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KR102540598B1 - 태평양굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

태평양굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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KR102540598B1
KR102540598B1 KR1020210047811A KR20210047811A KR102540598B1 KR 102540598 B1 KR102540598 B1 KR 102540598B1 KR 1020210047811 A KR1020210047811 A KR 1020210047811A KR 20210047811 A KR20210047811 A KR 20210047811A KR 102540598 B1 KR102540598 B1 KR 102540598B1
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peptide
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이기영
이인아
신계화
이지은
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군산대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 태평양굴에서 유래한 항균 펩타이드 유도체 및 이를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물, 식중도고 예방 또는 치료용 약학 조성물, 항균용 식품 첨가제, 항균용 사료 첨가제, 항균용 화장료 조성물 또는 위생용품에 관한 것이다.
본 발명의 태평양굴에서 유래한 항균 펩타이드는 태평양굴의 아가미로부터 유래하는 펩타이드인 cgRPL29를 모체로 하여 디자인한 것이며, 아미노산 수를 절감하여 상용화가 가능하게 디자인된 것이다. 상기 디자인된 항균 펩타이드는 절감된 아미노산 수에도 불구하고 항균 활성이 매우 우수할 뿐만 아니라 막 투과성이 높고, 용혈 활성이 낮으므로, 항균용 약학 조성물, 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물, 항균용 식품 첨가제, 항균용 사료 첨가제, 항균용 화장료 조성물 또는 위생용품 등의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.

Description

태평양굴에서 유래한 항균 펩타이드 및 이의 용도{Antibacterial peptide derived from Crassostrea gigas and its use}
본 발명은 태평양굴(Crassostrea gigas)에서 유래한 항균 펩타이드 및 이를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물, 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물, 항균용 식품 첨가제, 항균용 사료 첨가제, 항균용 화장료 조성물 또는 위생용품에 관한 것이다.
cgRPL-29은 태평양굴(Crassostrea gigas)의 아가미에서 정제된 약 6.4 kDa의 분자량을 가진 54개의 아미노산으로 구성된 항균 펩타이드로서 용혈활성은 거의 없으면서 Gram(+)와 Gram(-) bacteria에 대해서 강한 항균활성을 보이지만, 효모균인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)에는 활성을 나타내지 않는 항균 펩타이드이다. 이러한 cgRPL-29이 가진 활성의 제한성과 54개의 아미노산으로 구성된 길이의 한계성을 극복하기 위해 단편화된 길이의 항균 활성이 증가된 유도체를 디자인하는 것과 같은 새로운 항균 펩타이드의 개발이 절실하다.
최근의 연구에서는 굴, 홍합, 전복 등은 외부 감염원에 대한 효율적인 방어 기작의 하나로서 아가미 또는 외투막에 존재하는 항균 활성 펩타이드가 중요한 역할을 담당한다는 것이 보고되고 있다. 이러한 결과는 외부 환경에 대한 일차 방어 역할을 담당하는 아가미와 외투막이 조개류의 면역 기작에서 중요한 역할을 담당하는 기관으로서, 선천 면역의 기능을 수행하는 항균활성 물질의 탐색 및 정제에 대한 연구에 중요한 대상이 됨을 의미하는 것이지만, 이를 주요 대상으로 하여 신규한 항균 펩타이드를 개발하려는 노력은 아직 많이 부족한 실정이다.본 발명과 관련된 선행기술문헌으로는, 본 발명자들의 선행연구에 대한 내용을 개시하고 있는 대한민국 등록특허 제10-1834884호 (특허문헌 1) 및 Jung-Kil Seo et al., Fish & Shellfish Immunology 67 (2017) 675-683 (비특허문헌 1)가 있다. 상기 선행기술문헌들은 태평양굴 유래의 항균 펩타이드에 관한 것으로서 대장균 또는 바실러스 서브틸리스에 대하여 항균 활성이 있는 펩타이드에 관한 것이다. 이러한 선행기술문헌들에는 15개 이하의 아미노산으로 구성되어 상용화가 가능하고, 더욱 다양한 균주에 대하여 더욱 강한 항균 활성을 나타내는 태평양굴 유래 항균 펩타이드에 관하여는 개시하고 있지 않다.
KR 10-1834884 B
본 발명은 태평양굴(Crassostrea gigas)으로부터 유래하며 항균 활성이 우수한 펩타이드인 cgRPL-29를 이용하여, 상용화가 가능할 정도로 아미노산의 수를 절감하면서도 항균 활성이 우수한 항균 펩타이드를 디자인하여 제공하는 것에 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균용 식품 첨가제를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균용 사료 첨가제를 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 항균용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 하는 위생용품을 제공하기 위한 것이다.
본 발명은 태평양굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한, 서열번호 2 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 제공하기 위한 것이다.
상기 항균 펩타이드는 C-말단이 α-헬릭스(α-helix) 구조일 수 있다.
상기 항균 펩타이드는 C-말단이 아미드화(amidation)되는 것일 수 있다.
상기 항균 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균 및 효모(yeast)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가질 수 있다.
상기 항균 펩타이드는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 뮤탄스(Staphylococcus mutans), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)), 대장균(E. coli D31), 대장균(E. coli ML35p), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 중에서 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 첨가제를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 사료 첨가제를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 위생용품을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 태평양굴에서 유래한 항균 펩타이드는 태평양굴의 아가미로부터 유래하는 펩타이드인 cgRPL29를 모체로 하여 디자인한 것이며, 아미노산 수를 절감하여 상용화가 가능하게 디자인된 것이다. 상기 디자인된 항균 펩타이드는 절감된 아미노산 수에도 불구하고 항균 활성이 매우 우수할 뿐만 아니라 막 투과성이 높고, 용혈 활성이 낮으므로, 항균용 약학 조성물, 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물, 항균용 식품 첨가제, 항균용 사료 첨가제, 항균용 화장료 조성물 또는 위생용품 등의 제조에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 태평양굴 유래 항균 펩타이드인 cgRPL29와 다른 생물의 ribosomal protein L29의 아미노산 서열을 서열정렬 (alignment)하여 상동성을 확인한 결과이다.
도 2는 태평양굴 유래 항균 펩타이드인 cgRPL29의 아미노산 서열 및 본 발명에 따른 항균 펩타이드의 디자인을 위한 모티프 (motif) 부분 (단편)의 위치를 나타내는 것이다. 또한, 상기 도 2는 상기 펩타이드 cgRPL29의 2차 구조를 예측한 것으로서, α-헬릭스 (α-helix) 구조를 형성함을 나타내는 것이다. 상기 도면에서, 'H'는 α-헬릭스 구조, 'E'는 β-시트 구조, 'T'는 turn 구조 및 'C'는 random coil 구조를 나타낸다.
도 3A는 본 발명에 따른 항균 펩타이드들의 아미노산 서열 및 1차 구조를 나타내는 것이고, 도 3B는 본 발명에 따른 항균 펩타이드 각각의 2차 구조 예측 결과 및 헬리컬 휠 다이어그램 (helical wheel diagram)을 나타내는 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 항균 펩타이드들의 다양한 균주에 대한 항균 활성을 나타내는 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 항균 펩타이드들의 대장균에 대한 내막투과성을 나타내는 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 항균 펩타이드들의 대장균에 대한 MBC (Minimum Bactericidal Concentration)를 측정한 결과를 나타내는 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 항균 펩타이드들의 1×MBC와 5×MBC에서의 대장균에 대한 사멸 동역학 실험 (killing kinetics study) 수행 결과를 나타내는 것이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 태평양굴(Crassostrea gigas)에서 유래한 것으로서 항균 활성이 우수하면서 상용화가 가능한 항균 펩타이드를 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 태평양굴(Crassostrea gigas)의 아가미로부터 추출 및 정제한 펩타이드(cgRPL-29)로부터 유래한 것이며, 이 cgRPL-29는 항균력이 매우 우수한 펩타이드이다. 하지만, 상기 cgRPL-29는 총 54개의 아미노산으로 이루어져 있기 때문에 상용화가 어렵다는 문제점이 있었다. 이에 본 발명자들은 상기 태평양굴로부터 유래한 펩타이드인 cgRPL-29에서 유래한 것으로서 항균 활성이 우수하게 유지되면서 상용화가 가능한 항균 펩타이드를 개발하게 되었다.
본 발명자들은 항균 펩타이드의 디자인을 위해서 먼저, 2차 구조 예측 프로그램을 사용해서 cgRPL-29의 2차 구조를 예측하였다. 예측된 cgRPL-29의 2차 구조는 random coil 구조, α-헬릭스(α-helix) 구조, turn 구조 및 β-쉬트(β-sheet) 구조 등이 혼합된 구조로 나타났다. 상기의 예측된 2차 구조를 바탕으로 우선적으로 항균활성을 나타내는데 가장 이상적인 구조로 알려져 있는 양친매성 α-헬릭스(α-helix) 구조를 나타내는 부분을 본 발명의 펩타이드 유도체 디자인을 위한 모티프 부위(motif region) 또는 모체 펩타이드(parent peptide)로 선택을 하였다.
상기 선택한 단편 (비교예; 서열번호 1: KFLKNLKFSKKH)에 대하여 항균 활성을 측정한 결과 항균 활성이 약한 것으로 나타나, 상기 단편을 토대로 amidation 부가, 아미노산 첨가, 치환 또는 제거, 및/또는 D-형 아미노산 치환 방법 등을 사용해서 새로운 항균 펩타이드를 디자인함으로써, 항균 활성을 현저히 증대시켰다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 서열번호 2 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것이다.
상기 항균 펩타이드는 C-말단이 α-헬릭스(α-helix) 구조를 형성하는 것일 수 있다.
또한, 상기 항균 펩타이드는 C-말단이 아미드화(amidation)된 것일 수 있다. 항균 펩타이드의 C-말단이 아미드화(amidation) 된 경우에는 프로테아제(protease)에 대한 저항성 향상과 positive net-charge를 향상시키는효과가 향상되므로 바람직하다.
상기와 같이 디자인 및 제조된 본 발명의 항균 펩타이드는 그람 양성균 및 그람 음성균 등의 세균과 효모(yeast) 및 곰팡이 등의 진균으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 갖는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 항균 펩타이드는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 뮤탄스(Staphylococcus mutans), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 대장균(E. coli D31), 대장균(E. coli ML35p), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 중에서 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 나타낼 수 있다.
본 발명에 따른 항균 펩타이드는 항균 활성이 우수하면서, 아미노산 서열이 짧아 상용화가 가능한 것이다. 또한 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 내막 투과성이 강하다. 즉, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 세균의 내막을 직접적으로 투과함으로써 항균 활성을 나타내는 작용기작일 가능성이 높다. 또한 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 용혈활성을 보이지 않아 세포 독성의 문제가 없다.
또한, 본 발명은 바람직한 제2구현예로서, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물의 투여 방법은 특별한 제한이 있는 것은 아니지만, 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나, 피하로, 직장으로, 비강으로, 임의의 다른 비경구로도 투입될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 동맥 또는 정맥 내로 투입하거나 경구 투여하거나 또는 근육 세포에 직접 투입하는 것이 바람직하다.
또한 상기 조성물로부터 선택되는 투여 수준은 화합물의 활성, 투여 경로, 치료되는 병태의 중증도 및 치료되는 환자의 병태 및 이전 병력에 따를 것이다. 그러나 원하는 치료 효과의 달성을 위해 요구되는 것보다 낮은 수준의 화합물의 용량에서 시작하여, 원하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 서서히 증가시키는 것은 당업계의 지식 내에 있으며, 바람직한 투여량은 나이, 성별, 체형, 체중에 따라 결정될 수 있다. 상기 조성물은 약제학상 허용 가능한 제약 제제로 제제화 되기 전에 추가로 가공될 수 있으며, 바람직하게는 더 작은 입자들로 분쇄 또는 연마될 수 있다. 또한 상기 조성물은 병태 및 치료되는 환자에 따라 달라질 것이지만, 이는 비-독창적으로 결정할 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 항균 펩타이드의 유효 용량은 1~2 mg/kg이고, 바람직하게는 0.5~1 mg/kg이며, 하루 1 내지 3회 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 사용할 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 항균 펩타이드는 항균 활성을 보이는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 뮤탄스(Staphylococcus mutans), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 대장균(E. coli D31), 대장균(E. coli ML35p), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 또는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로부터 대표적으로 유발되는 질병인 식중독, 칸디다증, 장티푸스, 콜레라 등의 질병을 예방 또는 치료하는 것이 가능하기 때문에, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하여, 상기 세균으로 인한 감염성 질환들의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 활용될 수 있다.
본 발명은 바람직한 제3구현예로서, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 바람직한 제4구현예로서, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 첨가제를 제공한다.
본 발명은 바람직한 제5구현예로서, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명에 따른 항균 펩타이드는 그람 음성 및 그람 양성균뿐만 아니라 진균에 대해서도 우수한 항균 활성을 가지고, 세포독성이 없어서 항균용 식품첨가제 또는 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소시지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 본 발명의 항균 펩타이드는 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 중의 상기 항균 펩타이드의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 20중량%로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에, 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 바람직한 제6구현예로서, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
이때, 상기 화장료 조성물은 용액, 분말, 에멀션, 로션, 분사, 연고, 에어로졸, 크림 또는 거품의 형태일 수 있다. 또한, 본 발명의 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서 "화장품 제제에 있어서 수용 가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 정도 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.
상기 담체는 본 발명의 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1중량% 내지 약 99.99중량%, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90중량% 내지 약 99.99중량%로 포함될 수 있다. 상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물 또는 조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당물질 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명의 구체예로서, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 펩타이드 외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 향료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서의 피부는 얼굴뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 화장료 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로서 다양한 형태로 제조될 수 있다.
본 발명은 바람직한 제7구현예로서, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 위생용품을 제공한다.
상기 위생용품은 물티슈, 손 소독제, 구강청정제, 구강소독제, 치약첨가제 등을 포함한다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
<재료 및 방법>
시약 및 재료
항균활성 측정을 위한 tryptic soy broth (TSB) 및 sabouraud dextrose broth (SDB)는 Difco Bacto BBL사에서, agarose type I (Low EEO Agar)은 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 또한, 막 투과성을 측정하기 위해서 사용된 o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG)는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 펩타이드 합성물의 정제과정에서 사용된 HPLC용 water와 acetonitrile (CH3CN)은 Tedia사 (Ohio, USA)로부터 구입하였고, 그 이외의 모든 시약은 특급을 사용하였다.
항균 펩타이드의 디자인
cgRPL29의 유도체 디자인을 위해서 2차 구조 예측 프로그램인 EMBOSS GUI의 Ganier 프로그램을 사용하여 2차 구조를 예측하였다. 그 결과, 예측된 cgRPL29의 2차 구조를 바탕으로 C-말단 방향의 α-helix 구조를 나타내는 단편을 선택하여 유도체 디자인을 위한 motif로 활용하였다. 디자인된 각 유도체들은 각각 11개 또는 12개의 아미노산으로 구성되도록 하였고, C-말단의 아미드화(amidation), 및/또는 특정 위치에서의 아미노산의 첨가, 치환 및 제거 등의 방법을 활용하여 디자인되었다. 또한 펩타이드 분해효소에 대한 안정성을 부가하기 위해서, 선별된 유도체의 구성 아미노산을 모두 D-형으로 치환한 유도체도 디자인하였다.
항균 펩타이드의 합성 및 정제
디자인된 펩타이드 유도체는 펩트론(주)(대전)으로부터 순도 95% 이상으로 합성 및 정제되어 공급되었다. 상기 펩타이드 유도체들은 펩타이드 합성기 ASP48S (펩트론, 대전 한국)를 사용한 F-moc 고상합상법에 의해서 합성되었고, Shiseido Capcell-Pak C18 column (250 mm × 4.6 mm, 10 μm)을 이용한 RP-HPLC로 정제되었다. 정제 조건은 0.1% (v/v) trifluoro acetic acid를 포함하는 H2O-CH3CN의 용매시스템으로 3-40%의 농도구배 조건으로 220 nm에서 유속 1 mL/min으로 수행되었다. 정제된 펩타이드 유도체들의 분자량 측정은 liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS; HP1100 series; Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 수행되었다. 정제된 펩타이드 유도체들은 0.01% 초산에 1000 ug/mL의 농도로 녹여서 -70 ℃에 보관하면서 이후의 모든 실험에 사용하였다.
항균활성측정방법 및 사용균주
상기 펩타이드 유도체들의 항균활성 측정을 위해서, 그람 양성균 4종 (바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 뮤탄스(Staphylococcus mutans), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)), 그람 음성균 5종 (대장균(E. coli D31), 대장균(E. coli ML35p), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)) 및 yeast 1종 (칸디다 알비칸스(Candida albicans))을 사용하였다. 항균활성 측정 방법으로는 서로 다른 농도를 포함한 두 층의 배지를 사용하는 ultrasensitive radial diffusion assay (URDA)법을 이용하였다. URDA에 사용된 균주는 우선 각각의 배지 및 배양 온도에서 18시간 동안 프리-컬쳐(pre-culture) 후 컬러미터(Product No.52-1210, BioMerieux, Inc., USA)를 사용하여 균 농도를 84%T(≒ 1 x 108 CFU/mL)가 되도록 맞추었다. 그 후, 9.5 mL의 0.03% TSB, 1% TypeⅠ agarose 및 10 mM phosphate buffer (PB) (pH 6.5)를 포함하는 underlay gel에 각각의 농도로 희석된 균액 0.5 mL을 넣고 잘 섞은 후에 plate에 편평하게 부어 굳혔다. 굳은 plate에 punch를 사용하여 직경 2.5 mm의 well을 뚫은 후에 5 μL의 volume으로 1000 ug/mL ~ 31.3 ug/mL까지의 농도로 각각의 유도체를 도입시켰다. 모든 실험에서 상기 펩타이드 유도체의 용매로 사용된 0.01% acetic acid에 의한 항균 영향이 없음을 확인하였다. 상기 펩타이드 유도체가 배지에 스며들면 3시간 동안 1차 배양한 후, 그 위에 10 mL의 6% TSB, 1% TypeⅠ agarose 및 10 mM phosphate buffer (pH 6.5)를 포함하는 overlay gel을 붓고 굳힌 후에 동일한 온도에서 18시간 동안 2차 배양하였다. 다음날 well 주위에 생긴 clearing zone의 크기 (직경, diameter)를 측정하여 항균활성을 확인하였다. 측정된 clear zone에서 well diameter (2.5 mm)를 제거한 후에 측정에 사용된 펩타이드 유도체 농도의 log10에 대한 그래프의 X-축 기울기 값으로 최소효과농도 (minimal effective concentration, ug/ml, MEC)를 계산하였다. 항균활성 비교물질로는 미국산 잡종 농어의 비만세포에서 유래한 항균 펩타이드인 piscidin 1을 사용하였다.
세균의 내막 투과성 (Cytoplasmic membrane permeabilization) 측정
세균의 내막 투과성 측정은 nonmembrane-permeative chromogenic substrate인 O-nitro-phenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG)를 사용해서 E. coli ML35p의 세포질에 존재하는 β-galactosidase의 활성을 측정함으로써 수행되었다. 배양된 Mid-logarithmic phase의 E. coli ML35p를 10 mM sodium phosphate buffer (pH7.4)로 세척한 후에 1.5 mM의 ONPG를 포함하는 동일 buffer에 용해시켰다. 그 후, 측정할 펩타이드 유도체 40 ㎍/mL를 첨가한 뒤 유출된 E. coli ML35p의 β-galactosidase에 의한 ONPG의 O-nitrophenol로의 가수분해 정도를 405 nm에서 측정함으로써 수행되었다. 막투과 활성에 대한 비교물질로는 미국산 잡종 농어의 비만세포에서 유래한 항균 펩타이드인 piscidin 1을 사용하였다.
최소저해농도 (Minimum Inhibitory Concentration; MIC)와 최소살균농도 (Minimum bactericidal concentration; MBC)의 측정
상기 펩타이드 유도체들의 최소저해농도 (MIC)와 최소살균농도 (MBC) 측정은 Patrzykatet 등의 방법에 따라서 수행하였다(Patrzykat, A., Gallant, J.W., Seo, J.K., Pytyck, J., Douglas, S,E. Novel antimicrobial peptides derived from flatfish genes. Antimicrob Agents Chemother. 2003, 47(8), 2464-2470). 유도체들의 각각의 측정농도는 100 ug/mL ~ 3.13 ug/mL까지 0.01% HAc를 사용한 연속희석법으로 제조하였으며, 측정은 96-well polypropylene microtiter plates (Costar; Corning Incorporated, Corning, N.Y.)에서 수행하였다. 측정에 사용된 E. coli ML35p는 TSB medium에서 mid-logarithmic phase까지 16 시간 동안 배양을 한 후에 106 CFU/mL의 균농도로 TSB midium을 사용하여 최종 희석하였다. 최소저해농도를 측정하기 위해서 최종 희석된 균액 90 uL를 96-well plate의 각 well에 첨가한 후에 10 uL의 목적 측정농도의 ×10농도를 포함하는 각 펩타이드 유도체의 액을 각각의 well에 첨가하고, 37 ℃에서 16시간 동안 배양하였다. 측정결과에 대한 negative와 positive control로는 유도체를 첨가하지 않은 상태와 항균 펩타이드인 piscidin 1을 첨가한 상태를 사용하였다. 최소저해농도는 시각적인 방법으로 균의 성장을 확인한 후 균의 성장이 전혀 없는 well에 첨가된 유도체의 농도로 정의하였다.
또한 유도체들의 항균작용 형태를 확인하기 위해서 각 유도체들의 최소저해농도에 해당하는 각 well에서 균액을 취해서 TSA plate에 도말하고 37 ℃에서 16시간 동안 배양한 후에 colony 생성 유무로서 최소살균농도 (minimum bactericidal concentration; MBC)를 측정하여 유도체들의 항균활성이 정균 (bacteriostatic) 기작인지, 또는 살균 (bactericidal) 기작인지를 확인하였다.
사멸 동역학 실험 (Killing kinetic study)
Bactericidal process가 확인된 유도체들의 killing kinetic study를 위해서 MBC 측정에서 결정된 각 유도체들을 1×MBC와 5×MBC의 농도에서 60분 동안 시간 의존적인 killing rate를 확인하였다. 이를 위해서 106 CFU/mL의 E. coli ML35p를 포함하는 e-tube에 유도체들을 첨가한 후에 37 ℃에서 배양하면서 정해진 배양시간 (유도체 첨가 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60분 후)에 각각의 측정 tube에서 반응액 10 uL씩을 취해서 TSA plate에 도말하고 37 ℃에서 16시간 동안 배양한 후에 형성된 colony 수를 확인하였다. 대조군으로는 유도체를 첨가하지 않은 상태와 항균 펩타이드인 piscidin 1을 첨가한 상태를 사용하였다. 유도체들의 killing %는 유도체를 첨가하지 않은 조건에서의 생성된 colony 수에 대한 상대적인 비율로 나타내었다.
<시험예>
시험예 1: 디자인된 cgRPL29의 펩타이드 유도체들
1-1: cgRPL29
cgRPL-29은 태평양 굴 (Crassostrea gigas)의 아가미에서 정제된 것으로, 54개의 아미노산으로 구성되어 있고, 6484.6 Da의 분자량을 가진 항균 펩타이드이다. cgRPL-29는 참굴 아가미에서 유래된 단백질인 ribosomal protein L29와 거의 동일한 서열 유사성을 나타내었다(도 1).
도 1은 cgRPL-29와 다른 생물에 존재하는 ribosomal protein L29의 아미노산 서열을 서열정렬(alignment)하여 나타낸 것이다. 상기 도 1에서 보존된 서열은 검은색 부분으로 나타내었다.
1-2: cgRPL29의 이차구조 예측
상기 항균 펩타이드 cgRPL-29로부터, 더욱 단편화되고 항균활성이 개선된 펩타이드 유도체를 디자인하기 위해서 2차 구조 예측프로그램을 사용해서 cgRPL-29의 2차 구조를 예측하였다 (도 2). 이를 위한 cgRPL29의 2차 구조예측은 EMBOSS GUI의 Ganier 프로그램을 사용하여 수행되었다.
그 결과, cgRPL29은 α-helix, turn, sheet 및 random 구조가 섞여 있는 혼합구조를 이루고 있는 것으로 예측되었다 (도 2). 이러한 결과를 바탕으로 항균활성을 나타내는데 가장 이상적인 구조로 알려져 있는 양친매성 α-helix 구조를 나타내는 C-말단을 유도체 디자인을 위한 motif region으로 선택하였다.
1-3: 디자인된 펩타이드 유도체의 1차 구조
상기 선택된 C-말단 부분(motif region)의 구조적 특성은 양친매성의 α-helix 구조이다 (도 3B). 이는 cgRPL-29의 C-말단 부분이 유도체 디자인을 위한 최적 region임을 의미하는 것으로서, 상기 motif region으로 토대로, C-말단의 amidation 부가, 아미노산 첨가, 치환 또는 제거, 및/또는 D-형 아미노산 치환 방법을 사용해서 3개의 유도체를 디자인하였다 (도 3A 및 도 3B). 상기 디자인된 각 펩타이드 유도체의 예시들을 하기 표 1에 나타내었다. 각 유도체들은 11개 또는 12개의 아미노산 잔기로 구성되어 있다. 합성된 유도체들은 분자량 측정을 통해서 확인되었다.
서열번호 Peptide Sequence 개수
서열번호 1 비교예 KFLKNLKFSKKH-NH2 12
서열번호 2 실시예 1 KFLKLLKKLLK-NH2 11
서열번호 3 실시예 2 KFLKLLKKLLKH-NH2 12
서열번호 4 실시예 3 D-KFLKLLKKLLK-NH2 11
상기 표 1에서, 상기 비교예 (서열번호 1)는 본 발명의 항균 펩타이드 유도체의 디자인을 위한 cgRPL29의 C-말단의 "motif region"로서, 본 발명의 펩타이드 유도체에 대한 비교예에 해당된다.
또한, 상기 실시예 1 (서열번호 2), 실시예 2 (서열번호 3) 및 실시예 3 (서열번호 4)은 상기 비교예를 토대로 amidation 부가, 아미노산 첨가, 치환 또는 제거, 및/또는 D-형 아미노산 치환 방법을 사용해서 디자인된 펩타이드 유도체이다. 또한, 상기 실시예 3은 상기 실시예 1과 동일한 아미노산 서열로 이루어진 것으로, 상기 실시예 1의 구성 아미노산을 모두 D형 아미노산으로 치환한 펩타이드 유도체이다.
시험예 2: cgRPL-29 펩타이드 유도체들의 항균 활성
상기 펩타이드 유도체들과 대조군으로 사용된 항균 펩타이드인 piscidin 1 (미국산 잡종 농어에서 유래된 항균 펩타이드)의 상기 9종의 세균과 1종의 yeast (C. albicans)에 대한 항균 활성을 URDA법을 사용해서 측정하였다 (도 4 및 표 2).
항균활성 측정 결과, 비교예에 해당하는 항균 펩타이드는 측정에 사용된 모든 균주에 대해서 약한 항균활성을 나타낸 반면, 본 발명의 3가지의 펩타이드 유도체들 (실시예 1, 실시예 2, 실시예 3)은 강한 항균활성을 나타내었다. 특히, 본 발명의 펩타이드 유도체들은 대조군으로 사용된 piscidin 1의 활성과 유사한 정도의 항균활성을 나타내었고, 특히 C. albicans에 대해서는 piscidin 1보다도 활성이 강한 것으로 나타났다. 흥미로운 것은 모체 펩타이드인 cgRPL-29는 C. albicans에 대해서는 전혀 항균활성을 나타내지 않았으나, 본 발명의 펩타이드 유도체들은 C. albicans에 대해서도 강한 항균활성을 나타낸다는 것이다. 또한 본 발명의 펩타이드 유도체들은 여드름 및 충치 원인균으로 알려져 있는 S. epidermidis, P. acnes, C. albicans 및 S. mutans에 대해서도 강한 항균활성을 나타내었다.
이러한 결과는, 본 발명의 펩타이드 유도체들은 모체 펩타이드인 cgRPL29와 비교해서 펩타이드 길이가 단편화되고, 항균 활성이 개선되었으므로, 새로운 펩타이드 항생제의 개발을 위한 후보물질로서 활용이 가능하다는 것을 의미한다.
Microbes Gram Minimal Effectives Concentration (㎍/mL) [μM]n
비교예 실시예 1 실시예 2 실시예 3 Piscidin1
B.subtilis KCTC1021 + 16.8 6.7 1.0 4.4 7.5
S.epidermidis KCTC1917 + >100 5.9 1.2 6.9 NT
S.mutans KCCM40105 + 3.0 4.3 0.7 3.2 3.2
P.acnes KCTC11946 + >100 8.8 1.7 2.6 NT
E.coli D31 - 18.2 10.8 4.9 9.0 3.8
E.coli ML35p - 1.8 6.2 1.7 3.5 2.3
S.flexneri KCTC2009 - 3.2 8.7 2.4 2.6 8.0
P.aeruginosa KCTC2004 - >100 8.5 4.2 3.0 8.0
V.parahaemolyticus KCCM42264 - 90.5 4.6 0.7 3.0 3.0
C.albicans KCTC7965 Yeast >100 9.7 6.0 9.4 >62.5
시험예 3: 세균의 내막 투과성
본 발명의 펩타이드 유도체들과 대조군으로 사용된 항균 펩타이드인 piscidin 1의 박테리아 내막(bacteria inner membrane)에 대한 투과성을 확인하기 위해서, E. coli ML35p에 대한 내막 투과성을 확인하였다(도 5).
그 결과, 본 발명의 실시예 1 내지 3에 따른 펩타이드 유도체들은 강한 내막 투과성을 가지고 있다고 알려진 piscidin 1과 유사한 정도의 세균 내막 투과성을 나타낸 반면, 비교예의 펩타이드는 매우 약한 내막 투과성을 나타내었다.
이러한 결과는 상기 비교예의 펩타이드와 달리 실시예 1 내지 3의 펩타이드 유도체들은 세균의 막을 직접적인 target site로 인식해서 공격함으로써 항균활성을 나타내는 작용기작을 가진다는 것을 의미한다.
시험예 4: 최소저해농도(MIC) 및 최소살균농도(MBC) 측정
본 발명의 펩타이드 유도체들의 항균활성을 위한 작용기작이 정균(bacteriostatic)인지 아니면 살균(bactericidal)인지를 확인하기 위해서 MIC(최소저해농도) 및 MBC(최소살균농도) 측정과정을 수행하였다.
측정 결과, 본 발명의 펩타이드 유도체들은 E. coli ML35p에 대해서 piscidin 1과 유사하게 낮은 MIC를 나타내었다 (표 3). 반면, 비교예의 항균 펩타이드는 >100 ug/mL의 높은 MIC를 나타내었다.
펩타이드 Minimum Inhibitory Concentration (MIC, ㎍/mL)
비교예 > 100
실시예 1 3.13
실시예 2 6.25
실시예 3 25
본 발명의 펩타이드 유도체들의 항균 형태를 확인하기 위해서, 상기 얻어진 MIC 값을 바탕으로 MBC 측정 실험을 수행한 결과, 본 발명의 펩타이드 유도체들과 piscidin 1은 MIC 값과 동일한 MBC 값을 나타내는 것을 확인하였다(도 6 및 표 4).
펩타이드 Minimum Bactericidal Concentration (MBC, ㎍/mL)
비교예 > 100
실시예 1 3.13
실시예 2 6.25
실시예 3 25
이러한 결과는 본 발명의 펩타이드 유도체들이 동일한 MIC(최소저해농도) 및 MBC(최소살균농도)를 가지고 있으며, 살균(bactericidal) 기작을 통해서 항균활성을 나타낸다는 것을 의미하는 것이다.
시험예 5: 펩타이드 유도체들의 사멸 동역학 실험 (Killing kinetic study)
살균활성(Bactericidal activity)이 확인된 본 발명의 펩타이드 유도체들의 시간에 따른 사멸속도를 확인하기 위해서 1xMBC와 5xMBC의 농도에서 60분 동안 E. coli ML35p과 반응시킨 후의 killing kinetic study를 수행하였다(도 7). 그 결과, 본 발명의 실시예에 따른 펩타이드 유도체들은 실시예 1의 1xMBC (3.13 ㎍/mL)를 제외하고는 모두 1xMBC와 5xMBC의 농도에서 E. coli ML35p를 5분 이내에 사멸시키는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 본 발명의 펩타이드 유도체들이 세균과 접촉을 한 후에 매우 빠른 시간 (5분 이내)에 세균을 죽인다는 것을 의미하는 것이다. 따라서 본 발명의 펩타이드 유도체들은 세균의 막을 직접 공격하여 내막을 투과함으로써 세균을 lysis시켜, 매우 빠른 시간에 세균을 살균하는 작용기작을 가진 것으로 판단된다.
<결과>
본 발명자들은 태평양굴의 아가미로부터 정제되어 일차구조가 규명된 모체 항균 펩타이드(cgRPL-29)로부터 길이의 단편화와 항균활성의 개선이 이루어진 새로운 항균 펩타이드 유도체를 개발하기 위해서, 상기 cgRPL-29을 토대로 펩타이드 유도체들을 디자인하고 고상합성법으로 합성하였다 (도 3). 본 발명의 펩타이드 유도체들은 cgRPL-29의 C-말단 방향에 위치하고 있는 부위를 motif region으로 선택하여, 아미노산의 치환, 첨가, 제거하고, C-말단을 amide화 시키는 방법으로 디자인되었다. 또한 펩타이드 분해효소에 대한 안정성을 부가하기 위해서 디자인된 유도체의 구성 아미노산을 모두 D-형으로 치환하는 방법으로 디자인되었다.
상기와 같이 디자인된 본 발명의 펩타이드 유도체들 (실시예 1, 실시예 2, 실시예 3)의 항균활성을 측정한 결과, 여드름 및 충치 원인균을 포함한 다양한 균주들에 대해서 강한 항균활성은 나타내었다 (도 4, 표 2). 또한 유도체들의 작용기작 연구 결과 본 발명의 펩타이드 유도체들은 세균의 막에 작용한 후에 막을 투과하거나 저해함으로써 세균을 빠른 시간 내에 죽이는 방법으로 항균작용을 나타내는 것으로 밝혀졌다 (도 5 내지 도 7). 본 연구의 실험결과로부터, 본 발명의 펩타이드 유도체들은 기존의 항생제를 대체할 수 있는 항생제 대체제를 개발하기 위한 후보물질로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.
하기 본 발명의 항균 펩타이드 유도체를 위한 제제예를 예시한다.
<제제예 1> 약학적 제제의 제조
제제예 1-1: 산제의 제조
본 발명의 항균 펩타이드 20 mg
유당 50 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 1-2: 정제의 제조
본 발명의 항균 펩타이드 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예 1-3: 캡슐제의 제조
본 발명의 항균 펩타이드 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
스테아린산 마그네슘 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 1-4: 액제의 제조
본 발명의 항균 펩타이드 20 mg
이성화당 10g
만니톨 5g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 후 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
제제예 1-5: 주사제의 제조
본 발명의 항균 펩타이드 10 ㎍/mL
묽은 염산 BP pH 7.6이 될 때까지
주이용 염화나트륨 BP 최대 1mL
적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 본 발명의 펩타이드 유도체를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH7.6으로 조절한 후, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5㎖ 타입Ⅰ 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자 하에 봉입시키고, 120에서 15분 이상 오토클레이브 살균하여 주사제를 제조하였다.
<제제예 2> 화장품의 제조
제제예 2-1: 유연화장수(스킨)
본 발명의 펩타이드 유도체를 포함하는 항균용 유연화장수를 제조하기 위해 하기 표 5에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
배합성분 제조예2-1
(중량%)
본 발명의 항균 펩타이드 0.01~30
1,3-부틸렌글리콜 3.0
글리세린 5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 to 100
제제예 2-2: 영양화장수(로션)
본 발명의 펩타이드 유도체를 포함하는 항균용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 표 6에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
배합성분 제조예2-2
(중량%)
본 발명의 항균 펩타이드 0.01~30
1,3-부틸렌글리콜 3.0
글리세린 5.0
스쿠알란 10.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 2.0
유창목오일 0.1~30
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 to 100
제제예 2-3: 세안제(클렌징폼)
본 발명의 펩타이드 유도체를 포함하는 항균용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 표 7에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
배합성분 제조예2-3
(중량%)
본 발명의 항균 펩타이드 0.01~30
N-아실글루타민산나트륨 20.0
글리세린 10.0
PEG-400 15.0
프로필렌글리콜 10.0
POE(15) 올레일알코올에테르 3.0
라우린유도체 2.0
메틸파라벤 0.2
EDTA-4Na 0.03
향료 미량
정제수 to 100
제제예 2-4: 영양크림
본 발명의 펩타이드 유도체를 포함하는 항균용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 표 8에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
배합성분 제조예2-4
(중량%)
본 발명의 항균 펩타이드 0.01~30
바셀린 7.0
유동파라핀 10.0
밀납 2.0
폴리솔베이트60 2.5
솔비탄세스퀴올레이트 1.5
스쿠알란 3.0
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
산탄검 0.5
코토페닐아세테이트 0.1
향료, 방부제 미량
정제수 to 100
상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Kunsan National University <120> Antibacterial peptide derived from Crassostrea gigas and its use <130> HPC-9907 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Crassostrea gigas <400> 1 Lys Phe Leu Lys Asn Leu Lys Phe Ser Lys Lys His 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibacterial peptide analogue derived from Crassostrea gigas <400> 2 Lys Phe Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibacterial peptide analogue derived from Crassostrea gigas <400> 3 Lys Phe Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys His 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibacterial peptide analogue derived from Crassostrea gigas - D isomer of all amino acid residue <400> 4 Lys Phe Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys 1 5 10

Claims (12)

  1. 태평양굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 서열번호 2 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항균 펩타이드는 C-말단이 α-헬릭스(α-helix) 구조인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항균 펩타이드는 C-말단이 아미드화(amidation)된 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항균 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균 및 효모(yeast)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항균 펩타이드는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 뮤탄스(Staphylococcus mutans), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 대장균(E. coli D31), 대장균(E. coli ML35p), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 중에서 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  6. 태평양굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 서열번호 2 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 약학 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항균 펩타이드는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 뮤탄스(Staphylococcus mutans), 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes), 대장균(E. coli D31), 대장균(E. coli ML35p), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 중에서 선택되는 어느 하나 이상에 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균용 약학 조성물.
  8. 태평양굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 서열번호 2 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 식중독 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  9. 태평양굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 서열번호 2 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 식품 첨가제.
  10. 태평양굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 서열번호 2 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 사료 첨가제.
  11. 태평양굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 서열번호 2 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항균용 화장료 조성물.
  12. 태평양굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한 서열번호 2 내지 4 중에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 항균 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 위생용품.

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