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CN113106029A - 一种过表达aro8基因的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

一种过表达aro8基因的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用 Download PDF

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CN113106029A
CN113106029A CN202110423676.1A CN202110423676A CN113106029A CN 113106029 A CN113106029 A CN 113106029A CN 202110423676 A CN202110423676 A CN 202110423676A CN 113106029 A CN113106029 A CN 113106029A
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CN
China
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saccharomyces cerevisiae
fermentation
aro8
gene
recombinant plasmid
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CN202110423676.1A
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应汉杰
朱家庆
张涛
赵伟
蒋颖
王诗萌
张德力
陈勇
柳东
余斌
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Nanjing Tech University
Original Assignee
Nanjing Tech University
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Publication date
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Abstract

本发明公开了一种过表达ARO8基因的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用，所述酿酒酵母工程菌在原始酿酒酵母中导入了携带ARO8基因的重组质粒。本发明通过构建过表达ARO8酿酒酵母基因的酿酒酵母工程菌，提高了菌体的细胞通透性，从而提升了生物被膜的产量，从而使酿酒酵母在发酵过程中乙醇产量提高，菌落数量和粘附性增加，提高了糖转化率和乙醇产率，缩短了发酵周期。本发明通过包埋法共固定化糖化酶制剂与酿酒酵母细胞，在菌体细胞膜通透性被处理的基础上，进一步提升了酿酒酵母ARO8基因过表达基因工程菌的生物膜产量和葡萄糖转化率，缩短了发酵周期并减少了耗糖量。

Description

一种过表达ARO8基因的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及发酵领域，具体涉及一种过表达ARO8基因的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
生物膜，又称生物被膜，是一种由微生物自发形成的固定在介质表面的多细胞群体，它的主要成分是微生物细胞和其分泌的胞外多聚物(EPS)，因为其能增加细胞群体的抗逆性，利于细胞群体生存而受到人们的关注。生物被膜的生长是一个非静止的过程，主要分为初始粘附期、不可逆固着期、生长期、成熟期和扩散期这五个时期。随着时间的增长胞外分泌物会与细胞群落形成相对稳定的结构，菌落的抗逆性得到了极大的增强。在酿酒酵母生产乙醇的发酵过程中，限制乙醇产量的重要因素之一就是底物和产物的耐受性，高浓度的糖和乙醇会对酵母产生毒害作用，影响细胞本身的正常生长和发酵。一般超过200g/L的糖就会对酿酒酵母细胞产生毒害作用，而通过固定化发酵却可以使酵母的葡萄糖耐性达到300g/L以上。固定化发酵也可以使酿酒酵母的连续化和发酵效率提高，常规游离发酵的8个h可以消耗50g/L的葡萄糖作为碳源，而固定化发酵的酿酒酵母消耗同样的葡萄糖仅需要6个h左右，并且随着发酵批次的增加，整个固定化发酵体系会进入一个相对稳定的状态，此时整个体系可以以4h的发酵周期稳定进行几十个批次的乙醇发酵。因此如何调节生物被膜在固定化发酵中的作用显得尤为重要。生物被膜已经被证明在发酵生产中有积极的作用，而生物被膜的多少、膜的厚度在微生物发酵中都是重要影响因素。生物被膜过多可能会导致细胞与营养物质接触困难、代谢废物堆积从而损害细胞自身影响发酵产率；而生物被膜过少则发酵优势不明显。
细胞膜的通透性是细胞膜的特性之一，可以帮助细胞保留或者排出某些物质，通过人为的方法处理细胞可以改变细胞膜的通透性，从而改变代谢产物的排出效率和细胞的物质交换。生物被膜的形成与细胞的物质交换和代谢息息相关，改变细胞膜的通透性可以在很大程度上提升生物被膜的产量。
包埋固定化是一种将酶与酶、酶与细胞、细胞与细胞同时固定在体内形成固定化系统的一种技术，是目前酿酒酵母中应用最广泛的一种固定化方法。包埋法主要分为天然载体类包埋法和有机合成类载体包埋法。天然载体类包埋法主要有琼脂、角叉菜胶、海藻酸钙、卡拉胶、海藻酸钠及聚乙烯醇等。它们的特点是生物无毒，成型方便及固定化密度高，但机械强度低，传质能力弱，抗微生物分解能力较差。而有机合成类载体包埋法所采用的如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚乙烯醇虽化学性能稳定、机械强度高，但在固定化过程中聚合物形成条件剧烈，对细胞有损害作用。而且由于细胞被包埋在载体内部，所以也会存在着传质差、后期菌体死亡和催化效率低下的问题。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种酿酒酵母工程菌。
本发明还要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母工程菌的构建方法。
本发明进一步要解决的技术问题是提供上述酿酒酵母工程菌的应用。
为了解决上述第一个技术问题，本发明公开了一种酿酒酵母工程菌，该菌株中的ARO8基因被过表达，即在原始酿酒酵母中导入了携带ARO8基因的重组质粒。
其中，过表达ARO8前，ARO8基因序列如SEQ ID NO：1所示，过表达后ARO8后，所述携带ARO8基因的重组质粒基因序列如SEQ ID NO：3所示。
其中，所述原始酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288c。
其中，所述携带ARO8基因的重组质粒为携带ARO8基因的PYX212重组质粒。
为了解决上述第二个技术问题，本发明公开了上述酿酒酵母工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)以原始酿酒酵母的基因组为模板，PCR扩增ARO8基因；
(2)将步骤(1)得到的ARO8基因插入PYX212质粒的NHE1酶切位点之间，得到携带ARO8基因的PYX212重组质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化到E.coli DH5α的感受态细胞中，从E.coliDH5α中提取重组质粒；
(4)将步骤(3)提取所得重组质粒转化到原始酿酒酵母的感受态细胞中，即得到酿酒酵母工程菌。
步骤(1)中，所述PCR使用的引物如下：
ARO8-F：cattgttccttattcagttagCTAGCATGACTTTACCTGAATCAAAA(SEQ ID NO：4)；
ARO8-R：cgcatgatatctcgagctcagctagCCTATTTGGAAATACCAAATT(SEQ ID NO：5)。
步骤(3)中，所述重组质粒为重组质粒质粒PYX212+ARO8，其核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。
为了解决上述第三个技术问题，本发明公开了上述酿酒酵母工程菌发在发酵产乙醇中的应用。
其中，所述酿酒酵母工程菌在发酵产乙醇的过程中增加生物被膜产量也在本发明的保护范围之内。
其中，所述酿酒酵母工程菌经活化后再发酵。
其中，所述活化包括但不限于现有技术常见的活化方法；优选地，所述活化为将酿酒酵母工程菌菌液接种于YPD培养基中培养，离心；进一步优选地，所述活化为将酿酒酵母工程菌菌液按照20％-40％的体积比接种于YPD培养基中于20-40℃培养18-30h，离心；更进一步优选地，所述活化为将OD600为0.5-1.5的酿酒酵母工程菌菌液按照30％的体积比接种于YPD培养基中于30℃培养24h，离心；再更进一步优选地，所述活化为将OD600为1的酿酒酵母工程菌菌液按照30％的体积比接种于YPD培养基中于30℃培养24h，离心。
其中，发酵培养基的配方为60g/L葡萄糖、4g/L蛋白胨、4g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌。
其中，所述发酵为游离发酵、固定化发酵和包埋固定化发酵中的任意一种；优选地，所述发酵为固定化发酵或包埋固定化发酵；进一步优选地，所述发酵为包埋固定化发酵。
其中，所述固定化发酵以棉纤维作为固定化材料；优选地，所述固定化发酵中棉纤维的用量为5-9g/100mL；进一步优选地，所述固定化发酵中棉纤维的用量为7.5g/100mL。
其中，所述包埋固定化发酵以聚乙烯醇(PVA)为包埋材料，采用吸附法共固定化糖化酶和酿酒酵母工程菌。
其中，所述包埋固定化发酵包括如下步骤：
(i)将聚乙烯醇、海藻酸钠与水的混合物加热煮沸，得到第一凝胶溶液；
(ii)将所述第一凝胶溶液、糖化酶液、所述酿酒酵母工程菌的干酵母水溶液混合，得到第二凝胶溶液；
(iii)将第二凝胶溶液加入到交联剂溶液中，制成固定化凝胶颗粒；
(iv)将所得固定化颗粒于培养基中培养发酵，即得乙醇。
步骤(i)中，所述聚乙烯醇的平均分子量为20000-30000；优选地，所述聚乙烯醇的平均分子量为25000。
步骤(i)中，所述混合物中，聚乙烯醇的浓度为0.005-0.015g/mL；优选地，所述混合物中，聚乙烯醇的浓度为0.01g/mL。
步骤(i)中，所述混合物中，海藻酸钠的浓度为0.005-0.015g/mL；优选地，所述混合物中，海藻酸钠的浓度为0.01g/mL。
步骤(ii)中，所述糖化酶液的酶活为40000-60000U/g；优选地，所述糖化酶液的酶活为50000U/g。
步骤(ii)中，所述酿酒酵母工程菌的干酵母水溶液的浓度为5-15g/L；优选地，所述酿酒酵母工程菌的干酵母水溶液的浓度为10g/L。
步骤(ii)中，所述第一凝胶溶液、糖化酶液和酿酒酵母工程菌的干酵母水溶液的体积比为1：0.5-1.5：0.5-1.5；优选地，所述第一凝胶溶液、糖化酶液和酿酒酵母工程菌的干酵母水溶液的体积比为1：1：1。
步骤(iii)中，所述交联剂溶液为壳聚糖水溶液、醋酸水溶液、硼酸和氯化钙的混合溶液。
其中，所述壳聚糖水溶液的浓度为1％-3％；优选地，所述壳聚糖水溶液的浓度为2％。
其中，所述壳聚糖水溶液的粘度为0.5-1.5Pa.s；优选地，所述壳聚糖水溶液的粘度为1Pa.s。
其中，所述醋酸水溶液的浓度为1％-3％；优选地，所述醋酸水溶液的浓度为2％。
其中，所述壳聚糖水溶液与醋酸水溶液的体积比为1：0.5-1.5；优选地，所述壳聚糖水溶液与醋酸水溶液的体积比为1：1。
步骤(iii)中，所述交联剂溶液中氯化钙的浓度为2％-5％；优选地，所述交联剂溶液中氯化钙的浓度为3.5％。
步骤(iii)中，所述交联剂溶液中硼酸的浓度为1％-3％；优选地，所述交联剂溶液中硼酸的浓度为2％。
步骤(iv)中，所述固定化颗粒与发酵培养基的体积比为1：0.5-1.5；优选地，所述固定化颗粒与发酵培养基的体积比为1：1。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明通过构建过表达ARO8酿酒酵母基因的酿酒酵母工程菌，提高了菌体的细胞通透性，从而提升了生物被膜的产量，从而使酿酒酵母在发酵过程中乙醇产量提高，菌落数量和粘附性增加，提高了糖转化率和乙醇产率，缩短了发酵周期。
(2)本发明通过包埋法共固定化糖化酶制剂与酿酒酵母细胞，在菌体细胞膜通透性被处理的基础上，进一步提升了酿酒酵母ARO8基因过表达基因工程菌的生物膜产量和葡萄糖转化率，缩短了发酵周期并减少了耗糖量。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
图1为ARO8基因的电泳图。
图2为ARO8过表达菌落PCR电泳图。
图3为原始菌S288c与改造菌S288c-ARO8单批次固定化发酵的结果。
图4为未预处理和预处理后的S288c-ARO8的发酵结果。
图5为固定化S288c-ARO8与包埋共固定化S288c-ARO8的单批发酵。
图6为S288c与预处理共固定化S288c-ARO8的结晶紫染色结果。
具体实施方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中，所述糖化酶液和酶粉的酶活定义为：1mL酶液或者1g酶粉在40℃pH为4.6条件下，1小时分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量为一个酶活单位。
下述实施例中，所述％，若无特殊说明，均为质量百分比。
实施例1：
一、提取原始酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae S288c的基因组
使用Takara公司的真菌基因组提取试剂盒(Dr.GenTLETM(from Yeast)HighRecovery)
(1)取OD1.2-1.8的酿酒酵母过夜培养液至制度管中，12000rpm，离心1min，弃上清液；
(2)向沉淀中加入500μL的GenTLE Yeast Solution A轻松震荡并充分悬浮沉淀于37℃，温浴1h，期间轻轻震荡离心管数次；
(3)加入100μL的GenTLE Yeast Solution B，轻微震荡，混匀后于70℃水浴10分钟；
(4)加入200μL的GenTLE Yeast Solution C，轻微震荡，混匀后于冰上静置5分钟；
(5)将制度管于4℃下，转速12000rpm离心5分钟；
(6)将上清液移入新的制度管中，加入400μL的异丙醇，充分颠倒混匀；
(7)将制度管于4℃下，转速12000rpm离心5分钟，弃上清液；
(8)向沉淀中加入500μL预冷的70％乙醇，上下颠倒洗涤沉淀，于4℃下，转速12000rpm离心5分钟；
(9)弃上清液，室温下自然干燥DNA，沉淀至无乙醇气味；
(10)加入适量的TE Buffer/ddH2O。溶解基因组DNA。
二、PCR技术扩增目的基因ARO8
(1)以步骤一提取的酿酒酵母基因组为模板，采用PCR技术扩增ARO8基因。反应体系如表1。
表1 PCR反应体系
Figure BDA0003028519290000061
所述PCR使用的引物如下：
ARO8-F：cattgttccttattcagttagCTAGCATGACTTTACCTGAATCAAAA(SEQ ID NO：4)；
ARO8-R：cgcatgatatctcgagctcagctagCCTATTTGGAAATACCAAATT(SEQ ID NO：5)。
使用1.2％(1.2g/100mL)琼脂糖凝胶对上述PCR产物(ARO8基因片段)进行电泳，结果见图1。
(2)胶回收纯化片段ARO8使用takara试剂盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNAExtraction KitVer.4.0)
2.1使用TBE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的片段ARO8进行琼脂糖凝胶电泳；
2.2在紫外灯下切出含有目的片段ARO8的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽表面液体；
2.3切碎胶块，称量胶块重。计算体积时，以1mg＝1μL进行计算；
2.4向胶块中加入溶解液Buffer GM，Buffer GM加量没过胶块即可，均匀混合后室温15-25℃溶解胶块，此时应间断振荡混合，使胶块充分溶解；
2.5将试剂盒中的Spin Colum安置于收集管上；
2.6将步骤2.4得到的溶液转移至Spin Column中，12 00000rpm离心1min，弃滤液；
2.7将700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室温12000rpm离心1min，弃滤液；
2.8重复操作步骤2.7；
2.9将Spin Column安置于收集管上，室温12000rpm离心1min，弃滤液；
2.10将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入60μL灭菌水，室温静置1min；
2.11室温12000rpm离心1min洗脱ARO8片段；
2.12对纯化后的ARO8目的片段进行琼脂糖凝胶电泳验证，计算浓度；其中ARO8基因的核苷酸序列见SEQ ID NO：1。
三、提取质粒PYX212
利用Axygen的提质粒试剂盒(AxyPrepTM Plasmid Miniprep Kit)
(1)从平板培养基上挑选E.coli DH5α单菌落(内含PYX212，其核苷酸序列见SEQID NO：2)，其中E.coli DH5α购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司，NO.B528413，PET-28a的保存方法参考按照《分子克隆实验指南》(黄培堂等译，中国，科学出版社，2002，第三版)中方法进行；然后接种至5mL的含有抗生素的LB液体培养基中(抗性为卡那霉素50μg/mL)，37℃过夜培养12-16h；
(2)取2mL的过夜培养菌液，12000rpm离心1min，弃上清；
(3)用250μL的4℃预冷的Buffer S1(含RNase A)充分悬浮细菌沉淀；
(4)加入250μL的Buffer S2轻轻上下翻转混合4-6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液；
(5)加入350μL的Buffer S3轻轻上下翻转混合6-8次，直至形成紧实凝集块；
(6)室温12000rpm离心10min，取上清液；
(7)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube上；
(8)将步骤(6)得到的上清液转移至Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液；
(9)将500μL的Buffer W1加入Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液；
(10)将700μL的Buffer W2加入Spin Column中，12000rpm离心1min，弃滤液；
(11)重复操作步骤(10)；
(12)重新将Spin Column安置于Collection Tube上，12000rpm离心1min，除尽残留洗液；
(13)将Spin Column安置于新的1.5mL的离心管上，在Spin Column膜的中央处加入30-50μL的65℃灭菌水，室温静置1min；
(14)12000rpm离心1min洗脱DNA；
(15)对提取后的质粒PYX212进行琼脂糖凝胶电泳验证，计算浓度。
四、利用限制性内切酶NHE1酶切质粒PYX212
表2酶切反应体系
Figure BDA0003028519290000081
37℃酶切30min，跑胶验证，确认片段正确后进行胶回收。
五、连接目的基因ARO8和酶切后质粒PYX212得到重组质粒PYX212+ARO8
使用诺唯赞一步克隆试剂盒(
Figure BDA0003028519290000082
II)于冰水浴中配制如下反应体系，见表3。
表3酶连体系
Figure BDA0003028519290000091
37℃水浴30min后，立即冰浴五分钟，-20℃保存备用。
六、将重组质粒PYX212+ARO8转化到E.coli DH5α
(1)从-80℃冰箱中取出一管200μL E.coli DH5α感受态细胞(上海生工生物工程(上海)股份有限公司NO.B528413)悬液，室温下解冻，解冻后立即置于冰上；
(2)加入步骤五得到的重组质粒PYX212+ARO8溶液于E.coli DH5α感受态细胞悬液中，轻轻摇匀，冰上放置30min；
(3)42℃水浴热激45-90s，立即置于冰上冷却5min；
(4)加入1mL的LB液体培养基混匀后，37℃振荡培养40min，使菌体恢复正常生长状态；
(5)将上述菌液摇匀后取100μL涂布于LB抗性板，倒置培养皿，37℃恒温培养箱培养12h；其中LB抗性板的配方如下：氯化钠10g/L、胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、琼脂粉20g/L，121℃灭菌20min，冷却后加卡那霉素至终浓度为50μg/mL；
(6)从抗性板上挑取单菌落，保菌后，按步骤三提取质粒PYX212+ARO8，对提取后的质粒PET-PYX212+ARO8进行琼脂糖凝胶电泳验证和测序验证，结果正确，见图2，，其核苷酸序列见SEQ ID NO：3。
七、将重组质粒PYX212+ARO8电转化到原始酿酒酵母中
(1)将10μL的PYX212+ARO8重组质粒与酿酒酵母感受态混匀，于冰上预冷30分钟；
(2)将混合液转移至2mm电转杯中，冰浴5分钟；
(3)擦干电转杯外部水分，放入电转仪，进行电转(电压1500V，电容25μF,电阻200Ω)；
(4)想电转杯中加入1mL YPD培养基，混匀后转移到1.5mL离心管中，30℃，200rpm，复苏1h；
(5)离心。弃600上清液，用剩下的400重悬沉淀，取200菌液涂布在G418抗性的YPD平板上，30℃培养至长出菌落；
(6)菌落PCR验证是否为PYX212+ARO8重组酿酒酵母菌株。结果正确，见图2，核苷酸序列见SEQ ID NO：3。
实施例2
(1)取100μL甘油菌S288c(出发菌)和S288c-ARO8(实施例1构建的过表达菌)分别加入灭菌的5mL YPD液体培养基中过夜培养进行活化。
(2)按照体积比10％的接种比例，将步骤(1)中活化后的S288c菌液和S288c-ARO8菌液分别经过包埋固定化，转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃200r/min继续培养至菌液OD600在0.8-1.2之间，将所得培养物于3000r/min离心10min后，保留上清液；
其中，所述包埋共固定化的具体操作方法：取0.2g平均分子量为25000聚乙烯醇和0.2g海藻酸钠于20mL水中加热煮沸，使其充分溶解得到第一凝胶溶液，然后将所述的第一凝胶溶液冷却至30℃左右；将待处理的菌液与糖化酶液(50000U/g)、第一凝胶溶液按体积比等比例混合均匀，得到第二凝胶溶液；将所得到的第二凝胶溶液逐滴加入含有3.5％氯化钙与2％硼酸的水溶液的交联剂中，滴至制成直径为3mm左右的固定化凝胶颗粒，固化一段时间后，滤出固定化凝胶颗粒，用去离子水洗涤三次，浸入无菌水中备用，得到包埋固定化微生物载体；
其中，所述含有3.5％氯化钙与2％硼酸的水溶液的交联剂的制备方法为取浓度为2.0％粘度为1Pa.s的壳聚糖水溶液于等体积的2％醋酸溶液中50℃保温溶解，随即加入硼酸和的氯化钙，使硼酸和氯化钙的终浓度分别为2％和3.5％并保温溶解，即得。
(3)分别取步骤(2)所得两种上清液2mL，在OD600下测量吸光值，用灭菌的YPD液体培养基稀释菌液，使得稀释后菌液OD600为0.01。
(4)取200μL步骤(3)所得的两种菌液加入96孔板，37℃培养24h。
(5)将96孔板菌液倒出，用纯水缓冲3次，拍干。
(6)取1％结晶紫溶液200μL加入96孔板，染色10min，自来水冲洗，晾干。
(7)取33％冰醋酸200μL加入96孔板溶解后，轻轻振荡，OD600测量生物被膜产率，取平均值：S288c在96孔板培养24h OD值为1.2-1.5，S288c-ARO8过表达菌株在96孔板培养24h OD值为1.8-2.0。通过结晶紫染色实验可以定量的观测到生物被膜产量的变化，实验结如图6所示，从图中可以看出过表达ARO8基因的酿酒酵母去生物被膜明显增多。
实施例3
(1)各取100μL甘油菌S288c和S288c-ARO8加入灭菌的5mL YPD液体培养基中过夜培养，进行活化。
(2)按照体积比10％的接种比例，将步骤(1)所得的菌液分别转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8-1.2之间。
(3)将步骤(2)所得种子液分别转接至100mL的发酵培养基(棉纤维材料的用量为7.5g/100mL)中，于35℃、200rpm/min进行固定化发酵，葡萄糖耗尽后反应结束，利用分光光度计测定各时段发酵液残糖量，高效气相色谱仪测定发酵液中酒精的含量；
其中，所述发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖、4g/L蛋白胨、4g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌。
由于生物被膜的量与乙醇的产量和葡萄糖的消耗量相关，所以本实验通过乙醇的产量和葡萄糖的消耗量来定性的表征生物膜的产量的变化。由发酵数据可以看出原始菌和改造菌在固定化发酵的发酵周期对比有明显变化，其中，固定化发酵结果如图3所示，原始菌S288c和改造菌S288c-ARO8发酵周期分别为24h和18h，发酵周期缩短约6h；产物乙醇产量数据分析，在发酵终点时，原始菌株S288c和基因改造菌株S288c-ARO8乙醇产量约为83g/L和94g/L，产量提高约为11g/L，因此生物被膜产量得到了提升。
实施例4：活化培养法
(1)将酿酒酵母S288c-ARO8用活化培养法进行处理，该酵母活化培养法与实施例3中的活化方法不同，具体操作步骤如下：
活化培养法：将OD600为1.0的酿酒酵母菌液S288c-ARO8按体积比为30％的接种量接种于YPD培养基中，于30℃培养24h，所得培养物于300r/min离心10min后保留上清液，得到菌液。
(2)将步骤(1)中得到的活化培养法处理后的酿酒酵母S288c-ARO8和未经活化处理的酿酒酵母S288c-ARO8的菌液按照体积比10％的接种比例，分别转接至100mL的YPD液体培养基，于30℃、200r/min继续培养至菌液OD600在0.8-1.2之间。
(3)将步骤(2)所得种子液分别转接至100mL的发酵培养基中，于35℃、200rpm/min发酵，葡萄糖耗尽后反应结束，利用分光光度计测定各时段发酵液残糖量，高效气相色谱仪测定发酵液中酒精的含量。
其中，所述发酵培养基配方如下：60g/L葡萄糖、4g/L蛋白胨、4g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌。
发酵结果如图4所示，可以看出，经过酵母活化培养法预处理后的改造菌与未经过预处理的改造菌相比，发酵周期未有明显变化，但是乙醇产量有明显提升，预处理菌株的乙醇终产量约为80g/L，相比于未经过预处理菌株的73g/L相比提升了7g/L。
实施例5：包埋共固定化发酵
(1)取浓度为2.0％粘度为1Pa.s的壳聚糖水溶液于等体积的2％醋酸溶液中50℃保温溶解，随即加入硼酸和的氯化钙，使硼酸和氯化钙的终浓度分别为2％和3.5％并保温溶解，得到交联剂溶液。
(2)称取120mg糖化酶酶粉(50000U/g)，加入20mL pH为4.5的醋-醋酸钠缓冲溶液溶解，并用玻璃棒反复研捣不溶物，将已溶解的液体倒入容量瓶中，再用缓冲液冲洗残渣，重复3至4次，最后全部倒入容量瓶，用缓冲溶液定容，在4000rpm/min的离心机离心后取上清液，即糖化酶液。
(3)将甘油菌S288c和ARO8改造菌株(酿酒酵母S288c-ARO8)通过实施例4中的活化培养法进行预处理，离心，去上清，得到活性干酵母；将得到的活性干酵母制成10/L的活性干酵母水溶液，备用。
(4)称取0.2g的平均分子量为25000的聚乙烯醇和0.2g海藻酸钠，加入20mL去离子水，加热煮沸得到第一凝胶溶液。将第一凝胶溶液在34℃温度保温，将糖化酶液(50000U/g，步骤(2)制得)与浓度为10g/L活性干酵母水溶液(步骤(3)制得)一并加入混匀，酶液、第一凝胶溶液和酵母液的比例为1:1:1，得到第二凝胶溶液。吸取第二凝胶溶液，将其滴入含3.5％氯化钙和2％硼酸的水溶液的交联剂溶液(步骤(1)制得)中，制成直径为3mm左右的固定化凝胶颗粒，固化一段时间后，滤出固定化凝胶颗粒，用去离子水洗涤三次，浸入无菌水中备用，得到固定化酵母细胞凝胶颗粒。
(5)将固定化酵母细胞凝胶颗粒用无菌水浸洗6次，加入同体积的YPD培养基增殖培养。通气振荡培养24h后，密闭发酵。
发酵结果如图5所示，相对于固定化发酵的过表达菌株(实施例3，发酵周期30h，乙醇产量94g/L)，过表达菌株包埋共固定化的发酵时间为22h，缩短了8h，乙醇产量为120g/L，相对提高了26g/L；与原始菌的包埋共固定化产95g/L乙醇相比，产量提升了25g/L。
本发明提供了一种过表达ARO8基因的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种过表达ARO8基因的酿酒酵母工程菌及其构建方法与应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1503
<212> DNA
<213> ARO8
<400> 1
atgactttac ctgaatcaaa agacttttct tacttgtttt cggatgaaac caatgctcgt 60
aaaccatccc cattgaaaac ctgcatccat cttttccaag atcctaacat tatctttttg 120
ggtggtggcc tgccattaaa agattatttc ccatgggata atctatctgt agattcaccc 180
aagcctcctt ttccccaggg tattggagct ccaattgacg agcagaattg cataaaatac 240
accgtcaaca aagattacgc tgataaaagt gccaatcctt ccaacgatat tcctttgtca 300
agagctttgc aatacgggtt cagtgctggt caacctgaac tattaaactt cattagagat 360
cataccaaga ttatccacga tttgaagtat aaggactggg acgttttagc cactgcaggt 420
aacacaaatg cctgggaatc tactttaaga gtcttttgta accgaggtga tgtcatctta 480
gttgaggcac attctttttc ctcttcattg gcttctgcag aggctcaagg tgtcattacc 540
ttccccgtgc caattgacgc tgatggtatc attcctgaaa aattagctaa agtcatggaa 600
aactggacac ctggtgctcc taaaccaaag ttgttataca ctattccaac gggccaaaat 660
ccaactggta cttccattgc agaccataga aaggaggcaa tttacaagat cgctcaaaag 720
tacgacttcc taattgtgga agatgaacct tattatttct tacaaatgaa tccctacatc 780
aaagacttga aggaaagaga gaaggcacaa agttctccaa agcaggacca tgacgaattt 840
ttgaagtcct tggcaaacac tttcctttcc ttggatacag aaggccgtgt tattagaatg 900
gattcctttt caaaagtttt ggccccaggg acaagattgg gttggattac tggttcatcc 960
aaaatcttga agccttactt gagtttgcat gaaatgacga ttcaagcccc agcaggtttt 1020
acacaagttt tggtcaacgc tacgctatcc aggtggggtc aaaagggtta cttggactgg 1080
ttgcttggcc tgcgtcatga atacactttg aaacgtgact gtgccatcga tgccctttac 1140
aagtatctac cacaatctga tgctttcgtg atcaatcctc caattgcagg tatgtttttc 1200
accgtgaaca ttgacgcatc tgtccaccct gagtttaaaa caaaatacaa ctcagaccct 1260
taccagctag aacagagtct ttaccacaaa gtggttgaac gtggtgtttt agtggttccc 1320
ggttcttggt tcaagagtga gggtgagacg gaacctcctc aacccgctga atctaaagaa 1380
gtcagtaatc caaacataat tttcttcaga ggtacctatg cagctgtctc tcctgagaaa 1440
ctgactgaag gtctgaagag attaggtgat actttatacg aagaatttgg tatttccaaa 1500
tag 1503
<210> 2
<211> 9996
<212> DNA
<213> 质粒(PYX212)
<400> 2
ctgtatgtgt tttttgtagt tatagattta agcaagaaaa gaatacaaac aaaaaattga 60
aaaagattga tttagaatta aaaagaaaaa tatttacgta agaagggaaa atagtaaatg 120
ttgcaagttc actaaactcc taaattatgc tgccctttat attccctgtt acagcagccg 180
agccaaaggt atataggctc ctttgcatta gcatgcgtaa caaaccacct gtcagtttca 240
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tgccactgaa gattaaaaac tggatgccag aaaaggggtg tccgagtgta acatcaatag 360
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ctaaaccatt tcatcaggaa tactctggaa taaataccat gtgtaactag gacaacaaca 780
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gcgactctgt catatacatc tgccgcactt ctccatgagg gaatctgaag aagaatgacc 900
atacgtagat ccccaattct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg 960
ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc 1020
gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatcgc tcatgagaca 1080
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ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 1200
aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 1260
actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 1320
gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtgttg acgccgggca 1380
agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt acaccagtca 1440
cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagttcc tgccataacc 1500
atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaagagctaa 1560
ccgctttttt tcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 1620
tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gccatcaagc tcgacggccg 1680
gcccggtacc ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatttgaag tcggacagtg 1740
agtgtagtct tgagaaattc tgaagccgta tttttattat cagtgagtca gtcatcagga 1800
gatcctctac gccggacgca tcgtggccga cctgcagggg gggggggggc gctgaggtct 1860
gcctcgtgaa gaaggtgttg ctgactcata ccaggcctga atcgccccat catccagcca 1920
gaaagtgagg gagccacggt tgatgagagc tttgttgtag gtggaccagt tggtgatttt 1980
gaacttttgc tttgccacgg aacggtctgc gttgtcggga agatgcgtga tctgatcctt 2040
caactcagca aaagttcgat ttattcaaca aagccgccgt cccgtcaagt cagcgtaatg 2100
ctctgccagt gttacaacca attaaccaat tctgattaga aaaactcatc gagcatcaaa 2160
tgaaactgca atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc 2220
tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg 2280
tctgcgattc cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata 2340
aggttatcaa gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagc 2400
ttatgcattt ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca 2460
ctcgcatcaa ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga 2520
tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc 2580
agcgcatcaa caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt 2640
ttcccgggga tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg 2700
atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca 2760
tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca 2820
tacaatcgat agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca 2880
tataaatcag catccatgtt ggaatttaat cgcggcctcg agcaagacgt ttcccgttga 2940
atatggctca taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat 3000
gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aacgtggctt 3060
tccccccccc ccctgcaggt cggcatcacc ggcgccacag gtgcggttgc tggcgcctat 3120
atcgccgaca tcaccgatgg ggaagatcgg gctcgccact tcgggctcat gagcgcttgt 3180
ttcggcgtgg gtatggtggc aggccccgtg gccgggggac tgttgggcgc catctccttg 3240
catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggcataact 3300
tcgtatagca tacattatac gaagttatgg tacccaattc gccctatagt gagtcgtatt 3360
tcgagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca 3420
attccacaca acataggagc cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg 3480
aggtaactca cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 3540
tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 3600
tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgaccggta 3660
tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 3720
aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 3780
tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 3840
tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg 3900
cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga 3960
agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 4020
tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 4080
aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 4140
ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 4200
cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 4260
accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 4320
ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 4380
ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 4440
gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 4500
aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 4560
gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 4620
gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 4680
cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 4740
gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 4800
gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 4860
ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 4920
tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tccaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 4980
ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 5040
cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 5100
accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgagcgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 5160
cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 5220
tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 5280
cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 5340
acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 5400
atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcacg gttattgtct catgagcgga 5460
tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 5520
aaagtgccac ctgacgtact agtgagagtg cggccgcagc tttgaagaaa aatgcgcctt 5580
attcaatctt tgctataaaa aatggcccaa aatctcacat tggaagacat ttgatgacct 5640
catttctttc aatgaagggc ctaacggagt tgactaatgt tgtgggaaat tggagcgata 5700
agggtgcttc tgccgtggcc aggacaacgt atactcatca gataacagca atacctgatc 5760
actacttcgc actagtttct cggtactatg catatgatcc aatatcaaag gaaatgatag 5820
cattgaagga tgagactaat ccaattgagg agtggcagca tatagaacag ctaaagggta 5880
gtgctgaagg aagcatacga taccccgcat ggaatgggat aatatcacag gaggtactag 5940
actacctttc atcctacata aatagacgca tataagtacg catttaagca taaacacgca 6000
ctatgccgtt cttctcatgt atatatatat acaggcaaca cgcagatata ggtgcgacgt 6060
gaacagtgag ctgtatgtgc gcagctcgcg ttgcattttc ggaagcgctc gttttcggaa 6120
acgctttgaa gttcctattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga acttcagagc 6180
gcttttgaaa accaaaagcg ctctgaagac gcactttcaa aaaaccaaaa acgcaccgga 6240
ctgtaacgag ctactaaaat attgcgaata ccgcttccac aaacattgct gaaaagtatc 6300
tctttgctat atatctctgt gctatatccc tatataacct acccatccac ctttcgctcc 6360
ttgaacttgc atctaaactc gacctctaca ttttttatgt ttatctctag tattactctt 6420
tagacaaaaa aattgtagta agaactattc atagagtgaa tcgaaaacaa tacgaaaatg 6480
taaacatttc ctatacgtag tatatagaga caaaatagaa gaaaccgttc ataattttct 6540
gaccaatgaa gaatcatcaa cgctatcact ttctgttcac aaagtatgcg gaatccacat 6600
cggtatagaa tataatcggg gatgccttta tcttgaaaaa atgcacccgc agcttcgcta 6660
gtaatcagta aacgcgggaa gtggagtcag gcttttttta tggaagagaa aatagacacc 6720
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tctcgggatg catttttgta gaacaaaaaa gaagtataga ttctttgttg gtaaaatagc 6900
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accagctaga acagagtctt taccacaaag tggttgaacg tggtgtttta gtggttcccg 11220
gttcttggtt caagagtgag ggtgagacgg aacctcctca acccgctgaa tctaaagaag 11280
tcagtaatcc aaacataatt ttcttcagag gtacctatgc agctgtctct cctgagaaac 11340
tgactgaagg tctgaagaga ttaggtgata ctttatacga agaatttggt atttccaaat 11400
aggctagctg agctcgagat atcatgcgta gtcaggcaca tcatacggat acccgggtcg 11460
acgcgtaagc ttgtgggccc taggatccat ggtgaattc 11499
<210> 4
<211> 47
<212> DNA
<213> 引物(ARO8-F)
<400> 4
cattgttcct tattcagtta gctagcatga ctttacctga atcaaaa 47
<210> 5
<211> 46
<212> DNA
<213> 引物(ARO8-R)
<400> 5
cgcatgatat ctcgagctca gctagcctat ttggaaatac caaatt 46

Claims (10)

1.一种酿酒酵母工程菌，其特征在于，在原始酿酒酵母中导入了携带ARO8基因的重组质粒。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述原始酿酒酵母为Saccharomyces cerevisiae S288c。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述携带ARO8基因的重组质粒为携带ARO8基因的PYX212重组质粒。
4.权利要求1-3中任意一项所述的酿酒酵母工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以原始酿酒酵母的基因组为模板，扩增ARO8基因；
(2)将步骤(1)得到的基因插入PYX212质粒，得到携带ARO8基因的PYX212重组质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒转化到E.coli DH5α的感受态细胞中，从E.coli DH5α中提取重组质粒；
(4)将步骤(3)提取所得重组质粒转化到原始酿酒酵母的感受态细胞中，即得到酿酒酵母工程菌。
5.权利要求1-3中任意一项所述的酿酒酵母工程菌发在发酵产乙醇中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在发酵产乙醇的过程中增加生物被膜产量。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，发酵培养基的配方为60g/L葡萄糖、4g/L蛋白胨、4g/L硫酸铵、3g/L磷酸二氢钾、3g/L酵母膏、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L七水合硫酸亚铁、0.05g/L七水合硫酸锌。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵为固定化发酵。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述发酵为包埋固定化发酵。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，以聚乙烯醇为包埋材料，采用吸附法共固定化糖化酶和酿酒酵母工程菌。
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