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KR102529012B1 - 세포성 면역요법을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

세포성 면역요법을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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KR102529012B1
KR102529012B1 KR1020227030340A KR20227030340A KR102529012B1 KR 102529012 B1 KR102529012 B1 KR 102529012B1 KR 1020227030340 A KR1020227030340 A KR 1020227030340A KR 20227030340 A KR20227030340 A KR 20227030340A KR 102529012 B1 KR102529012 B1 KR 102529012B1
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후이핑 가오
펭 왕
후아 지앙
후아마오 왕
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크라제 메디컬 씨오 리미티드
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Abstract

글리피칸-3(GPC3)을 발현하는 고형 종양을 나타내는 대상자의 치료방법이 개시된다. 일반적으로 이 방법은 종양 세포를 사멸시키기 위해 이를 필요로 하는 대상자에게 GPC3 키메라 항원 수용체 면역반응 세포를 이용한다.

Description

세포성 면역요법을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS OF CELLULAR IMMUNOTHERAPY}
상호 참조
[0001] 본원은 2016.04.22.자 출원된 중국특허출원 CN201610256568.9에 기초한 우선권 주장출원으로서 상기 출원의 내용은 그 전체가 본원에 참조 병합된다.
[0002] 암은 세계적으로 사회에 중요한 영향을 미치고 있다. 2016년도에는 미국에서만 새롭게 1,685,210명의 암환자가 발생할 것으로 추산되고, 595,690명이 이 질병으로 사망할 것으로 추정된다. Journal of Oncology Practice (Erikson 2007)에 따르면 2005년의 최대 1170만명(26명당 1명)에서, 2020년까지 1820만명의 미국인 즉 19명당 1명꼴의 미국인이 암환자 또는 암 생존자가 될 것이다.
[0003] 키메라 항원 수용체 (CAR)는 단일 분자로, T 세포 및 기타 면역 세포의 특이성과 기능을 재설정하는, 항원에 대한 재조합 수용체이다. 암 면역치료법에서 이들을 사용함으로써 종양-표적화된 T 세포가 신속히 생성되어 활성 면역화의 장애를 우회할 수 있다. 세포에서 일단 발현되면, CAR-변형된 세포는 대상자에서 즉각적이고도 장기간 효과를 발휘할 수 있다.
[0004] 암환자의 T 세포로 하여금 그의 종양을 인식하도록 변형하는 키메라 항원 수용체 (CAR) T 세포 치료법은, 혈액암을 치료하는데 효과적인 것으로 나타났다. 최근 임상시험에서, CAR T 세포 요법은 달리 치료할 방법이 없는 형태의 말기 백혈병 및 림프종에 걸린 혈액암 환자들의 치료 효과를 극적으로 개선시켰다 (WO2012079000A1). 이와 대조적으로, CAR T 세포들은 고형 종양 측면에서 독특한 도전 국면을 맞이하고 있다 (Guo et al., Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells for Solid Tumors: Challenges and Prospects, J Immunol Res. 2016 Feb). 이러한 과제 중에는 그의 발현이 정상 조직으로부터 종양을 명확히 구분하고 종양 내 종양 세포를 효과적으로 사멸시켜 종양 크기를 감소시키는 항원의 동정이 포함된다.
WO2012079000A1
Guo et al., Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells for Solid Tumors: Challenges and Prospects, J Immunol Res. 2016 Feb.
발명의 개요
[0005] 광범위한 고형 종양에 대한 효과적인 별도의 치료방법이 시급히 요망되고 있다. 본 발명은 이러한 요구사항을 만족하며 관련한 이점도 제공한다. 따라서, 본 발명은 글리피칸-3 (GPC3)을 발현할 수 있는 고형 종양을 나타내는 대상자를 치료하는 바법을 개시한다. 일부 경우에서, 이 방법은 대상자에게 항-GPC3 키메라 항원 수용체 면역반응 세포를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 이러한 투여는 대상자에 대한 림프구 감소 치료(lymphocyte reduction treatment)와 동시에 또는 그 후에 실시할 수 있다. 일부 경우에서, 면역반응 세포는 NK 세포(항-GPC3-CAR NK 세포) 또는 T 세포 (항-GPC3-CAR T 세포)일 수 있다. 일부 경우에서, 대상자에 대한 항-GPC3-CAR T 세포의 투여는 대상자를 림프구 감소 치료한 후에 실시할 수 있다. 일부 경우에서, 적어도 약 5 x 104 항-GPC3-CAR T 세포/kg를 대상자에게 투여할 수 있다. 일부 경우에서, 약 5 x 104 내지 약 1 x 1012 항-GPC3-CAR T 세포/kg을 대상자에게 투여한다. 투여는 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔으로 측정시 종양 크기를 적어도 30%까지 감소시키는데 효과적일 수 있다. 일부 경우에서, 투여는 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔에 의해 측정시 종양 병변 직경의 기준 측정치에서 10% 이내의 변화만을 일으키도록 종양 크기를 안정화시키는데 효과적일 수 있다. 일부 경우에서, 항-GPC3-CAR T 세포의 투여 및 대상자의 림프구 감소 치료는 항-GPC3-CAR T 세포 투여 단독에 비해 대상작의 중간(medium) 생존 기간을 적어도 약 6개월까지 상승적으로 증가시킬 수 있다. 일부 경우에서, 고형 종양은 간암, 위암, 갑상선암 (예컨대, 갑상선 암종), 폐암, 유방암, 두경부암, 난소암, 신장암, 방광암, 자궁경부암, 췌장암, 지방육종, 고환 비분화성 생식세포암, 흑색종, 부신 선종, 신경초종, 악성 섬유성 조직구종, 또는 식도암일 수 있다. 일부 경우에서, 항-GPC3 키메라 항원 수용체는 GPC3의 C-말단에 대한 특이적인 결합을 나타낼 수 있는 항원 결합 유닛을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 항원 결합 유닛은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100% 서열 상동성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 항-GPC3-CAR은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, 또는 SEQ ID NO:30에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 항-GPC3-CAR은 SEQ ID NOS 28 내지 30 중 임의의 서열에 대해 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100%서열 동일성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 항-GPC3-CAR T 세포들은 적어도 두 개의 세포내 시그널링 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 항-GPC3-CAR T 세포들은 적어도 세 개의 세포내 시그널링 도메인을 포함할 수 있다. 세포내 시그널링 도메인은 CD3, CD28, 4-1BB, OX40, DAP10, 또는 ICOS로부터 유래된 시그널링 도메인으로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에서, 림프구 감소 치료는 대상자에 있어서 조절 T 세포의 양을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 조절 T 세포의 양을 감소시키는 것은 대상자에 있어서 순환 CD4+ 및 CD25+ 세포의 유세포분석에 의해 측정시 조절 T 세포를 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 림프구 감소 치료는 대상자에게 방사선 치료 또는 생물학적 제제의 투약을 포함할 수 있다. 림프구 감소 치료는 또한 대상자에게 화학요법제를 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 대상자에 대한 화학요법제의 투여는 사이클로포스파미드, 플루다라빈, 에토포사이드, 시타라빈, 메토트렉세이트, 빈크리스틴,아드리아마이신, 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 화학요법제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 화학요법제는 대상자에게 항-GPC3-CAR T 세포의 투여에 앞서 적어도 1회 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 림프구 감소 치료는 전혈구검사(CBC: complete blood count) 분석에 의해 측정시 적어도 약 20%까지 림프구의 양을 감소시킬 있다.
[0006] 본원에는 또한 대상자에게 항-GPC3-CAR T 세포를 2차 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법도 개시되어 있다. 일부 경우에서, 대상자는 난치성, 지속성 또는 진행성 질환에 걸려있을 수 있다. 항-GPC3-CAR T 세포는 대상자에게 자가(autologous) 또는 동종(allogenic)일 수 있다.
[0007] 본원에는 또한 대상자에 대한 항-GPC3 키메라 항원 수용체 면역반응 세포의 투여와 동시 또는 투여 후 적어도 1종의 면역자극제를 투여하는 것을 더 포함하는 방법도 개시되어 있다. 면역자극제는 알데스류킨 (IL-2), IL-3, IL-6, IL-11, GM-CSF, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 생물학적 제제는 림프구 상에서 발현되는 항원에 지향된 항체일 수 있다.
[0008] 본원에는 고형 종양을 나타내는 대상자에게 항-GPC3-CAR 면역반응 세포를 투여하기 위한 키트가 개시되며, 이 키트는: 유효량의 항-GPC3-CAR 면역반응 세포; 대상자에 존재하는 림프구를 감소시키는데 효과적인 화학요법제; 및 대상자에 대한 화학요법제의 투여와 동시 또는 투여 후 항-GPC3-CAR 면역반응 세포를 투여하기 위한 지침을 포함한다. 일부 경우에서, 항-GPC3-CAR 면역반응 세포는 NK 세포 또는 T 세포 (항-GPC3-CAR T 세포)일 수 있다. 화학요법제는 사이클로포스파미드, 플루다라빈, 에토포사이드, 시타라빈, 메토트렉세이트, 빈크리스틴, 아드리아마이신, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 키트는 또한 약 60mg/kg 내지 약 80 mg/kg 사이클로포스파미드 또는 약 25mg/m2 내지 약 35 mg/m2 플루다라빈을 이를 필요로 하는 대상자에게 투여하기 위해 더 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 키트는 약 1 x 104 세포 내지 약 1 x 1012 항-GPC3-CAR T 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 지침은 화학요법제 투여 후 항-GPC3-CAR T 세포를 투여하기 위한 절차를 제공할 수 있다. 일부 경우에서, 지침은 화학요법제 투여로부터 적어도 12시간 후 항-GPC3-CAR T 세포를 투여하기 위한 절차를 제공할 수 있다. 일부 경우에서, 지침은 화학요법제 투여로부터 적어도 24시간 후 항-GPC3-CAR T 세포를 투여하기 위한 절차를 제공할 수 있다. 항-GPC3-CAR T 세포는 정맥 주사용으로 조성될 수 있다. 항-GPC3-CAR T 세포는 고형 종양을 포함할 수 있는 대상자의 간에 동맥내 주사하기 위해 조성될 수도 있다.
참조 병합
[0009] 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 개별적인 각 간행물, 특허 또는 툭허출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 참조 병합되는 것으로 기재된 것과 동일한 정도로 참조 병합된다. 본원의 용어와 참조 병합된 문헌 내의 용어가 불일치하는 경우 본원의 용어에 따르는 것으로 한다.
[0010] 본 발명의 신규한 특징들을 첨부된 청구범위에 기재하였다. 본 발명의 특징 및 장점의 이해를 돕기 위해, 본 발명의 원리가 이용될 수 있는 예시적인 구체예들과 도면을 들어 본 발명을 이하에 더욱 상세히 설명한다. 첨부된 도면에서:
[0011] 도 1은 GPC3을 표적화하는 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 2세대 CAR-T 벡터를 나타낸 도면이다.
[0012] 도 2는 사이클로포스파미드 및/또는 플루다라빈으로 처리된 개체 H01, H02, 또는 H03의 림프구의 베이스라인 수준에 대한 비율(ratio-to-baseline level)을 나타낸 도면이다.
[0013] 도 3은 간 단면의 치료전 및 치료후 자기공명영상 (MRI) 스캔을 나타낸 도면이다.
[0014] 도 4A는 대조군 세포, SK-HEP-1와 함께 보조-배양된 33-28BBZ, 92-28BBZ, 및 4-28BBZ에 대해 수행된 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 결과를 나타내고, 도 4B는 이펙터:표적 비율 3:1, 1:1, 또는 1:3에서 제2 대조군 세포주, CHO-K1와 함께 보조-배양된 33-28Z, 92-28Z, 92-BBZ, 및 92-28BBZ에 대해 수행된 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 결과를 나타낸다.
[0015] 도 5A는 GPC3-양성 간암세포, Huh-7와 함께 공동 배양된 33-28BBZ, 92-28BBZ, 및 4-28BBZ에 대해 수행된 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 결과를 나타내고 도 5B는 이펙터:표적 비율 3:1, 1:1, 또는 1:3에서 GPC3, CHO-K1-GPC3+를 발현하도록 형질도입된 대조군 세포들 등에 대해 수행된 분석 결과를 나타낸다.
[0016] 도 6A는 HepG2 (HCC)와 함께 보조-배양된 항-GPC3 CAR-T 세포, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, 또는 모크(mock)에 대해 수행된 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 결과를 나타낸다. 도 6B는 Hep3B (HCC)와 함께 보조-배양된 항-GPC3 CAR-T 세포, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, 또는 모크에 대해 수행된 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 결과를 나타내고, 도 6C는 PLC/PRF/5 (Hepatoma)와 함께 보조-배양된 항-GPC3 CAR-T 세포, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, 또는 모크에 대해 수행된 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 결과를 나타낸다.
[0017] 도 7A는 이펙터:표적 비율 3:1, 1:1, 또는 1:3로 Huh-7 세포와 함께 보조-배양된 항-GPC3 CAR-T 세포, 33-28Z 또는 33-28BBZ에 대해 수행된 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 결과를 나타낸다. 도 7B는 이펙터:표적 비율 3:1, 1:1, 또는 1:3에서 위암종 세포주 KATO-III 세포와 함께 보조-배양된 항-GPC3 CAR-T 세포, 92-28Z 또는 92-28BBZ에 대해 수행된 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 결과를 나타낸다.
[0018] 도 8A는 2세대 CAR-T인 92-28Z로 처리된 마우스에서 3세대 CAR-T인 92-28BBZ 또는 식염수로 처리된 마우스에 비해 종양 크기가 현저히 감소되었음을 보여준다. 도 8B은 2세대 CAR-T인 92-28Z로 처리된, Huh-7 세포가 이식된(engrafted) 마우스의 경우, 3세대 CAR-T인 92-28BBZ 또는 식염수로 처리된 마우스에 비해 종양 크기가 현저히 감소되었음을 보여주는 종양 사진이다. 도 8C는 2세대 CAR-T인 92-28Z로 처리된 마우스들에서 3세대 CAR-T인 92-28BBZ 또는 식염수로 처리된 마우스에 비해 종양 무게 역시도 현저히 감소되었음을 보여준다. 도 8D는 2세대 CAR-T인 92-28Z로 처리된 마우스들이 3세대 CAR-T인 92-28BBZ 또는 식염수로 처리된 마우스에 비해 현저히 감소된 억제를 나타냈음을 보여준다.
[0019] 도 9는 이펙터: 표적 비율 3:1, 또는 1:1로 Huh7 (HCC) 세포와 보조-배양된 다양한 2세대 및 3세대 항-GPC3 CAR 구조물: 4-28Z, 4-28BBZ, 4-4-28BBZ, 4-14-28BBZ, 4-20-28BBZ, 4-35-28BBZ, 4-42-28BBZ의 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석의 특이적 용해(lysis) 결과를 나타낸 도면이다.
[0020] 도 10A는 A431 (GPC3 neg)와 함께 보조-배양된 항-GPC3 CAR-T 세포, 33-28Z, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, 또는 모크에 대해 수행된 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 결과를 나타낸 도면이다. 도 10B는 Huh-7 (GPC3 pos)와 함께 보조-배양된 항-GPC3 CAR-T 세포, 33-28Z, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, 또는 모크에 대해 수행된 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 결과를 나타낸 도면이다. CytoTox 분석은 모두 이펙터:표적 비율 3:1, 1:1, 또는 1:3에서 수행되었다.
[0021] 도 11A는 2세대 CAR-T인 92-28Z로 치료된 마우스가 3세대 CAR-T인 92-28BBZ 또는 모크로 치료된 마우스에 비해 종양 크기(mm3)가 현저히 감소되었음을 나타내는 이종이식(xenograft) 마우스 모델 결과를 나타낸 도면이다. 도 11B는 2세대 CAR-T인 92-28Z로 치료된 마우스가 3세대 CAR-T인 92-28BBZ 또는 식염수로 치료된 마우스에 비해 종양 무게가 현저히 감소되었음을 보여준다. 도 11C는 모크, 92-28BBZ, 또는 92-28Z CAR-T로 처리된 마우스로부터의 종양 사진이다.
[0022] 다음의 설명 및 실시예들은 본 발명의 구체예를 상세히 설명해준다. 이러한 개시 내용은 본원의 특정 구체예로 한정되는 것이 아니라 얼마든지 변형될 수 있다. 통상의 기술자라면 본원의 개시 내용이 다양하게 변형 또는 변화될 수 있음과, 이러한 변화와 변형도 본 발명에 의해 포괄됨을 이해할 것이다. 달리 언급하지 않는 한, 임의의 구체예를 임의의 다른 구체예와 조합할 수 있다.
[0023] 본원에서, 달리 언급하지 않는 한, 일부 본 발명의 구체예들은 수치 범위를 상정한다. 본 발명의 다양한 측면들은 범위 포맷으로 제공될 수 있다. 이와 같은 범위 포맷의 설명은 어디까지나 편의성과 간편성을 위해 채택된 것일 뿐 본 발명의 범위를 고정적으로 제한하려는 것이 아님을 이해하여야 한다. 따라서, 범위 설명은 명시적으로 기재한 것처럼 그 범위 내의 개별 수치 값 뿐만 아니라 가능한 모든 하위 범위를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6과 같이 구체적으로 개시된 하위 범위는 물론 1, 2, 3, 4, 5 및 6과 같이 해당 범위 내의 개별 수치도 포함함을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭과 관계 없이 적용된다. 어떤 범위가 존재할 경우 그 범위는 범위의 종점도 포함한다.
정의
[0024] 본원에서, 달리 언급되지 않는 한, 관사 "a"는 달리 특별히 언급되지 않는 한 하나 이상을 의미한다.
[0025] 본원에서, 달리 언급되지 않는 한, "함유하다", "함유하는", "포함하다", "포함하는" 등은 "포함하는"을 의미한다.
[0026] 본원에서 용어 "활성화" 및 그의 문법적 동의어는 세포가 휴지 상태에서 활성 상태로 전이되는 프로세스를 가리키는 것일 수 있다. 이 프로세스는 항원에 대한 반응, 이동 및/또는 기능적 활성 상태로의 표현형 또는 유전형 변화를 포함할 수 있다. 예를 들어, 용어 "활성화"는 T 세포 활성화의 단계별 프로세스를 가리킬 수 있다. 예를 들어, T 세포는 완전히 활성화되기까지 적어도 2가지 시그널을 필요로 할 수 있다. 첫 번째 시그널은 항원-MHC 복합체에 의한 TCR의 개재(engagement) 후에 일어날 수 있고, 두 번째 시그널은 공동-자극(co-stimulatory) 분자의 개재에 의해 일어날 수 있다 (표 3). 항-CD3은 첫 번째 시그널을 모방할 수 있고 항-CD28은 두 번째 시그널을 시험관내(in vitro) 모방할 수 있다. 예를 들어, 조작된 T 세포는 발현된 CAR에 의해 활성화될 수 있다. 본원에서, "T 세포 활성화" 또는 T 세포 촉발(triggering)은 검출가능한 세포 증식, 사이토카인 생성 및/또는 검출가능한 이펙터 기능을 유도하는데 충분히 자극된 바 있는 T 세포의 상태를 가리키는 것일 수 있다.
[0027] 본원에서 용어 "항원 결합 유닛"은 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 ("면역반응하는") 항원-결합 부위를 함유하는 분자를 가리킨다. 또한, 용어 "항원 결합 유닛"은 무척추동물과 척추동물을 비롯한 다양한 기원의 종들의 면역글로불린 분자도 포괄한다. 구조적으로, 가장 단순한 자연발생적인 항체 (예컨대, IgG)는 다이설파이드 결합에 의해 상호-연결되어 있는 4개의 폴리펩타이드 사슬, 즉 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)를 포함한다. 면역글로불린은 IgD, IgG, IgA, IgM 및 IgE와 같은 여러 유형의 분자들을 비롯한 분자들의 대규모 패밀리이다. 용어 "면역글로불린 분자"에는, 예를 들어, 하이브리드 항체 또는 변형된 항체 및 그의 단편이 포함된다. 항체의 항원 결합 기능은 자연발생적인 항체의 단편에 의해 수행가능한 것으로 밝혀진 바 있다. 이러한 단편들은 집합적으로 "항원-결합 유닛"이라 칭해진다. 용어 "항원 결합 유닛"에는 에피토프에 들어맞아 에피토프를 인식하는 특정 형태의 임의의 폴리펩타이드 사슬-함유 분자 구조물도 포함되며, 여기서 하나 이상의 비공유 결합 상호반응이 상기 분자 구조물과 에피토프 사이에서 복합체를 안정화시킨다.
[0028] 항원 결합 유닛은 만일 이것이 다른 레퍼런스 항원 예컨대 폴리펩타이드 또는 다른 물질들에 대한 이들의 결합에 비해 더 큰 친화성 또는 친밀성으로 어떤 항원과 결합할 경우 그 항원에 "특이적으로 결합"하거나 그 항원과 "면역 반응성"인 것이다.
[0029] 본원에서 "항원"이라 함은 항원 결합 유닛에 의해 특이적으로 인식 및 결합되는 물질을 의미한다. 항원에는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 다당류, 및 지질; 이들의 일부분 및 조합이 포함된다. 항원의 비제한적인 예에는 인간, 쥐 및 기타 유사체로부터의 GPC3이 포함된다. "항원"은 또한 면역 반응을 제공하는 분자를 가리키는 것일 수도 있다. 이 면역 반응은 항체 생성 또는 면역학적으로-유능한 특이적인 세포의 활성화 또는 양자 모두와 관련될 수 있다. 통상의 기술자라면 실제로 모든 단백질 또는 펩타이드를 비롯한 임의의 모든 거대 분자들이 항원으로서 작용할 수 있음을 이해할 것이다..
[0030] 본원에서 용어 "면역글로불린" 또는 "Ig"는 항체로서 기능하는 일군의 단백질을 가리키는 것일 수 있다. B 세포에 의해 발현되는 항체들은 때로 키메라 항원 수용체 또는 항원 수용체라 칭해진다. 이 부류의 단백질에 포함된 5 가지 멤버는 IgA, IgG, IgM, IgD, 및 IgE인데 이 중 IgG는 가장 흔한 순환 항체이다. 이것은 응집, 보체 고정 및 기타 항체 반응에 있어 가장 효과적인 면역글로불린이며 세균과 바이러스에 대한 방어에 있어서도 중요하다. 예를 들어, 종양 세포 항원은 CAR에 의해 인식될 수 있다.
[0031] 용어 "항-GPC3 항체"는 충분한 친화도를 가지고 GPC3에 결합할 수 있음으로 해서 어떤 세포에 의해 발현되는 다른 항원으로부터 GPC3을 식별하는데 유용한 항체 또는 항체 결합 부위를 가리키는 것일 수 있다. 일 구체예에서, 무관한 비-GPC3 단백질에 대한 항-GPC3 항체의 결합 정도는 예를 들어, 라디오 면역분석법(RIA)으로 측정시 GPC3에 대한 그 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구체예에서, GPC3에 결합하는 항체는 < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, , < 5 nM, , < 4 nM, , < 3 nM, , < 2 nM, < 1 nM, < 0.1 nM, < 0.01 nM, 또는 < 0.001 nM (예컨대, 10-8 M 이하, 예컨대 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(Kd)를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 항-GPC3 항체는 상이한 종으로부터의 GPC3 중에서 보존되는 GPC3의 에피토프에 결합한다.
[0032] 본원에서 용어 "자가(autologous)" 및 그의 문법적 동의어는 동일한 것으로부터 기원한다는 의미로 사용된다. 예를 들어, 어떤 샘플(예컨대, 세포)이 제거, 처리된 다음 나중에 동일한 대상자 (예컨대, 환자)에게 되돌려질 수 있다. 자가 프로세스는 공여자와 수혜자가 서로 다른 대상자들인 동종(allogenic) 프로세스와 구별된다.
[0033] 본원에서 사용된 용어 "이종이식(Xenotransplantation) 및 그의 문법적 동의어는 수혜자와 공여자가 서로 종을 달리하는 경우로서 세포, 조직 또는 장기를 수혜자에게 이식(transplatation), 이식(implantation) 또는 주입(infusion)을 수반하는 임의의 프로세스를 포괄할 수 있다. 본원에 기술된 세포, 장기 및/또는 조직의 이식은 인간으로의 이종이식을 위해 사용될 수 있다. 이종이식은 혈관화 이종이식편, 부분 혈관화 이종이식편, 비혈관화 이종이식편, 이종드레싱, 이종밴디지 및 이종구조물을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
[0034] 본원에서 사용된 용어 "동종이식(Allotransplantation)" 및 그의 문법적 동의어는 수혜자와 공여자가 동일한 종이지만 상이한 개체인 경우로서, 세포, 조직 또는 장기를 수혜자에게 이식, 이식 또는 주입을 수반하는 임의의 프로세스를 포괄할 수 있다. 본원에 기술된 세포, 장기 및/또는 조직의 이식은 인간으로의 동종이식을 위해 사용될 수 있다. 동종이식은 혈관화 동종이식편, 부분 혈관화 동종이식편, 비혈관화 동종이식편, 동종드레싱, 동종밴디지 및 동종구조물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
[0035] 본원에서 사용된 용어 "자가이식(Autotransplantation)" 및 그의 문벅적 동의어(예컨대, 자가이식(autologous transplantation))는 수혜자와 공여자가 동일한 개체인 경우로서, 세포, 조직 또는 장기를 수혜자에게 이식, 이식 또는 주입을 수반하는 임의의 프로세스를 포괄할 수 있다. 본원에 기술된 세포, 장기 및/또는 조직의 이식은 인간으로의 자가이식을 위해 사용될 수 있다. 자가이식은 혈관화 자가이식편, 부분 혈관화 자가이식편, 비혈관화 자가이식편, 자가드레싱, 자가밴디지 및 자가구조물을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
[0036] 본원에서 사용된 용어 "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR"은 비제한적인 예로서 T 세포에 의해 발현될 수 있는 조작된 분자를 가리킨다. T 세포에서 발현된 경우 CAR은 T 세포로 하여금 인공 수용체에 의해 지시되는 특이성을 가지고 표적 세포의 사멸을 유도하도록 재설정할 수 있다. CAR의 세포외 결합 도메인은 쥐, 인간화된 또는 완전 인간 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다. "항-GPC3-CAR"은 GPC3에 결합할 수 있는 CAR이다.
[0037] 본원에서 용어 "에피토프" 및 그의 문법적 동의어는 항체, B 세포, T 세포 또는 조작된 세포에 인식될 수 있는 항원 부분을 가리키는 것일 수 있다. 예를 들어, 에피토프는 TCR에 의해 인식되는 암 에피토프일 수 있다. 하나의 항원 내 다중 에피토프들 역시도 인식될 수 있다. 에피토프는 돌연변이될 수도 있다.
[0038] 본원에서 용어 "조작된(engineered)" 및 그의 문법적 동의어는 핵산, 예컨대 생명체의 게놈 내의 핵산의 하나 이상의 변경을 가리키는 것일 수 있다. 용어 "조작된"은 유전자의 변경, 부가 및/또는 결실을 가리킬 수 있다. 조작된 세포는 부가, 결실 및/또는 변경된 유전자를 갖는 세포를 가리킬 수도 있다.
[0039] 본원에서 용어 "세포" 또는 "조작된 세포" 및 이들의 문법적 동의어는 인간 또는 비인간 동물 기원의 세포를 가리킬 수 있다. 조작된 세포는 또한 CAR-발현 세포를 가리킬 수 있다.
[0040] 본원에서 용어 "품질관리기준" (GMP) 및 그의 문법적 동의어는 FDA 규정에 의거하여 안전하고, 유효하거나 또는 순수한 생성물을 가리키는 것일 수 있다. GMP는 또한 때??로 "cGMP"라고도 칭해진다. 여기서 "c"는 "현행(current)"를 의미한다. 제품의 제조자는 GMP 제품의 관련 규정을 준수하기 위해 최신 기술과 시스템을 사용할 수 있다. 연구조사용 세팅과 반대로 임상 세팅에서는 GMP 호환 제품이 일반적으로 사용된다.
[0041] 본원에서 용어 "형질감염(transfection)"은 외래 핵산을 진핵 세포 내로 도입하는 것을 가리킨다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전, DEAE-덱스트란-매개형 형질감염, 폴리브렌-매개형 형질감염, 전기천공, 마이크로인젝션, 리포좀 융합, 리포펙션, 원형질 융합, 레트로바이러스 감염 및 유전자총(biolistics)을 비롯한 다양한 공지 기술 수단에 의해 달성될 수 있다.
[0042] 용어 "안정한 형질감염" 또는 "안정하게 형질감염되다"라 함은 외래 핵산, DNA 또는 RNA가 형질감염된 세포의 게놈 내로 도입 및 통합되었음을 가리킨다. 용어 "안정한 형질감염체(stable transfectant)"라 함은 게놈 DNA 내로 안정하게 통합된 외래 DNA를 갖는 세포를 가리킨다.
[0043] 본원에서, 용어 "핵산 분자 인코딩," "DNA 서열 인코딩," 및 "DNA 인코딩"은 데옥시리보핵산 가닥을 따르는 데옥시리보뉴클레오타이드의 순서(order) 또는 서열(sequence)을 가리킨다. 이들 데옥시리보뉴클레오타이드의 순서는폴리펩타이드 (단백질) 사슬을 따라난 아미노산의 순서를 결정한다. 그러므로 핵산 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.
[0044] 본원에서 용어 "대상자"는 예컨대 포유동물 또는 유대동물과 같은 임의의 동물을 가리킨다. 본 발명의 대상자의 비제한적인 예로는 인간, 비인간 영장류(예컨대, 레수스 또는 기타 유형의 원숭이), 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 래트 및 임의의 가금류를 들 수 있다.
[0045] 본원에서 용어 "수혜자(recipient)" 및 이들의 문법적 동의어는 요법 또는 치료를 받는 인간 또는 비인간 동물을 가리키는 것일 수 있다.
[0046] 본원에서 용어 "말초 혈액 림프구" (PBL) 및 그의 문법적 동의어는 혈액 (예컨대, 말초 혈액) 내에서 순환하는 림프구를 가리키는 것일 수 있다. 말초 혈액 림프구는 장기로 국소화되지 않는 림프구를 가리킬 수도 있다. 말초 혈액 림프구는 T 세포, NK 세포, B 세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
[0047] 용어 "면역반응 세포(immunoresponsive cell)"는 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 세포를 가리키며 이의 비제한적인 예로는 T 세포, B 세포, 및 NKT 세포, 이들의 각 전구체 세포 및 후손 세포를 들 수 있다. 면역반응 세포는 또한 림프구 또는 골수구 계통의 세포를 가리키는 것일 수도 있다.
[0048] 본원에서 용어 "T 세포" 및 그의 문법적 동의어는 임의의 기원으로부터의 T 세포를 가리킬 수 있다. 예를 들어, T 세포는 일차(primary) T 세포, 예컨대, 자가 T 세포, 세포주 등일 수 있다. T 세포는 또한 인간 또는 비인간 유래일 수 있다.
[0049] 본원에서 용어 "T 세포 활성화" 또는 "T 세포 촉발(triggering)"이라 함은 검출가능한 세포 증식, 사이토카인 생성 및/또는 검출가능한 이펙터 기능을 유도하는데 충분히 자극된 T 상태를 가리키는 것일 수 있다. 일부 경우에서, "완전한 T 세포 활성화"는 T 세포 세포독성을 촉발하는 것과 유사할 수 있다. T 세포 활성화는 기술분야에 알려진 다양한 분석법을 이용하여 측정할 수 있다. 이러한 분석법으로는 사이토카인 분비를 측정하는 ELISA, ELISPOT, 세포내 사이토카인 발현 (CD107)을 측정하는 유세포 분석법, 증식을 측정하는 유세포 분석법, 및 표적 세포 제거를 알아내기 위한 세포독성 분석법 (51Cr 방출 분석법)을 들 수 있다. 상기 분석법은 전형적으로 조작된 세포(CAR T)와의 비교를 위해 대조군(조작되지 않은 세포)을 사용하여 대조군에 대한 조작된 세포의 상대적인 활성화를 결정한다. 또한, 상기 분석법은 표적 항원을 발현하지 않는 표적 세포와 함께 배양되거나 접촉된 조작된 세포들을 비교할 수 있다. 예를 들어, 상기 비교는 CD19를 발현하지 않는 표적 세포와 함께 배양된 CD19-CAR T 세포일 수 있다.
[0050] 용어 "서열" 및 그의 문법적 동의어가 뉴클레오타이드 서열을 가리킬 경우, 여기에는 DNA 또는 RNA가 포함되며; 및 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. 핵산 서열은 돌연변이될 수 있다. 핵산 서열은 임의의 길이, 예를 들어, 2 내지 1,000,000 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 길이 (또는 상기 수치 범위 사이의 정수값 또는 그 이상), 예컨대, 약 100 내지 약 10,000 뉴클레오타이드 또는 약 200 내지 약 500 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
사용 방법
[0051] 일 측면에서, 본원에 따라 글리피칸-3 (GPC3)을 발현하는 고형 종양을 갖는 대상자의 치료 방법이 개시된다. 이 방법은 전형적으로 대상자에게 항-GPC3 키메라 항원 수용체 면역반응 세포를 투여하는 단계를 포함하되 이러한 투여는 대상자의 림프구 감소 치료와 동시에 또는 그 후에 수행한다.
[0052] 본원에 개시된 방법에 의해 치료된 대상자들은 암 또는 고형 종양을 갖는 대상자일 수 있다. 종종, 암세포 또는 고형 종양 세포는 하나 이상의 종양 항원을 발현한다. 일반적으로, 종양 항원은 글리피칸-3 (GPC3)이다. GPC-3을 발현하는 암 또는 고형 종양을 갖는 대상자는 GPC3-양성 암을 나타낸다고 칭할 수 있다.
[0053] GPC3을 발현하는 암의 비제한적인 예로는 간암, 위암, 식도암, 폐암, 유방암, 두경부암, 난소암, 신장암, 방광암, 자궁경부암, 췌장암, 지방육종, 고환 비분화성 생식세포암, 흑색종, 선종, 부신암, 신경초종, 악성종양, 섬유성 조직구종, 또는 이들의 임의의 조합을 들 수 있다. 이 방법은 편평세포 암종 또는 선암종, 위장관의 신경내분비암 또는 문헌 ["Glypican-3 expression in gastrointestinal and pancreatic epithelial neoplasms. (2013) 44, 542-550 Human Pathology"]에 개시된 임의의 기타 암을 치료하는데 적용될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 면역반응 세포, 예컨대 본원에 개시된 항-GPC3-CAR-T는 난소암종, 담관암, 중피종, 유방암, 췌장 편평세포 암종, 자궁 경부 상피내 신생물, 자궁 경부 편평세포 암종, 간내암 및 간외암, 담낭암종, 침윤성 도관 암종, 선세포 암종, 종양세포종, 유두종 세포종, 유두 암종, 유두암 및 소엽 및 갑상선 수질 유방암종을 표적화하는데 이용될 수 있다. 항-GPC3 요법에 대한 부가적인 표적은 문헌 [ Glypican 3 expression in human nonneoplastic, preneoplastic, and neoplastic tissues. (2008) 129:899-906 Am J ClinPathol"]에 개시된 것들을 포함할 수 있다.
[0054] 일부 경우에서, 암 또는 종양 세포는 유세포 분석법 또는 면역조직화학법에 의해 GPC3 발현에 대해 평가될 수 있다. 암 또는 종양 세포 상의 GPC3 수준은 저, 중, 고로 분류될 수 있다.
[0055] 일부 경우에서, 암 또는 종양 세포는 세포 표면에서 GPC3을 발현할 수 있다. 세포 표면 상의 GPC3 발현은 예를 들어 면역조직화학 또는 유세포 분석법과 같은 방법에서 GPC3에 대한 항체를 이용함으로써 알아낼 수 있다. 별법으로, GPC3 mRNA 발현은 세포 표면 상의 GPC3 발현과 상관관계가 있는 것으로 고려될 수 있으며 인 시투(in situ) 혼성화 및 RT-PCR로부터 선택되는 방법에 의해 알아낼 수도 있다.
[0056] 일부 경우에서, GPC3은 표 2에 나타낸 유전자들과 적어도 50% 서열 동일성을 나타내는 핵산 서열을 포함하는 유전자에 의해 인코딩된다. GPC3은 표 2에나타낸 유전자들과 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100% 서열 동일성을 나타내는 핵산 서열을 ?l마하는 유전자에 의해 인코딩될 수 있다.
[0057] 일부 구체예에서, GPC3을 발현하는 고형 종양을 나타내는 대상자를 림프구 감소 치료하는 것과 동시에 또는 그 후에, 항-GPC3 키메라 항원 수용체 면역반응 세포를 상기 대상자에게 투여한다.
[0058] 본 항-GPC3 키메라 항원 수용체(CAR)는 전형적으로 세포외 항원 결합 영역, 막관통 도메인, 및 면역반응 세포 활성화를 조절하는 세포내 시그널링 영역을 포함한다. 일부 경우에서, 항-GPC3 CAR은 힌지 또는 스페이서를 더 포함한다. 일부 경우에서, 항-GPC3 CAR은 1 이상의 공동-자극 도메인을 더 포함한다.
[0059] 키메라 항원 수용체는 전형적으로 세포외 항원 결합 영역을 포함한다. 일 구체예에서, 세포외 항원 결합 영역은 완전히 인간 유래(fully human)일 수 있다. 또 다른 경우, 세포외 항원 결합 영역은 인간화된 것일 수 있다. 세포외 항원 결합 영역은 쥐 유래일 수 있거나 또는 세포외 항원 결합 영역 내 키메라는 적어도 2가지 상이한 동물 종으로부터 유래된 아미노산 서열들로 이루어진다. 일부 경우에서, 세포외 항원 결합 영역은 비인간의 것일 수 있다. 다양한 항원 결합 영역들을 GPC3을 표적화하도록 설계할 수 있다. 비제한적인 예에는 항체 유래 단쇄 가변 단편 (scFv's), 라이브러리로부터 선택된 항원 결합 영역 단편 (Fab), 단일 도메인 단편 또는 동족 수용체와 연관된 천연 리간드가 포함된다. 세포외 항원 결합 영역은 scFv, Fab 또는 천연 리간드뿐만 아니라 이들의 유도체 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 세포외 항원 결합 영역은 온전한 항체의 일부를 포함할 수 있고 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합가능한 완전한 항체 이외의 분자를 지칭할 수 있다. 항체 단편의 비제한적인 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2; 다이아바디; 선형 항체; 단일-사슬 항체 분자 (예컨대 scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이 항체를 들 수 있다.
[0060] 세포외 항원 결합 영역, 예를 들어 scFv, Fab, 또는 천연 리간드는 항원 특이성을 결정하는 CAR의 일부일 수 있다. 세포외 항원 결합 영역은 임의의 상보성 표적에 결합할 수 있다. 세포외 항원 결합 영역은 가변 영역의 서열이 공지인 항체로부터 유래할 수 있다. 세포외 항원 결합 영역은 마우스 이용가능한 마우스 하이브리도마로부터 얻어진 항체 서열로부터 유래할 수 있다. 별법으로, 세포외 항원 결합 영역은 종양 침윤 림프구(TIL: tumor infiltrating lymphocyte)와 같은 일차 세포 또는 종양 세포의 전체-엑솜 시퀀싱(whole-exomic sequencing)으로부터도 얻을 수도 있다.
[0061] 일부 경우에서, 세포외 항원 결합 영역의 결합 특이성은 상보성 결정 영역, 또는 경쇄 CDR이나 중쇄 CDR과 같은 CDR에 의해 결정가능하다. 많은 경우, 결합 특이성은 경쇄 CDR 및 중쇄 CDR에 결정될 수 있다. 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR의 주어진 조합은 GPC3과 같은 항원에 대해서, 다른 레퍼런스 항원에 비해 GPC3과 같은 항원에 대해 더 큰 친화성 및/또는 특이성을 부여할 수 있는 주어진 결합 포켓을 제공할 수 있다. 예를 들어, 글리피칸-3에 특이적인 CDR은 CAR의 세포외 결합 영역에서 발현되어 GPC3을 표적화하는 CAR이 GPC3을 발현하는 종양 세포로 면역반응 세포를 표적화시킬 수 있다.
[0062] 본원에 기재된 임의의 구체예 중 일부 측면에서, 세포외 항원 결합 영역, 예컨대 scFv는 GPC3에 특이적인 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 경쇄 CDR은 예컨대 CAR의 scFv과 같은 항원 결합 유닛의 경쇄의 상보성 결정 영역일 수 있다. 경쇄 CDR은 아미노산 잔기의 연속 서열, 또는 프레임워크 영역과 같은 비상보성 결정 영역에 의해 분리되고, 선택적으로 그 양측에 인접한 아미노산 잔기의 2개 이상의 연속 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 경쇄 CDR은 2 이상의 경쇄 CDR을 포함할 수 있으며 이들은 각각 경쇄 CDR-1, CDR-2, 등으로 칭해진다. 일부 경우에서, 경쇄 CDR은 각각 경쇄 CDR-1, 경쇄 CDR-2, 및 경쇄 CDR-3로 칭해질 수 있는 3개의 경쇄 CDR을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 흔한 경쇄 상에 존재하는 일군의 CDR은 경쇄 CDR인 것으로 집합적으로 칭해질 수 있다.
[0063] 본원에 기재된 임의의 구체예 중 일부 측면에서, 세포외 항원 결합 영역, 예컨대 scFv는 GPC3에 특이적인 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 중쇄 CDR은 scFv와 같은 항원 결합 유닛의 중쇄의 상보성 결정 영역일 수 있다. 중쇄 CDR은 아미노산 잔기의 연속 서열, 또는 프레임워크 영역과 같은 비상보성 결정 영역에 의해 분리 및 선택적으로 그 양?P에 인접한 아미노산 잔기의 2개 이상의 연속 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 중쇄 CDR은 중쇄 CDR-1, CDR-2, 등으로 칭해질 수 있는 2개 이상의 중쇄 CDR을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 중쇄 CDR은 3개의 중쇄 CDR을 포함할 수 있고 이들은 각각 중쇄 CDR-1, 중쇄 CDR-2, 및 중쇄 CDR-3으로 칭해질 수 있다. 일부 경우에서, 공통 중쇄 상에 존재하는 CDR 그룹은 중쇄 CDR로서 집합적으로 칭해질 수 있다.
[0064] 일부 경우에서, GPC3을 표적화하는 세포외 항원 결합 영역은 항-GPC3 CAR 면역반응 세포에 의해 발현될 수 있다. 일부 경우에서, GPC3 항원에 결합하는 CDR, 경쇄 및/또는 중쇄는 CAR T 세포와 같은 CAR 면역반응 세포의 세포외 항원 결합 영역 내에 포함될 수 있다. 일부 경우에서, 변형된 항-GPC3 CDR은 CAR 면역반응 세포의 세포외 항원 결합 영역 상에서 발현되어 오리지널 항-GPC3 CDR에 대해 약 50% 상동성 내지 약 100% 상동성을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 변형된 항-GPC3 CDR은 비변형 항-GPC3 CDR에 대해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100% 상동성을 가질 수 있다.
[0065] 일부 경우에서, GPC3을 표적화하는 scFv는 항-GPC3 CAR 면역반응 세포에 의해 발현될 수 있다. 일부 경우에서, GPC3 항원에 결합하는 CDR, 경쇄 및/또는 중쇄는 CAR T 세포와 같은 CAR 면역반응 세포의 scFv 상에서 발현될 수 있다. 일부 경우에서, 변형된 항-GPC3 CDR은 CAR T 세포와 같은 CAR 면역반응 세포의 scFv 상에서 발현될 수 있고 오리지널 항-GPC3 CDR에 대해 약 50% 상동성 내지 약 100% 상동성을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 변형된 항-GPC3 CDR은 비변형 항-GPC3 CDR에 대해 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100% 상동성을 가질 수 있다.
예시적인 항-GPC3 세포외 항원 결합 영역들:
SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8
[0066] 바람직한 경우, 세포외 항원 결합 영역은 GPC3을 특이적으로 인식한다. GPC3은 표 2의 GPC3 유전자와 적어도 80% 동일성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 세포외 항원 결합 영역은 GPC3의 N-말단, C-말단, 또는 N-말단으로부터 C-말단까지의 임의의 부분을 표적화할 수 있다. GPC3의 C-말단은 글리코실 포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 세포막에 공유적으로 결합될 수 있다. C-말단은 일부 경우 약 1 내지 약 800 염기를 포함할 수 있다. C-말단은 C-말단 엔드로부터 약 1, 50, 100, 150, 300, 500, 600개 최대 약 800개의 염기를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 세포외 항원 결합 영역은 GPC3의 GPI 앵커를 표적화할 수 있다.
GPC3
약어 명칭 NCBI No: GRCh38.p7 출발 정지 게놈 내 위치
GPC3 글리피칸 3 2719 133535745 133985646 Xq26.2
[0067] 유전자 조작을 이용함으로써, 세포외 항원 결합 영역을 다양한 방식으로 변형시킬 수 있다. 일부 경우에서, 세포외 항원 결합 영역이 그의 표적에 더해 더 높은 친화성을 가지면서 선택될 수 있도록 세포외 항원 결합 영역을 돌연변이시킬 수 있다. 일부 경우에서, 그의 표적에 대한 세포외 항원 결합 영역의 친화성은 정상 좆직에서는 낮은 수준으로 발현될 수 있는 표적에 대해 최적화될 수 있다. 이러한 최적화는 잠재적 독성을 최소화하기 위해 수행될 수 있다. 또 다른 경우, 막 결합 형태의 표적에 대해 더 높은 친화성을 갖는 세포외 항원 결합 영역의 클로닝이 그의 가용성 형태 카운터파트보다 더 바람직할 수 있다. 일부 표적들은 상이한 수준으로 가용성 형태로도 검출될 수 있고 그들의 표적화가 의도치않은 독성을 일으킬 수 있기 때문에 이러한 변형이 수행될 수 있다.[0068] 일부 경우에서, 세포외 항원 결합 영역은 상동성에 있어 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8 중 어느 하나와 약 50% 내지 약 100% 유사할 수 있다. 일부 경우에서, 세포외 항원 결합 영역은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8에 대해 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100% 상동성을 가질 수 있다. 일부 경우에서, 세포외 항원 결합 영역은 쥐의, 인간화된 것이거나 또는 완전히 인간 유래일 수 있다. 세포외 항원 결합 영역은 약 1% 내지 약 100% 인간일 수 있다. 일부 경우에서, 세포외 항원 결합 영역은 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 최대 약 100% 인간일 수 있다.
[0069] 일부 경우에서, 세포외 항원 결합 영역은 힌지 또는 스페이서를 포함한다. 힌지 및 스페이서라는 용어는 호환하여 사용될 수 있다. 힌지는 세포외 항원 결합 영역에 유연성을 제공하기 위해 사용되는 CAR의 일부분으로 간주될 수 있다. 일부 경우에서, 힌지는 특히 세포외 항원 결합 영역을 검출하기 위한 항체들이 기능성이 아니거나 입수불가능한 경우, 세포의 세포 표면 상에서 CAR을 검출하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 면역글로불린으로부터 유래된 힌지의 길이는 세포외 항원 결합 영역이 표적으로 하는 표적 상의 에피토프의 위치에 따라 최적화될 필요가 있다.
[0070] 일부 경우에서, 힌지는 면역글로불린에 속하지 않고 그 대신 CD8 알파 분자의 천연 힌지와 같은 다른 분자에 속할 수 있다. CD8 알파 힌지는 CD8 보조-수용체와 MHC 분자의 상호반응에서 어떤 역할을 하는 것으로 알려진 시스테인 및 프롤린 잔기를 함유할 수 있다. 상기 시스테인 및 프롤린 잔기는 상기 CAR의 성능에 영향을 미칠 수 있다.
[0071] CAR 힌지는 그 크기가 조율가능하고 CAR 면역반응 세포와 표적 세포 간의 직교 시냅스 거리를 표준화하는데 어느 정도 보상될 수 있다. 면역반응 세포와 표적 세포 간의 면역학적 시냅스의 이러한 위상은, 짧은 힌지 CAR로도 시그널링에 적합한 시냅스 거리를 가져올 수 없는, 세포-표면 표적 분자상의 막-원위 에피토프로 인해 CAR에 의해 기능적으로 브릿지될 수 없는 거리도 규정한다. 마찬가지로, 그의 시그널링 아웃풋이 긴 힌지 CAR 관점에서만 관찰되는 막-근위 CAR 표적 항원 에피토프들이 설명되어 왔다. 힌지는 사용되는 세포외 항원 결합 영역에 따라 조율되리 수 있다. 힌지는 임의의 길이일 수 있다.
[0072] 막관통 도메인은 CAR을 세포의 원형질막에 고정시킬 수 있다. CD28의 천연 막관통 부분은 CAR에서 사용될 수 있다. 또 다른 경우, CD8 알파의 천연 막관통 부분은 CAR에서도 사용될 수 있다. "CD8"이라 함은 자극 활성을 갖는 NCBI Reference No: NP_001759 또는 그의 단편과 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. "CD8 핵산 분자"라 함은 CD8 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. 일부 경우에서, 막관통 영역은 CD28의 천연 막관통 부분일 수 있다. "CD28"은 자극 활성을 갖는 NCBI Reference No: NP_006130 또는 그의 단편에 대해 적어도 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 동일성을 갖는 단백질을 의미할 수 있다. "CD28 핵산 분자"라 함은 CD28 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 의미할 수 있다. 일부 경우에서, 막관통 부분은 CD8α 영역을 포함할 수 있다.
[0073] CAR의 세포내 시그널링 영역은 CAR이 위치하고 있던 면역반응 세포의 이펙터 기능 중 적어도 하나의 활성화에 책임이 있을 수 있다. CAR은 사이토카인의 분비를 비롯하여 세포용해 활성 또는 헬퍼 활성일 수 있는, T 세포의 이펙터 기능을 유도할 수 있다. 그러므로, 세포내 시그널링 영역이라는 용어는 이펙터 기능 시그널을 전달하고 세포가 특수 기능을 수행하도록 지시하는 단백질 부분을 지칭한다. 일반적으로 전체 세포 내 시그널링 영역을 사용할 수 있지만, 많은 경우 시그널링 도메인의 전체 사슬을 사용할 필요는 없다. 어떤 경우에는, 세포내 시그널링 영역의 절단된 부분이 사용된다. 일부 경우, 세포내 시그널링 영역이라는 용어는 이펙터 기능 시그널을 전달하는데 충분한 세포내 시그널링 영역의 절단된 부분을 포함하는 의미이다.
[0074] CAR에서 사용하기 위한 시그널링 도메인의 바람직한 예는 표적-수용체 인게이지먼트 후 시그널 형질도입을 개시하는데 협업하는 보조-수용체 및 T 세포 수용체 (TCR)의 세포질 서열 뿐만 아니라 이들 서열의 임의의 유도체 또는 변이체 및 동일한 기능성을 갖는 임의의 합성 서열을 포함할 수 있다.
[0075] 일부 경우에서, 상기 세포내 시그널링 영역은 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAMs)로 알려진 시그널링 모티프를 함유할 수 있다. ITAM 함유 세포질 시그널링 서열의 예에는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 유래된 것들이 포함된다. 그러나, 바람직한 구체예에서, 세포내 시그널링 도메인은 CD3 제타 사슬로부터 유래된다.
[0076] An example of 하나 이상의 ITAM 모티프를 함유하는 T 세포 시그널링 도메인의 일례는 T-세포 수용체 T3 제타 사슬 또는 CD247라고도 알려진 CD3 제타 도메인이다. 이 도메인은 T-세포 수용체-CD3 복합체의 일부이며 T 세포의 주요 이펙터터 활성화와 함께 몇몇 세포내 시그널-형질도입 경로에 항원 인식을 연결시키는데 있어 중요한 역할을 한다. 본원에서, CD3 제타는 인간 CD3 제타 및 실제로 동일한 서열을 갖는 단백질을 비롯하여, Swissprot 엔트리 P20963으로 알려진 그의 이소폼에 주로 지향된다. 키메라 항원 수용체의 일부로서, 다시 완전한 T 세포 수용체 T3 제타 사슬이 요구되지는 않으며 T-세포 수용체 T3 제타 사슬의 시그널링 도메인을 포함하는 그의 임의의 유도체와 그의 기능적 등가물이면 적합하다.
[0077] 세포내 시그널링 도메인은 표 3의 도메인들 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 일부 경우에서, 도메인은 레퍼런스 도메인 중 어느 하나에 대한 상동성이 약 50% 내지 약 100%에 달하도록 변형될 수 있다. 표 3의 도메인들은 어느 것이든 그 변형된 버젼이 약 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 또는 최대 약 100% 상동성을 갖도록 변형될 수 있다.
[0078] CAR의 세포내 시그널링 영역은 하나 이상의 공동자극 도메인들을 더 포함할 수 있다. 세포내 시그널링 영역은 단일 공동-자극 도메인, 예를 들어 제타-사슬 (1세대 CAR), 또는 CD28 또는 4-1BB (2세대 CAR)을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 세포내 시그널링 영역은 CD28/OX40 또는 CD28/4-1BB (3세대)와 같이, 두 개의 공동-자극 도메인들을 포함할 수 있다.
[0079] CD8과 같은 세포내 시그널링 도메인과 함께, 이들 공동-자극 도메인들은 유전자 전사 및 기능성 세포 반응을 뒷받침하는, 키나아제 경로의 다운스트림 활성화를 생성할 수 있다. CAR의 공동-자극 도메인은 CD28 (포스파티딜이노시톨-4, 5-비스포스페이트 3-키나아제) 또는 4-1BB/OX40 (TNF-수용체-관련-인자 어댑터 단백질) 경로, 및 MAPK 및 Akt 활성화와 관련된 근위(proximal) 시그널링 단백질을 활성화시킬 수 있다.
[0080] 일부 경우에서, CAR을 통해 생성된 시그널들은 제2 또는 공동-자극 시그널과 복합될 수 있다. 공동-자극 시그널링 도메인과 관련하여, 키메라 항원 수용체 유사 복합체는 수 개의 가능한 공동-자극 시그널링 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 기술 분야에 알려진 바와 같이, 나이브 T 세포에서 T-세포 수용체의 단순한 인게이지먼트로는 세포독성 T 세포 내로 T 세포의 완전한 활성화를 유도하는데 충분치 않다. 완전한, 생산적인 T 세포 활성화는 제2의 공동-자극 시그널을 필요로 한다. T-세포 활성화에 있어 공동-자극을 제공하는 것으로 보고되어 온 수 개의 수용체들의 비제한적인 예로는 CD28, OX40, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18), 4-1BBL, MyD88 및 4-1BB를 들 수 있다. 이들 공동-자극 분자에 의해 이용되는 시그널링 경로는 일차 T 세포 수용체 활성화 시그널과 상승적으로 공통적인 작용 특성을 공유한다. 이들 공동-자극 시그널링 영역은 하나 이상의 ITAM 모티프, 예를 들어 CD3 제타 시그널링 도메인에 기원하는 일차 이펙터 활성화 시그널과 상승작용할 수 있으며, T 세포 활성화에 대한 요구사항들을 만족할 수 있다.
[0081] 일부 경우에서, 키메라 항원 수용체-유사 복합체에 공동-자극 도메인을 추가함으로써 조작된 세포의 효능과 내구성을 증가시킬 수 있다. 또 다른 구체예에서, T 세포 시그널링 도메인 및 공동-자극 도메인을 서로 융합시켜 시그널링 영역을 구성한다.
Figure 112022092041666-pat00001
[0082] 일부 경우에서, 대상 CAR은 SEQ ID NO: 9 내지 SEQ ID NO: 13, 표 4 중 어느 하나에 대해 약 50% 내지 약 100% 서열 동일성을 나타내는 서열 또는 그의 일부를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 대상 CAR은 SEQ ID NO: 9 내지 SEQ ID NO: 13의 어느 하나에 대해 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다.
예시적인 힌지, 막관통, 세포내 도메인들을 포괄하는 CAR-T 도메인
SEQ ID NOS: 9, 10, 11, 12, 13
[0083] 일부 경우에서, 대상 CAR은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, 또는 SEQ ID NO:30(표 5). 중 어느 하나에 대해 약 50% 내지 약 100% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 대상 CAR은 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, 또는 SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, 또는 SEQ ID NO:30 중 어느 하나에 대해 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 최대 약 100% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함할 수 있다.
Figure 112022092041666-pat00002
[0084] 일부 경우에서, 항-GPC3 CAR은 다음의 특성들 중 적어도 하나 또는 그 이상을 임의의 조합으로 가질 수 있다: a) 재조합 인간 GPC3에 결합한다; b) 재조합 시노몰구스 원숭이 GPC3에 결합한다; c) HepG2 세포 표면상의 내인성 GPC3에 결합한다; d) 293 세포 표면에서 발현된 시노몰구스 원숭이 GPC3에 결합한다; e) 암세포 표면 상의 내인성 GPC3에 결합한다; f) 간세포 암종 세포 표면 상의 내인성 GPC3에 결합한다; g) HepG2, Hep3B, Huh7, 및 JHH-7로부터 선택된 세포주의 세포 표면 상의 내인성 GPC3에 결합한다; h) 인간 GPC3의 아미노산 25 내지 137 내의 에피토프에 결합한다; i) 인간 GPC3의 아미노산 R358/S359에서의 퓨린 절단 부위에 걸친 에피토프에 결합한다; j) 전장의 성숙한 인간 GPC3에 결합하지만, 인간 GPC3의 N-말단 단편 또는 인간 GPC3의 C-말단 단편에는 결합하지 않는다; k) 인간 GPC3의 아미노산 420 내지 470 내의 에피토프에 결합한다; 1) 인간 GPC3의 아미노산 470 내지 509 내의 에피토프에 결합한다; m) 인간 GPC3에 대한 결합을 놓고 항체 7H1과 경쟁한다; n) 인간 GPC3에 대한 결합을 놓고 항체 4G7와 경쟁한다; o) 인간 GPC3에 대한 결합을 놓고 항체 15G1와 경쟁한다; 인간 GPC3의 C-말단 단편에 결합한다; 및/또는 p) 인간 GPC3에 대한 결합을 놓고 항체 4A11와 경쟁한다.
[0085] 대상 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 도입 유전자는 세포 내로 통합될 수 있다. 예를 들어, 도입 유전자(transgene)는 T 세포와 같은 면역반응 세포 내로 통합될 수 있다. 세포 내로 삽입되는 경우, 도입 유전자는 메신저 RNA (mRNA)의 카피인 상보성 DNA (cDNA) 절편, 또는 게놈 DNA (인트론이 있거나 없는)의 그의 오리지널 영역 내에 위치하는 유전자 자체일 수 있다.
[0086] 예컨대 도입 유전자 서열을 인코딩하는 DNA와 같은 핵산은 세포의 염색체 내로 무작위적으로 삽입될 수 있다. 이러한 무작위 통합은 예컨대 DNA와 같은 핵산을 세포 내로 도입하는 임의의 방법으로부터 결과될 수 있다. 예를 들어, 이러한 방법의 비제한적인 예로는 전기천공, 음파탐지, 유전자 총의 사용, 리포트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, 덴드리머의 사용, 마이크로인젝션 및 아데노바이러스, AAV, 및 레트로바이러스 벡터를 비롯한 바이러스 벡터 및/또는 그룹 II 리보자임의 사용을 들 수 있다.
[0087] 도입 유전자를 인코딩하는 DNA는 전기천공을 통해 세포 내로 도입할 수 있다. DNA는 또한 리포펙션, 감염, 또는 형질전환을 통해서도 세포 내로 도입될 수 있다. 전기천공 및/또는 리포펙션은 일차(primary) 세포를 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 전기천공 및/또는 리포펙션은 일차 조혈 세포를 형질감염시키는데 이용될 수 있다. DNA는 또한 상동성 재조합을 이용하지 않고도 세포 게놈 내로 도입될 수 있다. 일부 경우에서, DNA 옆에는 게놈 내 표적화된 이중가닥 브레이크 영역과 상보적인 조작된 부위들이 인접할 수 있다. 일부 경우에서, DNA는 상동성 재조합 없이 이중가닥 브레이크 영역에 삽입될 수 있도록 폴리핵산으로부터 절단될 수 있다.
[0088] 삽입될 도입 유전자 옆에는 폴리핵산으로부터의 도입 유전자가 이중가닥 브레이크 영역에 삽입될 수 있도록 게놈 내 표적화된 이중가닥 브레이크 부위와 유사한 조작된 부위들이 인접할 수 있다.
[0089] 도입 유전자를 인코딩하는 DNA는 또한 도입 유전자 또는 그의 발현 산물의 존재가 리포터 유전자의 활성화를 통해 감지되도록 리포터 유전자를 포함하게끔 설계될 수 있다. 임의의 리포터 유전자 예컨대 전술한 것들이 사용가능하다. 세포 배양체 내에서 리포터 유전자가 활성화된 세포들을 선택함으로써, 도입 유전자를 함유하는 세포를 선택할 수 있다.
[0090] CAR의 발현은 예를 들어, qPCR 또는 RNA의 수준 측정과 같은 발현 분석법에 의해 검증될 수 있다. 발현 수준은 카피 수를 가리킬 수도 있다. 예를 들어, 발현 수준이 극히 높을 경우, 이것은 두 카피 이상의 CAR이 게놈 내로 통합되었음을 가리키는 것일 수 있다. 또한, 높은 발현은 도입 유전자가 고도로 전사된 영역 내, 예를 들어, 고도로 발현된 프로모터 근방으로 통합되었음을 가리키는 것일 수 있다. 발현은 또한 예컨대 웨스턴 블로팅을 통하는 것과 같은 단백질 수준 측정에 의해서도 검증될 수 있다.
[0091] 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 하나 이상의 도입 유전자를 포함할 수 있다. 하나 이상의 도입 유전자는 항원 상의 적어도 하나의 에피토프 (예컨대, GPC3)를 인식 및 결합하는 CAR 단백질을 발현하거나 또는 항원 상의 돌연변이된 에피토프에 결합할 수 있다. CAR은 기능성 CAR일 수 있다. 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 또한 하나 이상의 CAR을 포함하거나 또는 2차 조작된 수용체와 단일 CAR을 포함할 수 있다.
[0092] 도입 유전자는 자살(suicide) 유전자를 인코딩할 수도 있다. 암 환자에 대한 많은 효과적인 치료를 통해 입증된 바와같이, CAR 면역반응 세포에 반응하는 객관적인 종양 퇴행은 독성을 동반할 수 있다. 일부 경우에서, CAR 면역반응 세포는 표적화된 항원이 종양과 정상 조직들에 의해 공유된 경우 종양과 정상 조직을 식별하지 못할 수 있다 ("온-타겟/오프-종양" 독성). 또 다른 경우, 사이토카인 방출 증후군(CRS)로 알려진 면역계의 전신 섭동(systemic perturbation)이 일어날 수 있다. 상기 CRS는 전신 염증반응 증후군 또는 CAR 면역반응 세포의 급속한 생체내 확산의 결과일 수 있는 사이토카인 스톰을 포함할 수 있다. CRS는 열과 저혈압을 특징으로 하는 병태로서, 심한 경우, 다발성 장기부전으로 이어질 수도 있다. 대부분의 경우, 상기 독성은 면역계의 일반적인 섭동을 야기하여 TNF 알파 및 IL-6과 같은 전염증성 사이토카인을 높은 수준으로 방출시킬 수 있는, 주입된 CAR 면역반응 세포의 생체내 확산과 연관이 있다.
[0093] 일부 경우에서, 정상 조직과 공유된 항원을 표적화하는 CAR 면역반응 세포가 생성되어 이들이 예컨대 수용체를 인코딩하는 mRNA의 전기천공 후 CAR을 일시적으로 발현할 수 있다. 또한, 심각한 온-타겟 독성의 경우 CAR 면역반응 세포의 극적인 제거를 허용할 수 있는 안전 스위치를 포함시킴으로써 CAR 면역반응 세포를 더 조작하려는 현저한 노력이 존재한다. CAR을 인코딩하는 벡터들은 예컨대 유도성 카스파제-9 유전자 (이량화의 화학 인쥬서에 의해 활성화됨) 또는 EGF 수용체 R의 트렁케이트 형태 (모노클로날 항체 세툭시맙에 의해 활성화됨) 또는 RQR8와 같은 안전 스위치와 조합될 수 있다.
[0094] 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 자살 유전자 도입 유전자를 인코딩할 수 있다. 상기 도입 유전자는 또한 CAR 수용체 또는 그 밖의 유사한 수용체를 포함할 수도 있다. 자살 유전자는 CAR 면역반응 세포의 제거를 유도할 수 있다. 자살 유전자는 상기 CAR 면역반응 세포에서 세포자멸사를 유도하는 임의의 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 바이러스 벡터 내 항-GPC3 CAR을 따라 인코딩될 수 있다.
[0095] 하나 이상의 도입 유전자들이 상이한 종들로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 도입 유전자들은 인간 유전자, 마우스 유전자, 래트 유전자, 돼지 유전자, 소 유전자, 개 유전자, 고양이 유전자, 원숭이 유전자, 침팬지 유전자, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도입 유전자는 인간 유전자 서열을 갖는 인간으로부터 유래할 수 있다. 하나 이상의 도입 유전자들은 인간 유전자를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 하나 이상의 도입 유전자들은 아데노바이러스 유전자가 아니다
[0096] 도입 유전자는 전술한 바와 같이, 무작위 또는 부위-특이적 방식으로 면역반응 세포의 게놈 내로 삽입될 수 있다. 예를 들어, 도입 유전자는 면역반응 세포의 게놈 내 무작위적인 위치로 삽입될 수 있다. 이들 도입 유전자들은 기능성일 수 있고 예컨대 게놈 내 어느 부위로든 삽입될 경우 완전히 기능성이다. 예를 들어, 도입 유전자는 그 자신의 프로모터를 인코딩하거나 또는 내인성 프로모터의 제어 하에 놓이게되는 위치로 삽입될 수 있다. 별법으로, 도입 유전자는 유전자의 인트론, 유전자의 엑손, 프로모터, 또는 비-코딩 영역 내로 삽입될 수 있다. 도입 유전자는 예컨대 내인성 면역 체크포인트와 같은 유전자를 파괴하도록 삽입될 수도 있다.
[0097] 때로, 도입 유전자 카피 두 개 이상을 게놈 내 두 개 이상의 무작위적인 위치에 삽입할 수 있다. 예를 들어, 게놈 내 무작위 위치로 복수개의 카피를 삽입할 수 있다. 이것은 도입 유전자가 일단 무작위적으로 삽입된 경우 전체적으로 증가된 발현으로 이어질 수 있다. 별법으로, 도입 유전자의 하나의 카피를 한 유전자에 삽입하고 도입 유전자의 또 다른 카피를 다른 유전제에 삽입할 수 있다. 도입 유전자는 면역반응 세포의 게놈 내 특이적 위치로 삽입되도록 표적화될 수 있다.
[0098] 일부 경우에서, 대상 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 서열을 포함하는 폴리핵산은 플라스미드 벡터 형태일 수 있다. 플라스미드 벡터는 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 프로모터는 구성적(constitutive)일 수 있다. 일부 경우에서, 프로모터는 유도성일 수 있다. 프로모터는 CMV, U6, MND, 또는 EF1a이거나 또는 이들로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에서, 프로모터는 CAR 서열에 인접할 수 있다. 일부 경우에서, 플라스미드 벡터는 스플라이싱 억셉터를 추가로 포함한다. 일부 경우에서, 스플라이싱 억셉터는 CAR 서열에 인접할 수 있다. 프로모터 서열은 PKG 또는 MND 프로모터일 수 있다. MND 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서에 의해 변형된 MoMuLV LTR의 U3 영역을 함유하는 합성 프로모터일 수 있다.
[0099] 일부 경우에서, 대상 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 폴리핵산은 비바이러스 기술에 의해 세포에 전달되도록 조작될 수 있다. 일부 경우에서, 폴리핵산은 품질관리기준 (GMP)을 만족하는 시약일 수 있다.
[00100] 대상 항-GPC3 CAR을 인코딩하는 폴리핵산의 발현은 하나 이상의 프로모터에 의해 제어될 수 있다. 프로모터는 어디에나 있고(ubiquitous), 구성적이며 (관련 유전자의 지속적인 전사를 허용하는 조절되지 않은 프로모터), 조직-특이적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 프로모터에 인접하여 또는 프로모터 근방에 삽입된 도입 유전자의 발현은 조절될 수 있다. 예를 들어, 도입 유전자는 유비쿼터스 프로모터 근처 또는 옆에 삽입될 수 있다. 일부 유비쿼터스 프로모터는 CAGGS 프로모터, hCMV 프로모터, PGK 프로모터, SV40 프로모터 또는 ROSA26 프로모터일 수 있다.
[00101] 프로모터는 내인성 또는 외인성일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 도입 유전자들이 내인성 또는 외인성 ROSA26 프로모터에 인접하여 또는 그 근방에 삽입될 수 있다. 또한, 프로모터는 면역반응 세포에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 도입 유전자들은 돼지의 ROSA26 프로모터에 인접하여 또는 그 근방에 삽입될 수 있다.
[00102] 조직 특이적 프로모터 또는 세포-특이적 프로모터는 발현 위치를 제어하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 도입 유전자들이 조직-특이적 프로모터에 인접하여 또는 그 근방으로 삽입될 수 있다. 조직-특이적 프로모터는 FABP 프로모터, Lck 프로모터, CamKII 프로모터, CD19 프로모터, 케라틴 프로모터, 알부민 프로모터, aP2 프로모터, 인슐린 프로모터, MCK 프로모터, MyHC 프로모터, WAP 프로모터, 또는 Col2A 프로모터일 수 있다.
[00103] 조직 특이적 프로모터 또는 세포-특이적 프로모터는 발현 위치를 제어하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 도입 유전자들이 조직-특이적 프로모터에 인접하여 또는 그 근방으로 삽입될 수 있다. 조직-특이적 프로모터는 FABP 프로모터, Lck 프로모터, CamKII 프로모터, CD19 프로모터, 케라틴 프로모터, 알부민 프로모터, aP2 프로모터, 인슐린 프로모터, MCK 프로모터, MyHC 프로모터, WAP 프로모터, 또는 Col2A 프로모터일 수 있다.
[00104] 유도성 프로모터 역시도 이용가능하다. 원한다면 이들 유도성 프로모터들은 유도체 첨가 또는 제거에 의해 작동시키거나 작동시키지 않을 수 있다. 유도성 프로모터의 비제한적인 예로 Lac, tac, trc, trp, araBAD, phoA, recA, proU, cst-1, tetA, cadA, nar, PL, cspA, T7, VHB, Mx, 및/또는 Trex를 들 수 있다.
[00105] 또한, 발현에 요구되는 것은 아니지만, 도입 유전자 서열은 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보좀 유입 부위, 2A 펩타이드 및/또는 폴리아데닐화 시그널을 인코딩하는 서열을 포함할 수도 있다.
[00106] 일부 사례에서, 도입 유전자는 항-GPC3 CAR이 발현되도록 안전한 항구(safe harbor) 내로 도입 유전자가 삽입되는 대상 항-GPC3 CAR을 인코딩한다. 일부 사례에서, 도입 유전자는 PD1 및/또는 CTLA-4 위치 내로 삽입된다. 또 다른 경우, 도입 유전자는 무작위 삽입을 위해 렌티바이러스 내 세포에 전달되는 반면 PD1- 또는 CTLA-4 특이적인 뉴클리아제는 mRNA로서 공급될 수 있다. 일부 사례에서, 도입 유전자는 안전한 항구 (예컨대 AAVS1, CCR5, 알부민 또는 HPRT)에 특이적인 뉴클리아제를 인코딩하는 mRNA를 따라 레트로바이러스, AAV 또는 아데노바이러스 등의 바이러스 벡터 시스템을 통해 전달된다. 세포들은 PD1 및/또는 CTLA-4 특이적 뉴클리아제를 인코딩하는 mRNA로 처리될 수도 있다. 일부 경우에서, CAR을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 HPRT 특이적 뉴클리아제 및 PD 1- 또는 CTLA-4 특이적 뉴클리아제를 인코딩하는 mRNA와 함께 바이러스 전달계를 통해 공급된다. 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용될 수 있는 CAR에는 1세대, 2세대 및 3세대 디자인을 비롯하여 모든 유형의 이들 키메라 단백질이 포함된다. CCR2 또는 siRNA와 같은 그 밖의 제제들을 PD-1 발현을 감소시키는데 적용시킬 수 있다.
[00107] 일부 경우에서, 도입 유전자를 면역반응 세포 내로 도입시키기 위해 레트로바이러스 벡터 (either 감마-레트로바이러스 또는 렌티바이러스)를 이용할 수 있다. 예를 들어, CAR (예컨대, 항-GPC3 CAR), 또는 GPC3 항원에 결합하는 임의의 수용체를 인코딩하는 도입 유전자, 또는 그의 변이체 또는 단편을 레트로바이러스 벡터에 클로닝하여 그의 내인성 프로모터, 레트로바이러스 장 말단 반복체 또는 목적하는 표적 세포 유형에 특이적인 프로모터로부터 발현을 구동시킬 수 있다. 비-바이러스 벡터 역시도 이용가능하다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템으로는 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포좀이나 폴록사머 등의 전달 비히클과 복합된 핵산을 들 수 있다.
[00108] 몇 가지 바이러스 기반 시스템이 포유동물 세포로의 유전자 전달을 위해 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스들은 유전자 전달 시스템을 위한 간편한 플랫폼을 제공한다. 선택된 유전자는 공지 기술을 이용하여 벡터 내로 삽입되어 레트로바이러스 입자 내에 패키징되리 수 있다. 렌티바이러스 등의 레트로바이러스로부터 유래된 벡터는 도입 유전자의 장기간 안정한 통합 및 딸 세포에서의 그의 증식을 가능케하기 때문에 장기간 유전자 전달을 달성하는데 적합한 도구이다. 이에 더해 렌티바이러스 벡터는 비-증식성 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 쥐의 백혈병 바이러스와 같은 온코-레트로바이러스로부터 유래된 벡터에 비해 유리하다. 이들은 또한 낮은 면역원성을 갖는다는 추가적인 장점도 갖는다. 아데노바이러스 벡터는 표적 세포 게놈 내로 통합하지 않기 때문에 부정적인 통합-관련 이벤트를 우회할 수 있다는 장점도 갖는다.
[00109] 세포는 CAR을 인코딩하는 도입 유전자로 형질감염될 수 있다. 도입 유전자 농도는 약 100 피코그램 내지 약 50 마이크로그램일 수 있다. 일부 경우에서, 세포 내로 도입될 수 있는 핵산 (예컨대, ssDNA, dsDNA, RNA)의 양은 형질감염 효율 및/또는 생존능을 최적화하기 위해 변화될 수 있다. 예를 들어, 전기천공을 위해 각 세포 샘플에 1 마이크로그램의 dsDNA를 첨가할 수 있다. 일부 경우에서, 최적의 형질감염 효율 및/또는 세포 생존능에 필요한 핵산 (예컨대, dsDNA)의 양은 세포 종류에 특이적일 수 있다. 일부 경우에서, 각 샘플에 사용되는 핵산(예컨대, dsDNA)의 양은 형질감염 효율 및/또는 세포 생존능에 직접 대응할 수 있다. 예를 들어, 형질감염의 농도 범위. 벡터에 의해 인코딩된 도입 유전자는 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 일부 경우에서, 벡터에 의해 인코딩된 도입 유전자의 통합은 정방향으로 일어난다. 또 다른 경우, 벡터에 의해 인코딩된 도입 유전자의 통합은 역방향으로 일어난다.
[00110] 일부 경우에서, CAR의 바이러스 전달 등 세포 변형을 위한 출발 세포 밀도는 형질감염 효율 및/또는 세포 생존능을 최적화하도록 변형될 수 있다. 일부 경우에서, 바이러스 벡터에 의한 세포의 형질감염 또는 형질도입을 위한 출발 세포 밀도는 약 1x105 세포 미만일 수 있다. 일부 경우에서, 바이러스 벡터에 의한 세포 변형을 위한 출발 세포 밀도는 적어도 약 1x105 세포 내지 적어도 약 5x107 세포일 수 있다. 일부 경우에서, 형질감염 효율 및/또는 세포 생존능에 최적인 출발 세포 밀도는 세포 종류에 특이적일 수 있다. 예를 들어, 1.5x106 세포의 출발 세포 밀도는 대식세포의 경우 최적일 수 있다 (예컨대, 최고의 생존능 및/또는 형질감염 효율을 제공함). 또 다른 예에서, 5x106 세포의 출발 세포 밀도는 인간 세포의 경우 최적일 수 있다 (예컨대, 최고의 생존능 및/또는 형질감염 효율을 제공함). 일부 경우에서, 어떤 출발 세포 밀도 범위가 주어진 세포 유형에 최적일 수 있다. 예를 들어, 5.6x106 내지 5 x107 세포의 출발 세포 밀도는 T 세포 등 인간 세포의 경우 최적일 수 있다 (예컨대, 최고의 생존능 및/또는 형질감염 효율을 제공함).
[00111] CAR을 인코딩하는 핵산 서열의 바이러스 시스템을 이용한 세포 게놈 내로의 통합 효율은 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.9%보다 높을 수 있다. 일부 경우에서, 조작된 세포의 세포막 상의 CAR의 검출은 유세포 분석으로 측정시 약 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 또는 99.9% 초과일 수 있다.
[00112] 일부 경우에서, 면역반응 세포는 CD45RO (-), CCR7(+), CD45RA (+), CD62L+ (L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및/또는 IL-7Rα+로 구성된 줄기 기억 TSCM 세포일 수 있고, 상기 줄기 기억 세포는 CD95, IL-2Rβ, CXCR3, 및/또는 LFA-1을 발현할 수도 있으며 상기 줄기 기억 세포들에 특징적인 다양한 기능적 속성을 나타낸다. 별법으로, 면역반응 세포는 L-셀렉틴 및 CCR7을 포함하는 중심 기억 TCM 세포일수도 있는데, 여기서 중심 기억 세포는 예컨대 IL-2는 분비하지만, IFNγ 또는 IL-4는 분비하지 못한다. 면역반응 세포는 L-셀렉틴 또는 CCR7을 포함하는 이펙터 기억 TEM 세포일 수도 있으며 예컨대 IFNγ 및 IL-4 등의 이펙터 사이토카인을 생산한다.
[00113] 벡터는 일반적으로 후술하는 바와 같이 전신 투여(예컨대, 정맥내, 복강내, 근육내, 피내 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해 개별 환자에게 생체내 투여될 수 있다. 별법으로, 벡터는 개체 환자로부터 외부 이식된 세포 등 생체외 세포로 전달된 다음 (예컨대, 림프구, T 세포, 소골수 흡입물, 조직 생검물), 대개 벡터가 통합된 세포에 대한 선택 후에 상기 세포를 환자에게 재이식한다.
[00114] 항-GPC3-CAR을 발현하기 위한 적절한 면역반응 세포는 이를 필요로 하는 대상자에게 자가이거나 비-자가인 세포일 수 있다.
[00115] 적절한 면역반응 세포의 급원(source)는 대상자로부터 얻어질 수 있다. 일부 경우에서 T 세포가 얻어질 수 있다. 상기 T 세포는 감염 부위, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직 및 종양으로부터의 PBMCs, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직 및 조직을 비롯한 여러 가지 급원으로부터 얻을 수 있다. 특정 사례에서, T 세포는 FicollTM 분리와 같은, 통상의 기술자에게 알려진 임의의 기술을 이용하여 대상자로부터 채혈된 혈액 유닛으로부터 얻어질 수 있다. 일 구체에에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 혈액은 아페레시스(apheresis)에 의해 얻어진다. 일 구체예에서, 아페레시스에 의해 수집된 세포들은 혈장 분획 제거를 위해 세척하고 세포들을 후속적인 처리 단계를 취해 적절한 완충액 또는 매질 내로 옮길 수 있다.
[00117] 일부 경우에서, 면역 반응 세포는 일차 T 세포, 줄기세포, 또는 원조(progenitor) 세포를 비롯한 일차 세포일 수 있다. 원조 세포는 조혈 원조 세포일 수 있다. 본 발명의 세포는 인간 세포일 수 있다. 적합한 세포는 생체외 확장가능하다. 적합한 세포는 또한 CD45RO(-), CCR7(+), CD45RA(+), CD62L(+), CD27(+), CD28(+), IL-7Rα(+), 또는 이의 조합일 수 있다.
[00118] 일부 경우에서, 적절한 일차 세포는 말초 혈액 단핵세포 (PBMC), 말초 혈액 림프구 (PBL), 및 그 밖의 혈액 세포 서브세트들, 예컨대 비제한적인 예로서, T 세포, 내추럴 킬러 세포, 단구, 내추럴 킬러 T 세포, 단구-전구체 세포, 조혈 줄기세포 또는 비-만능성 줄기세포를 포함한다. 일부 경우에서, 세포는 CD3+ T-세포, CD4+ T-세포, CD8+ T-세포, 또는 임의의 다른 유형의 T-세포와 같은 종양 침윤 세포(TIL) 등 임의의 T-세포를 비롯한 임의의 면역 세포일 수 있다. T 세포는 또한 기억 T 세포, 기억 줄기 T 세포, 또는 이펙터 T 세포를 포함할 수 있다. T 세포는 또한 예컨대 벌크 세포집단으로부터 전혈로부터 T 세포를 선택하는 등에 의해 선택될 수도 있다. T 세포는 또한 벌크 세포집단으로부터 증식될 수도 있다. T 세포는 또한 특정 세포집단 및 표현형으로 편향될 수도 있다. 예를 들어, T 세포는 CD45RO (-), CCR7 (+), CD45RA (+), CD62L (+), CD27 (+), CD28 (+) 및/또는 IL-7Rα (+)를 표현형적으로 포함하도록 편향될 수 있다. CD45RO (-), CCR7 (+), CD45RA (+), CD62L (+), CD27 (+), CD28 (+) 및/또는 IL-7Rα (+)를 포함하는 목록으로부터 선택된 1종 이상의 마커를 포함하는 적합한 세포를 선택할 수 있다. 적합한 세포는 또한 줄기세포를 포함할 수 있으며 이의 예에는 배아 줄기세포, 유도된 다능성 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포 및 중간엽 줄기세포와 같은 줄기세포가 포함된다. 적합한 세포는 인간 세포, 비인간 세포 및/또는 마우스 세포와 같은 임의의 수의 일차 세포를 포함할 수 있다. 적합한 세포는 원조 세포일 수 있다. 적합한 세포는 치료될 대상(예: 환자)으로부터 유래될 수 있다. 적합한 세포는 인간 공여자로부터 유래될 수 있다. 적합한 세포는 CD45RO (-), CCR7(+), CD45RA (+), CD62L+ (L-셀렉틴), CD27+, CD28+ 및 IL-7Rα+로 구성된 줄기 기억 TSCM 세포일 수 있고, 상기 줄기 기억 세포는 CD95, IL-2Rβ, CXCR3, 및 LFA-1를 발현할 수도 있으며, 상기 줄기 기억 세포에 특이적인 수많은 기능적 속성을 나타낸다. 적합한 세포는 L-셀렉틴 및 CCR7을 포함하는 중심 기억 TCM 세포일 수 있으며, 상기 중심 기억 세포는, 예를 들어, IL-2를 분비할 수 있으나, IFNγ 또는 IL-4는 분비하지 못한다. 적합한 세포들은 또한 L-셀렉틴 또는 CCR7를 포함하는 이펙터 기억 TEM 세포일 수 있고, 예를 들어, IFNγ 및 IL-4 등의 이펙터 사이토카인을 생산할 수 있다.
[00119] 일부 경우에서, 방법은 세포의 급속 확장 전에 CD8+ T 세포에 대한 배양된 T 세포를 강화(enriched)하는 것을 포함할 수 있다. IL-2에서 T 세포의 배양 후, T 세포는 예를 들어 CD8 마이크로비드 분리 (예컨대 CliniMACSplus CD8 마이크로비드 시스템 (Miltenyi Biotec)를 사용)를 사용하여 CD4+ 세포를 고갈시키고 CD8+ 세포를 강화시킬 수 있다. 특정 이론에 구애되는 것은 아니나, CD4+, CD25+ 조절 T-세포가 항-종양 반응을 방해할 수 있다고 믿을 수 있다. 따라서, CD8+ T 세포에 대한 배양된 T 세포를 강화하고 CD4+ 세포를 감소시키거나 제거하면 입양 전달된(adoptively transferred) 항-종양 CD8+ 세포의 영향을 개선하고, 환자의 반응 속도를 향상시키며 및/또는 CD4+ 세포에 의한 사이토카인 생산에 의해 나타나는 독성을 감소시킬 수 있다고 믿어진다. 또한, 강화된(enriched) CD8+ "어린" T 세포는 벌크 T 세포보다 임상적 규모의 신속 확장에서 더 신뢰성있게 그리고 더 예측가능하게 거동한다고 믿어질 수 있다.
[00120] 세포는 품질관리기준 (GMP)에 양립가능한 시약일 수 있다. 세포는 이를 필요로 하는 대상자에서 암, 감염, 자가면역 질환 또는 이식편 대 숙주 질환 (GVHD)을 치료하기 위한 조합 요법의 일부일 수 있다. 일부 경우에 있어서, 본 발명의 세포는 단일 요법으로서 이를 필요로 하는 대상자에게 투여될 수 있다.
[00121] 일부 경우에서, 대상 CAR을 발현하는 세포에는 이종 T 세포집단이 포함된다. 일부 경우, 사용된 세포는 크게 CD4와 CD8T 세포의 이종 비율로 구성될 수 있다. 상기 CD4 및 CD8 세포는 순환하는 이펙터 T 세포의 표현형 특성을 가질 수 있다. 상기 CD4 및 CD8 세포는 또한 이펙터-기억 세포의 표현형 특징을 가질 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 세포는 중심-기억 세포일 수 있다.
[00122] 공여자로부터 단리될 수 있는 적합한 세포는 태아, 신생아, 청소년 및 성인 단계의 세포일 수 있으나 이에 제한되지 않는 임의의 발달 단계에 있을 수 있다. 예를 들어, 공여자 면역반응 세포는 성인 인간으로부터 분리될 수 있다. 공여자 인간면역 반응 세포는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1세 미만일 수 있다. 예를 들어, 면역반응 세포는 6세 미만의 인간으로부터 분리될 수 있다. 면역반응 세포는 또한 3세 미만의 인간에게서 분리될 수 있다. 공여자 연령은 10세보다 많을 수 있다.
[00123] 적합한 세포를 얻는 방법은 주어진 마커에 기초하여 선택하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 마커는 GFP, 내성 유전자, 세포 표면 마커 또는 내인성 태그를 포함할 수 있다. 세포는 내인성마커를 사용하여 선택될 수 있다. 적용가능한 세포 선택 기술에는 유세포 분석법 및/또는 자성 컬럼이 포함된다. 선택된 세포는 이어서 대상자에게 주입될 수 있다. 선택된 세포는 많은 수로 증식될 수도 있다. 선택된 세포는 주입전에 증식될 수 있다.
[00124] 환자에서 치료학적으로 효과적으로 되는데 필요한 세포의 양은 세포의 생존능 및 세포가 유전적으로 변형된 효율 (예를 들어, 도입 유전자가 하나 이상의 세포로 통합되는 휴욜 또는 도입 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 발현 수준)에 따라 달라질 수 있다. 일부 경우에서, 유전자 변형 후 세포의 생존능의 산물 (예, 증식) 및 도입 유전자의 통합 효율은 대상자에게 투여하는데 이용가능한 세포의 치료적 분취량에 상응할 수 있다. 일부 경우에서, 유전자 변형 후 세포의 생존능 증가는 환자에서 치료적으로 효과적이기 위한 투여에 필요한 세포의 양의 감소에 대응할 수 있다. 일부 경우에서, 도입 유전자의 하나 이상의 세포로의 통합 효율의 증가는 환자에서 치료적으로 효과적이기 위한 투여에 필요한 세포의 양의 감소에 대응할 수 있다. 일부 경우에서, 치료적으로 효과적으로 되는데 필요한 세포의 양을 결정하는 것은 경시적으로 세포의 생존능의 변화에 대응하는 기능을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 치료적으로 효과적으로 되는데 필요한 세포의 양을 결정하는 것은 시간 의존성 변수(예컨대, 세포 배양 시간, 전기천공 시간, 세포 자극 시간)와 관련하여 도입 유전자의 하나 이상의 세포로의 통합 효율의 변화에 대응하는 기능을 결정하는 것을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 치료적으로 유효한 세포는 세포 표면 상의 항-GPC3 CAR의 약 30% 내지 약 100% 발현을 포함하는 세포집단일 수 있다. 일부 경우에서, 치료적으로 유효한 세포는 세포 표면 상에서 항-GPC3 CAR을 유세포 분석법으로 측정시 약 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 내지 약 99.9% 초과로 발현할 수 있다.
[00125] 다양한 세포들을 전술한 바와 같이 대상자 CAR을 발현하는데 이용할 수 있다. 항-GPC3 CAR은 포유동물 세포와 같은 진핵 세포의 세포질막에 존재할 수 있는데 적절한 포유동물 세포의 예로는 세포독성 세포, T 림프구, 줄기세포, 줄기세포의 자손, 원조세포, 원조세포의 자손 및 NK 세포를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
[00126] 진핵 세포의 세포질막에 존재할 경우, CAR은 그의 결합 표적의 존재 하에 활성적으로 될 수 있다. 예를 들어, 항-GPC3 CAR은 GPC3의 존재 하에 활성적일 수 있다. GPC3와 같은 표적은 막에서 발현될 수 있다. 표적은 또한 가용성(예컨대 세포에 결합하지 않음)일 수 있다. 표적은 표적 세포와 같은 세포의 표면에 존재할 수 있다. 표적은 지질 이중층 등과 같은 고체 표면 상에 제시될 수 있다. 표적은 가용성 항원고 같이 가용성일 수 잇다. 표적은 항원일 수 있다. 항원은 표적 세포와 같은 세포 표면 상에 존재할 수 있다. 항원은 지질 이중층 등과 같은 고형 표면 상에 제시될 수 있다. 일부 경우에서, 표적은 항원의 에피토프일 수 있다. 본원에 개시된 방법에서, 항원은 전형적으로 GPC3이고 GPC3 발현 표적 세포는 암 또는 종양 세포이다.
[00127] 일부 사례에서, CAR은 세포의 세포질막에 존재할 경우, 그리고 그의 표적 결합에 의해 활성화되는 경우, 그의 세포 표면 상에서 CAR의 결합 도메인이 결합하는 항원을 발현하는 표적에 대한 세포에 의한 세포독성 활성을 결과시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 사례에서, 세포는 세포독성 세포 (예컨대, NK 세포 또는 세포독성 T 림프구)일 수 있고 본원의 CAR은 세포의 세포직막에 존재할 경우 그리고 그의 표적 결합에 의해 활성화될 경우, CAR의 결합 도메인이 결합하는 항원을 그의 세포 표면 상에서 발현하는 표적 세포에 대한 세포독성 세포의 세포독성 활성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 일부 사례에서, 세포는 NK 세포 또는 T 림프구일 수 있고, 본원의 CAR은 세포의 세포질막에 존재할 경우 그리고 그의 표적 결합에 의해 활성화될 경우, 세포의 세포독성 활성을, 결합 표적 부재시의 세포의 세포독성 활성에 비해 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 5배, 적어도 10배, 또는 10배 이상 증가시킬 수 있다.
[00128] 일부 경우에서, CAR은 그의 표적 결합에 의해 활성화되는 경우, 증식 및 확장(증가된 세포분열 또는 항-세포자멸사 반응에 기인하는)과 같은 다른 CAR 활성화 관련 이벤트를 일으킬 수 있다. 세포 증식은 현미경로 관찰되는 것처럼 세포 클럼핑 관찰에 의해 시각적으로 측정가능하다. 세포 확장은 혈구계수기 측정에 의해 측정가능하다. 일부 경우에서, CAR-T 세포는 비교 T 세포, 비-CAR T 세포에 비해 증가된 세포 증식 및 확장을 가질 수 있다. 증가된 세포 확장은 비교 세포에 대해 약 1배 내지 약 20배 이상의 세포 확장을 나타낼 수 있다. 증가된 세포 확장은 비교 세포에 대해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 또는 최대 20배의 세포 확장을 나타낼 수 있다. 세포 확장은 경시적으로 측정가능하다. 예를 들어, 세포 확장은 세포 취득으로부터 대상자로의 주입 시간에 걸쳐 일어날 수 있다. 또 다른 경우, 세포 확장은 취득 후 약 1일 내지 최대 약 30일 사이에 일어날 수 있다. 세포 확장은 취득 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 최대 30일에 일어날 수 있다. 일부 경우에서, 대상자로의 주입 전에 세포를 확장시키는데 급속 확장 프로토콜(rapid expansion protocol: REP)을 이용할 수 있다. REP는 일부 경우에서 약 14일에 걸쳐 일어날 수 있다.
[00129] 일부 경우에서, CAR은 그의 표적 결합에 의해 활성화된 경우, 세포 시그널링 변조, 세포 분화 또는 세포 사멸과 같은 다른 CAR 활성화 관련 이벤트를 일으킬 수 있다. 일부 경우에서, 세포 상에서의 CAR 발현은 세포의 세포내 시그널링을 변경할 수 있다. 또 다른 경우, CAR의 발현은 세포 분화를 변경시킬 수 있다.
[00130] 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 GPC3 발현 암 또는 종양을 나타내는 대상자에게 림프구 감소 치료와 동시에 또는 그 후에 투여할 수 있다.
[00131] 일부 측면에서, 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 림프구 감소 치료 후에 투여된다. 이러한 치료는 치료된 대상자에서 순환 림프구를 감소시키거나 도는 숨환 림프구를 실질적으로 고갈시킬 수 있다 (즉, 림프구 감소). 예를 들어, 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 림프구 감소 치료로부터 적어도 1시간 내지 적어도 1주일 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 림프구 감소 치료 후 적어도 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 10시간, 12,시간, 14시간, 16시간, 18시간, 20시간, 24시간, 36시간, 48시간, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 또는 그 보다 더 긴 기간 후에 투여될 수 있다. 일부 경우에서, CAR-T는 림프구 감소 치료로부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6 주일, 또는 그 보다 더 후에 투여될 수 있다.
[00132] 일부 경우에서, 숙주 림프구 감소증은 CAR T 세포와 같은 항-GPC3 CAR 면역 반응 세포의 확장을 용이하게 할 수 있다. 한편으로, 림프구 감소증은 다가오는 입양 세포 전달을 위한 "공간"을 만들 수 있고, 다른 한편으로는 림프구 감소는 항상성 확장을 유도할 수 있다. 후자의 효과는 CAR T 세포와 같은 이펙터 세포 확장을 제한할 수 있는 억제성 사이토카인 (예컨대 TGF-β 및 IL-10)을 정상적으로 분비할 수 있는 내인성 조절 T 세포의 화학치료적 제거를 통해 매개될 수 있다. 일부 경우에서, 림프구 감소 치료는 생체내 항-GPC3 CAR 면역 반응성 세포의 확장을 림프구 감소 치료 없이 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 이용하여 치료하는 경우에 비해 약 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 11배, 12배, 13배, 14배, 15배, 16배, 17배, 18배, 19배, 또는 최대 20배까지 증가시킬 수 있다.
[00133] 또한, 일반적으로 제한된 양으로 존재할 수 있는 IL-7 및 IL-15와 같은 T 세포 성장 항상성 사이토카인은 경쟁이 적고 림프구 형성성 간질 세포에 의한 증가된 생산으로 인해 용이하게 입수할 수 있다. 따라서, 항-GPC3 CAR 면역반응 세포의 주입 전 림프구 감소의 유도는 대상자 치료시 항-GPC3 CAR 면역반응 세포의 효능을 증가시키기 위해 수행될 수 있다. 어떤 경우, 림프구 감소 치료는 림프구 감소 치료 없이 종양 감소 또는 대조군에 의한 약 10% 내지 약 100%의 치료로 측정 된 항종양 효능을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 림프구 감소 치료는 림프구 감소 치료 없이 치료하는 경우에 비해 항-종양 효능을 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 100% 증가시킬 수 있다.
[00134] 림프구 감소는 다양한 수단을 이용하여 수행할 수 있다. 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 투여 전 림프구 감소는 전신조사 (total body irradiation: TBI) 또는 세포독성 약물을 이용하여 수행할 수 있다. 비록 이러한 수단은 수혜자의 림프구 구획을 고갈시키기 위한 의도일 수 있으나 이들은 종양 세포 사멸 및 항원 방출을 촉발함으로써 종양 항원의 제시를 용이하게 할 수도 있다. 이어서, 이들 항원을 테이크업하여 항원 제시 세포(APC)에 의해 제시함으로써 항-GPC3 CAR 면역반응 세포의 활성화를 증강시킬 수 있다.
[00135] 조사 및/또는 화학요법은 숙주 세포의 활성화를 유도하여, TNF-α, IL-1 및 IL-4 등의 전염증성 사이토카인의 방출 및 CD80과 같은 공동-자극 분자의 상향조절을 결과시킬 수 있다. 일부 경우에서, 림프구 감소 치료는 숙주 세포의 활성화에 의한 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 치료법을 개선할 수 있다. 일부 경우에서, 림프구 감소 치료는 공동-자극 분자의 상향조절에 의해 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 치료법을 개선시킬 수 있다. 증강된 APC 기능 및 이용성에 더해, 프리컨디셔닝 요법은 이들 장기에 존재하는 세포의 방사선-유도된 세포자멸사를 통해 점막 배리어의 통합성을 훼손할 수 있다. 장관에 가해진 손상은 LPS와 같은 세균 생성물의 전신 순환으로의 전이를 허용할 수 있다. LPS는 이어서 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 생체내 활성화시켜 항종양 반응을 증강시킬 수 있다. 그러므로, 전염증성 사이토카인 및 미생물 산물은 DC의 활성화 및 성숙을 위한 중요한 "위험 시그널"을 제공함으로 해서 항-GPC3 CAR 면역반응 세포-매개된 종양 치료를 향상시킬 수 있다.
[00136] 일부 경우에서, 림프구 감소 치료는 인간화 항-Tac (항-CD25) 및 ONTAKTM (디프테리아 독소에 컨쥬게이트된 IL-2)를 비롯하여, 인간 내 CD25-발현 세포를 선택적으로 고갈시킬 수 있다.
[00137] 일부 경우에서, 대상자에서 림프구 감소를 실현하기 위해 화학요법제를 투여할 수 있다. 일부 경우에서, 대상자에게 비골수제거 림프-감소 화학요법(nonmyeloablative lympho-reduction chemotherapy)을 실시할 수도 있다. 비골수제거 림프-감소 화학요법은 이러한 치료에 적합한 것이면 어느 것이든 무방하고 임의의 적절한 경로를 통해 투약될 수 있다. 화학요법은 단일 알킬화제 예컨대 사이클로포스파미드 또는 클로람부실, 또는 조합제 예컨대 CVP (사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 프레드니손), CHOP (CVP 및 독소루비신), C-MOPP (사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카르바진), CAP-BOP (CHOP 플러스 프로카르바진 및 블레오마이신), m-BACOD (CHOP 플러스 메토트렉세이트, 블레오마이신 및 류코보린), ProMACE-MOPP (프레드니손, 메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포사이드 및 류코보린 플러스 스탠다드 MOPP), ProMACE-CytaBOM (프레드니손, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 에토포사이드, 시타라빈, 블레오마이신, 빈크리스틴, 메토트렉세이트 및 류코보린) 및 MACOP-B (메토트렉세이트, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 고정량의 프레드니손, 블레오마이신 및 류코보린)일 수 있다.
[00138] 비골수제거 림프-감소 화학요법은 예를 들어, 특히 암이 전이성일 수 있는 GPC3 양성인 경우, 사이클로포스파미드 및 플루다라빈의 투여를 포함할 수 있다. 사이클로포스파미드 및 플루다라빈을 투여하는 바람직한 경로는 정맥내 투여일 수 있다. 마찬가지로, 적절한 투여량의 사이클로포스파미드 및 플루다라빈을 투여할 수 있다. 바람직하게는 약 60mg/kg의 사이클로포스파미드를 2일 동안 투여할 수 있으며, 그 후 약 25m /m2의 플루다라빈을 약 5일 동안 투여할 수 있다.
[00139] 일부 경우에서, 림프구 감소는 면역-매개된 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 거부를 최소화하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 대상자를 사이클로포스파미드(Cy)로 치료한 다음 이어서 플루다라빈 (Flu) 림프구 감소 치료할 수 있다. Cy 등의 화학치료제의 투여량은 약 1 mg/kg 내지 약 200 mg/kg일 수 있다. Cy의 투여량은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 79 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 up 내지 약 200 mg/kg 대상자일 수 있다.
00140] 별법으로, Cy 치료를 위한 예시적인 투여량 및 투여방법은 1-3일, 좋기로는 1-2일 동안 약 0.5~5g/m2/일, 좋기로는 0.6~3g/m2/d, 더욱 좋기로는 1~2 g/m2/일일 수 있다.
[00141] Flu의 투여량은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 79 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 또는 최대 약 200 mg/m2 대상자일 수 있다.
[00142] 별법으로, 플루다라빈의 예시적인 투여량 및 투여방법은 2-10, 3-8 또는 4, 5, 6 또는 7일 동안 약 20~80 mg/m2/일, 좋기로는 25~70mg/m2/일 또는 25~30mg/m2/일일 수 있다.
[00143] 일부 경우에서, Cy와 Flu을 조합 사용할 수도 있다. 예를 들어, 먼저 Flu를 2~8일 또는 3~6일 동안 약 10~60 mg/m2/일 또는 15~50 mg/m2/일 또는 20~30 mg/m2/일의 범위로 투여한 다음 Cy를 1-5 또는 2-3일 동안 약 0.2~1 mg/m2/일 또는 0.3~0.8 mg/m2/일 또는 0.4~0.6 g/m2/일의 양으로 투여할 수 있다.
[00144] 일부 경우에서, 대상자에게 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 주입에 앞서 Cy 및 Flu를 Cy 60 mg/kg x 1회 투여 및 Flu 25 mg/m2 x 3 내지 5회 투여로 하여 치료할 수 있다. 대상자는 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 주입에 앞서 림프구 고갈 처리를 약 0 내지 약 20회 투여받을 수 있다. 대상자는 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 주입에 앞서, Cy 또는 Flu와 같은 림프구 고갈제를 약 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 최대 약 20회 투여받을 수 있다. 또 다른 경우, 대상자는 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 주입과 동시에 Cy 및/또는 Flu와 같은 림프구 고갈제를 공동-투여받을 수 있다 (co-administered). 또 다른 경우, 대상자는 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 투여 후 Cy 및/또는 Flu와 같은 림프구 고갈제를 투여받을 수 있다. 또 다른 경우, 대상자는 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 투여 전, 투여와 동시, 및/또는 투여 후에 림프구 고갈제를 투여받을 수 있다. 대상자는 일부 경우 림프구 감소 치료를 받지 않을 수 있다. 일부 경우에서, 치료경과 동안 림프구 고갈제를 여러 가지 상이한 투여량으로 사용할 수도 있다. 예를 들어, 대상자에게 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 투여 전에 60 mg/kg의 Cy를 투여한 다음 40 mg/kg의 Cy를 항-GPC3 CAR 면역반응 세포와 동시에 투여할 수 있다. 전혈구검사 (CBC)를 수행하여 림프구 감소 정도를 알아보고 추가 투여가 필요한지 결정할 수 있다. 일부 경우에서, Cy는 단독으로 투여될 수도 있다. 또 다른 경우, Flu는 단독으로 투여될 수도 있다. 일부 경우에서, Cy 및 Flu는 치료기간 동안 변경될 수도 있다.
[00145] 림프구 감소는 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 확장을 향상시킬 수도 있다. 림프구 감소는 혈액 내 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 지속성을 향상시킬 수 있다. 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 확장 및 지속성은 항-CAR 항체를 이용하여 유세포 분석에 의해 알아낼 수 있다. 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 지속성은 또한 qPCR에 의해 항-GPC3 CAR 면역반응 세포의 카피 수를 평가함으로써 측정할 수도 있다.
[00146] 일부 경우에서, 대상자는 림프구 감소 치료를 받지 않은 대상자에 비해, 림프구 감소 치료를 받을 경우 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 감소된 투여량으로 투여받을 수 있다.
[00147] 일부 경우에서, 림프구 감소 치료는 경시적으로 투여될 수 있다. 예를 들어 림프구 감소 치료는 약 1분 내지 최대 약 24 시간 동안 실시될 수 있다. 림프구 감소 치료는 1분, 15분, 45분, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 또는 최재 약 24시간 동안 수행될 수 있다. 림프구 감소제는 희석제, 방부제(uroprotectant), 부형제, 또는 이들의 조합과 같은 부가적인 제제와 공동투여될 수 있다. 예를 들어, 소듐 2-머캅토에탄설포네이트(Mesna)를 림프구 감소 치료에 포함시킬 수 있다. 일부 경우에서, 대상자에게 약 2일 동안 250 ml D5W 중 사이클로포스파미드 60 mg/kg/일을 IV 투여하고 2일 동안 Mesna 15 mg/kg/일을 1 시간 투여할 수 있다. Mesna는 다양한 투여량으로 림프구 고갈제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, Mesna는 약 1 mg/kg/일 내지 최대 약 50 mg/kg/일로 투여될 수 있다. Mesna는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 최대 약 50 mg/kg/일로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 비만 또는 소아 대상자의 경우 약물 투여량은 실질적인 체중을 이용하여 산출될 수 있다. 실질적 체중은 실제 체중과 이상적인 체중의 평균일 수 있다. 예를 들어, 이상적인 체중은 남성의 경우 = 50 kg + 2.3(60 인치를 초과하는 인치수)일 수 있다. 이상적인 체중은 여성의 경우 = 45.5 kg + 2.3 (60인치를 초과하는 인치수)일 수 있다. 일부 경우에서, Flu 투여량은 5일 동안 매일 30분씩 25 mg/m2/일 IVPB일 수 있다. 일부 경우에서, Flu 투여는 Cy 투여에 앞서 수행가능하다. 일부 경우에서, Flu 투여는 Cy 투여와 동시에 수행가능하다. 일부 경우에서, Flu 투여는 Cy 투여 후에 수행가능하다. 일부 경우에서, 플루다라빈의 투여는 Cy 및 mesna 투여로부터 약 1 내지 2 시간 후에 개시될 수 있다.
[00148] 전신조사는 방사선치료의 한 형태일 수 있다. 그 명칭이 암시하듯, TBI는 신체 전체에 대한 조사를 포함할 수 있으며, 다만 현대식 실시방법에서는 방사능-유발 폐 손상 위함을 낮추기 위해 폐를 부분적으로 보호할 수 있다. 전신조사는 다양한 선량으로 실시될 수 있다. 예를 들어, 전신조사는 약 10 내지 약 12 Gy로 실시될 수 있다. 일부 경우에서, 전신조사는 전체 선량을 한번에 조사하기 보다, 보다 작은 선량을 수회 세션에 걸쳐 나누어 조사함으로써 수행될 수 있다. 일부 경우에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 최대 10가지 상이한 조사 선량으로 조사할 수 있다.
[00149] 보고된 D0 값―특정한 조혈 줄기세포 유형을 제거하는데 필요한 이온화 조사량은 약 0.5 내지 약 1.4 Gy일 수 있는 반면, 인간 백혈병 세포주의 그것은 약 0.8 내지 약 1.5 Gy인데, 이는 두 가지 세포 모두 방사선 민감성(radiosensitive)임을 가리킨다. 이상적인 투약 스케쥴은 환자의 연령, 질환 및 의도된 치료 유형에 따라 달라질 수 있다. 골수제거 TBI는 약 4일에 걸쳐 하루 약 2 내지 약 3회 치료로 하여 약 8 내지 약 12 분획으로 약 12 내지 약 15 Gy로 주어질 수 있다. 일부 경우에서, 골수제거 TBI는 약 5 내지 약 20 Gy일 수 있다. 골수제거 TBI는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 내지 약 20 Gy일 수 있다. 일부 경우에서, 골수제거 TBI는 약 5 내지 약 20 Gy일 수 있다. 일부 경우에서 골수제거 TBI는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 내지 약 20 분획으로 나누어 주어질 수 있다. 골수제거 치료법은 약 1 내지 약 10일간 수행될 수 있다. 골수제거 치료법은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 최대 약 10일에 걸쳐 수행될 수 있다.
[00150] 일부 경우에서, 저선량 TBI는 약 1 내지 약 4회 분획으로 약 2 내지 약 8 Gy의 선량을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 저선량 TBI는 약 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 또는 최대 약 8 Gy의 선량을 포함할 수 있다. 저선량 TBI는 연령이나 합병증으로 인해 골수제거술을 견딜 수 없는 대상자에게 투여될 수 있다.
[00151] TBI는 TBI에 대해 약 4 내지 약 18 MV의 고에너지 광자 빔의 평행 한 대향 쌍을 사용하여 투여될 수 있다. 일부 경우, 광자 빔은 TBI에 대해 약 1 내지 약 25MV일 수 있다. 광자 빔은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 최대 약 25 MV일 수 있다. TCI는 Varian Clinac iX 또는 Siemens Artiste와 같은 장비를 사용하여 수행할 수 있다.
[00152] 일부 경우에서 투여 속도는 약 5 cGy/분 내지 약 100 cGy/분일 수 있다. 투여 속도는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 79 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 95, 또는 최대 100 cGy/분일 수 있다.
[00153] 일부 경우에서, 특정한 장기를 조사가 진행되는 동안 보호할 수 있다. 예컨대 간, 폐, 뇌, 심장 또는 이들의 조합을 전신 조사 동안 보호할 수 있다.
생물학적 제제(Biological Agents)
[00154] 일부 경우에서, 항체와 같은 생물학적 제제를 이용하여 면역 세포를 고갈시킬 수 있다. 림프구에 대해 세포용해성인 모노클로날 항체(mAbs)는 림프구 감소에 대한 대안적인 수단일 수 있다. 일부 경우, 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 주입 전에 투여될 수 있는 T 세포 림프구 감소용 항체는 주입된 항-GPC3 CAR 면역반응 세포로 급속 주입 및 재축적을 허용하기 위해 생체 내에서 효과적이지만 수명이 짧아야한다. 사용된 항체는 림프구와 같은 세포의 표면에서 발현된 마커로 지향될수 있다. 어떤 경우, 림프-감소 항체는 항-CD3, 항-CD4, 항-CD8, 항-CD45, 항-CD25, 항-CD52 및 이들의 임의의 조합일 수 있다.
[00155] 알렘투주맙(Campath-1H), 보르테조밉, 티모글로불린 (토끼 ATG, Genzyme), ATGAM (말의 ATG, Pfizer), 및 알렘투주맙 (Campath-1H)과 같은 항체들이 이용가능하다. 리툭시맙 (IDEC-C2B8), GA101, CD20에 대한 인간화 IgG1, XmAb5574, CD19에 대한 Fc-조작된 항체, 알레파셉트 (LFA3-Ig), 핑골리모드 (FTY720), 항흉선세포 글로불린 (ATG), 항-CD4 항체, 항-CD3 antibodies, 항-CD8 항체와 같은 항체들 역시도 림프구 감소제로서 이용될 수 있다. 일부 경우에서, 클라드리빈 (2-CdA, Leustatin®), 플루다라빈과 유사한 퓨린 동족체을 사용할 수 있다. 일부 경우에서, 항체 림프구 감소 치료는 알렘투주맙 (항-CD52)과 같은 단일 항체를 포함할 수 있다. 또 다른 경우, 항체-기반 림프구 감소 치료는 알렘투주맙 및 항-CD45와 같이 적어도 두 개의 항체를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 림프구 감소 치료는 복수의 림프구-감소 방법, 예컨대 항체 치료법과 조합된 방사선 요법 또는 방사선 요법과 조합된 화학요법을 포함할 수 있다. 화학요법과 항체 요법도 조합하여 사용될 수 있다.
[00156] 항생제, 항진균제 및 항바이러스제를 림프구 감소 치료 중에 예방 목적으로 대상자에게 투여할 수 있다. 예를 들어, 예방은 매일 Altrex 500mg, Bactrium DS 1정 q M W F 및 매일 Fluconazole 200 mg을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 투약 기간은 절대 림프구 개수(Absolute Lymphocyte count: ALC) 및 절대 호중구 개수(Absolute Neutrophil Count: ANC)가 투약전 베이스라인으로 되돌아가는 기간일 수 있다. 생물학적 제제는 또한 아드리아마이신일 수 있다.
[00157] 1종 이상의 사이토카인을 세포와 함께 도입할 수 있다. 사이토카인은 형질전환된 세포(입약전달된 종양-특이적 세포를 포함함)를 종양 미세환경 내에서 확장하도록 부스팅하는데 이용될 수 있다. 일부 경우에서, IL-2는 본원에서 설명된 세포들의 확장을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. IL-15와 같은 사이토카인을 사용할 수도 있다. IL-2, IL-7, IL-12, 및, L-21, 또는 이들의 임의의 조합 등 면역치료법 분야에서 그 밖의 타당한 사이토카인들도 사용가능하다. 일부 경우에서, 재조합 사이토카인이 사용된다.
[00158] 일부 경우에서, T-세포 성장 인자가 투여될 수 있다. 성장 인자는 임의의 적합한 경로에 의해 투여될 수 있다. 두 개 이상의 T-세포 성장 인자가 투여되는 경우, 이들은 이들은 동시에 또는 순차적으로 임의 순서로 투여될 수 있고 동일한 루트 또는 별개 루트로 투여될 수 있다. T-세포 성장 인자, 예컨대 알데스류킨 (IL-2)은 볼러스 주사처럼 정맥내 투여될 수 있다. IL-2 등의 T-세포 성장 인자의 투여량은 통상의 기술자가 높다고 생각하는 정도이다. 좋기로는, IL-2 약 720,000 IU/kg의 투여량은 관용되기 전까지 하루 3회 투여될 수 있다. 일부 사례에서, IL-2 약 5 내지 약 15회 투여량이 평균 9회 투여량으로 투여된다. T 세포 성장 인자의 투여는 약 0 내지 약 20일 수 있다. T 세포 성장 인자는 1, 2,3, 4, 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18,19, 또는 최대 약 20회 투여될 수 있다.
[00159] IL-2는 정맥내 볼러스로서 720,000 IU/kg (총 체중에 기초)의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에서, IL-2는 15분 기간 동안 투여될 수 잇다. 일부 경우에서, IL-2는 20분 기간 동안 투여될 수 있다. IL-2는 즉시 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 사례에서 IL-2는 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 또는 최대 6시간의 기간 동안 투여될 수 있다.
[00160] 일부 경우에서, IL-2는 세포 주입 24 시간 이내에 시작하여 최대 약 4 일 동안 (최대 12회 투여) 투여될 수 있다. 일부 경우에서, IL-2는 초기 투여 후 최대 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40일 동안 투여될 수 있다.
[00161] IL-2의 투여량은 8시간 마다 투여될 수 있다. 일부 경우, IL-2는 초기 투여 후 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 시간 후에 투여한다. 경우에 따라 독성이 검출되면 IL-2 투약을 중단할 수 있다. 설사, 메스꺼움, 구토, 저혈압, 피부 변화, 식욕 부진, 점막염, 연하 곤란증, 또는 구성적 증상 및 실험실 변화와 같은 Aldesleukin에 공통적인 가역적인 3 등급 독성을 제외하고 환자가 3 등급 또는 4 등급의 독성을 나타내면 투약을 지연시키거나 중단할 수 있다. 일부 경우, 이러한 독성을 지지 조치로 24 시간 이내에 쉽게 되돌릴 수 있다면 추가 투여할 수 있다. 또한, 담당 의사의 재량에 따라 투약을 실시하거나 중단할 수 있다.
[00162] 일부 경우에서, 항-GPC3 CAR을 발현하는 면역반응 세포는 항-GPC3 CAR을 발현하지 않는 비교대상 면역반응 세포에 비해 증가된 항-종양 효능을 가질 수 있다.
[00163] 일부 경우에서, 항-종양 효능은 세포독성 활성을 가리키는 것일 수 있다. 또 다른 경우, 항-종양 효능은 지속성을 가리킬 수 있다. 항-종양 효능은 종양을 표적화하는 세포의 능력을 가리킬 수도 있다. 항-종양 효능은 다양한 시험관내 분석법을 이용하여 측정가능하다. 예를 들어, 세포독성 능력은 인터류킨-2 (IL-2) 또는 인터페론-γ (IFNγ)의 방출을 측정하는 ELISA에 의해 측정할 수 있다. 세포독성 활성은 크롬-51 방출 분석법 또는 공동-배양 분석법과 같은 사멸(killing) 분석법에 의해 측정가능하다. 일부 경우에서, 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 비교대상 세포와 비교하여 증가된 항-종양 효능 및 능력을 나타낼 수 있다.
[00164] 항-GPC3 CAR 치료 효능은 여러가지 방법을 이용하여 평가할 수 있다. 효능은 GPC3-양성 종양과 같은 종양이 제어, 감소 또는 제거되는 정도인 항-종양 효능을 가리킬 수 있다. 치료 효능은 또한 CAR 면역반응 세포 확장, 지속성, 종양-표적화 및 이들의 임의의 조합을 가리키는 것일 수 있다.
[00165] 항-GPC3 CAR T 세포 요법 등 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 요법이 실시될 수 있는 대상자는, 주입 동안, 주입 직후 또는 주입으로부터 수년 후에 평가될 수 있다. 예를 들어, 치료된 대상자는 약 1일 내지 대상자 수명의 기간 동안 평가를 위해 클리닉에 되돌려질 수 있다. 치료된 대상자는 대상 CAR 면역반응 세포 초기 투여로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 또는 최대 90년 후에 평가될 수 있다. 일부 경우에서, 평가 스케쥴은 1일 모니터링, 주간 모니터링, 월간 모니터링 또는 연간 모니터링을 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 대상자는 임상적으로 지시된 것보다 더 자주 볼 수 있다. 평가에는 신체 검사, 화학 평가, 전혈구 검사, 갑상선 패널, 독성 평가, 신체 부위의 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔, 아페레시스, 및 이들의 임의의 조합이 포함될 수 있다.
[00166] 일부 경우에서, 아페레시스는 대상 CAR 면역반응 세포 주입의 투여 전 및 투여로부터 약 1 내지 내지 약 10주후에 수행될 수 있다. 다른 시점에서, 대상자의 말초혈액 림프구 (PBL)는 Ficoll 구배 원심 분리를 사용하여 정제함으로써 전혈로부터 수득가능하다. 말초혈액 단핵세포 (PBMCs)의 분취량은 세포 기능의 면역학적 모니터링을 위해 동결보존될 수 있다. 일부 경우에서, 다양한 검사법은 특이적 용해의 평가를 포함할 수 있고 사이토카인 방출, 대사학 및 바이오에너지 연구(해마를 이용함), 사이토카인 생산의 세포내 FACS, ELISA-스폿 분석 및 림프구 서브셋 분석을 이용하여 대상 CAR 면역반응 세포 치료의 면역학적 상관관계를 평가할 수 있다. 일반적으로, 이러한 분석법에서의 약 2 내지 약 3배 차이는 실제 생물학적 차이를 나타낼 수 있다. 일부 경우에서 시험관내 분석법, 포스트 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 치료법의 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 최대 약 5배의 차이는치료 효과를 나타낼 수 있다.
[00167] 일부 경우에서, 대상 CAR 면역반응 세포 치료는 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔 또는 MRI로 측정시 종양 크기를 적어도 30% 감소시킬 수 있다. 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 치료는 종양 크기를 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 최대 약 100% 감소시킬 수 있다. CAR-T 치료는 CT 스캔으로 측정시 종양을 제거할 수 있다. 일부 경우에서, 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 치료는 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔으로 측정시 종양 병변의 직경의 베이스라인 측정치의 변화폭을 10% 미만으로 하는 종양 크기 안정화를 일으킬 수 있다. 예를 들어, 종양은 항-GPC3 CAR 면역반응 세포의 투여 후 크기가 확장되지 않을 수 있다. 일부 경우에서, 안정화는 치료전 측정치와 비교시 종양 크기 변화가 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만인 것으로 간주할 수 있다.
[00168] 일부 경우에서, 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 효능은 대상자 생존기간 관점에서 고려할 수도 있다. 예를 들어, 항-GPC3 CAR 면역반응 세포, 예컨대 항-GPC3 CAR T 세포로 치료된 대상자는, 상이한 치료법으로 치료된 대상자나 미치료 대상자보다 더 오래 생존가능하다.
[00169] 일부 경우에서, 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 효능은 림프구 감소 치료와 같은 2차 치료의 부가에 의해 향상될 수 있다. 2차 치료는 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 치료법과 상승작용을 일으킬 수 있다. 일부 경우에서, 2차 치료는 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 치료법의 부가적인 효과를 가져올 수 있다. 2차 치료는 림프구 감소 뿐만 아니라 세포 치료법, 항체요법, 화학요법, 방사선요법, 외과수술, 항-혈관신생 치료법, 및 이들의 임의의 조합과 같은 부가적인 형태일 수 있다.
[00170] 치료 반응은 고체 종양에서의 응답 평가 기준(RECIST) 가이드라인 (버젼 1.1)에 의해 제안된 국제 기준을 사용하여 평가될 수 있다. 악성 림프절의 경우 종양 병변의 최대 직경 (일차원 측정)과 최단 직경의 변화가 RECIST 기준에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 측정가능한 병변은 흉부 X선 촬영에서 > 20mm, CT 스캔에서> 10mm, 또는 임상 시험에 의해 캘리퍼스로 > 10mm 이상인 경우 최소한 하나의 차원 (기록될 최장 직경)에서 정확하게 측정될 수 있는 것으로 정의된다. 병리학적으로 확대되고 측정가능한 것으로 간주되기 위해, CT 스캔으로 평가할 때 림프절은 단축에서 > 15 mm일 수 있다. 작은 병변 (가장 긴 직경이 < 10 mm이거나 병리학적 림프절 수가 ≥10 내지 < 15mm 단축임)을 포함한 다른 모든 병변 (또는 병이있는 부위)은 측정 불가능한 질병으로 간주될 수 있다. 뼈 병변, 렙토수막(leptomeningeal) 질병, 복수, 늑막/심낭 삼출, 피부 임파선염(lymphangitis cutis)/폐렴, 염증성 유방 질환은 측정할 수 없는 것으로 간주될 수 있다.
[00171] 모든 관련 장기를 대표하는, 장기 당 최대 2 병변 및 전체 5 병변까지의 모든 측정 가능한 병변을 표적 병변으로 식별하고, 베이스라인에서 기록 및 측정할 수 있다. 표적 병변은 크기(가장 긴 직경의 병변)를 기준으로 선택하고 모든 관련 장기를 대표할 수 있을 뿐만 아니라 재현 가능한 반복 측정에 적합하여야 한다. 때로 가장 큰 병변이 재현가능하게 측정되지 못할 경우가 있는데 이 경우 재현가능하게 측정될 수 있는다음으로 큰 병변을 선택하여야 한다. 모든 표적 병변에 대한 직경의 합 (비-결절성 병변에 대해 가장 길고, 결절성 병변에 대해 단축)을 계산하여 베이스라인 합계 직경으로 보고할 수 있다. 림프절이 합계에 포함될 경우 단축만 합계에 추가될 수 있다. 베이스라인 합계 직경은 질병의 측정 가능한 차원에서 객관적인 종양 퇴행을 특성화하기 위한 레퍼런스로서 사용될 것이다.
[00172] 경우에 따라, 임상 병변은 캘리퍼로 평가시 약 10 mm 직경(예컨대 피부 결절)이고 표재성일 때 (예컨대 피부 결절 및 촉지 림프절) 측정 가능한 것으로 간주될 수 있다. 캘리퍼스로 병변을 측정할 수 없는 경우 CT 스캔이나 MRI를 사용할 수도 있다. 어떤 경우에는 CT 스캔으로 약 5mm 이하의 조직 조각을 얻을 수 있다. CT 스캔은 5mm, 4mm, 3mm, 2mm, 1mm 또는 0.5mm 스캔 두께를 가질 수 있다. CT 스캔의 슬라이스 두께가 5mm보다 큰 경우 측정가능한 병변의 최소 크기는 슬라이스 두께의 두 배가 될 수 있다. 경우에 따라 MRI를 수행하여 대상을 평가할 수도 있다. 이상적으로는 동일한 유형의 스캐너를 사용하여야 하며 치료 효능을 결정할 때 이미지 획득 프로토콜을 가능한 빨리 이전 스캔에 따라야한다. 가능한 경우 신체 검사는 호흡 탐지 기술로 수행하여야 한다. 일부 경우에는 플루오로데옥시글루코스(플루오로deoxyglucose: FDG)-포지트론 방출단층촬영 (PET)을 사용하여 치료 효능을 측정할 수 있다.
[00173] 일단 대상이 평가되면, 표적 병변은 안정한 질병(SD: stable disease), 진행성 질병(PD: progressive disease), 부분적 반응(PR: partial response) 및/또는 완전한 반응(CR: complete response)으로 분류될 수 있다. 가장 작은 직경을 기준으로 할 때 SD는 PR이 되기에는 충분히 감쇠된 것이 아니고 PD라 하기에는 충분히 증가된 것이 아니다. 가장 작은 합계를 기준으로 할 때 (최소값일지도 모르는 베이스라인 합계를 포함할 수 있음) PD는 표적 병변 직경의 합계가 최소 20% 증가한 것으로 간주할 수 있다. 경우에 따라 약 20%의 상대적인 증가 이외에도 합계는 최소 약 5mm의 절대 증가가 입증되어야 한다. 베이스라인 직경 합계를 기준으로 할 때 PR은 표적 병변의 직경의 합계에 있어 적어도 약 30% 감소일 수 있다. CR은 표적 병변의 제거일 수 있다.
[00174] 일부 경우에서, 항-GPC3 CAR T 세포와 같은 항-GPC3-CAR 면역반응 세포의 투여 및 림프구 감소 치료는 항-GPC3-CAR 면역반응 세포의 단독 투여에 비해 적어도 6개월 동안 대상자의 중간 생존 기간을 상승적으로 증가시킬 수 있다, 표 6. 일부 경우, 항 -GPC3-CAR 면역반응 세포 치료 및 림프구 감소 치료의 조합은 항-GPC3-CAR 면역반응 세포를 단독으로 투여하는 경우에 비해, 환자의 생존 기간을 적어도 약 1 개월, 2 개월, 3 개월, 4 개월, 5 개월, 6 개월, 7 개월, 8 개월, 9 개월, 10 개월, 11 개월, 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 6 년, 7 년, 9 년, 10 년 또는 최대 약 25 년 상승적으로 증가시킬 수 있다.
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[00175] 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 의약으로 제형화되어 예컨대 암으로 진단되어 치료를 필요로 하는 인간이나 포유동물을 치료하는데 이용될 수 있다. 이들 의약은 1종 이상의 화학요법제 또는 화학요법 화합물과 함께 인간이나 포유동물에게 공동-투여될 수 있다.
[00176] CAR T 세포와 같은 대상 CAR 면역반응 세포의 세포집단을 통상의 기술자에게 알려진 기술을 이용하여 대상자에게 투여되도록 제형화할 수 있다. CAR 면역반응 세포의 세포집단 을 포함하는 제형은 약학적으로 허용가능한 부형제(들)을 포함할 수 있다. 제형에 포함되는 부형제들은 예를 들어 사용되는 T 세포의 서브집단 및 투여 방식에 따라 상이한 목적을 가질 것이다. 일반적으로 사용되는 부형제의 예로는: 식염수, 완충염수, 덱스트로스, 주사용수, 글리세롤, 에탄올, 및 이의 조합, 안정화제, 가용화제 및 계면활성제, 완충제 및 보존제, 등장화제, 벌크화제 및 윤활제를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. CAR 면역반응 세포의 세포집단을 포함하는 제형은 일반적으로 동물 혈청 등 비인간 성분의 부재 하에 제조 및 배양된 것이다. 제형은 CAR 면역반응 세포의 한 세포집단s, 또는 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 CAR 면역반응 세포집단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 제형은 CAR T 세포 한 집단, 또는 2, 3, 4, 5, 6개이상의 CAR T 세포집단을 포함할 수 있다.
[00177] 항-GPC3 CAR 면역반응 세포의 세포집단(들)을 포함하는 제형은 당업자에게 공지된 방식 및 기술을 사용하여 대상에게 투여될 수 있다. 예시적인 형태에는 정맥 내 주사가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다른 형태로는 종양내, 피내, 피하 (S.C., s.q., sub-Q, Hypo), 근육내 (i.m.), 복강내 (i.p.), 동맥내, 골수내, 심장내, 관절내 (joint), 활액내 (합동 유체 영역), 두개강내, 척수내, 및 경막내(척수액)을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 제형의 비경구 주입 주사에 유용한 임의의 공지 기구를 이용하여 이러한 투여를 실시할 수 있다.
[00178] Formulations comprising population(s) of CAR 면역반응 세포 that are administered to a 대상자에게 투여되는 CAR 면역반응 세포의 세포집단(들)을 포함하는 제형은 특정 증상 또는 질병의 치료 및/또는 예방에 효과적인 몇몇 CAR 면역반응 세포를 포함한다. 그러므로, CAR 면역반응 세포의 치료적으로-효과적인 세포집단을 대상자에게 투여할 수 있다. 일반적으로, 약 1 x 104 내지 약 1 x 1010 CAR 면역반응 세포를 포함하는 제형을 투여한다. 대부분의 경우, 제형은 약 1 x 105 내지 약 1 x 109 CAR 면역반응 세포, 약 5 x 105 내지 약 5 x 108 CAR 면역반응 세포, 또는 약 1 x 106 내지 약 1 x 107 CAR 면역반응 세포를 포함한다. 그러나, 대상자에게 투여되는 CAR 면역반응 세포의 수는 암의 위치, 소스, 동일성, 정도 및 위중도, 치료받을 개체의 연령과 상태 등에 따라 넓은 한도 내에서 가변적일 수 있다. 궁극적으로 사용될 적절한 투여량은 의사가 정한다.
[00179] 종양-표적화 분자들은 CAR 면역반응 세포의 투여 전, 투여와 동시 또는 투여 후에 대상자에게 투여한다. 종양-표적화 분자들은 종양-관련 항원 또는 종양-특이적 항원과의 연계에 의해 대상자에서 표적 세포에 결합한다. 종양-표적화 분자는 통상의 기술자에게 공지인 기술을 이용하여 대상자에게 투여되도록 제형화될 수 있다. 종양-표적화 분자의 제형은 약학적으로 허용가능한 부형제(들)을 포함할 수 있다. 일반적으로 사용되는 부형제의 비제한적인 예로는: 식염수, 완충염수, 덱스트로스, 주사용수, 글리세롤, 에탄올, 및 이의 조합, 안정화제, 가용화제 및 계면활성제, 완충제 및 보존제, 등장화제, 벌크화제 및 윤활제를 들 수 있다.
[00180] 종양-표적화 분자는 통상의 기술자에게 공지인 방식 및 기술을 이용하여 대상자에게 투여될 수 있다. 이의 예로는 정맥내, 복강내 및 종양내 주사를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 그 밖의 방식의 비제한적인 예로는 피내, 피하 (S.C., s.q., sub-Q, Hypo), 근육내 (i.m.), 동맥내, 골수내, 심장내, 관절내 (joint), 활액내 (합동 유체 영역), 두개강내, 척수내, 및 경막내(척수액)을 들 수 있다. 제형의 비경구 주입 주사에 유용한 임의의 공지 기구를 이용하여 이러한 투여를 실시할 수 있다. 일부 경우에서, CAR-T는 간 병변과 같은 종양 병변에 국소적으로 투여할 수 있다. 제형의 비경구 주사 또는 주입에 유용한 임의의 공지 기기를 이용하여 이러한 투여를 실시할 수 있다.
[00181] 종양-표적화 분자를 포함하는 제형을 특정 증상 또는 질병의 치료 및/또는 예방에 효과적인 양으로 대상자에게 투여한다. 일반적으로, 종양-표적화 분자를 적어도 약 0.1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 체중 포함하는 제형을 치료를 필요로 하는 대상자에게 투여한다. 대부분의 경우, 투여 경로, 증상 등을 고려하여, 일일 투여량은 태그된 단백질 약 1 mg/kg 내지 약 100 mg/kg 체중이다. 사용될 적절한 투여량은 의사가 결정한다.
[00182] 일 구체예에서, 면역반응세포-매개된 면역반응을 자극하기 위해 키메라 항원 수용체가 이용된다. 예를 들어, T 세포-매개된 면역반응은 T 세포의 활성화와 연관된 면역반응이다. 활성화된 항원-특이적 세포독성 T 세포는 예컨대 종양 항원을 나타내는 암세포와 같이, 그 표면에 외래 항원의 에피토프를 나타내는 표적 세포에서 세포자멸사를 유도할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 키메라 항원 수용체를 이용하여 포유동물에서 항-종양 면역을 제공한다. T 세포-매개된 면역반응으로 인해 대상자는 항-종양 면역을 발달시킬 것이다.
[00183] 특정 사례에서, 암에 걸린 대상자를 치료하는 방법은 치료를 필요로 하는 대상자에게 암세포와 결합하는 종양-표적화 분자들의 1종 이상의 제형을 투여하는 것, 그리고 종양-표적화 분자와 결합가능하고 암세포 사멸을 유도할 수 있는 대상 CAR 면역반응 세포의 1 이상의 치료적-유효 세포집단을 투여하는 것을 포함한다. 또 다른 구체예는 치료를 필요로 하는 대상자에게 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포의 1 이상의 치료적-유효 세포집단(여기서 CAR 면역반응 세포는 암세포와 결합함)을 투여함으로 해서 암세포 사멸을 유도하는 것을 포함하는, 암에 걸린 대상자를 치료하는 방법에 관한 것일 수 있다.
[00184] 종양-표적화 분자와 조합적으로 항-GPC3 CAR 면역반응 세포 및 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 포함하는 두 제형 모두의 투여 빈도는 치료하고자 하는 질병, CAR 면역반응 세포와 종양-표적화 분자를 포함하는 요소 및 투여 방식을 비롯한 인자들에 따라 달라질 것이다. 각각의 제형은 1일 4, 3, 2, 또는 1회, 또는 격일, 3일에 1회, 4일에 1회, 5일에 1회, 6일에 1회, 1주 1회, 8일에 1회, 9일에 1회, 10일에 1회, 2주에 1회, 1개월에 1회, 및 2개월에 1회 독립적으로 투여될 수 있다.
[00185] 본원에서 "화학요법제" 또는 "화학요법 화합물" 및 이들의 문법적 동의어는 암 치료에 유용한 화학적 화합물일 수 있다. 본원에 개시된 CAR 면역반응 세포와 조합적으로 사용가능한 암 화학요법 치료제의 예로는 유사분열 억제제(빈카 알칼로이드)를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 여기에는 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 NavelbineTM (비노렐빈, 5'-노르안하이드로블라스틴)이 포함된다. 또 다른 구체예에서, 암 화학요법 치료제에는 캄토테신 화합물과 같은 토포이소머라제 I 억제제가 포함된다. 본원에서, "캄토테신 화합물"에는 CamptosarTM (이리노테칸 HCL), HycamtinTM (토포테칸 HCL) 및 캄토테신으로부터 유래된 다른 화합물 및 그의 유사체가 포함된다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 사용가능한 암 화학요법 치료제의 또 다른 카테고리는 포로필로톡신 유도체, 예컨대 에토포사이드, 테니포사이드 및 미토포도지드이다. 본원은 또한 종양 세포내 유전자 물질을 알킬화시키는 알킬화제로서 알려진 그 밖의 암 화학요법 치료제도 포괄한다. 이들의 비제한적인 예로는 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포라미드, 카르무스틴, 부술판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 및 다카르바진을 들 수 있다.　 본원은 화학요법제로서 항대사물질을 포괄한다. 이러한 유형의 제제의 예로는 시토신 아라비노사이드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 아자티오프림, 및 프로카르바진을 들 수 있다.　 본원에 개시된 방법 및 조성물에 사용가능한 암 화학요법 치료제의 또 다른 카테고리에는 항생제가 포함된다.　이의 비제한적인 예로는 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 및 다우노마이신을 들 수 있다. 이들 화합물에 대해 상업적으로 구득가능한 수많은 리포좀 제형이 존재한다. 본 발명은 또한 비제한적인 예로서 항-종양 항체, 다카르바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, 이포스파미드 및 미토잔트론을 비롯한 다른 암 화학요법 치료제도 포괄한다.
[00186] 대상 항-GPCCAR 면역반응 세포는 세포독성/항신생물질 제제 및 항혈관신생 제제를 비롯한 다른 항종양 제제와 조합 투여될 수 있다. 세포독성/항신생물질 제제는 암세포를 공격 밀 사멸시키는 제제로서 정의될 수 있다. 어떤 세포독성/항신생물질 제제는 예컨대, 시스플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌 티오포스포라미드, 카르무스틴, 부술판, 클로람부실, 벨루스틴, 우라실 머스타드, 클로마파진, 및 다카바진과 같이 종양 세포내 유전자 물질을 알킬화시키는 알킬화제일 수 있다.　 그 밖의 세포독성/항신생물질 제제는 예컨대, 시토신 아라비노사이드, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 아자티오프림, 및 프로카르바진과 같이, 종양 세포에 대한 항대사물질일 수 있다. 그 밖의 세포독성/항신생물질 제제는 항생제, 예컨대, 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미트라마이신, 미토마이신, 미토마이신 C, 및 다우노마이신일 수 있다. 이들 화합물에 대한 상업적으로 구득가능한 수 많은 리포좀 제형이 존재한다. 또 다른 세포독성/항신생물질 제제는 유사분열 억제제 (빈카 알칼로이드)일 수 있다.　 여기에는 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 에토포사이드가 포함된다. 잡다한 세포독성/항신생물질 제제에는 탁솔 및 그의 유도체, L-아스파라기나제, 항-종양 항체, 다카르바진, 아자시티딘, 암사크린, 멜팔란, VM-26, 이포스파미드, 미토잔트론, 및 빈데신을 들 수 있다.
[00187] 항-혈관신생 제제 역시도 사용가능하다. 본 발명의 방법 및 조성물에 사용가능한 적절한 항-혈관신생 제제로는 인간화 항체와 키메라 항체를 비롯한 항-VEGF 항체, 항-VEGF 압타머 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 들 수 있다. 혈관신생의 그 밖의 억제제로는 안지오스타틴, 엔도스타틴, 인터페론, 인터류킨 1 (α 및 β포함) 인터류킨 12, 레티노인산 및 메탈로프로티나제-1 및 -2의 조직 억제제(TIMP-1 및 -2)를 들 수 있다. 라족산, 항-혈관신생 활성을 갖는 토포이소머라제 II와 같은 토포이소머라제를 비롯한 소형 분자들도 사용가능하다.
[00188] 대상 항-GPC3CAR 면역반응 세포와 조합적으로 사용가능한 항암제의 기타 예로는: 아시비신; 아클라루비신; 아코다졸 염산염; 아크로닌; 아도젤레신; 알데스류킨; 알트레타민; 암보마이신; 아메탄트론 아세테이트; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아스펄린; 아바스틴; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 벤조데파; 바이칼루타미드; 바이산트렌 염산염; 비스나파이드 디메실레이트; 바이젤레신; 블레오마이신 설페이트; 브레퀴나르 소듐; 브로피리민; 부술판; 칵티노마이신; 칼루스테론; 카라세마이드; 카르베티머; 카르보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 염산염; 카르젤레신; 세데핑골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 사이클로포스파미드; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 염산염; 데시타빈; 덱소르마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 염산염; 드롤록시펜; 드로록시펜 시트레이트, 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로니틴 염산염; 엘사미트루신; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 염산염; 에르불로졸; 에소루비신 염산염; 에스트라무스틴; 에스트라무스틴 포스페이트 소듐; 에타니다졸; 에토포사이드; 에토포사이드 포스페이트; 에토프린; 파드로졸 염산염; 파자라빈; 펜레티나이드; 플록스우리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 소듐; 겜시타빈; 겜시타빈 염산염; 히드록시우레아; 이다루비신 염산염; 이포스파미드; 일모포신; 인터류킨 II (재조합 인터류킨 II, 또는 rIL2를 포함한다), 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-n1; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-I; 인터페론 감마-I b; 이프로플라틴; 이리노테칸 염산염; 란레오타이드 아세테이트; 레트로졸; 류프롤라이드 아세테이트; 리아로졸 염산염; 로메트렉솔 소듐; 로무스틴; 로속산트론 염산염; 마소프로콜; 마이탄신; 메클로레타민 염산염; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 소듐; 메토프린; 메투레데파; 미틴도마이드; 미토카르신; 미토크로민; 미토길린; 미토말신; 미토마이신; 미토스퍼; 미토탄; 미토잔트론 염산염; 미코페놀산; 노코다졸; 노갈라마이신; 오르마플라틴; 옥시수란; 파클리탁셀; 페가스파르가제; 펠리오마이신; 펜타무스틴; 페프로마이신 설페이트; 퍼포스파미드; 피포브로만; 피포술판; 피로잔트론 염산염; 플리카마이신; 플로메스탄; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진 염산염; 퓨로마이신; 퓨로마이신 염산염; 피라조퓨린; 리보프린; 로글레티미드; 사핀골; 사핀골 염산염; 세무스틴; 심트라젠; 스파포세이트 소듐; 스파르소마이신; 스피로게르마늄 염산염; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 술로페누르; 탈리소마이신; 테코갈란 소듐; 테가푸르; 텔로잔트론 염산염; 테모포르핀; 테니포사이드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조퓨린; 티라파자민; 토레미펜 시트레이트; 트레스톨론 아세테이트; 트리시리빈 포스페이트; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트리프토렐린; 투불로졸 염산염; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오타이드; 버테포르핀; 빈블라스틴 설페이트; 빈크리스틴 설페이트; 빈데신; 빈데신 설페이트; 비네피딘 설페이트; 빈글리시네이트 설페이트; 빈류로신 설페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 설페이트; 빈졸리딘 설페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 염산염을 들 수 있다.　그 밖의 항암 약물의 비제한적인 예로는: 20-epi-1,25 디히드록시비타민 D3; 5-에티닐우라실; 아비라테론; 아클라루비신; 아실풀벤; 아데시페놀; 아도젤레신; 알데스류킨; ALL-TK 길항제; 알트레타민; 암바무스틴; 아미독스; 아미포스틴; 아미노레불린산; 암루비신; 암사크린; 아나그렐리드; 아나스트로졸; 안드로그라폴라이드; 혈관신생 억제제; 길항제 D; 길항제 G; 안타렐릭스; 항-도설라이징 모르포제네틱 단백질-1; 항안드로겐, 전립선 암종; 항에스트로겐; 항네오플라스톤; 안티센스 올리고뉴클레오타이드; 아피디콜린 글리시네이트; 세포자멸사 유전자 변형제; 세포자멸자 조절제; 아푸린산; ara-CDP-DL-PTBA; 아르기닌 데아미나제; 아술라크린; 아타메스탄; 아트리무스틴; 악시나스타틴 1; 악시나스타틴 2; 악시나스타틴 3; 아자세트론; 아자톡신; 아자티로신; 바카틴 III 유도체; 발라놀; 바티마스타트; CAR/ABL 길항제; 벤조클로린스; 벤조일스타우로스포린; 베타 락탐 유도체; 베타-알레틴; 베타클라마이신 B; 베툴린산; bFGF 억제제; 바이칼루타미드; 비산트렌; 비스아지리디닐스퍼민; 비스나파이드; 비스트라텐 A; 비젤레신; 브레플레이트; 브로피리민; 부도티탄; 부티오닌 설폭시민; 칼시포트리올; 칼포스틴 C; 캄토테신 유도체; 카나리폭스 IL-2; 카페시타빈; 카르바옥사미드-아미노-트리아졸; 카르복시아미도트리아졸; CaRest M3; CARN 700; 연골 유래 억제제; 카르젤레신; 카제인 키나아제 억제제 (ICOS); 카스타노스퍼민; 세크로핀 B;, 세트로렐릭스; 클로린스; 클로로퀴녹살린 설폰아미드; 시카프로스트; 시스-포르피린; 클라드리빈; 클로미펜 유사체; 클로트리마졸; 콜리스마이신 A; 콜리스마이신 B; 콤브레스타틴 A4; 콤브레스타틴 유사체; 코나제닌; 크람베시딘 816; 크리스나톨; 크립토피신 8; 크립토피신 A 유도체; 쿠라신 A; 시클로펜타안트라퀴논; 시클로플라탐; 시페마이신; 시타라빈 옥포스페이트; 세포용해 인자; 시토스타틴; 다클릭시맙; 데시타빈; 데히드로디데민 B; 데스로렐린; 덱사메타손; 덱시포스파미드; 덱스라족산; 덱스베라파밀; 디아지쿠온; 디데민 B; 디독스; 디에틸노르스퍼민; 디히드로-5-아자시티딘; 디히드로탁솔, 9-; 디옥사미신; 디페닐 스피로무스틴; 도세탁셀; 도코사놀; 돌라세트론; 독시플루리딘; 드롤록시펜; 드로나비놀; 듀오카르마이신 SA; 엡셀렌; 에코무스틴; 에델포신; 에레콜로맙; 에플로니틴; 엘레멘; 에미테푸어; 에피루비신; 에프리스테라이드; 에스트라무스틴 유사체; 에스트로겐 작용제; 에스트로겐 길항제; 에타니다졸; 에토포사이드 포스페이트; 엑세메스탄; 파드로졸; 파자라빈; 펜레티나이드; 필그라스팀; 피나스테라이드; 플라보피리돌; 플레젤라스틴; 플루아스테론; 플루다라빈; 플루오로다우노루비신 염산염; 포르페니멕스; 포르메스탄; 포스트리에신; 포테무스틴; 가돌리늄 텍사피린; 갈륨 니트레이트; 갈로시타빈; 가니렐릭스; 젤라티나제 억제제; 겜시타빈; 글루타티온 억제제; 헵설팜; 헤레굴린; 헥사메틸렌 비사세타미드; 하이퍼리신; 이반드론산; 이다루비신; 이독시펜; 이드라만톤; 일모페신; 일로마스타트; 이미다조아크리돈; 이미퀴모드; 면역자극 펩타이드; 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 억제제; 인터페론 작용제; 인터페론; 인터류킨; 이오벤구안; 요오도독소루비신; 이포메아놀, 4-; 이로플락트; 이르소글라딘; 이소벤가졸; 이소호모할리콘드린 B; 이타세트론; 자스플라키놀라이드; 카할라이드 F; 라멜라린-N 트리아세테이트; 란레오타이드; 레이나마이신; 레노그라스팀; 렌티난 설페이트; 렙톨스타틴; 레트로졸; 백혈병 억제인자; 백혈구 알파 인터페론; 류프롤라이드 + 에스트로겐 + 프로게스테론; 류프로렐린; 레바미솔; 리아로졸; 선형 폴리아민 유사체; 친지성 이당류 펩타이드; 친지성 백금 화합물; 리소클리나미드 7; 로바플라틴; 롬브리신; 로메트렉솔; 로니다민; 로소잔트론; 로바스타틴; 록소리빈; 류토테칸; 류테튬 텍사피린; 리소필린; 용해성 펩타이드; 마이탄신; 만노스타틴 A; 마리마스타트; 마소프로콜; 마스핀; 마트리라이신 억제제; 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제; 메노가릴; 메르바론; 메테렐린; 메티오니나제; 메토클로프라미드; MIF 억제제; 미페프리스톤; 밀테포신; 미리모스팀; 미스맷치된 이중가닥 RNA; 미토구아존; 미토락톨; 미토마이신 유사체; 미토나파이드; 미토톡신 섬유아세포 성장인자-사포린; 미토잔트론; 모파로텐; 몰그라모스팀; 모노클로날 항체, 인간 코리오닉 고나도트로핀; 모노포스포릴 지질 A + 미오박테리움 세포벽 sk; 모피다몰; 다제내성 유전자 억제제; 다중 종양 억제제 1-기반 치료법; 머스타드 항암제; 미카퍼옥사이드 B; 미코박테리알 세포벽 추출물; 미리아포론; N-아세틸디날린; N-치환된 벤즈아미드; 나파렐린; 나그레스팁; 날록센 + 펜타조신; 나파빈; 나프테르핀; 나르토그라스팀; 네다플라틴; 네모루비신; 네리드론산; 중성 엔도펩티다제; 닐루타미드; 니사마이신; 산화질소 조절제; 니트록사이드 항산화제; 니트룰린; O6-벤질구아닌; 옥트레오타이드; 오키세논; 올리고뉴클레오타이드; 오나프리스톤; 온단세트론; 온단세트론; 오라신; 경구 사이토카인 인듀서; 오르마플라틴; 오사테론; 옥살리플라틴; 옥사우노마이신; 파클리탁셀; 파클리탁셀 유사체; 파클리탁셀 유도체; 팔라우아민; 팔미토일리족신; 파미드론산; 파낙시트리올; 파노미펜; 파라박틴; 파젤립틴; 페가스파르가제; 펠데신; 펜토산 폴리설페이트 소듐; 펜토스타틴; 펜트로졸; 퍼플루브론; 퍼포스파미드; 페릴릴 알코올; 페나지노마이신; 페닐아세테이트; 포스파타제 억제제; 피시바닐; 필로카르핀 염산염; 피라루비신; 피리트렉심; 플라세틴 A; 플라세틴 B; 플라스미노겐 활성화제 억제제; 백금 복합체; 백금 화합물; 백금-트리아민 복합체; 포르피머 소듐; 포르피로마이신; 프레드니손; 프로필 비스-아크리돈; 프로스타글란딘 J2; 프로테아좀 억제제; 단백질 A-기반 면역조절제; 단백질 키나아제 C 억제제; 단백질 키나아제 C 억제제, 미크로알갈; 단백질 티로신 포스파타제 억제제; 퓨린 뉴클레오사이드 포스포릴라제 억제제; 푸르푸린; 피라졸로아크리딘; 피리독실화 헤모글로빈 폴리옥시에틸렌 컨쥬게이트; raf 길항제; 랄티트렉세드; 라모세트론; ras 파르네실 단백질 트랜스퍼라제 억제제; ras 억제제; ras-GAP 억제제; 레텔립틴 데메틸레이티드; 레늄 Re 186 에티드로네이트; 리족신; 리보자임; RII 레티나미드; 고글레티마이드; 로히투킨; 로무르타이드; 로퀴니멕스; 루비기논 B1; 루복실; 사핀골; 사인토핀; SarCNU; 사르코피톨 A; 사르그라모스팀; Sdi 1 미메틱스; 세무스틴; 세네센스 유래된 억제제 1; 센스 올리고뉴클레오타이드; 시그널 형질도입 억제제; 시그널 형질도입 조절제; 단일사슬 항원 결합 단백질; 시조피란; 소부족산; 소듐 보로캅테이트; 소듐 페닐아세테이트; 솔베롤; 소마토메딘 결합 단백질; 소네르민; 스파르포식산; 스피카마이신 D; 스피로무스틴; 스플레노펜틴; 스폰지스타틴 1; 스쿠알라민; 줄기세포 억제제; 줄기세포 분역 억제제; 스티피아미드; 스트로멜리신 억제제; 설피노신; 초고활성 혈관활성 장 펩타이드 길항제; 수라디스타; 수라민; 스웨인소닌; 합성 글리코사미노글리칸; 탈리무스틴; 타목시펜 메트요오다이드; 타우로무스틴; 타자로텐; 테코갈란 소듐; 테가푸어; 텔루라피릴륨; 텔로머라제 억제제; 테모포르핀; 테모졸로마이드; 테니포사이드; 테트라클로로데카옥사이드; 테트라조민; 탈리블라스틴;티오코랄린; 트롬보포이에틴; 트롬보포이에틴 미메틱; 티말파신; 티모포이에틴 수용체 작용제; 티모트리난; 갑상선 자극호르몬; 틴 에틸 에티오푸르푸린; 티라파자민; 티타노센 바이클로라이드; 톱센틴; 토레미펜; 토티포펜트 줄기세포 인자; 번역 억제제; 트레티노인; 트리아세틸우리딘; 트리시리빈; 트리메트렉세이트; 트립토렐린; 트로피세트론; 투로스테라이드; 티로신 키나아제 억제제; 티르포스틴; UBC 억제제; 우베니멕스; 비뇨생식동-유래된 성장 억제인자; 유로키나아제 수용체 길항제; 바프레오타이드; 바리올린 B; 벡터 시스템; 에리트로사이트 유전자 치료법; 벨라레솔; 베라민; 베르딘스; 베르테포르핀; 비노렐빈; 빈잘틴; 비탁신; 보로졸; 자노테론; 제니플라틴; 질라스코르브; 및 지노스타틴 스티말라머를 들 수 있다. 일 구체예에서, 항암 약물은 5-플루오로우라실, 탁솔, 또는 류코보린이다.
[00189] 일부 경우에서, 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 주사, 카테터 등에 의해 도입될 수 있다. 일부 경우에서, 예컨대 IL-2, IL-3, IL-6, 및 IL-11와 같은 인터류킨 및 기타 인터류킨와 같은 인터류킨, 콜로니 자극인자 예컨대 G-, M- 및 GM-CSF, 인터페론, 예컨대 감마-인터페론 및 에리트로포이에틴와 같은 면역자극제도 포함될 수 있다. 일부 경우에서, 대상자는 CAR-T, 면역고갈제 및 면역자극제에 의해 치료될 수 있다. 대상자는 CAR-T 세포 생성물의 성능을 부스트하기 위해 IL-2에 의해 치료될 수 있다. 일부 경우에서, 면역자극제는 재조합 단백질일 수 있다. 면역자극제는 또한 단백질의 활성부분을 포함할 수도 있다. 일부 경우에서, 면역자극제는 단백질 부분만을 포함할 수도 있다. 단백질 부분은 단백질의 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 최대 약 100%일 수 있다.
[00190] 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포, 예컨대 CAR T 세포를 포함하는 조성물은 멸균 액상 제제, 예컨대 등장성 수용액, 현탁액, 에멀젼, 분산물, 또는 점성 조성물로서 간편하게 제공될 수 있으며 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액상 제제는 보통 겔, 기타 점성 조성물 및 고형 조성물보다 제조하기 쉽다. 또한, 액상 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기가 다소 더 편리하다. 이와 반대로 점성 조성물은, 특정 조직과 더 오랫동안 접촉하도록 하기 위해 적절한 점도 범위를 제공하도록 조성될 수 있다. 액상 도는 점성 조성물은 예컨대 물, 식염수, 포스페이트 완충염수, 폴리올(예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적절한 혼합물을 비롯하여 용매 또는 분산 매질일 수 있는 캐리어를 포함할 수 있다. 멸균된 주사용액은 본 발명을 실시하는데 사용되는 유전자 변형된 CAR 면역반응 세포를 필요에 따라 다양한 양의 다른 성분들과 함께 필요량의 적절한 용매에 통합시킴으로써 제조가능하다. 이러한 조성물은 적절한 담체, 희석제, 또는 부형제 에컨대 멸균수, 생리식염수, 글루코스, 덱스트로스 등과 혼합될 수 있다. 조성물은 또한 동결건조될 수도 있다. 조성물은 또한 투여경로 및 원하는 제법에 따라 보조물질 예컨대 습윤제, 분산제 또는 유화제 (예컨대, 메틸셀룰로스), pH 완충제, 겔화제 또는 점도증강 첨가제, 보존제, 향료, 색소 등을 포함할 수도 있다. 표준 텍스트 예컨대 본원에 참조병합된 문헌 ["REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 제17판, 1985]을 참조로 과도한 실험없이 적절한 제제를 만들 수 있다. 조성물의 안정성 및 멸균성을 증강시키기 위한 다양한 조성물, 예컨대 항미생물 보존제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 완충제도 첨가할 수 있다. 미생물의 작용은 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등에 의해 방지할 수 있다. 주사가능한 약물 형태의 연장된 흡수는 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수지연제를 사용함으로써 달성할 수 있다. 그러나 본 발명에 따라 사용되는 임의의 비히클, 희석제 또는 첨가제는 유전자 변형된 CAR 면역반응 세포 또는 이의 전구세포들과 양립가능하여야 한다.
[00191] 일부 경우에서, 조성물은 등장성일 수 있다. 즉 조성물은 혈액 및 누액과 동일한 삼투압을 가질 수 있다. 본 발명의 조성물의 소망되는 등장성은 염화나트륨 또는 기타 약학적으로 허용가능한 물질 예컨대 덱스트로스, 붕산, 타르타르산 나트륨, 프로필렌 글리콜 또는 기타 무기 또는 유기 용질을 이용함으로써 달성가능하다. 염화나트륨은 나트륨 이온을 함유하는 완충제로서 특히 바람직하다. 필요하다면 조성물의 점도는 약학적으로 허용가능한 농후제를 이용하여 선택된 수준으로 유지할 수 있다. 메틸셀룰로스가 바람직한데 이는 이것이 쉽고도 경제적으로 입수가능하고 작업하기 쉽기 때문이다. 그 밖의 적절한 농후제의 예로는 잔탄검, 카르복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 카르보머 등을 들 수 있다. 농후제의 바람직한 농도는 선택된 제제에 따라 달라진다. 중요한 점은 선택된 점도를 달성할 수 있는 양을 사용하여야 한다는 것이다. 적절한 담체 및 기타 첨가제의 선택은 정확한 투여 경로 및 예컨대 액체 투여 제형과 같은 특정 투여 제형의 속성에 따라 달라질 것임이 명백하다 (예컨대 조성물을 용액, 현탁액, 젤 또는 기타 액상 제형 예컨대 서방형 또는 액체-충전 제형으로 할 것인지 여부).
[00192] 일부 경우에서, 예를 들어, 암을 치료하기 위한 조성물, 제형 및 방법에서, 투여되는 조성물 또는 제형의 유닛 투여량은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 mg일 수 있다.　 일부 경우에서, 투여되는 조성물 또는 제형의 총량은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100 g일 수 있다.
[00193] 일부 경우에서, 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포, 예컨대 CAR T 세포를 포함하는 의약 조성물은 단독으로 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께 임의의 경로에 의해 투여될 수 있고 이러한 투여는 단회 투여 또는 다회 투여로 수행가능하다. 더욱 구체적으로, 의약 조성물은 정제, 캡슐, 로젠지, 트로키, 핸드 캔디, 분말, 스프레이, 수성 현탁액, 주사가능한 용액, 엘릭서, 시럽 등의 형태로 다양한 약학적으로 허용가능한 불활성 담체와 조합될 수 있다. 또한, 이러한 경구용 의약 제형은 다양한 유형의 흔히 사용되는 감미료 및/또는 향료에 의해 적절히 가미될 수 있다.
[00194] 예를 들어, 세포는 비제한적인 예로서 항바이러스 요법, 시도포비어 및 인터류킨-2 또는 시타라빈(ARA-C라고도 알려짐)과 같은 제제를 이용한 치료 등 임의의 가짓수의 관련 치료 방식과 연계하여 (예컨대 전, 동시 또는 후) 환자에게 투여될 수 있다. 일부 경우에서, 조작된 세포는 화학요법, 조사, 면역억제제 예컨대 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 미코페놀레이트, 및 FK506, 항체 또는 기타 면역제거제 예컨대 CAMPATH, 항-CD3 항체 또는 기타 항체 요법, 시톡신, 플루다리빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코플리에놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 및 방사선조사와 조합 사용될 수 있다. 조작된 세포 조성물은 또한 환자에게 골수이식, 플루다라빈, 외부-빔조사요법(XRT), 사이크로포스파미드과 같은 화학요법제 또는 항체 예컨대 OKT3 또는 CAMPATH를 이용하는 T 세포 제거요법과 함께 연계하여 환자에게 투여될 수도 있다 (예컨대 전, 동시 또는 후). 일부 경우에서, 조작된 세포 조성물은 예컨대 리툭산과 같이 CD20과 반응하는 제제 등 B-세포 제거 요법 후에 투여될 수 있다. 예를 들어, 대상자를 고투여량 화학요법을 이용하여 표준 치료한 다음 말초 혈액 줄기세포를 이식할 수 있다. 특정한 경우, 이식 후에, 대상자에게 예컨대 확장된 조작된 세포와 같은 조작된 세포를 주입할 수 있다. 이에 더해, 확장된 조작된 세포는 외과수술 전 또는 후에 투여될 수 있다. 본원에 설명된 임의의 방법에 의해 수득된 조작된 세포는 숙주 대 이식편(HvG) 거부 및 이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 환자치료를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 숙주 대 이식편(HvG) 거부 및 이식편 대 숙주 질환(GvHD)의 치료를 필요로 하는 환자의 치료 방법으로서 상기 환자에게 불활성화된 TCR 알파 및/또는 TCR 베타 유전자를 포함하는 조작된 세포의 유효량을 투여하는 방법을 구상할 수 있다.
키트
[00195] 본원에 따라 조성물을 포함하느 키트가 제공된다. 본원에는 또한 암, 병원체 감염, 면역질환 또는 동종이식의 치료 또는 예방을 위한 키트도 개시된다. 일 구체예에서, 키트는 1종 이상의 항-GPC3 CAR을 단위 투여 제형으로 포함하는 세포의 유효량을 함유하는 치료 또는 예방용 조성물을 포함할 수 있다. 일부 구체에에서, 키트는 치료 또는 예방용 백신을 함유할 수 있는 멸균 용기를 포함하되; 이러한 용기는 박스, 앰풀, 보틀, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터팩 또는 기술분야에 알려진 기타 적절한 용기 유형일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 라미네이트된 종이, 금속 호일, 또는 의약을 고정하는데 적합한 기타 재질로 만들어질 수 있다. 일부 경우에서, 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포, 예컨대 CAR T 세포는 암, 병원체 감염, 면역질환 또는 동종 이식의 위험이 있거나 이러한 상태에 처해진 대상자에게 CAR 면역반응 세포를 투여하기 위한 지침을 함께 제공할 수 있다. 이러한 지침은 일반적으로 암, 병원체 감염, 면역질환 또는 동종 이식의 치료 또는 예방을 위한 조성물의 이용에 관한 정보를 포함한다. 일부 경우에서, 키트는 약 1 x 104 세포 내지 약 1 x 1012 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에서 키트는 적어도 약 1x105세포, 적어도 약 1x106세포, 적어도 약 1x107 세포, 적어도 약 4x107 세포, 적어도 약 5x107 세포, 적어도 약 6x107 세포, 적어도 약 6x107 세포, 적어도 약 8x107 세포, 적어도 약 9x107 세포, 적어도 약 1x108 세포, 적어도 약 2x108 세포, 적어도 약 3x108 세포, 적어도 약 4x108 세포, 적어도 약 5x108 세포, 적어도 약 6x108 세포, 적어도 약 6x108 세포, 적어도 약 8x108 세포, 적어도 약 9x108 세포, 적어도 약 1x109 세포, 적어도 약 2x109 세포, 적어도 약 3x109 세포, 적어도 약 4x109 세포, 적어도 약 5x109 세포, 적어도 약 6x109 세포, 적어도 약 6x109 세포, 적어도 약 8x109 세포, 적어도 약 9x109 세포, 적어도 약 1x1010 세포, 적어도 약 2x1010 세포, 적어도 약 3x1010 세포, 적어도 약 4x1010 세포, 적어도 약 5x1010 세포, 적어도 약 6x1010 세포, 적어도 약 6x1010 세포, 적어도 약 8x1010 세포, 적어도 약 9x1010 세포, 적어도 약 1x1011 세포, 적어도 약 2x1011 세포, 적어도 약 3x1011 세포, 적어도 약 4x1011 세포, 적어도 약 5x1011 세포, 적어도 약 6x1011 세포, 적어도 약 6x1011 세포, 적어도 약 8x1011 세포, 적어도 약 9x1011 세포, 또는 적어도 약 1x1012 세포를 포함한다. 예를 들어, 약 5x1010 세포가 키트에 포함될 수 있다. 또 다른 예에서, 키트는 3x106 세포를 포함할 수 있다; 세포는 약 5x1010 세포까지 확장가능하며 대상자에게 투여될 수 있다.
[00196] 일부 경우에서, 키트는 동종 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 키트는 게놈 변형을 포함할 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 키트는 "기성품(off-the-shelf)" 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 키트는 임상 용도로 확장될 수 있는 세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에서, 키트는 연구 목적의 내용물들을 포함할 수 있다.
[00197] 일부 경우에서, 지침은 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 치료제에 대한 설명; 신생물질, 병원체 감염, 면역질환 또는 동종 이식 또는 그의 증상의 치료 또는 예방을 위한 투여 스케쥴 및 투여방법; 주의사항; 경고; 지침; 카운터-지침; 오남용 정보; 부작용; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 레퍼런스. 지침은 용기(존재할 경우) 상에 직접 인쇄될 수도 있고, 또는 용기 내에 또는 용기에 적용되는 라벨로서 또는 별도 시트, 팜플렛, 카드, 또는 폴더로서 제공될 수도 있다. 일부 경우에서, 지침은 화학요법제 투여 후 항-GPC3 CAR T 세포와 같은 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 투여하기 위한 절차를 제시한다. 일부 경우에서, 지침은 화학요법제 투여 전 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 투여하기 위한 절차를 제시한다. 일부 경우에서, 지침은 화학요법제 투여와 동시에 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 투여하기 위한 절차를 제시한다. 일부 경우에서, 지침은 화학요법제 투여로부터 적어도 12시간 후 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 투여하기 위한 절차를 제시한다. 일부 경우에서, 지침은 화학요법제 투여로부터 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 최대 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 또는 7일 후에 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 투여하기 위한 절차를 제시한다. 일부 경우에서, 지침은 화학요법제 투여로부터 적어도 24시간 후 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 투여하기 위한 절차를 제시한다. 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 정맥내 주사를 위해 조성될 수 있다. 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 고형 종양을 포함할 수 있는 대상자의 간에 동맥내 조사하기 위해 제형화될 수 잇다.
[00198] 일부 경우에서, 키트는 사이클로포스파미드 및/또는 플루다라빈을, 이를 필요로 하는 대상자에게 각각 약 60mg/kg 내지 약 80 mg/kg 및 at 약 25mg/m2 내지 약 35 mg/m2의 양으로 투여하도록 포함할 수 있다. 일부 경우, 키트는 소아에게 투여하기 위한 투여량으로 성분을 함유할 수 있다.
[00199] 재조합 방법은 기술분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 프랙티스는, 달리 언급되지 않는 한, 통상의 기술자의 기술지식 범위 내에서 분자생물학(재조합 기술을 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학 분야의 통상적인 기술을 이용한다. 이러한 기술은 예컨대 여러 문헌 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology" (Wei & Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller & Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994); 및 "Current Protocols in Immunology" (Coligan et al., eds., 1991)]에 충분히 설명되어 있다. 이러한 기술은 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 제조에 적용가능하며, 본 발명을 실시하는데 고려될 수 있다. 특히 유용한 기술은 하기 섹션에서 논의된다.
부가적인 적용예
[00200] 유효한 입양세포 전달-기반 면역요법(adoptive cell transfer-based immunotherapies: ACT)은 암(예컨대 전이암) 환자를 치료하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, 자가 말초 혈액 림프구 (PBL)를 본원에 개시된 비-바이러스 또는 바이러스 방법론을 이용하여 암 또는 종양세포 상의 GPC3을 인식하는 항-GPC3 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하도록 변형시켜 개시된 방법 및 키트에 이용할 수 있다. 본 발명은 대상자에 대한 림프구 감소 치료와 동시에 또는 그 후에 인간 또는 인간화된 키메라 항원 수용체를 이용하여 비제한적인 예로서 암을 면역치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것일 수 있다. 이러한 키메라 항원 수용체는 대상자에 대한 림프구 감소 치료와 동시에 또는 그 후에 인간 또는 인간화 키메라 항원 수용체 구조물을 이용한다.
[00201] 이러한 조성물 및 방법은 많은 장점을 갖는 암 치료법을 제공할 수 있다. 일부 경우에서, 한 방법은 면역반응 세포가 주요 조직 적합성 복합체 (MHC)의 존재 또는 활성에 실질적으로 비-의존적이 되도록 면역반응 세포를 변형시키는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 경우, 본원에 기재된 폴리핵산은 키메라 항원 수용체를 인코딩할 수 있다. 또한, 항-GPC3 CAR과 같은 키메라 항원 수용체를 발현하는 면역반응 세포를 제조하는 방법이 개시된다. 또한, 암 또는 질환을 가진 환자에게 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 투여할 수 있는 치료 방법도 개시된다.
[00202] 본원에 따라 림프구 감소 치료에 이어 또는 림프구 감소 치료와 동시에 하나 이상의 대상 항-GPC3 CAR 면역 반응 세포를 수혜자에게 이식하는 것을 포함하는, 수혜자에서 질병 (예컨대 암)을 치료하는 방법이 개시된다.
[00203] 자가 림프구 주입이 치료에 사용될 수 있다. 자가 말초 혈액 단핵구 (PBMC)는 치료가 필요한 환자로부터 수집될 수 있고, T 세포는 본원에 기술되고 당 업계에 공지된 방법을 사용하여 활성화 및 확장되어 환자에게 다시 주입될 수 있다. 또 다른 경우에는 동종 세포를 사용하여 환자를 치료할 수 있다. 대상 CAR 면역반응 세포의 세포집단을 투여를 위해 제형화할 수 있으며; 여기서 대상자에 대한 투여는 통상의 기술자에게 알려진 기술을 이용한다. 이어서 확장된 세포는 변형되지 않은 세포와 유사한 조건 하에서 성장될 수 있으며, 이에 의해 변형된 세포는 다양한 목적으로 확장 및 사용될 수 있다.
[00204] 본원에 개시된 방법은 이식을 포함할 수 있다. 이식은 세포 산물의 입약 이식이라 칭할 수 있다. 이식은 자가이식, 동종이식, 이종이식 또는 임의의 기타 이식일 수 있다. 예를 들어, 이식은 이종이식일 수 있다. 이식은 또한 동종이식일 수도 있다.
[00205] 일부 경우에서, 약 5x1010 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포가 대상자에게 투여된다. 일부 구체예에서, 약 5x1010 세포는 대상자에게 투여되는 세포의 중간량(median amount)를 나타낸다. 일부 구체예에서, 약 5x1010 세포가 대상자에서 치료적 반응에 영향을 미치는데 필요하다. 일부 구체예에서, 적어도 약 적어도 약 1x107 세포, 적어도 약 2x107 세포, 적어도 약 3x107 세포, 적어도 약 4x107 세포, 적어도 약 5x107 세포, 적어도 약 6x107 세포, 적어도 약 6x107 세포, 적어도 약 8x107 세포, 적어도 약 9x107 세포, 적어도 약 1x108 세포, 적어도 약 2x108 세포, 적어도 약 3x108 세포, 적어도 약 4x108 세포, 적어도 약 5x108 세포, 적어도 약 6x108 세포, 적어도 약 6x108 세포, 적어도 약 8x108 세포, 적어도 약 9x108 세포, 적어도 약 1x109 세포, 적어도 약 2x109 세포, 적어도 약 3x109 세포, 적어도 약 4x109 세포, 적어도 약 5x109 세포, 적어도 약 6x109 세포, 적어도 약 6x109 세포, 적어도 약 8x109 세포, 적어도 약 9x109 세포, 적어도 약 1x1010 세포, 적어도 약 2x1010 세포, 적어도 약 3x1010 세포, 적어도 약 4x1010 세포, 적어도 약 5x1010 세포, 적어도 약 6x1010 세포, 적어도 약 6x1010 세포, 적어도 약 8x1010 세포, 적어도 약 9x1010 세포, 적어도 약 1x1011 세포, 적어도 약 2x1011 세포, 적어도 약 3x1011 세포, 적어도 약 4x1011 세포, 적어도 약 5x1011 세포, 적어도 약 6x1011 세포, 적어도 약 6x1011 세포, 적어도 약 8x1011 세포, 적어도 약 9x1011 세포, 또는 적어도 약 1x1012 세포. 예를 들어, 약 5x1010 세포를 대상자에게 투여할 수 있다. 또 다른 예에서, 3x106 세포로 시작하여 세포를 약 5x1010 세포로 확장시켜 대상자에게 투여할 수 있다. 일부 경우에서, 세포는 치료에 충분한 수로 확장된다. 예를 들어, 5 x107 세포가 급속히 확장되어 치료 용도에 충분한 수를 생성할 수 있다. 일부 경우에서, 치료 용도에 충분한 수는 5x1010일 수 있다. 치료 용도를 위해 세포를 임의의 개수로 주입할 수 있다. 예를 들어, 대상자에게 1x106 내지 5x1012 세포를 주입할 수 있다. 환자에게 이들을 위해 생성가능한 만큼의 세포를 주입할 수 있다. 일부 경우에서, 환자에게 주입되는 세포 모두가 조작되는 것은 아니다. 예를 들어, 환자에게 주입되는 세포의 적어도 90%가 조작될 수 있다. 다른 경우, 환자에게 주입되는 세포의 적어도 40%가 조작될 수 있다. 일부 구체예에서, 한 방법은 대상자에 있어서 치료적 반응에 영향을 미치는데 필요한 조작된 세포의 양을 계산하는 것 및/또는 대상자에게 투여하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 치료적 반응에 영향을 미치는데 필요한 조작된 세포의 양을 계산하는 것은 항-GPC3 CAR 도입 유전자가 게놈 내로 병합된 세포의 생존능 및/또는 효능을 구하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상자에서의 치료 반응에 영향을 미치기 위해, 대상자에게 투여되는 세포는 살아있는 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상자에 있어서 치료적 반응을 일으키기 위해, 세포의 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 85%, 적어도 약 80%, 적어도 약 75%, 적어도 약 70%, 적어도 약 65%, 적어도 약 60%, 적어도 약 55%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 15%, 적어도 약 10%는 살아있는 세포이다. 일부 구체예에서, 대상자에서 치료 반응에 영향을 미치기 위해, 대상자에게 투여되는 세포는 그 세포의 게놈 내로 하나 이상의 도입 유전자들이 성공적으로 병합되어 있는 세포일 수 있다. 일부 구체예에서, 대상자에서 치료 반응을 일으키기 위해, 세포의 적어도 약 95%, 적어도 약 90%, 적어도 약 85%, 적어도 약 80%, 적어도 약 75%, 적어도 약 70%, 적어도 약 65%, 적어도 약 60%, 적어도 약 55%, 적어도 약 50%, 적어도 약 45%, 적어도 약 40%, 적어도 약 35%, 적어도 약 30%, 적어도 약 25%, 적어도 약 20%, 적어도 약 15%, 적어도 약 10%에는 그 세포의 게놈 내로 하나 이상의 CAR 도입 유전자가 성공적으로 도입되어 있는 것이다.
[00206] 일부 경우에서, 대상자는 대상 항-GPC3 CAR 면역반응 세포를 투여받을 수 있는데, 여기서 투여가능한 CAR 면역반응 세포는 약 1 내지 약 35일된 것일 수 있다. 예를 들어, 투여된 세포들은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 최대 약 40일된 것일 수 있다. CAR 면역반응 세포의 나이는 자극 시점으로부터 고려할 수 있다. CAR 면역반응 세포의 나이는 아페레시스 시점으로부터 고려될 수 있다. CAR 면역반응 세포의 나이는 형질도입 시점으로부터 고려될 수 있다. 일부 구체예에서, 대상자에게 투여될 수 있는 CAR 면역반응 세포는 약 10 내지 약 14 또는 약 20일된 것일 수 있다. 일부 경우에서, CAR 면역반응 세포의 "나이"는 텔로미어의 길이에 의해 구할 수 있다. 예를 들어, "젊은" CAR 면역반응 세포는 "소모된" 또는 "늙은" CAR 면역반응 세포에 비해 텔로미어 길이가 더 길 수 있다. 특정 이론에 구애되는 것은 아니나, 면역반응 세포는 배양시 1주일에 약 0.8 kb의 텔로미어 길이를 잃는 것으로 평가되며 젊은 CAR 면역반응 세포 배양체는 44일된 면역반응 세포에 비해 약 1.4 kb 더 긴 텔로미어 길이를 가질 수 있는 것으로 믿어진다. 특정 이론에 구애되는 것은 아니나, 텔로미어 길이가 길다는 것은 환자에 있어 긍정적이고 객관적인 임상 반응 및 생체내 세포 지속성과 연관이 있을 수 있다고 믿어진다.
[00207] 일부 경우에서, 세포는 대상자 장기로부터 분리되어 핵산(예컨대, 유전자 또는 cDNA)에 의해 형질감염된 후 대상자 장기(예컨대 환자) 내로 다시 주입된다.
[00208] 이식 전, 후 및/또는 이식 중 세포(예컨대, 조작된 세포 또는 조작된 일차 T 세포)는 기능적일 수 있다. 예를 들어, 이식된 세포는 이식으로부터 적어도 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 6, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100일 동안 기능적일 수 있다. 이식된 세포는 이식으로부터 적어도 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12 개월 동안 기능적일 수 있다. 이식된 세포는 이식으로부터 적어도 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 30년간 기능적일 수 있다. 일부 경우에서, 이식된 세포는 수혜자의 수명동안 기능적일 수 있다.
[00209] 또한, 이식된 세포는 그들의 정상적으로 의도된 기능의 100% 기능을 발휘할 수 있다. 이식된 세포는 또한 그들의 정상적으로 의도된 기능의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 최대 약 100%의 기능을 발휘할 수 있다.
[00210] 이식된 세포는 또한 그들의 정상적으로 의도된 100% 기능을 초과하여 기능을 발휘할 수 있다. 예를 들어, 이식된 세포는 그들의 정상적으로 의도된 기능의 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 또는 최대 약 5000%로 기능을 발휘할 수있다.
[00211] 이식은 임의의 형태의 이식일 수 있다. 이식 부위의 예로는 간 피막하 공간, 비장 피막하 공간, 맹장하 피질 공간, 신장 피막하 공간, 망막, 위 또는 장의 점막하, 소장 혈관 부분, 정맥 낭, 고환, 뇌, 비장 또는 각막을 포함 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, 이식은 피막하 이식 (subcapsular transplanting) 일 수 있다. 이식은 또한 근육내 이식일 수 있다. 이식은 문맥내(intraportal) 이식일 수 있다.
[00212] 치료 후(예컨대, 본원에 개시된 임의의 치료), 하나 이상의 야생형 세포가 수혜자에 이식된 경우에 비해 이식 거부가 개선될 수 있다. 예를 들어, 이식 거부는 초긴급성 거부(hyperacute rejection)일 수 있다. 이식 거부는 급성 거부일 수도 있다. 거부의 기타 유형에는 만성 거부가 포함된다. 이식 거부는 도한 세포-매개형 거부 또는 T-세포 매개형 거부일 수도 있다. 이식 거부는 내추럴 킬러 세포-매개형 거부일 수도 있다.
[00213] 이식 개선은 바람직하지 않은 효과 또는 증상의 감소, 저감 또는 약화를 포함할 수 있는 초긴급성 거부의 감소를 의미할 수 있다. 이식은 세포 산물의 입양 이식을 의미할 수 있다.
[00214] 성공적인 이식의 또 다른 징후는 수혜자가 면역억제요법을 필요로 하지 않는 일수(days)일 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 치료 후(예컨대 이식), 수혜자는 적어도 또는 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상 면역억압 치료를 필요로하지 않을 수 있다. 이것은 이식이 성공적이었음을 가리키는 것일 수 있다. 이것은 또한 이식된 세포, 조직 및/또는 장기의 거부가 없음을 가리키는 것일 수도 잇다.
[00215] 일부 경우에서, 수혜자는 적어도 1일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 수혜자는 또한 적어도 7일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 수혜자는 또한 적어도 14일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 수혜자는 또한 적어도 21일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 수혜자는 또한 적어도 28일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 수혜자는 또한 적어도 60일 동안 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다. 또한 수혜자는 또한 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 면역억제 요법을 필요로 하지 않을 수 있다.
[00216] 성공적인 이식을 가늠하는 또 다른 지표는 수헤자가 면역억제 요법을 필요로 하는 일수의 감소일 수 있다. 예를 들어, 본원에 제공된 상기 치료 후, 수혜자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 이것은 이식이 성공적이었음을 나타내는 것일 수 있다. 이것은 또한 이식된 세포, 조직 및/또는 장기에서 거부 반응이 없거나 최소한도임을 가리키는 것일 수 있다.
[00217] 예를 들어, 수혜자는 적어도 1일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 수혜자는 또한 적어도 7일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 수혜자는 또한 적어도 14일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 수혜자는 또한 적어도 21일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 수혜자는 또한 적어도 28일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 수혜자는 또한 적어도 60일 동안 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다. 또한 수혜자는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 이상 감소된 면역억제 요법을 필요로 할 수 있다.
[00218] 감소된 면역억제 요법은 하나 이상의 야생형 세포가 수혜자로 이식된 경우 요구되는 면역억제 요법에 비해 덜 면역억제적인 요법을 가리키는 것일 수 있다.
[00219] 면역억제 요법은 면역계를 억제하는 임의의 치료를 포함할 수 있다. 면역억제 요법은 수혜자에서의 이식 거부를 완화, 최소화 또는 제거하는 것을 도울 수 있다. 예를 들어, 면역억제 요법은 면역-억제 약물을 포함할 수 있다. 이식 전,이식 중 및/또는 이식 후 사용가능한 면역억제 약물의 예로는, MMF (미코페놀레이트 모페틸 (Cellcept)), ATG (항-티모사이트 글로불린), 항-CD154 (CD4OL), 항-CD40 (2C10, ASKP1240, CCFZ533X2201), 알렘투주맙 (Campath), 항-CD20 (리툭시맙), 항-IL-6R 항체 (토실리주맙, Actemra), 항-IL-6 항체 (사릴루맙, 올로키주맙), CTLA4-Ig (Abatacept/Orencia), 벨라타셉트 (LEA29Y), 시롤리무스 (Rapimune), 에베롤리무스, 타크롤리무스 (Prograf), 다클리주맙 (Ze-napax), 바실릭시맙 (Simulect), 인플릭시맙 (Remicade), 사이클로스포린, 데옥시스퍼구알린, 가용성 보체 수용체 1, 코브라독 인자, 콤스타틴, 항-C5 항체 (에쿨리주맙/Soliris), 메틸프레드니솔론, FTY720, 에베롤리무스, 레플루노마이드, 항-IL-2R-Ab, 라파마이신, 항-CXCR3 항체, 항-ICOS 항체, 항-OX40 항체, 및 항-CD122 항체를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 또한, 하나 이상의 면역억제제/면역억제 약물을 함께 또는 순차적으로 이용할 수 있다. 1종 이상의 면역억제제/면역억제 약물은 유도 치료 또는 유지 치료에 이용가능하다. 유도 또는 유지 단계에서 동일 또는 상이한 약물을 사용할 수 있다. 일부 경우에서, 다클리주맙(Zenapax)을 유도 요법에 이용하고 타크롤리무스(Prograf) 및 시롤리무스(Rapimune)는 유지 요법에 이용할 수 있다. 다클리주맙(Zenapax)은 또한 유도 요법에 이용하고 저용량의 타크롤리무스 (Prograf) 및 저용량의 시롤리무스(Rapimune)를 유지 요법에 이용할 수도 있다. 면역억제는 또한 비-약물 요법을 이용하여 달성할 수도 있으며 이의 비제한적인 예로는 전신 조사, 흉선 조사 및 전체 및/또는 일부 비장절제술을 들 수 있다. 이러한 기술은 하나 이상의 면역-억제 약물과 조합하여 이용될 수도 있다.
실시예
[00220] 본 발명을 다음의 실험 실시예를 들어 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 설명 목적을 위해 제시된 것일 뿐 달리 명시되지 않는 한 본 발명 범위가 실시예로 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 본 발명은 결코 이하의 실시예에 의해 한정되는 것이 아니며 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 임의의 그리고 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1: 항-GPC3-CAR 벡터의 구축
[00221] 3세대 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터 시스템을 이용하여 예시적인 렌티바이러스 플라스미드 벡터를 구축하였다. 이 시스템은 공(empty) 벡터 pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE (Addgene)에 기반하여 패키징 플라스미드 pMDLg RRE 인코딩 Gag/Pol (Addgene), 패키징 플라스미드 pRSV-REV 인코딩 Rev (Addgene), 엔벨롭 플라스미드 pCMV-VSV-G 인코딩 VSV-G (Addgene), 및 CAR 유전자를 인코딩하는 재조합 발현 벡터를 함유한다. 이 시스템은 복제가능한 렌티바이러스 (RCL: replication capable lentivirus) 입자를 형성할 위험성을 효과적으로 낮출 수 있다.
[00222] 공 벡터 pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE는 신장(elongation) 인자-1 α (EF-1α)의 프로모터 및 상기 프로모터와 CD8αsp 시그널 펩타이드 사이에 삽입된 MluI 절단 부위를 갖는다. 구체적으로, pWPT-EGFP 벡터 (Addgene)를 ClaI/SalI (NEB)에 의해 이중 절단하여 1.1Kb의 DNA 단편을 회수하고 이것을 T4 DNA 리가아제를 이용하여, ClaI/SalI으로 이중 절단된 pRRLSIN-cPPT.PGK-GFP.WPRE와 접합시켰다. 이어서 접합 혼합물을 숙주세포 TOP10 내로 형질전환시켰다. 콜로니 PCR에 의해 양성 클론을 동정하고 시퀀싱하여, 재조합 플라스미드 pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP.WPRE를 얻었다. CD8α 시그널 도메인 (aka 단편 1, 442bp)의 EF-1α 프로모터 (SEQ ID NO: 33, Mlu I 절단 부위를 포함함)을 상류 프라이머 5'-gcaggggaaagaatagtagaca-3' (SEQ ID NO: 31), 하류 프라이머 5'-CGGCCTGGCGGCGTGGAG-3' (SEQ ID NO: 32), 및 주형(template)으로서 pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP.WPRE에 의해 증폭시키되 이 증폭은 다음 조건 하에서 실시하였다: 94℃에서 4분간 초기 변성; 94℃에서 30초간 변성, 53℃에서 30초간 어닐링, 및 68℃에서 30초간 연장(extension); 및 25 사이클 후 68℃에서 10분간 연장. 아가로스 겔 전기영동에 의해 예상된 단편 크기를 갖는 것에 의해 증폭된 밴드를 확인하였다.
[00223] 인간화 항체 35는 중국특허출원 No. CN201510481235.1에 설명된 바 있으며 인간화된 GPC3 단백질을 특이적으로 인식할 수 있다. 35-CAR 렌티바이러스 플라스미드를 구축하기 위해, 다음을 증폭시켜 이용하여 중쇄 가변 도메인 단편을 제공하고: 주형으로서 중쇄 가변 도메인 35 (CN201510481235.1에서 SEQ ID NO: 80)을 함유하는 단편, 상류 프라이머 5'-ctccacgccgccaggccggaggtgcagctggtgcag-3' (SEQ ID NO:34), 및 하류 프라이머 5'-GCGGTGTCCTCGCTCCGCAGGCTGCTCAGCTCCATGTAGGCGGTG-3' (SEQ ID NO:35); 다음을 이용하여 경쇄 가변 도메인 단편을 제공하였다: 주형으로서 경쇄 가변 도메인 35 (SEQ ID NO: 79, CN201510481235.1)을 함유하는 단편, 상류 프라이머 5'-GCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGTTCTACAGCTAC-3' (SEQ ID NO:36), 및 하류 프라이머 5'- CGGCGCTGGCGTCGTGGTACG TTTGATCTCCAGCTTGGTG-3' (SEQ ID NO:37). 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 프라이머들을 PCR 브릿징에 의해 증폭시켜 상류 CD8α 시그널 펩타이드 및 하류 힌지 영역에 대해 반복되는 서열을 포함하는, 35 scFv 단편 (SEQ ID NO: 38, 단편 2라고도 함, 765bp)을 얻었다. 하기 조건에서 PCR 증폭을 수행하였다: 94℃에서 4분간 초기 변성; 94℃에서 40초간 변성, 58℃에서 40초간 어닐링; 68℃에서 40초간 연장; 및 25 사이클 후 68℃에서 10분간 연장. 아가로스 겔 전기영동에 의해 예상된 단편 크기를 갖는 것으로써 증폭된 밴드를 확인하였다.
[00224] 상류 프라이머 5'-accacgacgccagcgccg-3' (SEQ ID NO: 39) 및 하류 프라이머 5'- aatccagaggttgattgtcgacctagcgagggggcagggcctgc-3' (SEQ ID NO: 40)을, 주형으로서 pWPT-eGFP-F2A-GPC3-28Z을 사용하여 (중국특허출원 CN 104140974 A 참조), Hinge-28Z (SEQ ID NO: 41, 단편 3, 703bp) (내부 Sal I 절단 부위)를 증폭시켰다. PCR 증폭은 다음 조건 하에서 실시하였다: 94℃에서 4분간 초기 변성; 94℃에서 30초간 변성, 60℃에서 30초간 어닐링; 68℃에서 30초간 연장; 및 25 사이클 후 68℃에서 10분간 최종 연장. 아가로스 겔 전기영동에 의해 예상된 단편 크기를 갖는 것으로써 증폭된 밴드를 확인하였다. 다음 조건 하에서 오버랩 PCR에 의해 동몰량 (약 50 ng)의 단편 1, 단편 2 및 단편 3을 증폭시켰다: 94℃에서 4분간 초기 변성; 94℃에서 40초간 변성, 60℃에서 40초간 어닐링; 68℃에서 140초간 연장; 및 5 사이클 후 68℃에서 10분간 최종 연장. 이어서 DNA 폴리머라제, 상류 프라이머 5'-gcaggggaaagaatagtagaca-3' (SEQ ID NO: 31) 및 하류 프라이머 5'- aatccagaggttgattgtcgacctagcgagggggcagggcctgc-3' (SEQ ID NO: 40)를 혼합물에 보강하고 다음 조건 하에서 25 사이클 동안 증폭시켰다: 94℃에서 4분간 초기 변성; 94℃에서 40초간 변성, 60℃에서 40초간 어닐링; 68℃에서 140초간 연장; 및 68℃에서 10분간 최종 연장. 결과적인 35-28Z (SEQ ID NO: 41)의 이론상 크기는 1874bp였다. 증폭 산물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인하였으며 예상된 단편 크기 및 SEQ ID NO: 23에 나타난 서열을 가졌다.
[00225] 벡터 pRRLSIN-cPPT.EF-1α-EGFP.WPRE 벡터 및 35-28Z를 MluI 및 SalI로 절단한 다음 T4 리가아제로 접합시키고 TOP10 내로 형질전환시켰다. pRRL-EF-1α-35-28Z이 수득되었는지 확인하기 위해 콜로니 PCR로 양성 클론을 동정하고 Invitrogen에 의해 시퀀싱하였다.
실시예 2: 항-GPC3-CAR 렌티바이러스의 패키징
[00226] 항-GPC3-CAR 렌티바이러스 스톡 용액(0.75L)을 배아 신장 세포(Embryonic Kidney Cells) 293 T (ATCC: CRL-11268)를 이용하여 제조하였다. 구체적으로, 293T 세포를 5-층 Cellstack(Corning) 상에 1.17Х104/cm2로 접종하였다. 이식 당일에 17ml DMEM 기초 배지에 966μg의 모든 플라스미드를 용해하여 가볍게 혼합함으로써, 133.2μg의 패키징 플라스미드 pRSV-Rev, 133.2μg의 pMDLg/pRRE, 51.56μg의 pCMV-VSV-G 및 111.7μg의 pRRL-EF-1α-35-28Z를 포함하는 용액 A를 제조하였다. 용액 B는 17ml DMEM 기초 배지에 2.9 mg PEI (Polysciences)를 용해시켜 제조하고 이 용액을 가볍게 혼합하여 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 이어서 용액 A를 용액 B에 넣고 균질 혼합한 다음 실온에서 20분 내지 25분간 정치시켰다. 이어서 293 T 배양 용액을 Cellstack으로부터 1L 플라스크로 옮겼다. 이어서 플라스미드 및 PEI를 포함하는 조합 용액을 배양 용액에 넣고 가볍게 혼합하였다. 얻어진 용액을 Cellstack으로 옮기고 37℃, 5%CO2 에서 5 시간 인큐베이션한 다음 10% FBS (Life Technology)가 보강된 신선한 성장 배지 DMEM으로 배지를 갈아주었다. 이어서 배양액을 37℃, 5%CO2에서 48시간 인큐베이션하였다. 렌티바이러스 스톡 용액을 회수하고, 0.45μm (Millipore) 필터로 여과한 다음 농축하고 KrosFlo® IIi Tangential Flow Filtration System (Spectrum)으로 정제한 다음 AIM-V(Life technology)로 세척하여 보관하였다. CN104140974A에 설명된 방법에 따라 바이러스 적정을 실시하였다. 바이러스 역가는 약 1Х108/ml인 것으로 계산되었다. 바이러스를 1Х108/바이알로 패키징하고 나중 사용을 위해 -80℃에서 보관하였다.
실시예 3: Preparation of 항-GPC3-CAR T 세포의 제조 및 간암세포에 대한 시험관내 항-종양 분석
[00227] CAR T 세포를 cGMP 기준에 맞춰 면역세포 제조 랩에서 제조하였다. 구체적으로, COBE Spectra 혈액 성분 분리기를 이용하여 수득된 대상자의 말초 혈액 또는 백혈구 세포가 농축된 혈액을 밀도구배 원심분리하여 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 얻었다. PBMC를 항-CD3 및 항-CD28 항체(Life technology)가 코팅된 자성 비드와, PBMC 대 자성 비드 비율을 1:3으로 해서 혼합하고, 최종 농도 300 U/mL (Shanghai Hua Xin High Biotechnology Co., Ltd.)의 재조합 인간 IL-2로 자극한 다음 48 시간 동안 배양하였다. 이어서 전술한 렌티바이러스를 이용하여 약 5의 MOI로 활성화된 T 세포를 형질도입하고 RetroNectin (Takara)에 의해 형질도입 효율을 증가시켰다. 형질도입으로부터 24시간 및 48시간 후, 자유 바이러스들을 저속 원심분리(100 g x 10분)를 통해 배지 변경에 의해 제거하였다. 형질도입 72시간 후, 자성 비드를 제거하였다. 전술한 원심분리를 반복하고 계대배양체를 5x105/mL의 밀도로 수득하였다. 이어서, 세포들을 약 3x105/mL의 밀도로 격일로 계대배양하는 한편 재조합 인간 IL-2를 300 U/mL의 최종 농도로 림프구 배양 배지에 첨가하였다.
[00228] 10 내지 12일간 시험관내 배양 후 유세포 분석에 의해 형질도입된 CAR T 세포를 CAR의 발현에 대해 분석하였다. 즉, CAR T 세포의 양성 형질도입 비율을 분석하여 이를 표 7에 나타내었다. 또한, 이펙터 대 표적 비율을 3:1, 1:1, 및 1:3로 하여, 시험관내 항-종양 분석을 GPC3 고발현 간암세포 Huh-7, GPC3 저발현 PLC/PRF/5, 및 GPC3 음성 SK-HEP-1와 함께 18 시간 동안 공동-인큐베이션함으로써 수행하였다. 구체적인 절차는 CN104140974A에 설명되어 있다. 이펙터 대 표적 비율 1:1에서의 시험관내 항-종양 활성 결과를 표 8에 나타내었다.
[00229] 실험 결과 항-GPC3-CAR T 세포는 CAR을 약 40% 내지 약 80% 범위로 발현한 것으로 나타났다. 또한, 항-GPC3-CAR T 세포는 이펙터-대-표적 비율에 대한 투여량 의존 효과를 나타내며 GPC3 양성 Huh-3 및 PLC/PRF/5를 사멸시키는 반면, GPC3 음성 SK-HEP-1는 사멸시키지 않았는데(표 8), 이는 본 발명에 따라 대상자로부터 제조된 항-GPC3-CAR T 세포가 탁월한 표적화 사멸 효과를 나타냄을 가리킨다.
Figure 112022092041666-pat00004
Figure 112022092041666-pat00005
실시예 4: 림프구 감소 후 림프구의 변화
[00232] 치료된 대상자로부터 항-GPC3-CAR T 세포의 준비 동안 아무런 이상이 발생하지 않았음을 확인한 후, 대상자들이 생체내 림프구 감소에 적합하였는지 알아보기 위해 대상자들을 다양한 신체 조건에 대하여 포괄적으로 평가하였다. 적합한 대상자에 대한 투여를 위해 일차 림프구 감소 프로토콜을 설계하였다.
[00233] 하기 두 가지 림프구 감소 프로토콜을 설계하였다: 프로토콜 1: 사이클로포스파미드 (CTX) 단일 제제 림프구 감소 프로토콜, 투여량 1g/m2/일 x 1일. 프로토콜 2: 플루다라빈 (FLU) + 사이클로포스파미드 림프구의 조합된 감소 프로토콜, 투여량 20~30 mg 플루다라빈 /m2/일 x 4일 + 500 mg 사이클로포스파미드 /m2/일 x 2일.
[00234] 다음 조건을 포함시키기 위해 프로토콜에 수정을 가하여 프로토콜을 실시하였다: 스티븐슨 방정식(Chinese Journal of Physiology, 12:327,1937)에 따라 인간 체표면적을 계산하였다. 즉, 표면적(m2) = 0.0061 x 신장 (cm) + 0.0128 x 체중(kg) - 0.1529. 예를 들어, 키가 170 cm이고 체중이 60 kg인 성인의 표면적은 1.6521 m2이다. 기존의 신체 조건 또는 그 자신의 의지로 인해 림프구 감소에 적합치 않은 대상자들은 2차 대기조로 할당하였다. 총 3명의 대상자(H01, H02, 및 H03)에 대해 상이한 림프구 감소 치료를 실시하였다. 대상자 1명(H04)은 신체 상태 및 그들의 의지에 따라 절제를 받지 않았다. 프로토콜을 다음 표 9에 나타내었다.
Figure 112022092041666-pat00006
[00236] H011은 대상자 H01에게 항-GPC3-CAR T 세포 치료를 초기 투여하였음을 가리킨다; H012는 대상자 H01에게 항-GPC3-CAR T 세포 치료를 2차 투여하였음을 가리킨다; 그리고 D0는 항-GPC3-CAR T 세포 투여가 수행된 날로서 정의된다. 전술한 림프구 감소 프로토콜 실행 후, 대상자에 있어 림프구의 절대값에 다양한 변화가 일어났다. 단일 제제로서 사이클로포스파미드의 림프구 감소 치료 결과, 림프구는 약 40% 내지 약 72% 감소하였다. 플루다라빈 및 사이클로포스파미드 림프구 감소 조합은 사이클로포스파미드 단일 제제 투여에 비해 림프구 감소에 있어 약 82% 내지 약 96.5%의 훨씬 더 유의한 차이를 발생시켰다. 구체적으로, 도 2는 림프구 감소 치료 투여 전후 각 모니터링된 시점에서 베이스라인에 대한 림프구 절대수의 비율 변화를 입증한다. 전술한 결과는 플루다라빈 및 사이클로포스파미드의 조합이 사이클로포스파미드 단일 제제 감소 프로토콜과 비교하여 더 우수한 림프구 감소를 결과시킨다는 것을 보여준다.
실시예 5: 절제 후 대상자의 임상 반응
[00237] 림프구 감소 실시로부터 약 2일 후 대상자에게 항-GPC3-CAR T 세포를 정맥 투여하였다. 항-GPC3-CAR T 세포의 투여량을 표 7에 나타내었다. 치료 후 대상자들의 임상 반응을 표 10에 요약하였다. 실험 결과 림프구 감소가 수행된 3명의 대상자들은 항-GPC3-CAR T 세포 치료 후 현재까지 안정한 질병(SD: stable disease) 또는 부분적 반응(PR: partial response) 상태인 것으로 입증되었다. 이와 대조적으로, 림프구 감소 치료를 받지 않은 대상자 H04는 항-GPC3-CAR T 세포 치료 후 4주일간 MRI에 의해 진행성 질병 상태를 나타내었다.
[00238] AFP 결과와 관련하여, 대상자 H02는 AFP 비감수성(insensitivity)로 인해 종양 마커로부터의 예후를 평가할 수 없었다. 다른 2 명의 대상자의 경우, 그들의 AFP 수준은 표 10에 나타난 바와 같이 다소 감소되었다. 대상자 H03은 플루다라빈 및 사이클로포스파미드 조합에 의한 림프구 감소 후, 치료전 베이스라인에 비해 AFP의 87% 감소를 나타내었다. 한편, 조영 결과 표적 부위는 부분적 임상 반응을 나타내었다. 도 3은 대상자 H03의 치료전 vs. 치료 10주 후의 MRI 결과를 나타낸다.
Figure 112022092041666-pat00007
[00240] 각주: ↓는 AFP 수준 감소를 나타내고; ↑는 AFP 수준 증가를 나타내며; PD는 진행성 질병을 나타내고; CR은 완전한 반응을 나타내며; PR은 부분적 반응을 나타낸다. 안전성 데이터 및 임상 관찰 결과 항-GPC3-CAR T 세포 치료 후, 어떠한 대상자도 관용할 수 없는 독성이나 부작용을 겪지 않은 것으로 나타났다. 모든 대상자는 어느 정도 발열 및 GRP 증가가 있었다. 대상자 H01 및 H04는 투여 후 떨었다. 대상자 H03은 발열로 인한 알부민 감소를 나타냈다. 외부 영양식과 알부민을 섭취하자 대상자는 발열이 멈춘 후 정상 알부민을 나타내었다 (표 11).
Figure 112022092041666-pat00008
[00242] 또한, CAR T 세포를 이용한 혈액암 치료시 종종 나타나는 사이토카인 방출 신드롬은 이 임상 연구에서는 관찰되지 않았는데 이는 항-GPC3-CAR T 세포가 안전함을 의미한다.
[00243] 종합하면, GPC3 양성 간세포성 암 치료를 위해 CAR-GPC T 세포를 이용한 임상 연구 결과 효과적으로 림프구가 감소된 대상자들은 항-GPC3-CAR T 세포 치료에 의해 어떤 임상적 이득을 본 반면, 림프구 감소 치료법을 받지 않은 대상자들은 어떠한 임상적 이득도 보지 못한 것이 입증되었다. 또한, 림프구가 감소되거나 되지 않은 대상자들 중 어느 누구도 발열 및 증가된 CRP와 같은 특정한 유해 반응은 가질지언정 관용할 수 없는 독성이나 부작용을 나타내지 않았는데, 이는 림프구 감소가대상자의 유해 반응을 악화시키지 않았음을 가리키는 것이다. 또한, 림프구 감소 요법의 효과 및 대상자에 대한 이득과 관련, 조합된 플루다라빈 및 사이클로포스파미드 림프구 감소 프로토콜이 사이클로포스파미드 단일 제제 림프구 감소 프로토콜에 비해 더 우수할 수 있다. 종합하면, 효과적인 림프구 감소 실시 후, 항-GPC3-CAR T 세포 치료는 GPC3 양성 간세포 암종의 임상 치료에 대한 효과적인 치료적 해결책을 제공하는 것일 수 있다.
실시예 6: 표현형 분석
[00244] 세포 표면 분자의 발현을 표준 방법론을 이용하여 유세포분석법에 의해 알아보았다. 피코에리트린, 플루오레신 이소티오시아네이트 및/또는 페리디닌 클로로필 II 단백질과 컨쥬게이트된 하기 모노클로날 항체들을 이용한다: CD3, CD4, CD8, CD30, CCR4, CD45RA, CD45RO, CCR7, CD62L, CD56, αβT-세포 수용체 (BD Biosciences PharMingen). T 세포에 의한 CAR의 발현을 항-CAR 항체를 이용하여 탐지한다. FACSCalibur (BD Biosciences PharMingen)를 이용하여 샘플을 분석하고, 데이터를 CellQuest Pro 소프트웨어 (BD Biosciences, San Jose, CA)에 의해 분석한다. 적어도 10,000개의 긍정적(positive) 이벤트가 각 샘플에 대해 측정된다.
실시예 7: 세포독성 분석: 간암
[00245] 2세대 또는 3세대 CAR-T 형질도입된 T 세포의 잠재적인 세포독성 효과를 평가하기 위해, CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 (Promega)을 수행하였다. 간단히 설명하면, 항-GPC3 CAR-T 세포, 33-28BBZ, 92-28BBZ, 및 4-28BBZ를 이펙터: 표적 비율 3:1, 1:1, 또는 1:3로 하여 대조군 세포, SK-HEP-1 (도 4A) 및 CHO-K1 (도 4B)와 함께 표적 세포 10,000/웰로 하여 공동-배양하고 37℃에서 18시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 가시광선 흡광도 데이터를 표준 96-웰 플레이트 리더를 이용하여 수집하였다.
[00246] 항-종양 세포독성 CAR-T 세포 평가를 위해, 33-28BBZ, 92-28BBZ, 및 4-28BBZ를. GPC3, CHO-K1-GPC3+를 발현하도록 형질도입된 GPC3-양성 간암세포, Huh-7, 또는 대조군 세포와 함께 이펙터: 표적 비율 3:1, 1:1, 또는 1:3로 하여 표적 세포 10,000/웰로 공동-배양하고 37℃에서 18 시간 인큐베이션하고, 그 결과를 도 5A 및 도 5B에 각각 나타내었다. 인큐베이션 후 가시광선 흡광도 데이터를 표준 96-웰 플레이트 리더를 이용하여 수집하였다.
[00247] 모든 이펙터: 표적 비율에서, 세포독성은 5 반복 웰의 평균값으로서 구하였다.
결과
[00248] 세포독성 데이터는 33-28BBZ, 92-28BBZ, 및 4-28BBZ CAR-T 구조물들이 GPC3을 발현하는 종양 세포주에 대해 세포독성을 나타내는 반면 3:1, 1:1, 및 1:3로 비-GPC3 발현 대조군에 대해서는 세포독성을 나타내지 않았음을 보여준다.
실시예 8: 세포독성 분석: 간암 패널
[00249] To 2세대 또는 3세대 CAR-T 형질도입된 T 세포의 잠재적인 세포독성 효과를 평가하기 위해, CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 (Promega)을 수행하였다. 간단히 설명하면, 항-GPC3 CAR-T 세포, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, 또는 모크(mock)를 HepG2 (HCC)(도 6A), Hep3B (HCC)(도 6B), 또는 PLC/PRF/5 (Hepatoma)(도 6C)와 함께 이펙터: 표적 비율 3:1, 1:1, 또는 1:3으로 하고 표적 세포 10,000/웰로 하여 공동-배양하고 37℃에서 18 시간 인큐베이션하였다. 2세대 및 3세대 CAR-T의 세포독성 효과를 평가하기 위해, GPC3 고발현 간암세포, Huh-7와 함께 공동-배양된 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, 또는 모크를 잉요하여 유사한 CytoTox 96® 분석을 수행하였다. 도 7A. 인큐베이션 후 가시광선 흡광도 데이터를 표준 96-웰 플레이트 리더를 이용하여 수집하였다.
결과
[00250] 세포독성 데이터는 2세대 및 3세대 구조물 모두 3:1, 1:1, 및 1:3에서 HCC 및 간암종 종양 세포주를 비롯한 모든 간암 패널에 걸쳐 필적할만한 세포독성을 나타냈음을 보여준다. 2세대 및 3세개 구조물은 GPC3 발현 수준을 달리하는 다양한 종양 세포들을 표적화할 수 있었고, 이는 광범한 종양 표적화 잠재능을 가리키는 것이다.
실시예 9: 세포독성 분석법: 위암종
[00251] 위암종 종양 세팅에서 2세대 또는 3세대 CAR-T 형질도입된 T 세포의 잠재적인 세포독성 효과를 평가하기 위해, CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 (Promega)을 수행하였다. 간단히 설명해서, 항-GPC3 CAR-T 세포, 92-28Z, 92-28BBZ, 또는 모크를 이펙터-대-표적 비율 1:3, 1:1, 및 3:1로 하여 KATO-III와 함께 (10,000/웰) 공동-배양하고 37℃에서 18 시간 인큐베이션하였다.
결과
[00252] 세포독성 데이터는 2세대 및 3세대 구조물 두 가지 모두 위암종 종양주 KATO-III에 대해 필적할만한 세포독성을 나타냈음을 보여주며 (도 7B) 모크 형질도입된 세포는 활성을 나타내지 않았다. 데이터는 CAR-T 세포가 이들의 종양 표적에 특이적이고 GPC3 항원을 발현하지 않는 조직에 대해서는 아무런 반응성을 나타내지 않음을 보여준다.
실시예 10: scFv 33 대 scFv 92 비교
[00253] CAR-T와 GPC3에 대한 상이한 scFv'를 비교하기 위해 2세대 또는 3세대 CAR-T 형질도입된 T 세포들을 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 (Promega)에 사용하였다. 간단히 설명해서, 항-GPC3 CAR-T 세포, 33-28Z, 92-28Z, 92-BBZ, 92-28BBZ, 또는 모크를 Huh-7 세포 또는 대조군 세포, A431 (GPC3 neg)와 이펙터: 표적 비율 3:1, 1:1, 또는 1:3 (표적 세포 10,000/웰)로 하여 공동-배양하고 37℃에서 18시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 가시광선 흡광도 데이터를 표준 96-웰 플레이트 리더를 이용하여 수집하였다.
결과
[00254] 세포독성 데이터는 scFv 92를 갖는 구조물이 scFv 33를 갖는 구조물에 비해 이펙터 대 표적 비율 3:1, 1:1, 및 1:3에서 증가된 세포독성을 나타냈음을 보여준다, 도 10B. 세포독성은 항원 특이적이었는데 이는 GPC3 neg 종양 세포주 A431의 경우 공동 배양시 아무런 세포독성이 감지되지 않았기 때문이다, 도 10A.
실시예 11: 2세대 및 3세대 CAR-T의 비교
[00255] 2세대 및 3세대 CAR-T를 비교하기 위해 CAR-T 형질도입된 T 세포를 CytoTox 96® 비방사선 세포독성 분석 (Promega)에 이용하였다. 간단히 설명해서, 항-GPC3 CAR-T 세포, 4-28Z, 4-28BBZ, 4-4-28BBZ, 4-14-28BBZ, 4-20-28BBZ, 4-35-28BBZ, 4-42-28BBZ 또는 모크-형질도입된 것들을 이펙터: 표적 비율 3:1, 또는 1:1 (표적 세포 10,000/웰)로 하여 Huh7 (HCC) 세포와 함께 공동-배양하고, 37℃에서 18시간 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 가시광선 흡광도 데이터를 표준 96-웰 플레이트 리더를 이용하여 수집하였다.
결과
[00256] 세포독성 데이터는 2세대 및 3세대 구조물 두 가지 모두 증가된 세포용해에 의해 측정되는 바와 같이 높은 세포 독성을 갖는 4-20-28BBZ, 4-35-28BBZ 및 4-42-28BBZ를 갖는 세포 독성을 가짐을 보여 준다, 도 9.
실시예 12: 증식 분석
[00257] 표적 세포 (Huh-7, GPC3+) 또는 대조군 세포 (SK-HEP-1, GPC3-)에 노출 후 항-GPC3 CAR-T의 증식을 카르복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르 희석 분석법에 의해 알아보었다.
[00258] 형질도입으로부터 1주일 후, 대조군 T 림프구 및 항-GPC3 CAR-T 세포들을 1.5μmol/L 카르복시플루오레신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE; Invitrogen)로 표지하고 이펙터-대-표적(E;T) 비율 5:1로 하여 조사된 종양 표적(GPC3 양성 및 GPC3 음성 세포주)과 함께 플레이팅하였다. CFSE 희석을 공동-배양으로부터 4일 후 유세포 분석법에 의해 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대해 측정하였다.
실시예 13: 환자 유래된 종양 이식 쥐 모델 및 림프구 감소
[00259] NOD/SCID 마우스들에게 각각 2x2x2mm 폐암 종양을 이식하였다. 이식한지 대략 27일 후 또는 종양 크기가 220mm3에 달하였을 때, 마우스에게 사이클로포스파미드를 정맥 투여하고 1x107 모크, hu92-28Z, 또는 hu92-28BBZ CAR-T 세포를 복강 투여하였다. 2차 투여는 제34일에 실시하였다. 종양 접종으로부터 52일이 될 때까지 대략 매 3-7일 마다 캘리퍼 측정법을 이용하여 종양 크기를 측정하였다.
결과
[00260] 종양 접종으로부터 51일째에, 92-28Z, 2세대 CAR-T로 처리된 마우스들은 92-28BBZ, 3세대 CAR-T, 또는 식염수로 처리된 마우스들에 비해 종양 크기가 현저히 감소하였다, 도 8A 및 도 8B. 92-28Z, 2세대 CAR-T로 처리된 마우스들은 92-28BBZ, 3세대 CAR-T, 또는 식염수로 처리된 마우스에 비해 종양 무게가 현저히 감소하였다, 도 8C. 또한 92-28Z, 2세대 CAR-T로 처리된 마우스들은 92-28BBZ, 3세대 CAR-T, 또는 식염수로 처리된 마우스들에 비해 현저히 감소된 억제를 나타내었다, 도 8D.
실시예 14: 이종이식 HCC 쥐 모델
[00261] 8주 내지 12주령의 NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스들 (Bar Harbor, ME)의 좌측 옆구리에 0.5x106 Huh-7 종양 세포를 이식하였다. 종양 접종으로부터 7일 후 마우스들에게 1x107 모크-형질도입된 T 세포, hu92-28Z, 또는 hu92-28BBZ를 꼬리 정맥에 주사하였다. 처리 후 마우스들을 종양 세포 접종으로부터 35일 후까지 적어도 1주일에 1회 캘리퍼 측정에 의해 모니터링하였다.
결과
[00262] hu92-28Z 및 hu92-28BBZ 처리는 모크-형질도입된 T 세포로 처리된 마우스에 비해 현저한 항-종양 활성을 나타내었다. 도 11A는 hu92-28Z 또는 hu92-28BBZ로 처리된 마우스들이 종양 세포 접종 35일 후에 종양 크기가 현저히 감소하였음을 보여준다. 도 11B는 hu92-28Z 또는 hu92-28BBZ로 처리된 마우스들이 모크 형질도입된 세포로 처리된 마우스에 비해 감소된 무게 측정치에 의해 입증되는 바와 같이 종양 크기가 현저히 작아졌음을 보여준다. 도 11C는 이종이식 종양의 이미지를 나타낸다.
실시예 15: 항-GPC3 CAR T 세포의 임상적 확장
[00263] 형질도입된 T 세포를 대량 생성하기 위해, 급속 확장 프로토콜(rapid expansion protocol: REP)를 이용하여 세포들을 증식하도록 유도하였다. REP에 이용되기 전, T 세포를 항-CD3, 항-CD28 및 IL-2와 함께 배양시키기 시작하여 배양 개시 2일차에 전술한 바와 같이 형질도입시켰다. 세포들을 75 cm2 플라스크 내에서 37℃ 및 5% CO2 하에 배양하였다. 세포 수를 세고 배양물에서 유지되는 남은 기간 동안 2일마다 300 IU/mL의 IL-2를 함유하는 새로운 T 세포 배지에 0.5 × 106 세포/mL의 농도로 현탁시킨다.
실시예 16: 임상 시험
[00264] 평가가능한 간암을 갖는 환자에 대해 아페레시스를 수행하여 말초 혈액 단핵구를 단리한다. 림프구를 단리하고, 항-GPC3 CAR로 바이러스를 형질도입하고, 확장하여, 면역 검사를 위해 분취한다. CAR-T 투여 전 -7 일과 -6 일에 환자들에게 60 mg/kg/day x 2일동안 IV로 1 시간에 걸쳐 사이클로포스파미드 예비 요법을 실시한다. CAR-T 투여 전 -7 일과 -3 일에 환자들에게 플루다라빈 25 mg/m2/일의 예비 투여를 IVPB에 의해 매일 30분씩 5일 동안 실시한다. 예비 요법 동안 환자는 매일 전혈구(CBC) 검사를 받는다.
[00265] 제1상 연구의 첫 번째 부분에서, 그룹 당 한 명의 환자를 이용하여 환자 당 109 항-GPC3 CAR-T에서 시작하여 용량 증가를 개시한다. 개별 환자들을 반 로그 증분(half log increments)로 치료한다. 따라서 다음의 투여량이 이용될 것이다: 109, 3x109 세포, 1010 세포, 3 x 1010 세포, 및 최대 1 x 1011 세포. 자가 항 -GPC3 CAR-T를 비 - 여과 된 튜빙을 통해 20 내지 30 분에 걸쳐 정맥 내 투여한다. 자가 항-GPC3 CAR-T를 비-여과 튜빙을 통해 20 내지 30분간 정맥 투여한다.
[00266] CAR-T 세포 생성물 투여 후 6주간 평가를 위해 모든 환자들을 병원에 돌려보낸다.
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SEQUENCE LISTING <110> CARSGEN THERAPEUTICS CO., LTD. <120> COMPOSITIONS AND METHODS OF CELLULAR IMMUNOTHERAPY <130> 52022-704.601 <140> PCT/CN2017/081446 <141> 2017-04-21 <150> CN 201610256568.9 <151> 2016-04-22 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 247 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Arg Gly Ser His Ala Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly 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Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Ser Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Arg Arg Gly Ser His Ala Asp Ala Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro 130 135 140 Ser Ala Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly 145 150 155 160 Thr Ser Ser Asp Val Gly Leu Met His Asn Val Ser Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ser Ser Ser Arg 180 185 190 Pro Ser 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33 gcaggggaaa gaatagtaga cataatagca acagacatac aaactaaaga attacaaaaa 60 caaattacaa aaattcaaaa ttttatcgat ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc 120 acatcgccca cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag 180 agaaggtggc gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc 240 gagggtgggg gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac 300 gggtttgccg ccagaacaca ggtgtcgtga cgcggatcca ggcctaagct tacgcgtcct 360 agcgctaccg gtcgccacca tggccttacc agtgaccgcc ttgctcctgc cgctggcctt 420 gctgctccac gccgccaggc cg 442 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 34 ctccacgccg ccaggccgga ggtgcagctg gtgcag 36 <210> 35 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 35 gcggtgtcct cgctccgcag gctgctcagc tccatgtagg cggtg 45 <210> 36 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 36 gcggagcgag gacaccgccg tgtactactg cgcccggttc tacagctac 49 <210> 37 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 37 cggcgctggc gtcgtggtac gtttgatctc cagcttggtg 40 <210> 38 <211> 765 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 38 ctccacgccg ccaggccgga ggtgcagctg gtgcagagcg gcgccgaggt gaagaagccc 60 ggcgccagcg tgaaggtgag ctgcaaggcc agcggctaca ccttcagcga ctacgagatg 120 cactgggtgc ggcaggcccc cggccagggc ctggagtgga tgggcgccat ccaccccggc 180 agcggcgaca ccgcctacaa ccagcggttc aagggccggg tgaccatcac cgccgacaag 240 agcaccagca ccgcctacat ggagctgagc agcctgcgga gcgaggacac cgccgtgtac 300 tactgcgccc ggttctacag ctacgcctac tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc 360 gccggtggag gcggttcagg cggaggtggt tctggcggtg gcggatcgga catcgtgatg 420 acccagaccc ccctgagcct gcccgtgacc cccggcgagc ccgccagcat cagctgccgg 480 agcagccaga gcctggtgca cagcaacggc aacacctacc tgcagtggta cctgcagaag 540 cccggccaga gcccccagct gctgatctac aaggtgagca accggttcag cggcgtgccc 600 gaccggttca gcggcagcgg cagcggcacc gacttcaccc tgaagatcag ccgggtggag 660 gccgaggacg tgggcgtgta ctactgcagc cagagcatct acgtgcccta caccttcggc 720 cagggcacca agctggagat caaacgtacc acgacgccag cgccg 765 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 39 accacgacgc cagcgccg 18 <210> 40 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 40 aatccagagg ttgattgtcg acctagcgag ggggcagggc ctgc 44 <210> 41 <211> 703 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 41 accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60 tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120 gacttcgcct gtgatttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 180 ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 240 cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc caacccgcaa gcattaccag 300 ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 360 gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 420 cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 480 aagccgcaga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 540 atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 600 gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 660 caggccctgc cccctcgcta ggtcgacaat caacctctgg att 703

Claims (39)

  1. 대상자의 간세포성 암의 치료에 사용하기 위한, 치료적 유효량의 항-GPC3 키메라 항원 수용체 (CAR) 면역반응 세포를 포함하는 약학적 조성물로서,
    상기 치료는 상기 대상자에게 림프구 감소 치료 후에 상기 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함하고,
    상기 림프구 감소 치료는 사이클로포스파미드 및 플루다라빈을 상기 대상자에게 투여하는 것을 포함하고,
    상기 항-GPC3 CAR 면역반응 세포는 T 세포 (항-GPC3-CAR T 세포)인 것인, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 치료는,
    컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔에 의해 측정시 종양 크기를 적어도 30% 감소시키는데 있어서, 및/또는
    컴퓨터 단층 촬영 (CT) 스캔에 의해 측정시 종양 병변 직경의 베이스라인 측정치에 있어 10% 미만의 변화에 의해 측정되는 바와 같이 종양 크기를 안정화시키는데 있어서, 효과적인 것인 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항-GPC3 CAR는 GPC3의 C-말단에 대해 특이적 결합을 나타내는 항원 결합 유닛을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항원 결합 유닛은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 또는 SEQ ID NO: 8에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-GPC3-CAR는 SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, 또는 SEQ ID NO: 30에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 림프구 감소 치료는 상기 대상자에 있어 조절 T 세포의 양을 감소시키는 것을 포함하는 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 림프구 감소 치료는 상기 대상자에게 방사선을 조사하거나 또는 항체 요법을 처리하는 것을 더 포함하는 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 림프구 감소 치료는 전혈구검사 (CBC) 분석법으로 측정시 림프구의 양을 적어도 20% 감소시키는 것인 약학적 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항-GPC3-CAR T 세포는 상기 대상자에게 자가 또는 동종인 것인 약학적 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 항-GPC3-CAR T 세포의 투여와 동시 또는 투여 후에 상기 대상자에게 적어도 1종의 면역자극제를 투여하는 것을 더 포함하는 것인 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 면역자극제는 알데스류킨 (IL-2), IL-3, IL-6, IL-11, GM-CSF, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
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