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CN105713881B - 双靶向gpc3和asgpr1的转基因免疫效应细胞及其应用 - Google Patents

双靶向gpc3和asgpr1的转基因免疫效应细胞及其应用 Download PDF

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CN105713881B CN201410736009.9A CN201410736009A CN105713881B CN 105713881 B CN105713881 B CN 105713881B CN 201410736009 A CN201410736009 A CN 201410736009A CN 105713881 B CN105713881 B CN 105713881B
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Abstract

本发明涉及双靶向GPC3和ASGPR1的转基因免疫效应细胞及其应用。首次揭示了一种能同时识别GPC3和ASGPR1的基因修饰的免疫效应细胞，其可应用于GPC3和ASGPR1双阳性肿瘤如肝癌的治疗。

Description

双靶向GPC3和ASGPR1的转基因免疫效应细胞及其应用
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫治疗领域，更具体地，本发明涉及双靶向GPC3和ASGPR1的转基因免疫效应细胞及其应用。
背景技术
T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中的作用日益受到重视。基于T淋巴细胞的过继性免疫治疗在部分肿瘤中取得了一定的效果，并且该种免疫治疗方法可以克服抗体治疗的上述缺陷，但在大多数肿瘤的疗效仍不能令人满意。近年来，根据CTL对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(T Cell Receptor，TCR)的发现，将针对肿瘤细胞相关抗原的抗体的scFv与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimericantigen receptor，CAR)，并将其通过如慢病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面。这种CAR T淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex，MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。CAR T淋巴细胞是肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略。
嵌合抗原受体(CAR)包括胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8，CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ或FcεRIγ及共刺激信号分子CD28、CD137、CD134等的胞内信号区。
胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CAR T可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是细胞因子分泌比较少，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应[Zhang T.et al.Chimeric NKG2D-modified T cells inhibit systemic T-cell lymphoma growth in amanner involvingmultiple cytokines and cytotoxic pathways，Can Res 2007，67(22):11029–11036.]。
随后发展的第二代CAR T淋巴细胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR T在体内的存活周期和抗肿瘤效果[Dotti G.et al.CD28costimulation improves expansion andpersistence of chimeric antigen receptor modified T cells in lymphomapatients.J Clin Invest，2011，121(5):1822-1826.]。
近些年发展的第三代CAR T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，进一步提高了CAR T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果[Carpenito C.，et al.Control of large established tumorxenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28andCD137domains.PNAS，2009，106(9):3360–3365.]。
尽管CAR T淋巴细胞在肿瘤免疫治疗中具有诱人的前景，但一些潜在的风险亦需要考虑。比如，由于某些/种正常组织低表达CAR所能识别的特异性抗原可能造成CAR T淋巴细胞对表达相应抗原的正常组织的损伤。如，针对肾细胞癌患者肿瘤细胞上表达的抗原碳酸酐酶IX(CAIX)是第一个用于临床的CAR T淋巴细胞过继治疗的案例，也是第一个报道含CAR细胞的脱靶效应的案例。病人在多次输入CAR T淋巴细胞后出现2-4级肝毒性。分析原因为肝胆管上皮细胞低表达CAIX，原临床试验被迫中断同时排除了病人治疗效果的任何评价[Stoter G.et al.Treatment of metastatic renal cell carcinoma with autologousT-lymphocytes genetically retargeted against carbonic anhydrase IX:firstclinical experience.J clin oncol，2006，24(13):e20-e22.；Ngo MC.，et al.Ex vivogene transfer for improved adoptive immunotherapy of cancer.Human MolecularGenetics，2011，R1–R7]。另外，CAR中过多的共刺激信号会降低效应细胞激活所需的阈值，使得基因修饰的T淋巴细胞在低水平抗原或没有抗原触发的条件下也可能会被活化，导致大量细胞因子的释放以致可能引发所谓的“细胞因子风暴”。这种信号外漏(singnalleakage)会导致脱靶细胞毒性，从而产生非特异性的组织损伤。例如，在采用针对Her2的第三代CAR临床治疗一个具有肝和肺转移的晚期结肠癌患者的过程中由于正常肺组织中低表达Her2而引发所谓的“细胞因子风暴”致病人猝死[Morgan RA.，et al.Report of aserious adverse event following the administration of T cells transduced witha chimeric antigen receptor recognizing Erbb2.Molecular Therapy，2010，18(4):843–851.]。因此，本领域迫切需要研究化解CAR T细胞疗效低及存在潜在风险的问题的方法，开发出更有效杀伤肿瘤细胞的方法。
磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3，GPC3，又称DGSX，GTR2-2，MXR7，OCI-5，SDYS，SGB，SGBS或SGBS1)是一种细胞表面蛋白，属于硫酸乙酰肝素蛋白多糖家族。GPC3基因编码产生70-kDa左右的前体核心蛋白，该前体蛋白能够被弗林蛋白酶(furin)剪切产生40-kDa左右的可溶性的能够进入血液的氨基端(N末端)肽和30-kDa左右含有2个硫酸乙酰肝素(HS)糖链的膜结合的羧基端(C末端)肽。GPC3蛋白通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚依附在细胞膜上。
GPC3高度表达于胎儿肝脏，而不表达于正常成年人的肝组织，但在肝细胞肝癌中恢复表达，与肝癌的发生发展有十分密切的关系，不仅在肝癌发生的早期检出率较高，而且随着肝癌的发展，其检出率也随之增高。而GPC3的表达在肝腺癌，胆管细胞癌，肝转移癌和12种常见实体瘤和21种非肝癌细胞系中均未检测出。此外，GPC3也在例如黑色素瘤，卵巢透明细胞癌、卵黄囊瘤、神经母细胞瘤等肿瘤中表达。
利用抗GPC3抗体进行肝癌检测和利用抗GPC3抗体的抗体依赖的(ADCC)或补体依赖的(CDC)细胞毒性研究方案已有报道。一般用于治疗的抗体识别的是GPC3蛋白的C末端。然而，抗体治疗存在着抗体在体内血液循环中半衰期的限制，一般来说，半衰期大多在23天以内。因此，持续给药和/或增大给药剂量是肿瘤抗体治疗所要求的，这导致患者治疗成本的增加，以及某些情况下，甚至不得已终结治疗。另外，治疗性抗体作为异源蛋白，还有可能在体内产生过敏反应及针对该治疗性抗体的中和性抗抗体的风险。
本发明人的已有研究表明针对GPC3的CAR T细胞对GPC3阳性的肝癌细胞具有非常好的杀伤作用(CN201310164725.x)。但是，GPC3虽然在肝脏等大部分正常器官没有表达，但是在胃腺体(3/7[43％])、肾小管((9/17[53％])和睾丸生殖细胞中有表达。需要考虑单独靶向GPC3的CAR T细胞就有可能对这些正常组织(胃腺体，肾小管和睾丸生殖细胞)产生损伤。
去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR1，或称ASGR1)，又称半乳糖受体，是一种跨膜蛋白，相对分子质量约41000，由H1和H2两个结构不同的亚基组成，H1是受体的主要组分。ASGPR1的胞外结构域含有糖识别结构域(carbohydraterecognition domain，CRD)，能识别和结合半乳糖残基和N乙酰半乳糖胺残基。当CRD与特异的糖残基结合后，即发生受体介导的胞吞作用。ASGPR1的主要功能是清除外周血循环中失去末端唾液酸而暴露半乳糖残基或乙酰半乳糖胺残基的糖蛋白、脂蛋白和凋亡细胞，还介导嗜肝病毒(如乙肝病毒和丙肝病毒)与肝细胞的结合及摄取。ASGPR1主要表达于哺乳动物肝窦状隙的肝实质细胞表面，密度很高，每个细胞表面可多达500000个受体。在发生肝细胞肝癌、肝炎、肝硬化等肝脏疾病时，ASGPR1表达数量及功能有所下降。
目前现有技术中，从来没有关于ASGPR1作为免疫细胞治疗的靶点，更没有将GPC3、ASGPR1与CAR免疫效应细胞联合应用的报导。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双靶向GPC3和ASGPR1的转基因免疫效应细胞及其应用。
在本发明的第一方面，提供一种双靶向的嵌合抗原受体(CAR)免疫效应细胞，该细胞表达如下嵌合受体：特异性识别GPC3的嵌合抗原受体；和特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体。
在一个优选例中，所述的特异性识别GPC3的嵌合抗原受体包括：抗GPC3的单链抗体(scfv)，T细胞刺激信号分子。
在另一优选例中，所述的T细胞刺激信号分子选自：CD3ζ或FcεRIγ；更佳地，所述的特异性识别GPC3的嵌合抗原受体包括(较佳地5’→3’)：抗GPC3的单链抗体(scfv)，CD8跨膜区，CD3ζ。
在另一优选例中，在抗GPC3的单链抗体(scfv)的5’端，还包括报告基因1(如eGFP)、F2A，藉由F2A将报告基因1与抗GPC3的单链抗体相连，藉由报告基因1呈现细胞内所述特异性识别GPC3的嵌合抗原受体的表达情况。
在另一优选例中，所述的特异性识别GPC3的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的特异性识别GPC3的嵌合抗原受体由病毒载体表达；较佳地为慢病毒载体，如pWPT。
在另一优选例中，所述的特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体包括：抗ASGPR1的单链抗体(scfv)，T细胞激活的共刺激信号分子。
在另一优选例中，所述的T细胞激活的共刺激信号分子选自：CD27，CD28，CD137，CD134，ICOS蛋白的胞内信号区，或其组合；更佳地，所述的特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体包括(较佳地5’→3’)：抗ASGPR1的单链抗体(scfv)，CD28分子的跨膜区(CD28a)，CD28分子的胞内信号区(CD28b)和CD137胞内信号区。
在另一优选例中，在抗ASGPR1的单链抗体(scfv)的5’端，还包括报告基因2(如mCherry)、F2A，藉由F2A将报告基因2与抗ASGPR1的单链抗体相连，藉由报告基因2呈现细胞内所述特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体的表达情况。
在另一优选例中，所述的特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述的特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体由病毒载体表达；较佳地为慢病毒载体，如pWPT。
在另一优选例中，所述的免疫效应细胞选自：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞。
在本发明的另一方面，提供所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药盒；所述的肿瘤是GPC3和ASGPR1双阳性肿瘤；较佳地所述的肿瘤是肝癌。
在本发明的另一方面，提供一种用于治疗肿瘤的药盒，所述的药盒中包括：所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞；所述的肿瘤是GPC3和ASGPR1双阳性肿瘤；较佳地所述的肿瘤是肝癌。
在本发明的另一方面，提供一种用于制备所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞的试剂盒，所述的试剂盒中包括：
(a)表达构建物a，其包括特异性识别GPC3的嵌合抗原受体的表达盒(能在免疫细胞中表达)；和
(b)表达构建物b，其包括特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体的表达盒(能在免疫细胞中表达)。
在一个优选例中，所述的特异性识别GPC3的嵌合抗原受体的表达盒包括表达抗GPC3的单链抗体和T细胞刺激信号分子的构建物(表达载体)；较佳地其具有SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体的表达盒包括表达抗ASGPR1的单链抗体和T细胞激活的共刺激信号分子的构建物(表达载体)；较佳地其具有SEQID NO:23所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的特异性识别GPC3的嵌合抗原受体包括：抗GPC3的单链抗体，T细胞刺激信号分子；较佳地，所述的T细胞刺激信号分子选自：CD3ζ或FcεRIγ；
所述的特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体包括：抗ASGPR1的单链抗体，T细胞激活的共刺激信号分子；较佳地，所述的T细胞激活的共刺激信号分子选自：CD27，CD28，CD137，CD134，ICOS蛋白的胞内信号区，或其组合。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、ASGPR1和GPC3在各种肝癌细胞系的表达水平的Western-blot检测结果。
图2、ASGPR1和GPC3在各种肝癌细胞系的表达水平的流式细胞检测结果。
图3、Western-blot检测MHCC-97H-G、MHCC-97H-A、MHCC-97H-GA稳转细胞系中GPC3、ASGPR1表达情况。
图4、Western blot检测感染的T细胞目的基因的表达。
图5、表达不同嵌合抗原受体的T细胞与表达不同抗原的靶细胞共培养后，在第7天检测T细胞的增殖情况。
图6、将Mock T、GCAR T、ACCR T以及GZ+28BB T淋巴细胞与ASGPR1和GPC3表达阳性的MHCC-97H-GA细胞或两者阴性表达的MHCC-97H的细胞按效靶比1:1共孵育24h，收集T淋巴细胞，检测BCL-XL XL的表达情况。
图7、MHCC-97H-A、MHCC-97H-G、MHCC-97H-GA细胞体内抗肿瘤活性检测。
图8、过继转移基因修饰的T淋巴细胞后1周，检测外周血内T细胞的数量。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次揭示了一种能同时识别GPC3和ASGPR1的基因修饰的免疫效应细胞，其可应用于GPC3和ASGPR1双阳性肿瘤(如肝癌)的治疗。
术语“嵌合抗原受体(CAR)免疫效应细胞”是本领域公知的，其是利用基因改造技术表达肿瘤特异性嵌合抗原受体的免疫效应细胞，在体外和临床试验中显示出一定的靶向性、杀伤活性和持久性，为过继性细胞免疫治疗方法。所述的免疫效应细胞例如包括T细胞，NK细胞。
常规的制备“嵌合抗原受体免疫效应细胞”的方法是本领域技术人员已知的，包括让其表达胞外抗原(如肿瘤相关抗原)结合区；以及胞内共刺激细胞分子胞内结构域，例如CD28(较佳地包括CD28a，CD28b)，CD137，CD27，CD3ζ(较佳地为CD3ζ细胞内域)，CD8，CD19，CD134，CD20，FcRγ中的一种或多种。通过它们与相应配体结合，激活免疫效应细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞的存活时间。
本发明中，除非另外说明，所述的肿瘤是指GPC3和ASGPR1双阳性的肿瘤，例如所述的肿瘤包括：肝癌。
本发明人在研究中意外地发现，磷脂酰肌醇蛋白多糖-3(Glypican-3，GPC3，又称DGSX，GTR2-2，MXR7，OCI-5，SDYS，SGB，SGBS或SGBS1)和去唾液酸糖蛋白受体(asialoglycoprotein receptor，ASGPR1，或称ASGR1)在肝癌细胞中共表达，这是至今没有文献报导的。
基于GPC3和ASGPR1的共表达这一新发现以及本发明人长期研究经验，本发明人针对这两个蛋白设计了双靶向的免疫效应细胞，其同时含有能识别GPC3的嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor recognizing GPC3，GCAR)以及能识别ASGPR1的嵌合共刺激受体(Chimeric costimulatory receptor recognizing ASGPR1，ACCR)。
本发明的免疫效应细胞，其中一种嵌合受体胞外区含有一段识别GPC3的多肽组成，胞内区具有T细胞刺激信号(如CD3ζ或FcεRIγ的ITAM基序)，称为GCAR；另一个嵌合受体的胞外区含有一段识别ASGPR的多肽，胞内区含有T细胞激活的共刺激信号区段(可以是CD28，CD137或者其它共刺激信号分子的胞内信号区段)，称为ACCR。所述嵌合受体均含有一个跨膜区。所述识别GPC3或ASGPR的多肽可以是配体蛋白、小分子多肽、单链抗体、单结构域抗体或其它抗体片段。
本发明的编码嵌合受体的核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明的编码嵌合抗原受体蛋白氨基酸序列的核酸密码子可以是简并的，即编码同一氨基酸序列的多种简并核酸序列都包含在本发明的范围之中。编码对应氨基酸的简并核酸密码子是本领域公知的。本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
特异性识别人GPC3的C末端表位的单克隆抗体已被公开在例如，中国专利文献CN101186650A中外制药株式会社)，此外据文献Advances in Liver Cancer AntibodyTherapies:A Focus on Glypican-3and Mesothelin，BioDrugs.2011October 1；25(5):275–284其他已知特异性识别C末端表位的单克隆抗体包括GC33和hGC33也分别被报道，其针对GPC3的抗原决定簇位于C端524-563位氨基酸残基，同时被报道的还包括GPC3-C02和1G12等单克隆抗体。这些被公开的单克隆抗体可以用于制备本发明的核酸所编码的嵌合抗原受体中的单链抗体部分。其他识别GPC3的C末端表位的单克隆抗体也可以合适的方式运用于本发明。还有针对GPC3的硫酸乙酰肝素链的单克隆抗体也有报道(Gao W，Kim H，FengM，Phung Y，Xavier CP，Rubin JS，Ho M.Inactivation of Wnt signaling by a humanantibody that recognizes the heparan sulfate chains of glypican-3for livercancer therapy.Hepatology.2014Aug；60(2):576-87)。
作为本发明的优选方式，采用特异性识别人GPC3的单链抗体(scfv)。单链抗体scFv(GPC3)可以根据上述公开的GPC3单克隆抗体的序列通过基因工程方法或化学合成方法制备。本发明中使用的术语“单链抗体(scFv)片段”指的是通过如下定义的抗体片段，其是包含通过接头(linker)连接的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的重组蛋白，接头使得这两个结构域相关联，以最终形成抗原结合位点。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。本发明使用的单链抗体可单独或联合使用本领域已知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加、和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是众所周知的；见例如，Sambrook，分子克隆：实验手册，ColdSpring Harbor Laboratory(1989)N.Y.。所指的修饰优选在核酸水平上进行。上述单链抗体还可以包括其衍生物。本发明中“抗体的衍生物”包括例如当通过噬菌体展示技术获得所述抗体的衍生物时，可使用如BIAcore系统中使用的表面等离子共振技术来增加与GPC3抗原表位结合的噬菌体抗体的效率(Schier，人抗体杂交瘤7(1996)，97-105；Malmborg,免疫学方法杂志183(1995)，7-13)。还包括，例如WO 89/09622中描述的嵌合抗体的产生的方法，EP-A10239400和WO90/07861中描述的人源化抗体产生的方法，WO91/10741,WO94/02602和WO96/33735中有描述的产生异种抗体例如小鼠中的人抗体的方法所产生的抗体的衍生物。
本发明的术语“特异性识别”的意思是本发明的双特异性抗体不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。在本发明中，特异性识别优选通过流式细胞技术来确定，而具体情况下特异性识别的标准可由本领域一般技术人员根据其掌握的本领域常识来判断。
嵌合受体的跨膜区可以选自CD8或CD28等蛋白的跨膜区。CD8或CD28是T淋巴细胞表面的天然标记物。人CD8蛋白是个异二聚体，由αβ或者γδ两条链组成。在本发明的一个实施方案中，跨膜区选自CD8α或者CD28的跨膜区。此外，CD8α铰链区(hinge)是一个柔性区域，因此，CD8或CD28和跨膜区加上铰链区被用于将嵌合受体CAR或CCR的靶点识别结构域和胞内信号区连接起来。
GCAR的胞内信号区可以选自CD3或FcεRIγ；ACCR的胞内信号区可以选自CD27，CD28，CD137，CD134，ICOS蛋白的胞内信号区，或其组合。CD3分子由五个亚单位组成，其中CD3ζ亚单位(又称CD3zeta，简称Z)含有3个ITAM基序，该基序是TCR-CD3复合体中重要的信号转导区。CD3δZ是截短的不具有ITAM基序的CD3ζ序列，在本发明实践中一般作为阴性对照的构建。FcεRIγ主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，其含有一个ITAM基序，在结构、分布及功能上与CD3ζ类似。此外如前所述，CD27、CD28、CD137、CD134、ICOS是共刺激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作用引起T淋巴细胞的持续增殖，并能够提高T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高存在相应T淋巴细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。
本发明的核酸所编码的抗GPC3嵌合受体蛋白GCAR可以选自按如下方式顺序连接：scFv(GPC3)-CD8-CD3ζ；其中scFv(GPC3)代表识别GPC3的单链抗体，CD8代表CD8的跨膜区。
本发明的核酸所编码的抗ASGPR1嵌合受体蛋白ACCR可以选自按如下方式顺序连接：Fv(ASGPR)-CD28a-CD28b-CD137；其中相关嵌合抗原受体蛋白中Fv(ASGPR1)代表识别ASGPR1的单结构域抗体；CD28a代表CD28分子的跨膜区，CD28b代表CD28分子的胞内信号区，CD137代表CD137分子的胞内信号区。
本发明还包含上述编码表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体蛋白的核酸构建物或载体。在一个具体实施方案中，本发明使用的载体是一种慢病毒质粒载体pWPT-eGFP。该质粒属于第三代自灭活慢病毒载体系统，该系统共有三个质粒即编码蛋白Gag/Pol、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2；编码VSV-G蛋白的包膜质粒PMD2.G；及空载体pWPT-eGFP，其可以用于重组引入目的核酸序列，即编码CAR的核酸序列。空载体pPWT-eGFP(其本身为后续试验中的mock)中由延长因子-1α(elongation factor-1α，EF-1α)启动子调控增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)的表达。而包含编码CAR的目的核酸序列的重组表达载体pWPT-eGFP-F2A-CAR是通过由来自口蹄疫病毒(food-and-mouthdisease virus，FMDV)的核糖体跳跃序列(ribosomal skipping sequence 2A)(简称F2A)实现eGFP与CAR的共表达的。
本发明还包括包含上述载体的病毒。本发明的病毒包括包装后的具有感染力的病毒，也包括包含包装为具有感染力的病毒所必需成分的待包装的病毒。本领域内已知的其他转导T淋巴细胞的病毒及其对应的质粒载体也可用于本发明。
在本发明的一个实施方案中，所述病毒是包含上述pWPT-eGFP-F2A-CAR重组载体(即含有scFv(GPC3)-CAR)的慢病毒。
本发明还包括一种基因修饰的T淋巴细胞，其被转导有本发明的核酸或被转导有本发明的上述包含所述含有该核酸的重组质粒，或包含该质粒的病毒。本领域常规的核酸转导方法，包括非病毒和病毒的转导方法都可以用于本发明。基于非病毒的转导方法包括电穿孔法和转座子法。近期Amaxa公司研发的nucleofector核转染仪能够直接将外源基因导入细胞核获得目的基因的高效转导。另外，基于睡美人转座子(Sleeping Beautysystem)或PiggyBac转座子等转座子系统的转导效率较普通电穿孔有较大提高，将nucleofector转染仪与睡美人转座子系统联合应用已有报道[Davies JK.，etal.Combining CD19redirection and alloanergization to generate tumor-specifichuman T cells for allogeneic cell therapy of B-cell malignancies.Cancer Res，2010，70(10):OF1-10.]，该方法既具有较高的转导效率又能够实现目的基因的定点整合。在本发明的一个实施方案中，实现嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞的转导方法是基于病毒如逆转录病毒或慢病毒的转导方法。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。在该转基因T淋巴细胞表面，转导的核酸通过转录、翻译表达在其表面。通过对各种不同的培养的肿瘤细胞进行体外细胞毒实验证明，本发明的抗GPC3嵌合抗原受体基因修饰的T淋巴细胞具有高度特异性的肿瘤细胞杀伤效果(亦称细胞毒性)。因此本发明的编码嵌合抗原受体蛋白的核酸，包含该核酸的质粒，包含该质粒的病毒和转导有上述核酸，质粒或病毒的转基因T淋巴细胞可以有效地用于肿瘤的免疫治疗。
本发明还涉及包含所述双靶向的免疫效应细胞的药盒。本发明还涉及应用于制备本发明的双靶向的免疫效应细胞的试剂盒。在阅读了本发明后，本领域技术人员了解如何制备所述的药盒或试剂盒。所述的药盒或试剂盒中中还可包含说明用法的使用说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、ASGPR1和GPC3在各种肝癌细胞系的表达水平的检测以及稳定表达的肝癌细胞系的建立
1、ASGPR1和GPC3在各种肝癌细胞系的表达水平的检测
本发明人首先检测了ASGPR1和GPC3在各种肝癌细胞系的表达。
Western-blot检测方法：将生长状态良好的肝癌细胞HepG2、Huh-7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97H、SK-HEP-1以及SMMC-7721细胞分别使用D-PBS洗2次后，加T-REP组织细胞裂解液，冰上裂解1h后，12000rpm离心10min，收集上清。采用BCA法定量按照BCA测定试剂盒说明书操作，紫外分光光度计检测570nm波长的吸光度。之后用12％SDS-PAGE电泳上述收集的样品，分别上样20μg总蛋白。SDS-PAGE电泳后，使用5％的脱脂牛奶封闭2小时后分别加入小鼠抗人GPC3单克隆抗体(上海锐劲生物技术有限公司)以及小鼠抗人ASGPR1单克隆抗体(Abcam公司)，4℃过夜。次日，0.5％PBST洗涤3次后加入HRP-羊抗鼠抗体(上海锐劲生物技术有限公司)，室温孵育1小时，0.5％PBST洗涤3次后加入底物反应，曝光、显影。
Western-blot检测结果如图1所示，ASGPR1以及GPC3蛋白除了在MHCC-97H、SK-HEP-1以及SMMC-7721细胞不表达外，在其余细胞中均有不同程度的表达。
流式细胞检测：将生长状态良好的肝癌细胞HepG2、Huh7、Hep3B、PLC/PRF/5、MHCC-97H、SK-HEP-1以及SMMC-7721细胞用10mM的EDTA消化处理细胞吹散细胞于流式管中，3000～4000rpm离心5min。2mL 1％NCS PBS洗涤2次。加入小鼠抗人GPC3单克隆抗体(上海锐劲生物技术有限公司)以及小鼠抗人ASGPR1单克隆抗体(Abcam公司，终浓度为5μg/mL，冰浴45min；之后用2mL 1％NCS PBS洗涤2次后，加入羊抗鼠IgG-FITC(上海锐劲生物技术有限公司)，冰浴45min；1％NCS PBS洗涤2次后加入200～500μL 1％NPBS重悬细胞，上机检测。
流式结果如图2所示，ASGPR1以及GPC3除了在MHCC-97H、SK-HEP-1以及SMMC-7721细胞不表达外，在其余细胞中均有不同程度的表达，与Western-blot结果一致。
2、ASGPR1和GPC3稳定表达肝癌细胞系的构建及鉴定
肝癌细胞MHCC-97H是GPC3/ASGPR1双阴性细胞，选择双阴性的细胞系MHCC-97H来构建GPC3+，ASGPR1+及GPC3+/ASGPR1+的过表达细胞系，建立MHCC-97H-G、MHCC-97H-A、MHCC-97H-GA三个细胞系，分别代表表达GPC3的MHCC-97H细胞系、表达ASGPR1的MHCC-97H细胞系、同时表达GPC3和ASGPR1的MHCC-97H细胞系。
pWPT-GPC3质粒构建：以Hep 3B细胞cDNA为模板，以上游引物5’-agcttacgcgtcctagcgctaccgg tcgccaccatggccgggaccgtgcgcacc-3’(SEQ ID NO:1)和下游引物5’-CGAGGTCGA CCTATCAGTGCACCAGGAAGAAGAAGCAC-3’(SEQ ID NO:2)扩增获得GPC3全长ORF核酸片段，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性94℃40s，退火56℃40s，延伸68℃50s，进行30个循环；然后总延伸68℃10min。扩增产物经琼脂糖电泳确认，经过MluI和SalI双酶切后插入到经同样双酶切的慢病毒载体pWPT-eGFP连接转化，挑取阳性克隆鉴定并测序确认序列正确即获得含有全长GPC3蛋白(SEQ ID NO:4)的编码序列(SEQ ID NO:3)表达质粒pWPT-GPC3质粒。
pWPT-ASGPR1质粒构建：以含有人的ASGPR1全长ORF的质粒为模板，以上游引物5’-gcttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatgaccaaggagtatcaagacc-3’(SEQ ID NO:5)和下游引物5’-CGAGGTCGACCTATTAAAGGAGAGGTGGCTCCT GGCT-3’(SEQ ID NO:6)扩增ASGPR全长ORF核酸片段，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：56℃，40s；延伸：68℃，50s，进行30个循环，然后总延伸68℃，10min，扩增产物经琼脂糖电泳确认，经过MluI和SalI双酶切后插入到经同样酶切的pWPT-eGFP载体连接转化，挑取阳性克隆鉴定并测序确认序列正确即获得含有全长ASGPR蛋白(SEQ ID NO:8)的编码序列(SEQ ID NO:7)的表达质粒pWPT-ASGPR1质粒。
GPC3和ASGPR1慢病毒包装：
(1)以6×106的密度接种培养至第6～10代的293T细胞于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜准备用于转染，培养基为含10％胎牛血清(PAA)的DMEM。
(2)A液配制：分别将目的基因质粒pWPT-eGFP(即为Mock)、pWPT-GPC3以及pWPT-ASGPR1各10μg，分别与包装质粒pPAX2：7.5μg和包膜质粒pMD2.G：3μg，将质粒溶解于800μl的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀。
(3)B液配制：将60μg PEI(1μg/μl)溶解于800μl的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀，室温孵育5min。
(4)将A液加入B液中轻轻混合，室温下孵育20min。然后将转染复合物1.6ml滴加入10cm培养皿中。
(5)4-5h小时后，用2％FBS的DMEM培基给转染的293T细胞换液。
(6)37℃孵育72h，收集病毒液上清。
病毒感染：取1mL病毒上清，加入终浓度为0.6μg/mL polybrene，重悬5×104细胞，2200rpm，RT，室温离心30min，悬浮感染。离心结束后重悬细胞束后，细胞悬起，补加1mL新鲜培基，铺于6-well中。待细胞基本长满，收集细胞，Western-blot检测混合克隆中细胞中外源蛋白的表达情况。
结果如图3所示，在MHCC-97H-G、MHCC-97H-A、MHCC-97H-GA三个稳转细胞系中分别检测到GPC3、ASGPR1的表达以及GPC3和ASGPR1蛋白的共表达。表明ASGPR1和GPC3稳定转染的肝癌细胞系构建成功。
实施例2、GCAR T细胞(或称GZ T细胞)，ACCR T细胞(或称28BB T细胞)以及GZ+28BB T细胞的建立
1、pWPT-eGFP-F2A-GPC3-CD3ζ构建
scFv(GPC3)序列的扩增以单链双功能抗体核苷酸GPC3/CD3为模板，模板的序列参见中国专利申请201210480326.x中的SEQ ID NO:9。扩增所采用的引物对为上游引物5’-gatgttgtgatgactcagtctc-3’(SEQ ID NO:9)和下游引物5’-gcgctggcgtcgtggttgaggagacggtgaccag-3’(SEQ ID NO:10)用于扩增scFv(GPC3)(SEQ ID NO:11，其编码SEQ ID NO:12)；目的扩增条带大小为746bp。PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：58℃，40s；延伸：68℃，40s；进行30个循环，然后总延伸68℃，10min。PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。
GPC3嵌合抗原受体蛋白的除scFv(GPC3)外其他部分的核酸序列分别以专利申请号为201310108532.2中公开的序列SEQ ID NO:1为模板通过PCR方式获得。具体地，CD8-CD3ζ(Z)以scFv(EFGR)-CD8-CD3ζ(专利申请201310108532.2中SEQ ID NO:1)模板，采用上游引物5’-accacgacgccagcgccgcgaccac-3’(SEQ ID NO:13)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatgtgaag-3’(SEQ ID NO:14)扩增，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性94℃40s，退火60℃40s，延伸68℃40s，进行25个循环；然后总延伸68℃10min。目的条带分别为549bp，PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小。3’端带有F2A及CD8信号肽的eGFP核酸片段扩增以上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3’(SEQ ID NO:15)和下游引物5’-cggcctggcggcgtggagcag-3’(SEQ ID NO:16)扩增慢病毒载体中3’端带有F2A及CD8信号肽的eGFP核酸片段，以专利申请201310108532.2中公开的以scFv(EGFR)-CD8-CD3ζ(专利申请201310108532.2中SEQ IDNO:1)模板为模板，PCR扩增条件为预变性：94℃4min；变性94℃40s，退火56℃40s，延伸68℃50s，进行25个循环；然后总延伸68℃，10min，理论大小为883bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。
分别将如前述段落中扩增获得的片段CD8-CD3ζ，3’端带有F2A及CD8信号肽的eGFP核酸片段(质量约为50ng)及等摩尔的scFv(GPC3)(质量约为50ng)三片段拼接并PCR，拼接条件为：预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagc aagggcgaggag-3’(SEQ ID NO:15)和下游引物5’-gaggtcgacctagcgagggggcagggcctgcatg-3’(SEQ ID NO:14)后PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行20个循环，然后总延伸68℃，10min。扩增获得包含全长eGFP-F2A-GPC3-CD3ζORF(SEQ ID NO:17，编码SEQ ID NO:18)序列，理论大小分别为2161bp，扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。经过MluI和SalI双酶切经同样酶切的pWPT-eGFP载体连接转化，挑取阳性克隆鉴定并测序确认序列正确即获得pWPT-eGFP-F2A-GPC3-CD3ζ。
2、pWPT-mCherry-F2A-ASGPR-CD28a-CD28b-CD137质粒构建
抗ASGPR的单结构域抗体序列如SEQ ID NO:20，通过全基因序列合成获得(SEQ IDNO:19，其编码SEQ ID NO:20)。3’端带有F2A及CD8信号肽的mCherry核酸片段序列通过全基因序列合成获得。ASGPR-CD28a-CD28b-CD137嵌合抗原受体蛋白的除抗ASGPR单结构域抗体外其他部分的核酸序列分别以专利申请号为201310108532.2中公开的序列SEQ ID NO:3为模板通过PCR方式获得。具体地，以scFv(EFGR)-CD8-28BBZ(专利申请201310108532.2中SEQID NO:3)模板，采用上游引物5’-accacgacgccagcgccgcgaccac-3’(SEQ ID NO:13)和下游引物5’GAGGTCGACCTACAGTTCACATCCTCCTTCT-3’(SEQ ID NO:21)扩增，PCR扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，40s；进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。PCR扩增条带通过琼脂糖凝胶电泳确认符合预计的片段大小(477bp)。
分别将如前述段落中扩增获得的片段：3’端带有F2A及CD8信号肽的mCherry核酸片段及等摩尔的抗ASGPR的单结构域抗体，以及CD28a-CD28b-CD137三片段拼接并PCR，拼接条件为：预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行5个循环，然后总延伸68℃，10min，补充DNA聚合酶及上游引物5’-cttacgcgtcctagcgctaccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggag-3’(SEQ ID NO:15)和下游引物5’-GAGGTCGACCTACAGTTCACATCCTCCT-3’(SEQ ID NO:22)后PCR扩增25个循环，扩增条件为预变性：94℃，4min；变性：94℃，40s；退火：60℃，40s；延伸：68℃，140s，进行25个循环，然后总延伸68℃，10min。扩增获得包含mCherry-F2A-ASGPR-CD28a-CD28b-CD137(SEQ ID NO:23，其编码SEQ ID NO:24)全长ORF序列，理论大小分别为1711bp。扩增产物经琼脂糖电泳确认与理论大小一致。经过MluI和SalI双酶切经同样酶切的pWPT-eGFP载体连接转化，挑取阳性克隆鉴定并测序确认序列正确即获得pWPT-mCherry-F2A-ASGPR-CD28a-CD28b-CD137。
GCAR和ACCR慢病毒包装：
(1)以6×106的密度接种培养至第6～10代的293T细胞于10cm培养皿中，37℃，5％CO2培养过夜准备用于转染，培养基为含10％胎牛血清(PAA)的DMEM。
(2)A液配制：分别将目的基因质粒pWPT-eGFP(即为Mock)、pWPT--eGFP-F2A-GPC3-CD3ζ以及pWPT-mCherry-F2A-ASGPR-CD28a-CD28b-CD137各10μg，分别与包装质粒pPAX2：7.5μg和包膜质粒pMD2.G：3μg，将质粒溶解于800μl的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀。
(3)B液配制：将60μg PEI(1μg/μl)溶解于800μl的无血清DMEM培养液中，轻轻混匀，室温孵育5min。
(4)将A液加入B液中轻轻混合，室温下孵育20min。然后将转染复合物1.6ml滴加入10cm培养皿中。
(5)4-5h小时后，用2％FBS的DMEM培基给转染的293T细胞换液。
(6)37℃孵育72h，收集病毒液上清。
3、重组慢病毒感染CTL细胞
外周血单核细胞(PBMC)用Ficoll(来自Biochrom)密度梯度离心方法，按照标准步骤从健康人供主的血液中分离。离心后，用1×磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞，然后重悬于RPMI 1640完全培养基(Gibco)，将分离好的外周血单个核细胞通过CTL细胞磁珠(StemCell Technologies)负性分选方法获得CTL，分选后的CTL细胞进行流式细胞检测CTL细胞的纯度，以CTL细胞的阳性率≥95％为宜进行下一步操作。以约1×106/mL密度加入Quantum007淋巴细胞培养基液(PAA公司)培养并以细胞：磁珠比例为1:1加入同时包被有抗CD3和CD28抗体的磁珠(Invitrogen公司)和终浓度100U/mL的重组人IL-2刺激培养24h。然后以MOI≈5用上述构建的重组慢病毒感染CTL细胞。感染后的细胞每隔一天采用5×105/mL的密度进行传代，同时在淋巴细胞培养液中补加终浓度100U/mL的重组人IL-2。
4、流式细胞分析T细胞感染的阳性率
感染的CTL细胞在培养第8天时通过流式细胞检测不同嵌合抗原受体表达，由于eGFP与CAR共表达以及mCherry与CCR共表达，检测eGFP或mCherry阳性的细胞即为表达嵌合抗原受体的阳性细胞。以未感染的T淋巴细胞作为阴性对照，表达不同嵌合抗原受体的病毒感染CTL细胞其阳性率如表1所示。该阳性率结果表明，通过慢病毒感染的方法能够获得一定阳性率的能识别GPC3的嵌合抗原受体T细胞(GCAR T)，能识别ASGPR1的嵌合共刺激受体T细胞(ACCR T细胞)以及GZ+28BB T细胞。
表1
转染有下列CAR的CTL细胞 CTL细胞感染阳性率
Mock(空载体对照) 66％
GCAR T 61％
ACCR T 57％
GZ+28BB T 30％
5、Western blot检测感染的T细胞目的基因的表达
将感染的Mock T细胞，GCAR T细胞，ACCR T细胞以及GZ+28BB T细胞离心收集后，加入细胞裂解液进行裂解，抽提细胞蛋白，BCA试剂盒(Thermo)进行蛋白定量。采用12％SDS-PAGE电泳上述收集的样品，分别上样20μg的总蛋白。SDS-PAGE电泳后，使用5％的脱脂牛奶封闭2小时后加入小鼠抗人CD3ζ单克隆抗体(Sigma)以及小鼠抗人CD28抗体(Abcam)，4℃过夜。次日0.5％PBST洗涤后加入HRP-羊抗鼠二抗，室温孵育1小时，0.5％PBST洗涤后加入底物显色，曝光。
结果如图4所示，图4A显示在Mock T以及ACCR T细胞中只检测到内源性CD3的表达，而在GCAR T以及GZ+28BB T细胞中则同时检测到内源性CD3的表达和外源转染CD3的表达。图4B则显示了在Mock T以及GCAR T细胞中只检测到内源性CD28的表达，而在ACCR T以及GZ+28BB T细胞中均同时检测到内源性CD28的表达以及外源转染CD28的表达。表明稳定转染嵌合抗原受体的细胞系均构建成功。
实施例3、体外细胞毒性实验
靶细胞：使用HepG2细胞(表达内源性GPC3和ASGPR1，购自ATCC)、MHCC-97H以及稳定转染的肝癌细胞系MHCC-97H-G(高表达GPC3)、MHCC-97H-A(高表达ASGPR1)、MHCC-97H-GA(同时表达GPC3和ASGPR1)。
效应细胞：如实施例2所验证的体外培养的FACS检测嵌合抗原受体表达阳性的CTL细胞：GCAR T细胞，ACCR T细胞以及GZ+28BB T细胞。
效靶比为3:1，靶细胞数量为10000/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。各组均设5个复孔，取5个复孔的平均值。检测时间为第18h。
其中各实验组和各对照组如下：
各实验组：各靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的T细胞，
对照组1：靶细胞最大释放LDH；
对照组2：靶细胞自发释放LDH；
对照组3：效应细胞自发释放LDH。
检测方法：采用CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒(Promega公司)进行。该方法是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。CytoTox检测定量地测量乳酸脱氢酶(LDH)。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐(INT)转化为红色的甲臜(formazan)。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
细胞毒性计算公式为：
实验结果如表2所示，T细胞不管是否表达本发明所述的嵌合抗原受体，均无法对ASGPR1-GPC3-(MHCC-97H)(MHCC-97H细胞，不表达ASGPR1以及GPC3基因)和ASGPR1+GPC3-(MHCC-97H-A)(MHCC-97H-A细胞，只表达ASGPR1而不表达GPC3基因)肝癌细胞产生特异性细胞毒性作用。但是本发明的表达嵌合抗原受体的GCAR T细胞和GZ+28BB T细胞对ASGPR1-GPC3+(MHCC-97H-G)细胞(MHCC-97H-G细胞，只表达GPC3而不表达ASGPR1基因)和ASGPR1+GPC3+(MHCC-97H-GA或HepG2)(MHCC-97H-GA或HepG2细胞，且ASGPR1以及GPC3基因均表达)均能表现出较强特异性细胞毒性作用，并呈现效靶比梯度依赖性即效靶比越高细胞毒性作用越强。GZ+28BB双感染的T细胞在效靶比3：1时对MHCC-97H-GA以及HepG2肝癌细胞的细胞毒性分别为55％和57％，其细胞毒性作用比GCAR T(分别为35％和36％)略强。
相比较而言，被含有mock质粒(不携带GCAR/ACCR的空质粒载体)的病毒转染的作为空白对照的T细胞对上述五种细胞均未产生细胞毒性作用。
表2
实施例5、体外细胞扩增实验
将靶细胞MHCC-97H-G，MHCC-97H-A，MHCC-97H-GA细胞加入丝裂霉素(20μg/mL的终浓度)，37℃孵育2h。然后用PBS洗两遍后，除去残余的裂霉素。胰酶处理，悬起成细胞悬液。将CTL细胞在分别感染包装有不同嵌合抗原受体的病毒后，以细胞密度为5×105/ml与靶细胞1:1混合，隔天传代培养、计数、并对传代的细胞培养液补加IL-2(终浓度为100U/ml)，每周计数一次，共计数三周。结果如下：表达不同嵌合抗原受体的T细胞与表达不同抗原的靶细胞共培养后，在第7天约有6～20倍的扩增(见图5)，GZ+28BB T细胞相比其他的T细胞(包括GCAR T、ACCR T，MockT)，在双抗原的刺激下具有更大的扩增能力。
实施例6、ASGPR1/GPC3蛋白刺激可上调GCAR T、ACCR T以及GZ+28BB T淋巴细胞BCL-XL的表达
将Mock T、GCAR T、ACCR T以及GZ+28BB T淋巴细胞与ASGPR1和GPC3表达阳性的MHCC-97H-GA细胞或两者阴性表达的MHCC-97H的细胞按效靶比1:1共孵育24h，收集T淋巴细胞，检测BCL-XL XL的表达情况，结果如图6，在ASGPR1和GPC3表达阳性的MHCC-97H-GA细胞刺激下，与其他转染的T淋巴细胞相比，GZ+28BB T细胞的BCL-XL的表达水平出现上调，说明在CAR和CCR信号区同时作用的情况下可以上调细胞内BCL-XL的表达，该部分结果进一步提示在双抗原(ASGPR1/GPC3)刺激的作用下，GZ+28BB双感染的T淋巴细胞可能在体内能够更好的存活。
实施例7、体内抗肿瘤活性
(1)接种肿瘤：收集处于对数生长期并生长良好的MHCC-97H-A、MHCC-97H-G、MHCC-97H-GA细胞，每只小鼠接种细胞数为3×106。
(2)分组：每个种植瘤模型中，分别将6-8周龄NOD/SCID小鼠随机分为4组，每组6只，实验分组为：No T cell对照组，ACCR T治疗组，GCAR T治疗组，以及GZ+28BBT治疗组。
(3)过继转移T细胞：待小鼠肿瘤体积约200mm3时，腹腔注射环磷酰胺(200mg/kg)，次日，于尾静脉注射6×106/只基因修饰的T细胞(效靶比为2:1)或仅生理盐水。
(4)测量肿瘤体积，观察基因修饰的T细胞对皮下移植瘤的治疗效果。
结果显示，双转染的GZ+28BB T基因修饰的T淋巴细胞显著抑制表达双抗原的MHCC-97H-GA细胞移植瘤的生长，图7所示肿瘤生长曲线，在肿瘤细胞接种后第38天，GZ+28BB T细胞治疗组小鼠移植瘤的体积明显小于其他治疗组(GZ+28BB T vs No T cell，抑制率72％，***P<0.001；GZ+28BB T vs ACCR T，抑制率70％，***P<0.001；GZ+28BB T vsGCAR T，抑制率64％，***P<0.001)，然而，无论在ASGPR+GPC3-以及ASGPR+GPC3-的种植瘤中，GZ+28BB T细胞治疗组均不能明显抑制肿瘤生长，表明GZ+28BB T细胞只有在双抗原同时存在的情况下才能显著抑制肿瘤生长。
实施例8、体内细胞扩增实验
过继转移基因修饰的T淋巴细胞后1周，检测外周血内T细胞的数量。
(1)采用肝素抗凝管从小鼠眼眶采血≥50μL；
(2)采用防倒吸移液器取20μL CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP抗体加入BDTruCounttubes(含有已知数量的珠子)，切忌Tip接触到珠子；吸取50μL充分混匀的抗凝血，盖上管帽与抗体轻柔充分混匀；室温孵育15min(20-25℃)；
(3)加450μL 1×BD FACS裂解缓冲液，盖上管帽与抗体轻柔充分混匀；室温孵育15min(20-25℃)；
(4)上机检测，首先分别对PerCP阳性的细胞进行圈门及beads圈门，进而分别由FITC和PE分析阳性细胞，
(5)计数二者阳性细胞数
计算公式：细胞数/μL＝FITC或PE阳性的细胞数×总的beads数目/beads数目/50μL。
结果如图8所示，在接种MHCC-97H-GA细胞的种植瘤模型中，GZ+28BB T细胞治疗组小鼠体内的T细胞数量极其显著地高于其他治疗组，提示GZ+28BB T淋巴细胞在体内能够更好地存活。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (13)

1.一种双靶向的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，该细胞表达如下嵌合受体：
特异性识别GPC3的嵌合抗原受体；和
特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体，
其中，所述的特异性识别GPC3的嵌合抗原受体包括：抗GPC3的单链抗体，T细胞刺激信号分子；所述的特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体包括：抗ASGPR1的单链抗体，T细胞激活的共刺激信号分子。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，所述的T细胞刺激信号分子选自：CD3ζ或FcεRIγ。
3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，所述的特异性识别GPC3的嵌合抗原受体包括：抗GPC3的单链抗体，CD8跨膜区，CD3ζ。
4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，所述的T细胞激活的共刺激信号分子选自：CD27，CD28，CD137，CD134，ICOS蛋白的胞内信号区，或其组合。
5.如权利要求1所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，所述的特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体包括：抗ASGPR1的单链抗体，CD28分子的跨膜区，CD28分子的胞内信号区和CD137胞内信号区。
6.如权利要求1所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞，其特征在于，所述的免疫效应细胞选自：T淋巴细胞，NK细胞或NKT细胞。
7.权利要求1-6任一所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞的用途，用于制备治疗肿瘤的药盒；所述的肿瘤是GPC3和ASGPR1双阳性肿瘤。
8.如权利要求7所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞的用途，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌。
9.一种用于治疗肿瘤的药盒，其特征在于，所述的药盒中包括：权利要求1-6任一所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞；
所述的肿瘤是GPC3和ASGPR1双阳性肿瘤。
10.如权利要求9所述的药盒，其特征在于，所述的肿瘤是肝癌。
11.一种用于制备权利要求1-6任一所述的嵌合抗原受体免疫效应细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：
(a)表达构建物a，其包括特异性识别GPC3的嵌合抗原受体的表达盒；和
(b)表达构建物b，其包括特异性识别ASGPR1的嵌合抗原受体的表达盒。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的T细胞刺激信号分子选自：CD3ζ或FcεRIγ。
13.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述的T细胞激活的共刺激信号分子选自：CD27，CD28，CD137，CD134，ICOS蛋白的胞内信号区，或其组合。
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