
이에, 본 발명은, 하기 목적으로 게놈이 변형된, 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 관한 것이다:
(A) 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제의 과다 발현 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치,
(B) 아스파르토키나제의 발현 조절, 및
(C) (i) (a) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 및 (b) 메티오닌 신타제의 과다 발현 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치, 및/또는
(ii) (a) 호모세린 키나제 및 (b) O-포스포-L-호모세린 (OHPS) 의존적인 메티오닌 신타제 활성이 개선된 시스타티오닌 γ-신타제 1의 과다 발현 및/또는. 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치.
본 발명에 따른 재조합 효모는 전술한 유전자 변형을 포함하지 않는 모 효모보다 높은 수율로 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체를 생산한다. 나아가, 본 발명에 따른 재조합 효모는 설페이트를 사용하지 않고도 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체를 생산하지만, 대신 메탄티올 (MeSH), 소듐 메탄티올레이트 (MeSNa) 또는 다이메틸티오에테르 (MeSMe)와 같은 환원된 황 소스를 이용함으로써 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체를 생산한다. 예를 들어, 황을 설페이트 (SO4) 대신 환원된 형태 (SH)로 이용하여, 유익하게는 NADPH의 소비를 낮출 수 있다. 또한, 메티오닌을 합성하기 위해 MeSH, MeSNa 또는 MeSMe, 특히 MeSH를 이용함으로써, 이는 환원된 황 소스일 뿐 아니라 중요한 메틸 소스가 되는 2가지 이점을 가진다. 이는, 유익하게는, 아세틸-호모세린 (또는 포스포호모세린)으로부터 바로 메티오닌을 수득할 수 있으며, 시스타티오닌의 생산도 호모시스테인의 생산도 경유하지 않아도 된다.
아울러, 본 발명에 따른 재조합 효모는, 적절한 글루타메이트 데하이드로게나제 또는 적절한 아스파르테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제와 같이, NADPH보다는 NADH를 이용하는 효소의 발현을 촉진하도록, 유전자 변형된 것이다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 일부 구현예에서, 발현되는 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제 (HOM2)는 강한 프로모터 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치된 사카로마이세스 세레비지애 내인성 유전자로 구성된다.
일부 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제는 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 HOM2 유전자에 의해 코딩된다.
일부 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제는 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 HOM2 유전자에 의해 코딩되며, 유전자는 본원의 실시예에 나타낸 바와 같이 NAD 및/또는 NADP 둘다를 이용하는 돌연변이된 HOM2 단백질을 코딩한다. 이러한 유전자 변이체는, 예를 들어, 실시예에서 예시되며, HOM2-1으로 지칭된다. 이는 이하 언급된 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애 HOM2 유전자 돌연변이이다.
HOM2의 코엔자임으로서 NADP 고 선택성을 완화하고 NAD에 대한 효소 친화성을 높이기 위해, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제 변이체 내 수개의 아미노산 잔기를 타겟으로 하는 돌연변이들의 특징들은 당해 기술 분야의 당업자에 공지되어 있으며, 예를 들어 Faehnle, C. R. et al., Journal of Molecular Biology 1055-1068 (2005)에서 찾아볼 수 있다. 특히, 뉴클레오티드 서열에서 115-117번 위치의 TCT 뉴클레오티드를 GAG 뉴클레오티드로 치환한, 돌연변이 S39 내지 E39를 들 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자에 널리 공지된 아미노산의 명칭과 관련해, S는 세린을, E는 글루탐산을 의미한다.
일부 구현예에서, 아스파르토키나제 (HOM3)는, 본원의 실시예에 나타낸 바와 같이, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 HOM3 유전자에 의해 코딩된다.
나아가, 아스파르토키나제 발현의 통제된 발현은 아스파르토키나제-코딩 핵산을 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치함으로써 달성된다. 본 발명에 따른 재조합 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 효모를 수득하기 위해 사용될 수 있는 예시적인 유도성 또는 억제성 프로모터는 본 명세서 도처에 기술되어 있다.
예시적으로, 유도성 또는 억제성 프로모터가 사카로마이세스 세레비지애로부터 기원한 pCUP1-1 프로모터인 구현예에서, 아스파르토키나제의 발현은 배양 배지에 구리를 첨가함으로써 유도할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자는 특히 Koller et al. (2000, Yeast, Vol. 16 : 651-656)를 참조할 수 있다.
재조합 효모의 구현예 "(C)-(i)"
본원에서 이미 명시된 바와 같이, 본 발명의 재조합 효모 구현예 "(C)-(i)"에는, (a) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 (MET2 및/또는 METX)의 과다 발현 및 (b) 메티오닌 신타제 (MET17)의 과다 발현이 존재한다.
일부 구현예에서, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제는 가장 바람직하게는 본원의 실시예에 언급된 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애 MET2-유전자에 의해 코딩된다.
일부 구현예에서, 메티오닌 신타제는 가장 바람직하게는 본원의 실시예에 언급된 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애 MET17-유전자에 의해 코딩된다.
재조합 효모의 구현예 "(C)-(ii)"
본원에서 앞서 명시한 바와 같이, 본 발명의 재조합 효모의 구현예 "(C)-(ii)"에는, 호모세린 키나제 (THR1)의 과다 발현 및 (b) O-포스포-L-호모세린 (OHPS) 의존적인 메티오닌 신타제 활성이 개선된, 시스타티오닌 γ-신타제 1 (CGS1)을 코딩하는 외인성 핵산의 삽입이 존재한다.
일부 구현예에서, 호모세린 키나제는 가장 바람직하게는 본원의 실시예에 언급된 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애 THR1-유전자에 의해 코딩된다.
일부 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1은 본원의 실시예에 기술되고 후술한 바와 같이 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) CGS1-유전자에 의해 코딩된다.
본 발명에 따른 재조합 효모를 수득하기 위해 도입되는 유전자 변형은 특징은 아래에서 더욱 상세히 설명된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 효모는 구현예 "(C)-(i)" 및 구현예 "(C)-(ii)"에 따른 변형을 포함할 수 있다.
아스파르테이트 - 세미알데하이드 데하이드로게나제 -코딩 유전자의 과다 발현 및/또는 통제된 발현
본 발명에 따른 재조합 효소에 대한 바람직한 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제-코딩 유전자의 과다 발현은, 효모 게놈의 선택된 위치(들)에 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 삽입함으로써, 달성된다. 본 발명에 포함되는 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제 및 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제-코딩 유전자는 본 명세서 도처에 상세히 기술되어 있다.
일부 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 구현예의 대안으로서 또는 추가적으로, 하나 이상의 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능하는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치될 수 있다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제의 과다 발현이 중간 대사산물 아스파르틸 포스페이트 (아스파르틸-P)에서 아스파르틸-세미알데하이드로의 변환을 강화할 수 있다고 생각한다. 하나 이상의 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있을 경우에 동일하게 적용된다.
일부 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제는 아스파르틸 포스페이트 (아스파르틸-P)에서 아스파르틸-세미알데하이드로의 촉매적 변환에 NADH 또는 NADPH를 둘다 이용하는 효소 변이체일 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 상기한 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제-코딩 유전자는, 사카로마이세스 세레비지애 유래 HOM2 유전자이거나, 또는 다른 예로 본원의 실시예와 앞에서 언급된 바와 같이 NADH 및/또는 NADPH 둘다를 이용하는 HOM2 변이체이다.
바람직한 구현예에서, 상기한 아스파르테이트 세미-알데하이드 데하이드로게나제-코딩 유전자는 강한 프로모터 pADH1, 강한 프로모터 pTEF1, 유도성 또는 억제성 프로모터 pCUP1-1 또는 유도성 또는 억제성 프로모터 pACU8의 통제 하에 배치된다.
예시적으로, HOM2 유전자는 본원의 실시예에 나타낸 바와 같이 HOM3 유전자 내에 및/또는 PYK2 유전자 내에 및/또는 MUP3 유전자 내에 및/또는 SAM1 유전자 내에 및/또는 SAM2 유전자 내에 삽입될 수 있다.
아스파르토키나제 -코딩 유전자의 통제된 발현
본 발명에 포함되는 아스파르토키나제 및 아스파르토키나제-코딩 유전자는 본 명세서의 도처에서 상세히 설명된다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 아스파르토키나제-코딩 유전자의 통제된 발현으로, 본 발명에 따른 재조합 효모의 높은 생존성에 기여하는 아스파르테이트에서 아스파르틸 포스페이트 (아스파르틸-P)로의 통제된 수준의 변환이 달성된다고 생각하였다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 일부 구현예에서, 아스파르토키나제-코딩 유전자의 통제된 발현은, 유도성 또는 억제성 프로모터와 같이, 유도성 조절 인자의 통제 하에 배치된 아스파르토키나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 효모 게놈의 선택 위치(들)에 삽입함으로써, 달성된다.
일부 구현예에서, 아스파르토키나제-코딩 유전자의 통제된 발현은, 효모 게놈에 본래 존재하는 내인성 프로모터를 그 게놈 위치에서 치환하는, 유도성 또는 억제성 프로모터와 같은 유도성 조절 서열을 천연 효모 아스파르토키나제 오픈 리딩 프래임 위치에 삽입함으로써 수득된다.
일부 바람직한 구현예에서, 상기한 아스파르토키나제-코딩 유전자는 본원에 실시예에 나타낸 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 HOM3 유전자이다.
바람직한 구현예에서, 상기한 아스파르토키나제-코딩 유전자는 유도성 또는 억제성 프로모터 pCUP-1-1, 유도성 또는 억제성 프로모터 pSAM4 또는 유도성 또는 억제성 프로모터 pACU3p의 통제 하에 배치된다.
예시적으로, HOM3 유전자는 본원의 실시예에 나타낸 바와 같이 TRP1 유전자 및/또는 HOM3 유전자 및/또는 MUP3 유전자 및/또는 SAM3 유전자에 삽입될 수 있다.
호모세린의 메티오닌으로 변환하기 위한 변형 경로에 대한 제1 구현예
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 구현예들에서, 효모는 메티오닌 생산에 중간 대사산물 아스파르틸-세미알데하이드를 최적 사용하기 위한 유전자 변형을 추가로 포함하며, 추가적인 유전자 변형은 (i) 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자 (MET2 또는 METX) 및 (ii) 메티오닌 신타제 (MET17, 또한 MET25 또는 MET15으로 지칭됨)의 과다 발현, 및/또는 이들 유전자의 통제된 발현을 포함한다.
이에, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 효모의 게놈에서,
a) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 MET2를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치되거나, 및/또는
호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치되고,
b) O-아세틸 호모세린-O-아세틸 세린 설프하이드릴라제 MET17을 코딩하는 하나 이상의 핵산은 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치된다.
호모세린-O- 아세틸트랜스퍼라제 -코딩 유전자의 과다 발현 및/또는 통제된 발현
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 바람직한 구현예에서, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자의 과다 발현은, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 효모 게놈의 선택 위치(들)에 삽입함으로써, 달성된다. 본 발명에 포함되는 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 및 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는 본 명세서 도처에서 상세히 설명된다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 이러한 구현예 외에도 또는 이의 대안으로서, 하나 이상의 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능하는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓일 수 있다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제의 과다 발현이 아세틸-CoA의 존재시 중간 대사산물 호모세린에서 O-아세틸호모세린으로의 변환 수준을 높인다고 생각하였다. 하나 이상의 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있을 경우에도 동일하게 적용된다.
바람직한 구현예에서, 상기한 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는, 본원에 실시예에 나타낸 바와 같이, 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래되는 유전자이다.
바람직한 구현예에서, 상기한 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는, 본원에 실시예에 나타낸 바와 같이, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum) 유래의 METX 유전자이다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 효모는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 유전자인 하나 이상의 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자와, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 METX 유전자인 하나 이상의 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기한 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 유전자는, 독립적으로, 복수의 카피로 존재한다면, pPDC1, pTDH3, pADH1, pCCW12, pENO2 또는 pTEF3와 같은 강한 프로모터 또는 pCUP1, pCUP1-1 또는 pSAM4와 같은 강한 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 각각의 카피가 배치된 유전자이다.
예시적으로, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 MET2/METX 유전자는, 본원의 실시예들에 나타낸 바와 같이, HOM3 유전자 및/또는 MAE1 유전자 및/또는 MUP3 유전자 및/또는 URA3 유전자 및/또는 LYP1 유전자에 삽입될 수 있다.
메티오닌 신타제 -코딩 유전자의 과다 발현 또는 통제된 발현
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 바람직한 구현예에서, 메티오닌 신타제-코딩 유전자의 과다 발현은, 효모 게놈의 선택 위치(들)에, 메티오닌 신타제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 삽입함으로써 달성된다. 본 발명에 포함되는 메티오닌 신타제 및 메티오닌 신타제-코딩 유전자는 본 명세서 도처에서 상세히 설명된다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 메티오닌 신타제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이 메티오닌 신타제의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 이러한 구현예 외에도 또는 이의 대안으로서, 하나 이상의 메티오닌 신타제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능하는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓일 수 있다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 메티오닌 신타제의 과다 발현이 중간 대사산물 O-아세틸호모세린에서 메티오닌으로의 변환을 증가시킨다고 생각하였다. 하나 이상의 메티오닌 신타제 코딩 서열 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓인 경우에도 동일하게 적용된다.
바람직한 구현예에서, 상기한 메티오닌 신타제-코딩 유전자는 본원에 실시예에 나타낸 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 유전자이다. MET17은 당해 기술 분야에서, 또한 본 발명의 일부 부분에서는 MET25 또는 MET15으로도 지칭될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기한 메티오닌 신타제-코딩 유전자는 루에게리아 포메로이 (Ruegeria pomeroyi) 유래 유전자이다.
바람직한 구현예에서, 상기한 메티오닌 신타제-코딩 유전자는 강한 프로모터 pTEF3, pCUP1, pCUP1-1 또는 pENO2의 통제 하에 놓인다.
예시적으로, 메티오닌 신타제 유전자는 본원의 실시예들에 나타낸 바와 같이 URA3 유전자, HOM3 유전자 및/또는 MAE1 유전자 및/또는 MUP3 유전자 및/또는 GNP1 유전자 및/또는 LYP1 유전자에 삽입될 수 있다.
호모세린에서 메티오닌으로 변환하기 위한 변형된 경로에 대한 제2 구현예
본 발명에 따른 재조합 효모의 구현예들에 있어서, 상기한 효모는 대안적으로 또는 보완적으로 메티오닌 생산을 위해 중간 대사산물 아스파르틸-세미알데하이드를 최적으로 사용하기 위한 추가적인 유전자 변형을 포함하며, 상기한 추가적인 유전자 변형은 (i) 호모세린 키나제-코딩 유전자 (THR1)의 과다 발현 및 (ii) 시스타티오닌 γ-신타제 1 (CGS1)의 과다 발현, 및/또는 이들 유전자의 통제된 발현을 포함한다.
이에, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 효모의 게놈은 호모세린 키나제 THR1을 코딩하는 하나 이상의 핵산은 독립적으로 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓이거나 및/또는 불안정화된 형태이다.
호모세린 키나제-코딩 유전자 과다 발현 또는 통제된 발현
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 바람직한 구현예에서, 호모세린 키나제-코딩 유전자의 과다 발현은 효모 게놈의 선택 위치(들)에 호모세린 키나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 삽입함으로써 달성된다. 본 발명에 포함되는 호모세린 키나제 및 호모세린 키나제-코딩 유전자는 본 명세서 도처에서 상세히 설명된다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 호모세린 키나제-코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 호모세린 키나제의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 이러한 구현예 외에도 또는 이의 대안으로서, 하나 이상의 호모세린 키나제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능하는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓일 수 있다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 호모세린 키나제의 과다 발현이 중간 대사산물에서 포스포-호모세린으로의 변환을 증가시킨다고 생각하였다. 이는 하나 이상의 호모세린 키나제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있을 경우에도 동일하게 적용된다.
바람직한 구현예에서, 상기한 호모세린 키나제-코딩 유전자는, 본원에 실시예에 나타낸 바와 같이, 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 유전자이다.
바람직한 구현예에서, 상기한 호모세린 키나제-코딩 유전자는 강한 프로모터 pTDH3 또는 유도성 또는 억제성 프로모터 pACU6의 통제 하에 놓인다.
예시적으로, 호모세린 키나제 유전자는 본원의 실시예들에 나타낸 바와 같이 SAM3 유전자에 삽입될 수 있다.
시스타티오닌 γ-신타제 1-코딩 유전자 과다 발현 또는 통제된 발현
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 바람직한 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1-코딩 유전자의 과다 발현은 효모 게놈의 선택 위치(들)에 시스타티오닌 γ-신타제 1 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 삽입함으로써 수득된다. 본 발명에 포함되는 시스타티오닌 γ-신타제 1 및 시스타티오닌 γ-신타제 1-코딩 유전자는 본 명세서 도처에서 상세히 설명된다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 시스타티오닌 γ-신타제 1은 개선된 O-포스포-L-호모세린 (OHPS) 의존적인 메티오닌 신타제 활성을 가진다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이 시스타티오닌 γ-신타제 1의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 이러한 구현예 외에도 또는 이의 대안으로서, 하나 이상의 시스타티오닌 γ-신타제 1-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능하는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓일 수 있다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 시스타티오닌 γ-신타제 1의 과다 발현이 중간 대사산물 포스포-호모세린에서 메티오닌으로의 변환을 증가시킨다고 생각하였다. 하나 이상의 시스타티오닌 γ-신타제 1 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓일 경우 동일하게 적용된다.
바람직한 구현예에서, 상기한 시스타티오닌 γ-신타제 1-코딩 유전자는 본원에 실시예에 나타낸 바와 같이 아라비돕시스 탈리아나로부터 유래되는 유전자이다.
바람직한 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1은 CGS1에 S-아데노실메티오닌에 의해 발휘되는 번역 억제를 완화하는 돌연변이를 포함한다 (Onoue et al. Journal of Biological Chemistry 286 (2011), 14903-149 1). 이러한 돌연변이된 CGS1은 특히 WO 2014064244 출원에 기술되어 있다.
바람직한 구현예에서, 상기한 시스타티오닌 γ-신타제 1-코딩 유전자는 강한 프로모터 pCCW12 또는 강한 유도성 또는 억제성 프로모터 pCUP1-1의 통제 하에 놓인다.
예시적으로, 시스타티오닌 γ-신타제 1 유전자는 본원의 실시예들에 나타낸 바와 같이 SAM3 유전자에 삽입될 수 있다.
(i) 아스파르테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제, (ii) 아스파르토키나제, (iii) 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제, (iv) 메티오닌 신타제, (v) 호모세린 키나제, 및 (vi) 시스타티오닌 γ-신타제 1을 코딩하는 유전자들은 아래에에서 설명된다.
아스파르테이트 - 세미알데하이드 데하이드로게나제 ( HOM2 )
아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제는 L-아스파르틸-4-포스페이트의 환원성 탈인산화에 의해 L-아스파르테이트-세미알데하이드의 NADPH-의존적인 형성을 촉매하는 것으로 당해 기술 분야에 공지된 단백질이다. 사카로마이세스 세레비지애의 게놈에 의해 코딩되는 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제는 HOM2로 지칭될 수 있다.
아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제의 활성 수준을 측정하기 위해 실행되는 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
본 발명에서 바람직한 아스파르테이트 세미알데하이드-데하이드로게나제는 EC 번호 1.2.1.11의 효소이다.
바람직한 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균 (archaebacteria)으로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제의 변이체 또는 돌연변이일 수 있으며, 이러한 변이체 효소 또는 돌연변이 효소는 반응 촉매시 NADH 또는 NADPH 둘다를 이용한다. 이러한 변이체 또는 돌연변이 효소는 당해 기술 분야에 공지되어 있으며, 본원에서 앞서 설명하였다.
다른 바람직한 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 1 및 서열번호 2의 참조 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 핵산과 적어도 27%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성 및 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다. 서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산은 사카로마이세스로부터 기원하는 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하며, 이는 본원에서 총체적으로 HOM2로 지칭된다.
서열과 관련하여 동일한 특성의 생물학적 활성은 L-아스파르틸-4-포스페이트의 환원성 탈인산화에 의해 NADPH-의존적인 L-아스파르테이트-세미알데하이드의 형성을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 27%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 상기한 참조 핵산 서열과 적어도 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 상기한 참조 핵산 서열과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 상기한 참조 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
사카로마이세스 세레비지애 유래의 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제의 아미노산 서열에 대해서는, 당해 기술 분야의 당업자는 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP010442 또는 본원의 서열번호 3을 참조할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 27%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 서열 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다. 예시적으로, 락토바실러스 워사첸시스 (Lactobacillus wasatchensis)로부터 기원하는 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제는 서열번호 3의 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제와 27%의 아미노산 동일성을 가진다.
이 서열과 동일한 특성의 생물학적 활성은 앞서 기술된 바와 같이 L-아스파르틸-4-포스페이트의 환원성 탈인산화에 의해 NADPH-의존적인 L-아스파르테이트-세미알데하이드의 형성을 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 27%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제의 발현 수준은, 하기에서 보다 상세히 설명되는 등의, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 및 3' 위치 각각에 존재하는 하나 이상의 프로모터 및 하나 이상의 종결인자에 의해 규제된다.
본원의 도처에 명시된 바와 같이, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓인다.
일부 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제의 과다 발현은 재조합 효모에서 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제로 발생할 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제의 과다 발현은 재조합 효모의 게놈 내 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제-코딩 서열의 복수의 카피 존재로 인해 발생할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제의 과다 발현은 (i) 재조합 효모 내 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제 및 (ii) 재조합 효모의 게놈 내 아스파르테이트-세미알데하이드 데하이드로게나제-코딩 서열의 복수 카피의 존재 둘다로 인해 발생할 수 있다.
아스파르토키나제 ( HOM3 )
아스파르토키나제 효소는 ATP 존재시 L-아스파르테이트를 4-포스포-L-아스파르테이트로 변환하는 반응을 촉매하는 당해 기술 분야에 기술된 단백질이다. 사카로마이세스 세레비지애의 게놈에 의해 코딩되는 아스파르토키나제는 HOM3로 지칭될 수 있다.
아스파르토키나제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Stadtman et al. (1961, J Biol Chem, Vol. 236 (7) : 2033-2038)에 언급된 방법을 참조할 수 있다.
본원에서 바람직한 아스파르토키나제는 EC 2.7.2.4의 효소이다.
바람직한 구현예에서, 아스파르토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 아스파르토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 아스파르토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 바실러스 섭틸리스 및 효모로부터 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 아스파르토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 아스파르토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 4의 핵산과 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다. 서열번호 4의 핵산은 HOM3로 지칭될 수도 있는 사카로마이세스로부터 기원하는 아스파르토키나제를 코딩한다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 ATP의 존재시 L-아스파르테이트에서 4-포스포-L-아스파르테이트로의 변환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 25%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 상기한 참조 핵산 서열과 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 상기한 참조 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 참조 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
사카로마이세스 세레비지애 유래의 아스파르토키나제의 아미노산 서열에 대해, 당해 기술 분야의 당업자는 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP010972 또는 본원의 서열번호 5를 참조할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 아스파르토키나제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다다. 예시적으로, 아쿠아마리나 아클란티카 (Aquamarina atlantica)로부터 기원한 아스파르토키나제는 서열번호 5의 아스파르토키나제와 25%의 아미노산 동일성을 가진다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 전술한 바와 같으며, 즉 ATP의 존재시 L-아스파르테이트에서 4-포스포-L-아스파르테이트로의 변환을 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 아스파르토키나제의 발현 수준은 아스파트로키나제를 코딩하는 핵산 서열의 각각 5' 및 3' 위치에 존재하는, 아래에서 보다 상세히 설명된 것 등의 하나 이상의 프로모터 및 하나 이상의 종결인자에 의해 규제된다.
본원의 도처에 명시된 바와 같이, 강한 아스파르토키나제 발현은 본 발명에 따른 재조합 효모에서 통제되어야 한다.
바람직한 구현예에서, 아스파르토키나제의 조절된 강한 발현은 아스파르토키나제-코딩 핵산 서열을 적절한 유도성 또는 억제성 프로모터, 바람직하게는 강한 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치함으로써 수행된다.
호모세린 O- 아세틸트랜스퍼라제 ( MET2 ; METX )
호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제 효소는 아세틸-CoA 및 L-호모세린에서 CoA 및 O-아세틸-L-호모세린으로의 반응을 촉매하는 당해 기술 분야에 공지된 단백질이다. 사카로마이세스 세레비지애의 게놈에 의해 코딩된 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 MET2로도 지칭할 수 있다.
호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Shuzo Yamagata (1987, The Journal of Bacteriology, Vol. 169(8): 3458-3463에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본원에서 바람직한 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 EC 2.3.1.31의 효소이다.
바람직한 구현예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 유기체, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 및 효모로부터 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다.
특정 구현예에서, 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 핵산은 박테리아 유래 핵산이며, 특히, 독립적으로 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilius influenza), 스트렙토마이세스 라벤듈라 (Streptomyces lavendulae), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia), 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아 유래 핵산이다.
다른 바람직한 구현예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 6의 핵산과 적어도 27%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다. 서열번호 6의 핵산은 MET2로 또한 지칭될 수 있는 사카로마이세스 세레비지애로부터 기원하는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩한다. 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 기원하는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 일반적으로 METX로 지칭된다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 아세틸-CoA 및 L-호모세린에서 CoA 및 O-아세틸-L-호모세린으로의 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 27%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은 참조 핵산 서열과 적어도 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 상기한 참조 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 참조 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
사카로마이세스 세레비지애 유래의 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 아미노산 서열에 대해, 당해 기술 분야의 당업자는 UniProt 데이터베이스에서 등재번호 NP014122 또는 본원에 기술된 서열번호 7을 참조할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 7의 아미노산 서열과 적어도 27%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다. 예시적으로, 아쿠아마리나 아클란티카로부터 기원하는 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 서열번호 7의 호모세린 O-아세틸 트랜스퍼라제와 27%의 아미노산 동일성을 가진다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 아세틸-CoA 및 L-호모세린에서 CoA 및 O-아세틸-L-호모세린으로의 반응을 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 27%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
전술한 바와 같이, 본원에서 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 발현 수준은,호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 및 3' 위치 각각에 위치한, 이하 보다 상세히 기술된 바와 같은, 하나 이상의 프로모터 및 하나 이상의 종결인자에 의해 규제된다.
본원의 도처에 명시된 바와 같이, 본 발명의 일부 구현예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓인다.
일부 구현예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 과다 발현은 재조합 효모에서의 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제로 발생할 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 과다 발현은 재조합 효모의 게놈에서 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 서열의 복수의 카피의 존재로 발생할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제의 과다 발현은 (i) 재조합 효모에서 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제 및 (ii) 호모세린 O-아세틸트랜스퍼라제-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재 둘다로 인해 발생할 수 있다.
메티오닌 신타제 ( MET17 )
메티오닌 신타제는 메탄티올의 존재시 O-아세틸-L-호모세린 (OAH)의 메티오닌 및 아세테이트로의 변환을 촉매하는 당해 기술 분야에 기술된 단백질이다. 메티오닌 신타제는 또한 OAH에서 호모시스테인으로의 변환 또는 O-아세틸세린 (OAS)에서 시스테인으로의 변환을 촉매하는 기술 분야에서 언급되어 있다. 사카로마이세스 세레비지애 게놈에 의해 코딩된 메티오닌 신타제는 MET17으로 지칭될 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애 게놈에 의해 코딩되는 메티오닌 신타제는 또한 당해 기술 분야에서 MET25 또는 MET15으로도 지칭될 수 있다.
메티오닌 신타제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Ravanel (1995, Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 316 : 572-584)에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 메티오닌 신타제는 EC 번호 2.5.1.49의 효소이다.
바람직한 구현예에서, 메티오닌 신타제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 메티오닌 신타제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 메티오닌 신타제를 코딩하는 핵산(들)은 유기체, 바람직하게는 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애로부터 선택되는 유기체로부터 기원한 핵산(들)일 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 메티오닌 신타제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 8의 핵산과 적어도 47%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다. 서열번호 8의 핵산은 사카로마이세스 세레비지애로부터 기원하는 메티오닌 신타제를 코딩하며, 이는 또한 MET17으로 지칭될 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 메탄티올의 존재시 O-아세틸-L-호모세린 (OAH)의 메티오닌 및 아세테이트로의 변환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 47%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산은 참조 핵산 서열과 적어도 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 상기한 참조 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 참조 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
사카로마이세스 세레비지애 유래의 메티오닌 신타제의 아미노산 서열에 대해, 당해 기술 분야의 당업자는 UniProt 데이터베이스에서 NP013406 또는 본원에 기술된 서열번호 9를 참조할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 메티오닌 신타제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 9의 아미노산 서열과 적어도 47%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다. 예시적으로, 락토코커스 플란타룸 (Lactococcus plantarum)으로 기원하는 메티오닌 신타제는 서열번호 9의 메티오닌 신타제와 47%의 아미노산 동일성을 가진다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 메탄티올의 존재시 O-아세틸-L-호모세린 (OAH)에서 메티오닌 및 아세테이트로의 변환을 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 47%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 메티오닌 신타제의 발현 수준은 메티오닌 신타제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 및 3' 위치 각각에 위치한, 이하 보다 상세히 기술된 바와 같은, 하나 이상의 프로모터 및 하나 이상의 종결인자에 의해 규제된다.
본원의 도처에 명시된 바와 같이, 본 발명의 일부 구현예에서, 메티오닌 신타제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓인다.
일부 구현예에서, 메티오닌 신타제의 과다 발현은 재조합 효모에서의 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제로 발생할 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 메티오닌 신타제의 과다 발현은 재조합 효모의 게놈에서 메티오닌 신타제-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재로 발생할 수 있다.
호모세린 키나제 ( THR1 )
호모세린 키나제 효소는 L-호모세린에서 L-호모세린 포스페이트로의 ATP-의존적인 인산화를 촉매하는 당해 기술 분야에서 공지된 단백질이다. 호모세린 키나제는 사카로마이세스의 게놈에 의해 코딩되며, THR1으로 지칭될 수 있다.
호모세린 키나제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Mannhaupt and Feldmann (1990, Eur J Biochem, Vol. 191: 115-122)에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 호모세린 키나제는 EC 2.7.1.39의 EC 번호를 가진 효소이다.
바람직한 구현예에서, 호모세린 키나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 호모세린 키나제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 호모세린 키나제를 코딩하는 핵산(들)은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 호모세린 키나제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 10의 핵산 서열과 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다. 서열번호 10의 핵산 서열은 사카로마이세스로부터 기원하며, 또한 THR1으로도 지칭될 수 있는 호모세린 키나제를 코딩한다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 L-호모세린에서 L-호모세린 포스페이트로의 ATP-의존적인 인산화를 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 25%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 상기한 참조 핵산 서열과 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 상기한 참조 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 참조 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
사카로마이세스 세레비지애 유래의 호모세린 키나제의 아미노산 서열에 대해, 당해 기술 분야의 당업자는 UniProt 데이터베이스에서 NP011890 또는 본원에 기술된 서열번호 11을 참조할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 호모세린 키나제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다. 예시적으로, 아쿠아마리나 아클라티카 (Aquamarina atlantica)로부터 기원하는 호모세린 키나제는 서열번호 11의 호모세린 키나제와 25%의 아미노산 동일성을 가진다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 L-호모세린에서 L-호모세린 포스페이트로의 ATP-의존적인 인산화를 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 상기한 참조 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 호모세린 키나제의 발현 수준은, 호모세린 키나제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 및 3' 위치 각각에 위치한, 이하 보다 상세히 기술된 바와 같은, 하나 이상의 프로모터 및 하나 이상의 종결인자에 의해 규제된다.
본원의 도처에 명시된 바와 같이, 본 발명의 일부 구현예에서, 호모세린 키나제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓인다.
일부 구현예에서, 호모세린 키나제의 과다 발현은 재조합 효모에서의 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제로 발생할 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 호모세린 키나제의 과다 발현은 재조합 효모의 게놈에서 호모세린 키나제-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재로 발생할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 호모세린 키나제의 과다 발현은 (i) 재조합 효모에서 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제 및 (ii) 호모세린 키나제-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재 둘다로 인해 발생할 수 있다.
시스타티오닌 γ-신타제 1 ( CGS1 )
시스타티오닌 γ-신타제 1 효소는 γ-치환 반응을 통해 L-시스타티오닌에서 호모세린 에스테르 및 L-시스테인으로의 형성을 촉매하는, 당해 기술 분야에 개시된 단백질이다. 아라비돕시스 탈리아나의 게놈에 의해 코딩되는 시스타티오닌 γ-신타제 1은 CGS1으로 지칭될 수 있다.
시스타티오닌 γ-신타제 1의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Loizeau et al. (2007, Plant Physiology, Vol. 145 : 491-503)에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 시스타티오닌 γ-신타제 1은 EC 2.5.1.48의 효소이다.
바람직한 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1을 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1을 코딩하는 핵산(들)은 식물, 특히 아라비돕시스 탈리아라로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1을 코딩하는 핵산(들)은, CGS1으로도 지칭될 수 있는, 아라비돕시스 탈리아나로부터 기원하는, UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NM_110977.3, 특히 서열번호 12의 핵산 서열과 적어도 40%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다.
특정 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1 돌연변이를 코딩하는 핵산은, 독립적으로, 식물 시스타티오닌 γ-신타제 1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 미생물에 속하는 핵산이며, 바람직하게는 아라비돕시스 탈리아나 유래의 시스타티오닌 γ-신타제 1이다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 γ-치환 반응을 통해 L-시스타티오닌에서 호모세린 에스테르 및 L-시스테인을 형성하는 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 40%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 12의 핵산, 특히 서열번호 12의 핵산과 100%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 참조 핵산 서열과 적어도 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 12의 핵산을 가진, 특히 서열번호 12의 핵산과 100%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 참조 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 12의 핵산, 특히 서열번호 12의 핵산과 100%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 참조 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
아라비돕시스 탈리아나 유래의 시스타티오닌 γ-신타제 1의 아미노산 서열에 대해서, 당해 기술 분야의 당업자는 UniProt 데이터베이스에서 NP186761 또는 본원에 기술된 서열번호 13을 참조할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1을 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 UniProt 데이터베이스에서 NP186761의 아미노산 서열과 적어도 40%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 γ-치환 반응을 통해 L-시스타티오닌에서 호모세린 에스테르 및 L-시스테인을 형성하는 반응을 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 40%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 UniProt 데이터베이스에서 NP186761의 아미노산 서열과 적어도 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 UniProt 데이터베이스에서 NP186761의 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 13의 아미노산 서열 또는 UniProt 데이터베이스에서 NP186761의 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 재조합 효모에 사용되는 시스타티오닌 γ-신타제 1은 출원 WO2014064244에 언급된 CGS1의 돌연변이들 중에서 선택될 수 있으며, 특히 본원에 따른 O-포스포-L-호모세린 (OHPS) 의존적인 메티오닌 신타제이다.
이러한 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 시스타티오닌 γ-신타제 1은 다음과 같이 (i) - (ii)일 수 있다:
(i) 서열번호 13에서 하기 (a) - (jj)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 또는 결손에 의해, 서열번호 13에 나타낸 아미노산 서열을 가진 시스타티오닌 γ-신타제 1으로부터 유래되는, OHPS 의존적인 메티오닌 신타제:
(a) 프롤린 10;
(b) 아스파라긴 11 ;
(c) 글루타민 15;
(d) 이소루신 27;
(e) 알라닌 30;
(f) 루신 45;
(g) 세린 47;
(h) 발린 60;
(i) 알라닌 68;
(j) 페닐알라닌 150;
(k) 트레오닌 178;
(l) 아스파르테이트 183;
(m) 이소루신 185;
(n) 트레오닌 220;
(o) 메티오닌 232;
(P) 발린 245;
(q) 알라닌 257;
(r) 아스파라긴 259;
(s) 페닐알라닌 261;
(t) 페닐알라닌 275;
(u) 이소루신 287;
(v) 히스티딘 289;
(w) 티로신 324;
(x) 글리신 326;
(y) 프롤린 356;
(z) 트레오닌 371;
(aa) 발린 396;
(bb) 프롤린 405;
(cc) 아스파르테이트 431 ;
(dd) 이소루신 436;
(ee) 이소루신 457;
(ff) 아스파르테이트 459;
(gg) 프롤린 470;
(hh) 글루타메이트 472;
(ii) 알라닌 506;
(jj) 이소루신 507.
또는
(ii) 서열번호에서 상기한 (a) - (jj) 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환 또는 결손에 의해, 서열번호 13에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 60%의 서열 동일성을 가진 아미노산 서열의, 시스타티오닌 γ-신타제 1 유래의 OHPS 의존적인 메티오닌 신타제. 바람직하게는, 서열 동일성은 적어도 70%, 보다 더 바람직하게 적어도 80%, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%이다.
일 구현예에서, 본 발명의 OHPS 의존적인 메티오닌 신타제는, 다음과 같은 특징의 아미노산 서열을 가진다:
(i) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 10번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 루신으로 치환되거나; 및/또는
(ii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 11번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 아스파르테이트로 치환되거나; 및/또는
(iii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 15번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 아르기닌으로 치환되거나; 및/또는
(iv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 27번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환되거나; 및/또는
(v) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 30번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환되거나; 및/또는
(vi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 45번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환되거나; 및/또는
(vii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 47번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환되거나; 및/또는
(viii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 60번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 아스파르테이트로 치환되거나; 및/또는
(ix) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 68번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환되거나; 및/또는
(x) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 150번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 루신으로 치환되거나; 및/또는
(xi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 178번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 이소루신으로 치환되거나; 및/또는
(xii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 183번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 글루타메이트로 치환되거나; 및/또는
(xiii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 185번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 발린으로 치환되거나; 및/또는
(xiv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 220번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환되거나; 및/또는
(xv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 232번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 루신으로 치환되거나; 및/또는;
(xvi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 245번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되거나; 및/또는
(xvii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 257번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환되거나; 및/또는
(xviii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 259번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 아스파르테이트 또는 세린으로 치환되거나; 및/또는
(xiv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 261번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환되거나; 및/또는
(xx) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 275번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 루신으로 치환되거나; 및/또는
(xxi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 287번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 발린 또는 페닐알라닌으로 치환되거나; 및/또는
(xxii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 289번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 티로신 또는 아르기닌으로 치환되거나; 및/또는
(xxiii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 324번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 페닐알라닌으로 치환되거나; 및/또는
(xxiv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 326번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환되거나; 및/또는
(xxv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 356번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환되거나; 및/또는
(xxvi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 371번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되거나; 및/또는
(xxvii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 396번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환되거나;
(xxviii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 405번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환되거나; 및/또는
(xxix) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 431번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 글리신으로 치환되거나; 및/또는
(xxx) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 436번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환되거나; 및/또는
(xxxi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 457번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 루신으로 치환되거나; 및/또는
(xxxii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 459번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 아스파라긴으로 치환되거나; 및/또는
(xxxiii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 470번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환되거나; 및/또는
(xxxiv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 472번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 글리신으로 치환되거나; 및/또는
(xxxv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 506번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 글리신으로 치환되거나; 및/또는
(xxxvi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 507번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 발린으로 치환됨.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다:
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 10, 27, 60, 324 및 457번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 32, 287, 289 및 356번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 10, 232, 245, 259, 356, 431 및 436번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 11, 15, 30, 45, 47, 68, 178, 356, 371 및 459번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 32 및 356번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 32, 60, 324 및 457번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 32, 287, 289 및 356번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 32, 232, 245, 259, 356, 431 및 436번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 32, 45, 47, 68, 178, 356, 371 및 459번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 232, 245, 259, 356, 431 및 436번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 178, 356, 371 및 459번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 150, 257, 259, 261, 275, 289, 356 및 506번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 185, 356 및 405번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 275, 356, 396 및 472번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 275, 326, 356 및 396번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 220, 275, 356 및 396번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 83, 275, 356, 396 및 507번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 275, 287, 356, 396 및 507번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 275, 356, 396 및 470번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 275, 356 및 507번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 275, 356 및 396번 위치.
일 구현예에서, 치환 및/또는 결손이 이루어지는 위치는 다음과 같다: 275, 287 및 356번 위치.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 시스타티오닌 γ-신타제 1의 발현 수준은, 시스타티오닌 γ-신타제 1을 코딩하는 핵산 서열의 5' 및 3' 위치 각각에 위치한, 이하 보다 상세히 기술된 바와 같은, 하나 이상의 프로모터 및 하나 이상의 종결인자에 의해 규제된다.
본원의 도처에 명시된 바와 같이, 본 발명의 일부 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1은 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓인다.
일부 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1의 과다 발현은 재조합 효모에서의 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제로 발생할 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1의 과다 발현은 시스타티오닌 γ-신타제 1-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재로 발생할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 시스타티오닌 γ-신타제 1의 과다 발현은 (i) 재조합 효모에서 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제 및 (ii) 시스타티오닌 γ-신타제 1-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재 둘다로 인해 발생할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명은, 하기한 게놈의, 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 관한 것이다:
(A) 아스파르테이트 세미-알데하이드 데하이드로게나제 HOM2를 코딩하는 하나 이상의 핵산 및/또는 NAD 및/또는 NADP 둘다를 코엔자임으로서 이용할 수 있는 아스파르테이트 세미-알데하이드 데하이드로게나제 HOM2를 코딩하는 하나 이상의 핵산이, 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있고;
(B) 아스파르토키나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 HOM3 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있고; 및
(C) (i) a) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 MET2를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 및/또는
호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있으며, 및
b) O-아세틸 호모세린-O-아세틸 세린 설프하이드릴라제 MET17을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나;
및/또는
(ii) a) 호모세린 키나제 THR1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있으며, 및
b) O-포스포-L-호모세린 (OHPS) 의존적인 메티오닌 신타제 활성이 개선된 시스타티오닌 γ-신타제 1 CGS1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있음.
메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 대한 구체적인 구현예들
아스파르테이트 트랜스아미나제의 과다 발현 및/또는 통제된 발현
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 바람직한 구현예에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AAT2)를 코딩하는 하나 이상의 핵산은 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 위치한다.
아스파르테이트 트랜스아미나제 효소 (아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제라고도 함)는 옥살로아세테이트 및 L-글루타메이트의 생산에서 L-아스파르테이트 및 2-옥소글루타레이트의 반응을 촉매하는, 당해 기술 분야에 공지된 단백질이다. 사카로마이세스 세레비지애 게놈에 의해 코딩된 아스파르테이트 트랜스아미나제 효소는 AAT2로 지칭될 수 있다.
이러한 구현예에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제-코딩 유전자의 과다 발현은, 아스파르테이트 트랜스아미나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 효모 게놈의 선택 위치(들)에 삽입함으로써 달성된다. 본 발명에 포함되는 아스파르테이트 트랜스아미나제 및 아스파르테이트-트랜스아미나제-코딩 유전자는 본 명세서 도처에 상세히 설명된다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 아스파르테이트 트랜스아미나제 코딩 서열의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 이러한 구현예 외에도 또는 이의 대안으로서, 하나 이상의 아스파르테이트 트랜스아미나제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능하는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓일 수 있다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AAT2)의 과다 발현이 옥살로아세테이트에서 아스파르테이트로의 변환을 높은 수준으로 유도할 수 있다고 생각하였다. 하나 이상의 아스파르테이트 트랜스아미나제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓일 경우에 동일하게 적용된다.
아스파르테이트 트랜스아미나제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Yagi et al. (1982, Biochem, VOl. 92: 35-43)에 기술된 방법을 참조한다.
일부 구현예에서, 상기한 아스파르테이트 트랜스아미나제-코딩 유전자는 본원에 실시예에 나타낸 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된 유전자이다.
바람직한 구현예에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제는 아라비돕시스 탈리아나 AAT2-유전자에 의해 코딩된다.
바람직한 구현예에서, 상기한 아스파르테이트 트랜스아미나제-코딩 유전자는 유도성 또는 억제성 프로모터 pSAM4의 통제 하에, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터 pACU1의 통제 하에, 또는 강한 프로모터 pADH1의 통제 하에, 또는 강한 프로모터 pPGK1의 통제 하에, 또는 강한 프로모터 pTEF3의 통제 하에 놓인다.
예시적으로, 아스파르테이트 트랜스아미나제 유전자는, 본원의 실시예들에 나타낸 바와 같이, TRP1 유전자 및/또는 PYK1 유전자 및/또는 GNP1 유전자 및/또는 MUP3 유전자에 삽입될 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 아스파르테이트 트랜스아미나제는 EC 번호 2.6.1.1로 알려져 있다.
아스파르테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 핵산(들)은 효모 유기체, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제 또는 AAT2를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 39%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 옥살로아세테이트 및 L-글루타메이트를 생산하기 위해 L-아스파르테이트 및 2-옥소글루타레이트의 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 39%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 14의 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
사카로마이세스 세레비지애 유래의 아스파르테이트 트랜스아미나제 AAT2의 아미노산 서열에 대해, 당해 기술 분야의 당업자는 UniProt 데이터베이스에서 NP013127 또는 본원에 기술된 서열번호 15를 참조할 수 있다. 예시적으로, E. coli로부터 기원한 아스파르테이트 트랜스아미나제는 서열번호 15의 아스파르테이트 트랜스아미나제 AAT2와 39%의 아미노산 동일성을 가진다.
다른 특정 구현예에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 핵산(들)은, 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 39%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 옥살로아세테이트 및 L-글루타메이트를 생산하기 위해 L-아스파르테이트 및 2-옥소글루타레이트의 반응을 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 39%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 15의 아미노산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 아스파르테이트 트랜스아미나제의 발현 수준은, 아스파르테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 및 3' 위치 각각에 위치한, 이하 보다 상세히 기술된 바와 같은, 하나 이상의 프로모터 및 하나 이상의 종결인자에 의해 규제된다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 재조합 효모의 게놈은, 아스파르테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓인다.
일부 구현예에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제의 과다 발현은 재조합 효모에서의 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제로 발생할 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제의 과다 발현은 아스파르테이트 트랜스아미나제-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재로부터 발생할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제의 과다 발현은 (i) 재조합 효모에서 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제 및 (ii) 아스파르테이트 트랜스아미나제-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재 둘다로 발생할 수 있다.
글루타메이트 데하이드로게나제의 과다 발현 및/또는 통제된 발현
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 바람직한 구현예에서, 글루타메이트 데하이드로게나제-코딩 유전자 (또는 NAD-특이적인 글루타메이트 데하이드로게나제)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 서열은 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓인다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 효모의 게놈은, 옥소-글루타레이트를 글루타메이트로 변환하는 글루타메이트 데하이드로게나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓인다.
글루타메이트 데하이드로게나제 효소 (NAD-특이적인 글루타메이트 데하이드로게나제라고도 함)는, L-글루타메이트를 생산하기 위해 2-옥소글루타레이트의 변환을 촉매하는, 당해 기술 분야에 개시된, 단백질이다. 따라서, 글루타메이트 데하이드로게나제는 NADH의 존재시 2-옥소글루타레이트에서 L-글루타메이트로의 변환을 수반하는 화학적 반응에 특이적으로 참여하는 효소이다.
이러한 구현예에서, 글루타메이트 데하이드로게나제 효소-코딩 유전자의 과다 발현은, 글루타메이트 데하이드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 효모 게놈의 선택 위치(들)에 삽입함으로써, 달성된다. 본 발명에 포함되는 글루타메이트 데하이드로게나제 및 글루타메이트 데하이드로게나제-코딩 유전자는 본 명세서 도처에서 상세히 설명된다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 글루타메이트 데하이드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 글루타메이트 데하이드로게나제의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 이러한 구현예 외에도 또는 이의 대안으로서, 하나 이상의 글루타메이트 데하이드로게나제-코딩 유전자는 효모 세포에서 기능하는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓일 수 있다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 옥소글루타레이트의 글루타메이트로의 변환에 의한 글루타메이트 데하이드로게나제의 과다 발현이, NAD를 동시에 생산한다고 생각하였다. 하나 이상의 글루타메이트 데하이드로게나제 코딩 서열이 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있을 경우에도 동일하게 적용된다.
글루타메이트 데하이드로게나제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Noor and Punekar (2005, Microbiology, Vol. 151 : 1409-1419)에 기술된 방법을 참조한다.
바람직한 구현예에서, 상기한 글루타메이트 데하이드로게나제-코딩 유전자는, 본원에 실시예에 나타낸 바와 같이, NADPH 대신 NADH를 이용하는 글루타메이트 데하이드로게나제를 코딩하며, 특히 엔토디늄 카우다툼 (Entodinium caudatum) 유래 GDH 유전자 (GDH.eCa)이다.
본원에서 바람직한 글루타메이트 데하이드로게나제는 특히 EC 1.4.1.2의 효소일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기한 글루타메이트 데하이드로게나제-코딩 유전자는 강한 프로모터 pTDH3의 통제 하에 놓인다.
예시적으로, GDH 유전자는, 본원의 실시예들에 나타낸 바와 같이, TRP1 유전자 HIS3 유전자 및/또는 SAM3 유전자에 삽입될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 글루타메이트 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 글루타메이트 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 고세균으로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 구현예에서, 글루타메이트 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 유기체, 바람직하게는, 엔토디늄 카우다툼, 바실러스 섭틸리스, 클로스트리듐 심비오슘 (Clostridium symbiosium)으로부터 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 글루타메이트 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 49%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다. 서열번호 16의 핵산 서열은 엔토디늄 카우다툼으로부터 기원하는 글루타메이트 데하이드로게나제를 코딩하며, 상기한 핵산 서열은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애에서 발현시키기 위해 코돈-최적화된 것이다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 L-글루타메이트를 생산하기 위해 2-옥소글루타레이트의 변환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 49%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 16의 핵산 서열과 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
엔토디늄 카우다툼 유래의 글루타메이트 데하이드로게나제의 아미노산 서열에 대해, 당해 기술 분야의 당업자는 UniProt 데이터베이스에서 AAF15393 또는 본원에 기술된 서열번호 17을 참조할 수 있다. 예시적으로, 지아르디아 인테스티날리스 (Giardia intestinalis)로부터 기원하는 글루타메이트 데하이드로게나제는 서열번호 17의 글루타메이트 데하이드로게나제와 49%의 아미노산 동일성을 가진다.
다른 특정 구현예에서, 글루타메이트 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은, 서열번호 17의 아미노산 서열과, 적어도 49%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 L-글루타메이트를 생산하기 위해 2-옥소글루타레이트의 변환을 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 49%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 17의 아미노산 서열과, 적어도 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 17의 아미노산 서열과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 17의 아미노산 서열과, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 글루타메이트 데하이드로게나제의 발현 수준은, 글루타메이트 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 및 3' 위치 각각에 위치한, 이하 보다 상세히 기술된 바와 같은, 하나 이상의 프로모터 및 하나 이상의 종결인자에 의해 규제된다.
본원의 도처에 명시된 바와 같이, 글루타메이트 데하이드로게나제는 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과다 발현된다.
일부 구현예에서, 글루타메이트 데하이드로게나제의 과다 발현은 재조합 효모에서의 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제로 발생할 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 글루타메이트 데하이드로게나제의 과다 발현은 재조합 효모의 게놈에서 글루타메이트 데하이드로게나제-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재로 발생할 수 있다..
또 다른 구현예에서, 글루타메이트 데하이드로게나제의 과다 발현은 (i) 재조합 효모에서 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제 및 (ii) 글루타메이트 데하이드로게나제-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재 둘다로 인해 발생할 수 있다.
호모세린 데하이드로게나제의 과다 발현
본 발명에 따른 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모의 일부 구현예에서, 효모는 호모세린 데하이드로게나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되는 게놈을 가진 것으로, 추가적으로 정의된다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 바람직한 구현예에서, 호모세린 데하이드로게나제-코딩 유전자의 과다 발현은, 효모 게놈의 선택 위치(들)에, 호모세린 데하이드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 삽입함으로써, 달성된다. 본 발명에 포함되는 호모세린 데하이드로게나제 및 호모세린 데하이드로게나제-코딩 유전자는 본 명세서 도처에서 상세히 설명된다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 호모세린 데하이드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 호모세린 데하이드로게나제의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
다른 구현예들에서, 호모세린 데하이드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 호모세린 데하이드로게나제의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 호모세린 데하이드로게나제의 과다 발현이 중간 대사산물 아스파르틸-세미알데하이드의 호모세린으로의 변환을 증가시킨다고 생각하였다.
일부 구현예에서, 효모로부터 기원하는 호모세린 데하이드로게나제, 예를 들어 사카로마이세스 세레비지애로부터 기원하는 HOM6-코딩 유전자를 사용한다. 일부 구현예에서, 효모 게놈에 HOM6-코딩 유전자는 복수의 카피로 도입된다. 일부 구현예에서, 특히 HOM6-코딩 유전자가 한 카피로 존재하는 구현예에서, HOM6-코딩 유전자는 강한 프로모터의 통제 하에 배치된다.
바람직한 구현예에서, 상기한 호모세린 데하이드로게나제-코딩 유전자는, 본원의 실시예에 나타낸 바와 같이, 사카로마이세스 세레비지애 유래의 HOM6 유전자이다.
바람직한 구현예에서, 상기한 호모세린 데하이드로게나제-코딩 유전자는 강한 프로모터 pRPLA1 또는 강한 프로모터 pADH1의 통제 하에 배치된다.
예시적으로, 호모세린 데하이드로게나제 유전자는, 본원의 실시예들에 나타낸 바와 같이, HOM3 유전자 및/또는 MUP3 유전자에 삽입될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 호모세린 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 바람직하게는 원핵생물 유기체 및 진핵생물 유기체를 포함하는 군에서 선택되는 유기체로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다. 일부 바람직한 구현예에서, 호모세린 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 효모, 특히 사카로마이세스 세레비지애로부터 기원하는 핵산(들)일 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 호모세린 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 18의 핵산과 적어도 31%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다. 서열번호 18의 핵산은 사카로마이세스로부터 기원하며, 또한 HOM6로도 지칭될 수 있는 호모세린 데하이드로게나제를 코딩한다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 중간 대사산물 아스파르틸-세미알데하이드에서 호모세린으로의 변환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 적어도 31%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 18의 핵산 서열과, 적어도 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 18의 핵산 서열과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 18의 핵산 서열과, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
사카로마이세스 세레비지애 유래의 호모세린 데하이드로게나제의 아미노산 서열에 대해, 당해 기술 분야의 당업자는 UniProt 데이터베이스에서 AJR75529 또는 NP012673 또는 본원에 기술된 서열번호 19를 참조할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 호모세린 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은, 서열번호 19의 아미노산 서열과, 적어도 31%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다. 예시적으로, 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia)로부터 기원하는 호모세린 데하이드로게나제는 서열번호 19의 호모세린 데하이드로게나제와 31%의 아미노산 동일성을 가진다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 중간 대사산물 아스파르틸-세미알데하이드에서 호모세린으로의 변환을 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 31%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 19의 아미노산 서열과, 적어도 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 19의 아미노산 서열과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 19의 아미노산 서열과, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에서 호모세린 데하이드로게나제의 발현 수준은, 호모세린 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산 서열의 5' 및 3' 위치 각각에 위치한, 이하 보다 상세히 기술된 바와 같은, 하나 이상의 프로모터 및 하나 이상의 종결인자에 의해 규제된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 효모의 게놈은, 호모세린 데하이드로게나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되는 것이다.
일부 구현예에서, 호모세린 데하이드로게나제의 과다 발현은 재조합 효모에서의 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제로 발생할 수 있다.
일부 다른 구현예에서, 호모세린 데하이드로게나제의 과다 발현은 재조합 효모의 게놈에서 호모세린 데하이드로게나제-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재로 발생할 수 있다. .
또 다른 구현예에서, 호모세린 데하이드로게나제의 과다 발현은 (i) 재조합 효모에서 강한 프로모터에 의한 해당 유전자의 통제 및 (ii) 호모세린 데하이드로게나제-코딩 서열의 재조합 효모 게놈 내 복수의 카피의 존재 둘다로 인해 발생할 수 있다.
S- 아데노실메티오닌 신타제 1 및 2 유전자의 과소 발현
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 일부 구현예에서, 재조합 효모는, (i) S-아데노실메티오닌 신타제 1을 코딩하는 유전자 (본원에서, SAM1으로도 지칭됨), (ii) S-아데노실메티오닌 신타제 2를 코딩하는 유전자 (본원에서, SAM2로도 지칭됨), 또는 (iii) S-아데노실메티오닌 신타제 1을 코딩하는 유전자와 S-아데노실메티오닌 신타제 2를 코딩하는 유전자 둘다를 과소 발현하는 것으로 정의된다.
이에, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 효모의 게놈은, 부가적으로, 독립적으로, 하기 (i) 또는 (ii)의 특징을 가진다:
(i) S-아데노실 메티오닌 신타제 SAM1 및/또는 SAM2를 코딩하는 내인성 핵산 중 하나 이상, 바람직하게는 전체가 결손됨, 또는
(ii) S-아데노실 메티오닌 신타제 SAM1 및/또는 SAM2를 코딩하는 핵산 중 하나 이상, 바람직하게는 전체가 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는 불안정화된 형태임.
SAM1은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 S-아데노실메티오닌 신타제 1이다. SAM1의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_010790을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001180810을 참조할 수 있다.
SAM2는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 S-아데노실메티오닌 신타제 2이다. SAM2의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_013281을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_00118082067을 참조할 수 있다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, SAM1 유전자, SAM2 유전자 또는 이 둘다 중 어느 하나의 과소 발현이, S-아데노실-메티오닌으로의 변환에 의한 생산되는 메틸오닌의 소비를 줄임으로써, 재조합 효모에 의한 메티오닌 생산을 높일 것이라고 생각하였다.
SAM1 및 SAM2와 관련하여, 이들 유전자의 과소 발현은, 예를 들어, SAM1, SAM2 또는 SAM1과 SAM2 둘다의 끊어짐 (interruption) 또는 결손에 의한 이의 발현의 완전한 억제 (complete repression)를 포함한다.
일부 구현예에서, SAM1, SAM2 또는 SAM1과 SAM2 둘다의 과소 발현은, 예를 들어, 유도성 또는 억제성 프로모터와 같은, 억제성 조절 서열의 통제 하에 이(이들) 유전자(들)의 발현을 배치함으로써, 조건 (conditional) 부여될 수 있다.
유전자 발현 억제, 타겟 유전자 끊어짐 또는 타겟 유전자 결손 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다.
SAM1 및 SAM2와 관련하여, 과소 발현은 또한 불안정화된 SAM1을 코딩하는 핵산의 삽입, 또는 불안정화된 SAM2를 코딩하는 핵산의 삽입, 또는 이 둘다를 포함한다.
불안정화된 SAM1 또는 SAM2는, 각각, 효모 세포에서, 모 SAM1 또는 SAM2보다 빨리 분해되는, SAM1 또는 SAM2의 변이체이다.
바람직한 구현예에서, 불안정화된 SAM1은 degron-태깅된 SAM1 단백질로 구성된다
바람직한 구현예에서, 불안정화된 SAM2는 degron-태깅된 SAM2 단백질로 구성된다.
실시예에 예시된 바와 같이, SAM1 유전자는 loxP에 의해, 또는 예를 들어 URA3.Kl-loxP에 의해 끊어질 수 있으며, 즉 결손된다 (비활성화로 지칭될 수 있음).
시스타티오닌 γ-리아제 유전자의 과소 발현
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 일부 구현예에서, 상기한 재조합 효모는, 본원에서 CYS3로도 지칭될 수 있는, 시스타티오닌 γ-리아제를 코딩하는 유전자가 과소 발현된 것으로, 추가적으로 정의된다.
이에, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 효모의 게놈은, 시스타티오닌 γ-리아제 CYS3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이, 독립적으로, 약한 프로모터 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 및/또는 불안정화된 형태인, 것이다.
CYS3는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 시스타티오닌 γ-리아제이다. CYS3의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_009390을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001178157을 참조할 수 있다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 임의의 CYS3 유전자의 과소 발현이 생산된 메티오닌의 시스테인 생산 쪽으로의 소비를 낮출 것이라고 생각하였다.
CYS3와 관련하여, 이 유전자의 과소 발현은, 예를 들어, CYS3의 끊어짐 또는 결손에 의한 이의 발현의 완전한 억제를 포함한다.
일부 구현예에서, CYS3의 과소 발현은, 예를 들어, 유도성 또는 억제성 프로모터와 같은 억제성 조절 서열의 통제 하에 유전자의 발현을 배치함으로써, 조건 부여될 수 있다.
유전자 발현 억제, 타겟 유전자의 끊어짐 또는 타겟 유전자의 결손 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다.
CYS3와 관련하여, 과소 발현은 또한 불안정화된 CYS3를 코딩하는 핵산의 삽입 또는 불안정화된 CYS3를 코딩하는 핵산의 삽입 또는 이 둘다를 포함한다.
불안정화된 CYS3는 효모 세포에서 모 CYS3보다 빨리 분해되는 CYS3의 변이체이다.
바람직한 구현예에서, 불안정화된 CYS3는 degron-태깅된 CYS3 단백질로 구성된다.
시스타티오닌 β- 신타제 유전자의 과소 발현
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 일부 구현예에서, 재조합 효모는, 본원에서 CYS4로도 지칭될 수 있는, 시스타티오닌 β-신타제를 코딩하는 유전자가 과소 발현된 것으로 추가로 정의된다.
이에, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 효모의 게놈은, 시스타티오닌 β-신타제 CYS4를 코딩하는 하나 이상의 핵산이, 약한 프로모터 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 및/또는 불안정화된 형태인 것이다.
CYS4는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 시스타티오닌 β-신타제이다. CYS4의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_011671을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001181284를 참조할 수 있다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 시스타티오닌 β-신타제 유전자의 과소 발현이 시스테인 생산 쪽으로 생산된 메티오닌의 소비를 낮출 것이라고 생각하였다.
시스타티오닌 β-신타제와 관련하여, 유전자의 과소 발현은, 예를 들어, 시스타티오닌 β-신타제의 끊어짐 또는 결손에 의한 발현의 완전한 억제를 포함한다.
일부 구현예에서, 시스타티오닌 β-신타제의 과소 발현은, 예를 들어, 유도성 또는 억제성 프로모터와 같은 억제성 조절 서열의 통제 하에 유전자의 발현을 배치함으로써, 조건 부여될 수 있다.
유전자 발현 억제, 타겟 유전자 끊어짐 또는 타겟 유전자 결손 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다.
시스타티오닌 β-신타제와 관련하여, 과소 발현은 또한 불안정화된 시스타티오닌 β-신타제를 코딩하는 핵산의 삽입 또는 불안정화된 시스타티오닌 β-신타제를 코딩하는 핵산의 삽입, 또는 이 둘다를 포함한다.
불안정화된 시스타티오닌 β-신타제는 효모 세포에서 모 시스타티오닌 β-신타제보다 더 빨리 분해되는 시스타티오닌 β-신타제의 변이체이다.
바람직한 구현예에서, 불안정화된 시스타티오닌 β-신타제는 degron-태깅된 시스타티오닌 β-신타제 단백질로 구성된다.
방향족 아미노트랜스퍼라제 I 유전자 ( Aro8 )의 발현 및 시토졸 분지쇄 아미노산 ( BCAA ) 아미노트랜스퍼 라제 유전자 ( BAT2 )의 발현의 변형
a. 메티오닌 생산
메티오닌을 생산하고자 하는 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 효모는, 유익하게는, (i) 방향족 아미노트랜스퍼라제 I (aromatic aminotransferase I) 유전자 (본원에서 ARO8로 지칭됨)를 코딩하는 유전자, (ii) 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 유전자 (cytosolic branched-chain amino acid amino transferase gene) (본원에서 BAT2로도 지칭됨) 또는 (iii) 방향족 아미노트랜스퍼라제 I 유전자 (Aro8)를 코딩하는 유전자와 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 유전자 (BAT2)를 코딩하는 유전자 둘다가 과소 발현되는 것으로, 정의된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 효모의 게놈은, 독립적으로, 하기한 특징을 가진다:
(i) 방향족 아미노트랜스퍼라제 I ARO8 및/또는 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 유전자 BAT2를 코딩하는 내인성 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전체가 결손됨, 또는
(ii) 방향족 아미노트랜스퍼라제 I ARO8 및/또는 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 유전자 BAT2를 코딩하는 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전부가 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나 및/또는 불안정화된 형태임.
ARO8은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 방향족 아미노트랜스퍼라제 I이다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001181067.1을 참조할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 방향족 아미노트랜스퍼라제 I을 코딩하는 핵산(들)은, 서열번호 20의 핵산과, 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 메티오닌에서 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB) 및 메티오놀로의 변환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 25%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 20의 핵산 서열과, 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 20의 핵산 서열과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 20의 핵산 서열과, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
ARO8의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_011313.1 또는 본원의 서열번호 21을 참조할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 방향족 아미노트랜스퍼라제 I을 코딩하는 핵산(들)은, 서열번호 21의 아미노산 서열과, 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 메티오닌에서 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB) 및 메티오놀로의 변환을 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 21의 아미노산 서열과, 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 21의 아미노산 서열과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 21의 아미노산 서열과, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
BAT2는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제이다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001181806.1을 참조할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은, 서열번호 22의 핵산과, 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 메티오닌에서 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB) 및 메티오놀로의 변환을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 25%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 22의 핵산과, 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 22의 핵산과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 22의 핵산과, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
BAT2의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_012682.1 또는 서열번호 23의 아미노산 서열을 참조할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 핵산(들)은, 서열번호 23의 아미노산 서열과, 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 메티오닌에서 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB) 및 메티오놀로의 변환을 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 23의 아미노산 서열과, 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 23의 아미노산 서열과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 23의 아미노산 서열과, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 임의의 ARO8 유전자, BAT2 유전자 또는 이 둘다의 과소 발현이 메티오닌에서 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB) 및 메티오놀으로의 변환을 감소시킬 것이라고 생각하였다.
ARO8 및 BAT2와 관련하여, 이들 유전자의 과소 발현은, 예를 들어, ARO8, BAT2 또는 ARO8과 BAT2 둘다의 끊어짐 또는 결손에 의한, 발현의 완전한 억제를 포함한다.
일부 구현예에서, ARO8, BAT2 또는 ARO8과 BAT2 둘다의 과소 발현은, 예를 들어, 유도성 또는 억제성 프로모터와 같은 억제성 조절 서열의 통제 하에, (이들) 유전자(들)의 발현을 배치함으로써, 조건 부여될 수 있다.
유전자 발현 억제, 타겟 유전자 끊어짐 또는 타겟 유전자 결손 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다.
ARO8 및 BAT2와 관련하여, 과소 발현은 또한 불안정화된 ARO8을 코딩하는 핵산의 삽입 또는 불안정화된 BAT2를 코딩하는 핵산의 삽입, 또는 이 둘다를 포함한다.
불안정화된 ARO8 또는 BAT2는, 각각 효모 세포에서 모 ARO8 또는 BAT2보다 빨리 분해되는 ARO8 또는 BAT2의 변이체이다.
b. 메티오닌 유도체의 생산
반면, 메티오닌 유도체를 생산하고자 하는 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 효모는, 유익하게는, (i) 방향족 아미노트랜스퍼라제 I 유전자를 코딩하는 유전자 (본원에서 Aro8으로도 지칭됨), (ii) 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 유전자를 코딩하는 유전자 (본원에서 BAT2로도 지칭됨) 또는 (iii) 방향족 아미노트랜스퍼라제 I 유전자 ( ARO8 )를 코딩하는 유전자와 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 유전자 (BAT2)를 코딩하는 유전자 둘다가, 과다 발현 및/또는 통제된 발현되는 것으로, 정의된다.
이에, 특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 효모의 게놈은, 독립적으로, 하기한 특징을 가진다:
(i) 방향족 아미노트랜스퍼라제 I ARO8을 코딩하는 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전체, 및/또는
(ii) 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 유전자 BAT2를 코딩하는 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전체가,
과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있음.
이러한 구현예에서, 방향족 아미노트랜스퍼라제 I 유전자 또는 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 유전자의 과다 발현은, 각각 방향족 아미노트랜스퍼라제 I 코딩 서열 또는 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 효모 게놈의 선택 위치(들)에 삽입함으로써, 달성된다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 방향족 아미노트랜스퍼라제 I 코딩 서열 또는 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 방향족 아미노트랜스퍼라제 I 또는 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 이러한 구현예 외에도 또는 이의 대안으로서, 하나 이상의 방향족 아미노트랜스퍼라제 I 코딩 서열 및/또는 하나 이상의 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 코딩 서열은 효모 세포에서 기능하는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓일 수 있다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 임의의 ARO8 유전자, BAT2 유전자 또는 이 둘다의 과다 발현이 메티오닌에서 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB)으로의 변환을 증가시킬 것이라고 생각하였다.
방향족 아미노트랜스퍼라제 I 또는 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
추가적인 구현예에서, 대상 메티오닌 유도체는 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB)이며, ARO8 코딩 유전자, BAT2 코딩 유전자 또는 ARO8 코딩 유전자와 BAT2 코딩 유전자 둘다의 과다 발현 및/또는 통제된 발현을 가진 본 발명에 따른 재조합 효모는, 또한 페닐피루베이트 데카르복실라제 유전자 (ARO10)를 과소 발현하고, 2-하이드록시산 데하이드로게나제 유전자 (KDH)를 발현하지 않는 것으로 정의된다.
KDH는 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 유래의 2-하이드록시산 데하이드로게나제이다. 핵산 서열은 효소 위원회 번호 E.C. 1.1.1.145를 참조할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 2-하이드록시산 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은, 서열번호 24의 핵산 서열과, 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 2-케토-4-메틸티오부티르산을 2-하이드록시-4-(메틸티오)부탄산으로 변환하는 반응을 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 25%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 24 또는 서열번호 25의 핵산 서열과, 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 24 또는 서열번호 25의 핵산 서열과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 24 또는 서열번호 25의 핵산 서열과, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산을 포함한다.
KDH의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 WP_011835036.1 및/또는 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 WP_010905887.1의 아미노산 서열을 참조할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 2-하이드록시산 데하이드로게나제를 코딩하는 핵산(들)은, 서열번호 26 또는 서열번호 27의 아미노산 서열과, 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성 및, 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 2-케토-4-메틸티오부티르산에서 2-하이드록시-4-(메틸티오)부탄산으로의 변환을 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 26 또는 서열번호 27의 아미노산 서열과, 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 26 또는 서열번호 27의 아미노산 서열과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 26 또는 서열번호 27의 아미노산 서열과, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
선택적으로, 아미노산 서열은 단백질의 2번 위치에 삽입된 부가적인 세린을 포함하며, 따라서 대응되는 핵산 서열은 핵산 서열의 4-6번 위치에 삽입된 뉴클레오티드 TCA 또는 AGT를 포함할 수 있다. 이러한 서열을 가진 KDH는 본원에서 KDH1-0으로 지칭될 수 있으며, 일부 실시예에 제시된다.
ARO10은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 페닐피루베이트 데카르복실라제이다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001180688.3을 참조할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, 페닐피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산(들)은, 서열번호 28의 핵산 서열과, 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 2-케토-4-메틸티오부티르산의 탈카르복시화를 촉매하는 효소를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 25%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 28의 핵산 서열과, 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 65%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 28의 핵산 서열과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 80%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 서열번호 28의 핵산 서열과, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
ARO10의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_010668.3 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 참조할 수 있다.
다른 특정 구현예에서, 페닐피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 핵산(들)은, 서열번호 29의 아미노산 서열과, 적어도 25%, 유익하게는 적어도 65%, 바람직하게는 적어도 80%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 2-케토-4-메틸티오부티르산의 탈카르복시화를 촉매하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 25%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 29의 아미노산 서열과, 적어도 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40% 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 29의 아미노산 서열과, 적어도 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 80%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은, 서열번호 29의 아미노산 서열과, 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
선택적으로, 아미노산 서열은 단백질의 2번 위치에 삽입된 세린을 포함할 수 있으며, 따라서 대응되는 핵산 서열은 핵산 서열의 4-6번 위치에 삽입된 뉴클레오티드 TCA 또는 AGT를 포함할 수 있다. 이러한 서열을 가진 ARO10은 본원에서 KDH1-0으로 지칭될 수 있으며, 일부 실시예에서 제시된다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, ARO10 유전자의 과소 발현이 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB)의 변환을 감소시켜, 이의 이용성을 높일 것이라고 생각하였다. 특히, 본 발명자들은, ARO10의 과소 발현이 메티오날 변환을 낮춘다고 생각하였다.
ARO10과 관련하여, 유전자의 과소 발현은, 예를 들어, ARO10의 끊어짐 또는 결손에 의한 이의 발현의 완전한 억제를 포함한다.
일부 구현예에서, ARO10의 과소 발현은, 예를 들어, 유도성 또는 억제성 프로모터와 같은 억제성 조절 서열의 통제 하에 유전자의 발현을 배치함으로써, 조건 부여될 수 있다.
유전자 발현 억제, 타겟 유전자 끊어짐 또는 타겟 유전자 결손 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다.
ARO10과 관련하여, 과소 발현은 또한 불안정화된 ARO10을 코딩하는 핵산의 삽입을 포함한다.
불안정화된 ARO10은 효모 세포에서 모 ARO10보다 더 빨리 분해되는 ARO10의 변이체이다.
대상 메티오닌 유도체가 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB)인 구현예에서, 상기에서 정의되는 본 발명에 따른 재조합 효모는 수 형성 NADH 옥시다제 (NOXE) (water forming NADH oxidase)를 코딩하는 유전자가 과다 발현되거나 및/또는 통제된 발현을 가진 것으로, 선택적으로 정의될 수 있다.
본 발명에서, 바람직한 수 형성 NADH 옥시다제는 EC 번호 1.6.3.1 및 1.6.99.3 (NAD(P)H 옥시다제 (H(2)O(2)-형성)에 의해, 듀얼 옥시다제, NAD(P)H 옥시다제, ThOX, THOX2, 티로이드 NADPH 옥시다제, 티로이드 옥시다제, EC 1.6.3.1에서 티로이드 옥시다제 2 및/또는 NADH 데하이드로게나제, Beta-NADH 데하이드로게나제 다이뉴클레오티드, 시토크롬 C 리덕타제, 디아포라제 (Diaphorase), 다이하이드로코데하이드로게나제 I 데하이드로게나제 (Dihydrocodehydrogenase I dehydrogenase), 다이하이드로니코틴아미드 아데닌 다이뉴클레오티드 데하이드로게나제 (Dihydronicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase), 다이포스포피리나제 (Diphosphopyrinase), DPNH 디아포라제, NADH 디아포라제, NADH 하이드로게나제, NADH 옥시도리덕타제, NADH-메나디온 옥시도리덕타제 (NADH-menadione oxidoreductase), NADH:시토크롬 C 옥시도리덕타제, 환원된 다이포스포피리딘 뉴클레오티드 디아포라제 (reduced diphosphopyridine nucleotide diaphorase), 1형 데하이드로게나제, EC 1.6.99.3에서 1형 데하이드로게나제)에 의해 알려져 있다.
본 발명에서 고려될 수 있는 수 형성 NADH 옥시다제는 특히 WO 2006/134277에 언급되어 있다.
본 발명에 따른 NADH 옥시다제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Lopez DE FELIPE et al. (International Daily Journal, 2001, vol. 11: 37-44 (ISSN 0958-6946))에 기술된 방법을 참조한다.
바람직한 구현예에서, NADH 옥시다제 또는 NOXE를 코딩하는 핵산(들)은 스트렙토코커스 뉴모니아, 락토코커스 락티스, 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis) 및 이들의 혼합을 포함하는 군으로부터 선택되는, 바람직하게는 스트렙토코커스 뉴모니아로부터 유래되는 핵산일 수 있다.
NOXE는, 락토코커스 락티스 유래의 수 형성 NADH 옥시다제, 특히, NCBI 참조 번호 WP_012897225.1의 아미노산 서열일 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 참조 번호 YP003352913.1을 참조할 수 있다.
다른 바람직한 구현예에서, NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 30, 31, 32 및 33의 핵산 서열과 적어도 78%, 바람직하게는 적어도 80%의 핵산 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 수 형성 NADH 옥시다제를 코딩하는 능력이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 핵산 서열과 적어도 78%의 뉴클레오티드 동일성을 가진 핵산 서열은, 참조 핵산 서열과, 적어도 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 뉴클레오티드 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 핵산 서열을 포함한다.
다른 특정 구현예에서, NADH 옥시다제를 코딩하는 핵산(들)은 서열번호 34, 35, 36 및 37의 서열과 적어도 78%, 바람직하게는 적어도 80%의 동일성, 및 또한 동일한 특성의 생물학적 활성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산(들)일 수 있다.
이러한 서열과 관련하여 동일한 특성을 가진 생물학적 활성은 본원에 기술된 바와 같으며, 즉 수 형성 NADH 옥시다제이다.
본원에 기술된 바와 같이, 참조 아미노산 서열과 적어도 78%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열과 적어도 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 및 99%의 아미노산 동일성을 가진 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 이러한 구현예에서, NADH 옥시다제 유전자의 과다 발현은, 효모 게놈의 선택 위치(들)에, NADH 옥시다제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 삽입함으로써 달성된다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, NADH 옥시다제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, NADH 옥시다제의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 대상 메티오닌 유도체는 2-하이드록시-4-(메틸티오)부탄산 (HMB)이며, Aro8 코딩 유전자, BAT2 코딩 유전자 또는 Aro8 코딩 유전자와 BAT2 코딩 유전자 둘다의 과다 발현 및/또는 통제된 발현을 가진 본 발명에 따른 재조합 효모는, 2-하이드록시산 데하이드로게나제 유전자 (KDH)의 과다 발현 및/또는 통제된 발현, 및 바람직하게는 ARO10의 과소 발현을 가진 것으로 또한 정의된다.
이에, 특정 구현예에서, 본 발명의 재조합 효모의 게놈은 2-하이드록시산 데하이드로게나제 (KDH)를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 및/또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 놓인다.
HMB는 본 발명에 따른 효모에 의해 자연적으로 생산되지 않는다.
본 발명에 따른 재조합 효모의 구현예들에 있어서, 2-하이드록시산 데하이드로게나제 유전자의 과다 발현은, 효모 게놈의 선택 위치(들)에, 2-하이드록시산 데하이드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 한 카피 이상으로 삽입함으로써, 달성된다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 2-하이드록시산 데하이드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 2-하이드록시산 데하이드로게나제의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
다른 구현예들에서, 2-하이드록시산 데하이드로게나제 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 2-하이드록시산 데하이드로게나제의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
대상 화합물의 배출 (export)
본 발명에 따른 재조합 효모의 추가적인 구현예들에서, 생산된 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 효모 세포 외부로의 배출은, (i) 효모 퍼미아제 (permease)를 코딩하는 유전자의 과소 발현에 의해, (ii) 아미노산 엑스포터 (exporter) 단백질을 코딩하는 유전자의 과다 발현에 의해, 또는 (iii) 효모 퍼미아제를 코딩하는 유전자의 과소 발현과 아미노산 엑스포터 단백질을 코딩하는 유전자의 과다 발현 둘다에 의해, 강화될 수 있다.
퍼미아제 -코딩 유전자(들)의 과소 발현
후술한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과소 발현될 수 있는 퍼미아제-코딩 유전자는 AGP1, AGP3, BAP3, BAP2, GAP1, GNP1, MUP3 및 MUP1을 포함한다.
이에, 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 재조합 효모의 게놈은, 다음과 같은 변형들 중 하나 이상이 달성된 것이다:
(A) 제너럴 아미노산 퍼미아제 (general amino acid permease) AGP3를 코딩하는 내인성 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전체가 효모 게놈으로부터 결손됨, 및 선택적으로:
(i) 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입되어 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치, 및/또는
(ii) 불안정화된 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입됨;
(B) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3 (branched-chain amino-acid permease 3) BAP3를 코딩하는 내인성 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전체가 효모 게놈으로부터 결손됨, 및 선택적으로:
(i) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3 BAP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입되어 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있음, 및/또는
(ii) 불안정화된 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3 BAP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입됨;
(C) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2 BAP2를 코딩하는 내인성 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전체가 효모 게놈으로부터 결손됨, 및 선택적으로:
(i) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2 BAP2를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입되어 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있음, 및/또는
(ii) 불안정화된 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2 BAP2를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입됨;
(D) GAP1을 코딩하는 내인성 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전체가 효모 게놈으로부터 결손됨, 및 선택적으로:
(i) 제너럴 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입되어 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있음, 및/또는
(ii) 불안정화된 제너럴 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입됨;
(E) 고-친화성 글루타민 퍼미아제 (high-affinity glutamine permease) GNP1을 코딩하는 내인성 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전체가 효모 게놈으로부터 결손됨, 및 선택적으로:
(i) 고-친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입되어 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있음, 및/또는
(ii) 불안정화된 고-친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입됨;
(F) 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 내인성 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전체가 효모 게놈으로부터 결손됨, 및 선택적으로:
(i) 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입되어 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있음, 및/또는
(ii) 불안정화된 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입됨;
(G) 저-친화성 메티오닌 퍼미아제 (low-affinity methionine permease) MUP3를 코딩하는 내인성 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전체가 효모 게놈으로부터 결손됨, 및 선택적으로:
(i) 저-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입되어 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있음, 및/또는
(ii) 불안정화된 저-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입됨;
(H) 고-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 내인성 핵산 하나 이상, 바람직하게는 전체가 효모 게놈으로부터 결손됨, 및 선택적으로:
(i) 고-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입되어 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있음, 및/또는
(ii) 불안정화된 고-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 삽입됨;
(I) 추정의 트랜스포터 (probable transporter) AQR1을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 과다 발현; 및/또는
(J) 폴리아민 트랜스포터 1 (polyamine transporter 1) TPO1을 코딩하는 하나 이상의 핵산의 과다 발현.
특정 구현예에서, 이들 변형들 중 2 이상, 특히 3 이상이 본 발명에 따른 효모의 게놈에서 달성된다.
AGP1은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 제너럴 아미노산 퍼미아제 1이다. AGP1의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_009905를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001178671을 참조할 수 있다.
AGP3는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 제너럴 아미노산 퍼미아제 3이다. AGP3의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_116600을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001179912를 참조할 수 있다.
BAP3는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 발린 아미노산 퍼미아제이다. BAP3의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_010331을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001180354를 참조할 수 있다.
BAP2는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 Leu/Val/Ile 아미노산 퍼미아제이다. BAP2의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_009624를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001178416을 참조할 수 있다.
GAP1은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 제너럴 아미노산 퍼미아제이다. GAP1의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_012965.3을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001179829를 참조할 수 있다.
GNP1은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 고-친화성 글루타민 퍼미아제이다. GNP1의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_010796을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001180816을 참조할 수 있다.
MUP3는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 저-친화성 메티오닌 퍼미아제이다. MUP3의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_011827을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001179116을 참조할 수 있다.
MUP1은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 저-친화성 메티오닌 퍼미아제이다. MUP의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_011569를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001181184를 참조할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 일부 구현예에서, 상기한 재조합 효모는 AGP1, AGP3, BAP3, BAP2, GAP1, GNP1, MUP3 및 MUP1 퍼미아제를 포괄하는, 하나 이상의 퍼미아제 코딩 유전자가 과소 발현되는 것으로, 추가적으로 정의된다.
특정 구현예에서, S-아데노실 메티오닌 SAM1 및/또는 SAM2, 시스타티오닌 γ-리아제 CYS3, 시스타티오닌 β-신타제 CYS4, 호모세린 키나제 THR1, 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP3, 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3 BAP3, 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2 BAP2, 제너럴 아미노산 퍼미아제 GAP1, 고-친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1, 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP1, 저-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3 및 고-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 삽입되는 하나 이상의 핵산은, 독립적으로, 효모, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래되는 핵산이다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 퍼미아제 유전자들 중 임의의 유전자의 과소 발현이 생산된 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체를 효모 세포 외부로, 예를 들어 배양 배지에서 배출하는 것을 증가시킬 것으로 생각하였다.
퍼미아제와 관련하여, 이들 유전자들 중 하나 이상의 과소 발현은, 예를 들어, 하나 이상의 퍼미아제 유전자의 끊어짐 또는 결손에 의한, 발현의 완전한 억제를 포함한다.
일부 구현예에서, 퍼미아제-코딩 유전자의 과소 발현은, 예를 들어, 유도성 또는 억제성 프로모터와 같은 억제성 조절 서열의 통제 하에 유전자의 발현을 배치함으로써, 조건 부여될 수 있다.
유전자 발현 억제, 타겟 유전자 끊어짐 또는 타겟 유전자 결손 방법은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다.
퍼미아제 유전자와 관련하여, 과소 발현은 또한 불안정화된 퍼미아제 단백질을 코딩하는 핵산의 삽입 또는 불안정화된 퍼미아제 단백질을 코딩하는 핵산의 삽입, 또는 이 둘다를 포함한다.
불안정화된 퍼미아제는 효모 세포에서 모 퍼미아제보다 빨리 분해되는 퍼미아제의 변이체이다.
바람직한 구현예에서, 불안정화된 퍼미아제는 degron-태깅된 퍼미아제 단백질로 구성된다.
실시예에 예시된 바와 같이, AGP3 유전자, BAP3 유전자, GAP1 유전자, GNP1 유전자 및 MUP3 유전자는 loxP에 의해 끊어질 수 있으며, 즉 결손될 수 있다.
아미노산 엑스포터 단백질-코딩 유전자(들)의 과다 발현
후술한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모에서 과다 발현될 수 있는 엑스포터 단백질-코딩 유전자는 AQR1 및 TPO1을 포함한다.
AQR1은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 트랜스포터이이다. AQR1의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_014334를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001182903을 참조할 수 있다.
TPO1은 사카로마이세스 세레비지애 유래의 폴리아민 트랜스포터이다. TPO1의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_013072를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001181848을 참조할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 바람직한 구현예에서, 트랜스포터-코딩 유전자의 과다 발현은, 트랜스포터 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 하나 이상의 부가적인 카피로 효모 게놈의 선택 위치(들)에 삽입함으로써, 달성된다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 트랜스포터-코딩 유전자의 과다 발현이 생산된 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 효모 세포 외부로의, 예를 들어 배양 배지에서의 배출을 증가시킬 것이라고 생각하였다.
일부 구현예에서, 트랜스포터-코딩 유전자의 과다 발현은, 트랜스포터 유전자 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트를 하나 이상의 부가적인 카피로 효모 게놈의 선택 위치(들)에 삽입함으로써, 달성된다. 이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 트랜스포터 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 트랜스포터의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
일부 다른 구현예에서, 트랜스포터-코딩 유전자의 1 카피가 효모 게놈의 선택 위치에 삽입된다. 이의 다른 구현예에서, 트랜스포터 코딩 서열을 포함하는 발현 카세트의 한 카피 이상은, 효모 세포에서 기능하는 강한 프로모터와 같이, 트랜스포터의 강한 발현을 허용하는 조절 서열을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 상기한 아미노산 엑스포터 단백질-코딩 유전자 AQR1은 강한 프로모터 pTEF3의 통제 하에 놓인다.
예시적으로, AQR1 유전자는 본원의 실시예에 나타낸 바와 같이 hom3 유전자에 삽입될 수 있다.
바람직한 구현예에서, 상기한 아미노산 엑스포터 단백질-코딩 유전자 TPO1은 강한 유도성 또는 억제성 프로모터 pSAM4 또는 강한 구성적인 프로모터 (strong constitutive promoter) pTEF1의 통제 하에 놓인다.
TPO1-1이 TPO1 대신 사용될 수 있다. TPO1-1은 라이신 10, 49, 86, 143, 144 및 145가 아르기닌으로 치환된 인공적인 대립유전자이다.
본 발명자들은, 이러한 변형이 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통해 TPO1을 분해로부터 보호하며, 따라서 이를 안정화한다고, 생각하였다.
예시적으로, TPO1 유전자는 본원의 실시예에 나타낸 바와 같이 mae1 유전자 내에 및/또는 trp1 유전자에 삽입될 수 있다.
메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 생산을 더욱 증가시키는 측면에서, 본 발명에 따른 재조합 효모는, 중간산물 옥살로아세테이트를 대량 생산하도록 추가적인 유전자 변화를 포함할 수 있다. 이러한 선택적인 유전자 변화는 아래에서 설명한다.
메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 대한 추가적인 구현예들
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 일부 구현예에서, 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 생산은 중간 대사산물 옥살로아세테이트의 생산 증가를 유도하는 조건에 재조합 효모를 배치함으로써 추가로 높일 수 있다.
옥살로아세테이트의 생산 증가를 유도하는 조건에 재조합 효모의 배치는 효모 게놈에 추가적인 유전자 변형을 도입함으로써 수행될 수 있다.
본 발명자들은, 최적으로 증가된 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체 생산이, 아래에 설명된, 추가적인 유전자 변화를 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 도입함으로써, 달성할 수 있다는 것을, 알게 되었다.
메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 대한 추가적인 제1 구현예
본 발명에 따른 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 대한 추가적인 제1 구현예에서, 재조합 효모에 대한 추가적인 유전자 조작은 중간산물 포스포에놀-피루베이트 (PEP)의 생산을 높이기 위한 목적으로 수행된다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 도입되는 추가적인 유전자 변화가, (i) NADPH의 과다 생산, (ii) 포스포에놀 피루베이트에서 옥살로아세테이트 및 피루베이트 각각으로의 통제된 및 균형잡힌 변환, 및 (iii) 피루베이트에서 에탄올로의 변환 감소 및 포스포에놀 피루베이트에서 옥살로아세테이트 변환으로의 전향 (redirection)을 유발한다고 생각하였다.
본 발명에 따른 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 유전자 조작에 의해 도입되는 이러한 추가적인 유전자 변화는 아래에서 상세히 명시된다.
이러한 구현예에서, 유전자 변화는, 글루코스-6-포스페이트-1-데하이드로게나제 (MET19 또는 ZWF1으로도 지칭됨) 및 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제, 탈카르복시화 1 (GND1으로도 지칭됨)을 과다 발현하도록 도입된다. 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 본 발명자들은 MET19 및 GND1의 과다 발현이 NADPH 생산 증가를 유발한다고 생각하였다.
이러한 구현예에서, 유전자 변화는 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 (PEPC 또는 PPC로도 지칭됨) 및/또는 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 [ATP] (PCK1 또는 pEPCK로도 지칭됨)를 과다 발현하도록 도입된다.
이러한 구현예에서, 유전자 변화는 피루베이트 키나제 1 (PYK1 또는 CDC19로도 지칭됨) 및 피루베이트 키나제 2 (PYK2로도 지칭됨)를 과소 발현하도록 도입된다. 이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, PYK2 유전자는 과소 발현되기 보다는 결손될 수 있다. 일부 구현예에서, PYK1 유전자는 과소 발현되기 보다는 결손될 수 있다. 특정 구현예에서, PYK1 유전자 및 PYK2 유전자는 과소 발현되기 보다는 결손될 수 있다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 피루베이트 데카르복실라제를 코딩하는 하나 이상의 유전자는 바람직하게는 결손에 의해 불활성화된다. 피루베이트 데카르복실라제-코딩 유전자는 각각 PDC1, PDC5 및 PDC6로 지칭되는 것을 포함한다. 이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, PDC1 및/또는 PDC6 유전자는 바람직하게는 끊어짐 또는 결손에 의해 불활성화되는 반면, 다른 피루베이트 데카르복실라제-코딩 유전자 PDC5는 변형되지 않은 채 유지되거나; 또는 이의 발현은 약한 프로모터를 사용해 이를 통제함으로써 감소된다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 재조합 효모의 알코올 데하이드로게나제 활성은 하나 이상의 알코올 데하이드로게나제-코딩 유전자의 발현의 변형에 의해 감소된다. 이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, ADH1의 발현은 유전자를 약한 프로모터의 통제 하에 배치하거나 또는 불안정화된 ADH1 효소를 생산함으로써, 감소된다. 이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, ADH3, ADH4 및 ADH5 중 하나 이상은 바람직하게는 끊어짐 또는 결손에 의해 불활성화될 수 있다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 외인성 아세틸 데하이드로게나제-코딩 유전자 (MHPF로도 지칭됨)는 효모 게놈에 도입되어, 과다 발현될 수 있다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 외인성 아세테이트 키나제-코딩 유전자 (ACKA로도 지칭됨)는 효모 게놈에 도입되어, 과다 발현될 수 있다.
이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, 외인성 포스페이트 아세틸 트랜스퍼라제-코딩 유전자 (PTA로도 지칭됨)는 효모 게놈에 도입되어, 과다 발현될 수 있다.
글루코스 -6- 포스페이트 -1- 데하이드로게나제
글루코스-6-포스페이트-1-데하이드로게나제 효소는, NADP에서 NADPH로의 환원과 동시적으로, D-글루코스 6-포스페이트에서 6-포스포-D-글루코노-1,5-락톤으로의 반응을 촉매하는, 당해 기술 분야에 기술된, 단백질이다.
글루코스-6-포스페이트-1-데하이드로게나제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Kuby, S. et al. (1966) Dehydrogenases and Oxidases Methods in Enzymology 9, 116-117에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 글루코스-6-포스페이트-1-데하이드로게나제는 EC 1.1.1.49의 효소이다.
글루코스-6-포스페이트-1-데하이드로게나제 (MET19라고도 함)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_014158.1를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001183079.1을 참조할 수 있다.
6- 포스포글루코네이트 데하이드로게나제 , 탈카르복시화 1
6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제, 탈카르복시화 1 효소는, NADP에서 NADPH로의 환원과 동시적으로, 6-포스포글루코네이트에서 리불로스 5-포스페이트 및 CO2로의 산화적 탈카르복시화 (oxidative decarboxylation)를 촉매하는, 당해 기술 분야에 개시된, 단백질이다.
6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제, 탈카르복시화 1의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 He W. et al. (2007) BMC Structural Biology, 7:38에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제, 탈카르복시화 1은 EC 1.1.1.44의 효소이다.
6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제, 탈카르복시화 1 (GND1으로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_012053을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001179314를 참조할 수 있다.
피루베이트 키나제 1
피루베이트 키나제 1 효소는 ATP의 존재시 피루베이트에서 포스포에놀피루베이트로의 변환을 촉매하는 당해 기술 분야에 개시된 단백질이다.
피루베이트 키나제 1의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Susan-resiga and Nowak (biochemistry, 2004, 43, 15230-15245)에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 피루베이트 키나제 1은 EC 2.7.1.40의 효소이다.
피루베이트 키나제 1 (PYK1으로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_009362를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001178183을 참조할 수 있다.
피루베이트 키나제 2
피루베이트 키나제 2 효소는 ATP의 존재시 피루베이트에서 포스포에놀피루베이트로의 변환을 촉매하는 당해 기술 분야에 개시된 단백질이다. 피루베이트 키나제 2는 당분해성 플럭스 (glycolytic flux) 수준이 매우 낮은 조건에서 효모 세포에 의해 사용될 수 있다.
피루베이트 키나제 2의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Susan-resiga and Nowak (biochemistry, 2004, 43, 15230-15245)에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 피루베이트 키나제 2는 EC 2.7.1.40의 효소이다.
피루베이트 키나제 2 (PYK2로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_014992를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001183767을 참조할 수 있다.
피루베이트 데카르복실라제 이소자임 1
피루베이트 데카르복실라제 이소자임 1은 알코올 발효시 피루베이트에서 아세트알데하이드 및 이산화탄소로의 비-산화적 변환에 참여하는, 당해 기술 분야에 기술된, 단백질이다.
피루베이트 데카르복실라제 이소자임 1의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40:1755-1763)에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 피루베이트 데카르복실라제 이소자임 1은 EC 4.1.1.1의 효소이다.
피루베이트 데카르복실라제 이소자임 1 (PDC1으로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_013145를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001181931을 참조할 수 있다.
피루베이트 데카르복실라제 이소자임 2
피루베이트 데카르복실라제 이소자임 2는 알코올 발효시 피루베이트에서 아세트알데하이드 및 이산화탄소로의 비-산화적 변환에 참여하는, 당해 기술 분야에 기술된, 단백질이다.
피루베이트 데카르복실라제 이소자임 2의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40: 1755-1763)에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 피루베이트 데카르복실라제 이소자임 2는 EC 4.1.1.1의 효소이다.
사카로마이세스 세레비지애 유래의 피루베이트 데카르복실라제 이소자임 2의 아미노산 서열에 대해, 당해 기술 분야의 당업자는 UniProt 데이터베이스에서 또는 NP013235.1을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001182021을 참조할 수 있다.
피루베이트 데카르복실라제 이소자임 3
피루베이트 데카르복실라제 이소자임 3는 알코올 발효시 피루베이트에서 아세트알데하이드 및 이산화탄소로의 비-산화적 변환에 참여하는, 당해 기술 분야에 기술된, 단백질이다.
피루베이트 데카르복실라제 이소자임 3의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Wang et al. (Biochemistry, 2001, 40:1755-1763)에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 피루베이트 데카르복실라제 이소자임 3는 EC 4.1.1.1의 효소이다.
피루베이트 데카르복실라제 이소자임 3 (PDC6으로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP011601.3을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001181216.3을 참조할 수 있다.
아세트알데하이드 데하이드로게나제
아세트알데하이드 데하이드로게나제는 NAD와 코엔자임 A를 이용하여 아세트알데하이드에서 아세틸-CoA로의 변환을 촉매하는 당해 기술 분야에 기술된 단백질이다.
아세트알데하이드 데하이드로게나제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Fisher et al. (2013) Chemi. Biol. Interact. 202　70-77에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 아세트알데하이드 데하이드로게나제는 EC 1.1.1.10의 효소이다.
아세트알데하이드 데하이드로게나제 (MHPF로 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_414885를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NC_000913.3을 참조할 수 있다.
아세테이트 키나제
아세테이트 키나제는 아세테이트 및 ATP로부터 아세틸포스페이트를 형성하는 당해 기술 분야에 기술된 단백질이다.
아세테이트 키나제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Sagers et al. J.Bacteriology (1961) 82　233-238에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
아세테이트 키나제 (ACKA로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_416799를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NC_000913.3을 참조할 수 있다.
포스페이트 아세틸트랜스퍼라제
포스페이트 아세틸트랜스퍼라제는 아세틸-CoA와 아세틸 포스페이트의 가역적인 상호 변환을 촉매하는 당해 기술 분야에 기술된 단백질이다.
포스페이트 아세틸트랜스퍼라제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Castano-Cerezo and Canovas, Microbial Cell Factories 2009, 8:54에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 포스페이트 아세틸트랜스퍼라제는 EC 2.3.1.8의 효소이다.
포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 (PTA로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_416800을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NC_000913을 참조할 수 있다.
알코올 데하이드로게나제 1
알코올 데하이드로게나제 1은 일차 비-분지형 알코올을 대응되는 알데하이드로 변환하는 반응을 촉매하는 당해 기술 분야에 개시된 단백질이다.
알코올 데하이드로게나제 1의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 알코올 데하이드로게나제 1은 EC 1.1.1.1의 효소이다.
알코올 데하이드로게나제 1 (ADH1으로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_014555를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001183340을 참조할 수 있다.
알코올 데하이드로게나제 3
알코올 데하이드로게나제 3는 일차 비-분지형 알코올을 대응되는 알데하이드로 변환하는 반응을 촉매하는 당해 기술 분야에 개시된 단백질이다.
알코올 데하이드로게나제 3의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 알코올 데하이드로게나제 3는 EC 1.1.1.1의 효소이다.
알코올 데하이드로게나제 3 (ADH3로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_013800을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001182582를 참조할 수 있다.
알코올 데하이드로게나제 4
알코올 데하이드로게나제 4는 일차 비-분지형 알코올을 대응되는 알데하이드로 변환하는 반응을 촉매하는 당해 기술 분야에 개시된 단백질이다.
알코올 데하이드로게나제 4의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 알코올 데하이드로게나제 4는 EC 번호 1.1.1.1의 효소이다.
알코올 데하이드로게나제 4 (ADH4로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_011258을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001181122를 참조할 수 있다.
알코올 데하이드로게나제 5
알코올 데하이드로게나제 5는 일차 비-분지형 알코올을 대응되는 알데하이드로 변환하는 반응을 촉매하는 당해 기술 분야에 개시된 단백질이다.
알코올 데하이드로게나제 5의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Ganzhorn et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry, 262, 3754-61에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 알코올 데하이드로게나제 5는 EC 번호 1.1.1.1의 효소이다.
알코올 데하이드로게나제 5 (ADH5로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_009703을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_001178493을 참조할 수 있다.
메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 대한 추가적인 제2 구현예
본 발명에 따른 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 대한 추가적인 구현예에서, 재조합 효모에 대한 추가적인 유전자 조작은 중간산물 포스포에놀-피루베이트 (PEP)의 생산을 증가시키고자 하는 목적으로 달성된다.
본 발명자들은, 임의의 특정 이론으로 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 도입되는 추가적인 유전자 변화가, (i) NADPH의 과다 생산, (ii) 포스포에놀 피루베이트에서 옥살로아세테이트 및 피루베이트 각각으로의 통제된 및 균형잡힌 변환, 및 (iii) 피루베이트에서 에탄올로의 변환 감소 및 포스포에놀 피루베이트에서 옥살로아세테이트 변환으로의 전향 (redirection)을 유발한다고 생각하였다.
이러한 목적으로, 본 발명자들은, 포스포페놀피루베이트에서 시작해 옥살로아세테이트의 생산으로 끝나는, 완전하고 새로운 대사 경로를 구상하게 되었다.
본 발명에 따른 메티오닌-생산 및/또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모에 유전자 조작에 의해 도입되는 이러한 추가적인 유전자 변화는 아래에서 상세히 명시된다.
이러한 구현예에서, 유전자 변화는, 피루베이트 키나제 1 (PYK1으로도 지칭됨), 및 선택적으로 또한 피루베이트 키나제 2 (PYK2로도 지칭됨)를 과소 발현하기 위해, 도입된다. 이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, PYK1은 유전자를 약한 프로모터 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치함으로써 과소 발현시킬 수 있다. 이러한 구현예들 중 일부 구현예에서, PYK2는 예를 들어 끊어짐 또는 결손에 의해 불활성화될 수 있다. 일부 구현예에서, PYK1 유전자는 과소 발현되기 보다는 결손될 수 있다. 특정 구현예에서, PYK1 유전자 및 PYK2 유전자는 과소 발현되기 보다는 결손될 수 있다.
이러한 구현예에서, 유전자 변화는, (i) 구성적인 과다 발현, 또는 (ii) 유도성 과다 발현에 의해, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 [ATP] (PCK 또는 pCKA 또는 pEPCK로도 지칭됨)를 과다 발현하기 위해, 도입된다.
이러한 구현예에서, 유전자 변화는, (i) 구성적인 과다 발현, 또는 (ii) 유도성 과다 발현에 의해, 과산화소체 말레이트 데하이드로게나제 (peroxisomal malate dehydrogenase) (MDH3로도 지칭됨)와 같은 사이토플라즘 말레이트 데하이드로게나제를 과다 발현하기 위해, 도입된다.
이러한 구현예에서, 유전자 변화는, (i) 구성적인 과다 발현, 또는 (ii) 유도성 과다 발현에 의해, NADP-의존적인 말릭 효소 3 (NADP-dependent malic enzyme 3) (ME3 또는 NADP-ME3로도 지칭됨)를 과다 발현하기 위해, 도입된다.
이러한 구현예에서, 유전자 변화는, 예를 들어, (i) 대응되는 코딩 서열을 약한 프로모터, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 배치하거나, 또는 (ii) 알코올 데하이드로게나제(들)의 불안정화된 형태를 생산함으로써, 하나 이상의 알코올 데하이드로게나제(들), 바람직하게는 알코올 데하이드로게나제 1 (ADH1으로도 지칭됨), 알코올 데하이드로게나제 3 (ADH3로도 지칭됨), 알코올 데하이드로게나제 4 (ADH4로도 지칭됨) 및 알코올 데하이드로게나제 5 (ADH5로도 지칭됨)를 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 알코올 데하이드로게나제(들)의 발현을 감소시키기 위해, 도입된다.
또한 이러한 구현예에서, 유전자 변화는, (i) 구성적인 과다 발현, 또는 (ii) 유도성 과다 발현에 의해, 외인성 아세트알데하이드 데하이드로게나제 (MHPF로도 지칭됨)를 과다 발현하기 위해, 도입된다.
피루베이트 키나제 1 및 피루베이트 키나제 2는 전술한 바와 같이 정의된다.
포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 ( PPCK )
포스포에놀 카르복시키나제 [ATP] 효소는 뉴클레오시드 트리포스페이트와 옥살로아세테이트 간의 직접적인 포스포릴 전달을 통해 옥살로아세테이트에서 포스포에놀피루베이트로의 변환을 촉매하는 당해 기술 분야에 기술된 단백질이다.
포스포에놀 카르복시키나제 [ATP]의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Bazaes S. et al. (2007) The Protein Journal, 26, 265-269 및 Mariet J. Van der Werf et al.·(1997) Arch Microbiol 167: 332-342에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 포스포에놀 카르복시키나제 [ATP]는 EC 번호 4.1.1.49의 효소이다.
포스포에놀 카르복시키나제 [ATP] (PCKA로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_417862를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NC_000913에 기술된 것을 참조할 수 있다.
본 발명에 따른 바람직한 포스포에놀 카르복시키나제는 EC 번호 4.1.1.32의 PEPCK과 같은 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 PPCK로부터 선택될 수 있다.
말레이트 데하이드로게나제
말레이트 데하이드로게나제 효소는 NADH의 존재시 말레이트에서 옥살로아세테이트로의 변환을 촉매하는 당해 기술 분야에 개시된 단백질이다.
말레이트 데하이드로게나제의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다. 예를 들어, 레퍼런스 MAK196-1KT 하에 "말레이트 데하이드로게나제 분석 키트"라는 명칭으로 Sigma 사로부터 판매되는 시판 키트를 참조할 수 있다.
말레이트 데하이드로게나제 (MDH3로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_010205를 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_00118037을 참조할 수 있다.
NADP -의존적인 말릭 효소 3
NADP-의존적인 말릭 효소 3는 NADP의 존재시 말레이트에서 피루베이트로의 변환을 촉매하는 당해 기술 분야에 개시된 단백질이다.
NADP-의존적인 말릭 효소 3의 활성 수준을 측정하기 위한 실행 방법은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다.
이와 관련하여, 당해 기술 분야의 당업자는 유익하게는 Gerrard-Wheeler et al. FEBS Journal 276 (2009) 5665-5677에 기술된 방법을 참조할 수 있다.
본 명세서에서 바람직한 NADP-의존적인 말릭 효소 3는 EC 번호 1.1.1.40의 효소이다.
NADP-의존적인 말릭 효소 3 (NADP-ME3 또는 ME3로도 지칭됨)의 아미노산 서열은 UniProt 데이터베이스에서 등재 번호 NP_197960을 참조할 수 있다. 핵산 서열은 NCBI 데이터베이스에서 등재 번호 NM_122489를 참조할 수 있다.
알코올 데하이드로게나제 1, 알코올 데하이드로게나제 3, 알코올 데하이드로게나제 4, 아세트알데하이드 데하이드로게나제 및 알코올 데하이드로게나제 5는 상기와 같이 정의된다.
프로모터
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모를 수득하기 위해 유전자 조작된 대상 유전자들의 발현은, 사카로마이세스 세레비지애를 비롯한 효모 세포에서 기능하는 적절한 조절 서열을 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 다양한 프로모터들이 대상 코딩 서열을 바람직한 발현을 사용될 수 있으며, 그 예로는 (i) 구성적인 강한 프로모터 (본원에서 강한 프로모터로도 언급됨), (ii) 구성적인 약한 프로모터 (본원에서 약한 프로모터로도 언급됨) 및 (iii) 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함한다. 여러가지 매체에서 상대적인 활성을 가진 효모 프로모터의 리스트는 Keren et al. (2013) Molecular Systems Biology 9:701에서 확인할 수 있다.
주어진 유전자의 구성적인 과다 발현을 허용하는 프로모터는 문헌 (Velculescu et al. (1997) Cell 88, 243-251)에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에서 특히 흥미로운 강한 프로모터는 하기 프로모터들을 포함하는 군으로부터 선택할 수 있다:
ㆍ pTDH3 (서열번호 38),
ㆍ pENO2 (서열번호 39),
ㆍ pTEF KI (서열번호 40),
ㆍ pTEF3 (서열번호 41),
ㆍ pTEF1 (서열번호 42),
ㆍ pADH1 (서열번호 43),
ㆍ pGMP1 (서열번호 44),
ㆍ pFBA1 (서열번호 45),
ㆍ pPDC1 (서열번호 46),
ㆍ pCCW12 (서열번호 47), 및
ㆍ pGK1 (서열번호 48).
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 강한 프로모터는, 독립적으로, pTDH3, pENO2, pTEF-KI, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 및 pGK1으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에서 특히 흥미로운 약한 프로모터는 하기 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택할 수 있다:
ㆍ pURA3 (서열번호 50),
ㆍ pRPLA1 (서열번호 51)
ㆍ pNUP57 (서열번호 130), 및
ㆍ pGAP1 (서열번호 131).
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 약한 프로모터는, 독립적으로, pURA3, pRPLA1, pNUP57 및 pGAP1으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
전술한 바와 같이, 유도성 또는 억제성 프로모터는 생물적 또는 비-생물적 인자의 존재 또는 부재에 의해, 또한 이들 인자의 양에 의해, 활성이 조절되는 프로모터이다. 이에, 일부 프로모터에서, 소정의 인자의 양이 증가하거나 또는 증가되는 경우, 이의 활성은 특히 유도되어 증가될 것이며, 상기한 인자의 양이 줄어들거나 또는 감소되는 경우에는 이러한 동일한 프로모터의 활성은 억제되어 감소될 수 있다. 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하는 본 발명의 재조합 효모의 배양 배지 내 상기한 인자(들)의 함량은 당해 기술 분야의 당업자에 의해 결정되고, 따라서 통제될 수 있다.
예를 들어, pSAM4 프로모터를 포함하는 본 발명에 따른 재조합 효모의 배양 배지 내 메티오닌의 양적 증가는, 유전자의 전사를 프로모터의 통제 하에 유도할 것이며, 즉 증가시킬 것이다. 반면, 배양 배지 내 메티오닌의 양적 감소는 유전자의 전사를 프로모터의 통제 하에 억제 유도할 것이며, 즉 감소될 것이다.
다른 예로, pCTR1 프로모터를 포함하는 본 발명에 따른 재조합 효모의 배양 배지 내 구리의 양적 증가는, 유전자의 전사를 프로모터의 통제 하에 억제할 것이며, 즉 감소시킬 것이다. 반면, 배양 배지 내 구리의 양적 감소는, 유전자의 전사를 프로모터의 통제 하에 유도할 것이며, 즉 증가시킬 것이다.
이런 이유로, 다음과 같은 프로모터는 "유도성 또는 억제성 프로모터"로 본원에서 언급된다.
제1 구현예에서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는 구리 유도성 또는 억제성 프로모터, 메티오닌 유도성 또는 억제성 프로모터 및 트레오닌 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으며, 특히 하기 프로모터들로 이루어진 군으로부터 선택된다:
ㆍ pSAM4 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (서열번호 52),
ㆍ pCUP1-1 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 53),
ㆍ pCUP1.cgla - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 54),
ㆍ pCUP1.sba - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 55),
ㆍ pACU1 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 56),
ㆍ pACU2 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 57),
ㆍ pACU3p - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 58),
ㆍ pACU4p - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 59),
ㆍ pACU5 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 60),
ㆍ pACU6 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 61),
ㆍ pACU7 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 62),
ㆍ pACU8 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 63),
ㆍ pACU9 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 64),
ㆍ pACU10p - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 65),
ㆍ pACU11 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 66),
ㆍ pACU12 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 67),
ㆍ pACU13 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 68),
ㆍ pACU14 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 69),
ㆍ pACU15 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 70),
ㆍ pGAL/CUP1p - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 71),
ㆍ pCRS5 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 72), 및
ㆍ pCHA1 - 트레오닌 유도성 또는 억제성 (서열번호 73).
이러한 구현예에서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는, 특히, 독립적으로 pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5 및 pCHA1으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
이들 프로모터의 활성은, 따라서, 전술한 바와 같이, 메티오닌, 구리 또는 트레오닌의 존재 증가에 의해 유도되며, 이의 활성은 메티오닌, 구리 또는 트레오닌의 양적 감소시 감소되며, 즉, 억제된다.
제2 구현예에서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는 구리 유도성 또는 억제성 프로모터, 라이신 유도성 또는 억제성 프로모터 및 메티오닌 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으며, 특히 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
ㆍ pCTR1 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 74),
ㆍ pCTR3 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 75),
ㆍ pCUR1 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 76),
ㆍ pCUR2 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 77),
ㆍ pCUR3 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 78),
ㆍ pCUR4 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 79),
ㆍ pCUR5p - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 80),
ㆍ pCUR6 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 81),
ㆍ pCUR7 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 82),
ㆍ pCUR8 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 83),
ㆍ pCUR9 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 84),
ㆍ pCUR10 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 85),
ㆍ pCUR11 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 86),
ㆍ pCUR12 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 87),
ㆍ pCUR13 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 88),
ㆍ pCUR14 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 89),
ㆍ pCUR15 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 90),
ㆍ pCUR16 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 91),
ㆍ pCUR17 - 구리 유도성 또는 억제성 (서열번호 92),
ㆍ pLYS1 - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 93),
ㆍ pLYS4 - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 94),
ㆍ pLYS9 - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 95),
ㆍ pLYR1p - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 96),
ㆍ pLYR2p - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 97),
ㆍ pLYR3p - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 98),
ㆍ pLYR4p - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 99),
ㆍ pLYR5p - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 100),
ㆍ pLYR6p - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 101),
ㆍ pLYR7p - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 102),
ㆍ pLYR8 - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 103),
ㆍ pLYR9 - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 104),
ㆍ pLYR10 - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 105),
ㆍ pLYR11 - 라이신 유도성 또는 억제성 (서열번호 106),
ㆍ pMET17 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (서열번호 107),
ㆍ pMET6 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (서열번호 108),
ㆍ pMET14 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (서열번호 109),
ㆍ pMET3 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (서열번호 110),
ㆍ pSAM1 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (서열번호 111), 및
ㆍ pSAM2 - 메티오닌 유도성 또는 억제성 (서열번호 112),
ㆍ pMDH2 - 글루코스 유도성 또는 억제성 (서열번호 49),
ㆍ pJEN1 - 글루코스 유도성 또는 억제성 (서열번호 132),
ㆍ pICL1 - 글루코스 유도성 또는 억제성 (서열번호 133),
ㆍ pADH2 - 글루코스 유도성 또는 억제성 (서열번호 134), 및
ㆍ pMLS1 - 글루코스 유도성 또는 억제성 (서열번호 135).
이러한 구현예에서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는, 독립적으로, pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 및 pMLS1으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는 구리 유도성 또는 억제성 프로모터, 글루코스 유도성 또는 억제성 프로모터, 라이신 유도성 또는 억제성 프로모터, 메티오닌 유도성 또는 억제성 프로모터 및 트레오닌 유도성 또는 억제성 프로모터를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
이들 프로모터의 활성은, 따라서, 전술한 바와 같이, 메티오닌, 구리, 라이신 또는 글루코스의 존재 증가에 의해 억제되며, 이의 활성은 메티오닌, 구리, 라이신 또는 글루코스의 양적 감소시 증가, 즉 유도된다.
보다 구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 유도성 또는 억제성 프로모터는, 독립적으로, pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5, pCHA1, pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 및 pMLS1으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
보다 구체적으로, 상기한 프로모터는, 동일하거나 또는 상이하며, 바람직하게는, 서열번호 38-112 및 130-135의 서열과 적어도 80%의 동일성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 특징으로 할 수 있다.
Blazeck & Alper (2013) Biotechnol. J. 8 46-58에 언급된 합성 프로모터 역시 이용할 수 있다.
본 발명의 강한, 약한 및 유도성 또는 억제성 프로모터는 사카로마이세테스 (Saccharomycetes) 강으로부터 유래되는 임의의 유기체로부터 기원할 수 있으며, 특히, 독립적으로 사카로마이세스 세레비지애, 사카로마이세스 볼라르디이 (Saccharomyces boulardii), 사카로마이세스 카스텔리이 (Saccharomyces castelii), 사카로마이세스 베이야누스 (Saccharomyces bayanus), 사카로마이세스 아르보리콜라 (Saccharomyces arboricola), 사카로마이세스 쿠드리아브제비이 (Saccharomyces kudriavzevii), 아시비아 고시피이 (Ashbya gossypii), 클로베로마이세스 락티스 (Kluveromyces lactis), 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris), 칸디다 글라브라타 (Candida glabrata), 칸디다 트로피칼리스 (Candida tropicalis), 데바리오마이세스 카스텔리이 (Debaryomyces castelii), 야로위아 리폴리티카 (Yarrowia lipolitica) 및 사이버린드네라 자디니이 (Cyberlindnera jadinii)로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기체로부터 기원할 수 있다.
본 발명의 강한, 약한 및 유도성 또는 억제성 프로모터는 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애, 사카로마이세스 카스텔리이, 사카로마이세스 베이야누스, 사카로마이세스 아르보리콜라, 사카로마이세스 쿠드리아브제비이 및 크리로베로마이세스 락티스로 이루어진 군으로부터 선택되는 유기체로부터 기원할 수 있다.
종결인자
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모를 수득하기 위해 유전자 조작된 대상 유전자의 발현은, 사카로마이세스 세레비지애를 비롯한 효모 세포에서 기능하는 적절한 전사 종결인자 서열을 포함한다.
전사 종결인자는, 동일하거나 또는 상이하며, 문헌 Yamanishi et al., (2013) ACS synthetic biology 2, 337-347에서 확인할 수 있다.
본 발명에서 특히 흥미로운 종결인자는 하기 종결인자들을 포함하는 군으로부터 선택할 수 있다:
ㆍ tTDH2, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 이소자임 2를 코딩하는 유전자로부터 유래 (TDH2 유전자 = 서열번호 113의 서열),
ㆍ tCYC1 (= 서열번호 114의 서열),
ㆍ tTDH3 (= 서열번호 115의 서열), 및
ㆍ tADH1, 알코올 데하이드로게나제의 코딩 유전자로부터 유래 (ADH1 유전자 = 서열번호 116의 서열),
ㆍ tADH2, 알코올 데하이드로게나제의 코딩 유전자로부터 유래 (ADH2 유전자 = 서열번호 117의 서열),
ㆍ tTPI1, 트리오스 포스페이트 이소머라제의 코딩 유전자로부터 유래 (TPI1　유전자 = 서열번호 118의 서열),
ㆍ tMET17, O-아세틸 호모세린-O-아세틸 세린 설프하이드릴라제의 코딩 유전자로부터 유래 (Met17 유전자 = 서열번호 119의 서열),
ㆍ tENO2, 에놀라제 II의 코딩 유전자로부터 유래 (ENO2 유전자 = 서열번호 120의 서열),
ㆍ tMET3 (= 서열번호 121의 서열), 및
ㆍ tPGK1, 3-포스포글리세레이트 키나제의 코딩 유전자로부터 유래 (PGK1　유전자 = 서열번호 122의 서열),
ㆍ tDIT1 (= 서열번호 123의 서열),
ㆍ tRPL3 (= 서열번호 124의 서열),
ㆍ tRPL41B (= 서열번호 125의 서열),
ㆍ tRPL15A (= 서열번호 126의 서열),
ㆍ tIDP1 (= 서열번호 127의 서열).
보다 구체적으로, 종결인자는, 서로 동일하거나 또는 상이하며, 바람직하게는 서열번호 113-127의 서열과 적어도 80%의 동일성을 가진 서열들로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 특징으로 할 수 있다.
재조합 효모
일반적으로, 효모는 박테리아와 비교해 더 높은 밀도로 배양할 수 있으며, 보다 빨리 증식할 수 있으며, 산업적인 조건에서 무균 환경을 요하지 않는다. 아울러, 효모 세포는 박테리아 세포와 비교해 배양 배지에서 쉽게 분리할 수 있어, 생산물 추출 및 정제 과정이 크게 단순화된다.
선호적으로는, 본 발명의 효모는 사카로마이세스 (Saccharomyces), 칸디다 (Candida), 아시비아 (Ashbya), 데케라 (Dekkera), 피키아 (한세눌라), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 클라비스포라 (Clavispora), 로데로마이세스 (Lodderomyces), 야로위아 (Yarrowia), 지고사카로마이세스 (Zigosaccharomyces), 시조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 토룰라스포라 (Torulaspora), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 브레타노마이세스 (Brettanomycces), 크립토코커스 (Cryptococcus) 또는 말라세지아 (Malassezia) 속으로부터 선택될 수 있다.
보다 선호적으로, 효모는 사카로마이세스, 데케라, 시조사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 토룰라스포라, 지고사카로마이세스 또는 브레타노마이세스 속의 크랩트리 (Crabtree) 양성 효모일 수 있다.
보다 선호적으로, 효모는 사카로마이세스 세레비지애, 사카로마이세스 볼라르디이 (Saccharomyces boulardii), 사카로마이세스 도글라시이 (Saccharomyces douglasii), 사카로마이세스 베이야누스 (Saccharomyces bayanus) 또는 지고사카로마이세스 베일리이 (Zigosaccharomyces bailii), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 데케라 브루셀렌시스 (Dekkera brucelensis), 데케라 인터메디아 (Dekkera intermedia), 브레타노마이세스 쿠스터시이 (Brettanomycces custersii), 브레타노마이세스 인터메디우스 (Brettanomycces intermedius), 클루이베로마이세스 서모톨레렌스 (Kluyveromyces themotolerens), 토룰라스포라 글로보사 (Torulaspora globosa), 코룰라스폴 글라브라타 (Torulaspora glabrata) 종으로부터 유래될 수 있다.
보다 선호적으로, 재조합 효모는 사카로마이세스 속, 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 종에 속할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 재조합 효모는 본 명세서에 기술된 것들로부터 선택되는 하나 이상의 DNA 구조체(들) 삽입에 의해 감소되는 피루베이트 데카르복실라제 활성을 가진다.
유전자에 특정 DNA 구조체를 삽입하기 위해 실행되는 방법들은 당해 기술 분야의 당업자의 일반 지식에 속한다. 관련 방법은 이하 실시예에서 보다 상세히 기술된다.
배양 조건
또한, 본 발명은 메티오닌 및/또는 그 유도체의 생산에 있어 전술한 재조합 효모의 용도에 관한 것이다.
본 발명은, 또한, 하기 단계들을 포함하는 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 생산 방법에 관한 것이다:
- 전술한 재조합 미생물을 제공하는 단계, 탄소원이 함유된 배양 배지에서 재조합 미생물을 배양하는 단계, 및
- 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체를 회수하는 단계.
전형적으로, 본 발명의 미생물은, 적절한 배양 배지에서, 약 20℃ 내지 약 37℃, 바람직하게는 27 내지 34℃ 범위의 온도에서 증식한다.
본 발명에 따른 재조합 효모가 사카로마이세스 세레비지애 종에 속하는 경우, 적절한 배양 배지에서 온도는 유익하게는 27-34℃ 범위일 수 있다.
효모에 적합한 배양 배지는, 탄소/에너지원으로서 효모 질소 베이스, 암모늄 설페이트 및 덱스트로스를 포함하는 브로스, 또는 YPD 배지, 펩톤, 효모 추출물 및 덱스트로스의 블렌드와 같이, 대부분 증식하는 최적의 비율로, 상업적으로 제조된다. 그외 정의된 또는 합성 배양 배지도 사용될 수 있으며, 특정 미생물의 증식에 적절한 배지는 미생물학 및 발효 과학 분야에서 당업자가 알 것이다.
용어 "적절한 배양 배지"는 상기와 같이 정의된다.
본 발명에 따른 재조합 효모에 대한 공지된 배양 배지의 예들은 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지되어 있으며, 다음과 같은 간행물 D. Burke et al., Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000)에 공지되어 있다.
발효에 적절한 pH 범위는 pH 3.0 내지 pH 7.5일 수 있으며, 초기 조건으로서 pH 4.5 내지 pH 6.5가 바람직하다.
발효는 호기 조건 또는 미세-호기 조건에서 수행될 수 있다.
발효 배지 내 생산물의 양은 다수의 당해 기술 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 고 성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 또는 기체크로마토그래피 (GC)를 사용해 측정할 수 있다.
본 공정은 발효의 배치 방식을 채택할 수 있다. 고전적인 배치 발효는, 배지 조성이 발효 개시시 설정되고 발효 중에 인공적으로 변형되지 않는, 밀폐된 시스템이다. 즉, 발효 개시시, 배지에 원하는 유기체 또는 유기체들을 접종하고, 시스템에 어떠한 첨가없이 발효가 이루어질 수 있다. 전형적으로, 그러나, "배치" 발효는 탄소원이 첨가되는 배치이며, 온도, pH 및 산소 농도와 같은 인자의 조절이 대개 시도된다. 배치 시스템에서, 시스템의 대사산물 및 생중량 (biomass) 조성은, 발효가 중단될 때까지, 계속적으로 달라진다. 배치 배양에서, 세포는 정체 지연기를 지나 고 증식 지수기로, 마지막으로 증식 속도가 감소 또는 정지되는 정지기 (stationary phase)를 거친다. 만일 방치하게 되면, 세포는 정지기에서 궁극적으로 죽을 것이다. 세포는 지수기에서 최종 산물 또는 중간산물을 대량으로 생산한다.
또한, 본 발명에서 피드-배치 시스템이 사용될 수 있다. 피드-배치 시스템은, 발효가 진행됨에 따라 탄소원 기질을 증가시켜 첨가하는 것을 제외하고는, 전형적인 배치 시스템과 유사하다. 피드-배치 시스템은, 분해대사산물 억제 (catabolite repression) (예, 글루코스 억제)가 세포의 대사를 억제하는 경향이 있으며 배지 내 기질의 양을 제한하는 것이 바람직한 경우에, 유용하다. 피드-배치 시스템에서 실제 기질의 농도를 측정하기는 어려우며, 따라서 pH, 용해 산소 및 C02와 같은 폐 가스 (waste gas)의 부분 압력과 같은 측정가능한 인자의 변화를 토대로 추정된다.
발효는 당해 기술 분야에서 일반적으로 잘 알려져 있으며, 그 예는 Sunderland et al., (1992)에서 찾아볼 수 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 본 발명이 배치 방식으로 수행되더라도, 그 방법을 연속 발효에 맞게 조정하는 것도 고려된다.
연속 발효는, 지정된 발효 배지를 생물반응조에 연속적으로 첨가하고, 동량의 컨디셔닝화된 배지를 공정을 위해 동시에 제거하는, 개방된 시스템이다. 연속 발효는 일반적으로 세포가 주로 지수기 증식 상태에서 일정한 고 밀도 배양이 이루어지게 유지시킨다.
연속 발효는 세포 증식 또는 최종 산물 농도에 영향을 미치는 한가지 인자 또는 임의 개수의 인자의 조정을 허용한다. 예를 들어, 한가지 방법은 탄소원 또는 질소 농도와 같은 제한 영양소를 고정된 비율로 유지시키고, 그외 모든 파라미터는 변형시킬 수 있다. 다른 시스템의 경우, 배지 탁도에 의해 측정되는 세포 농도는 일정하게 유지하면서, 증식에 영향을 미치는 다수의 인자들을 연속적으로 변형시킬 수 있다. 연속 시스템은 정상 상태 증식 조건을 유지하고자 하는 것으로, 따라서 배지 배출로 인한 세포 소실이 발효시 세포 증식 속도와 균형을 이루어야 한다. 연속 배양 공정에서 영양소 및 성장인자를 조절하는 방법뿐 아니라 산물 생산 속도 최적화 기법은 산업 미생물 분야에 잘 알려져 있다.
본 발명은 배치, 피드-배치 또는 연속 공정으로 수행할 수 있으며, 공지된 발효 방식이 적합한 것으로 생각된다. 아울러, 세포는 전체 세포 촉매로서 기판 상에 고정하고, 생산을 위한 발효 조건에 노출시킬 수 있는 것으로, 여겨진다.
메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체 생산을 여전히 개선하기 위해, 특정 구현예는 전술한 바와 같이 재조합 효모를 적절한 배양 배지에서 배양하는 것으로 이루어질 수 있으며, 이러한 배양 배지는 탄소원, 특히 글루코스를 최적량으로 포함한다.
바람직하게는, 세포는 전체 배양 기간 중 일부 기간 동안에만 상기한 최적의 배양 배지에서 배양된다. 일부 구현예에서, 효모 세포는, 배양 개시 후 11, 12, 13, 14, 15 또는 16시간 이상을 포함하는, 배양 개시 후 10시간 이상 동안 상기한 최적의 배양 배지에서 배양된다.
바람직하게는, 세포는, 배양 개시 후 6-10시간, 예를 들어 8시간을 포함하는, 5-15시간 범위의 기간 동안 상기한 최적의 배양 배지에서, 배양된다.
바람직한 구현예에서, 상기한 최적의 배양 배지에 포함되는 탄소원은 글루코스로 구성된다. 바람직한 구현예에서, 상기한 최적의 배양 배지는 12% 이상의 글루코스, 예를 들어 15% w/w 이상의 글루코스를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기한 최적의 배양 배지는 최대 40% w/w 글루코스, 예를 들어 최대 35% w/w 글루코스를 포함한다.
따라서, 전술한 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체 생산 방법은 단계 (a)와 (c) 사이에, 상기한 최적의 배양 배지에서 효모 세포를 배양하는 단계로 구성되는, 중간 단계 (b)를 더 포함한다.
메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 정제
본 발명의 특정 측면에서, 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 발효 생산은, 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체를 분리하는 단계를 포함한다. 배양 배지로부터 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 회수는 당해 기술 분야의 당업자에게 일상적인 업무이다. 비-제한적으로, 증류, 기체-스트리핑 (gas-stripping), 투과증발 (pervaporation), 선택적인 석출 또는 액체 추출 등의, 당해 기술 분야에 널리 공지된 다수의 기법으로 달성할 수 있다. 이 분야의 전문가라면 분리할 물질의 특징에 따라 각 기법의 파라미터를 변형시키는 방법을 알 것이다.
본 발명에서 미생물 모델로서 효모는 합성된 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체를 세포 외부로 완전히 배출하도록 유지되며, 따라서 정제 공정이 단순화된다.
합성된 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체는 증류에 의해 수집할 수 있다. 증류는, 특히 물과 공비 혼합물을 형성함으로써, 메티오닌 및/또는 메티오닌 유도체의 분리를 용이하게 하기 위해, 배양 배지와 다른 선택 성분이 관여할 수 있다. 이러한 선택 성분은 사이클로헥산, 펜탄, 부탄올, 벤젠, 톨루엔, 트리클로로에틸렌, 옥탄, 다이에틸에테르 또는 이들의 혼합물과 같은 유기 용매이다.
기체 스트리핑은 헬륨, 아르곤, 이산화탄소, 수소, 질소 또는 이들의 혼합물로부터 선택되는 스트리핑 기체를 사용해 달성된다.
액체 추출은 펜탄, 헥산, 헵탄 또는 도데칸과 같은 유기 용매를 소수성 상 (hydrophobic phase)으로서 이용하여 달성된다.
메티오닌 유도체
본 발명에 따른 메티오닌 유도체는, 본 발명에 따른 메티오닌 생산 미생물, 특히 본 발명에 따른 메티오닌 생산 효모에 천연적으로 및/또는 인공적으로 존재하는 하나 이상의 효소에 의한 변형 후, 메티오닌으로부터 수득할 수 있는 화합물이다.
메티오닌 유도체의 예는 예를 들어 2-하이드록시-4-(메틸티오)부탄산 (HMB) 또는 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB)일 수 있다.
바람직하게는, 메티오닌 유도체는 2-하이드록시-4-(메틸티오)부탄산 (HMB) 및 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB)으로부터 선택되며, 바람직하게는 HMB이다.
이들 화합물은 예를 들어 후술한 바와 같이 수득할 수 있다.
청구항을 포함한 명세서 전체에서, "를 포함하는"은, 달리 언급되지 않은 한, "하나 이상을 포함하는"과 동의어로서 이해되어야 한다.
용어 "... 내지... " 및 "... 내지...의 범위"는, 달리 언급되지 않은 한, 한계값을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
후술한 실시예 및 도면은 예시적인 방식으로 제시되며, 본 발명을 제한하는 것으로 암시되지 않는다.
실시예
실시예 1: 본 발명에 따른 재조합 사카로마이세스 세레비지애 균주의 제조 프로토콜
이하 수득되는 재조합 사카로마이세스 세레비지애 균주들 모두 표준 효모 분자 유전학 절차를 이용해 표준 균주로부터 확립하였다 (Methods in yeast Genetics - A cold spring harbor laboratory course Manual (2000) by D. Burke, D. Dawson, T. Stearns CSHL Press).
서열 상동성을 가진 프리 DNA 말단들을 효과적으로 재조합하는 효모의 능력을 이용해 전술한 유전자 클러스터를 재조합 효모에 한번에 삽입하였다.
또한, 하기 유전자형을 더 잘 이해하기 위해:
- ade2, his3, leu2, trp1 및 ura3는 영양 요구성 마커 유전자이다.
- 소문자는 그 유전자가 불활성임을, 대문자는 활성 유전자임을 의미한다.
- "::": 다음에 오는 유전자명은 유전자가 다음에 오는 것에 의해 끊어진 것을 의미한다 (유전자가 2 이상 삽입된다면, 이는 괄호로 표시된다). 유전자의 끊어짐은 코딩 서열의 전체 결손과 동시적이지만, 프로모터는 보존된다. 따라서, "::" 뒤에 위치한 유전자는 비활성형이며, 소문자로 표시된다. 명시되지 않은 경우, 삽입된 유전자의 전사는 파괴된 유전자의 프로모터에 의해 통제된다.
- "gene.Kl"은 유전자가 클루이베로마이세스 락티스로부터 유래되는 것을 의미한다.
보다 구체적으로, 클로닝할 코딩 서열은 인공적으로 합성하였다. 이종의 서열 (비-효모)의 경우, 효모 코돈 용법을 이용해 동일한 코딩 서열을 수득하기 위해 핵산 서열을 변형하였다. 제한효소 및 고전적인 클로닝 기술을 이용해, 각 합성 서열을 전사 프로모터와 전사 종결인자 사이에 클로닝하였다. 각 프로모터 서열 앞에는, 상류 유전자의 종결인자 서열과 상동적인 뉴클레오티드 50-200개가 선행된다. 마찬가지로, 각 유전자 (프로모터-코딩 서열-종결인자)의 종결인자 뒤에는, 바로 뒤에 오는 유전자와 상동적인 서열이 배치된다. 병합되는 각각의 유닛은 유닛 상류 및 유닛 하류 둘다와 중복되는 뉴클레오티드 50-200개를 가진다. 제1 유닛의 경우, 병합될 유전자 좌에 대한 효모 염색체 뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드 50-200개가 프로모터 앞에 위치된다. 마찬가지로, 마지막 유닛의 경우, 병합될 유전자 좌에 대한 효모 염색체 뉴클레오티드와 상보적인 뉴클레오티드 50-200개가 종결인자 다음에 위치된다.
각 유닛을 플라스미드 구조체로부터 PCR에 의해 증폭시켜, 중첩 서열을 가진 선형 DNA로 된 X 유닛을 수득하였다. 이 유전자 중 적어도 하나는 재조합 현상을 선별하기 위한 영양요구성 마커이다. 모든 선형 단편들을 효모에 한번에 형질전환하고, 사용 마커와 관련된 영양요구성으로 재조합 효모를 선별하였다. 서열의 완전성을 PCR 및 서열분석으로 검증하였다.
실시예 2: 메티오닌 생산에 대한 비교예
A. 먼저, 2종의 재조합 균주를 수득하였다: YA2326-14 및 YA2408-27. 이들 2종의 균주는 본 발명에 따른 변형의 일부만 포함하도록 재조합된 것이다.
이에, 2종의 균주는 다음과 같다:
균주 YA2326-14: Matα, ade2, agp3::loxP, bap3::loxP, can1-100, gap1::loxP, gnp1::loxP, his3::[ pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6, hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1], leu2, mae1::[ADE2.Kl- pENO2-PYC2- pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg], met19::[ pENO2-MET19- pTEF3-GND1], mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP, sam1::loxP, trp1::[pTDH3-GDH-2.Eca-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x5, ura3::[ pTEF3-MET17- pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
균주 YA2408-27: Matα, ade2, agp3::loxP, bap3::loxP, gap1::loxP, gnp1::loxP, his3::[ pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6, hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1], leu2, mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg], met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1], mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP, sam1::loxP, trp1::[pACU1-AAT2- pCUP1-1-HOM3-TRP1]x3, ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
2종의 균주 YA2326-14와 YA2408-27의 조합 변형을 포함하는, 3번째 균주를 수득하였다. 즉, DA705-1은 본 발명에 따른 균주이다.
DA705-1　: (YA2408-27 x YA2326-14)　: ade2/ade2, agp3::loxP/agp3::loxP, bap3::loxP/bap3::loxP, CAN1-100/can1-100, gap1::loxP/gap1::loxP, gnp1::loxP/gnp1::loxP, his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6, hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1]/hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1], leu2/leu2, mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg]/mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg], met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1], mup3::loxP/mup3::loxP, pdc1::loxP/pdc1::loxP, pdc6::loxP/pdc6::loxP, sam1::loxP/sam1::loxP, trp1::[pACU1-AAT2- pCUP1-1-HOM3-TRP1]x3/trp1::[pTDH3-GDH-2.Eca-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x5, ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
PPC-5는 알라닌이 N+1로 부가된 보다 안정적인 PPC 형태이다.
이들 균주들 모두 YE (효모 추출물) 2%, 글루코스 8%, (NH4)2SO4 50mM 및 CH3SNa 1g/L에서 24시간 배양하였다. 500 μM CuSO4를 8시간 후 첨가하였다. 26시간 후, 배지 내 메티오닌의 함량을 Waters 사의 AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit를 제조사에서 권고된 바와 같이 사용해 아미노산 측정을 위한 AccQ-Tag 프리컬럼 유도체화 방법으로 분석하였다.
이러한 여러가지 균주를 사용해 수득한 메티오닌의 함량은 각각 다음과 같다:
- YA2326-14: 1.47 g/L-1.
- YA2408-27: 1.5 g/L-1.
- DA705-1: 1.9 g/L-1.
이러한 비교 실험에서, 본 발명에 따른 변형을 포함하는 재조합 균주가, 본 발명에 따른 모든 유전자 변형을 포함하지 않는 다른 재조합 균주와 동일한 조건에서 배양하였을 경우, 메티오닌을 더 많이 생산한다는 결과가 수득되었다.
B. 다른 재조합 균주 3종을 수득하였다: YA1919-13, YA2058-33 및 YA2058-27.
이들 3종의 균주는 다음과 같다:
균주 YA1919-13: agp3::loxP, bap3::loxP, gap1::loxP, gnp1::loxP, mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP, sam1::loxP, hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1], mae1::[ADE2.Kl- pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg], met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1], ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7, his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6
YA2058-23: agp3::loxP, bap3::loxP, gap1::loxP, gnp1::loxP, mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP, sam1::loxP, hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1], mae1::[ADE2.Kl- pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg], met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1], ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7, his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6, trp1::[pCUP1-1-HOM3-TRP1]x2
YA2058-37: agp3::loxP, bap3::loxP, gap1::loxP, gnp1::loxP, mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP, sam1::loxP, hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1], mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg], met19::[pENO2-MET19-pTEF3--GND1], ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC5.Ec-URA3]x7, his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6, trp1::[pCUP1-1-HOM3-TRP1]x3.
이들 3종의 균주를 YE (효모 추출물) 2%, 글루코스 8%, (NH4)2SO4 50mM 및 MeSNa 1g/L에서 48시간 배양하였다. 500 μM CuSO4를 8시간 후 첨가하였다. 배지 내 메티오닌의 함량을, 26시간 후, Waters 사의 AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit를 제조사에서 권고된 바와 같이 사용해 아미노산 측정을 위한 AccQ-Tag 프리컬럼 유도체화 방법으로 분석하였다.
이들 3종의 균주를 사용하여 수득한 메티오닌의 함량은 각각 다음과 같다:
- YA1919- 13: 3.9 g/L-1.
- YA2058- 23: 6.1 g/L-1.
- YA2058- 37: 7.1 g/L-1.
본 발명의 재조합 효모에서는, HOM3의 통제된 강한 발현으로 이의 메티오닌의 생산을 현저하게 개선되었다.
C. 균주 YA1919-13 외에도, 2종의 다른 재조합 균주가 수득되었다: YA2160-40 및 YA2230-9.
YA2160-40: agp3::loxP, bap3::loxP, gap1::loxP, gnp1::loxP, mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP, sam1::loxP, hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1], mae1::[ADE2.Kl- pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg], met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1], ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7, his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6, trp1::[pSAM4-TPO1-pCUP1-1-HOM3 -TRP1]x5
YA2230-9: agp3::loxP, bap3::loxP, gap1::loxP, gnp1::loxP, mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP, sam1::loxP, hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1], mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg], met19::[pENO2-MET19-pTEF3--GND1], ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7, his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6, trp1::[pTDH3-GDH.E.Ca-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x5
이들 3종의 균주를 48시간 동안 YE (효모 추출물) 2%, 글루코스 8%, (NH4)2SO4 50mM 및 MeSNa 1g/L에서 배양하였다. 500 μM CuSO4를 8시간 후 첨가하였다. 배지 내 메티오닌의 함량을, 26시간 후, Waters 사의 AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit를 제조사에서 권고된 바와 같이 사용해 아미노산 측정을 위한 AccQ-Tag 프리컬럼 유도체화 방법으로 분석하였다.
이들 3종의 균주를 사용하여 수득한 메티오닌의 함량은 각각 다음과 같다:
- YA1919- 13: 3.9 g/L-1.
- YA2160- 40: 7.4 g/L-1.
- YA2230- 9: 9.6 g/L-1.
본 발명의 재조합 효모에서는, HOM3의 통제된 강한 발현이, TPO1의 강한 통제된 발현과 조합하여, 메티오닌 생산을 현저하게 개선하였다.
아울러, 본 발명의 재조합 효모의 경우, HOM3의 강한 통제된 발현이, GDH의 구성적인 강한 과다 발현과 조합되어, 메티오닌의 생산을 현저하게 개선하였다.
D. 균주 YA1919-13 외에도, 다른 재조합 균주를 수득하였다: YA2231-8.
YA2231-8 : agp3::loxP, bap3::loxP, gap1::loxP, gnp1::loxP, mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP, sam1::loxP, hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1], mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg], met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1], ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7, his3::[pTDH3-MHPF.Ec-HIS3]x6, trp1::[pSAM4-AAT2-pCUP1-1-HOM3-TRP1]x4
이들 2종의 균주를 48시간 동안 YE (효모 추출물) 2%, 글루코스 8%, (NH4)2SO4 50mM 및 MeSNa 1g/L에서 배양하였다. 500 μM CuSO4를 8시간 후 첨가하였다. 배지 내 메티오닌의 함량을, 26시간 후, Waters 사의 AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit를 제조사에서 권고된 바와 같이 사용해 아미노산 측정을 위한 AccQ-Tag 프리컬럼 유도체화 방법으로 분석하였다.
이들 3종의 균주를 사용하여 수득한 메티오닌의 함량은 각각 다음과 같다:
- YA1919- 13: 3.9 g/L-1.
- YA2231- 8: 7 g/L-1.
본 발명의 재조합 효모에서는, HOM3의 통제된 강한 발현이, AAT2의 조절된 강한 발현과 조합하여, 메티오닌의 생산을 현저하게 개선하였다.
E. 본 발명에 따른 추가적인 3종의 재조합 균주를 수득하였다: YA2679-28, YA2687-142 및 YA3083-58C.
이들 3종의 균주는 다음과 같다:
YA2679-28　: MAT-α, gnp1::[ LEU2.Kl, pENO2-ADH2-tIDP1, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-tRPL3, pPDC1-PEPCK.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3, leu2, mup3::[LEU2.Kl, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-TPO1-tMET17, pCCW12-MET17-tRPL41B, pTDH3-MET2-tRPL3, pCUP1-1-HOM3-tDIT1, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-PEPCK.Ec-tIDP1, pTEF1-HOM2-tTDH3, pPDC1-MDH3-tRPL15A, pADH1-HOM6-tENO2], pyk1::[HIS5.Sp-pCUR3-PYK1-4], sam3::[pTDH3-GDH-2.Eca-tRPL3-pSAM4-HOM3-tTPI1]x9, trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1.Sc]x5, ura3::[pCCW12-ME3.At-tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3.Sc]x11
YA2687-142　: MAT-α, gnp1::[LEU2.Kl, pENO2-ADH2-tIDP1, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-tRPL3, pPDC1-PEPCK.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3, leu2, mup3::[LEU2.Kl, pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-TPO1-tMET17, pCCW12-MET17-tRPL41B, pTDH3-MET2-tRPL3, pCUP1-1-HOM3-tDIT1, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-PEPCK.Ec-tIDP1, pTEF1-HOM2-tTDH3, pPDC1-MDH3-tRPL15A, pADH1-HOM6-tENO2], pyk1::[HIS5.Sp-pCUR3-PYK1-6], sam3::[pTDH3-GDH-2.Eca-tRPL3-pSAM4-HOM3 -tTPI1].
PYK1-4 및 PYK1-6는 당해 기술 분야의 당업자에 널리 공지된, N-말단 법칙에 따라 불안정화된, PYK1의 불안정화된 형태이다 (Gibbs et al. (2014) Trends in Cell Biology, 10, 603-610).
YA3083-58C　: MAT-a, agp3::loxP, gap1::loxP, gnp1::loxP, his3::[pTDH3- MHPF.Ec -tIDP1-HIS3]x6, hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1, pPDC1-MET2-tADH2, pRPLA1-HOM6-tTDH2, pENO2-MET25-tPGK1, pTEF3-AQR1], leu2, lyp1::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x7, mae1::[ADE2.Kl-RS, pTEF3-MET17-tCYC1, pTEF1-TPO1-1-tADH1, pTDH3-METX.Cg-tADH2], met19::[pENO2-MET19-tCYC1, pTEF3-GND1], mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP, pyk2::[LEU2.Kl- pCUP1-HOM2-1-tTDH3], sam1::loxP, trp1::[pTDH3-GDH.Eca-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5, ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
이들 3종의 균주를 48시간 동안 YE (효모 추출물) 2%, 글루코스 8%, (NH4)2SO4 50mM 및 MeSNa 1g/L에서 배양하였다. 500 μM CuSO4를 8시간 후 첨가하였다. 배지 내 메티오닌의 함량을, 26시간 후, Waters 사의 AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit를 제조사에서 권고된 바와 같이 사용해 아미노산 측정을 위한 AccQ-Tag 프리컬럼 유도체화 방법으로 분석하였다.
대응되는 비-재조합형 효모는 메티오닌을 검출가능한 양으로 생산하지 않았지만, 균주 YA2679-28은 24시간내에 메티오닌을 2g.L-1로 생산하였으며, 균주 YA2687-142는 동일한 시간내에 메티오닌을 2.2 g.L-1로, 균주 YA3083-58C는 24시간내에 메티오닌을 2.2 g.L-1로 생산하였다.
F. 본 발명에 따라 수득한 아래 2종의 재조합 균주를 사용해 발효기에서 추가적인 실험을 수행하였다:
DA964-31: MAT-a/MAT-α, ade2/ade2, agp3::loxP/agp3::loxP, bap3::loxP/bap3::loxP, CAN1-100/can1-100, gap1::loxP/gap1::loxP, gnp1::loxP/gnp1::loxP, his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6, hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1, pPDC1-MET2-tADH2, pRPLA1-HOM6-tTDH2, pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2, pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1], leu2/leu2, mae1::[ADE2.Kl-RS, pTEF3-MET17-tCYC1, pTEF1-TPO1-1-tADH1, pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1, pTEF1-TPO1-1-tADH1, pTDH3-METX.Cg-tADH2], met19::[pENO2-MET19-tCYC1, pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1], mup3::loxP/mup3::loxP, pdc1::loxP/pdc1::loxP, pdc6::loxP/pdc6::loxP, sam1::loxP/sam1::[LEU2.Kl- pACU8-HOM2-1-tRPL15A, pACU5-TPO1-3-tTPI1], trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pTDH3-GDH-.Eca-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5, ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
DA1047-1: MAT-a/MAT-α, ADE2/ADE2, agp3::loxP/agp3::loxP, BAP3/bap3::loxP, gap1::loxP/gap1::loxP, gnp1::loxP/gnp1::loxP, his3::[pTDH3- MHPF.Ec -tIDP1-HIS3]x6/his3::[ pTDH3- MHPF.Ec -tIDP1-HIS3]x6, hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1, pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1, pTEF3-AQR1], leu2/leu2, LYP1/lyp1::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x5, mae1::[ADE2.Kl-RS, pTEF3-MET17-tCYC1, pTEF1-TPO1-1-tADH1, pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2], met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1], mup3::loxP/mup3::loxP, pdc1::loxP/pdc1::loxP, pdc6::loxP/pdc6::loxP, pyk2::[LEU2.Kl- pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]/pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3], sam1::loxP/sam1::loxP, trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pACU3p-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-5.Ec-tIDP1]x8, ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
이들 균주를 YE (효모 추출물) 2%, 글루코스 8%, (NH4)2SO4 50mM 및 500 μM CuSO4에서, Peng et al. (2017) biotechnology for buefuels 10-43에 기술된 바와 같은, "피드 배치" 기법에 따라, 발효기에서 배양하였다.
또한, 배양 배지에 1g/L MeSH 및/또는 1g/L MeSNA를 첨가하였다.
그 후, 메티오닌 생산을 전술한 바와 같이 측정하였으며, 이들 2종의 균주를 사용해 수득한 메티오닌의 양은 각각 다음과 같다:
(i) MeSH가 첨가된 경우:
- DA964- 31: 70시간 후 32 g/L-1.
- DA1047- 1: 50시간 후 16 g/L-1.
(ii) MeSNa가 첨가된 경우:
- DA964- 31: 63시간 후 20 g/L-1.
- DA1047- 1: 47시간 후 11 g/L-1.
균주를 MeSNa 대신 MeSH가 존재하는 조건에서 배양하였을 경우, 메티오닌이 더 많이 수득되었다. 여기서, 대응되는 비-재조합 균주는 메티오닌을 임의의 검출가능한 양으로 생산하지 않았다.
G. 아래 예시한, 본 발명에 따른 추가적인 재조합 균주 2종에서 메티오닌을 분석하였다.
균주 YA3984-2: MAT-α, gap1::HIS5.Sp-loxP, gnp1::[RS-pENO2-ADH2-tIDP1, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3, leu2, mup3::[pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-TPO1-3-tMET17, pCCW12-MET17-tRPL41B, pTDH3-MET2-tRPL3, pCUP1-1-HOM3-tDIT1, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pTEF1-HOM2-tTDH3, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pADH1-HOM6-tENO2], pyk1::[pCUR3-PYK1-7-tCYC1, HIS5.Sp-loxP], sam3::[ pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX.Cg-tTPI1]x4, trp1::[ pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3 -pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5, ura3::[pCCW12-ME3.At tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3]x4
균주 YA4178: MAT-α, gap1::loxP, gnp1::[pENO2-ADH2-tIDP1, pADH1-AAT2-tRPL15A, pTEF3-MDH3-1-tRPL3, pPDC1-PEPCK-1.Ec-tMET17, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1, pCCW12-ME3.At-tRPL3], his3, leu2, mup3::[pPGK1-AAT2-tTDH2, pENO2-TPO1-3-tMET17, pCCW12-MET17-tRPL41B, pTDH3-MET2-tRPL3, pCUP1-1-HOM3-tDIT1, pTDH3-MHPF.Ec-tTPI1, pCCW12-ME3.At-tRPL3, pTDH3-PEPCK-1.Ec-tIDP1, pTEF1-HOM2-tTDH3, pPDC1-MDH3-1-tRPL15A, pADH1-HOM6-tENO2], pyk1::[pCUR3-PYK1-7-tCYC1, HIS5.Sp-loxP], pyk1::[ pCUR3-PYK1-7-tCYC1, HIS5.Sp-loxP], sam3::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX.Cg- tTPI1]x10, trp1::[pTDH3-MHPF.Ec-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5, ura3::[pCCW12-ME3.At tRPL3-pTEF3-MET17-tRPL15A-URA3]x4
PYK1-7은 degron으로 태깅된 PYK1의 인공 대립유전자이다.
PEPCK-1은 2번 위치의 아르기닌 아미노산이 글리신으로 변형되어 안정화된 PEPCK 형태이다.
이들 2종의 균주를 25 ml의 효모 추출물 2%, 글루코스 10%, Urea 50 mM 및 Cu(SO4) 500 μM에서 7시간 배양한 다음, 최종 농도 500 μM로 Cu(SO4)2를 첨가하였으며, CH3SNa (23g/l) 4 ml을 서서히 첨가하였다 (0.25ml/h). 배지 내 메티오닌의 함량을, 25시간 30분 후, Waters 사의 AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit를 제조사에서 권고된 바와 같이 사용해 아미노산 측정을 위한 AccQ-Tag 유도체화 방법으로 분석하였다.
대응되는 비-재조합 효모는 메티오닌을 검출가능한 함량으로 생산하지 않았지만, 균주 YA3984-2는 25시간 30분내에 메티오닌을 1.32 g.L-1로, 균주 YA4178은 동일한 시간내에 메티오닌을 1.26 g.L-1로 생산하였다.
실시예 3: 본 발명에 따른 메티오닌 생산 균주
하기 예시된, 본 발명에 따른 2종의 재조합 균주에서 메티오닌을 분석하였다.
균주 YA2573-36B: MAT-a, agp3::loxP, gap1::loxP, gnp1::loxP, his3::[pTDH3-GDH-2.Eca-pPDC1-MHPF.Ec-HIS3]x5, hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1], leu2, mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg], met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1], mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP,pyk1::[TRP1.Kl-RS-pTEF3-AAT2-pCUP1-1-MET19-pACU1-PEPCK-1.Ec-pMET17-PYK1], pyk2::[LEU2.Kl-RS-pADH1-HOM2-1], sam1::loxP, trp1::[pACU3p-HOM3-pACU3p-PPC-5.Ec-TRP1]x8, ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
균주 YA2691-2　: MAT-a, agp3::loxP, gap1::loxP, gnp1::loxP, his3::[pTDH3-GDH-2.Eca-pPDC1-MHPF.Ec-HIS3]x5, hom3::[pCUP1-1-HOM3-pADH1-HOM2-pADH1-MET2-pRPLA1-HOM6-pENO2-MET17-pTEF3-AQR1], leu2, mae1::[ADE2.Kl-pENO2-PYC2-pTEF3-MET17-pTEF1-TPO1-1-pTDH3-METX.Cg], met19::[pENO2-MET19-pTEF3-GND1], mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP, pyk1::[TRP1.Kl-RS-pTEF3-AAT2-pCUP1-1-MET19-pACU1-PEPCK-1.Ec-pMET17-PYK1], pyk2::[LEU2.Kl-RS-pADH1-HOM2-1], sam1::loxP, sam3::[pCUP1-1-CGS1-mut-pACU6-THR1-SAM3]x4, trp1::[pACU3p-HOM3-pACU3p-PPC-5.Ec-TRP1]x8, ura3::[pTEF3-MET17-pTDH3-PPC-5.Ec-URA3]x7
이들 2종의 균주를 24시간 동안 YE (효모 추출물) 2%, 글루코스 8%, (NH4)2SO4 50mM 및 CH3SNa 1g/L에서 배양하였다. 500 μM CuSO4를 8시간 후 첨가하였다. 배지 내 메티오닌의 함량을, 26시간 후, Waters 사의 AccQ-Tag Ultra Derivatization Kit를 제조사에서 권고된 바와 같이 사용해 아미노산 측정을 위한 AccQ-Tag 프리컬럼 유도체화 방법으로 분석하였다.
이들 2종의 균주를 사용해 수득한 메티오닌 함량은 각각 다음과 같다:
- YA2573-36B: 1.8 g/L-1.
- YA2691-2: 2.1 g/L-1.
실시예 4: 본 발명에 따른 메티오닌 및 메티오닌 유도체 생산 균주
A. 아래에 예시된, 본 발명에 따른 2종의 재조합 균주에서 메티오닌 및 KMB 생산을 분석하였다.
이들 2종의 균주는 다음과 같다:
YA3344-12: MAT-α, ADE2, agp3::loxP, aro10::[pENO2-SAM2-pENO2-ARO8-tTDH3]x6, bap3::loxP, CAN1-100, gap1::loxP, gnp1::loxP, his3::[ pTDH3- MHPF.Ec -tIDP1-HIS3]x6, hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1, pPDC1-MET2-tADH2, pRPLA1-HOM6-tTDH2, pENO2-MET17-tPGK1, pTEF3-AQR1], leu2, lyp1::[pCUP1-MET17.Rp-1-tRPL15A -pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x5, mae1::[ ADE2.Kl-RS, pTEF3-MET17-tCYC1, pTEF1-TPO1-1-tADH1, pTDH3-METX.Cg-tADH2], met19::[ pENO2-MET19-tCYC1, pTEF3-GND1], mup3::loxP, pdc1::loxP, pdc6::loxP, sam1::loxP, sam2::[ LEU2.Kl- pACU8-HOM2-1-tRPL15A, pACU5-TPO1-3-tTPI1], trp1::[pTDH3-GDH.Eca-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5, ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
DA1025-9: MAT-a/MAT-α, ade2/ade2, agp3::loxP/agp3::loxP, ARO10/aro10::[pENO2-SAM2-pENO2-ARO8-tTDH3]x11, bap3::loxP/bap3::loxP, CAN1-100/can1-100, gap1::loxP/gap1::loxP, gnp1::loxP/gnp1::loxP, his3::[pTDH3- MHPF.Ec -tIDP1-HIS3]x6/his3::[ pTDH3- MHPF.Ec -tIDP1-HIS3]x6, hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1, pPDC1-MET2-tADH2, pRPLA1-HOM6-tTDH2, pENO2-MET17-tPGK1, pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1, pPDC1-MET2-tADH2, pRPLA1-HOM6-tTDH2, pENO2-MET17-tPGK1, pTEF3-AQR1], leu2/leu2, mae1::[ ADE2.Kl-RS, pTEF3-MET17-tCYC1, pTEF1-TPO1-1-tADH1, pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ ADE2.Kl-RS, pTEF3-MET17-tCYC1, pTEF1-TPO1-1-tADH1, pTDH3-METX.Cg-tADH2], met19::[ pENO2-MET19-tCYC1, pTEF3-GND1]/met19::[ pENO2-MET19-tCYC1, pTEF3-GND1], mup3::loxP/mup3::loxP, pdc1::loxP/pdc1::loxP, pdc6::loxP/pdc6::loxP, sam1::loxP/sam1::loxP, sam2::[ LEU2.Kl- pACU8-HOM2-1-tRPL15A]/sam2::[ LEU2.Kl- pACU8-HOM2-1-tRPL15A], trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pTDH3-GDH.Eca-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1-TRP1]x5, ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
이들 2종의 균주를 YE (효모 추출물) 2%, 글루코스 8%, (NH4)2SO4 50mM, 1g/L MeSNa 및 500 μM CuSO4에서, Peng et al. (2017) biotechnology for buefuels 10-43. doi: 10.1186/s13068-017-0728-x에 기술된 바와 같은, "피드 배치" 기법에 따라, 발효기에서 배양하였다.
그 후, 메티오닌 및 KMB의 생산을 전술한 바와 같이 측정하였으며, 이들 2종의 균주를 사용해 수득한 메티오닌 및 KMB의 함량은 각각 다음과 같다:
(i) YA3344- 12: 39시간 후, 메티오닌 0.5 g/L-1 및 KMB 1.2 g/L-1.
(ii) DA1025- 9: 39시간 후, 메티오닌 7.5 g/L-1 및 KMB 8 g/L-1.
이들 배양 조건에서, 대응되는 비-재조합 균주는 KMB를 검출가능한 함량으로 생산하지 않았다.
B. 아래에 예시된, 본 발명에 따른 재조합 균주 3종에서 메티오닌 및 HMB 생산을 분석하였다.
이들 3종의 균주는 다음과 같다:
DA1047-1: MAT-a/MAT-α, ADE2/ADE2, agp3::loxP/agp3::loxP, BAP3/bap3::loxP, gap1::loxP/gap1::loxP, gnp1::loxP/gnp1::loxP, his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6/his3::[pTDH3-MHPF.Ec-tIDP1-HIS3]x6, hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1, pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1, pPDC1-MET2-tADH2, pRPLA1-HOM6-tTDH2, pENO2-MET17-tPGK1, pTEF3-AQR1], leu2/leu2, LYP1/lyp1::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x5, mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1, pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2], met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1], mup3::loxP/mup3::loxP, pdc1::loxP/pdc1::loxP, pdc6::loxP/pdc6::loxP, pyk2::[LEU2.Kl- pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]/pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3], sam1::loxP/sam1::loxP,trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pACU3p-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-5.Ec-tIDP1]x8, ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
DA1555-2: MAT-a/MAT-α, ADE2/ADE2, agp3::loxP/agp3::loxP, BAP3/bap3::loxP, gap1::loxP/gap1::loxP, gnp1::loxP/gnp1::loxP, his3::[ pTDH3- MHPF.Ec -tIDP1-HIS3]x6/his3::[pTDH3- MHPF.Ec -tIDP1-HIS3]x6, hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1, pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2, pENO2-MET17-tPGK1, pTEF3-AQR1], leu2/leu2, LYP1/lyp1::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x5, mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1, pTEF1-TPO1-1-tADH1, pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2],met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1], mup3::loxP/mup3::loxP, pdc1::loxP/pdc1::loxP, pdc6::loxP/pdc6::loxP, pyk2::[LEU2.Kl- pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]/pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3], sam1::loxP/sam1::loxP, sam3::[pCCW12-ARO8-tRPL15A-pTDH3-KDH1-0.Ll-tTPI1]x1/sam3::[pCCW12-ARO8-tRPL15A-pTDH3-KDH1-0.Ll-tTPI1]x2, trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pACU3p-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-5.Ec-tIDP1]x8, ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
DA1156-11　: DA1555-2: MAT-a/MAT-α, ADE2/ADE2, agp3::loxP/agp3::loxP, BAP3/bap3::loxP, gap1::loxP/gap1::loxP, gnp1::loxP/gnp1::loxP, his3::[ pTDH3- MHPF.Ec -tIDP1-HIS3]x6/his3::[pTDH3- MHPF.Ec -tIDP1-HIS3]x6, hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1, pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1,pTEF3-AQR1]/hom3::[pADH1-HOM2-tTPI1,pPDC1-MET2-tADH2,pRPLA1-HOM6-tTDH2,pENO2-MET17-tPGK1, pTEF3-AQR1], leu2/leu2, LYP1/lyp1::[pCUP1-1-MET17.Rp-tRPL15A-pACU6-METX-1.Cg-tTPI1]x5, mae1::[ADE2.Kl-RS, pTEF3-MET17-tCYC1, pTEF1-TPO1-1-tADH1, pTDH3-METX.Cg-tADH2]/mae1::[ADE2.Kl-RS,pTEF3-MET17-tCYC1,pTEF1-TPO1-1-tADH1,pTDH3-METX.Cg-tADH2], met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1]/met19::[pENO2-MET19-tCYC1,pTEF3-GND1], mup3::loxP/mup3::loxP, pdc1::loxP/pdc1::loxP, pdc6::loxP/pdc6::loxP, pyk2::[LEU2.Kl- pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3]/pyk2::[LEU2.Kl-pCUP1-1-HOM2-1-tTDH3], sam1::loxP/sam1::loxP, sam3::[pCCW12-ARO8-tRPL15A-pTDH3-KDH2-0.Ll-tTPI1]x1/sam3::[pCCW12-ARO8-tRPL15A-pTDH3-KDH2-0.Ll-tTPI1]x2, trp1::[pACU1-AAT2-tRPL3-pCUP1-1-HOM3-tIDP1]x3/trp1::[pACU3p-HOM3-tRPL3-pACU3p-PPC-1.Ec-tIDP1]x8, ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7/ura3::[pTEF3-MET17-tRPL3-pTDH3-PPC-5.Ec-tDIT1-URA3]x7
이들 균주를 에를렌마이어에서 배양하였다: 효모 추출물 2%, 글루코스 8%, CuSO4 500 μM, CH3SNa 10g/l, 24시간. 배양 상층액에서 메티오닌, KMB 및 HMB를 LC-MS에 의해 측정하였다 (LC: 컬럼: Hi-Plex H 300*7.7 mm Ref PL1170-6830 Agilent, 용리제 85% 포름산 0.5%, 15% 아세토니트릴, 이온화 ESI-, 질량분광기 Quattro Micro API Waters).
이들 배양 조건에서, 대응되는 비-재조합 균주는 KMB를 검출가능한 함량으로 생산하지 못하였으며, HMB를 생산하지 못하였다.
이들 3종의 균주로 수득한 메티오닌, KMB 및 HMB의 양은 각각 다음과 같다:
(i) DA1047-1: 메티오닌 2.3 g/L-1, KMB 0.3 g/L-1 및 HMB 0.1 g/L-1 (48시간 후).
(ii) DA1555- 2: 36시간 후, 메티오닌 0.3 g/L-1, KMB 0.15 g/L-1 및 HMB 2.8 g/L-1.
(iii) DA1156- 11: 44시간 후, 메티오닌 0.4 g/L-1, KMB 0.15 g/L-1 및 HMB 2.4 g/L-1.
본 발명에 따른 재조합 균주에서 ARO8 과다 발현이, 여러가지 형태의 KDH의 과다 발현과 더불어, HMB의 생산을 유도함을 알 수 있다. 또한, HMB로 변환되지 않은 KMB의 양이 본 실시예에서 매우 낮다는 것을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ADISSEO FRANCE S.A.S <120> Methionine-producing yeast <130> PR74636 <150> EP17305906 <151> 2017-07-11 <160> 135 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 1098 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> ASPARTATE-SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE (HOM2) <220> <223> ASPARTATE-SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE (HOM2) <400> 1 atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc 60 attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctcttctaga 120 tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt gctaccggaa 180 tctgctaccg atattattgt ttccgaatgt aaatctgaat tctttaaaga gtgtgacatc 240 gtcttttccg gattggatgc tgactatgct ggcgctatcg aaaaggaatt catggaagct 300 ggtatcgcca ttgtttccaa tgccaagaat tatagaagag aacaagatgt gccattgatt 360 gttcctgttg tcaatcctga gcatttggat attgtagctc aaaagcttga caccgccaag 420 gctcaaggta agccaagacc agggttcatt atctgtattt ccaattgttc cactgcaggt 480 ttggttgcac cattgaagcc tttgattgaa aaattcggtc ctattgatgc tttgaccact 540 actactttgc aagcaatctc aggtgctggt ttctccccag gtgtaccagg tattgatatt 600 ctagacaata ttattccata cattggtggt gaagaagaca agatggaatg ggagaccaag 660 aaaatcttgg ctccattagc agaagacaag acacacgtca aactattgac tccagaagaa 720 atcaaagtct ctgctcaatg taacagagtc gctgtttccg atgggcacac cgaatgtatc 780 tctttgaggt tcaagaacag acctgctcca tccgtcgagc aagtcaagac atgcctaaaa 840 gaatacgtct gcgatgccta caaattaggc tgtcattctg ctccaaagca aactattcat 900 gttttggaac aaccagacag acctcaacca aggttggaca ggaacagaga cagcggttac 960 ggtgtttccg ttggtagaat cagagaagac ccattgttag atttcaaaat ggttgtcctt 1020 tcccacaaca ccattattgg tgccgctggt tctggtgtct tgattgccga aatcttacta 1080 gcaagaaact tgatttaa 1098 <210> 2 <211> 1098 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> ASPARTATE-SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE (HOM2) <220> <223> ASPARTATE-SEMIALDEHYDE DEHYDROGENASE (HOM2) <400> 2 atggctggaa agaaaattgc tggtgttttg ggtgctactg gttccgttgg tcaacgtttc 60 attctgttgt tggcaaatca ccctcatttc gaactgaaag ttcttggtgc ctctgagaga 120 tcagctggca agaaatacgt tgacgctgtg aactggaagc aaaccgattt 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actctggtaa gttcccatgg aaggactacc cagaaaagtt ccctcaattc 720 tctcaacctg ccgaaggata tcacggtact atctacaatg aagcctacgg taacttggca 780 tacatcgttc atgttagaac tgaactatta agagatttgg gtccattgat gaacccattt 840 gcctctttct tgctactaca aggtgttgaa acattatctt tgagagctga aagacacggt 900 gaaaatgcat tgaagttagc caaatggtta gaacaatccc catacgtatc ttgggtttca 960 taccctggtt tagcatctca ttctcatcat gaaaatgcta agaagtatct atctaacggt 1020 ttcggtggtg tcttatcttt cggtgtaaaa gacttaccaa atgccgacaa ggaaactgac 1080 ccattcaaac tttctggtgc tcaagttgtt gacaatttaa agcttgcctc taacttggcc 1140 aatgttggtg atgccaagac cttagtcatt gctccatact tcactaccca caaacaatta 1200 aatgacaaag aaaagttggc atctggtgtt accaaggact taattcgtgt ctctgttggt 1260 atcgaattta ttgatgacat tattgcagac ttccagcaat cttttgaaac tgttttcgct 1320 ggccaaaaac catga 1335 <210> 9 <211> 444 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> HOMOCYSTEINE/CYSTEINE SYNTHASE (MET17) <220> <223> HOMOCYSTEINE/CYSTEINE SYNTHASE (MET17) <400> 9 Met Pro Ser His Phe Asp Thr Val Gln Leu His 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agttgtccac cgccgactcc agaggcgttc ttccaaaagc ctacccaacc 720 caggacttgg ttttcaatct acaaagattg gccgtcttga ccacagcttt gaccatggac 780 ccacctaatg ccgacttaat ctaccctgct atgcaagatc gtgtccacca accttataga 840 aagacattga tcccaggtct cacggaaatc ttatcatgtg tcaccccatc cacataccct 900 ggcctattgg gtatctgctt gtcaggtgca ggcccaacta tcttggcttt ggccactgag 960 aatttcgaag aaatctctca agaaattatc aacaggttcg ccaaaaacgg catcaagtgc 1020 tcctggaaac tactggagcc tgcctacgat ggtgctagcg tcgaacagca atga 1074 <210> 11 <211> 357 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> HOMOSERINE KINASE (THR1) <220> <223> HOMOSERINE KINASE (THR1) <400> 11 Met Val Arg Ala Phe Lys Ile Lys Val Pro Ala Ser Ser Ala Asn Ile 1 5 10 15 Gly Pro Gly Tyr Asp Val Leu Gly Val Gly Leu Ser Leu Phe Leu Glu 20 25 30 Leu Asp Val Thr Ile Asp Ser Ser Gln Ala Gln Glu Thr Asn Asp Asp 35 40 45 Pro Asn Asn Cys Lys Leu Ser Tyr Thr Lys Glu Ser Glu Gly Tyr Ser 50 55 60 Thr Val Pro Leu Arg Ser Asp Ala Asn Leu Ile Thr Arg Thr Ala Leu 65 70 75 80 Tyr Val Leu 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caaggacttt tctccattaa atgttggttc tgattggaag 180 gctgctttag cagcctccac tactaaaacg ttgcctttgg atgatttaat tgctcatttg 240 aagacttcac ctaagccagt cattttggtt gataacactt ccagcgctta cattgctggt 300 ttttacacta agtttgtcga aaatggtatt tccattgcta ctccaaacaa gaaggccttt 360 tcctctgatt tggctacctg gaaggctctt ttctcaaata agccaactaa cggttttgtc 420 tatcatgaag ctaccgtcgg tgctggtttg cctatcatca gtttcttaag agaaattatt 480 caaaccggtg acgaagttga aaaaattgaa ggtatcttct ctggtactct atcttatatt 540 ttcaacgagt tctccactag tcaagctaac gacgtcaaat tctctgatgt tgtcaaagtt 600 gctaaaaaat tgggttatac tgaaccagat ccaagagatg atttgaatgg gttggatgtt 660 gctagaaagg ttaccattgt tggtaggata tctggtgtgg aagttgaatc tccaacttcc 720 ttccctgtcc agtctttgat tccaaaacca ttggaatctg tcaagtctgc tgatgaattc 780 ttggaaaaat tatctgatta cgataaagat ttgactcaat tgaagaagga agctgccact 840 gaaaataagg tattgagatt cattggtaaa gtcgatgttg ccaccaaatc tgtgtctgta 900 ggaattgaaa agtacgatta ctcacaccca ttcgcatcat tgaagggatc agataacgtt 960 atttccatca agactaagcg ttacaccaat cctgttgtca ttcaaggtgc cggtgccggt 1020 gctgccgtta ctgccgctgg tgttttgggt gatgttatca agattgctca aagactttaa 1080 <210> 19 <211> 308 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> HOMOSERINE DESHYDROGENASE (HOM6) <220> <223> HOMOSERINE DESHYDROGENASE (HOM6) <400> 19 Met Ser Thr Lys Val Val Asn Val Ala Val Ile Gly Ala Gly Val Val 1 5 10 15 Gly Ser Ala Phe Leu Asp Gln Leu Leu Ala Met Lys Ser Thr Ile Thr 20 25 30 Tyr Asn Leu Val Leu Leu Ala Glu Ala Glu Arg Ser Leu Ile Ser Lys 35 40 45 Asp Phe Ser Pro Leu Asn Val Gly Ser Asp Trp Lys Ala Ala Leu Ala 50 55 60 Ala Ser Thr Thr Lys Thr Leu Pro Leu Asp Asp Leu Ile Ala His Leu 65 70 75 80 Lys Thr Ser Pro Lys Pro Val Ile Leu Val Asp Asn Thr Ser Ser Ala 85 90 95 Tyr Ile Ala Gly Phe Tyr Thr Lys Phe Val Glu Asn Gly Ile Ser Ile 100 105 110 Ala Thr Pro Asn Lys Lys Ala Phe Ser Ser Asp Leu Ala Thr Trp Lys 115 120 125 Ala Leu Phe Ser Asn Lys Pro Thr Asn Gly Phe Val Tyr His Glu Ala 130 135 140 Thr Val Gly Ala Gly Leu Pro Ile Ile Ser Phe Leu Arg Glu Ile 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cttttccaag atcctaacat tatctttttg 120 ggtggtggcc tgccattaaa agattatttc ccatgggata atctatctgt agattcaccc 180 aagcctcctt ttccccaggg tattggagct ccaattgacg agcagaattg cataaaatac 240 accgtcaaca aagattacgc tgataaaagt gccaatcctt ccaacgatat tcctttgtca 300 agagctttgc aatacgggtt cagtgctggt caacctgaac tattaaactt cattagagat 360 cataccaaga ttatccacga tttgaagtat aaggactggg acgttttagc cactgcaggt 420 aacacaaatg cctgggaatc tactttaaga gtcttttgta accgaggtga tgtcatctta 480 gttgaggcac attctttttc ctcttcattg gcttctgcag aggctcaagg tgtcattacc 540 ttccccgtgc caattgacgc tgatggtatc attcctgaaa aattagctaa agtcatggaa 600 aactggacac ctggtgctcc taaaccaaag ttgttataca ctattccaac gggccaaaat 660 ccaactggta cttccattgc agaccataga aaggaggcaa tttacaagat cgctcaaaag 720 tacgacttcc taattgtgga agatgaacct tattatttct tacaaatgaa tccctacatc 780 aaagacttga aggaaagaga gaaggcacaa agttctccaa agcaggacca tgacgaattt 840 ttgaagtcct tggcaaacac tttcctttcc ttggatacag aaggccgtgt tattagaatg 900 gattcctttt caaaagtttt ggccccaggg acaagattgg gttggattac tggttcatcc 960 aaaatcttga agccttactt gagtttgcat gaaatgacga ttcaagcccc agcaggtttt 1020 acacaagttt tggtcaacgc tacgctatcc aggtggggtc aaaagggtta cttggactgg 1080 ttgcttggcc tgcgtcatga atacactttg aaacgtgact gtgccatcga tgccctttac 1140 aagtatctac cacaatctga tgctttcgtg atcaatcctc caattgcagg tatgtttttc 1200 accgtgaaca ttgacgcatc tgtccaccct gagtttaaaa caaaatacaa ctcagaccct 1260 taccagctag aacagagtct ttaccacaaa gtggttgaac gtggtgtttt agtggttccc 1320 ggttcttggt tcaagagtga gggtgagacg gaacctcctc aacccgctga atctaaagaa 1380 gtcagtaatc caaacataat tttcttcaga ggtacctatg cagctgtctc tcctgagaaa 1440 ctgactgaag gtctgaagag attaggtgat actttatacg aagaatttgg tatttccaaa 1500 tag 1503 <210> 21 <211> 500 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> Aromatic aminotransferase I (ARO8) <220> <223> Aromatic aminotransferase I (ARO8) <400> 21 Met Thr Leu Pro Glu Ser Lys Asp Phe Ser Tyr Leu Phe Ser Asp Glu 1 5 10 15 Thr Asn Ala Arg Lys Pro Ser Pro Leu Lys Thr Cys Ile His Leu Phe 20 25 30 Gln Asp Pro Asn 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gtaatgaact gaacgccgct 240 tatgcggccg acggatattc ccgttactct aataagattg gctgtttaat aaccacgtat 300 ggcgttggtg aattaagcgc cttgaacggt atagccggtt cgttcgctga aaatgtcaaa 360 gttttgcaca ttgttggtgt ggccaagtcc atagattcgc gttcaagtaa ctttagtgat 420 cggaacctac atcatttggt cccacagcta catgattcaa attttaaagg gccaaatcat 480 aaagtatatc atgatatggt aaaagataga gtcgcttgct cggtagccta cttggaggat 540 attgaaactg catgtgacca agtcgataat gttatccgcg atatttacaa gtattctaaa 600 cctggttata tttttgttcc tgcagatttt gcggatatgt ctgttacatg tgataatttg 660 gttaatgttc cacgtatatc tcaacaagat tgtatagtat acccttctga aaaccaattg 720 tctgacataa tcaacaagat tactagttgg atatattcca gtaaaacacc tgcgatcctt 780 ggagacgtac tgactgatag gtatggtgtg agtaactttt tgaacaagct tatctgcaaa 840 actgggattt ggaatttttc cactgttatg ggaaaatctg taattgatga gtcaaaccca 900 acttatatgg gtcaatataa tggtaaagaa ggtttaaaac aagtctatga acattttgaa 960 ctgtgcgact tggtcttgca ttttggagtc gacatcaatg aaattaataa tgggcattat 1020 acttttactt ataaaccaaa tgctaaaatc attcaatttc atccgaatta tattcgcctt 1080 gtggacacta ggcagggcaa tgagcaaatg ttcaaaggaa tcaattttgc ccctatttta 1140 aaagaactat acaagcgcat tgacgtttct aaactttctt tgcaatatga ttcaaatgta 1200 actcaatata cgaacgaaac aatgcggtta gaagatccta ccaatggaca atcaagcatt 1260 attacacaag ttcacttaca aaagacgatg cctaaatttt tgaaccctgg tgatgttgtc 1320 gtttgtgaaa caggctcttt tcaattctct gttcgtgatt tcgcgtttcc ttcgcaatta 1380 aaatatatat cgcaaggatt tttcctttcc attggcatgg cccttcctgc cgccctaggt 1440 gttggaattg ccatgcaaga ccactcaaac gctcacatca atggtggcaa cgtaaaagag 1500 gactataagc caagattaat tttgtttgaa ggtgacggtg cagcacagat gacaatccaa 1560 gaactgagca ccattctgaa gtgcaatatt ccactagaag ttatcatttg gaacaataac 1620 ggctacacta ttgaaagagc catcatgggc cctaccaggt cgtataacga cgttatgtct 1680 tggaaatgga ccaaactatt tgaagcattc ggagacttcg acggaaagta tactaatagc 1740 actctcattc aatgtccctc taaattagca ctgaaattgg aggagcttaa gaattcaaac 1800 aaaagaagcg ggatagaact tttagaagtc aaattaggcg aattggattt ccccgaacag 1860 ctaaagtgca tggttgaagc agcggcactt aaaagaaata aaaaatag 1908 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agcaatcctg aggaattagc cagtttagga gccactgtga aaatggaaca caacgtagaa 240 gagatcaatg tcgatgataa gacagttacg gcaaagaatc tacaaacagg tgcaacagaa 300 accgtatcct acgataagtt ggtcatgact actggaagtt ggcctataat tccaccaata 360 cccggaattg atgctgagaa cattctactt tgcaagaatt attctcaagc gaatgtcatt 420 atcgaaaagg ccaaagatgc gaaaagagtc gttgtcgttg gtggtggcta tattggtata 480 gagttagttg aagcttttgt tgaaagcggt aaacaggtga ccctagttga tggtctagac 540 aggattttga acaagtattt ggacaaaccg tttactgatg ttttagaaaa ggagttagtt 600 gatagaggtg tgaacttagc cttaggtgaa aatgtccaac agtttgtagc tgatgaacag 660 ggaaaagttg caaaagttat cactccatct caagaattcg aagcagacat ggtcataatg 720 tgtgttggct ttagaccaaa taccgaactt ttgaaagaca aagttgatat gttgcctaac 780 ggtgcaattg aggttaacga gtatatgcaa acgtccaatc cagatatctt tgctgctggt 840 gattcagccg tagtgcatta caacccatcg caaacgaaga attatattcc cttagcgact 900 aatgcagtaa gacagggtat gttggtgggg agaaacttga cagaacagaa acttgcctat 960 agaggcaccc aaggtacgtc tggcttgtac ttgttcggtt ggaaaattgg ctcaacagga 1020 gtaaccaaag 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atttcgtgaa tgttcttgta agggacggta gatttacaag tgatacaaca aaaagcaagg 180 cgctttttct aataaaaaga agaaaagcat ttaacaattg aacacctcta tatcaacgaa 240 gaatattact ttgtctctaa atccttgtaa aatgtgtacg atctctatat gggttactc 299 <210> 119 <211> 299 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> tMET17" <223> "tMET17 <220> <223> tMET17 <220> <223> tMET17 <400> 119 gtgtgcgtaa tgagttgtaa aattatgtat aaacctactt tctctcacaa gtactatact 60 tttataaaac gaactttatt gaaatgaata tccttttttt cccttgttac atgtcgtgac 120 tcgtactttg aacctaaatt gttctaacat caaagaacag tgttaattcg cagtcgagaa 180 gaaaaatatg gtgaacaaga ctcatctact tcatgagact actttacgcc tcctataaag 240 ctgtcacact ggataaattt attgtaggac caagttacaa aagaggatga tggaggttt 299 <210> 120 <211> 305 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> tENO2" <223> "tENO2 <220> <223> tENO2 <220> <223> tENO2 <400> 120 ggatcctaaa gtgcttttaa ctaagaatta ttagtctttt ctgcttattt tttcatcata 60 gtttagaaca ctttatatta acgaatagtt tatgaatcta tttaggttta aaaattgata 120 cagttttata agttactttt 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Ala Ala Phe Leu Ala 165 170 175 Leu Gln Gln Asn Pro Pro Leu Pro Ile Trp Ser Leu Asp Lys Ala Asn 180 185 190 Val Leu Ala Ser Ser Arg Leu Trp Arg Lys Thr Val Glu Glu Thr Ile 195 200 205 Lys Thr Glu Phe Pro Gln Leu Thr Val Gln His Gln Leu Ile Asp Ser 210 215 220 Ala Ala Met Ile Leu Val Lys Ser Pro Thr Lys Leu Asn Gly Val Val 225 230 235 240 Ile Thr Asn Asn Met Phe Gly Asp Ile Ile Ser Asp Glu Ala Ser Val 245 250 255 Ile Pro Gly Ser Leu Gly Leu Leu Pro Ser Ala Ser Leu Ala Ser Leu 260 265 270 Pro Asp Thr Asn Lys Ala Phe Gly Leu Tyr Glu Pro Cys His Gly Ser 275 280 285 Ala Pro Asp Leu Pro Ala Asn Lys Val Asn Pro Ile Ala Thr Ile Leu 290 295 300 Ser Ala Ala Met Met Leu Lys Leu Ser Leu Asp Leu Val Glu Glu Gly 305 310 315 320 Arg Ala Leu Glu Glu Ala Val Arg Asn Val Leu Asp Ala Gly Val Arg 325 330 335 Thr Gly Asp Leu Gly Gly Ser Asn Ser Thr Thr Glu Val Gly Asp Ala 340 345 350 Ile Ala Lys Ala Val Lys Glu Ile Leu Ala 355 360 <210> 130 <211> 499 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pNUP57 <220> <223> pNUP57 <400> 130 tcatctgcgc aatgactatc aagaccttct gcaagaattt caaatctcac tgaaaatctt 60 gaccgaaaag tgtcttgaaa acccatcaag cctgcaaaac ctatctttga cattagtctc 120 cattataaaa acggcatagt tgggagaaaa cttttcatac ttcaattgtg gactgatata 180 agtattttgg ttttgcccgc atgatcatcc cacatggcta cagcagttct ctcataggaa 240 atagtacaat agctacgtga tataatctaa ataattgttg ccaatgtgta attatatcat 300 tttgaacgtt cgcgaaatgg attattttca aaaattttgt ttcttgaaat gagtaaaagc 360 aaaagtccaa ctctccaagt cgatgtaaac aactttttgc caaagggact gaaagactaa 420 atcgaggatt atcccgttca aactattcca gaaacgctcg ttagtaacaa aagacatacc 480 ttgttgacca attgatcac 499 <210> 131 <211> 451 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pGAP1 <220> <223> pGAP1 <400> 131 cactttcacc agatcccaaa tgtcccgccc ctattcccgt gttccatcac gtaccataac 60 ttaccatttc atcacgttct ctatggcaca ctggtactgc ttcgactgct ttgcttcatc 120 ttctctatgg gccaatgagc taatgagcac aatgtgctgc gaaataaagg gatatctaat 180 ttatattatt acattataat atgtactagt gtggttattg gtaattgtac 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ttcccagatg ggtgcgaaag tcagtgatcg aggaagttat tgagcgcgcg gcttgaaact 600 atttctccat ctcagagccg ccaagcctac cattattctc caccaggaag ttagtttgta 660 agcttctgca caccatccgg acgtccataa ttcttcactt aacggtcttt tgccccccct 720 tctactataa tgcattagaa cgttacctgg tcatttggat ggagatctaa gtaacactta 780 ctatctccta tggtactatc ctttaccaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaatcag 840 caaagtgaag taccctcttg atgtataaat acattgcaca tcattgttga gaaatagttt 900 tggaagttgt ctagtccttc tcccttagat ctaaaaggaa gaagagtaac agtttcaaaa 960 gtttttcctc aaagagatta aatactgcta ctgaaaat 998 <210> 133 <211> 450 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pICL1 <220> <223> pICL1 <400> 133 ttttgctact cgtcatccga tgagaaaaac tgttcccttt tgccccaggt ttccattcat 60 ccgagcgatc acttatctga cttcgtcact ttttcatttc atccgaaaca atcaaaactg 120 aagccaatca ccacaaaatt aacactcaac gtcatctttc actacccttt acagaagaaa 180 atatccatag tccggactag catcccagta tgtgactcaa tattggtgca aaagagaaaa 240 gcataagtca gtccaaagtc cgcccttaac caggcacatc ggaattcaca aaacgtttct 300 ttattatata aaggagctgc ttcactggca aaattcttat tatttgtctt ggcttgctaa 360 tttcatctta tccttttttt cttttcacac ccaaatacct aacaattgag agaaaactct 420 tagcataaca taacaaaaag tcaacgaaaa 450 <210> 134 <211> 598 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pADH2 <220> <223> pADH2 <400> 134 tatcttaact gatagtttga tcaaaggggc aaaacgtagg ggcaaacaaa cggaaaaatc 60 gtttctcaaa ttttctgatg ccaagaactc taaccagtct tatctaaaaa ttgccttatg 120 atccgtctct ccggttacag cctgtgtaac tgattaatcc tgcctttcta atcaccattc 180 taatgtttta attaagggat tttgtcttca ttaacggctt tcgctcataa aaatgttatg 240 acgttttgcc cgcaggcggg aaaccatcca cttcacgaga ctgatctcct ctgccggaac 300 accgggcatc tccaacttat aagttggaga aataagagaa tttcagattg agagaatgaa 360 aaaaaaaaaa aaaaaaggca gaggagagca tagaaatggg gttcactttt tggtaaagct 420 atagcatgcc tatcacatat aaatagagtg ccagtagcga cttttttcac actcgaaata 480 ctcttactac tgctctcttg ttgtttttat cacttcttgt ttcttcttgg taaatagaat 540 atcaagctac aaaaagcata caatcaacta tcaactatta actatatcgt aatacaca 598 <210> 135 <211> 793 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <223> pMLS1 <220> <223> pMLS1 <400> 135 tgtctaatgc gaaggtactt ttattttttt cagattcaaa gcaatattat ttagacaatt 60 gatactaagt gagcttaagg aggattaaac aactgtggaa tccttcacaa ggattcaata 120 tttgtttttc ctggttattt tgccatcatt caactttcct cagacgtaaa attcgtgctt 180 agtgatgtct caatattccc gcagggtaat aaaattcaat aactatcact atatacgcaa 240 cagtattacc ctacattgct atcggctcaa tggaaatccc catatcatag cttccattgg 300 gccgatgaag ttagtcgacg gatagaagcg gttgtcccct ttcccggcga gccggcagtc 360 gggccgaggt tcggataaat tttgtattgt gttttgattc tgtcatgagt attacttatg 420 ttctctttag gtaaccccag gttaatcaat cacagtttca taccggctag tattcaaatt 480 atgacttttc ttctgcagtg tcagccttac gacgattatc tatgagcttt gaatatagtt 540 tgccgtgatt cgtatcttta attggataat aaaatgcgaa ggatcgatga cccttattat 600 tatttttcta cactggctac cgatttaact catcttcttg aaagtatata agtaacagta 660 aaatataccg tacttctgct aatgttattt gtcccttatt tttcttttct tgtcttatgc 720 tatagtacct aagaataacg actattgttt tgaactaaac aaagtagtaa aagcacataa 780 aagaattaag aaa 793

Claims (25)

  1. 메티오닌-생산 또는 메티오닌 유도체-생산 재조합 효모로서,
    상기 메티오닌 유도체가 2-하이드록시-4-(메틸티오)부탄산 (HMB) 또는 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB)이고,
    상기 재조합 효모의 게놈에서,
    (A) 아스파르테이트 세미-알데하이드 데하이드로게나제 (aspartate semi-aldehyde dehydrogenase)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 또는 코엔자임으로서 NAD 및 NADP 둘다를 이용할 수 있는 아스파르테이트 세미-알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있으며;
    (B) 아스파르토키나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있으며; 및
    (C) (i) a) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 MET2를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나; 또는
    호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있으며, 및
    b) 메티오닌 신타제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나;
    또는
    (ii) a) 호모세린 키나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있으며, 및
    b) O-포스포-L-호모세린 (OHPS) 의존적인 메티오닌 신타제 활성을 가진 시스타티오닌 γ-신타제 1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있는,
    재조합 효모.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 게놈에서, 아스파르테이트 트랜스아미나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있는, 재조합 효모.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 게놈에서, 옥소-글루타레이트를 글루타메이트로 변환하는 글루타메이트 데하이드로게나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있는, 재조합 효모.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 게놈에서, 호모세린 데하이드로게나제를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되는, 재조합 효모.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 게놈에서,
    (i) S-아데노실 메티오닌 신타제 SAM1 또는 SAM2를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 결손되었거나, 또는
    (ii) S-아데노실 메티오닌 신타제 SAM1 또는 SAM2를 코딩하는 핵산의 하나 이상 또는 전체가 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는 불안정화된 형태이거나, 또는
    (iii) S-아데노실 메티오닌 신타제 SAM1 또는 SAM2를 코딩하는 핵산의 하나 이상 또는 전체가 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나 또는 불안정화된 형태이고, 상기 S-아데노실 메티오닌 신타제 SAM1 또는 SAM2를 코딩하는 핵산이 효모 또는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 핵산인, 재조합 효모.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 게놈에서,
    (i) 방향족 아미노트랜스퍼라제 I ARO8 또는 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 유전자 BAT2를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 또는 전체가 결손되었거나, 또는
    (ii) 방향족 아미노트랜스퍼라제 I ARO8 또는 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 유전자 BAT2를 코딩하는 핵산의 하나 이상 또는 전체가 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는 불안정화된 형태인, 재조합 효모.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 게놈에서,
    (i) 방향족 아미노트랜스퍼라제 I ARO8을 코딩하는 핵산의 하나 이상 또는 전체, 또는
    (ii) 시토졸 분지쇄 아미노산 (BCAA) 아미노트랜스퍼라제 유전자 BAT2를 코딩하는 핵산의 하나 이상 또는 전체가,
    과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있는, 재조합 효모.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 게놈에서, 2-하이드록시산 데하이드로게나제 (2-hydroxyacid dehydrogenase)(KDH)를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있는, 재조합 효모.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 게놈에서,
    (i) 시스타티오닌 γ-리아제 CYS3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 약한 프로모터 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는 불안정화된 형태이거나, 또는
    (ii) 시스타티오닌 γ-리아제 CYS3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 약한 프로모터 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나 또는 불안정화된 형태이고, 상기 시스타티오닌 γ-리아제 CYS3를 코딩하는 핵산이 효모 또는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 핵산이고; 및
    상기 약한 프로모터가 pURA3, pRPLA1, pNUP57 및 pGAP1으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 효모.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 게놈에서,
    (i) 시스타티오닌 β-신타제 CYS4를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 약한 프로모터 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는 불안정화된 형태이거나, 또는
    (ii) 시스타티오닌 β-신타제 CYS4를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 약한 프로모터 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나 또는 불안정화된 형태이고, 상기 시스타티오닌 β-신타제 CYS4를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 효모 또는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 핵산이고; 및
    상기 약한 프로모터가 pURA3, pRPLA1, pNUP57 및 pGAP1으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 효모.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 게놈에서,
    a) 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 MET2를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는
    호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있으며, 및
    b) O-아세틸 호모세린-O-아세틸 세린 설프하이드릴라제 MET17을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나, 또는 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있는, 재조합 효모.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 게놈에서,
    (i) 호모세린 키나제 THR1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는 불안정화된 형태이거나, 또는
    (ii) 호모세린 키나제 THR1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나 또는 불안정화된 형태이고, 상기 호모세린 키나제 THR1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 효모 또는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 핵산인, 재조합 효모.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 게놈이 하기 변형들 중 하나 이상을 포함하는, 재조합 효모:
    (A) 제너럴 아미노산 퍼미아제 (general amino acid permease) AGP3를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었거나; 또는
    (A') 제너럴 아미노산 퍼미아제 (general amino acid permease) AGP3를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었고, 및
    (i) 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되어, 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는
    (ii) 불안정화된 (destabilized) 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되었거나; 또는
    (B) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3 (branched-chain amino-acid permease 3) BAP3를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었거나; 또는
    (B') 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3 (branched-chain amino-acid permease 3) BAP3를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었고, 및
    (i) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3 BAP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되어, 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는
    (ii) 불안정화된 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3 BAP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되었거나; 또는
    (C) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2 BAP2를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었거나; 또는
    (C') 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2 BAP2를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었고, 및
    (i) 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2 BAP2를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되어, 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는
    (ii) 불안정화된 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2 BAP2를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되었거나; 또는
    (D) 제너럴 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었거나; 또는
    (D') 제너럴 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었고, 및
    (i) 제너럴 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되어, 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는
    (ii) 불안정화된 제너럴 아미노산 퍼미아제 GAP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되었거나; 또는
    (E) 고-친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었거나; 또는
    (E') 고-친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었고, 및
    (i) 고-친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되어, 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는
    (ii) 불안정화된 고-친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되었거나; 또는
    (F) 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었거나; 또는
    (F') 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었고, 및
    (i) 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되어, 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는
    (ii) 불안정화된 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되었거나; 또는
    (G) 저-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었거나; 또는
    (G') 저-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3를 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었고, 및
    (i) 저-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되어, 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는
    (ii) 불안정화된 저-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3를 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되었거나; 또는
    (H) 고-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었거나; 또는
    (H') 고-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 내인성 핵산의 하나 이상 또는 전체가 효모 게놈으로부터 결손되었고, 및
    (i) 고-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되어, 유도성 또는 억제성 프로모터의 통제 하에 있거나, 또는
    (ii) 불안정화된 고-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 도입되었거나; 또는
    (I) 추정의 트랜스포터 (probable transporter) AQR1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현되거나; 또는
    (J) 폴리아민 트랜스포터 1 TPO1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 과다 발현됨.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 게놈이, 제13항에 기술된 변형들 중 2 이상, 또는 3 이상을 포함하는, 재조합 효모.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 아스파르토키나제가 아스파르토키나제 HOM3 이고, 상기 아스파르토키나제 HOM3를 코딩하는 핵산이 효모 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 핵산인, 재조합 효모.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 호모세린-O-아세틸트랜스퍼라제 METX를 코딩하는 핵산이 박테리아로부터 유래되는 핵산이거나, 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli), 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilius influenza), 스트렙토마이세스 라벤듈라 (Streptomyces lavendulae), 렙토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans), 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia) 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 박테리아로부터 유래되는 핵산인, 재조합 효모.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 시스타티오닌 γ-신타제 1이 시스타티오닌 γ-신타제 1 CGS1 돌연변이이고, 상기 시스타티오닌 γ-신타제 1 CGS1 돌연변이를 코딩하는 핵산이 식물로부터 기원하는 핵산이거나, 또는 아라비돕시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) 유래의 시스타티오닌 γ-신타제 1이고,
    상기 시스타티오닌 γ-신타제 1 CGS1 돌연변이는:
    (i) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 10번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 루신으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (ii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 11번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 아스파르테이트로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (iii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 15번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 아르기닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (iv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 27번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (v) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 30번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (vi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 45번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (vii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 47번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (viii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 60번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 아스파르테이트로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (ix) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 68번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (x) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 150번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 루신으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 178번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 이소루신으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 183번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 글루타메이트로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xiii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 185번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 발린으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xiv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 220번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 232번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 루신으로 치환 또는 결손되거나; 또는;
    (xvi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 245번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xvii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 257번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xviii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 259번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 아스파르테이트 또는 세린으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xiv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 261번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xx) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 275번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 루신으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 287번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 발린 또는 페닐알라닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 289번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 티로신 또는 아르기닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxiii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 324번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 페닐알라닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxiv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 326번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 356번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxvi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 371번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxvii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 396번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 알라닌으로 치환 또는 결손되거나;
    (xxviii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 405번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxix) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 431번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 글리신으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxx) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 436번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 트레오닌으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxxi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 457번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 루신으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxxii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 459번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 아스파라긴으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxxiii) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 470번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 세린으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxxiv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 472번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 글리신으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxxv) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 506번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 글리신으로 치환 또는 결손되거나; 또는
    (xxxvi) 서열번호 13의 아미노산 서열에서 507번 위치 또는 이 위치에 대응되는 위치에서 아미노산 잔기가 발린으로 치환 또는 결손된 것인,
    재조합 효모.
  18. 제13항에 있어서,
    도입되는, 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP3, 분지쇄 아미노산 퍼미아제 3 BAP3, 분지쇄 아미노산 퍼미아제 2 BAP2, 제너럴 아미노산 퍼미아제 GAP1, 고-친화성 글루타민 퍼미아제 GNP1, 제너럴 아미노산 퍼미아제 AGP1, 저-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP3 및 고-친화성 메티오닌 퍼미아제 MUP1을 코딩하는 하나 이상의 핵산이 효모 또는 사카로마이세스 세레비지애 유래의 핵산인, 재조합 효모.
  19. 제1항에 있어서,
    과다 발현된 핵산이 강한 프로모터의 통제 하에 있으며, 상기 강한 프로모터가 pTDH3, pENO2, pTEF-KI, pTEF3, pTEF1, pADH1, pGMP1, pFBA1, pPDC1, pCCW12 및 pGK1으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 효모.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 유도성 또는 억제성 프로모터가, 구리 유도성 또는 억제성 프로모터, 메티오닌 유도성 또는 억제성 프로모터 및 트레오닌 유도성 또는 억제성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 pSAM4, pCUP1-1, pCUP1.Cgla, pCUP1.Sba, pACU1, pACU2, pACU3p, pACU4p, pACU5, pACU6, pACU7, pACU8, pACU9, pACU10p, pACU11, pACU12, pACU13, pACU14, pACU15, pGAL/CUP1p, pCRS5 및 pCHA1으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 효모.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 유도성 또는 억제성 프로모터가 구리 유도성 또는 억제성 프로모터, 라이신 유도성 또는 억제성 프로모터 및 메티오닌 유도성 또는 억제성 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 pCTR1, pCTR3, pCUR1, pCUR2, pCUR3, pCUR4, pCUR5p, pCUR6, pCUR7, pCUR8, pCUR9, pCUR10, pCUR11, pCUR12, pCUR13, pCUR14, pCUR15, pCUR16, pCUR17, pLYS1, pLYS4, pLYS9, pLYR1p, pLYR2p, pLYR3p, pLYR4p, pLYR5p, pLYR6p, pLYR7p, pLYR8, pLYR9, pLYR10, pLYR11, pMET17, pMET6, pMET14, pMET3, pSAM1, pSAM2, pMDH2, pJEN1, pICL1, pADH2 및 pMLS1으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 재조합 효모.
  22. 메티오닌 또는 하나 이상의 그 유도체의 생산 방법으로서,
    상기 메티오닌 유도체가 2-하이드록시-4-(메틸티오)부탄산 (HMB) 또는 2-케토-4-메틸티오부티르산 (KMB)이고,
    상기 방법이 (a) 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따라 정의되는 재조합 효모를 배양 배지에서, 또는 MeSH, MeSNa 또는 MeSMe를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 배양 배지로부터 메티오닌 또는 하나 이상의 그 유도체를 회수하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 배양 배지가 탄소원을 포함하거나, 또는 글루코스 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 탄소원을 포함하는 것인, 방법.
  24. 삭제
  25. 삭제
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