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KR102039400B1 - mBjAMP1 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

mBjAMP1 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도 Download PDF

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KR102039400B1
KR102039400B1 KR1020180098568A KR20180098568A KR102039400B1 KR 102039400 B1 KR102039400 B1 KR 102039400B1 KR 1020180098568 A KR1020180098568 A KR 1020180098568A KR 20180098568 A KR20180098568 A KR 20180098568A KR 102039400 B1 KR102039400 B1 KR 102039400B1
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KR
South Korea
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peptide
antimicrobial
antimicrobial peptide
seq
present
Prior art date
Application number
KR1020180098568A
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English (en)
Inventor
박윤경
박종관
Original Assignee
조선대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Abstract

본 발명은 mBjAMP1 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 항균 펩타이드는 그람 음성균 및 항생제 내성균에 대해 우수한 항균활성을 보이며, 인간 유래 세포에 대해 낮은 세포독성을 나타내어, 항균용 항생제, 화장료 조성물, 식품 첨가제, 사료 첨가제 및 생물 농약의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

mBjAMP1 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도{Novel antimicrobial peptide derived from mBjAMP1 peptide and uses thereof}
본 발명은 mBjAMP1 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.
세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 세균의 항생제 저항성(resistance)이 야기되었다. 실제로, 세균이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빨리 일어난다. 예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 등의 세균 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다.
항생제 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다. 항생제에 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다. 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신(autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소(endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.
세균이 여러 가지 항생제에 대해 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다. 아울러, 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행조건이라고 간주되는데 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다. 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다. 실제로 항생제에 저항성을 보이는 모든 세균들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로, 이러한 항생제 저항성을 가지는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생제의 개발이 필요하다.
항생제 내성은 작용 기작의 측면에서 크게 두가지 경로로 이루어지는데, 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장속도가 감소할 때 일어나는 외형적(phenotypic) 내성이며, 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두에 있어서 기본적인 현상은 오토라이신 활성의 하향조절(down regulation)이 일어난다는 것인데, 이러한 하향조절은 외부자극에 대한 외형적인 내성일 경우에는 일시적이며, 세포 용혈을 조절하는 경로의 변화를 야기하는 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소에 결손이 일어나는 것인데, 확실하지 않은 여러 가지 이유로 인해서 이러한 자살 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 임상적으로 발견된 적은 없으며, 오히려 임상적인 내성은 오토라이신의 활성을 조절함으로써 이루어진다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 항생제에 저항성을 나타내는 세균들과 싸우기 위해서는 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 아울러 오토라이신 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다.
한편, 세균은 펩타이드나 작은 유기물 분자들을 합성해서 이웃하는 세균을 죽일 수 있는데, 이러한 박테리오신(bacteriocin)들은 구조적으로 세 부류로 분류된다. 첫 번째는 란티바이오틱스(lantibiotics)이며, 두 번째는 비란티바이오틱스(nonlantibiotics)이고, 세 번째는 신호 펩타이드(signal peptide)에 의해 분비되는 것들이다. 곤충을 포함하는 동물들 역시 자연적으로 생성되는 펩타이드 항생제를 생산하는데, 상기의 항생제는 구조적으로 세 개의 그룹으로 나누어진다. 첫 번째는 시스테인이 풍부한(cysteine-rich) β-시트(sheet) 펩타이드이고, 두 번째는 α-나선형(helical)의 양친화성 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드이다. 이들 항균 펩타이드들은 숙주방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있는데, 이러한 항균 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 가지며, 이들 구조 중 활유어(amphioxus)에서 발견된 항균 펩타이드인 mBjAMP1은 양친화성 알파 나선형 구조를 형성한다.
한편, 한국등록특허 제1875057호에는 항생 펩타이드인 파필리오신(Papiliocin)의 N 말단 잔기 및 마가이닌(Magainin)의 N 말단 잔기를 연결하여 제조된 '그람음성 다제내성균에 대해 항생제와 상승적 항균효과를 가지는 항생 펩타이드 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1420849호에는 '다제내성균에 높은 항균 효과를 보이는 프로태티아마이신 항균펩타이드 유도체 및 그 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 mBjAMP1 펩타이드로부터 유래한 신규 항균 펩타이드 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 항균활성을 가지는 것으로 기존에 보고된 양친화성을 갖는 mBjAMP1 항균 펩타이드를 주형으로 하여, 서열번호 2 내지 서열번호 12로 기재되는 신규한 11종의 항균 펩타이드(IAAR-mBjAMP1, IAAR-Anal1~IAAR-Anal10)를 합성하였고, 상기 합성된 항균 펩타이드의 그람 음성균 및 항생제 내성균에 대한 항균활성을 분석한 결과, 신규한 11종의 항균 펩타이드가 mBjAMP1 펩타이드보다 우수한 항균활성을 보이며, 인간 적혈구 및 인간 정상 세포주에 대하여 낮은 세포독성을 나타냄을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기 i) 내지 ⅱ) 중 어느 하나의 변이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 항균 펩타이드를 제공한다:
i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 이소루신(I)-알라닌(A)-아르기닌(R)-아르기닌(R)으로 이루어진 펩타이드가 추가되거나,
ⅱ) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 이소루신(I)-알라닌(A)-아르기닌(R)-아르기닌(R)으로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 9번째, 11번째, 14번째, 15번째 및 19번째 아미노산이 각각 알라닌(A) 또는 리신(K)으로 치환됨.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 생물 농약을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 의약외품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 펩타이드를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 개체 내 항균 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 항균 펩타이드(IAAR-mBjAMP1, IAAR-Anal1~IAAR-Anal10)는 우수한 항균 활성과 동시에 낮은 세포 독성을 가지고 있으므로, 항생제, 화장료 조성물, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 생물 농약 및 의약외품 등의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
도 1은 인간 정상 세포주(MRC-5)에 대한 IAAR-mBjAMP1 및 IAAR-Anal10 신규 펩타이드의 독성을 확인한 결과이다.
도 2는 모체 항균 펩타이드인 mBjAMP1(대조군)와 신규 펩타이드인 IAAR-mBjAMP1 및 IAAR-Anal10의 다양한 용매 상에서 2차 구조 형성 여부를 확인한 결과이다. SDS: sodium dodecyl sulfate, TFE: trifluoroethanol.
도 3은 모체 항균 펩타이드인 mBjAMP1(대조군)와 신규 펩타이드인 IAAR-mBjAMP1 및 IAAR-Anal10를 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 균주에 처리한 후, PI(Propidium Iodide) 염색을 통해 항균 펩타이드의 박테리아 막에 미치는 영향을 유세포분석기로 분석한 결과이다.
도 4는 신규한 항균 펩타이드인 IAAR-mBjAMP1 및 IAAR-Anal10의 플라스미드 DNA와의 결합수준을 확인한 결과이다. Buforin 2: 항균 펩타이드, 레인 1 내지 레인 8은 각각 항균 펩타이드와 DNA의 혼합 비율이 순서대로 0:1, 0.25:1, 0.5:1, 0.75:1, 1:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1인 실험군을 의미한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 i) 내지 ⅱ) 중 어느 하나의 변이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 항균 펩타이드를 제공한다:
i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 이소루신(I)-알라닌(A)-아르기닌(R)-아르기닌(R)으로 이루어진 펩타이드가 추가되거나,
ⅱ) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 이소루신(I)-알라닌(A)-아르기닌(R)-아르기닌(R)으로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 9번째, 11번째, 14번째, 15번째 및 19번째 아미노산이 각각 알라닌(A) 또는 리신(K)으로 치환됨.
기존에 알려진 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 모체 펩타이드인 mBjAMP1은 Japanese lancelet(Branchiostoma japonicum) 유래 항균 펩타이드이다. 상기 mBjAMP1 펩타이드는 당업계에 알려진 통상의 펩타이드 합성 방법에 의해 제조가 가능하며, 제조 방법에 특별히 한정되지 않는다. 상기 합성을 위한 방법으로 당업계의 통상적인 펩타이드의 화학적 합성 방법으로 합성하는 것이 바람직하며, 구체적으로는 액상 펩타이드 합성법(solution-phase peptide synthesis), 고상 펩타이드 합성법(solid-phase peptide synthesis), 단편 응축법 및 F-moc 또는 T-BOC 화학법으로 합성하는 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로는 액상 펩타이드 합성법(Merrifield, RB., J.Am. Chem. Soc., 85, 2149, 196)으로 합성하는 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 항균 펩타이드는 상기 i) 또는 ⅱ)의 조건을 만족해야 하는데, 상기 ⅱ)의 변이를 갖는 아미노산 서열로 구성된 항균 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 이소루신(I)-알라닌(A)-아르기닌(R)-아르기닌(R)으로 이루어진 펩타이드(이하 IARR)가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 9번째, 11번째, 14번째, 15번째 및 19번째 아미노산이 각각 순서대로 알라닌(A), 리신(K), 리신(K), 알라닌(A), 리신(K), 알라닌(A), 리신(K), 알라닌(A), 알라닌(A) 및 알라닌(A)으로 하나 이상 치환된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 항균 펩타이드는 바람직하게는, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 IARR로 이루어진 펩타이드가 추가된 펩타이드(IAAR-mBjAMP1; 서열번호 2); 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 IARR로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 아미노산이 A으로 치환된 펩타이드(IAAR-Anal1; 서열번호 3); 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 IARR로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째 및 3번째 아미노산이 각각 알라닌(A) 및 리신(K)으로 치환된 펩타이드(IAAR-Anal2; 서열번호 4); 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 IARR로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째 및 4번째 아미노산이 차례대로 A, K 및 K으로 치환된 펩타이드(IAAR-Anal3; 서열번호 5); 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 IARR로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째, 4번째 및 5번째 아미노산이 차례대로 A, K, K 및 A으로 치환된 펩타이드(IAAR-Anal4; 서열번호 6); 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 IARR로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째, 4번째, 5번째 및 6번째 아미노산이 차례대로 A, K, K, A 및 K으로 치환된 펩타이드(IAAR-Anal5; 서열번호 7); 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 IARR로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째 및 9번째 아미노산이 차례대로 A, K, K, A, K 및 A으로 치환된 펩타이드(IAAR-Anal6; 서열번호 8); 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 IARR로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 9번째 및 11번째 아미노산이 차례대로 A, K, K, A, K, A 및 K으로 치환된 펩타이드(IAAR-Anal7; 서열번호 9); 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 IARR로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 9번째, 11번째 및 14번째 아미노산이 차례대로 A, K, K, A, K, A, K 및 A으로 치환된 펩타이드(IAAR-Anal8; 서열번호 10); 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 IARR로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 9번째, 11번째, 14번째 및 15번째 아미노산이 차례대로 A, K, K, A, K, A, K, A 및 A으로 치환된 펩타이드(IAAR-Anal9; 서열번호 11); 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드의 아미노 말단에 IARR로 이루어진 펩타이드가 추가되고, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 9번째, 11번째, 14번째, 15번째 및 19번째 아미노산이 차례대로 A, K, K, A, K, A, K, A, A 및 A으로 치환된 항균 펩타이드(IAAR-Anal10; 서열번호 12);일 수 있다(표 1). 상기 치환은 전극의 증/감을 이용하여 세포독성을 낮추며, 그람 음성균 및 항생제 내성균에 대하여 항균활성을 증가 또는 유지하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 항균 펩타이드는 그람 음성균 또는 항생제 내성균에 대해 항균 활성을 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 그람 음성균은 아시네토박터 속(Acinetobacter), 슈도모나스 속(Pseudomonas), 크렙시엘라 속(Klebsiella), 대장균 속(Escherichia), 살모넬라 속(Salmonella), 렙토스피라 속(Leptospira), 리케치아 속(Rickettsia)을 포함하는 그람 음성균으로 당업계에 공지된 모든 그람 음성균인 것이 바람직하며, 구체적으로 아시네토박터 속 (Acinetobacter), 슈도모나스 속(Pseudomonas) 또는 크렙시엘라 속(Klebsiella)일 수 있고, 더욱 구체적으로는 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 항생제 내성균은 항생제 내성을 갖는 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 항생제는 이에 제한되지는 않으나, 아미노글리코사이드 계열(아미노글리코사이드, 겐타마이신, 네오마이신 등), 페니실린 계열(앰피실린 등), 술폰아미드 계열, 베타-락탐 계열(베타-락탐, 아목시실린/클라불란산 등), 클로람페니콜 계열, 에리트로마이신 계열, 플로르페니콜 계열, 포스포마이신 계열, 카나마이신 계열, 린코마이신 계열, 메티실린 계열, 퀴놀론 계열, 스트렙토마이신 계열, 테트라사이클린 계열, 트리메소프림 계열 및 반코마이신 계열의 항생제를 포함한다.
본 발명의 상기 항균 펩타이드는 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 가진 것일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제를 제공한다. 상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 2 내지 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로, 각 펩타이드에 관한 것은 전술한 바와 같다.
본 발명의 mBjAMP1 항균 펩타이드로부터 유래된 신규한 항균 펩타이드인 IAAR-mBjAMP1, IAAR-Anal1 내지 IAAR-Anal10 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 항균용 항생제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다. 본 발명의 항균 펩타이드를 의약품으로 사용하는 경우, 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
즉, 본 발명의 항균 펩타이드는 실제의 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항균 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 항균 펩타이드의 유효용량은 0.1 내지 2mg/kg이고, 바람직하게는 0.5 내지는 1mg/kg 이며, 하루 1 회 내지 3 회 투여될 수 있다.
본 발명의 항생제에서 본 발명의 신규한 펩타이드의 총 유효량은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규한 펩타이드의 항생제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명은 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 2 내지 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 전술한 바와 같다. 상기 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 항균용 화장료 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 항균 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예켠대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 펩타이드는 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸타, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라가칸타 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제를 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 2 내지 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로, 상기 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 식품 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 펩타이드를 식품 첨가물로 사용하는 경우, 상기 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적절하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 펩타이드는 원료에 대하여 15 중량부이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안정성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 첨가제를 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 2 내지 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로 전술한 바와 같다. 상기 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항생 펩타이드는 사료 첨가제의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 기존의 항생제를 대체하고 유해한 식품 병원성균의 생장을 억제하여 동물체의 건강상태를 양호하게 하고, 가축의 증체량과 육질을 개선시키며, 산유량 및 면역력을 증가시키는 효과가 있다. 본 발명의 사료 조성물은 발효사료, 배합사료, 펠렛 형태 및 사일레지 등의 형태로 제조될 수 있다.
상기 발효사료는 본 발명의 펩타이드 이외의 여러 가지 미생물군 또는 효소들을 첨가함으로서 유기물을 발효시켜 제조할 수 있으며, 배합사료는 여러 종류의 일반사료와 본 발명의 펩타이드를 혼합하여 제조할 수 있다. 펠렛 형태의 사료는 상기 배합사료 등을 펠렛기에서 열과 압력을 가하여 제조할 수 있으며, 사일레지는 청예사료를 미생물로 발효시킴으로써 제조할 수 있다. 습식발효사료는 음식물 쓰레기 등과 같은 유기물을 수집 및 운반하여 살균과정과 수분조절을 위한 부형제를 일정비율로 혼합한 후, 발효에 적당한 온도에서 24시간 이상 발효하여, 수분함량이 약 70%로 포함되도록 조절하여 제조할 수 있다. 발효건조사료는 습식발효사료를 건조과정을 추가로 거쳐 수분함량이 30% 내지 40% 정도 함유되도록 조절하여 제조할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 방부 조성물, 항균용 생물 농약, 및 항균용 의약외품 조성물을 제공한다.
상기 항균 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 2 내지 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 아미노산 서열을 갖는 펩타이드로서 전술한 바와 같다. 상기 펩타이드는 강한 항균 활성을 나타내면서, 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 나타내므로, 본 발명의 항균 펩타이드는 항균용 생물 농약, 방부 조성물 및 의약외품 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 방부 조성물에는 화장품 보존제 또는 의약품 보존제 등이 있다. 상기 식품의 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 방부 조성물의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.
본 발명의 조성물을 의약외품 첨가물로 사용할 경우, 상기 항균 펩타이드를 그대로 첨가하거나 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합량은 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게는 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제, 패치, 또는 필터 충진제일 수 있다.
본 발명은 또한, 약학적으로 유효한 양의 상기 항균 펩타이드를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체 내 항균 방법을 제공한다. 상기 개체는 인간을 제외한 포유류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 펩타이드의 합성 및 분리정제
본 발명자들은 메리필드(Merrifield)의 액상 펩타이드 합성법(Merrifield, RB., J. Am. Chem. Soc. 85, 2149, 196)에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 모체 펩타이드인 mBjAMP1의 아미노 말단에 이소루신(I)-알라닌(A)-아르기닌(R)-아르기닌(R)으로 이루어진 펩타이드(이하 IARR)를 추가하고, mBjAMP1의 아미노산 서열에서 1번째, 3번째, 4번째, 5번째, 6번째, 9번째, 11번째, 14번째, 15번째 및 19번째 아미노산을 알라닌(A) 또는 리신(K)로 치환하여 각각의 펩타이드를 합성하였다.
구체적으로, 본 발명에서 설계한 펩타이드의 카르복실 말단이 NH2 형태인 펩타이드는 링크 아미드 MBHA-레진(Rink Amide MBHA-Resin)을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 OH 형태의 펩타이드는 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다.
Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬(chain)의 연장은 DCC(N-hydroxybenzo trizole(HOBt)-dicyclo-hexycarbodiimide)법에 의해 실시하였다. 각 펩타이드의 아미노말단의 Fmoc-아미노산을 커플링시킨 후, NMP(20% piperidine/N-methyl pyrolidone) 용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 DCM(dichoromethane)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 건조시켰다. 여기에 TFA(trifluoroacetic acid), 페놀, 싸이오아니졸(thioanisole), H2O 및 트리이소프로필실레인(triisopropylsilane)을 각각 85 : 5 : 5 : 2.5 : 2.5(v/v)의 비율로 혼합한 용액을 가하고 2~3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 후, 디에틸에테르(diethylether)로 펩타이드를 침전하여 이를 수득하였다. 상기 수득한 크루드(crude) 펩타이드는 0.05% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도구배(acetonitrile gradient)에서 정제형 역상(reverse phase, RP)-HPLC 컬럼(Delta Pak, C18300Å,15,19.0mm×30 cm, Waters, USA)을 이용하여 정제하였다. 합성 펩타이드를 6N 염산으로 110℃에서 가수분해한 후 잔사를 감압 농축하고, 0.02N 염산에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정한 후, 펩타이드의 순도 및 분자량을 확인하기 위하여 MALDI 질량 분석법(Hill, et al., Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5: 395, 1991)을 수행하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 나타난 바와 같이, 서열번호 1 내지 서열번호 12의 아미노산 서열로 기재되는 펩타이드를 95% 이상의 순도로 합성하였고, 이의 분자량은 예상한 분자량과 동일한 분자량을 나타내는 것을 확인하였다.
Figure 112018083669027-pat00001
실시예 2. 항균 활성 측정
본 발명자들은 상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들의 항균 활성을 비교하기 위하여, 균체가 분열되지 않는 펩타이드의 최소 농도인 생육 최소저해농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC) 값을 측정하였다.
구체적으로, 하기 표 2 및 표 3에 기재된 균주를 구입하여, MHB(Mueller Hinton Broth) 배지에서 중간-로그 상(mid-log phase)까지 배양한 다음, 2×105 세포/50 ㎕의 균체 농도로 희석하여 마이크로 타이트레이트 플레이트(Nunc, USA)에 접종하였다. 그런 다음, 상기 실시예 1에서 합성한 IAAR-mBjAMP1 및 IAAR-Anal1 내지 IAAR-Anal10 펩타이드를 각각 96 웰에 1/2배씩 계열 희석(serial dilution)하여 50 ㎕ 씩 플레이트에 첨가한 후 37℃에서 18시간 동안 배양하였고, 마이크로 타이트레이트 플레이트 판독기(Merck Elisa reader, 독일)를 이용하여 600 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 각 균주에 대한 MIC 값을 결정하였다. 대조군으로는, 모체 펩타이드인 mBjAMP1을 상기와 동일한 방법을 수행하여 각 균주에 대한 MIC 값을 결정하였다.
본 발명에서 사용한 균주 및 이의 입수처
균주명 출처 기탁번호


그람
음성균		 아시네토박터 바우마니
(Acinetobacter baumannii)		 한국 세포주은행 KCTC 2508
슈도모나스 에루지노사
(Pseudomonas aeruginosa)		 미국 세포주은행 ATCC 27853
크렙시엘라 뉴모니애
(Klebsiella pneumoniae)		 한국 세포주은행 KCTC 2208





내성균
 크렙시엘라 뉴모니애 (EJKP 00001) 을지병원
크렙시엘라 뉴모니애 (EJKP 00002) 을지병원
크렙시엘라 뉴모니애 (EJKP 00003) 을지병원
크렙시엘라 뉴모니애 (EJKP 00004) 을지병원
크렙시엘라 뉴모니애 (EJKP 00005) 을지병원
크렙시엘라 뉴모니애 (EJKP 00006) 을지병원
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본 발명에서 사용한 균주 및 이의 입수처 (continued)
균주명 출처 기탁번호












내성균		 크렙시엘라 뉴모니애 (EJKP 000013) 을지병원
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그 결과, 하기 표 4 및 5에 나타난 바와 같이 실험군인 IAAR-mBjAMP1, IAAR-Anal1~IAAR-Anal10 펩타이드는 그람 음성균 및 항생제 내성균에 대해 항균활성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 특히 합성된 펩타이드 유사체 중 IAAR-Anal2 내지 IAAR-Anal10 펩타이드는 그람음성균 및 항생제 내성균에 대한 항균활성에서 모체 펩타이드인 mBjAMP1보다 우수한 항균활성을 나타내는 것으로 확인되었다.
Figure 112018083669027-pat00002
Figure 112018083669027-pat00003
실시예 3. 용혈 활성 측정
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들의 세포독성을 비교하기 위하여, 합성한 펩타이드들의 적혈구 용혈 활성을 측정하였다.
구체적으로, 인간 적혈구를 8%의 농도가 되도록 PBS(pH 7.0)로 희석하고, IAAR-mBjAMP1 또는 IAAR-Anal10 펩타이드를 각각 3.13, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0, 100.0 또는 200 μM/웰의 농도로 처리하여, 37℃에서 1 시간 동안 반응하였다. 그런 다음, 1,000 xg로 원심 분리하여 수득한 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 양을 414 ㎚ 파장에서 흡광도를 측정하여 확인하였다. 세포 파괴 정도의 기준이 되는 대조군으로, 1% 트리톤 X-100 (sigma, USA)을 처리하여 37℃에서 1 시간 동안 반응한 후 수득한 상등액의 흡광도를 측정하였고, 상기 흡광도 값을 적혈구 용혈활성 100%로 하여, 하기 식을 사용하여 각 펩타이드의 용혈활성(hemolysis)을 계산하였다.
○ 적혈구 파괴능(%) = (흡광도 A-흡광도 B)/(흡광도 C-흡광도 B) X 100
(흡광도 A, 414㎚ 파장에서 측정한 각 펩타이드를 처리한 반응 용액의 흡광도; 흡광도 B, 414㎚ 파장에서 측정한 PBS를 처리한 반응 용액의 흡광도; 흡광도 C, 414㎚ 파장에서 측정한 1% 트리톤 X-100를 처리한 반응 용액의 흡광도.)
그 결과, 하기 표 6에 나타난 바와 같이 IAAR-mBjAMP1과 IAAR-Anal10 펩타이드는 200 μM 농도에서도 적혈구에 대한 파괴능을 거의 나타내지 않는 것을 확인하여, 본 발명의 항균 펩타이드는 인간 적혈구에 대한 세포독성을 보이지 않는다는 것을 확인하였다.
항균 펩타이드의 용혈 활성 측정
펩타이드 명칭 % 적혈구 파괴능
농도(μM) 200 100 50 25 12.5 6.25 3.13
IAAR-mBjAMP1 1.75 0.53 0.68 0.95 0.09 0.67 0
IAAR-Anal10 1.44 0.26 0.51 0.74 0.25 0.07 0.04
실시예 4. 정상 세포주에서 세포독성 확인
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드들의 정상 세포주에서의 세포독성을 확인하기 위해, 사람의 폐 유래 섬유아세포주(Medical Research Council cell strain 5, MRC-5)를 이용하여 세포독성을 측정하였다.
구체적으로, 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 DMEM 배지에서 배양된 정상 사람 섬유아세포(MRC-5)를 2×104 세포/웰로 마이크로 적정 플레이트에 분주하고 24시간 배양한 후, IAAR-mBjAMP1 또는 IAAR-Anal10 펩타이드를 각각 200 μM/웰의 농도로 처리하여, 24 시간 동안 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 상기 펩타이드 처리 시, 사멸되는 세포의 핵에 염색되는 형광 염료를 함께 처리하여, 배양 동안 Incucyte Live-Cell Analysis system을 이용하여 형광 발현의 강도와 세포의 모양을 관찰하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이 200 μM의 IAAR-mBjAMP1 또는 IAAR-Anal10 펩타이드를 처리한 세포의 배양 시간 동안 형광값이 증가하지 않음을 확인할 수 있었으며, 무처리 대조군과 비교하여 세포의 형태학적 변화가 없음을 확인하여, 본 발명에 따른 IAAR-mBjAMP1 또는 IAAR-Anal10 펩타이드는 세포 독성이 없음을 유추할 수 있었다.
실시예 5. 원이색법 스펙트럼 측정
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드를 이용하여 2차 구조인 α-나선형 구조를 유도하는지 확인하고자 원이색법(circular dichroism) 방법을 이용하여 측정하였다.
구체적으로, 10 mM 인산나트륨(sodium phosphate, pH 7.4), 30 mM 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS) 또는 50% 트리플루오로에탄올(2,2,2-trifluoroethanol, TFE) 용액에 mBjAMP1, IAAR-mBjAMP1 또는 IAAR-Anal10 펩타이드를 40 μM로 첨가하여 0.1 cm 길이(path-length)의 셀에 가한 후, jasco 810 분광광도계(spectrophotometer)에 온도를 25℃로 고정하여 원이색법 스펙트럼을 측정하였다. 상기 원이색법 스펙트럼을 이용한 α-나선형 구조 계산식은 하기 식을 사용하였다.
Figure 112018083669027-pat00004
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 10 mM 인산나트륨 용액에 각 펩타이드를 첨가하였을 때에는 2차 구조를 형성하지 않은 반면, 50% TFE 용액과 30 mM SDS 용액에 펩타이드를 첨가하였을 때에는 정도의 차이를 보이지만 모든 펩타이드에서 2차 구조인 α-나선형 구조를 형성하는 것을 확인하였다. 이의 결과를 통해, 본 발명의 항균 펩타이드는 미생물인 박테리아 막과 유사한 SDS와 TFE 용액 상에서 α-나선형 구조를 형성하는 것을 알 수 있었다.
실시예 6. 유세포분석기(Flow cytometry) 측정
상기 실시예 1의 방법으로 제조된 펩타이드가 박테리아 막에 작용하는지 여부를 확인하기 위하여, 유세포분석기(Flow cytometry)를 이용하여 분석하였다.
구체적으로, 상기 표 4 및 표 5를 통해 최소억제농도(MIC) 값이 대조군인 mBjAMP1보다 낮은 농도를 가지면서, 고농도에서도 세포독성을 나타내지 않는 펩타이드인 IAAR-mBjAMP1 및 IAAR-Anal10를 선별해서 수행하였다. IAAR-mBjAMP1 또는 IAAR-Anal10의 최소억제농도 값을 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 균주에 처리한 후 2시간 동안 37℃에서 반응시켰다. 그 후, 원심분리기를 이용해 상층액을 제거한 다음 0.1 ㎎/㎖ 농도의 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide, PI)로 4℃에서 30분간 염색하였다. 그런 다음, 결합하지 않은 프로피디움 요오드화물을 원심분리기를 이용해 제거하고 생리식염수(PBS) 1 ㎖을 첨가하여 세포의 뭉침 현상을 제거하고, Bechman 유세포분석기를 이용하여 박테리아 막에 대한 각 펩타이드의 영향을 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 PBS만 처리한 대조군(control)과 IAAR-mBjAMP1 또는 IAAR-Anal10 펩타이드를 처리한 군에서 형광의 수준 및 이동이 일어나지 않아, 상기 IAAR-mBjAMP1 및 IAAR-Anal10 펩타이드는 세균 막에 영향을 주지 않음을 알 수 있었다.
실시예 7. 항생 펩타이드와 플라스미드 DNA의 결합수준 분석
본 발명의 합성 펩타이드가 항균활성을 나타내는 기작을 구체적으로 확인하기 위하여, 250 ng의 플라스미드 DNA(pRSETA)와 IARR-mBjAMP1 또는 IARR-Anal10 펩타이드를 각기 다른 비율로 혼합하여 아가로스 겔 상에서 DNA의 이동이 저해되는지 분석하였다.
구체적으로, 각 펩타이드와 DNA의 비율(펩타이드:플라스미드 DNA)을 각각 0:1, 0.25:1, 0.5:1, 0.75:1 1:1, 1.5:1, 2:1, 2.5:1로 정하고 10분 동안 37℃에서 반응시켰다. 반응 후에, 1% 아가로스 겔에서 전기영동을 수행한 후 EtBr(Ethidium bromide)로 염색한 후 DNA의 이동을 UV로 확인하였다. 세균의 막에 영향을 주지 않고 침투 후에 DNA 또는 RNA에 결합하여 세균의 기능에 영향을 주어 항균 활성을 보이는 것으로 알려진 항균 펩타이드 Buforin 2를 비교군으로 사용하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 IARR-mBjAMP1과 IARR-Anal10는 플라스미드 DNA와 결합하는 것을 관찰할 수 있었고, 이를 통해 본 발명의 mBjAMP1 유래 신규 항균 펩타이드는 박테리아의 막에 작용하지 않고 DNA에 결합하여 세균에 대한 항균활성을 나타내는 것을 유추할 수 있었다.
하기에 본 발명의 조성물을 위한 제조예를 예시한다.
<제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
본 발명의 펩타이드 20㎎
유당 20㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
본 발명의 펩타이드 10㎎
옥수수전분 100㎎
유당 100㎎
스테아린산 마그네슘 2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<1-3> 캡슐제의 제조
본 발명의 펩타이드 10㎎
결정성 셀룰로오스 3㎎
락토오스 14.8㎎
스테아린산 마그네슘 0.2㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4> 액제의 제조
본 발명의 펩타이드 20㎎
이성화당 10g
만니톨 5g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
<1-5> 주사제의 제조
본 발명의 펩타이드 10㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 7.6로 될 때까지
주이용 염화나트륨 BP 최대 1㎖
적당한 용적의 주이용 염화나트륨 BP 중에 본 발명의 펩타이드를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 이용하여 pH 7.6로 조절하고, 주이용 염화나트륨 BP를 이용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 고압증기멸균기로 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<제조예 2> 화장품의 제조
<2-1> 유연화장수(스킨)
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 유연화장수를 제조하기 위해 하기 표 7에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
유연화장수 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
1,3-부틸렌글리콜 3.0
글리세린 5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<2-2> 영양화장수(로션)
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 영양화장수를 제조하기 위해 하기 표 8에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
영양화장수 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
스쿠알란 10.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 2.0
유창목오일 0.1~30
1,3-부틸렌글리콜 8.0
글리세린 5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 0.2
에탄올 8.0
구연산 0.02
구연산나트륨 0.06
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<2-3> 에센스
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 에센스를 제조하기 위해 하기 표 9에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
에센스 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
시토스테롤 1.7
플리글리세릴2-올레이트 1.5
세라마이드 0.7
세테아레스-4 1.2
콜레스테롤 1.5
디세틸포스페이트 0.4
농글리세린 5.0
카르복시비닐폴리머 0.2
산탄검 0.2
방부제 미량
향료 미량
정제수 To 100
<2-4> 세안제(클렌징폼)
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 세안제(클렌징폼)를 제조하기 위해 하기 표 10에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
세안제 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
N-아실글루타민산나트륨 20.0
글리세린 10.0
PEG-400 15.0
프로필렌글리콜 10.0
POE(15) 올레일알코올에테르 3.0
라우린유도체 2.0
메틸파라벤 0.2
EDTA-4Na 0.03
향료 0.2
정제수 To 100
<2-5> 영양크림
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 영양크림을 제조하기 위해 하기 표 11에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조한다.
영양크림 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
바셀린 7.0
유동파라핀 10.0
밀납 2.0
폴리솔베이트60 2.5
솔비탄세스퀴올레이트 1.5
스쿠알란 3.0
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
산탄검 0.5
토코페닐아세테이트 0.1
향료, 방부제 미량
정제수 To 100
<2-6> 마사지크림
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 마사지크림을 제조하기 위해 하기 표 12에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조한다.
마사지크림 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
프로필렌글리콜 6.0
글리세린 4.0
트리에탄올아민 0.5
밀납 2.0
토코페닐아세테이트 0.1
폴리솔베이트60 3.0
솔비탄세스퀴올레이트 2.5
세테아릴알코올 2.0
유동파라핀 30.0
산탄검 0.5
향료, 방부제 미량
정제수 To 100
<2-7> 팩
본 발명의 펩타이드를 포함하는 항균용 팩을 제조하기 위해 하기 표 13에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조한다.
팩 조성
성분 함량(중량%)
본 발명의 펩타이드 0.1~30
프로필렌글리콜 2.0
글리세린 4.0
폴리비닐알코올 10.0
에탄올 7.0
파이지-40 히드로게비이티드캐스터오일 0.8
트리에탄올아민 0.3
향료, 방부제 미량
정제수 To 100
이상의 본 발명은 상기에 기술된 실시예 및 제조예에 의해 한정되지 않고, 통상의 기술자들에 의해 다양한 변형 및 변경을 가져올 수 있으며, 그외의 색조 화장품을 포함하는 다양한 용도의 화장품에 적용될 수 있는 것이고, 그 효능에 따라 인체에 얇게 도포하여 바를 수 있는 약제 즉, 연고로 제조에 이용될 수 있고, 이는 첨부된 청구항에서 정의되는 본 발명의 취지와 범위에 포함된다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Chosun University <120> Novel antimicrobial peptide derived from mBjAMP1 peptide and uses thereof <130> PN18291 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Branchiostoma japonicum <400> 1 Asn Leu Cys Ala Ser Leu Arg Ala Arg His Thr Ile Pro Gln Cys Lys 1 5 10 15 Lys Phe Gly Arg Arg 20 <210> 2 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IARR-mBjAMP1 <400> 2 Ile Ala Arg Arg Asn Leu Cys Ala Ser Leu Arg Ala Arg His Thr Ile 1 5 10 15 Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Arg Arg 20 25 <210> 3 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IARR-Anal1 <400> 3 Ile Ala Arg Arg Ala Leu Cys Ala Ser Leu Arg Ala Arg His Thr Ile 1 5 10 15 Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Arg Arg 20 25 <210> 4 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IARR-Anal2 <400> 4 Ile Ala Arg Arg Ala Leu Lys Ala Ser Leu Arg Ala Arg His Thr Ile 1 5 10 15 Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Arg Arg 20 25 <210> 5 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IARR-Anal3 <400> 5 Ile Ala Arg Arg Ala Leu Lys Lys Ser Leu Arg Ala Arg His Thr Ile 1 5 10 15 Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Arg Arg 20 25 <210> 6 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IARR-Anal4 <400> 6 Ile Ala Arg Arg Ala Leu Lys Lys Ala Leu Arg Ala Arg His Thr Ile 1 5 10 15 Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Arg Arg 20 25 <210> 7 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IARR-Anal5 <400> 7 Ile Ala Arg Arg Ala Leu Lys Lys Ala Lys Arg Ala Arg His Thr Ile 1 5 10 15 Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Arg Arg 20 25 <210> 8 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IARR-Anal6 <400> 8 Ile Ala Arg Arg Ala Leu Lys Lys Ala Lys Arg Ala Ala His Thr Ile 1 5 10 15 Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Arg Arg 20 25 <210> 9 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IARR-Anal7 <400> 9 Ile Ala Arg Arg Ala Leu Lys Lys Ala Lys Arg Ala Ala His Lys Ile 1 5 10 15 Pro Gln Cys Lys Lys Phe Gly Arg Arg 20 25 <210> 10 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IARR-Anal8 <400> 10 Ile Ala Arg Arg Ala Leu Lys Lys Ala Lys Arg Ala Ala His Lys Ile 1 5 10 15 Pro Ala Cys Lys Lys Phe Gly Arg Arg 20 25 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IARR-Anal9 <400> 11 Ile Ala Arg Arg Ala Leu Lys Lys Ala Lys Arg Ala Ala His Lys Ile 1 5 10 15 Pro Ala Ala Lys Lys Phe Gly Arg Arg 20 25 <210> 12 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IARR-Anal10 <400> 12 Ile Ala Arg Arg Ala Leu Lys Lys Ala Lys Arg Ala Ala His Lys Ile 1 5 10 15 Pro Ala Ala Lys Lys Phe Ala Arg Arg 20 25

Claims (14)

  1. 서열번호 4 내지 8 및 서열번호 11 내지 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 항균 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 그람 음성균 또는 항생제 내성균에 대해 항균 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  5. 제4항에 있어서, 상기 그람 음성균은 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  6. 제4항에 있어서, 상기 항생제 내성균은 항생제 내성을 갖는 크렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae)인 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 인간 유래 세포에 대하여 낮은 세포 독성을 가지는 것을 특징으로 하는 항균 펩타이드.
  8. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제.
  9. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물.
  10. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 식품 첨가제.
  11. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 사료 첨가제.
  12. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 생물 농약.
  13. 제1항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 의약외품 조성물.
  14. 약학적으로 유효한 양의 제1항의 항균 펩타이드를 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 인간을 제외한 개체 내 항균 방법.
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