KR102519861B1

KR102519861B1 - γδ T-세포 집단의 선택적 확장을 위한 방법 및 그의 조성물

Info

Publication number: KR102519861B1
Application number: KR1020187035576A
Authority: KR
Inventors: 아야 자코보비츠; 오릿 푸어드; 앤디 안-데 린; 마리안느 테레사 산타귀다; 라디카 체탄 데사이; 이펑 프랭크 징; 다울렛 카딜 삿파예브; 얀 리
Original assignee: 아디셋 바이오, 인크.
Priority date: 2016-05-12
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2023-04-10
Also published as: US11299708B2; JP7210286B2; KR20190016960A; AU2023278051A1; CN110072533B; EP3454870A1; EP3454870A4; WO2017197347A1; IL262919A; MX2023006546A; CN118421557A; JP2019519210A; ZA201808140B; IL262919B2; JP2022180371A; IL262919B1; CN110072533A; CA3023993A1; AU2017261804A1; IL301527A

Abstract

본 발명은 γδ T-세포 집단(들)의 선택적 확장을 위한 방법, 이의 조성물 및 혼합물 및 이를 치료제로서 이용하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 비-조작된 그리고 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단은 다양한 암, 감염성 질환 및 면역 장애의 치료에서 유용하다.

Description

γδ T-세포 집단의 선택적 확장을 위한 방법 및 그의 조성물

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 미국 특허법(Section 119(e)) 하에서 2016년 5월 12일자로 출원된 미국 가출원 특허 제62/335,572호의 유익의 주장하며, 이 기초출원의 전체 개시내용은 전문이 모든 목적을 위하여 참고로 포함된다.

T 림프구에 의한 항원 인식은 고도로 다양한 이형이량체 수용체인 T-세포 수용체(T-cell receptor: TCR)에 의해 달성될 수 있다. 혈액 및 림프 기관 중의 인간 T-세포의 대략 95%는 이형이량체 αβTCR 수용체(αβT-세포 계통)를 발현시킨다. 혈액 및 림프 기관 중의 인간 T-세포의 대략 5%는 이형이량체 γδ TCR 수용체(γδ T-세포 계통)를 발현시킨다. 이들 T-세포 서브세트는 각각 'αβ' 및 'γδ' T-세포로서 지칭될 수 있다. αβ와 γδ T-세포는 기능이 상이하다. 이어서, αβT-세포의 활성화는 항원 제시 세포(antigen presenting cell: APC)가 클래스 I/II MHC와 관련하여 항원을 제시할 때 일어난다. αβT-세포와 대조적으로, γδ T-세포는 MHC 제한과 독립적으로 항원을 인식할 수 있다. 추가로, γδ T-세포는 선천성 면역과 입양 면역 둘 다의 인식 및 반응을 조합한다.

γδ T 세포는 체세포적으로 재배열된 가변(V), 다양성(D), 결합(J) 및 불변(C) 유전자의 별개의 세트를 이용한다. γδ T 세포는 αβT 세포보다 더 소수의 V, D 및 J 세그먼트를 함유한다. 생식계열 Vγ 및 Vδ 유전자의 수는 Vα 및 Vβ TCR 유전자의 레퍼토리보다 더 제한되지만, TCR γ 및 δ쇄 재배열 동안 더 광대한 접합 다양화 과정은 TCR의 레퍼토리보다 잠재적인 더 큰 TCR 레퍼토리를 야기한다(Carding and Egan, Nat Rev Immunol (2002)　 2:336).

인간 γδ T-세포는 그들의 TCR을 만드는 데 3가지의 주된 Vδ(Vδ1, Vδ2, Vδ3) 및 최대 6가지의 Vγ 영역 유전자를 사용한다(Hayday AC., Annu Rev Immunol. 2000;18, 975-1026). 2가지 주된 Vδ 서브세트는 Vδ1 및 Vδ2 γδ T 세포이다. TCR이 상피 세포 상의 스트레스 분자를 인식하는 것으로 나타나는 경우에 상이한 Vγ를 갖는 Vδ1 T 세포는 점막 γδ T 세포의 상피내 서브세트에서 우세하다(Beagley KW, Husband AJ. Crit Rev Immunol. 1998;18(3):237-254). 일반적으로 Vγ9를 공동발현시키는 Vδ2 T 세포는 말초 혈액 및 림프계에서 흔하다.

병에 걸린 세포 상의 항원을 직접적으로 인식하고 종양 세포를 사멸시키는 고유한 능력을 나타내는 γδ T-세포의 능력은 γδ T-세포에 매력적인 치료 도구를 제공한다. Vγ9Vδ2 T 세포의 입양 전달은 암의 연구 치료를 위한 제한된 객관적 임상 반응을 수득하였는데(Kondo et al, Cytotherapy, 10:842- 856, 2008; Lang et al, Cancer Immunology, Immunotherapy: CII, 60: 1447-1460, 2011; Nagamine et al, 2009; Nicol et al, British Journal of Cancer, 105:778-786, 2011; Wilhelm et al, Blood. 2003 Jul 1;102(1):200-6), 이는 새로운 γδ T-세포 집단을 단리시키고 임상적으로 시험할 필요를 나타낸다.

개선된 순도로 그리고 임상적으로 적절한 수준에서 강한 항종양 활성을 갖는 γδ T-세포 서브세트 집단을 선택적으로 확장시키는 능력은 고도로 바람직하다. 항체 및 사이토카인 칵테일은 더 다양한 세트의 γδ T 세포를 증식시키는 데 사용되었지만, 충분한 순도 및 임상적으로 적절한 수준으로 특정 γδ T-세포 서브세트의 활성화는 달성되지 않았다(Dokouhaki et al, 2010; Kang et al, 2009; Lopez et al, 2000; Kress, 2006). 따라서, 생체밖 특정 γδ T 세포 서브세트를 확장시키는 임상적으로 적절한 방법, 및 이에 의해 생산된 세포가 크게 필요하다.

서열목록

본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출되고 본 명세서에 전체가 참고로 포함된 서열목록을 함유한다. 2016년 3월 3일자로 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 47165-701.201-SL.txt이며 용량은4,366 킬로바이트이다.

일 양상에서, 본 발명은 풍부한 γδ T-세포 집단을 생성하기 위한 생체외 방법을 제공한다. 농축 γδ T-세포 집단은 농축된 γδ T 세포 집단을 제공하기 위해 혼합 세포 집단, 또는 이의 정제된 분획을:

i) δ1 TCR의 특이적인 에피토프에 결합함으로써 δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키거나,

ii) δ2 TCR의 특이적인 에피토프에 결합함으로써 δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키거나,

iii) δ1 TCR 및 δ4 TCR의 특이적인 에피토프에 결합함으로써 δ1 및 δ4 T-세포를 선택적으로 확장시키거나, 또는

iv) δ1 TCR, δ3 TCR, δ4 TCR 및 δ5 TCR의 특이적인 에피토프에 결합함으로써 δ1, δ3, δ4 및 δ5 T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 단리된 혼합 세포 집단으로부터 생산될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 농축된 γδ T 세포 집단은 임상적으로 적절한 수준의 γδ T 세포를 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 임상적으로 적절한 수준의 농축된 γδ T 세포 집단을 제공하기 위해 혼합 세포 집단을:

iv) δ1 TCR, δ3 TCR, δ4 TCR 및 δ5 TCR의 특이적인 에피토프에 결합함으로써 δ1, δ3, δ4 및 δ5 T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제와 직접적으로 접촉시키는 단계를 포함하는 단리된 혼합 세포 집단으로부터 농축된 γδ T-세포 집단을 생산하기 위한 생체외 방법을 제공한다.

특정 실시형태에서, 임상적으로 적절한 수준은 대략 더 많은 또는 적어도 약, 10⁸개의 γδ T 세포, 10⁹개의 γδ T 세포, 10¹⁰개의 γδ T 세포, 10¹¹개의 γδ T 세포 또는 10¹²개의 γδ T 세포(예를 들어, 약 10⁸ 내지 약 10¹²개)를 포함한다. 일 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 단일 공여자로부터 유래되며, 상기 방법은 단일 공여자로부터, 예를 들어, 단일 공여자로부터의 단일 샘플로부터 또는 단일 공여자로부터의 2 이상의 샘플로부터 확장된 농축된 γδ T 세포 집단의 임상적으로 적절한 수준을 제공한다. 다른 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 1 초과의 공여자 또는 다중 공여자로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 제1 농축 단계 후에, 농축된 γδ T-세포 집단은 10⁸개 초과의 임상적으로 적절한 수준의 γδ T-세포 서브세트를 포함한다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 제2, 제3, 제4, 제5 등의 농축 단계 후에, 농축된 γδ T-세포 집단은 10⁸개 초과의 임상적으로 적절한 수준의 γδ T-세포 서브세트를 포함한다.

특정 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 TS-1 및 TS8.2로부터 선택되는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 제제로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 TS-1 및/또는 TS8.2 항체에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 에피토프에 결합하는 제제이다. 일부 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 TS-1 또는 TS8.2 항체에 의해 결합되는 에피토프와 중복되지 않는 에피토프 또는 이들 항체와 경쟁하지 않는 에피토프에 결합하는 제제이다. 일부 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 δ1 가변 영역을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 제제로부터 선택된다. 다른 실시형태에서, 제제는 도 24의 공통 서열의 아미노산 서열을 포함하는 δ1 TCR 가변 영역에 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 제제는 δ1 가변 영역의 잔기 Arg71 또는 Asp72, 및/또는 J1 또는 J2 영역의 Lys120을 포함하는 에피토프에 결합한다. 일부 실시형태에서, 제제는 δ1 J1 또는 δ1 J2의 K120에서의 돌연변이, 예를 들어, K120A, K120G, K120P, K120V, K120E, K120D 또는 K120S를 포함하는 돌연변이체 δ1 TCR 폴리펩타이드에 대해 감소된 결합을 가진다.

특정 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 항체 R9.12와 동일한 에피토프에 결합하는 제제로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 항체 R9.12에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 에피토프에 결합하는 제제이다. 일부 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 항체 R9.12에 의해 결합되는 에피토프와 중복되지 않는 에피토프 또는 이들 항체와 경쟁하지 않는 에피토프에 결합하는 제제이다.

특정 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 δ1 및 δ4 T-세포, 또는 δ1, δ3, δ4 및 δ5 T 세포에 선택적으로 결합하고/하거나 이들을 확장시키는 제제이다. 특정 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 δ1-05, δ1-08, δ1-18, δ1-22, δ1-23, δ1-26, δ1-35, δ1-37, δ1-39, δ1-113, δ1-143, δ1-149, δ1-155, δ1-182, δ1-183, δ1-191, δ1-192, δ1-195, δ1-197, δ1-199, δ1-201, δ1-203, δ1-239, δ1-253, δ1-257, δ1-278, δ1-282, 및 δ1-285로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 상보성 결정 영역(complementarity determining region: CDR)을 포함하는 제제이다. 특정 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 δ1-05, δ1-08, δ1-18, δ1-22, δ1-23, δ1-26, δ1-35, δ1-37, δ1-39, δ1-113, δ1-143, δ1-149, δ1-155, δ1-182, δ1-183, δ1-191, δ1-192, δ1-195, δ1-197, δ1-199, δ1-201, δ1-203, δ1-239, δ1-253, δ1-257, δ1-278, δ1-282 및 δ1-285로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 가변 영역을 포함하는 제제이다. 특정 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 δ1-05, δ1-08, δ1-18, δ1-22, δ1-23, δ1-26, δ1-35, δ1-37, δ1-39, δ1-113, δ1-143, δ1-149, δ1-155, δ1-182, δ1-183, δ1-191, δ1-192, δ1-195, δ1-197, δ1-199, δ1-201, δ1-203, δ1-239, δ1-253, δ1-257, δ1-278, δ1-282, 및 δ1-285로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 동일한 에피토프, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 이들로부터 선택되는 항체와 경쟁하는 제제이다. 특정 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 δ1-05, δ1-08, δ1-18, δ1-22, δ1-23, δ1-26, δ1-35, δ1-37, δ1-39, δ1-113, δ1-143, δ1-149, δ1-155, δ1-182, δ1-183, δ1-191, δ1-192, δ1-195, δ1-197, δ1-197, δ1-199, δ1-201, δ1-203, δ1-239, δ1-253, δ1-257, δ1-278, δ1-282, 및 δ1-285로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체이다. 특정 실시형태에서, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 Bin 1 δ1 에피토프, Bin 1b δ1 에피토프, Bin 2 δ1 에피토프, Bin 2b δ1 에피토프, Bin 2c δ1 에피토프, Bin 3 δ1 에피토프, Bin 4 δ1 에피토프, Bin 5 δ1 에피토프, Bin 6 δ1 에피토프, Bin 7 δ1 에피토프, Bin 8 δ1 에피토프 또는 Bin 9 δ1 에피토프에 결합하는 항체이다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 T 림프구를 포함하는 단리된 혼합 세포 집단으로부터 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ1 세포를 포함하는 농축된 γδ T-세포 집단(들)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 확장된 γδ T-세포 집단을 정제시키는 단계 전에, 예를 들어, 농축된 γδ T-세포 집단(들)으로부터 γδ T-세포의 양성 선택(예를 들어, δ1 T 세포, δ1 및 δ3 γδ T 세포; δ1 및 δ4 γδ T 세포의 양성 선택; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포(예를 들어, 표시된 δ-아형(들)의 γδ T 세포); 및/또는 δ2 T 세포의 양성 선택)에 의해, 또는 농축된 γδ T-세포 집단(들)로부터 비- γδ T-세포(예를 들어, 비-δ1 T 세포, 예컨대 αβ T 세포)의 고갈에 의해, T 림프구를 포함하는 단리된, 예를 들어, 혼합 세포 집단으로부터 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ1 세포를 포함하는 농축된 γδ T-세포 집단(들)을 제공한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 δ1 γδ T 세포 및 δ2 γδ T 세포를 포함하는 γδ T-세포 집단을 제공하되, 상기 집단은 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ1 γδ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 δ1 γδ T 세포; δ2 γδ T 세포; δ1 및 δ4 γδ T 세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 γδ T 세포를 포함하는 γδ T-세포 집단을 제공하되, (i) 상기 집단은 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ1 γδ T 세포이거나; (ii) 상기 집단은 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ1 및 δ3 γδ T 세포이거나; (iii) 상기 집단은 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ1 및 δ4 γδ T 세포이거나; 또는 (iv) 상기 집단은 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 γδ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 αβ T 세포가 없거나 또는 이의 약 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 미만을 함유하는 γδ T 세포(예를 들어, δ1 γδ T 세포)의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.

특정 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1.2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4% 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 이하의 γδ T 세포(예를 들어, δ1, δ2, δ1 및 δ2, δ1 및 δ3, 또는 δ1 및 δ4 γδ T 세포 또는 이들의 조합)를 포함한다. 특정 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 0.5% 내지 약 5% γδ T 세포(예를 들어, δ1, δ2, δ3, δ4 또는 δ8 γδ T 세포 또는 이들의 조합)를 포함한다.

특정 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 순환성 또는 샘플-(예를 들어, 종양- 또는 상피 샘플) 침윤성 γδ T-세포보다 더 큰 중위 수준을 갖는 공여자 또는 다중 공여자로부터 유래된다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 0.5% 내지 약 10% γδ T 세포(예를 들어, δ1, δ2, δ3, δ4 또는 δ8 γδ T 세포 또는 이들의 조합)를 포함한다. 다른 예로서, 일부 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 10% 내지 약 30% γδ T 세포(예를 들어, δ1, δ2, δ3, δ4 또는 δ8 γδ T 세포 또는 이들의 조합)를 포함한다. 일부 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 1.5% 이하의 γδ T 세포, 바람직하게는 약 1.2% 미만의 γδ T 세포, 더 바람직하게는 약 1% 미만의 γδ T 세포, 또한 더 바람직하게는 약 0.5% 미만의 γδ T 세포, 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 0.4%의 γδ T 세포를 포함한다.

특정 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20%의 T 림프구 및 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1.2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4% 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 γδ T 세포(예를 들어, δ1, δ2, δ1 및 δ2, δ1 및 δ3, 또는 δ1 및 δ4 γδ T 세포 또는 이들의 조합)를 포함한다. 특정 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20%의 T 림프구 및 약 0.5% 내지 약 5%의 γδ T 세포(예를 들어, δ1, δ2, δ3, δ4 또는 δ8 γδ T 세포 또는 이들의 조합)를 포함한다.

특정 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 순환성 또는 샘플-(예를 들어, 종양- 또는 상피 샘플) 침윤성 γδ T-세포보다 더 큰 중위 수준을 갖는 공여자 또는 다중 공여자로부터 유래된다. 따라서, 예를 들어, 일부 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20%의 T 림프구 및 약 0.5% 내지 약 10%의 γδ T 세포(예를 들어, δ1, δ2, δ3, δ4 또는 δ8 γδ T 세포 또는 이들의 조합)를 포함한다. 다른 예로서, 일부 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20%의 T 림프구 및 약 10% 내지 약 30%의 γδ T 세포(예를 들어, δ1, δ2, δ3, δ4 또는 δ8 γδ T 세포 또는 이들의 조합)를 포함한다. 일부 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20%의 T 림프구 및 약 1.5% 미만의 γδ T 세포, 바람직하게는 약 1.2% 미만의 γδ T 세포, 더 바람직하게는 약 1% 미만의 γδ T 세포, 또한 더 바람직하게는 약 0.5% 미만의 γδ T 세포, 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 0.4%의 γδ T 세포를 포함한다.

일부 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 말초 혈액 샘플(예를 들어, 전혈, PBMC 또는 PBL), 백혈구분반술 샘플, 제대혈 샘플, 종양 샘플, 또는 조직 샘플(예를 들어, 상피 샘플)로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 단일 공여자로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 1 초과의 공여자 또는 다중 공여자로부터 유래된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 다클론성 γδ TCR 다양성을 포함하는 농축된 γδ T-세포 집단(들)을 제공한다.

다른 실시형태에서, δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 B6 및 15D로부터 선택되는 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 제제로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 B6 및 15D로부터 선택되는 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 제제로부터 선택된다. 또 다른 실시형태에서, δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 B6 또는 15D 항체에 의해 결합되는 에피토프와 중복되지 않는 에피토프에 결합하거나, 또는 이들 항체와 경쟁하는 제제로부터 선택된다. 일 실시형태에서, δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 δ2 가변 영역을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 제제로부터 선택된다. 구체적 실시형태에서, 제제는 δ2 가변 영역의 G35에서의 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 δ2 TCR에 대해 감소된 결합을 가진다.

특정 실시형태에서, δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 δ2-14, δ2-17, δ2-22, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36 및 δ2-37(또는 δ2-14, δ2-17, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36 및 δ2-37)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 제제이다. 특정 실시형태에서, δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 δ2-14, δ2-17, δ2-22, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36 및 δ2-37(또는 δ2-14, δ2-17, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36 및 δ2-37)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체의 가변 영역을 포함하는 제제이다.

특정 실시형태에서, δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 δ2-14, δ2-17, δ2-22, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36, 및 δ2-37(또는 δ2-14, δ2-17, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36, 및 δ2-37)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 동일하거나, 또는 본질적으로 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 이들 항체화 경쟁하는 제제이다. 특정 실시형태에서, δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 δ2-14, δ2-17, δ2-22, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36, 및 δ2-37 (or δ2-14, δ2-17, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36, 및 δ2-37)로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체이다. 특정 실시형태에서, δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 Bin 1 δ2 에피토프, Bin 2 δ2 에피토프, Bin 3 δ2 에피토프, 또는 Bin 4 δ2 에피토프에 결합하는 항체이다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 T 림프구를 포함하는 단리된 혼합 세포 집단으로부터 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ2 세포를 포함하는 농축된 γδ T-세포 집단(들)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 확장된 γδ T-세포 집단을 정제시키는 단계 전에, 예를 들어, 농축된 γδ T-세포 집단(들)으로부터의 γδ T-세포의 양성 선택(예를 들어, δ2 T 세포의 양성 선택)에 의해, 또는 농축된 γδ T-세포 집단(들)로부터의 비-γδ T-세포의 고갈(예를 들어, 비-δ2 T 세포의 고갈 또는 αβ T 세포의 고갈)에 의해 T 림프구를 포함하는 단리된, 예를 들어, 혼합된, 세포 집단으로부터 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ2 세포를 포함하는 농축된 γδ T-세포 집단(들)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 δ2 γδ T 세포 및 δ1 γδ T 세포를 포함하는 γδ T-세포 집단을 제공하되, 상기 집단은 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 δ2 γδ T 세포이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 αβ T 세포가 없거나 또는 이의 약 2%, 1%, 0.5%, 0.4%, 0.1%, 0.05% 또는 0.01% 미만을 함유하는 δ2 γδ T 세포의 집단을 포함하는 조성물을 제공한다.

특정 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20% T 림프구 및 약 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4% 0.3%, 0.2%, 0.1%, 0.05% 또는 0.02% 미만의 δ2 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 말초 혈액 샘플(예를 들어, PBMC 또는 PBL), 백혈구분반술 샘플, 제대혈 샘플, 종양 또는 조직으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 다클론성 TCR 다양성을 포함하는 농축된 γδ T-세포 집단(들)을 제공한다.

특정 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 항원 제시 세포(APC), 인공 항원 제시 세포(aAPC), 항원 제시 세포의 방사선 조사된 집단(예를 들어, 방사선 조사된 PBMC, 방사선 조사된 불멸 세포주, 또는 방사선 조사된 aAPC), 아미노포스포네이트, 아미노포스페이트, 비스포스포네이트, 또는 이들의 조합물에 의해 확장되지 않거나 또는 이들의 존재 하에 확장되지 않는다. 특정 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 방사선 조사된 PBMC에 의해 확장되지 않거나, 또는 이들의 존재 하에 확장되지 않는다. 특정 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 방사선 조사된 aAPC(예를 들어, 조작된 K562, RPMI8226, T2 또는 JVM-3)에 의해 확장되지 않거나, 또는 이들의 존재 하에 확장되지 않는다. 특정 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 불멸 세포주의 방사선 조사된 집단에 의해 확장되지 않거나, 또는 이의 존재 하에 확장되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, δ1 T-세포, δ2 T-세포, δ1 T-세포 및 δ4 T-세포, 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포(예를 들어, γδ T 세포)를 선택적으로 확장시키는 상기 1종 이상의 제제는 항체이다.

일부 실시형태에서, δ1 T-세포, δ2 T-세포, δ1 T-세포 및 δ4 T-세포, 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포(예를 들어, 표시된 δ-아형(들)의 γδ T 세포)를 선택적으로 확장시키는 상기 1종 이상의 제제는 표면 상에 고정된다. 일부 실시형태에서, δ1 T-세포, δ2 T-세포, δ1 T-세포 및 δ4 T-세포, 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포(예를 들어, 표시된 δ-아형(들)의 γδ T 세포)를 선택적으로 확장시키는 상기 1종 이상의 제제는 제1 및/또는 제2 또는 후속적 확장에서 항원 제시 세포(예를 들어, aAPC)의 표면 상에 고정된다. 항원 제시 세포의 표면 상에 고정된 제제는, 예를 들어, APC의 표면 상에서 발현된 Fc 수용체에 결합될 수 있거나 또는 APC의 표면 상에서 발현될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, IL-18, IL-19, IL-21, IL-23, IL-33, IFNγ, 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF), 과립구 집락자극인자(G-CSF), 렉틴(예를 들어, PHA-E, PHA-L 또는 ConA), 또는 이들 중 2 이상의 또는 모두의 조합물로 보충된 배양 배지를 이용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 IL-21로 보충되지 않은 배양물 배지를 이용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, IL-18, IL-19, IL-21, IL-23, IL-33, IFNγ, 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF), 과립구 집락자극인자(G-CSF), 렉틴(예를 들어, PHA-E, PHA-L 또는 ConA), 또는 이들 중 2 이상의 또는 모두의 조합물로 보충된 배양 배지를 이용하는 제1 γδ T-세포 확장에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 IL-21로 보충되지 않은 배양물 배지를 이용하는 제1 γδ T-세포 확장에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, IL-18, IL-19, IL-21, IL-23, IL-33, IFNγ, 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF), 과립구 집락자극인자(G-CSF), 렉틴(예를 들어, PHA-E, PHA-L 또는 ConA), 또는 이들 중 2 이상의 또는 모두의 조합물로 보충된 배양 배지를 이용하는 제2 γδ T-세포 확장에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 IL-21로 보충되지 않은 배양물 배지를 이용하는 제2 γδ T-세포 확장에 의해 수행된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 임의의 본 명세서에 기재된 γδ T-세포 확장 방법 또는 조성물을 포함하는 제1 γδ T-세포 확장, 및 δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ3 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포(예를 들어, 표시된 δ-아형(들)의 γδ T 세포)를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제가 없는 배양물 배지를 이용하는 제2 γδ T-세포 확장에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 본 명세서에 기재된 임의의 γδ T-세포 확장 방법 또는 조성물(예를 들어, 활성화제)을 포함하는 제1 γδ T-세포 확장, 그리고, 이어서, i) δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제가 없거나; ii) (예를 들어, 고정된) 구조적으로 상이한 δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 선택적으로 확장시키는 제제를 함유하거나; iii) 비고정(가용성) δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 함유하거나; 또는 iv) αβ T 세포에 비해 T 세포를 확장시키는(예를 들어, αβ 및 γδ T 세포를 확장시키거나) 또는 γδ T 세포를 선택적으로 확장시키는 제제를 함유하는, 배양 배지를 이용하는 제2 γδ T-세포 확장에 의해 수행되며, 이 방법은 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포, 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포의 집단, 및/또는 세포의 단리된 혼합 집단을 δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포(예를 들어, 표시된 δ-아형(들)의 γδ T 세포)를 선택적으로 확장시키는 고정된 제제와 접촉시키는 단계를 포함한다.

일부 경우에, T 세포를 확장시키는 제제는 CD3, 예컨대 항-CD3 항체(예를 들어, OKT3)에 결합하는 제제이다. 일부 경우에, γδ T 세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 γ-쇄 불변 영역 또는 δ-쇄 불변 영역에 결합하는 제제, 또는 γδ TCR에 결합하는 제제, 예컨대 γδ TCR에 결합하는 항체(예를 들어, IMMU510)이다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 제1 세포 확장과 제2 세포 확장 사이의, 그리고/또는 제2 세포 확장 후의 양성 선택에 의해 농축된다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 제1 세포 확장과 제2 세포 확장 사이의, 그리고/또는 제2 세포 확장 후의 αβ T 세포의 고갈에 의해 농축된다.

본 발명의 방법의 특정 실시형태에서, 예를 들어, 농축된, γδ T-세포 집단은 항원 제시 세포(APC)를 함유하는 배양 배지에서 제1, 제2 또는 후속적 확장에서 확장된다. 일부 실시형태에서, 배양 배지는 T 세포를 확장시키거나, γδ T-세포를 확장시키거나, γδ T-세포를 선택적으로 확장시키거나, 또는 δ1 T-세포, δ2 T-세포, δ1 T-세포 및 δ3 T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제, 또는 δ1 T-세포 및 δ4 T-세포(예를 들어, γδ TCR의 불변 또는 가변 영역에 결합하는 항체, CD3에 결합하는 항체, 및/또는 아미노포스포네이트)를 함유한다. 특정 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 방사선 조사된 PBMC를 함유하는 배양 배지에서 확장된다. 특정 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 방사선 조사된 인공 APC(aAPC)를 함유하는 배양 배지에서 확장된다. 특정 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 불멸 세포주(예를 들어, K562 APC)의 방사선 조사된 세포 집단을 함유하는 배양 배지에서 확장된다. 일부 경우에, APC는 HLA 클래스 I, HLA 클래스 II, HLA 클래스 II 비변이체 쇄 및/또는 HLA-DM을 발현시키지 않고/않거나 이들의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 경우에, APC는 접착 또는 공자극 분자, 예컨대 세포내 접착 분자-1, CD11a, CD18, CD54, CD80, CD86, 4-1BBL, OX-40L, CD70, 또는 막, 및/또는 백혈구 기능-관련 항원-3에 걸린 하나 이상의 γδ T 세포 활성화제를 발현시킨다. 일부 경우에, APC는 Fc 수용체, 예컨대 본 명세서에 기재된 γδ T-세포 확장 방법에서 사용되는 활성화제의 아이소타입에 특이적인 Fc 수용체를 발현시킨다. 일부 경우에, APC는 CD64, CD32A, CD32B, CD32C, CD16A, CD16B, FcRn, TRIM21, 또는 CD307, 또는 더 고친화도 또는 변경된 특이성을 갖는 이들의 조작된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현시킨다.

일부 실시형태에서, 항원 제시 세포(APC), 인공 항원 제시 세포(aAPC), 또는 항원 제시 세포(예를 들어, PBMC, 불멸 세포주, 또는 aAPC)의 방사선 조사된 집단을 함유하는 배양 배지는 추가로 δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ3 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제를 추가로 함유한다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, 방사선 조사된, PBMC, APC, aAPC 또는 불멸 세포주의 세포 집단은 그들의 세포 표면 상에서 δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제를 발현시킨다. 일부 바람직한 실시형태에서, δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 선택적으로 확장시키는 상기 1종 이상의 제제는 항체이다. 일부 실시형태에서, δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T-세포를 선택적으로 확장시키는 상기 1종 이상의 제제는 APC의 표면 상에서 발현되거나 또는 APC의 표면 상에서 발현된 Fc-수용체(예를 들어, Fcγ 수용체)에 결합되는 항체이다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 (i) (a) (예를 들어, γδ TCR에 결합함으로써) γδ T-세포를 확장시키거나, 또는 (b) 제1 γδ T-세포 확장에서

- δ1 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1 T-세포;

- δ2 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ2 T-세포;

- δ1 TCR 및 δ4 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는

- δ1, δ3, δ4, 및 δ5 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제와 직접적으로 접촉시켜, 제1의 농축된 γδ T-세포 집단을 생산하는 단계, 및 이어서 (ii) 선택적으로 (a) T-세포를 확장시키거나, (b) (예를 들어, γδ TCR에 대한 결합에 의해) γδ T-세포를 확장시키거나, 또는 (c) 제2 γδ T-세포 확장에서:

- δ1, δ3, δ4, 및 δ5 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 가용성 또는 불멸화제의 존재 하에서 제1의 농축된 γδ T-세포 집단의 적어도 일부를 항원 제시 세포(APC)와 직접적으로 접촉시켜, 제2의 농축된 γδ T-세포 집단을 생산하는 단계를 포함하는 단리된, 예를 들어, 혼합 세포 집단으로부터 농축된 γδ T-세포 집단을 생산하는 생체외 방법을 제공하되, 제2의 농축된 γδ T-세포 집단은 임상적으로 적절한 수(예를 들어, 10⁸개 초과)의 δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 포함한다.

일부 경우에, 임상적으로 적절한 수(예를 들어, 10⁸개 초과)의 γδ T-세포는 단일 공여자로부터, 예를 들어, 단일 샘플 또는 공여자로부터의 2개 이상의 샘플로부터 얻는다. 일부 경우에, 임상적으로 적절한 수(예를 들어, 10⁸개 초과)의 γδ T-세포는 확장의 30일 미만 내에, 바람직하게는 확장의 21일 미만, 더 바람직하게는 확장의 19일 내에, 단일 공여자로부터, 예를 들어, 단일 샘플 또는 공여자로부터의 2 이상의 샘플로부터 얻는다.

일부 경우에, γδ T-세포 집단은 (i)과 (ii) 사이에, 또는 (ii) 후에 양성 선택에 의해 농축된다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 (i)과 (ii) 사이에, 또는 (ii) 후에 αβ T 세포의 고갈에 의해 농축된다. 일부 경우에, T 세포를 확장시키는 제제는 CD3, 예컨대 항-CD3 항체에 결합하는 제제이다. 일부 경우에, γδ T 세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 γ-쇄 불변 영역 또는 δ-쇄 불변 영역에 결합하는 제제, 또는 γδ TCR에 결합하는 제제, 예컨대 γδ TCR에 결합하는 항체(예를 들어, IMMU510)이다.

본 발명의 방법의 특정 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 (i) 단리된, 예를 들어, 혼합된, 세포 집단을 (a) (예를 들어, γδ TCR에 결합함으로써) γδ T-세포를 확장시키거나 또는 (b)

- δ1, δ3, δ4, 및 δ5 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 선택적으로 활장시키는 1종 이상의 제1 제제와 접촉시켜, 제1 γδ T-세포 확장에서 제1 농축된 γδ T 세포 집단을 제공하는 단계; 및, 이어서, (ii) 제2 γδ T-세포 확장에서, 제1 농축된 γδ T 세포 집단, 또는 이의 일부를 (a) T 세포를 확장시키거나, (b) (예를 들어, γδ TCR에 대한 결합에 의해) γδ T-세포를 확장시키거나, 또는 (c)

- δ1, δ3, δ4, 및 δ5 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 선택적으로 확장시키는, 1종 이상의 제2 제제와 접촉시켜 제2 농축된 γδ T 세포 집단을 제공하는 단계에 의해 생산되되, 1종 이상의 제2 제제는 1종 이상의 제1 제제와 구조적으로 상이하다. 일부 경우에, 1종 이상의 제2 제제는 1종 이상의 제1 제제에 비교하여 상이한 γδ TCR 에피토프에 결합한다.

일부 경우에, γδ T-세포 집단는 (i)과 (ii) 사이에, 또는 (ii) 후에 양성 선택에 의해 농축된다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 (i)과 (ii) 사이에, 또는 (ii) 후에 αβ T 세포의 고갈에 의해 농축된다. 일부 경우에, T 세포를 확장시키는 제제는 CD3, 예컨대 항-CD3 항체에 결합하는 제제이다. 일부 경우에, γδ T 세포를 선택적으로 확장시키는 제제는 γ-쇄 불변 영역 또는 δ-쇄 불변 영역에 결합하는 제제, 또는 γδ TCR에 결합하는 제제, 예컨대 γδ TCR에 결합하는 항체(예를 들어, IMMU510)이다.

일부 경우에, 제1 γδ T-세포 확장은 항원 제시 세포(APC)를 함유하는 배양 배지에서 수행된다. 일부 경우에, 제2 γδ T-세포 확장은 항원 제시 세포(APC)를 함유하는 배양 배지에서 수행된다. 일부 경우에, 제1 γδ T-세포 확장은 항원 제시 세포(APC)를 함유하지 않는 배양 배지에서 수행된다. 일부 경우에, 제1 γδ T-세포 확장은 항원 제시 세포(APC)를 함유하지 않는 배양 배지에서 수행되고, 제2 γδ T-세포 확장은 항원 제시 세포(APC)를 함유하지 않는 배양 배지에서 수행된다. 일부 경우에, 제1 및 제2 γδ T-세포 확장은 항원 제시 세포(APC)를 함유하는 배양 배지에서 수행된다. 일부 경우에, 제1 및 제2 γδ T-세포 확장은 아미노포스페이트, 아미노포스포네이트, 비스포스포네이트 또는 이들의 조합물을 함유하는 배양 배지에서 수행된다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 농축된 γδ T-세포 집단(들)은 대상체에 대한 투여를 위해 추가로 제형화될 수 있다. 본 발명의 농축된 γδ T-세포 집단(들)은 치료적 유효량의 γδ T-세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, γδ T-세포 집단(들)은 1개 이상의 구조적으로 별개의 종양 인식 모이어티를 안정하게 발현시키도록 조작된다. 특정 실시형태에서, 조작된 γδ T-세포(들)는 본 명세서에 기재된 바와 같이 확장되고/되거나 추가로 확장된다.

일부의 앞서 언급한 양상, 실시형태, 경우 및 예에서, 1종 이상의 제제는 30시간 미만에, 예를 들어 약 17시간 초과 내지 약 30시간 미만에 1회 세포 분할의 평균 속도에서 γδ T-세포의 확장을 자극한다. 일부 실시형태에서, 상기 분할의 평균 속도는 γδ T-세포 확장의 0-4, 0-5, 0-7 연속일, γδ T-세포 확장의 0-13 연속일, γδ T-세포 확장의 0-19 연속일, γδ T-세포 확장의 0-21 연속일 동안 또는 γδ T-세포 확장의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 19 또는 21 연속일 동안이다. 다른 실시형태에서, 1종 이상의 제제는 24시간 미만에, 예를 들어 약 17시간 초과 내지 약 24시간 미만에 1회 세포 분할의 평균 속도에서 γδ T-세포의 확장을 자극한다. 다른 실시형태에서, 1종 이상의 제제는 18시간 미만 또는 약 18시간에 1회 세포 분할의 평균 속도로 γδ T-세포의 확장을 자극한다.

앞서 언급한 양상, 실시형태, 경우 및 예 중 하나 이상은, 예컨대 γδ T-세포 조작된 클론 또는 세포주, 하나 이상의(예를 들어, 구조적으로 상이한) 조작된 γδ T-세포를 함유하는 집단을 확립한 후에, 또는 γδ T-세포를 함유하는 세포 집단의 음성 또는 양성 선택 중 하나 이상의 단계 후에 실질적으로 균질한 세포의 집단으로부터 γδ T-세포 확장(예를 들어, 선택적γδ T-세포 확장)에 용이하게 적합하게 될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 앞서 언급한 방법 중 하나 이상 또는 이들의 조합은 조작된 γδ T-세포 또는 이의 집단을 가용성 또는 고정된 형태(예를 들어, APC의 표면 상에 고정)에서 본 명세서에 기재된 항체 중 하나 이상을 포함하는 본 명세서에 기재된 임의의 1종 이상의 활성화 제제와 접촉시킴으로써 조작된 γδ T-세포를 확장시키는 데 사용될 수 있다.

이렇게 해서, 일부 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 본 명세서에 제공된 방법 또는 조성물에서, γδ T-세포 조작된 클론 또는 세포주, 또는 하나 이상의(예를 들어, 구조적으로 상이한) 조작된 γδ T-세포를 함유하는 집단으로 대체된다.

다른 양상에서, 본 발명은 선택적으로 확장된 γδ T-세포 집단(들)을 제공하되, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 확장된 γδ T-세포는 δ1 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1 T-세포, δ3 T-세포, δ4 T-세포, 및 δ5 T-세포이다. 특정 실시형태에서, 선택적으로 확장된 γδ T-세포 집단(들)은 δ1 T-세포 및 δ2 T-세포를 포함하되, 60%, 70%, 80% 또는 90% 초과의 확장된 γδ T-세포는 δ1 T-세포 δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1 T-세포, δ3 T-세포, δ4 T-세포, 및 δ5 T-세포이다. 특정 실시형태에서, 선택적으로 확장된 γδ T-세포 집단(들)은 γδ T-세포의 양성 선택(예를 들어, δ1 T 세포, δ1 T-세포 및 δ3 T-세포, 또는 δ1 T-세포 및 δ4 T-세포의 양성 선택)에 의해 농축된 γδ T-세포 집단으로부터의, 또는 농축된 γδ T-세포 집단으로부터의 비- γδ T-세포의 고갈(예를 들어, 비-δ1 T 세포, 예컨대 αβ T 세포의 고갈)에 의해 정제되지 않았다.

특정 실시형태에서, 선택적으로 확장된 γδ T-세포 집단(들)은 T 림프구를 포함하는 단리된 혼합 세포 집단과 별개로 확장된다. 특정 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%의 T 림프구 및 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1.2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4% 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 δ1 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1.2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4% 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 δ1 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플, 종양, 상피 조직, 또는 피부, 간 또는 기타 조직의 생검으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 단일 공여자로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 1 초과의 공여자 또는 다중 공여자로부터 유래된다. 일 실시형태에서, 확장된 γδ T-세포 집단(들)은, 예를 들어, 결장 선암종 전이, 간, 난소, 두경부, 또는 신장의 암으로부터 단리될 수 있는 종양 침윤성 림프구로부터 유래된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 선택적으로 확장된 γδ T-세포 집단(들)은 미경험 또는 T 중추 기억(TCM) 표현형 CD45RA+/CD27+ 및/또는 CD45RA-/CD27+를 각각 발현시키는 60% 또는 70% 초과의 δ1 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1 T-세포, δ3 T-세포, δ4 T-세포, 및 δ5 T-세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 확장된 γδ T-세포 집단은 다클론성 γδ TCR 다양성을 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 선택적으로 확장된 γδ T-세포 집단(들)을 제공하되, 80% 또는 90% 초과의 확장된 γδ T-세포는 δ2 T-세포이다. 특정 실시형태에서, 선택적으로 확장된 γδ T-세포 집단(들)은 농축된 γδ T-세포 집단으로부터의 γδ T-세포의 양성 선택(예를 들어, δ2 T 세포의 양성 선택)에 의해, 또는 비- 농축된 γδ T-세포 집단으로부터의 γδ T-세포의 고갈(예를 들어, 비-δ2 T 세포의 고갈, 예컨대 αβ T 세포의 고갈)에 의해 정제되지 않았다. 특정 실시형태에서, 선택적으로 확장된 γδ T-세포 집단(들)은 T 림프구를 포함하는 단리된 혼합 세포 집단과 별개로 확장된다. 특정 실시형태에서, γδ T-세포 집단(들)으로부터 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20%의 T 림프구 및 약 60%, 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1.2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4% 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 δ2 세포를 포함한다. 특정 실시형태에서, γδ T-세포가 본 명세서에 기재된 방법에서 확장된 단리된 혼합 세포 집단은 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1.5%, 1.2%, 1%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4% 0.3%, 0.2% 또는 0.1% 미만의 δ2 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플 또는 종양으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 확장된 γδ T-세포 집단(들)은, 예를 들어, 결장 선암종 전이, 간, 난소, 두경부, 또는 신장의 암으로부터 단리될 수 있는 종양 침윤성 림프구로부터 유래된다.

다른 양상에서, 본 발명은 선택적으로 확장된 γδ T-세포 집단(들)을 제공하되, 확장된 γδ T-세포의 10 내지 90%는 δ1 T-세포이고, 확장된 γδ T-세포의 90 내지 10%는 δ2 T-세포이다.

특정 실시형태에서, 상기 집단은 동시에 또는 별개의 접촉 단계들에서, 예를 들어 혼합 세포 집단을 δ1 세포; δ1 T-세포 및 δ3 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1 T-세포, δ3 T-세포, δ4 T-세포, 및 δ5 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제와, 그리고 δ2 세포를 선택적으로 확장시키는 제제와 접촉시킴으로써, 함께 확장된다. 다른 실시형태에서, 집단은 단리된 혼합 세포 집단으로부터 별개로 그리고 선택적으로 확장된 δ1 및 δ2 T-세포 집단의 혼합물이다. 모든 실시형태에서, 본 발명의 확장된 γδ T-세포 집단(들) 또는 이의 혼합물은 대상체에 대한 투여를 위해 추가로 제형화될 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 γδ T-세포 또는 γδ T-세포 집단(들)은 발현 카세트에 의해 암호화되는 1개 이상의 구조적으로 별개의 종양 인식 모이어티를 안정하게 발현시키도록 조작된다. 일 실시형태에서, γδ T-세포는 발현 카세트에 의해 암호화되는 2개 이상의 구조적으로 별개의 종양 인식 모이어티를 안정하게 발현시키도록 유전자 조작된다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 구조적으로 별개의 종양 인식 모이어티는 동일한 항원의 상이한 에피토프 또는 상이한 항원의 상이한 에피토프를 인식한다. 종양 인식 모이어티는 (i) 세포 표면 종양 항원 또는 (ii) MHC와의 복합체(펩타이드-MHC 복합체)로서 세포 표면 상에서 발현되는 종양 항원으로부터 유래되는 펩타이드에 결합하는, αβ TCR, γδ TCR, αβ TCR 또는 γδ TCR의 단편, 키메라 항원 수용체(CAR), 전체 항체 또는 그들의 항원-결합 단편, 단일쇄 가변 단편(scFv), 중쇄 또는 경쇄 단일 도메인 항체(sdAb), Fab, F(ab)₂, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 실시형태에서, 종양 인식 모이어티는 비-MHC 제한 방식으로 종양-특이적 항원을 인식하는 종양 침윤성 림프구의 γδ TCR이다.

다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 따라 얻은 확장된 γδ T-세포 집단(들)을 제공한다. 일부 실시형태에서, γδ T-세포 집단은 항원 제시 세포 또는 아미노포스포네이트에 의한 항원 자극 없이 생체외에서 확장된다. 특정 실시형태에서, γδ T-세포 집단은 단클론성 항체, 항체 단편 또는 융합 단백질에 의해 생체외에서 활성화된다. 본 발명의 γδ T-세포 집단(들)은 또한 IL-2와의 공동 투여 없이 대상체에 대한 투여를 위해 제형화될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 γδ T-세포 집단(들)은 또한 IL-2와의 공동 투여와 함께 대상체에 대한 투여를 위해 제형화될 수 있다.

다른 양상에서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명에 따른 확장된 γδ T-세포 집단을 투여하는 단계를 포함하는, 암치료가 필요한 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 확장된 γδ T-세포 집단은 대상체의 MHC 좌위에 대해 동종이계이다. 특정 실시형태에서, 확장된 γδ T-세포 집단은 1개 이상의 발현 카세트에 의해 암호화된 1개 이상의, 또는 2개 이상의 종양 인식 모이어티를 안정하게 발현시키도록 조작된다. 추가 실시형태에서, 확장된 γδ T-세포 집단은 적어도 2개의 구조적으로 상이한 인식 모이어티를 안정하게 발현시키고, 각각의 구조적으로 상이한 인식 모이어티는 (i) 동일한 항원의 상이한 에피토프, 또는 (ii) 상이한 항원의 상이한 에피토프를 인식한다. 종양 인식 모이어티는 (i) 세포 표면 종양 항원 또는 (ii) MHC와의 복합체(펩타이드-MHC 복합체)로서 세포 표면 상에서 발현되는 종양 항원으로부터 유래되는 펩타이드에 결합하는, 전체 항체 또는 그들의 항원-결합 단편, 단일쇄 가변 단편(scFv), 중쇄 또는 경쇄 단일 도메인 항체(sdAb), Fab, F(ab)₂, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, αβ TCR, γδ TCR, 키메라 항원 수용체(CAR)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

다른 양상에서, 본 발명은 조작된 γδ T-세포를 제공하되, 조작된 γδ T-세포는 종양 인식 모이어티를 발현시키도록 조작되되, 종양 인식 모이어티는 종양 항원을 인식하고, 그리고/또는 조작된 γδ T-세포는 TS-1, TS8.2, B6 또는 15D 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 1종 이상의 제제의 존재 하에서 시험관 내에서(예를 들어, 시험관내에서 접촉됨) 확장된다. 다른 양상에서, 본 발명은 조작된 γδ T-세포를 제공하되, 조작된 γδ T-세포는 종양 인식 모이어티를 발현시키도록 조작되되, 종양 인식 모이어티는 TS-1, TS8.2, B6 또는 15D 항체에 의해 결합되는 에피토프와 상이한 에피토프 또는 이들과 중복되지 않는 에피토프에 결합하는 1종 이상의 제제의 존재 하에서 시험관 내에서(예를 들어, 시험관내에서 접촉됨) 확장된다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 γδ T-세포에 대한 TS-1, TS8.2, B6 또는 15D의 결합과 경쟁하지 않는 1종 이상의 제제의 존재 하에서 시험관 내에서(예를 들어, 시험관내에서 접촉됨) 확장된다. 일 실시형태에서, 상기 제제는 본 명세서에 기재된 가용성 또는 고정된 활성화제 중 임의의 1종 이상이다. 일 실시형태에서, 조작된 γδ T-세포는 δ1, δ2, δ3 또는 δ4 조작된 T-세포이다.

특정 실시형태에서, 조작된 γδ T-세포는 적어도 하나의 HLA 좌위로부터의 유전자 발현을 결여하도록 추가로 조작된다. 일 실시형태에서, 1종 이상의 제제는 30시간 미만에, 예를 들어 약 17시간 초과 내지 약 30시간 미만에 1회 세포 분할의 평균 속도에서 조작된 γδ T-세포의 확장을 자극한다. 일부 실시형태에서, 상기 분할의 평균 속도는 γδ T-세포 확장의 0-4, 0-5, 0-7 연속일, γδ T-세포 확장의 0-13 연속일, γδ T-세포 확장의 0-19 연속일, γδ T-세포 확장의 0-21 연속일 동안 또는 γδ T-세포 확장의 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 19 또는 21 연속일 동안이다. 다른 실시형태에서, 1종 이상의 제제는 24시간 미만에, 예를 들어 약 17시간 초과 내지 약 24시간 미만에 1회 세포 분할의 평균 속도에서 조작된 γδ T-세포의 확장을 자극한다. 다른 실시형태에서, 1종 이상의 제제는 18시간 미만 또는 약 18시간에 1회 세포 분할의 평균 속도로 조작된 γδ T-세포의 확장을 자극한다. 특정 실시형태에서, 종양 인식 모이어티는 종양 침윤성 림프구로부터 유래된다.

다른 양상에서, 본 발명은 γδ T-세포의 확장된 집단을 제공하되, γδ T-세포 집단은 항-종양 세포독성을 포함한다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 NKp30 활성, NKp44 활성 및/또는 NKp46 활성과 독립적인 항-종양 세포독성을 포함한다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 항-종양 세포독성을 포함하되, 항-종양 세포독성은 NKp30 활성, NKp44 활성 및/또는 NKp46 활성과 독립적인 항-종양 활성으로 이루어지거나, 또는 본질적으로 이루어진다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 항-종양 세포독성을 포함하되, 항-종양 세포독성의 적어도 50%, 60%, 75%, 80%, 90% 또는 99%는 NKp30 활성, NKp44 활성 및/또는 NKp46 활성과 독립적이다.

일부 경우에, γδ T-세포 집단은 조작된 γδ T-세포의 집단이다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 비-조작된 γδ T-세포의 집단이다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 NKp30 활성-의존적 항-종양 세포독성, NKp44 활성-의존적 항-종양 세포독성, 및/또는 NKp46 활성-의존적 항-종양 세포독성을 포함하지 않는다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 NKp30 활성-의존적 항-종양 세포독성을 포함하지 않는다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 NKp44 활성-의존적 항-종양 세포독성을 포함하지 않는다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 항-CD20 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 γδ T-세포의 조작된 집단이다. 일부 경우에, 집단 내 γδ T-세포의 90%, 80%, 75%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20% 또는 10% 미만은 검출 가능한 수준의 NKp30, NKp44 및/또는 NKp46을 발현시킨다.

참고에 의한 포함

본 명세서에서 언급되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개개 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참고로 포함되는 것으로 구체적으로 그리고 개별적으로 나타내는 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명의 신규한 특징은 특히 첨부하는 청구범위에서 제시된다. 본 발명의 특징 및 이점의 더 양호한 이해는 본 발명의 원칙이 이용되는 예시적 실시형태를 제시하는 다음의 상세한 설명, 및 수반하는 도면(또한 본 명세서에서 "도면" 및 "도")을 참고로 하여 얻을 것이다, 이 중:
도 1은 조작된 γδ T-세포를 개략적으로 도시한 도면. 패널 A는 1개의 종양 인식 모이어티를 발현시키는 조작된 γδ T-세포를 도시한다. 패널 B는 2개의 구조적으로 별개의 종양 인식 모이어티를 발현시키는 조작된 γδ T-세포를 도시한다.
도 2는 대상체를 치료하기 위한 방법을 개략적으로 도시한 도면.
도 3은 대상체에게 조작된 γδ T-세포의 집단을 투여하기 위한 방법을 개략적으로 도시한 도면.
도 4는 간에 대한 결장 선암종 전이(TIL 1) 및 신장 종양(TIL 2)로부터 단리된 γδ1 및 γδ2 림프구의 성장을 도시하며 CCR4 및 CCR7을 발현시키는 것으로 나타난 그래프를 도시한 도면.
도 5는 혈청-함유 및 무혈청 배지 내 γδ T-세포 성장을 도시하는 그래프를 도시한 도면.
도 6은 5A6.E9, B1, TS8.2, 15D, B3, B6, TS-1, γ3.20, 이뮤노510 또는 11F2를 이용하는 항-γδ TCR 항체 차단 실험을 도시하는 그래프를 도시하는 도면.
도 7은 5A6.E9, B1, TS8.2, 15D, B3, B6, TS-1, γ3.20, 이뮤노510 또는 11F2를 이용하는 항-γδ TCR 항체 차단 실험을 도시하는 그래프를 도시하는 도면.
도 8은 항-TCR Vδ1 TS-1 항체를 이용하는 경쟁 실험을 도시하는 도면.
도 9는 항-TCR Vδ1 TS8.2 항체를 이용하는 경쟁 실험을 도시하는 도면.
도 10은 PBMC로부터의 δ1 T-세포의 활성화 및 확장을 도시하는 그래프를 도시하는 도면.
도 11은 PBMC로부터의 δ2 T-세포의 활성화 및 확장을 도시하는 그래프를 도시하는 도면.
도 12는 PBMC로부터의 δ1 T-세포의 확장 배수를 도시하는 그래프를 도시하는 도면.
도 13은 PBMC로부터의 δ2 T-세포의 확장 배수를 도시하는 그래프를 도시하는 도면.
도 14는 인간 Vδ1 아미노산 서열을 도시하는 도면. CDR1, CDR3 및 CDR3 영역은 밑줄 표시되어 있다.
도 15는 인간 Vδ2 아미노산 서열을 도시하는 도면. CDR1, CDR3 및 CDR3 영역은 밑줄 표시되어 있다.
도 16은 Vδ1⁺ T 세포의 상당한 그리고 특정 확장을 초래하는 TS-1 또는 TS8.2 항체를 이용하는 PBMC의 활성화를 도시하는 도면. (A) MAb는 직접적으로 코팅되거나(1㎍/㎖)(TS1, TS8.2, B6 및 15D) 또는 24-웰 플레이트에서 염소-항-마우스 Fc(5㎍/㎖)(TS1Fc, TS8.2Fc, B6Fc 및 15DFc)를 이용하여 (0.1㎍/㎖) 포획하였다. PBMC를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2를 이용하여 RPMI에서 10⁶개의 세포/㎖로 플레이팅하였다. 제7일에, 세포를 항체 없이 새로운 플레이트에 옮기고 나서, 제14일까지 추가로 확장되었다. 배양 배지를 2 내지 3일마다 보충하였다. 데이터는 14일에 걸쳐 Vδ1⁺ 세포의 확장을 도시한다; (B) 제14일 및 제0일(d0)에 Vδ1⁺ 세포의 백분율을 나타내는 A와 동일한 배양물; (C) Vδ1⁺ 세포를 다음과 같이 상이한 공여자로부터의 단리된 PBMC로부터 확장하였다. MAb는 직접적으로 코팅되거나(1㎍/㎖)(TS1, TS8.2, B6 및 15D) 또는 24-웰 플레이트에서 염소-항-마우스 Fc(5㎍/㎖)(TS1Fc, TS8.2Fc, B6Fc 및 15DFc)를 이용하여 (0.1㎍/㎖) 포획하였다. PBMC를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2를 이용하여 PBMC에서 10⁶개의 세포/㎖로 플레이팅하였다. 세포를 제7일에 항체 없이 새로운 플레이트에 옮기고, 신선한 배지를 이용하여 10⁶개의 세포/㎖로 조절하였다. 배양 배지를 2 내지 3일마다 보충하고 나서, 10⁶개 세포/㎖로 조절하였다. 데이터는 14일에 걸친 Vδ1+ 세포 확장을 도시한다. (D) PBMC를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2를 이용하여 RPMI에서 10⁶개의 세포/㎖로 플레이팅하였다. 제7일에, 세포를 항체 없이 새로운 플레이트로 옮기고 나서, 10⁶개의 세포/㎖로 조절하고, 제23일까지 추가로 확장시켰다. 배양 배지를 2 내지 3일마다 보충하였다.
도 17은 B6을 이용하는 PBMC의 활성화를 도시하며 15D 항체는 Vδ2+ T 세포의 상당한 특정 활성화 및 확장을 초래한다는 곳을 도시하는 도면. (A) MAb는 직접적으로 코팅되거나(1㎍/㎖)(TS1, TS8.2, B6 및 15D) 또는 24-웰 플레이트에서 염소-항-마우스 Fc(5㎍/㎖)(TS1Fc, TS8.2Fc, B6Fc 및 15DFc)를 이용하여 (0.1㎍/㎖) 포획하였다. PBMC를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2를 이용하여 RPMI에서 10⁶개의 세포/㎖로 플레이팅하였다. 제7일에, 세포를 항체 없이 새로운 플레이트에 옮기고 나서, 제14일까지 추가로 확장되었다. 배양 배지를 2 내지 3일마다 보충하였다. 데이터는 14일에 걸친 Vδ2⁺ T-세포 확장을 도시한 도면; (B) 제14일 및 제0일(d0)에 Vδ2⁺ 세포의 백분율을 나타내는 A와 동일한 배양물; (C) MAb를 24-웰 플레이트에서 직접적으로 코팅하였다(1㎍/㎖)(15D 및 pan-γδ TCR Mab Immu510). 상이한 공여자로부터의 PBMC를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2를 이용하여 RPMI에서 10⁶개의 세포/㎖로 플레이팅하였다. 제7일에 항체 없이 새로운 플레이트에 세포를 전달하였다. 배양물을 2 내지 3일마다 보충하고 나서, 신선한 배지를 이용하여 10⁶개의 세포/㎖로 조절하였다. 데이터는 14일에 걸친 Vδ2⁺ T-세포 확장; (D) 제14일 및 제0일(d0) Vδ2⁺ T-세포의 백분율을 나타내는 C와 동일한 배양물을 도시한다. (e) MAb는 직접적으로 코팅되거나(1㎍/㎖)(TS1, TS8.2, B6 및 15D) 또는 24-웰 플레이트에서 염소-항-마우스 Fc(5㎍/㎖)(TS1Fc, TS8.2Fc, B6Fc 및 15DFc)를 이용하여(0.1㎍/㎖) 포획하였다. 다른 공여자로부터의 PBMC를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2를 이용하여 RPMI에서 10⁶개의 세포/㎖로 플레이팅하였다. 세포를 제7일에 항체 없이 새로운 플레이트에 옮기고, 신선한 배지를 이용하여 10⁶개의 세포/㎖로 조절하였다. 배양 배지를 2 내지 3일마다 보충하고 나서, 10⁶개 세포/㎖로 조절하였다. 데이터는 14일에 걸친 Vδ2+ T-세포 확장을 도시한다.
도 18은 γδ특이적 항체 TS1, TS8.2, B6 및 15D와 함께 배양시킨 PBMC에서 αβT 세포의 백분율의 상당한 감소를 도시한다. (A) MAb는 직접적으로 코팅되거나(1㎍/㎖)(TS1, TS8.2, B6 및 15D) 또는 24-웰 플레이트에서 염소-항-마우스 Fc(5㎍/㎖)(TS1Fc, TS8.2Fc, B6Fc 및 15DFc)를 이용하여 (0.1㎍/㎖) 포획하였다. PBMC를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2를 이용하여 RPMI에서 10⁶개의 세포/㎖로 플레이팅하였다. 제7일에, 세포를 항체 없이 새로운 플레이트에 옮기고 나서, 제14일까지 추가로 확장되었다. 배양 배지를 2 내지 3일마다 보충하였다. 데이터는 14일에 걸친 αβT-세포 확장; (B) 제14일 및 제0일(d0) αβT-세포의 백분율을 나타내는 A와 동일한 배양물을 도시한다.
도 19는 γδ TCR의 활성화가 γδ T-세포 배가 시간의 감소를 초래한다는 것을 도시한 도면.
MAb는 직접적으로 코팅되거나(1㎍/㎖)(TS1, TS8.2, B6 및 15D) 또는 24-웰 플레이트에서 염소-항-마우스 Fc(5㎍/㎖)(TS1Fc, TS8.2Fc, B6Fc 및 15DFc)를 이용하여 (0.1㎍/㎖) 포획하였다. PBMC를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2를 이용하여 RPMI에서 10⁶개의 세포/㎖로 플레이팅하였다. 세포를 제7일에 항체 없이 새로운 플레이트에 옮기고, 신선한 배지를 이용하여 10⁶개의 세포/㎖로 조절하였다. 배양물을 2 내지 3일마다 보충하고 나서, 신선한 배지를 이용하여 10⁶개의 세포/㎖로 조절하였다. Vδ1, Vδ2 및 αβ T-세포에 대한 배가 시간을 (A), (B) 및 (C)에서 각각 나타낸다.
도 20은 항체 TS8.2 및 TS1에 의한 Vδ1 의 활성화가 우세하게 미경험 및 중추 기억 표현형을 초래한다는 것을 도시한 도면. 항체를 24 웰 플레이트(TS8.2, R9.12 및 pan-γδImmu510)에서 1㎍/㎖로 직접적으로 코팅하였다. PBMC를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2를 이용하여 RPMI에서 10⁶개/㎖로 플레이팅하였다. 신선한 배지에서 배양물을 1:2로 희석시켰을 때 제15일을 제외하고 23일까지 배지를 2 내지 3일마다 보충하였다. 제14일 및 제23일에 세포 표현형을 유세포 분석을 이용하여 CD45RA 및 CD27 발현에 의해 결정한다.
도 21은 TS8.2 및 MICA에 의한 PBMC의 활성화가 Vδ1 T-세포의 향상된 확장을 초래하지만 αβT-세포는 그렇지 않다는 것을 도시한 도면. MICA-Fc(1 및 5㎍/㎖)와 함께 항체 TS8.2(1㎍/㎖) 또는 TS8.2를 24 웰 플레이트에서 직접적으로 코팅하였다. PBMC를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2를 이용하여 RPMI에서 10⁶개/㎖로 플레이팅하였다. 배지를 2 내지 3일마다 보충한다. (A) Vδ1 T-세포 확장; (B) αβT세포 확장.
도 22는 δ1 및 δ2 특이적 항체를 이용하는 제대혈 단핵세포의 활성화가 Vδ1⁺ 및 Vδ2⁺ T-세포의 상당한 그리고 특이적 확장을 초래한다는 것을 도시한 도면. MAb TS8.2, R9.12, B6 및 15D를 24 웰 플레이트에서 1㎍/㎖로 직접적으로 코팅하였다. 제대혈 단핵세포를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2와 함께 RPMI에서 10⁶/㎖로 활성화시켰다. Vδ1 및 Vδ2 T-세포 확장을 각각 (A) 및 (B)에 나타낸다.
도 23은 γ8쇄와 Vδ1J1, Vδ1J2 및 Vδ1J3쇄의 짝짓기로부터 생성된 가용성 TCR에 대한 결합을 도시한 도면. 데이터는 TS1 및 TS8.2가 Vδ1J1 및 Vδ1J2 쇄로부터 생성된 가용성 TCR을 인식하지만 Vδ1J3 쇄에는 결합하지 않는다는 것을 나타내는데, 이는 J1 및 J2 유전자 세그먼트가 TS1 및 TS8.2 결합에 중요하다는 것을 나타낸다. Vδ1에 결합하는 R9.12, 및 δ불변 영역에 결합하는 pan 항체 이뮤노510(Immuno510)은 특정 J 영역에 의해 영향받지 않는다.
도 24는 인간 Vδ1J1, J2 및 J3 영역 및 선택 위치에서 Vδ1J1 쇄로 이루어진 돌연변이의 서열 정렬을 도시한 도면. BE-13은 δ1γ8 TCR을 발현시키는 T 세포 백혈병 세포주(DSMZ 등록 번호 ACC 396)로부터의 δ1J 영역을 지칭한다. 위치 Lys120에서 단일 아미노산 잔기의 Vδ1J1 및 Vδ1J2 영역에서 Thr 또는 Ala에 의한 대체는 TS-1 및 TS8.2 MAb의 결합을 완전히 없앴는데, 이는 Vδ1J1 및 Vδ1J2영역 내 이 아미노산이 TS-1 및 TS8.2의 결합에 기여한다는 것을 나타낸다. 위치 Thr120에서 단일 아미노산 잔기의 Vδ1J3 영역 내 Lys에 의한 대체는 TS-1 및 TS8.2 MAb의 결합 획득을 초래하였는데, 이는 Vδ1J1 및 Vδ1J2 영역 내 이 아미노산이 TS-1 및 TS8.2의 결합에 기여한다는 것을 추가로 나타낸다.
도 25는 Lys120으로부터 Thr 또는 Ala으로의 Vδ1J1 내 점 돌연변이가 TS-1 및 TS8.2 MAb에 의한 결합의 상실을 초래한다는 것을 도시한 도면.
도 26은 인간 Vδ1 단백질 서열 및 인간 Vδ1 과 소 Vδ1 아미노산 서열(젠뱅크:AFP25162.1) 사이의 차이에 기반한 6개의 돌연변이 인간 Vδ1 서열을 도시한 도면. 돌연변이를 볼드체로 나타낸다.
도 27은 인간 Vδ1 돌연변이 쇄에 대한 TS-1 및 TS8.2 항체의 결합 상실을 도시한 도면.
도 28은 상이한 Vδ2/γ쇄 짝짓기(γ3, γ8, γ9)에 대한 B6 MAb의 결합을 도시한 도면.
도 29는 인간(IMGT 인가 TRDV2) 및 레서스 원숭이(젠뱅크: AY190028.1) Vδ2 가변 영역의 단백질 서열 정렬 및 Vδ2 CDR1(G35S), CDR2(D65G) 및 CDR3(C104S)에서 이루어진 변화를 도시한 도면.
도 30은 CDR1에서 돌연변이된 Vδ2(G35S)에 대한 15D의 결합 상실을 도시한 도면.
도 31은 δ1, δ2 및 αβ에 대해 각각 TS8.2, B6 및 IP26 항체를 이용하는 고도로 농축된 Vδ1+, Vδ2+ 및 αβ T 세포 배양물의 특성규명을 도시한 도면. PBMC로부터 유래된 집단은 δ1 세포 또는 15D를 확장시키기 위한 TS-1 및 TS8.2와 δ2 세포를 확장시키기 위한 B6의 조합물을 이용하여 확장시켰다. 확장된 배양물은 IP26 마이크로비드를 이용하여 αβ T 세포를 고갈시켰다. 양성 선택된 αβ T 세포를 또한 수집하였다(농축된 αβ).
도 32는 고형 종양(BxPC3, SKMEL5) 및 형질세포종(RPMI8226) 세포주에 대한 Vδ1+ 및 Vδ2+ 집단의 세포독성을 도시한 도면.
도 33은 δ1-특이적 MAb의 중쇄 프레임워크 및 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 34는 도 33에 기재된 δ1-특이적 MAb의 경쇄 프레임워크 및 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 35는 δ2-특이적 MAb의 중쇄 프레임워크 및 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 36은 δ2-특이적 MAb의 경쇄 프레임워크 및 상보성 결정 영역 아미노산 서열을 도시한 도면.
도 37은 ELISA에 의해 결정한 바와 같은 표시된 δ1-특이적 항체의 다른 γδ TCR과의 교차 반응성을 도시한 도면.
도 38은 인간과 돌고래 사이의 Vδ1 연역 아미노산 서열 정렬을 도시한 도면.
도 39는 본 명세서에 기재된 γδ T 세포 확장 방법에 의해 얻어지는 Vδ1 세포 (A) 또는 Vδ2 세포(B)를 증식시키는 백분율을 도시한 도면.
도 40은 본 명세서에 기재된 γδ T 세포 확장 방법에 의해 얻어지는 단리된 혼합 세포 집단으로부터의 Vδ1 세포(A) 또는 Vδ2 세포(B)의 확장 배수를 도시한 도면.
도 41은 본 명세서에 기재된 γδ T 세포 확장 방법에 의해 얻어지는 단리된 혼합 세포 집단으로부터의 표현형 데이터를 도시한 도면. 세포 표현형을 유세포 분석을 이용하여 CD45RA 및 CD27 발현에 의해 결정한다.
도 42는 본 명세서에 기재된 γδ T 세포 확장 방법에 따라 활성화되고 확장된 δ1 T 세포가 종양 세포주에 대해 강한 세포독성을 나타낼 수 있다는 것을 도시한 도면.
도 43은 본 발명의 방법에 의해 달성된 제19일의 Vδ1 확장 배수 및 순도를 도시한 도면.
도 44는 본 발명의 방법에 의해 달성된 제19일의 Vδ1 확장 배수 및 누적 배가 시간을 도시한 도면.
도 45는 본 발명의 방법에 의해 달성된 제14일 내지 제19일의 Vδ1 확장 배수 및 누적 배가 시간을 도시한 도면.
도 46은 δ1 T 세포 상에서 항-CD20 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현을 도시한 도면. 확장된 세포를 CAR 레트로바이러스 작제물에 의한 형질도입 후 제7일에 Vδ1 특이적 항체(R9.12) 및 항-리툭시맙 FITC로 염색하였다. 35%까지의 Vδ1 세포는 CD20 CAR+였다.
도 47A 내지 도 47B는 δ-1 특이적 γδ T 세포 활성체에 대한 에피토프 결합 특이성 데이터를 도시한 도면.
도 48은 δ2-특이적 γδ T 세포 활성체에 대한 에피토프 결합 특이성 데이터를 도시한 도면.

본 발명의 다양한 실시형태를 본 명세서에 나타내고 기재하였지만, 이러한 실시형태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 분명할 것이다. 수많은 변형, 변화 및 치환은 본 발명으로부터 벗어나는 일 없이 당업자에게 일어날 수 있다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

정의

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 명세서에 기재된 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서를 해석하는 목적을 위해, 다음의 정의를 적용하며, 적절한 경우에, 단수 형태로 사용되는 용어는 또한 복수를 포함하고, 그 반대도 해당될 것이다. 임의의 정의가 본 명세서에 참고로 포함되는 임의의 문헌과 상충되는 경우에, 이하에 제시하는 정의로 제어할 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "γδ T-세포(감마 델타 T-세포)"는 하나의 γ-쇄 및 하나의 쇄 및 하나의 δ-쇄로 구성된 별개의 T-세포 수용체(TCR), γδ TCR을 그들의 표면 상에서 발현시키는 T-세포의 서브세트를 지칭한다. 용어 "γδ T-세포"는 구체적으로는 제한 없이, Vδ1 및 Vδ2, Vδ3 γδ T 세포뿐만 아니라 미경험, 효과기 기억, 중추 기억, 및 말단 분화된 γδ T-세포를 포함하는 γδ T-세포의 모든 서브세트를 포함한다. 추가적인 예로서, 용어 "γδ T-세포"는 Vδ4, Vδ5, Vδ7 및 Vδ8 γδ T 세포뿐만 아니라 Vγ2, Vγ3, Vγ5, Vγ8, Vγ9, Vγ10 및 Vγ11 γδ T 세포를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 용어 "T 림프구" 또는 "T 세포"는 CD3(CD3+) 및 T 세포 수용체(TCR+)를 발현시키는 면역 세포를 지칭한다. T 세포는 세포 매개 면역에서 중심 역할을 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "TCR" 또는 "T 세포 수용체"는 알파-베타 또는 감마-델타 수용체를 형성하는 이량체 이종성 세포 표면 신호전달 단백질을 지칭한다. αβ TCR은 MHC 분자로 제시하는 항원을 인식하는 반면, γδ TCR은 MHC 제시와 독립적으로 항원을 인식한다.

용어 "MHC"(주조직 적합 복합체(major histocompatibility complex))는 세포-표면 항원 제시 단백질을 암호화하는 유전자의 서브세트를 지칭한다. 인간에서, 이들 유전자는 인간 백혈구 항원(HLA) 유전자로서 지칭된다. 본 명세서에서, 약칭 MHC 또는 HLA는 상호 호환적으로 사용된다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "말초 혈액 림프구(들)" 또는 "PBL(들)"은 가장 광범위한 의미로 사용되며, 다양한 분화 및 기능성 단계의 T 세포 및 B 세포, 혈장 세포, 단핵구, 대식세포, 자연 살해 세포, 호염기구, 호산구 등을 포함하는 백혈구 세포(들)를 지칭한다. 말초 혈액 중의 T 림프구 범위는 약 20 내지 80%이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 집단"은 적합한 공급원으로부터, 보통 포유류로부터 직접적 단리에 의해 얻어지는 다수의 세포를 지칭한다. 단리된 세포 집단은 후속적으로 시험관내에서 배양될 수 있다. 당업자는 본 발명과 함께 사용하기 위한 세포 집단 및 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 집단 내 다양한 세포를 단리시키고 배양하기 위한 다양한 방법을 인식할 것이다. 세포 집단은, 예를 들어, 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플, 종양, 줄기 세포 전구체, 종양 생검, 조직, 림프로부터, 또는 외부 환경과 직접 접촉하는 대상체의 상피 부위로부터 유래되거나, 또는 줄기 전구체 세포로부터 유래된 혼합된 이질적 세포 집단일 수 있다. 대안적으로, 혼합 세포 집단은 포유류 세포의 시험관내 배양물로부터 유래되거나, 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플, 종양, 줄기 세포 전구체, 종양 생검, 조직, 림프로부터 확립되거나, 또는 외부 환경과 직접 접촉하는 대상체의 상피 부위로부터 유래되거나, 또는 줄기 전구체 세포로부터 유래될 수 있다.

"농축된" 세포 집단 또는 제제는 출발 집단 내 세포 유형의 백분율보다 구체적 세포 유형의 더 큰 백분율을 함유하는 출발 혼합 세포 집단으로부터 유래된 세포 집단을 지칭한다. 예를 들어, 출발 혼합 세포 집단은 특정 γδ T-세포 집단에 대해 농축될 수 있다. 일 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 출발 집단 내 해당 세포 유형보다 더 큰 백분율의 δ1 세포를 함유한다. 다른 예로서, 농축된 γδ T-세포 집단은 출발 집단 내 세포 유형의 백분율보다 더 큰 백분율의 δ1 세포와 더 큰 백분율의 δ3 세포를 둘 다 함유할 수 있다. 또 다른 예로서, 농축된 γδ T-세포 집단은 출발 집단 내 세포 유형의 백분율보다 더 큰 백분율의 δ1 세포와 더 큰 백분율의 δ4 세포를 둘 다 함유할 수 있다. 또 다른 예로서, 농축된 γδ T-세포 집단은 출발 집단 내 해당 세포 유형의 백분율보다 더 큰 백분율의 δ1 T 세포, δ3 T 세포, δ4 T 세포, 및 δ5 T 세포를 함유할 수 있다. 다른 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 출발 집단 내 해당 세포 유형보다 더 큰 백분율의 δ2 세포를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 출발 집단 내 해당 세포 유형보다 더 큰 백분율의 δ1 세포와 δ2 세포를 둘 다 함유한다. 모든 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단은 더 적은 백분율의 αβ T-세포 집단을 함유한다.

본 명세서에서 사용되는 "확장된"은 농축된 제제에서 목적으로 하는 또는 표적 세포 유형(예를 들어, δ1 및/또는 δ2 T-세포)의 수는 초기 또는 출발 세포 집단 내 수보다 더 높다는 것을 의미한다. "선택적으로 확장한다"는 표적 세포 유형(예를 들어, δ1 또는 δ2 T-세포)가 다른 비표적 세포 유형, 예를 들어, αβ T-세포 또는 NK 세포 이상으로 우선적으로 확장된다는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 활성화제는, 예를 들어, δ2 T-세포의 상당한 확장 없이 조작된 또는 비조작된, δ1 T-세포를 선택적으로 확장시킨다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 활성화제는, 예를 들어, δ1 T-세포의 상당한 확장 없이 조작된 또는 비조작된, δ2 T-세포를 선택적으로 확장시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 활성화제는, 예를 들어, δ2 T-세포의 상당한 확장 없이 조작된 또는 비조작된, δ1 및 δ3 T-세포를 선택적으로 확장시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 활성화제는, 예를 들어, δ2 T-세포의 상당한 확장 없이 조작된 또는 비조작된, δ1 및 δ4 T-세포를 선택적으로 확장시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 활성화제는, 예를 들어, δ2 T-세포의 상당한 확장 없이 조작된 또는 비조작된, δ1, δ3, δ4 및 δ5 T-세포를 선택적으로 확장시킨다. 이와 관련하여 용어 "의 상당한 확장 없이"는 우선적으로 확장된 세포 집단은 기준 세포 집단보다 적어도 10배, 바람직하게는 100배, 및 더 바람직하게는 1,000배 초과로 확장된다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "혼합물"은 혼합된, 이종성 세포 집단으로부터 유래된 2 이상의 단리된, 농축된 세포 집단의 조합물을 지칭한다. 특정 실시형태에 따르면, 본 발명의 세포 집단은 단리된 γδ T 세포 집단이다.

세포 집단에 적용되는 용어 "단리된"은 생체내 또는 시험관내 상기 세포 집단과 관련된 하나 이상의 세포 집단이 실질적으로 없는 인간 또는 동물 신체로부터 단리된 세포 집단을 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 세포 집단 용어 "접촉시키는"은 시약, 예를 들어, 비드 또는 세포 중 하나에 연결될 수 있는 항체, 사이토카인, 리간드, 미토겐 또는 공자극 분자와 함께 단리된 세포 집단의 인큐베이션을 지칭한다. 항체 또는 사이토카인은 가용성 형태일 수 있거나, 또는 이는 고정될 수 있다. 일 실시형태에서, 고정된 항체 또는 사이토카인은 비드 또는 플레이트에 단단히 결합되거나 또는 공유적으로 연결된다. 일 실시형태에서, 항체는 Fc-코팅 웰 상에 고정된다. 바람직한 실시형태에서, 접촉은 생체외(예를 들어, 시험관내) 또는 생체내에서 일어난다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린(Ig) 분자(즉, 항원에 특이적으로 결합하는(이와 면역반응하는) 항원 결합 부위를 함유하는 분자)의 면역학적으로 활성인 부분을 지칭한다. "특이적으로 결합한다" 또는 "와 면역반응한다" 또는 "로 향한다"는 항체가 목적으로 하는 항원의 하나 이상의 항원 결정소와 반응하고, 다른 폴리펩타이드와 반응하지 않거나 또는 훨씬 더 낮은 친화도(K_D > 10^-6 몰)로 반응한다는 것을 의미한다. 항체는 다클론성, 단클론성, 키메라, sdAb(중쇄 또는 경쇄 단일 도메인 항체), 단일쇄, F_ab, F_ab' 및 F_(ab')2 단편, scFv, 다이어바디, 미니바디, 나노바디 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "키메라 항원 수용체(CAR)"는 인공 T-세포 수용체, T-바디, 단일쇄 면역수용체, 키메라 T-세포 수용체 또는 키메라 면역수용체를 지칭할 수 있고, 예를 들어, 특정 면역 효과기 세포에 대한 인공 특이성을 접목시키는 조작된 수용체를 포함한다. CAR은 T 세포 상에 단클론성 항체의 특이성을 부여하기 위해 사용될 수 있고, 이에 의해, 예를 들어, 입양 세포 요법에서 사용하기 위해 매우 다수의 특정 T 세포가 생성되도록 허용한다. 구체적 실시형태에서, CAR은, 예를 들어, 종양 관련 항원에 대한 세포의 특이성에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, CAR은 길이가 다를 수 있고 질환 또는 장애 관련된, 예를 들어, 종양-항원 결합 영역을 포함하는, 세포내 활성화 도메인(표적 세포, 예컨대 표적 종양 세포와 표적화 모이어티의 맞물림 시 T 세포가 활성화되도록 허용함), 막관통 도메인 및 세포외 도메인을 포함한다. 특정 양상에서, CAR은 CD3-제타 막관통 도메인 및 엔도도메인에 융합된 단클론성 항체로부터 유래된 단일쇄 가변 단편(scFv)의 융합을 포함한다. 다른 CAR 설계의 특이성은 수용체의 리간드(예를 들어, 펩타이드)로부터 또는 덱신과 같은 패턴-인식 수용체로부터 유래될 수 있다. 특정 경우에, 항원-인식 도메인의 스페이싱은 활성화-유도 세포사를 감소시키도록 변형될 수 있다. 특정 경우에, CAR은 추가적인 공자극 신호전달, 예컨대 CD3-제타, FcR, CD27, CD28, CD137, DAP 10/12 및/또는 OX40, ICOS, TLR 등에 대한 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 공자극 분자, (예를 들어, 양전자 방출 단층 촬영술을 위한) 영상화를 위한 수용체 유전자, 프로드러그, 귀소 수용체, 케모카인, 케모카인 수용체, 사이토카인, 및 사이토카인 수용체의 첨가 시 T 세포를 조건적으로 제거하는 유전자 산물을 포함하는 분자가 CAR과 함께 공동 발현될 수 있다.

염기성 항체 구조 단위는 사량체를 포함하는 것으로 알려져 있다. 각각의 사량체는 폴리펩타이드 쇄의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 1개의 "경"쇄(약 25 kDa) 및 1개의 "중"쇄(약 50-70 kDa)를 가진다. 각각의 쇄의 아미노-말단 부분은 주로 항원 인식을 초래하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 각각의 쇄의 카복실-말단 부분은 주로 효과기 기능을 초래하는 불변 영역을 정한다. 일반적으로, 인간으로부터 얻은 항체 분자는 임의의 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 부류에 관한 것인데, 이들은 분자 내에 존재하는 중쇄의 특성에 따라 서로 다르다. 특정 부류는 하위부류, 예컨대 IgG₁, IgG₂, 및 기타도 가진다. 더 나아가, 인간에서, 경쇄는 카파쇄 또는 람다쇄일 수 있다.

용어 "Fab"는 H 쇄의 가변 영역 도메인(V_H), 및 하나의 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)과 함께 전체 L 쇄(V_L 및 C_L)로 이루어진 항체 단편을 지칭한다. 무손상 항체의 파파인 분해는 2개의 Fab 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있는데, 이들 각각은 단일 항원-결합 부위를 함유한다. 전형적으로, 파파인 분해에 의해 생성되는 Fab의 L 쇄 및 H 쇄 단편은 쇄간 이황화결합에 의해 연결된다.

용어 "Fc"는 H 쇄의 카복시-말단 부분(CH2 및 CH3)과 이황화결합에 의해 함께 보유되는 힌지 영역의 일부를 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 항체의 효과기 기능은 Fc 영역 내 서열에 의해 결정되며; 이 영역은 또한 특정 유형의 세포 상에서 발견되는 Fc 수용체(FcR)에 의해 인식되는 부분이다. 1개의 Fc 단편은 무손상 항체의 파파인 분해에 의해 얻어질 수 있다.

용어 "F(ab')₂"는 무손상 항체의 펩신 분해에 의해 생성되는 항체 단편을 지칭한다. F(ab')₂ 단편은 2개의 Fab 단편 및 이황화 결합에 의해 함께 보유되는 힌지 영역의 일부를 함유한다. F(ab')₂ 단편은 2가 항원-결합 활성을 가지며, 항원을 가교할 수 있다.

용어 Fab'는 F(ab')₂ 단편의 환원 산물인 항체 단편을 지칭한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카복시 말단에서 소수의 추가적인 잔기를 가짐으로써 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'에 대한 본 명세서의 표기이다.

용어 "Fv"는 단단한, 비공유 결합으로 1개의 중쇄 가변 영역 및 1개의 경쇄 가변 영역 도메인의 이량체로 이루어진 항체 단편을 지칭한다. 이들 두 도메인의 폴딩으로부터 항원 결합을 위한 아미노산 잔기에 기여하고 항체에 항원 결합 특이성을 부여하는 6개의 초가변 루프(H 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)가 나온다. 그러나, 종종 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에도 불구하고, 단일 가변 도메인(또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)조차 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 가진다.

"sFv" 또는 "scFv" 로 지칭되는 용어 "단일쇄 Fv"는 또한 단일 폴리펩타이드 쇄에 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. 전형적으로, scFv 폴리펩타이드는 VH와 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함하는데, 이는 scFv가 항원 결합을 위한 목적으로 하는 구조를 형성하는 것을 가능하게 한다. scFv의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌[Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); 및 Malmborg et al., J. Immunol. Methods 183:7-13, 1995] 참조.

발현 "선형 항체"는 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 V_H-C_H1 세그먼트의 쌍(V_H-C_H1-V_H-C_H1)을 포함하는 폴리펩타이드를 지칭하기 위해 사용된다. 선형 항체는 이중특이성 또는 단일특이성일 수 있으며, 예를 들어, 문헌[Zapata et al., Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)]에 의해 기재된다.

용어 "가변"은 가변 도메인의 특정 부분이 항체 중의 서열에서 광범위하게 다르며, 그의 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에서 사용된다는 사실을 지칭한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체적으로 균일하게 분포되지 않는다. 이는 경쇄와 중쇄 가변 도메인 둘 다에서 초가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에서 농축된다. 가변 도메인의 더 고도로 보존된 부분은 프레임워크 영역(framework region: FR)으로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결을 형성하고, 일부 경우에 베타-시트 구조의 부분을 형성하는 각각 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는 베타-시트 입체배치를 대부분 채택하는 4개의 FR을 포함한다. 각각의 쇄에서 초가변 영역은 FR에 의해 그리고 다른 도메인으로부터의 초가변 영역과 함께 밀접한 근위에서 함께 보유되며, 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다(문헌[Kabat et al (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.] 참조). 불변 도메인은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 연루되지 않지만, 다양한 효과기 기능, 예컨대 항체 의존적 세포의 세포독성(ADCC)에서 항체의 참여를 나타낸다.

용어 "항원-결합 부위" 또는 "결합 부분"은 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 부분을 지칭한다. 항원 결합 부위는 중("H") 및 경("L") 쇄의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. "초가변 영역"으로 지칭되는 중쇄 및 경쇄의 V 영역 내에서 3개의 고도로 다양한 신장은 "프레임워크 영역" 또는 "FR"로서 알려진 더 보존된 측접 신장 사이에 개재된다. 따라서, 용어 "FR"은 면역글로불린 내 초가변 영역 사이에 그리고 이에 인접하여 자연적으로 발견되는 아미노산 서열을 지칭한다. 항체 분자에서, 경쇄의 3개의 초가변 영역 및 중쇄의 3개의 초가변 영역은 3차원 공간에서 서로에 대해 배치되어 항원-결합 표면을 형성한다. 항원-결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 대해 상보성이며, 각각의 중쇄 및 경쇄의 3개의 초가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"로서 지칭된다. 각각의 도메인에 대한 아미노산의 배정은 문헌[Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 및 1991)), 또는 Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)]의 정의에 따른다.

용어 "초가변 영역", "HVR" 또는 "HV"는 서열에서 초가변이고/이거나 구조가 정해진 루프를 형성하는 항체 가변 도메인의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR(VH에서 3개(H1, H2, H3), 및 VL에서 3개(L1, L2, L3))를 포함한다. 천연 항체에서, H3 및 L3은 6개의 HVR의 대부분의 다양성을 나타내며, 특히 H3은 항체에 우수한 특이성을 부여함에 있어서 독특한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 문헌[Xu et al., Immunity 13:37-45 (2000); Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003)] 참조. 사실, 중쇄만으로 이루어진 천연 유래 낙타과 항체는 기능성이며 경쇄가 없을 때 안정하다. 예를 들어, 문헌[Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996)] 참조.

"프레임워크 영역"(FR)은 CDR 잔기 이외의 해당 가변 도메인 잔기이다. 각각의 가변 도메인은 전형적으로 FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 동정되는 4개의 FR을 가진다. CDR이 카바트에 따라 정해진다면, 경쇄 FR 잔기는 대략 잔기 1 내지 23(LCFR1), 35-49 (LCFR2), 57-88 (LCFR3), 및 98-107(LCFR4)에 위치되며, 중쇄 FR 잔기는 대략 중쇄 잔기 내 잔기 1-30(HCFR1), 36-49 (HCFR2), 66-94(HCFR3) 및 103-113 (HCFR4)에 위치된다. CDR이 초가변 루프로부터의 아미노산 잔기를 포함한다면, 경쇄 FR 잔기가 경쇄 내 대략 잔기 1-25(LCFR1), 33-49(LCFR2), 53-90(LCFR3) 및 97-107(LCFR4)에 위치되고, 그리고 중쇄 FR 잔기가 중쇄 잔기 내 대략 잔기 1-25 (HCFR1), 33-52 (HCFR2), 56-95 (HCFR3) 및 102-113 (HCFR4)에서 위치된다. 일부 예에서, CDR이 카바트에 의해 정해지는 CDR과 초가변 루프의 그것 둘 다로부터의 아미노산을 포함할 때, FR 잔기는 그에 따라 조절될 것이다. 예를 들어, CDRH1이 아미노산 H26-H35를 포함할 때, 중쇄 FR1 잔사는 위치 1 내지 25에 있고, FR2 잔기는 위치 36 내지 49에 있다.

"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 통상적으로 생기는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위그룹으로부터 유래된다. 일반적으로, 서열의 하위 그룹은 카바트에서와 같은 하위그룹이다. 특정 예에서, VL에 대해, 하위그룹은 카바트에서와 같은 하위그룹 카파 I이다. 특정 예에서, VH에 대해, 하위그룹은 카바트에서와 같은 하위그룹 카파 III이다.

본 명세서에서 사용되는, "Kd" 또는 "Kd 값"은 약 10 반응 단위(RU)에서 항원 또는 항체에 의해 고정된 CM5 칩을 이용하여 25℃에서, 예를 들어, 비아코어(BIAcore)(상표명)-2000 또는 비아코어(상표명)-3000(뉴저지주 피츠카타웨이에 소재한 비아코어 인코포레이티드(BIAcore, Inc.))를 이용하는 표면 플라즈몬 공명 분석을 사용함으로써 측정된 해리 상수를 지칭한다. 2가 또는 다른 다가 항체에 대해, 전형적으로 항체는 해리 상수의 측정에 의한 아비디티-유도 간섭(avidity-induced interference)을 회피하도록 고정된다. 추가적인 상세한 설명을 위해, 예를 들어, 문헌[Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)] 참조.

용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 결정소, 지질 또는 탄수화물 결정소를 포함한다. 에피토프 결정소는 보통 분자의 활성 표면 그룹, 예컨대 아미노산, 지질 또는 당 측쇄로 이루어지며, 보통 특정 3차원의 구조적 특징뿐만 아니라 특정 하전 특징을 가진다. 항체는 평형 해리 상수(K_D)가 10^-6 내지 10^-12M의 범위일 때 항원에 특이적으로 결합하는 것으로 언급된다. "활성화 에피토프"는 결합 시 특정 γδ T-세포 집단을 활성화시킬 수 있다.

2개의 항체가 동일하거나 또는 입체적으로 중복되는 에피토프를 인식할 때, 항체는 기준 항체와 "본질적으로 동일한 에피토프"에 결합한다. 2개의 에피토프가 동일하거나 또는 입체적으로 중복되는 에피토프에 결합하는지의 여부를 결정하기 위해 가장 널리 사용되고 빠른 방법은 경쟁 분석인데, 이는 표지된 항원 또는 표지된 항체를 이용하여 다수의 상이한 형식으로 입체배치될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원은 96-웰 플레이트 상에 고정되고, 표지된 항체의 결합을 차단하는 비표지 항체의 능력은 방사성 또는 효소 표지를 이용하여 측정된다. 대안적으로, 표지 및 비표지 항체를 이용하는 경쟁 연구는 항원-발현 세포 상에서 유세포분석을 이용하여 수행된다.

"에피토프 맵핑"은 항체의 표적 항원 상에서 항체의 결합 부위, 또는 에피토프를 동정하는 과정이다. 항체 에피토프는 선형 에피토프 또는 입체배좌 에피토프일 수 있다. 선형 에피토프는 단백질 내 아미노산의 인접한 서열에 의해 형성된다. 입체배좌 에피토프는 단백질 서열에서 불연속이지만, 단백질이 그의 3차원 구조 내로 폴딩 시 합쳐지는 아미노산으로 형성된다.

본 명세서에서 사용되는 "에피토프 비닝(binning)"은 그들이 인식하는 에피토프에 기반한 항체 그룹화 과정이다. 더 구체적으로는, 에피토프 비닝은 항체의 에피토프 인식 특성에 기반한 항체를 클러스터링하고 별개의 결합 특이성을 갖는 항체를 동정하기 위한 컴퓨터 과정과 조합된, 상이한 항체의 에피토프 인식 특성을 차별화시키기 위한 방법 및 시스템을 포함한다.

본 발명에 따른 "제제" 또는 "화합물"은 소분자, 폴리펩타이드, 단백질, 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명과 관련하여 소분자는 일 실시형태에서 1000 달톤보다 더 작은, 특히 800 달톤보다 더 작은, 더 구체적으로는 500 달톤보다 더 작은 분자량을 갖는 화학물질을 의미한다. 용어 "치료제"는 생물학적 활성을 갖는 제제를 지칭한다. 용어 "항암제"는 암세포에 대해 생물학적 활성을 갖는 제제를 지칭한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "세포 배양물"은 임의의 시험관내 세포 배양물을 지칭한다. 인접한 세포주(예를 들어, 불멸 표현형을 가짐), 1차 세포 배양물, 유한 세포주(예를 들어, 비형질전환 세포), 및 줄기 세포, 혈액 세포, 제대혈 세포, 종양 세포, 형질도입 세포 등을 포함하는 시험관내에서 유지된 임의의 다른 세포 집단이 이 용어 내에 포함된다.

용어 "치료하다" 또는 "치료"는 치료적 처치와 예방적 또는 방지적 측정을 모두 지칭하되, 대상은 원치않는 생리적 변화 또는 장애를 방지하거나 또는 늦추기(줄이기) 위한 것이다. 유리한 또는 목적으로 하는 임상 결과는 증상의 경감, 질환 정도의 감소(예를 들어, 종양 크기, 종양 부담 또는 종양 분포의 감소), 질환의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 개선 또는 완화, 및 관해(부분적이든 또는 전체적이든), 검출 가능한지 또는 검출 불가능한지의 여부를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않는다면 예상되는 생존에 비해 장기간의 생존을 의미할 수 있다. 치료가 필요한 대상은 병태 또는 장애가 이미 있는 것뿐만 아니라 병태 또는 장애를 갖는 경향이 있는 것을 포함하며, 이때 병태 또는 장애는 예방될 것이다.

1종 이상의 추가적인 치료제와 "조합된" 투여는 동시(일시적) 그리고 임의의 순서로 연이은 투여를 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "동일한"은 동일한 2 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 추가로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 동일한"은 비교창에 걸친 최대 대응도, 또는 비교 알고리즘을 이용하여 또는 수동 정렬에 의해 그리고 시각적 관찰에 의해 측정되는 표시된 영역에 대해 비교되고 정렬될 때 동일한 순차적 단위의 백분율을 갖는 2 이상의 서열을 지칭한다. 단지 예로서, 2 이상의 서열은 서열 단위가 구체화된 영역에 걸쳐 약 60% 동일하거나, 약 65% 동일하거나, 약 70% 동일하거나, 약 75% 동일하거나, 약 80% 동일하거나, 약 85% 동일하거나, 약 90% 동일하거나 또는 약 95% 동일하다면 "실질적으로 동일할" 수 있다. 이러한 백분율은 2 이상의 서열의 "동일성%"를 기재하기 위한 것이다. 서열의 동일성은 길이가 적어도 약 75 내지 100개의 순차적 단위인 영역에 걸쳐, 길이가 약 50개의 순차적 단위인 영역에 걸쳐, 또는 구체화되지 않은 경우에, 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다. 이 정의는 또한 시험 서열의 상보체를 지칭한다. 추가로, 단지 예로서, 핵산 잔기가 동일할 때 2개 이상의 폴리펩타이드 서열이 동일한 반면, 핵산 잔기가 구체화된 영역에 걸쳐 약 60% 동일하거나, 약 65% 동일하거나, 약 70% 동일하거나, 약 75% 동일하거나, 약 80% 동일하거나, 약 85% 동일하거나, 약 90% 동일하거나 또는 약 95% 동일하다면, 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열은 "실질적으로 동일하다". 동일성은 길이가 적어도 약 75 내지 약 100개의 핵산인 영역에 걸쳐, 길이가 약 50개의 핵산인 영역에 걸쳐, 또는 구체화되지 않은 경우에, 폴리뉴클레오타이드 서열의 전체 서열에 걸쳐 존재할 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 화합물의 생물학적 활성 또는 특성을 없애지 않고, 상대적으로 비독성인 염, 담체 또는 희석제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 물질을 지칭하며, 즉, 물질은 원치않는 생물학적 효과를 야기하거나 또는 그것이 함유된 조성물의 임의의 성분과 함께 해로운 방식으로 상호작용하는 일 없이 개체에게 투여될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "대상체" 또는 "환자"는 척추동물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 척추동물은 포유류이다. 포유류는 인간, 비인간 영장류, 농장 동물(예컨대 소), 운동 동물 및 반려동물(예컨대, 고양이, 개 및 말)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, 포유류는 인간이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 치료 중인 질환, 장애 또는 병태의 증상 중 하나 이상을 일정한 정도로 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 저지하거나 또는 경감하기에 충분한, 이미 질환, 병태 또는 장애를 앓고 있는 대상체, 예를 들어, 인간 환자에게 투여되는 본 발명의 확장된 세포집단 및/또는 혼합물을 함유하는 조성물의 양을 지칭한다. 이러한 조성물의 유효성은 질환, 장애 또는 병태의 중증도 및 과정, 이전의 요법, 환자의 건강 사태 및 약물에 대한 반응, 및 치료하는 의사의 판단을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 조건에 의존한다. 단지 예로서, 치료적 유효량은 용량 상승 임상 시험을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 일상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.

용어 항원 제시 세포(APC)는 야생형 APC, 또는 조작된 또는 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 지칭한다. APC는 APC의 방사선 조사된 집단으로서 제공될 수 있다. APC는 불멸 세포주(예를 들어, K562 또는 불멸 세포주로부터 유래된 조작된 aAPC)로부터 또는 공여자로부터의 세포(예를 들어, PBMC)의 분획으로서 제공될 수 있다.

단백질 또는 이의 폴리펩타이드 단편, 또는 에피토프에 관해 본 명세서에서 사용되는 용어 "구조적으로 상이한" 및 "구조적으로 별개의"는 적어도 2개의 상이한 단백질, 이의 폴리펩타이드 단편 또는 에피토프 사이의 공유(즉, 구조적) 차이를 지칭한다. 예를 들어, 2개의 구조적으로 상이한 단백질(예를 들어, 항체)는 상이한 1차 아미노산 서열을 갖는 2개의 단백질을 지칭할 수 있다. 일부 경우에, 구조적으로 상이한 활성제는 구조적으로 상이한 에피토프, 예컨대 상이한 1차 아미노산 서열을 갖는 에피토프에 결합한다.

구체화된 수용체 활성(예를 들어, NKp30 활성, NKp44 활성 및/또는 NKp46 활성)과 "독립적인" 본 명세서에서 사용되는 용어 "항-종양 세포독성"은 구체화된 수용체 또는 수용체의 구체화된 조합이 세포에 의해 발현되는지 기능성인지의 여부를 나타내는 항 종양 세포독성을 지칭한다. 이렇게 해서, NKp30 활성, NKp44 활성 및/또는 NKp46 활성과 독립적인 항-종양 세포독성을 나타내는 γδ T-세포는 또한 NKp30 활성-의존적 항-종양 세포독성, NKp44 활성-의존적 항-종양 세포독성, 및/또는 NKp46 활성-의존적 항-종양 세포독성을 나타낼 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "NKp30 활성-의존적 항-종양 세포독성", "NKp44 활성-의존적 항-종양 세포독성" 및 "NKp46 활성-의존적 항-종양 세포독성"은 구체화된 수용체의 기능성 발현을 필요로 하는 항-종양 세포독성을 지칭한다. 이러한 수용체 의존적 항-종양 세포독성의 존재 또는 부재는 구체화된 수용체의 길항제의 존재 또는 부재 하에서 실시예 48에서 수행되는 것과 같은 표준 시험관내 세포독성 분석을 수행함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, NKp30 활성-의존적 항-종양 세포독성의 존재 또는 부재는 항-NKp30 길항제의 존재 하에 실시예 48에 기재한 바와 같은 시험관내 세포독성 분석 결과를 항-NKp30 길항제의 부재 하에 얻어진 결과에 비교함으로써 결정될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 항-종양 세포독성의 적어도 구체화된 "%"가 구체화된 수용체 활성(예를 들어, NKp30 활성, NKp44 활성 및/또는 NKp46 활성)과 "독립적인" 항-종양 세포독성을 포함하는 γδ T-세포 집단은 구체화된 수용체의 차단이 측정된 항-종양 세포독성을 수치적 값% 이하만큼 감소시키는 세포를 지칭한다. 따라서, 항-종양 세포독성의 적어도 50%가 NKp30 활성과 독립적인 항-종양 세포독성을 포함하는 γδ T-세포 집단은 NKp30 길항제의 부재 하에 비해서 NKp30 길항제의 존재 하에서 시험관내 항종양 세포독성의 50% 이하의 감소를 나타낼 것이다.

개요

인간에서 γδ T-세포(들)는 선천선 면역 반응과 적응성 면역 반응 사이의 연결을 제공하는 T 세포의 서브세트이다. 이들 세포는 항원-특이적 γδ T-세포 수용체(γδ TCR), 및 γδ T-세포(들)를 생성하기 위한 V-(D)-J 세그먼트 재배열을 겪으며, 그리고 γδ TCR 또는 기타, 비-TCR 단백질 중 하나에 의한 항원의 인식을 통해 직접적으로 활성화되어, 독립적으로 작용하거나 또는 함께 γδ T-세포 효과기 기능을 활성화시키는 작용을 할 수 있다. γδ T-세포는 포유류에서 전반적인 T-세포 집단의 소분획(말초 혈액 및 림프 기관에서 T 세포의 대략 1 내지 5%)를 나타내며, 그들은 상피 세포 풍부 구획에 주로 존재하는 것으로 나타난다. 주조직 적합 복합체 분자(MHC)에 결합된 항원을 인식하는 αβTCR과 달리, γδ TCR은 박테리아 항원, 바이러스 항원, 질환 세포에 의해 발현되는 스트레스 항원, 및 무손상 단백질 또는 비펩타이드 화합물의 형태인 종양 항원을 직접적으로 인식할 수 있다.

TS-1, TS8.2, B6 및 15D는 γδ T 세포를 활성화시킬 수 있다. 이론에 의해 구속되는 일 없이, 상이한 공여자로부터 유래된 배양물의 상이한 수준의 활성화 및 확장은 공여자 γδ가변 TCR 레퍼토리 및 항체 결합 에피토프의 특이성에 기인할 수 있다. 특정 γδ T-세포 서브세트에 결합하는 모든 제제가 특정 γδ T-세포를 활성화시킬 수 없고 구체적으로는 특정 γδ T-세포 집단을 임상적으로 적절한 수준까지, 즉, 농축 배양물에서 10⁸개 초과의 표적 γδ T 세포를 활성화시킬 수 없다는 것이 발견되었다. 유사하게는, γδ T-세포 집단의 모든 결합 에피토프가 활성화 에피토프는 아니며, 즉, 결합 시 특정 γδ T-세포 집단을 활성화시킬 수 없다.

본 발명의 발명자는 특정 γδ T 세포 아형의 강한 활성화와 관련된 특정 γδ 가변 TCR 결합 영역을 동정하였고, 따라서 환자에게 투여될 수 있는 증가된 순도를 갖는 고도로 농축된 γδ T-세포 집단 및 이의 혼합물의 임상적으로 적절한 수준을 생산하는 γδ T 세포 아형의 특정 활성화를 가능하게 한다. γδ T 세포 아형의 향상된 활성화 및 확장을 유도할 수 있는 활성화 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 신규한 활성화 리간드가 또한 상정되고, 본 명세서에서 추가로 기재된다.

일부 경우에, 본 발명의 방법을 이용하는 γδ T 세포의 임상적으로 적절한 수준(즉, 10⁸개 초과)의 생산은 상대적으로 작은 용적의 배양 배지에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 임상적으로 적절한 수준의 γδ T 세포는 대략 25ℓ; 20ℓ; 10ℓ; 5ℓ; 3ℓ; 2ℓ; 1,5000㎖; 1,000㎖; 500㎖; 200㎖; 150㎖; 100㎖ 이하(예를 들어, 약 10㎖ 내지 약 100㎖, 약 100㎖ 내지 약 500㎖, 약 500㎖ 내지 약 5,000㎖, 또는 약 5ℓ 내지 약 25 L)의 최종 배양물 용적으로 세포 집단(예를 들어, 세포의 단리된 혼합 집단)의 확장으로부터 얻을 수 있다. 다른 예로서, 일부 실시형태에서, 임상적으로 적절한 수준의 γδ T 세포는 공여자 또는 다중 공여자로부터 얻은 세포의 단리된 혼합 집단을 확장시키는 데 사용되는 배양 배지의 총 용적이 약 50ℓ, 25ℓ, 20ℓ, 10ℓ, 5L, 1ℓ 또는 750㎖ 미만이 되는(예를 들어, 약 750㎖ 내지 약 50ℓ 미만, 약 100㎖ 내지 약 750㎖, 약 750㎖ 내지 약 5ℓ, 약 1ℓ 내지 약 10ℓ, 약 10ℓ 내지 약 50ℓ, 또는 약 10ℓ 내지 약 25ℓ) 조건 하에서 얻을 수 있다.

단리된 혼합 세포 집단으로부터 직접적으로, 예를 들어, 비표적 세포 유형의 사전 고갈 없이, 세포독성 특성을 갖는 농축된 γδ T 세포 집단(들)의 임상적으로 적절한 수준을 제공하기 위한 γδ T-세포 아형의 선택적 활성화 및 확장 방법이 본 명세서에 기재된다. 특정 γδ세포 집단(들)의 γδ가변 TCR 에피토프 활성화가 또한 기재된다. 본 발명은 또한 본 발명의 농축된 γδ T-세포 집단(들)을 포함하는 조성물을 이용하는 치료 방법을 제공한다.

본 명세서에서 γδ T-세포의 하나 이상의 특정 서브세트를 포함하는 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포의 임상적으로 적절한 수준(10⁸개 초과)을 생산하거나 또는 제공하는 방법이 기재된다. 이러한 방법은 단일 공여자로부터(단일 공여자의 단일 샘플로부터를 포함) 이러한 임상적으로 적절한 수준을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 게다가, 이러한 방법은 10⁸개보다 상당히 더 많은 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포를 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 약 또는 적어도 약, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹ 또는 10¹²개의 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포(γδ T-세포의 하나 이상의 특정 서브세트를 포함)는 본 명세서에 기재된 방법에서 생산될 수 있다. 일부 경우에, 이러한 집단 크기는 19 내지 30일만큼에 그리고/또는 약 1L 미만의 사용되는 배양 배지의 총 용적으로 달성될 수 있다.

γδ T-세포의 단리

일부 양상에서, 본 발명은 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포의 확장을 위한 생체외 방법을 제공한다. 일부 경우에, 상기 방법은 γδ T-세포의 특정 집단, 예컨대 IL-4, IL-2 또는 IL-15, 또는 이들의 조합의 확장을 선호하는 사이토카인을 포함하지 않는 하나 이상의(예를 들어, 제1 및/또는 제2) 확장 단계를 사용한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 단리된 혼합 세포 집단, 농축된 γδ T 세포 집단을 제공하기 위해 혼합 세포 집단을 δ1 TCR; δ1 및 δ4 TCR; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 TCR 각각의 특이적인 에피토프에 결합함으로써 δ1 T-세포; δ1 T-세포 및 δ3 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 단리된 혼합 세포 집단으로부터 농축된 γδ T-세포 집단을 생산하기 위한 생체외 방법을 제공한다. 다른 양상에서, 본 발명은 농축된 γδ T 세포 집단을 제공하기 위해 혼합 세포 집단을 δ2 TCR의 특이적인 에피토프에 결합함으로써 δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 단리된 혼합 세포 집단으로부터 농축된 γδ T-세포 집단을 생산하는 생체외 방법을 제공한다.

다른 양상에서, 본 개시내용은 대상체로부터 단리된 γδ T-세포를 유전자 조작하기 위한 방법을 제공한다. 농축, 활성화, 확장 또는 유전자 조작 방법은 개별적으로 또는 임의의 순서로 조합하여 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, γδ T-세포는 단리되고, 유전자 조작되고, 이어서 활성화 및 확장될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, γδ T-세포는 단리되고, 활성화 및 확장되고, 이어서 선택적으로 유전자 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 활성화되고 확장되고, 이어서 유전자 조작된 γδ T-세포는 추가로 활성화 및/또는 확장될 수 있다.

예를 들어, 비조작된, γδ T-세포 집단은 대상체의 복합체 샘플로부터 확장될 수 있다. 복합체 샘플은 말초 혈액 샘플(예를 들어, PBL 또는 PBMC), 백혈구분반술 샘플, 제대혈 샘플, 종양, 줄기 세포 전구체, 종양 생검, 조직, 림프일 수 있거나, 또는 외부 환경과 직접 접촉하는 대상체의 상피 부위로부터 유래되거나, 또는 줄기 전구체 세포로부터 유래될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용은 Vδ1⁺ 세포, Vδ2⁺ 세포, Vδ1⁺ 세포 및 Vδ3⁺ 세포, Vδ1⁺ 세포 및 Vδ4⁺세포, Vδ1⁺ 세포, Vδ3⁺ 세포, Vδ4⁺ 세포, 및 Vδ5⁺세포 또는 이들의 임의의 조합의 선택적 확장을 위한 방법을 제공한다.

말초 혈액 단핵세포는, 예를 들어, 피콜-플라그(Ficoll-Paque)(상표명) PLUS(GE 헬스케어(GE Healthcare)) 시스템, 또는 다른 적합한 장치/시스템을 포함하는 성분채집기를 이용하여 대상체로부터 수집될 수 있다. γδ T-세포(들), 또는 γδ T-세포(들)의 목적으로 하는 하위집단은, 예를 들어, 유세포 분석 기법에 의해 수집 샘플로부터 정제될 수 있다. 제대혈 세포는 또한 대상체의 출생 동안 제대혈로부터 얻을 수 있다. PBMC 단리, γδ T 세포 활성화, 및 γδ T 세포 활성화제의 제조 및 이용을 위한 방법 및 조성물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 모든 목적을 위해 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 WO 2016/081518 참조.

γδ T-세포는, 혼합 세포 집단을, 예를 들어, 제1 농축 단계에서 농축된 γδ T-세포 집단을 제공하기 위해 γδ TCR의 에피토프에 특이적으로 결합함으로써 γδ T-세포를 확장시키는 1종 이상의 제제와 접촉시킴으로써 시험관내에서 배양되는 단리된 복합체 샘플 또는 혼합 세포 집단으로부터 확장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 특정 세포 집단, 예컨대 다음의 비- γδ T 세포 단핵구(αβT-세포, B-세포 및 NK 세포) 중 하나 이상 또는 모두의 사전 결실 없이 전체 PBMC 집단에 포함되는 γδ T 세포는 활성화 및 확장되어, 농축된 γδ T-세포 집단을 생성할 수 있다. 일부 양상에서, γδ T-세포의 활성화 및 확장은 천연 또는 조작된 APC의 존재 없이 수행된다. 일부 양상에서, 종양 표본으로부터의 γδ T 세포의 단리 및 확장은 γδ TCR의 활성화 에피토프에 특이적인 항체를 포함하는 고정된 γδT 세포 미토겐, 및 본 명세서에 제공된 γδ TCR의 활성화 에피토프에 결합하는, 렉틴을 포함하는 다른 활성화제를 이용하여 수행될 수 있다.

특정 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 약, 또는 적어도 약, 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 17일, 약 19일, 약 21일, 약 25일, 약 29일, 약 30일 또는 그 사이의 임의의 범위 동안 γδ T-세포를 확장시키는 1종 이상의 제제와 접촉된다. 예를 들어, 단리된 혼합 세포 집단은 제1의 농축된 γδ T-세포 집단을 제공하기 위해 약 1 내지 약 4일, 약 2 내지 약 4일, 약 2 내지 약 5일, 약 3 내지 약 5일, 약 5 내지 약 21일, 약 5 내지 약 19일, 약 5 내지 약 15일, 약 5 내지 약 10일 또는 약 5 내지 약 7일 동안 γδ T-세포를 확장시키는 1종 이상의 제제와 접촉된다. 다른 예로서, 단리된 혼합 세포 집단은 제1의 농축된 γδ T-세포 집단을 제공하기 위해 약 7 내지 약 21일, 약 7 내지 약 19일, 약 7 내지 약 23일 또는 약 7 내지 약 15일 동안 γδ T-세포를 확장시키는 1종 이상의 제제와 접촉된다.

일부 경우에, 정제 또는 단리 단계는 제1 확장 단계와 제2 확장 단계 사이에 수행된다. 일부 경우에, 단리 단계는 1종 이상의 활성제의 제거를 포함한다. 일부 경우에, 단리 단계는 γδ T-세포, 또는 이의 아형의 특정 단리를 포함한다. 일부 경우에, 1종 이상의(예를 들어, 모든) 활성화제(예를 들어, 세포 배양 배지의 통상적인 성분이 아닌 모든 활성화제, 예컨대 혈청 성분 및/또는 IL-2))는 제1 확장 단계와 제2 확장 단계 사이에 제거되지만, γδ T-세포는 다른 세포 유형(αβ T-세포)으로부터 특이적으로 단리되지 않는다.

일부 실시형태에서, 제1 농축 단계, 및 선택적으로 제2 농축 단계에서 γδ TCR의 활성화 에피토프에 결합하는 활성화제를 이용하는 γδ T 세포의 활성화 및 확장 후에, 예를 들어, 본 발명의 제1의 농축된 γδ T 세포 집단(들)은 제2, 제3, 제4, 제5 등의 농축 단계에서 제2 또는 추가적인 농축된 γδ T 세포 집단(들)을 얻기 위해 당업계에 공지된 기법을 이용하여 추가로 농축되거나 또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 예를 들어, 제1의농축된 γδ T 세포 집단(들)은 αβT-세포, B-세포 및 NK 세포가 고갈될 수 있다. 수집된 γδ T-세포(들) 상에서 발현되는 세포 표면 마커의 양성 및/또는 음성 선택은 γδ T-세포, 또는, 예를 들어, 제1의 농축된 γδ T-세포 집단(들)으로부터 유사한 세포 표면 마커를 발현시키는 γδ T-세포(들)의 집단을 직접적으로 단리시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, γδ T-세포는 마커, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD44, Kit, TCR α, TCR β, TCR γ(하나 이상의 TCR γ아형을 포함), TCR δ하나 이상의 TCR δ아형을 포함), NKG2D, CD70, CD27, CD28, CD30, CD16, OX40, CD46, CD161, CCR7, CCR4, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM-1, CD242, JAML, 및 다른 적합한 세포 표면 마커의 양성 또는 음성 발현에 기반하여 농축된 γδ T-세포 집단으로부터 (예를 들어, 제1 및/또는 제2 확장 단계 후에) 단리될 수 있다.

일부 실시형태에서, 제1 확장 단계 후에(예를 들어, 제1 확장 단계에 후속적으로 수행되는 단리 단계 후에), 확장된 세포는 선택적으로 희석되고, 제2 확장 단계에서 배양된다. 바람직한 실시형태에서, 제2 확장 단계는 제2 확장 단계에서 배양 배지가 약 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-5, 2-4 또는 2-3일마다 보충되는 조건 하에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 제2 확장 단계는 세포가 추가로 γδ T-세포 확장을 1, 2, 3, 4, 5, 6회 이상 지원하는 밀도로 희석되거나 또는 조절되는 조건 하에 수행된다. 일부 경우에, 세포 밀도 조절은 배양 배지의 보충과 같은 시기에(즉, 동일한 날에 또는 동시에) 수행된다. 예를 들어, 세포 밀도는 제2 확장 단계에서 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 2-5, 2-4 또는 2-3일마다 조절될 수 있다. 추가로 γδ T-세포 확장을 지원하는 전형적인 세포 밀도는 약 1 x 10⁵, 2 x 10⁵, 3 x 10⁵, 4 x 10⁵, 5 x 10⁵, 6 x 10⁵, 7 x 10⁵, 8 x 10⁵, 9 x 10⁵, 1 x 10⁶, 2 x 10⁶, 3 x 10⁶, 4 x 10⁶, 5 x 10⁶개의 세포/㎖, 10 x 10⁶개의 세포/㎖, 15 x 10⁶개의 세포/㎖, 20 x 10⁶개의 세포/㎖, 또는 30 x 10⁶개의 세포/㎖의 배양물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 실시형태에서, 세포 밀도는 약 0.5 x 10⁶ 내지 약 1 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.5 x 10⁶ 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.5 x 10⁶ 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶ 내지 약 1 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶ 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶ 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 1 x 10⁶ 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 3 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 4 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 10 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 15 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 20 x 10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 1 x 10⁶ 내지 약 30 x 10⁶개의 세포/㎖의 밀도로 조절된다.

일부 실시형태에서, 제2 확장 단계는 세포가 사전결정된 세포 밀도(또는 밀도 간격)에서 모니터링되며 유지되고/되거나 사전결정된 글루코스 함량을 갖는 배양 배지에서 유지되는 조건 하에 수행된다. 예를 들어, 세포는 약 0.5 x 10⁶ 내지 약 1 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.5 x 10⁶ 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.5 x 10⁶ 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶ 내지 약 1 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶ 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 0.75 x 10⁶ 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 2 x 10⁶개의 세포/㎖, 또는 약 1 x 10⁶ 내지 약 1.5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 3 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 4 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 5 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 10 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 15 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 20 x 10⁶개의 세포/㎖, 약 1 x 10⁶ 내지 약 30 x 10⁶개의 세포/㎖의 생세포 밀도로 유지될 수 있다.

일부 경우에, 세포는 적어도 일부의 확장 동안 더 고농도에서 유지될 수 있다. 예를 들어, 제1 또는 제2 확장의 제1 부분에 대해, 세포 생존도는 더 높은 세포 농도에서 향상될 수 있다. 다른 예로서, 제1 또는 제2 확장의 최종 부분에 대해, 배양물 용적은 더 높은 세포 농도에서 가장 효율적으로 이용될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 세포는 제1 또는 제2 확장 배양물의 적어도 일부 또는 제1 또는 제2 확장 배양물의 모두에 대해 약 1 x 10⁶개의 세포/㎖ 내지 약 20 x 10⁶개의 세포/㎖의 생세포 밀도에서 유지될 수 있다.

다른 예로서, 세포는 약 0.5 g/ℓ 내지 약 1 g/ℓ, 약 0.5 g/ℓ 내지 약 1.5 g/ℓ, 약 0.5 g/ℓ 내지 약 2 g/ℓ, 약 0.75 g/ℓ 내지 약 1 g/ℓ, 약 0.75 g/ℓ 내지 약 1.5 g/ℓ, 약 0.75 g/ℓ 내지 약 2 g/ℓ, 약 1 g/ℓ 내지 약 1.5 g/ℓ, 약 1 g/ℓ 내지 약 2 g/ℓ, 1 g/ℓ 내지 3 g/ℓ, 또는 1 g/ℓ 내지 4 g/ℓ의 글루코스 함량을 갖는 배양 배지에서 유지될 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 약 1.25 g/ℓ의 글루코스 함량을 갖는 배양 배지에서 유지될 수 있다. 일부 경우에, 예컨대 높은 세포 밀도 배양물이 유지되는 경우에, 세포는 약 1 g/ℓ 내지 약 5 g/ℓ, 약 1 g/ℓ 내지 약 4 g/ℓ, 약 2 g/ℓ 내지 약 5 g/ℓ, 또는 약 2 g/ℓ 내지 약 4 g/ℓ의 글루코스 함량을 갖는 배양 배지에서 유지될 수 있다.

전형적으로 글루코스 함량은 배양물에 신선한 혈청 함유 또는 무혈청 배양물 배지를 첨가함으로써 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포는, 예를 들어, 사전결정된 제한 내의 매개변수를 유지하기 위해 각각의 매개변수를 모니터링하고 신선한 배지를 첨가함으로써, 사전결정된 생세포 밀도 간격으로 그리고 사전결정된 글루코스 함량 간격을 갖는 배양 배지에서 유지될 수 있다. 일부 실시형태에서, 배양물에서 신선한 혈청 함유 또는 무혈청 배양 배지를 첨가하는 한편, 관류 생물반응기에서 소모된 배지를 제거하고, 내부 세포를 유지시킴으로써 글루코스 함량이 유지된다. 일부 실시형태에서, pH, O₂의 분압, O₂ 포화, CO₂의 분압, CO₂ 포화, 락트산염, 글루타민, 글루탐산염, 암모늄, 나트륨, 칼륨 및 칼슘 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 추가적인 매개변수는 γδ T-세포 확장(예를 들어, 선택적 γδ T-세포 확장) 동안 또는 본 명세서에 기재된 γδ T-세포 확장(예를 들어, 선택적 γδ T-세포 확장) 의 제1 또는 제2 단계 동안 모니터링되고/되거나 유지된다.

γδ T-세포 아형은: 예를 들어, 제1 농축 단계에서 농축된 γδ T-세포 집단을 제공하기 위해

i) δ1 TCR의 에피토프에 특이적으로 결합함으로써 δ1 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제,

ii) δ2 TCR의 에피토프에 특이적으로 결합함으로써 δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 제제,

iii) δ1 및 δ4 TCR의 에피토프에 특이적으로 결합함으로써 δ1 및 δ4 T 세포를 선택적으로 확장시키는 제제; 또는

iv) δ1, δ3, δ4 및 δ5 TCR의 에피토프에 특이적으로 결합함으로써 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T 세포를 선택적으로 확장시키는 제제 중 1종 이상의 제제와 접촉시킴으로써 시험관내에서 배양되는 단리된 복합체 샘플 또는 혼합 세포 집단으로부터 선택적으로 확장될 수 있다. 일부 경우에, 1종 이상의 제제는 δ1J1, δ1J2, 또는 δ1J3 TCR, 또는 이들 중 둘, 또는 이들 모두에 특이적으로 결합한다. 일부 실시형태에서, 특정 세포 집단, 예컨대 단핵구, αβ T-세포, B-세포 및 NK 세포의 사전 고갈 없이 전체 PBMC 집단 내 γδ 세포는 활성화 및 확장되어, 농축된 γδ T-세포 집단을 생성할 수 있다. 일부 양상에서, γδ T-세포의 활성화 및 확장은 천연 또는 조작된 APC의 존재 없이 수행된다. 일부 양상에서, 종양 표본으로부터의 γδ T 세포의 단리 및 확장은 δ1 TCR; δ1, δ3, δ4, 및 δ5 TCR, δ1 및 δ4 TCR; 또는 δ2 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 특이적인 항체를 포함하는 고정된 γδ T 세포 미토겐, 및 δ1 TCR; δ1, δ3, δ4 및 δ5 TCR; δ1 및 δ4 TCR; 또는 본 명세서에 제공된 δ2 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합하는, 렉틴을 포함하는 다른 활성화제를 이용하여 수행될 수 있다.

특정 실시형태에서, 단리된 혼합 세포 집단은 약 5일, 6일, 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일 또는 그 사이의 임의의 범위 동안 δ1, δ1 및 δ4, δ2, 또는 δ1 및 δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제와 접촉된다. 예를 들어, 단리된 혼합 세포 집단은 제1의 농축된 γδ T-세포 집단을 제공하기 위해 약 1 내지 약 3일, 약 1 내지 약 4일, 약 1 내지 약 5일, 약 2 내지 약 3일, 약 2 내지 약 4일, 약 2 내지 약 5일, 약 3 내지 약 4일, 약 3 내지 약 5일, 약 4 내지 약 5일, 약 5 내지 약 15일 또는 약 5 내지 약 7일 동안 δ1 또는 δ2 T-세포를 선택적으로 확장하는 1종 이상의 제제와 접촉된다. 일부 실시형태에서 선택적으로 확장된 δ1, δ1 및 δ3, δ1 및 δ4, δ2, 또는 δ1 및 δ2 T-세포는 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 확장 단계에서 추가로 확장된다.

특정 실시형태에서, 출발 단리된 혼합 세포 집단, 예를 들어, 말초 혈액 샘플은 약 20 내지 80% 범위에서 T 림프구를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 농축된 γδ T-세포 집단(들)에서 잔여 αβ T 세포 및 NK 세포의 백분율은 각각 약 2.5% 및 1% 이하이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 농축된 γδ T-세포 집단(들)에서 잔여 αβ T 세포 또는 NK 세포의 백분율은 각각 약 1%, 0.5%, 0.4%, 0.2%, 0.1% 또는 0.01% 이하이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 농축된 γδ T-세포 집단(들)에서 잔여 αβ T 세포의 백분율은 약 0.4%, 0.2%, 0.1% 또는 0.01% 이하(예를 들어, γδ T-세포 또는 이의 아형에 대한 양성 선택 단계 후에 또는 αβ T 세포의 고갈 후에)이다. 일부 실시형태에서, αβ T 세포는 고갈되지만, NK 세포는 제1 및/또는 제2 γδ T-세포 확장 전에 또는 후에 고갈되지 않는다. 특정 양상에서, 단리된 혼합 세포 집단은 단일 공여자로부터 유래된다. 다른 양상에서, 단리된 혼합 세포 집단은 1명 초과의 공여자 또는 다중 공여자로부터(예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 2-5, 2-10 또는 5-10명 공여자 이상으로부터) 유래된다.

이렇게 해서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 1명만큼의 소수의 공여자로부터 임상적으로 적절한 수(>10⁸, >10⁹, >10¹⁰, >10¹¹, 또는 >10¹², 또는 약 10⁸ 내지 약 10¹²)의 확장된 γδ T-세포를 제공할 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 방법은 공여자 샘플을 얻는 시간으로부터 19 또는 21일 미만 내에 임상적으로 적절한 수(>10⁸, >10⁹, >10¹⁰, >10¹¹ 또는 >10¹², 또는 약 10⁸ 내지 약 10¹²)의 확장된 γδ T-세포를 제공할 수 있다.

제1 농축 단계에서 δ1, δ1 및 δ3 TCR, δ1 및 δ4 TCR, 또는 δ2 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합하는 활성화제를 이용하는 특정 γδ T 세포 서브세트의 특정 활성화 및 확장 후에, 본 발명의 제1 농축된 γδ T 세포 집단(들)은 제2, 제3, 제4, 제5, 등의 농축 단계에서 제2 또는 추가적인 농축된 γδ T 세포 집단(들)을 얻기 위해 당업계에 공지된 기법을 이용하여 추가로 농축되거나 또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 제1의 농축된 γδ T 세포 집단(들)은 αβ T-세포, B-세포 및 NK 세포가 고갈될 수 있다. 수집된 γδ T-세포(들) 상에서 발현되는 세포 표면 마커의 양성 및/또는 음성 선택은 γδ T-세포, 또는 제1의 농축된 γδ T-세포 집단(들)으로부터 유사한 세포 표면 마커를 발현시키는 γδ T-세포(들)의 집단을 직접적으로 단리시키는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, γδ T-세포는 마커, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD44, Kit, TCR α, TCR β, TCR γ(또는 이의 하나 이상의 아형), TCR δ(또는 이의 하나 이상의 아형), NKG2D, CD70, CD27, CD28, CD30, CD16, OX40, CD46, CD161, CCR7, CCR4, DNAM-1, JAML, 및 다른 적합한 세포 표면 마커의 양성 또는 음성 발현에 기반하여 제1의 농축된 γδ T-세포 집단으로부터 단리될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 제1 γδ T-세포 확장, 제1 농축 단계, 제2 γδ T-세포 확장, 및/또는 제2 농축 단계 후에, 농축된 γδ T-세포 집단은, 예를 들어, 10㎖, 25㎖, 50㎖, 100㎖, 150㎖, 200㎖, 500㎖, 750㎖, 1ℓ, 2ℓ, 3ℓ, 4ℓ, 5ℓ, 10ℓ, 20 L 또는 25 L 미만의 배양물 용적에서 10⁸개 초과의 세포의 γδ T-세포 서브세트의 임상적으로 적절한 수준을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 10-100㎖; 25-100㎖; 50-100㎖; 75-100mL; 10-150㎖; 25-150㎖; 50-150㎖; 75-150㎖; 100-150㎖; 10-200㎖; 25-200㎖; 50-200㎖; 75-200㎖, 100-200㎖; 10-250㎖; 25-250㎖; 50-250㎖; 75-250㎖, 100-250㎖; 150-250㎖; 5-1,000㎖; 10-1,000㎖, 또는 100-1,000㎖; 150-1,000㎖; 200-1,000㎖; 250-1,000㎖, 400㎖ 내지 1L, 1ℓ 내지 2ℓ, 2ℓ 내지 5ℓ, 2ℓ 내지 10ℓ, 4ℓ 내지 10ℓ, 4ℓ 내지 15ℓ, 4ℓ 내지 20ℓ, 또는 4ℓ 내지 25ℓ의 용적을 갖는 확장 배양물 내 10⁸개 초과의 세포의 γδ T-세포 서브세트의 임상적으로 적절한 수준을 제공할 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 제2, 제3, 제4, 제5 등의 농축 단계 후에, 농축된 γδ T-세포 집단은 10⁸개 초과의 임상적으로 적절한 수준의 γδ T-세포 서브세트를 포함한다.

일부 실시형태에서, γδ T-세포(들)는 한 가지 이상의 항원과 접촉하는 반응에서 빠르게 확장할 수 있다. 일부 γδ T-세포(들), 예컨대 Vγ9Vδ2⁺ γδ T-세포(들)는 조직 배양 동안에 프레닐-파이로포스페이트, 알킬아민 및 대사물질 또는 미생물 추출물과 같은 일부 항원과 접촉하는 반응에서 시험관내에서 빠르게 확장된다. 추가로, 일부 야생형 γδ T-세포(들), 예컨대 Vγ2Vδ2⁺ γδ T-세포(들)는 특정 유형의 백신접종(들)에 반응하여 인간에서 생체내에서 빠르게 확장한다. 자극된 γδ T-세포는 복합체 샘플로부터 γδ T-세포(들)의 단리를 용이하게 할 수 있는 수많은 항원-제시, 공자극 및 접착 분자를 나타낼 수 있다. 복합체 샘플 내의 γδ T-세포(들)는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 선택적 γδ T-세포 확장제, 예컨대 항체 또는 고정된 항체와 조합하여, 이들 항체를 이용하는 확장 전에 또는 후에 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 약 5-15일, 5-10일 또는 5-7일, 또는 다른 적합한 시간 기간 동안 적어도 하나의 항원을 이용하여 자극될 수 있다. 적합한 항원을 이용하는 γδ T-세포의 자극은 시험관내 γδ T-세포 집단을 확장시킬 수 있다.

시험관내 복합체 샘플로부터 γδ T-세포(들)의 확장을 자극하기 위해 사용될 수 있는 항원의 비제한적 예는 프레닐-파이로포스페이트, 예컨대 아이소펜테닐 파이로포스페이트(IPP), 알킬-아민, 인간 미생물 병원균의 대사물질, 상업적 박테리아의 대사물질, -메틸-3-뷰테닐-1-파이로포스페이트(2M3B1PP), (e)-4-하이드록시-3-메틸-부트-2-엔일 파이로포스페이트(HMB-PP), 에틸 파이로포스페이트(EPP), 파르네실 파이로포스페이트(FPP), 다이메틸알릴 포스페이트(DMAP), 다이메틸알릴 파이로포스페이트(DMAPP), 에틸-아데노신 트라이포스페이트(EPPPA), 제라닐 파이로포스페이트(GPP), 제라닐제라닐 파이로포스페이트(GGPP), 아이소펜텐일-아데노신 트라이포스페이트(IPPPA), 모노에틸 포스페이트(MEP), 모노에틸 파이로포스페이트(MEPP), 3-폼일-1-뷰틸-파이로포스페이트(TUBAg 1), X-파이로포스페이트(TUBAg 2), 3-폼일-1-뷰틸-유리딘 트라이포스페이트(TUBAg 3), 3-폼일-1-뷰틸-데옥시티미딘 트라이포스페이트(TUBAg 4), 모노에틸 알킬아민, 알릴 파이로포스페이트, 크로토일 파이로포스페이트, 다이메틸알릴-γ유리딘 트라이포스페이트, 크로토일-γ유리딘 트라이포스페이트, 알릴-γ유리딘 트라이포스페이트, 에틸아민, 아이소뷰틸아민, sec-뷰틸아민, 아이소-아밀아민 및 질소 함유 비스포스포네이트를 포함한다.

γδ T-세포의 활성화 및 확장은 특정 γδ T-세포 증식 및 지속적 집단을 촉발하기 위해 본 명세서에 기재된 활성화 및 공동자극 제제를 이용하여 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 상이한 배양물로부터의 γδ T-세포의 활성화 및 확장은 별개의 클론 또는 혼합된 다클론성 집단 서브세트를 달성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 특정 γδ 활성화 신호를 제공하는 제제를 동정하기 위해 상이한 작용제가 사용될 수 있다. 일 양상에서, 특정 γδ 활성화 신호를 제공하는 제제는 γδ TCR로 향하는 상이한 단클론성 항체(MAb)일 수 있다.

일 양상에서, MAb는 γ TCR 및/또는 δ TCR의 불변 또는 가변 영역 상에서 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 일 양상에서, MAb는 γδ TCR pan MAb를 포함할 수 있다. 일 양상에서, γδ TCR pan MAb는 δ1 및 δ2 세포 집단을 포함하는 γ또는 δ쇄 중 하나 또는 둘 다 상에서 상이한 γ 및 δ TCR에 의해 공유되는 도메인을 인식할 수 있다. 일 양상에서, 항체는 5A6.E9(써모 사이언티픽(Thermo scientific)), B1(바이오레전드(Biolegend)), IMMU510 및/또는 11F2(11F2)(벡크만 쿨터(Beckman Coulter))일 수 있다. 일 양상에서, MAb는 γ쇄(7A5 Mab, Vγ9 TCR (써모 사이언티픽 #TCR1720)로 향함)의 가변 영역에 독특한 특정 도메인, 또는 Vδ1 가변 영역 상의 도메인(Mab TS8.2(써모 사이언티픽 #TCR1730; MAb TS-1(써모피셔 #TCR 1055), MAb R9.12(벡크만 쿨터#IM1761)), 또는 Vδ2 쇄(MAb 15D(써모 사이언티픽 #TCR1732 또는 라이프 테크놀로지즈 #TCR2732) B6(바이오레전드(Biolegend) #331402)로 향할 수 있으며, δ1# 항체 중 하나는 도 33 내지 34에 기재되어 있거나, 또는 δ2# 항체 중 하나는 도 35 내지 36에 기재되어 있다.

일부 실시형태에서, γδ TCR의 상이한 도메인에 대한 항체(pan 항체 및 서브세트 집단 상에서 특정 가변 영역 에피토프를 인식하는 항체)는 γδ T 세포의 향상된 활성화에 대한 그들의 능력을 평가하도록 조합될 수 있다. 일부 실시형태에서, γδ T-세포 활성체는 γδ TCR-결합제, 예컨대 MICA, NKG2D에 대한 작용제, 예를 들어, Fc 태그, MICA의 융합 단백질, ULBP1, 또는 ULBP3(R&D systems Minneapolis, MN) ULBP2 또는 ULBP6(중국에 소재한 시노 바이올로지컬 베이징(Sino Biological Beijing))을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 아네르기 및 세포자멸사의 유도 없이 특정 γδ T 세포 증식을 촉발시키는 것을 보조하는 데 동반 공자극제가 동정될 수 있다. 이들 공자극제는 γδ 세포 상에서 발현되는 수용체에 대한 리간드, 예컨대 다음 중 하나 이상에 대한 리간드(들)를 포함할 수 있다: NKG2D, CD161, CD70, JAML, DNAX, CD81 부속 분자-1(DNAM-1) ICOS, CD27, CD196, CD137, CD30, HVEM, SLAM, CD122, DAP 및 CD28. 일부 양상에서, 공자극제는 CD2 및 CD3 분자 상의 독특한 에피토프에 특이적인 항체일 수 있다. CD2 및 CD3은 αβ 또는 γδ T-세포(들) 상에서 발현될 때 상이한 입체배좌 구조를 가질 수 있고, 일부 경우에, CD3 및 CD2에 대한 특정 항체는 T-세포의 선택적 활성화를 야기할 수 있다.

γδ T-세포(들)의 집단은 γδ T-세포(들)의 조작 전에 생체외에서 확장될 수 있다. 시험관내 γδ T-세포 집단의 확장을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있는 시약의 비제한적 예는 항-CD3 또는 항-CD2, 항-CD27, 항-CD30, 항-CD70, 항-OX40 항체, IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, IL-18, IL-19, IL-21, IL 23, IL-33, IFNγ, 과립구-대식세포 집락자극인자(GM-CSF), 과립구 집락자극인자(G-CSF), CD70(CD27 리간드), 콘카발린 A(ConA), 미국자기콩(PWM), 단백질 땅콩 응집소(PNA), 대두 응집소(SBA), 레스 쿨리나리스응집소(Les Culinaris Agglutinin: LCA), 완두콩 응집소(Pisum Sativum Agglutinin: PSA), 헬릭스 포마티아 응집소(Helix pomatia Agglutinin: HPA), 비시아 그라미네아 렉틴(Vicia graminea Lectin: VGA), 강낭콩 적혈구응집소(Phaseolus Vulgaris Erythroagglutinin: PHA-E), 강낭콩 백혈구응집소(Phaseolus Vulgaris Leucoagglutinin: PHA-L), 삼부쿠스 니그라 렉틴(Sambucus Nigra Lectin: SNA, EBL), 다릅나무 렉틴 II (MAL II), 회화나무 응집소(Sophora Japonica Agglutinin: SJA), 돌리코스 비플로루스 응집소(Dolichos Biflorus Agglutinin: DBA), 렌즈콩 응집소(Lens Culinaris Agglutinin: LCA), 등나무 렉틴(Wisteria Floribunda Lectin: WFA, WFL) 또는 T 세포 증식을 자극할 수 있는 다른 적합한 미토겐을 포함한다.

γδ T-세포(들)의 유전자 조작은 종양 인식 모이어티를 발현시키는 작제물, 예컨대 αβ TCR, γδ TCR, 항체를 암호화하는 CAR, 이들의 항원 결합 단편 또는 림프구 활성화 도메인을 단리된 γδ T-세포(들), 사이토카인(예를 들어, IL-15, IL-12, IL-2, IL-7, IL-21, IL-18, IL-19, IL-33, IL-4, IL-9, IL-23 또는 IL1β)의 게놈 내로 안정하게 통합하여 생체외 또는 생체내 T-세포 증식, 생존 및 기능을 향상시키는 것을 포함할 수 있다. 단리된 γδ T-세포의 유전자 조작은 또한 단리된 γδ T-세포, 예컨대 MHC 좌위(좌위들)의 게놈 내 하나 이상의 내인성 유전자로부터의 유전자 발현을 결실시키거나 또는 방해하는 것을 포함할 수 있다.

γδ T-세포의 생체외 확장

다른 양상에서, 본 개시내용은 입양 전달 용법을 위한 비조작된 그리고 조작된 γδ T-세포 집단의 생체외 확장을 위한 방법을 제공한다. 본 개시내용의 비조작된 또는 조작된 γδ T-세포는 생체외에서 확장될 수 있다. 본 개시내용의 비조작된 또는 조작된 γδ T-세포는 APC에 의한 활성화 없이, 또는 APC 및/또는 아미노포스포네이트와 함께 공동 배양 없이 시험관내에서 확장될 수 있다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 본 개시내용의 비조작된 또는 조작된 γδ T-세포는 APC와 함께 그리고/또는 하나 이상의 아미노포스포네이트와 함께 공동 배양에 의한 활성화를 포함하는 적어도 하나의 확장 단계를 이용하여 시험관내에서 확장될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 개시내용의 비-조작된 또는 조작된 γδ T-세포는 제1 γδ T-세포 확장에서 APC에 의한 활성화 없이 시험관내에서 확장될 수 있고, 제2 γδ T-세포 확장에서 APC에 의한 활성화에 의해 시험관내에서 확장될 수 있다. 일부 경우에, 제1 γδ T-세포 확장은 γδ T-세포를 (a) γδ T-세포를 확장시키거나, 또는 (b) δ1 TCR; δ2 TCR; δ1 및 δ4 TCR; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 TCR 각각의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ3 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제와 접촉시키는 것을 포함한다.

일부 경우에, 제2 γδ T-세포 확장은 제1 γδ T-세포 확장에서 사용되는 1종 이상의 제제가 없는 배양 배지에서 수행된다. 일부 경우에, 제2 γδ T-세포 확장은 (a) T 세포를 확장시키거나, (b) γδ T-세포를 확장시키거나, 또는 (c) δ1 TCR; δ2 TCR; δ1 및 δ4 TCR; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 TCR 각각의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ3 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제2 제제를 함유하는 배양 배지에서 수행된다.

일부 경우에, 제2 제제는 제1 γδ T-세포 확장에서 사용되는 제제에 비교하여 상이하다(예를 들어, 상이한 1차 아미노산 서열을 갖고/갖거나 구조적으로 상이한 γδ TCR 에피토프에 결합함). 일부 경우에, 제2 제제는 중복 γδ TCR 에피토프, 동일한 γδ TCR 에피토프에 결합할 수 있거나, 또는 γδ TCR에 대한 결합에 대해 제1 γδ T-세포 확장에서 사용되는 제제와 경쟁할 수 있다. 일부 경우에, 제2 제제는 APC의 세포 표면 상에서 발현된다. 일부 경우에, 제2 제제는, 예를 들어, APC의 표면 상에서 제2 제제의 불변 영역과 Fc 수용체 사이의 결합 상호작용에 의해, APC의 표면에 결합된다. 일부 경우에, 제2 제제는 가용성이다. 일부 경우에, 제2 γδ T-세포 확장은 가용성 제2 제제 및 APC를 함유하는 배양 배지에서 수행되고, 선택적으로 APC는 그들의 세포 표면 상에서 발현되거나 또는 그들의 세포 표면에 γδ T 세포 집단을 확장시키거나 또는 선택적으로 확장시키는 제제를 결합시킨다.

일부 경우에, 제1 γδ T-세포 확장은 APC 없이 수행되고, 제2 γδ T-세포 확장은 APC에 의해 수행된다. 일부 경우에, 제2 γδ T-세포 확장은 (a) T 세포를 확장시키거나, (b) γδ T-세포를 확장시키거나, 또는 (c) δ1 TCR; δ2 TCR; δ1 및 δ4 TCR; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 TCR 각각의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ3 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제2 제제 및 APC에 의해 수행된다.

당업자는 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 제2 확장 단계의의 방법이 제1 확장 단계로서 수행될 수 있고, 본 명세서에 기재된 제1 단계의 방법이 제2 확장 단계로서 수행될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예로서, 제한없이, 일부 실시형태에서, 세포의 혼합 집단(예를 들어, PBMC)은 제1 단계에서 APC와 접촉함으로써 확장될 수 있고, 그리고, 이어서, APC의 부재 하에서, 예를 들어, 제1 확장 단계로부터의 확장된 집단을 δ1 TCR; δ2 TCR; δ1 및 δ4 TCR; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 TCR 각각의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1 T-세포; δ2 T-세포; δ1 T-세포 및 δ3 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T-세포를 선택적으로 확장시키는 고정된 제제와 접촉시킴으로써, 확장될 수 있다.

본 발명의 방법은 다양한 γδ T-세포(들) 집단, 예컨대 Vγ1⁺, Vγ2⁺, 또는 Vγ3⁺ γδ T-세포 집단을 확장시킬 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 방법은 Vδ1⁺ T-세포 집단; Vδ1⁺ 및 Vδ3⁺ T-세포 집단; Vδ1⁺ 및 Vδ4⁺ T-세포 집단; Vδ1⁺ 및 Vδ2⁺ T-세포 집단; 또는 Vδ1⁺, Vδ3⁺, Vδ4⁺, 및 Vδ5⁺T-세포 집단을 확장시킬 수 있다.

일부 예에서, γδ T-세포 집단은 36일 미만, 35일 미만, 34일 미만, 33일 미만, 32일 미만, 31일 미만, 30일 미만, 29일 미만, 28일 미만, 27일 미만, 26일 미만, 25일 미만, 24일 미만, 23일 미만, 22일 미만, 21일 미만, 20일 미만, 19일 미만, 18일 미만, 17일 미만, 16일 미만, 15일 미만, 14일 미만, 13일 미만, 12일 미만, 11일 미만, 10일 미만, 9일 미만, 8일 미만, 7일 미만, 6일 미만, 5일 미만, 4일 미만 또는 3일 미만에 시험관내에서 확장될 수 있다.

일부 양상에서, 혼합 세포 집단으로부터의 γδ T-세포를 활성화제와 접촉시킴으로써 조작된 그리고 비조작된 γδ T-세포를 포함하는, 다양한 γδ T-세포를 선택적으로 확장시키는 방법이 제공된다. 일부 경우에, 활성화 또는 활성화제는 γδ T-세포의 세포 표면 수용체 상에서 특정 에피토프에 결합한다. 활성화제는 단클론성 항체와 같은 항체일 수 있다. 활성화제는 γδ T-세포의 한 가지 이상의 유형, 예컨대, δ1, δ2, δ1 및 δ3, 또는 δ1 및 δ4 세포 집단의 성장을 특이적으로 활성화시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화제는 δ1 세포 집단의 성장을 특이적으로 활성화시켜 농축된 δ1 T-세포 집단을 제공한다. 다른 경우에, 활성화제는 δ2 세포 집단의 성장을 특이적으로 활성화시켜 농축된 δ2 T-세포 집단을 제공한다.

활성화제는 조작된 그리고 비조작된 γδ T-세포의 확장을 빠른 성장 속도로 자극할 수 있다. 예를 들어, 제제는 30시간 미만에 1회의 세포 분할, 29시간 미만에 1회의 세포 분할, 28시간 미만에 1회의 세포 분할, 27시간 미만에 1회의 세포 분할, 26시간 미만에 1회의 세포 분할, 25시간 미만에 1회의 세포 분할, 24시간 미만에 1회의 세포 분할, 23시간 미만에 1회의 세포 분할, 22시간 미만에 1회의 세포 분할, 21시간 미만에 1회의 세포 분할, 20시간 미만에 1회의 세포 분할, 19시간 미만에 1회의 세포 분할, 18시간 미만에 1회의 세포 분할, 17시간 미만에 1회의 세포 분할, 16시간 미만에 1회의 세포 분할, 15시간 미만에 1회의 세포 분할, 14시간 미만에 1회의 세포 분할, 13시간 미만에 1회의 세포 분할, 12시간 미만에 1회의 세포 분할, 11시간 미만에 1회의 세포 분할, 10시간 미만에 1회의 세포 분할, 9시간 미만에 1회의 세포 분할, 8시간 미만에 1회의 세포 분할, 7시간 미만에 1회의 세포 분할, 6시간 미만에 1회의 세포 분할, 5시간 미만에 1회의 세포 분할, 4시간 미만에 1회의 세포 분할, 3시간 미만에 1회의 세포 분할, 2시간 미만에 1회의 세포분할의 평균 속도로 γδ T-세포 집단의 확장을 자극한다.

일부 경우에, 활성화제는 약 4시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 5시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 6시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 7시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 8시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 9시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 10시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 11시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 12시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 13시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 14시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 15시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 16시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 17시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 18시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 19시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 20시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 21시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 22시간 당 약 1회 분할의 속도, 약 23시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 24시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 25시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 26시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 27시간 당 약 1회 분할의 속도, 약 28시간 당 약 1회 분할의 속도, 약 29시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 30시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 31시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 32시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 33시간 당 약 1회 분할의 속도, 약 34시간 당 약 1회 분할의 속도, 약 35시간 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 36시간 당 약 1회 분할의 평균 속도로 조작된 그리고 비조작된 γδ T-세포의 확장을 자극할 수 있다.

일부 경우에, 활성화제는 γδ T-세포 확장 배양물에서 조작된 그리고/또는 비조작된 γδ T-세포의 빠른 확장을 자극할 수 있되, 빠른 확장은 세포 분할의 앞서 언급한 평균 속도 중 하나에서 이며, 약 1 연속일 내지 약 19 연속일, 약 1 연속일 내지 약 14 연속일, 약 1 연속일 내지 약 7 연속일, 약 1 연속일 내지 약 5 연속일, 약 2 연속일 내지 약 19 연속일, 약 2 연속일 내지 약 14 연속일, 약 2 연속일 내지 약 7 연속일, 약 2 연속일 내지 약 5 연속일, 약 4 연속일 내지 약 19 연속일, 약 4 연속일 내지 약 14 연속일, 약 4 연속일 내지 약 7 연속일, 또는 약 4 연속일 내지 약 5 연속일 동안 유지된다.

일부 경우에, 활성화제는 약 12시간(예를 들어, 10-12시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 13시간(예를 들어, 10-13시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도,약 14시간(예를 들어, 10-14시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 15시간(예를 들어, 10-15시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 16시간(예를 들어, 10-16 시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 17시간(예를 들어, 10-17시간 또는 12-17시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 18시간(예를 들어, 10-18시간 또는 12-18시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 19시간(예를 들어, 10-19시간 또는 12-19시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 20시간(예를 들어, 12-20시간, 16-20시간 또는 18-20시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 21시간(예를 들어, 12-21 시간, 16-21시간 또는 18-21시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 22시간(예를 들어, 12-22시간, 16-22시간 또는 18-22시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 23시간 이하(예를 들어, 12-23 시간, 16-23시간 또는 18-23시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 24시간(예를 들어, 12-24 시간, 16-24시간 또는 18-24시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도로 약 2 내지 약 7 연속일, 또는 약 2 내지 약 5 연속일 동안 유지된 γδ T-세포 확장 배양물 내 조작된 그리고/또는 비조작된 γδ T-세포의 확장을 자극할 수 있다.

일부 경우에, 활성화제는 약 25시간(예를 들어, 12-25 시간, 16-25시간 18-25 시간, 또는 20-25시간)당 약 1회 분할의 평균 속도,약 26시간(예를 들어, 12-26 시간, 16-26시간 18-26 시간, 또는 20-26시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 27시간(예를 들어, 12-27 시간, 16-27시간 18-27 시간, 또는 20-27시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 28시간(예를 들어, 12-28 시간, 16-28시간 18-28 시간, 20-28 시간, 또는 22-28시간)당 약 1회 분할의 속도, 약 29시간(예를 들어, 16-29시간 18-29 시간, 20-29 시간, 또는 22-29시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 30시간(예를 들어, 16-30시간 18-30 시간, 20-30 시간, 또는 22-30시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 31시간(예를 들어, 16-31시간 18-31 시간, 20-31 시간, 22-31 시간, 또는 24-31시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 32시간(예를 들어, 18-32 시간, 20-32 시간, 22-32 시간, 또는 24-32시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 33시간(예를 들어, 18-33 시간, 20-33 시간, 22-33 시간, 또는 24-33시간)당 약 1회 분할의 속도, 약 34시간(예를 들어, 18-34 시간, 20-34 시간, 22-34 시간, 또는 24-34시간)당 약 1회 분할의 속도, 약 35시간(예를 들어, 18-35 시간, 20-35 시간, 22-35 시간, 또는 24-35시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 36시간(예를 들어, 18-36 시간, 20-36 시간, 22-36 시간, 또는 24-36시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도로 약 2 내지 약 7 연속일, 또는 약 2 내지 약 5 연속일 동안 유지된 γδ T-세포 확장 배양물에서 조작된 그리고/또는 비조작된 γδ T-세포의 확장을 자극할 수 있다.

일부 경우에, 활성화제는 약 12시간(예를 들어, 10-12시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 13시간(예를 들어, 10-13시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도,약 14시간(예를 들어, 10-14시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 15시간(예를 들어, 10-15시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 16시간(예를 들어, 10-16 시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 17시간(예를 들어, 10-17시간 또는 12-17시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 18시간(예를 들어, 10-18시간 또는 12-18시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 19시간(예를 들어, 10-19시간 또는 12-19시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 20시간(예를 들어, 12-20시간, 16-20시간 또는 18-20시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 21시간(예를 들어, 12-21 시간, 16-21시간 또는 18-21시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 22시간(예를 들어, 12-22시간, 16-22시간 또는 18-22시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 23시간 이하(예를 들어, 12-23 시간, 16-23시간 또는 18-23시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 24시간(예를 들어, 12-24 시간, 16-24시간 또는 18-24시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도로 적어도 14연속일 동안 유지된 γδ T-세포 확장 배양물 내 조작된 그리고/또는 비조작된 γδ T-세포의 확장을 자극할 수 있다.

일부 경우에, 활성화제는 약 25시간(예를 들어, 12-25 시간, 16-25시간 18-25 시간, 또는 20-25시간)당 약 1회 분할의 평균 속도,약 26시간(예를 들어, 12-26 시간, 16-26시간 18-26 시간, 또는 20-26시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 27시간(예를 들어, 12-27 시간, 16-27시간 18-27 시간, 또는 20-27시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 28시간(예를 들어, 12-28 시간, 16-28시간 18-28 시간, 20-28 시간, 또는 22-28시간)당 약 1회 분할의 속도, 약 29시간(예를 들어, 16-29시간 18-29 시간, 20-29 시간, 또는 22-29시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 30시간(예를 들어, 16-30시간 18-30 시간, 20-30 시간, 또는 22-30시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 31시간(예를 들어, 16-31시간 18-31 시간, 20-31 시간, 22-31 시간, 또는 24-31시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 32시간(예를 들어, 18-32 시간, 20-32 시간, 22-32 시간, 또는 24-32시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 33시간(예를 들어, 18-33 시간, 20-33 시간, 22-33 시간, 또는 24-33시간)당 약 1회 분할의 속도, 약 34시간(예를 들어, 18-34 시간, 20-34 시간, 22-34 시간, 또는 24-34시간)당 약 1회 분할의 속도, 약 35시간(예를 들어, 18-35 시간, 20-35 시간, 22-35 시간, 또는 24-35시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 36시간(예를 들어, 18-36 시간, 20-36 시간, 22-36 시간, 또는 24-36시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도로 적어도 14 연속일 동안 유지된 γδ T-세포 확장 배양물에서 조작된 그리고/또는 비조작된 γδ T-세포의 확장을 자극할 수 있다.

일부 경우에, 활성화제는 약 12시간(예를 들어, 10-12시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 13시간(예를 들어, 10-13시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도,약 14시간(예를 들어, 10-14시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 15시간(예를 들어, 10-15시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 16시간(예를 들어, 10-16 시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 17시간(예를 들어, 10-17시간 또는 12-17시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 18시간(예를 들어, 10-18시간 또는 12-18시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 19시간(예를 들어, 10-19시간 또는 12-19시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 20시간(예를 들어, 12-20시간, 16-20시간 또는 18-20시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 21시간(예를 들어, 12-21 시간, 16-21시간 또는 18-21시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 22시간(예를 들어, 12-22시간, 16-22시간 또는 18-22시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 23시간 이하(예를 들어, 12-23 시간, 16-23시간 또는 18-23시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 24시간(예를 들어, 12-24 시간, 16-24시간 또는 18-24시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도로 적어도 19연속일 동안 유지된 γδ T-세포 확장 배양물 내 조작된 그리고/또는 비조작된 γδ T-세포의 확장을 자극할 수 있다.

일부 경우에, 활성화제는 약 25시간(예를 들어, 12-25 시간, 16-25시간 18-25 시간, 또는 20-25시간)당 약 1회 분할의 평균 속도,약 26시간(예를 들어, 12-26 시간, 16-26시간 18-26 시간, 또는 20-26시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 27시간(예를 들어, 12-27 시간, 16-27시간 18-27 시간, 또는 20-27시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 28시간(예를 들어, 12-28 시간, 16-28시간 18-28 시간, 20-28 시간, 또는 22-28시간)당 약 1회 분할의 속도, 약 29시간(예를 들어, 16-29시간 18-29 시간, 20-29 시간, 또는 22-29시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 30시간(예를 들어, 16-30시간 18-30 시간, 20-30 시간, 또는 22-30시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 31시간(예를 들어, 16-31시간 18-31 시간, 20-31 시간, 22-31 시간, 또는 24-31시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 32시간(예를 들어, 18-32 시간, 20-32 시간, 22-32 시간, 또는 24-32시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 33시간(예를 들어, 18-33 시간, 20-33 시간, 22-33 시간, 또는 24-33시간)당 약 1회 분할의 속도, 약 34시간(예를 들어, 18-34 시간, 20-34 시간, 22-34 시간, 또는 24-34시간)당 약 1회 분할의 속도, 약 35시간(예를 들어, 18-35 시간, 20-35 시간, 22-35 시간, 또는 24-35시간)당 약 1회 분할의 평균 속도, 약 36시간(예를 들어, 18-36 시간, 20-36 시간, 22-36 시간, 또는 24-36시간) 당 약 1회 분할의 평균 속도로 적어도 19 연속일 동안 유지된 γδ T-세포 확장 배양물에서 조작된 그리고/또는 비조작된 γδ T-세포의 확장을 자극할 수 있다.

활성화제는 상이한 성장 속도로 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포의 하위 집단의 확장을 자극할 수 있다. 예를 들어, 배양의 제1일 내지 제90일의 시간 기간에 걸쳐(예를 들어, 약 1일 내지 약 19, 21 또는 23일의 배양) 확장이 다른 γδ T-세포 집단, 예컨대 δ2 또는 δ3 집단에 대해; 확장 전 γδ T-세포의 시작 수에 대해; 확장 전 γδ1 T-세포의 시작 수에 대해; 또는 배양물 내 αβ T 세포 집단에 대해 약 10배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1,000배, 10,000배, 20,000배, 30,000배, 50,000배, 70,000배, 100,000배 또는 1,000,000배 초과의 확장을 초래하도록 상기 제제는 더 빠른 속도로 δ1 세포 집단의 성장을 자극할 수 있다.

다른 경우에, 배양의 제1일 내지 제90일의 시간 기간(예를 들어, 약 1일 내지 약 19, 21 또는 23일의 배양)에 걸쳐 확장이 δ2 T-세포 집단에 대해; 다른 γδ T-세포 하위집단에 대해; 확장 전에 γδ T-세포의 시작 수에 대해; 확장 전에 γδ1 T-세포의 시작 수에 대해; 확장 전에 γδ1 및 γδ3 T-세포의 시작 수에 대해; 또는 배양물 내 αβ T 세포 집단에 대해 10배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1,000배, 10,000배, 20,000배, 30,000배, 50,000배, 70,000배, 100,000배 또는 1,000,000배 초과를 초래하도록 상기 제제는 더 빠른 속도로 δ1 및 δ4의 성장을 자극할 수 있다.

다른 경우에, 배양의 제1일 내지 제90일의 시간 기간(예를 들어, 약 1일 내지 약 19, 21 또는 23일의 배양)에 걸쳐 확장이 δ2 T-세포 집단에 대해; 다른 γδ T-세포 하위집단에 대해; 확장 전에 γδ T-세포의 시작 수에 대해; 확장 전에 γδ1 T-세포의 시작 수에 대해; 확장 전에 γδ1 및 γδ4 T-세포의 시작 수에 대해; 또는 배양물 내 αβ T 세포 집단에 대해 10배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1,000배, 10,000배, 20,000배, 30,000배, 50,000배, 70,000배, 100,000배 또는 1,000,000배 초과를 초래하도록 상기 제제는 더 빠른 속도로 δ1 및 δ4의 성장을 자극할 수 있다.

다른 경우에, 배양의 제1일 내지 제90일의 시간 기간(예를 들어, 약 1일 내지 약 19, 21 또는 23일의 배양)에 걸쳐 확장이 δ2 T-세포 집단에 대해; 다른 γδ T-세포 하위집단에 대해; 확장 전에 γδ T-세포의 시작 수에 대해; 확장 전에 γδ1 T-세포의 시작 수에 대해; 확장 전에 γδ1 및 γδ3 T-세포의 시작 수에 대해; 확장 전에 γδ1, γδ3, γδ4, 및 γδ5 T-세포의 시작 수에 대해; 또는 배양물 내 αβ T 세포 집단에 대해 10배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1,000배, 10,000배, 20,000배, 30,000배, 50,000배, 70,000배, 100,000배 또는 1,000,000배 초과를 초래하도록 상기 제제는 더 빠른 속도로 δ1, δ3, δ4 및 δ5 의 성장을 자극할 수 있다.

다른 경우에, 배양의 제1일 내지 제90일의 시간 기간(예를 들어, 약 1일 내지 약 19, 21 또는 23일의 배양)에 걸쳐 확장이 δ1 T-세포 집단에 대해; δ3 T-세포 집단에 대해; 다른 γδ T-세포 하위 집단에 대해; 확장 전에 γδ T-세포의 시작 수에 대해, 확장 전에 f γδ2 T-세포의 시작 수에 대해, 또는 αβ T-세포에 대해 10배, 100배, 200배, 300배, 400배, 500배, 600배, 700배, 800배, 900배, 1,000배, 10,000배, 20,000배, 30,000배, 50,000배, 70,000배, 100,000배 또는 1,000,000배 초과의 확장을 초래하도록 상기 제제는 더 빠른 속도로 δ2 집단의 성장을 자극할 수 있다.

일부 양상에서, 본 개시내용은 빠른 속도, 예컨대 30시간 당 약 1개의 세포 분할의 속도로 또는 더 빠르게 γδ T-세포 집단의 확장을 자극하는 제제와 접촉하여 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단을 제공한다. 일부 경우에, 제제는 선택적으로 δ1; δ2; δ1 및 δ4; 또는 δ1, δ3, δ4, 및 δ5 T-세포 중 하나의 증식을 자극한다. γδ T-세포 집단은 비-조작된 γδ T-세포의 양 및 조작된 γδ T-세포의 양을 포함할 수 있다. 일부 경우에, γδ T-세포 집단은 상이한 백분율의 δ1, δ2, δ3, 및 δ4 T-세포를 포함한다. 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은, 예를 들어, 90% 미만의 δ1 T-세포, 80% 미만의 δ1 T-세포, 70% 미만의 δ1 T-세포, 60% 미만의 δ1 T-세포, 50% 미만의 δ1 T-세포, 40% 미만의 δ1 T-세포, 30% 미만의 δ1 T-세포, 20% 미만의 δ1 T-세포, 10% 미만의 δ1 T-세포, 또는 5% 미만의 δ1 T-세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 5% 초과의 δ1 T-세포, 10% 초과의 δ1 T-세포, 20% 초과의 δ1 T-세포, 30% 초과의 δ1 T-세포, 40% 초과의 δ1 T-세포, 50% 초과의 δ1 T-세포, 60% 초과의 δ1 T-세포, 70% 초과의 δ1 T-세포, 80% 초과의 δ1 T-세포, 또는 90% 초과의 δ1 T-세포를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 상기 제제는 본 명세서에 기재된 선택적 확장제 중 하나이다. 일부 경우에, 상기 제제는 세포 배양물 표면, 또는 APC의 표면과 같은 표면 상에 고정된다(예를 들어, APC의 표면 상에서 발현되거나 또는 APC의 표면 상에서 발현된 Fc 수용체에 결합됨).

조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은, 예를 들어, 90% 미만의 δ2 T-세포, 80% 미만의 δ2 T-세포, 70% 미만의 δ2 T-세포, 60% 미만의 δ2 T-세포, 50% 미만의 δ2 T-세포, 40% 미만의 δ2 T-세포, 30% 미만의 δ2 T-세포, 20% 미만의 δ2 T-세포, 10% 미만의 δ2 T-세포, 또는 5% 미만의 δ2 T-세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 5% 초과의 δ2 T-세포, 10% 초과의 δ2 T-세포, 20% 초과의 δ2 T-세포, 30% 초과의 δ2 T-세포, 40% 초과의 δ2 T-세포, 50% 초과의 δ2 T-세포, 60% 초과의 δ2 T-세포, 70% 초과의 δ2 T-세포, 80% 초과의 δ2 T-세포, 또는 90% 초과의 δ2 T-세포를 포함할 수 있다.

조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은, 예를 들어, 90% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 80% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 70% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 60% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 50% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 40% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 30% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 20% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 10% δ1 및 δ4 T-세포, 또는 5% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 5% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 10% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 20% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 30% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 40% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 50% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 60% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 70% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 80% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 또는 90% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포를 포함할 수 있다.

조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은, 예를 들어, 90% 미만의 δ4 T-세포, 80% 미만의 δ4 T-세포, 70% 미만의 δ4 T-세포, 60% 미만의 δ4 T-세포, 50% 미만의 δ4 T-세포, 40% 미만의 δ4 T-세포, 30% 미만의 δ4 T-세포, 20% 미만의 δ4 T-세포, 10% 미만의 δ4 T-세포 또는 5% 미만의 δ4 T-세포를 포함할 수 있다. 대안적으로, 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은 5% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 10% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 20% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 30% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 40% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 50% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 60% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 70% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 80% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포, 또는 90% 초과의 δ1 및 δ4 T-세포를 포함할 수 있다. 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포 집단은, 예를 들어, 90% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 80% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 70% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 60% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 50% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 40% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 30% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 20% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포, 10% δ1 및 δ4 T-세포, 또는 5% 미만의 δ1 및 δ4 T-세포를 포함할 수 있다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 10-90% δ1 T-세포 및 90-10% δ2 T-세포를 포함하는 확장된 γδ T-세포 집단의 혼합물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 10-90% δ1 및 δ3 T-세포 및 90-10% δ2 T-세포를 포함하는 확장된 γδ T-세포 집단의 혼합물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 10-90% δ1 및 δ4 T-세포 및 90-10% δ2 T-세포를 포함하는 확장된 γδ T-세포 집단의 혼합물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 10-90% δ1, δ3, δ4 및 δ5 T-세포 및 90-10% δ2 T-세포를 포함하는 확장된 γδ T-세포 집단의 혼합물을 제공한다.

1종 이상의 활성화제는 γδ T-세포(예를 들어, 활성체 γδ T 세포 고유 수용체)와 접촉할 수 있고, 이후에 공자극 분자는 추가적인 자극을 제공하기 위해 그리고 γδ T-세포를 확장시키기 위해 γδ T-세포와 접촉될 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화제 및/또는 공자극제는 γδ T-세포, 및 다른 비-렉틴/비-항체 제제를 활성화시키는 식물 및 비식물 유래의, 단클론성 항체의 렉틴일 수 있다. 다른 경우에, 식물 렉틴은 예컨대 다른 식물 렉틴이 사용될 수도 있지만, 콘카나발린 A(ConA)일 수 있다. 렉틴의 다른 예는 단백질 땅콩 응집소(PNA), 대두 응집소(SBA), 레스 쿨리나리스 응집소(LCA), 완두콩 응집소(PSA), 헬릭스 포마티아 응집소(HPA), 비시아 그라미네아 렉틴(VGA), 강낭콩 적혈구응집소(PHA-E), 강낭콩 백혈구응집소(PHA-L), 삼부쿠스 니그라 렉틴(SNA, EBL), 다릅나무 렉틴 II (MAL II), 회화나무 응집소(SJA), 돌리코스 비플로루스 응집소(DBA), 렌즈콩 응집소(LCA), 등나무 렉틴(WFA, WFL)을 포함한다.

활성화제 및 공자극 분자의 비제한적 예는 δ 또는 γ-쇄 또는 본 명세서에 기재된 이의 아형에 선택적인 임의의 1종 이상의 항체, 5A6.E9, B1, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, γ3.20, 7A5, IMMU510, R9.12, 11F2과 같은 항체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 활성화제 및 공자극 분자의 다른 예는 졸레드로네이트, 포볼 12-미리스테이트-13-아세테이트(TPA), 메제레인, 스타필로코커스 엔테로톡시 A(staphylococcal enterotoxin A: SEA), 스트렙토코커스 단백질 A, 또는 이들의 조합을 포함한다.

다른 경우에, 활성화제 및/또는 공자극제는 α TCR, β TCR, γ TCR, δ TCR, CD277, CD28, CD46, CD81, CTLA4, ICOS, PD-1, CD30, NKG2D, NKG2A, HVEM, 4-1 BB(CD137), OX40(CD134), CD70, CD80, CD86, DAP, CD122, GITR, FcεRIγ, CD1, CD16, CD161, DNAX, 부속 분자-1(DNAM-1), 하나 이상의 NCR(예를 들어, NKp30, NKp44, NKp46), SLAM, 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스 수용체 또는 이들의 조합에 대한 항체 또는 리간드일 수 있다.

조작된 γδ T 세포

조작된 γδ T-세포(예를 들어, 도 1 참조)는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 생성될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 특정 종양 인식 모이어티를 안정하게 발현시키도록 설계될 수 있다. 종양 인식, 또는 다른 유형의 인식 모이어티을 포함하는 발현 카세트를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 트랜스포존/트랜스포사제 시스템 또는 바이러스기반 유전자 전달 시스템, 예컨대 렌티바이러스 또는 레트로바이러스계, 또는 다른 적합한 방법, 예컨대 형질감염, 전기천공법, 형질도입, 리포펙션, 인산칼슘(CaPO₄), 나노조작된 물질, 예컨대 오르모실(Ormosil), 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노-관련 바이러스를 포함하는 바이러스 전달 방법, 또는 다른 적합한 방법에 의해 γδ T-세포 내로 안정하게 도입될 수 있다. αβ 또는 γδ 중 하나인 항원 특이적 TCR은 γδ T-세포의 게놈 내로 항원 특이적 TCR에 대한 유전자 암호를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 안정하게 삽입함으로써 조작된 γδ T-세포 내로 도입될 수 있다. 종양 인식 모이어티를 이용하여 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 γδ T-세포의 게놈 내로 폴리뉴클레오타이드를 안정하게 삽입함으로써 조작된 γδ T-세포 내로 도입될 수 있다. 일부 경우에, 조작된 종양 인식 모이어티는 조작된 T-세포 수용체이고, 조작된 γδ T-세포의 게놈 내로 혼입된 발현 카세트는 조작된 TCR α(TCR 알파) 유전자, 조작된 TCR β(TCR 베타) 유전자, TCR δ(TCR 델타) 유전자, 또는 조작된 TCR γ(TCR 감마) 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포의 게놈 내로 혼입된 발현 카세트는 항체 단편 또는 이의 항원 결합 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 경우에, 항체 단편 또는 이의 항원 결합 단편은 CAR 및 T-세포 수용체(TCR), 또는 상이한 항원과 관련된 CAR을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR) 작제물, 또는 이중특이성 작제물의 부분으로서 세포 표면 종양 항원에 결합하는 전체 항체, 항체 단편, 단일쇄 가변 단편(scFv), 단일 도메인 항체(sdAb), Fab, F(ab)₂, Fc, 항체 상의 경쇄 또는 중쇄, 항체의 가변 또는 불변 영역, 또는 이들의 임의의 조합을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드이다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 인간으로부터 또는 다른 종으로부터 유래된다. 비인간 종으로부터 유래된 항체 단편 또는 항원 결합 단편 폴리뉴클레오타이드는 인간에서 자연적으로 생성된 항체에 대한 그들의 유사성을 증가시키도록 변형될 수 있고, 항체 단편 또는 항원 결합 단편은 부분적으로 또는 완전히 인간화될 수 있다. 항체 단편 또는 항원 결합 단편 폴리뉴클레오타이드는 또한 키메라, 예를 들어 마우스-인간 항체 키메라일 수 있다. CAR을 발현시키는 조작된 γδ T-세포는 또한 종양 인식 모이어티에 의해 인식되는 항원에 대한 리간드를 발현시키도록 조작될 수 있다.

당업계에 공지된 다양한 기법은 조작된 γδ T-세포의 게놈 내 특정 위치 내로 종양 인식 모이어티에 대한 유전자 암호를 포함하는, 클로닝되거나 또는 합성으로 조작된 핵산을 도입하기 위해 사용될 수 있다. WO201409370, WO2003087341, WO2014134412 및 WO2011090804에 의해 각각 기재되는 바와 같은 미생물의 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복부(clustered regularly interspaced short palindromic repeat: CRISPR) 시스템, 아연 핑거 뉴클레아제(zinc finger nuclease: ZFN), 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제(TALENs) 및 메가뉴클레아제 기법으로부터의 RNA-가이드 Cas9 뉴클레아제는 γδ T-세포(들)에서 효율적인 게놈 조작을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 기법은 또한 하나의 유전자의 넉아웃(knock-out) 및 다른 유전자의 넉인(knock-in)을 동시에 제공하는 게놈 위치 내로 발현 카세트를 삽입하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 발현 카세트를 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 MHC 유전자를 암호화하는 게놈 영역 내로 삽입될 수 있다. 이러한 조작은 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 발현 카세트에 포함된 유전자, 및 다른 유전자, 예를 들어, MHC 좌위의 넉 아웃을 동시에 제공할 수 있다.

하나의 경우에, 종양 인식 모이어티에 대한 핵산 암호를 포함하는 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존은 조작 중인 세포 γδ T-세포 내로 도입된다. 본 명세서에 전문이 참고로 포함된 미국 특허 제7,985,739호에 기재된 트랜스포존과 같은 야생형 잠자는 숲속의 미녀에 비해 향상된 통합을 제공하는 돌연변이체 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포사제는 조작된 γδ T-세포 내 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위해 사용될 수 있다.

일부 경우에, 바이러스 방법은 조작된 γδ T-세포의 게놈 내로 종양 인식 모이어티를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위해 사용된다. 다수의 바이러스 방법, 예컨대 본 명세서에 전문이 포함된 WO 1993020221에 기재된 방법이 인간 유전자 요법에 사용되었다. γδ T-세포를 조작하기 위해 사용될 수 있는 바이러스 방법의 비제한적 예는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 단순포진 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스 또는 아데노 바이러스 관련 바이러스 방법을 포함한다.

종양 인식 모이어티에 대한 유전자 암호를 함유하는 폴리뉴클레오타이드는 조작된 γδ T-세포 또는 종양 세포에 특이적인 항원, 예컨대 고환-특이적 암 항원의 성장, 증식, 활성화 상태에 영향을 미치는 돌연변이 또는 다른 이식유전자를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 γδ T-세포는 항원 인식 모이어티에 연결된 활성화 도메인, 예컨대 TCR-CD3 복합체 또는 공자극 인자 내 분자를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키기 위해 조작될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 T-림프구 활성화 도메인인 세포내 신호전달 도메인을 발현시킬 수 있다. γδ T-세포는 세포내 활성화 도메인 유전자 또는 세포내 신호전달 도메인를 발현시키기 위해 조작될 수 있다. 세포내 신호전달 도메인 유전자는, 예를 들어 CD3ζ, CD28, CD2, ICOS, JAML, CD27, CD30, OX40, NKG2D, CD4, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIγIL-2RB/CD 122, IL- 2RG/CD132, DAP 분자, CD70, 사이토카인 수용체, CD40, 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 또한 사이토카인, 항원, 세포 수용체 또는 다른 면역조절 분자를 발현시키도록 조작된다.

조작된 γδ T-세포에 의해 발현될 적절한 종양 인식 모이어티는 치료될 질환에 기반하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에 종양 인식 모이어티는 TCR이다. 일부 경우에, 종양 인식 모이어티는 암 세포 상에서 발현된 리간드에 대한 수용체이다. 적합한 수용체의 비제한적 예는 NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, CD244 (2B4), DNAM-1, NKp30, NKp44, NKp46 및 NKp80을 포함한다. 일부 경우에, 종양 인식 모이어티는 리간드, 예를 들어, IL-13 리간드 또는 종양 항원에 대한 리간드 모빙체, 예컨대 IL13R에 대한 IL-13 모방체를 포함할 수 있다.

γδ T-세포는 NKG2D, NKG2A, NKG2C, NKG2F, LLT1, AICL, CD26, NKRP1, CD244 (2B4), DNAM-1, 또는 항-종양 항체, 예컨대 항-Her2neu 또는 항-EGFR로부터 유래된 리간드 결합 도메인 및 CD3-ζ, Dap 10, Dap 12, CD28, 41BB 및 CD40L로부터 얻은 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 종양 인식 모이어티를 발현시키도록 조작될 수 있다. 일부 예에서, 키메라 수용체는 MICA, MICB, Her2neu, EGFR, EGFRvIII, 메소텔린, CD38, CD20, CD19, BCMA, PSA, RON, CD30, CD22, CD37, CD38, CD56, CD33, CD138, 　CD123, CD79b, CD70,　 CD75, CA6, 　GD2, 알파태아단백질(AFP), CS1, 암배 항원(CEA), CEACAM5, CA-125, MUC-16, 5T4, NaPi2b, ROR1, ROR2, PLIF, Her2/Neu, EGFRvIII, GPMNB, LIV-1, 당지질F77, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), PSMA, STEAP-1, STEAP-2, c-Met, CSPG4, CD44v6, PVRL-4, VEGFR2,　 C4.4a, PSCA, 엽산 결합 단백질/수용체, SLC44A4, Cripto, CTAG1B, AXL, IL-13Rα2, IL-3R, EPHA3, SLTRK6,　 gp100,　 MART1, 타이로시나제, SSX2, SSX4, NYESO-1, 상피 종양 항원(ETA), MAGEA 패밀리 유전자(예컨대 MAGEA3. MAGEA4), KKLC1, 돌연변이된 ras(H, N, K), BRaf, p53,　β-카테닌, EGFRT790, MHC 클래스 I 쇄-관련 분자 A(MICA), 또는 MHC 클래스 I 쇄-관련 B(MICB), 또는 HPV, CMV 또는 EBV 중 하나 이상의 항원에 결합한다.

일부 경우에, 종양 인식 모이어티는 종양-관련 펩타이드와의 복합체로 MHC 클래스 I 분자(HLA-A, HLA-B 또는 HLA-C)를 표적화한다. MHC 클래스 I 분자와의 복합체로 종양-관련 펩타이드를 표적화하는 종양 인식 모이어티를 생성하고 인식하기 위한 방법 및 조성물은 문헌[Weidanz et al., Int. Rev. Immunol. 30:328-40, 2011; Scheinberg et al, Oncotarget. 4(5):647-8, 2013; Cheever et al, Clin. Cancer Res. 15(17):5323-37, 2009; Dohan & Reiter Expert Rev Mol Med. 14:e6, 2012; Dao et al., Sci Transl Med. 2013 Mar 13;5(176):176ra33]; 미국 특허 제9,540,448호; 및 WO 2017/011804에 기재된 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 펩타이드 MHC 복합체의 표적화된 종양-관련 펩타이드는 윌름 종양 단백질 1(WT1), 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT), 서비빈, 마우스 이중 극미 2 상동체(MDM2), 사이토크롬 P450(CYP1B), KRAS 또는 BRAF의 펩타이드이다.

2 이상의 종양 인식 모이어티가 조작된 γδ T-세포로부터 또는 조작된 γδ T-세포에 안정하게 혼입된 유전적으로 별개의 αβTCR 폴리뉴클레오타이드로부터 안정하게 발현된 유전적으로 상이한, 실질적으로 상이한, 또는 실질적으로 동일한, αβTCR 폴리뉴클레오타이드로부터의 γδ T-세포에서 발현될 수 있다. 유전적으로 별개인 αβTCR(들)의 경우에, 동일한 조건과 관련된 상이한 항원을 인식하는 αβTCR(들)이 이용될 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에서, γδ T-세포는 인간 또는 마우스 유래로부터, 상이한 MHC 단상형과 관련하여 동일한 항원을 인식하는 하나 이상의 발현 카세트로부터 상이한 TCR을 발현시키도록 조작된다. 다른 바람직한 실시형태에서, γδ T-세포는 상이한 MHC 단상형과 복합체화된 주어진 항원과 동일 또는 상이한 펩타이드와 관련된 TCR 및 2 이상의 항원을 발현시키도록 조작된다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포에 의한 단일 TCR의 발현은 적절한 TCR 짝짓기를 용이하게 한다. 상이한 TCR을 발현시키는 조작된 γδ T-세포는 보편적인 동종이계 조작된 γδ T-세포를 제공할 수 있다. 제2의 바람직한 실시형태에서, γδ T-세포는 펩타이드-MHC 복합체와 관련된 하나 이상의 상이한 항체를 발현시키도록 조작되며, 각각은 동일 또는 상이한 MHC 단상형과 복합체화된 동일 또는 상이한 펩타이드와 관련된다. 일부 경우에, 종양 인식 모이어티는 펩타이드-MHC 복합체에 결합하는 항체일 수 있다.

γδ T-세포는 상이한 MHC 단상형과 관련하여 동일한 항원을 인식하는 하나 이상의 발현 카세트로부터의 TCR을 발현시키도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 조작된 세포 내의 TCR 미스매칭 가능성을 최소화하기 위해 단일 TCR, 또는 CAR과 조합된 TCR을 발현시키도록 설계된다. 2 이상의 발현 카세트로부터 발현된 종양 인식 모이어티는 바람직하게는 상이한 폴리뉴클레오타이드 서열을 가지고, 예를 들어, 상이한 HLA 단상형과 관련하여 동일한 표적의 상이한 에피토프를 인식하는 종양 인식 모이어티를 암호화한다. 이러한 상이한 TCR 또는 CAR을 발현시키는 조작된 γδ T-세포는 보편적인 동종이계 조작된 γδ T-세포를 제공할 수 있다.

일부 경우에, γδ T-세포는 하나 이상의 종양 인식 모이어티를 발현시키도록 조작된다. 2 이상의 종양 인식 모이어티는 γδ T-세포에서 조작된 유전적으로 동일한 또는 실질적으로 동일한, 항원-특이적 키메라(CAR) 폴리뉴클레오타이드로부터 발현될 수 있다. 2 이상의 종양 인식 모이어티는 γδ T-세포에서 조작된 유전적으로 별개의 CAR 폴리뉴클레오타이드로부터 발현될 수 있다. 유전적으로 별개인 CAR(들)은 동일한 조건과 관련된 상이한 항원을 인식하도록 설계될 수 있다.

γδ T-세포는 대안적으로 이중특이성일 수 있다. 이중특이성의 조작된 γδ T-세포는 2 이상의 종양 인식 모이어티를 발현시킬 수 있다. 이중특이성의 조작된 γδ T-세포는 TCR과 CAR 종양 인식 모이어티를 둘 다 발현시킬 수 있다. 이중특이성의 조작된 γδ T-세포는 동일한 조건과 관련된 상이한 항원을 인식하도록 설계될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 동일한 또는 실질적으로 동일한 항원을 인식하는 2 이상의 CAR/TCR(들) 이중 특이성 폴리뉴클레오타이드를 발현시킬 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 별개의 항원을 인식하는 2 이상의 CAR/TCR(들) 이중 특이성 작제물을 발현시킬 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 이중 특이성 작제물은 표적 세포의 활성화 및 비활성화 도메인에 결합함으로써, 증가된 표적 특이성을 제공한다. γδ T-세포는 적어도 1 종양 인식 모이어티, 적어도 2 종양 인식 모이어티, 적어도 3 종양 인식 모이어티, 적어도 4 종양 인식 모이어티, 적어도 5 종양 인식 모이어티, 적어도 6 종양 인식 모이어티, 적어도 7 종양 인식 모이어티, 적어도 8 종양 인식 모이어티, 적어도 9 종양 인식 모이어티, 적어도 10 종양 인식 모이어티, 적어도 11 종양 인식 모이어티, 적어도 12 종양 인식 모이어티, 또는 다른 적합한 수의 종양 인식 모이어티를 발현시키도록 조작될 수 있다.

적절한 TCR 기능은 ITAM 모티프를 포함하는 2 작용성ζ(제타) 단백질에 의해 향상될 수 있다. 적절한 TCR 기능은 또한 αβ 또는 γδ 활성화 도메인, 예컨대 CD3ζ, CD28, CD2, CTLA4, ICOS, JAML, PD-1, CD27, CD30, 41-BB, OX40, NKG2D, HVEM, CD46, CD4, FcεRIγIL-2RB/CD122, IL-2RG/CD132, DAP 분자 및 CD70의 발현에 의해 향상될 수 있다. 발현된 폴리뉴클레오타이드는 종양 인식 모이어티, 링커 모이어티 및 활성화 도메인에 대한 유전자 암호를 포함할 수 있다. 조작된 γδ T-세포에 의한 폴리뉴클레오타이드의 번역은 단백질 링커에 의해 연결되는 종양 인식 모이어티 및 활성화 도메인을 제공할 수 있다. 종종, 링커는 종양 인식 모이어티 및 활성화 도메인의 폴딩을 방해하지 않는 아미노산을 포함한다. 링커 분자는 길이가 적어도 약 5개의 아미노산, 약 6개의 아미노산, 약 7개의 아미노산, 약 8개의 아미노산, 약 9개의 아미노산, 약 10개의 아미노산, 약 11개의 아미노산, 약 12개의 아미노산, 약 13개의 아미노산, 약 14개의 아미노산, 약 15개의 아미노산, 약 16개의 아미노산, 약 17개의 아미노산, 약 18개의 아미노산, 약 19개의 아미노산 또는 약 20개의 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, 링커 내 아미노산의 적어도 50%, 적어도 70% 또는 적어도 90%는 세린 또는 글리신이다.

일부 경우에, 활성화 도메인은 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 적합한 돌연변이는, 예를 들어, 구성적으로 활성인 활성화 도메인을 제공하는 돌연변이일 수 있다. 하나 이상의 핵산의 동일성을 변경시키는 것은 번역된 아미노산의 아미노산 서열을 변화시킨다. 암호화된 아미노산이 극성, 비극성, 염기성 또는 산성 아미노산으로 변형되도록 핵산 돌연변이가 이루어질 수 있다. 종양 인식 모이어티가 종양으로부터의 에피토프를 인식하도록 최적화되도록 핵산 돌연변이가 이루어질 수 있다. γδ T-세포의 조작된 종양 인식 모이어티, 조작된 활성화 도메인, 또는 다른 조작된 성분은 1개 초과의 돌연변이, 2개의 아미노산 돌연변이, 3개의 아미노산 돌연변이, 4개의 아미노산 돌연변이, 5개의 아미노산 돌연변이, 6개의 아미노산 돌연변이, 7개의 아미노산 돌연변이, 8개의 아미노산 돌연변이, 9개의 아미노산 돌연변이, 10개의 아미노산 돌연변이, 11개의 아미노산 돌연변이, 12개의 아미노산 돌연변이, 13개의 아미노산 돌연변이, 14개의 아미노산 돌연변이, 15개의 아미노산 돌연변이, 16개의 아미노산 돌연변이, 17개의 아미노산 돌연변이, 18개의 아미노산 돌연변이, 19개의 아미노산 돌연변이, 20개의 아미노산 돌연변이, 21개의 아미노산 돌연변이, 22개의 아미노산 돌연변이, 23개의 아미노산 돌연변이, 24개의 아미노산 돌연변이, 25개의 아미노산 돌연변이, 26개의 아미노산 돌연변이, 27개의 아미노산 돌연변이, 28개의 아미노산 돌연변이, 29개의 아미노산 돌연변이, 30개의 아미노산 돌연변이, 31개의 아미노산 돌연변이, 32개의 아미노산 돌연변이, 33개의 아미노산 돌연변이, 34개의 아미노산 돌연변이, 35개의 아미노산 돌연변이, 36개의 아미노산 돌연변이, 37개의 아미노산 돌연변이, 38개의 아미노산 돌연변이, 39개의 아미노산 돌연변이, 40개의 아미노산 돌연변이, 41개의 아미노산 돌연변이, 42개의 아미노산 돌연변이, 43개의 아미노산 돌연변이, 44개의 아미노산 돌연변이, 45개의 아미노산 돌연변이, 46개의 아미노산 돌연변이, 47개의 아미노산 돌연변이, 48개의 아미노산 돌연변이, 49개의 아미노산 돌연변이 또는 50개의 아미노산 돌연변이를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 본 개시내용의 γδ T-세포는 하나 이상의 MHC 분자를 발현시키지 않는다. 조작된 γδ T-세포 내 하나 이상의 MHC 좌위의 결실은 조작된 γδ T-세포가 숙주 면역계에 의해 인식될 수 있는 가능성을 감소시킬 수 있다. 인간 백혈구 항원(HLA) 시스템으로서 알려진 인간 주조직 적합 복합체(MHC) 좌위는 γδ T-세포를 포함하는 항원 제시 세포에서 발현되는 거대 유전자 패밀리를 포함한다. HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 분자는 항원 제시 세포에 대한 항원으로서 세포내 펩타이드를 제시하는 작용을 한다. HLA-DP, HLA-DM, HLA-DOA, HLA-DOB, HLA-DQ 및 HLA-DR 분자는 항원 제시 세포에 대한 항원으로서 세포외 펩타이드를 제시하는 작용을 한다. HLA 유전자의 일부 대립유전자는 GVHD, 자가면역 장애, 및 암과 관련되었다. 본 명세서에 기재된 조작된 γδ T-세포는 하나 이상의 HLA 유전자의 유전자 발현을 결실하거나 또는 파괴하도록 추가로 조작될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조작된 γδ T-세포는 MHC 복합체의 하나 이상의 성분의 유전자 발현, 예컨대 MHC 유전자의 하나 이상의 완전한 결실, 특정 엑손의 결실, 또는 β₂ 마이크로글로불린(B2m)의 결실을 결실시키거나 또는 방해하도록 추가로 조작될 수 있다. 적어도 하나의 HLA 유전자의 유전자 절단 또는 유전자 파괴는 숙주편대 이식편 질환을 야기하는 일 없이 임의의 HLA 단상형을 갖는 대상체에게 투여될 수 있는 임상적으로 치료적인 γδ T-세포를 제공할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 조작된 γδ T-세포는 임의의 HLA 단상형을 갖는 인간 대상체에 대한 보편적인 공여자일 수 있다.

γδ T-세포는 하나 또는 다양한 HLA 좌위(좌위들)로 조작될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 HLA-A 대립유전자, HLA-B 대립유전자, HLA-C 대립유전자, HLA-DR 대립유전자, HLA-DQ 대립유전자, 또는 HLA-DP 대립유전자를 결실하도록 조작될 수 있다. 일부 경우에, HLA 대립유전자는 인간 병태, 예컨대 자가면역 병태와 관련된다. 예를 들어, HLA-B27 대립유전자는 관절염 및 포도막염과 관련되었고, HLA-DR2 대립유전자는 전신 홍반 루푸스, 및 다발성 경화증과 관련되었으며, HLA-DR3 대립유전자는 21-하이드록실라제 결핍증과 관련되었고, HLA-DR4는 류마티스 관절염 및 1형 당뇨병과 관련되었다. 예를 들어, HLA-B27 대립유전자를 결여하는 조작된 γδ T-세포는 대상체의 면역계를 용이하게 인식하는 일 없이 관절염을 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 HLA 좌위의 결실은 임의의 HLA 단상형을 갖는 임의의 대상체에 대한 보편적 공여자인 조작된 γδ T-세포를 제공한다.

일부 경우에, γδ T-세포의 조작은 γδ T-세포 게놈의 결실 부분을 필요로 한다. 일부 경우에, 게놈의 결실된 부분은 MHC 좌위(좌위들)의 부분을 포함한다. 일부 예에서, 조작된 γδ T-세포는 야생형 인간 γδ T-세포로부터 유래되고, 그리고 MHC 좌위는 HLA 좌위이다. 일부 경우에, 게놈의 결실된 부분은 MHC 복합체 내 단백질에 대응하는 유전자의 부분을 포함한다. 일부 경우에, 게놈의 결실된 부분은 β2 마이크로글로불린 유전자를 포함한다. 일부 예에서, 게놈의 결실된 부분은 PD-1, CTLA-4, LAG3, ICOS, BTLA, KIR, TIM3, A2aR, B7-H3, B7-H4 및 CECAM-1과 같은 면역관문 유전자를 포함한다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 T-세포 활성화 및 세포독성을 향상시키는 활성화 도메인을 발현시키도록 설계될 수 있다. 조작된 γδ T-세포에 의해 발현될 수 있는 활성화 도메인의 비제한적 예는 CD2, ICOS, 4-1 BB(CD137), OX40 (CD134), CD27, CD70, CD80, CD86, DAP 분자, CD122, GITR, FcεRIγ를 포함한다.

조작된 γδ T-세포 게놈의 임의의 부분은 내인성 γδ T-세포 유전자의 발현을 파괴하도록 결실될 수 있다. γδ T-세포 게놈에서 결실되거나 또는 파괴될 수 있는 게놈 영역의 비제한적 예는 프로모터, 활성체, 인핸서, 엑손, 인트론, 비암호 RNA, 마이크로-RNA, 소핵 RNA, 가변 수 직렬 반복부(variable number tandem repeat: VNTR), 짧은 직렬 반복부(short tandem repeat: STR), SNP 패턴, 초가변 영역, 미소부수체, 다이뉴클레오타이드 반복부, 트라이뉴클레오타이드 반복부, 테트라뉴클레오타이드 반복부 또는 단순 서열 반복부를 포함한다. 일부 경우에, 게놈의 결실된 부분은 1개의 핵산 내지 약 10개의 핵산, 1개의 핵산 내지 약 100개의 핵산, 1개의 핵산 내지 약 1,000개의 핵산, 1개의 핵산 내지 약 10,000개의 핵산, 1개의 핵산 내지 약 100,000개의 핵산, 1개의 핵산 내지 약 1,000,000개의 핵산 또는 다른 적합한 범위의 범위에 있다.

조작된 γδ T-세포 내 HLA 유전자 발현은 또한 당업계에 공지된 다양한 기법에 의해 파괴될 수 있다. 일부 경우에, 거대 좌위 유전자 편집 기법은 조작된 γδ T-세포 게놈으로부터의 유전자를 절단하기 위해, 또는 조작된 γδ T-세포 내 적어도 하나의 HLA 좌위의 유전자 발현을 파괴하기 위해 사용된다. 조작된 γδ T-세포의 게놈 상에서 목적으로 하는 좌위를 편집하기 위해 사용될 수 있는 유전자 편집 기법의 비제한적 예는 각각 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 WO201409370, WO2003087341, WO2014134412 및 WO 2011090804에 의해 각각 기재되는 바와 같은 주기적으로 간격을 띠고 분포하는 짧은 회문구조의 반복부(CRISPR)-Cas, 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성체-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 및 메가뉴클레아제 기법을 포함한다.

γδ T-세포는 종양 인식 모이어티를 이미 발현시키는 단리된 비-조작된 γδ T-세포로부터 조작될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 단리된 야생형 γδ T-세포에 의해 내인성으로 발현되고, 예를 들어, 종양 샘플의 종양 침윤성 림프구로부터 단리된 종양 세포 인식 모이어티를 보유할 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포 종양 세포 인식 모이어티는 야생형 γδ TCR을 대체한다.

γδ T-세포는 하나 이상의 귀소 분자, 예컨대 림프구 귀소 분자를 발현시키도록 조작될 수 있다. 귀소 분자는, 예를 들어, 림프구 귀소 수용체 또는 세포 접착 분자일 수 있다. 귀소 분자는 대상체에 대한 조작된 γδ T-세포의 투여 시 조작된 γδ T-세포가 표적화된 고형 종양을 포함하는 고형 종양을 이동시키고 침윤하도록 도울 수 있다. 귀소 수용체의 비제한적 예는 CCR 패밀리의 구성원, 예를 들어: CCR2, CCR4, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CLA, CD44, CD103, CD62L, E-셀렉틴, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 인테그린, 예컨대 VLA-4 및 LFA-1을 포함한다. 세포 접착 분자의 비제한적 예는 ICAM, N-CAM, VCAM, PE-CAM, L1-CAM, 넥틴(PVRL1, PVRL2, PVRL3), LFA-1, 인테그린 알파X베타2, 알파v베타7, 대식세포-1 항원, CLA-4, 당단백질 IIb/IIIa를 포함한다. 세포 접착 분자의 추가적인 예는 칼슘 의존적 분자, 예컨대 T-카데린, 및 기질 메탈로프로테이나제(MMP), 예컨대 MMP9 또는 MMP2에 대한 항체를 포함한다.

T-세포 성숙, 활성화, 증식, 및 기능에 수반된 단계는 면역관문 단백질을 통한 공자극 및 저해 신호를 통해 조절될 수 있다. 면역관문은 면역계에 고유한 공자극 및 저해 요소이다. 면역관문은 자기 관용을 유지하는 데, 그리고 면역계가 질환 병태, 예컨대 세포 형질전환 또는 감염에 반응할 때에 조직에 대한 손상을 방지하기 위한 생리적 면역 반응의 지속기간 및 진폭을 조절하는 데 도움을 준다. γδ및 αβT-세포 중 하나로부터의 면역 반응을 제어하기 위해 사용되는 공자극과 저해 신호 사이의 평형상태는 면역관문 단백질에 의해 조절될 수 있다. 면역관문 단백질, 예컨대 PD1 및 CTLA4는 T-세포 표면 상에 존재하며, 면역 반응 "켜짐" 또는 "꺼짐"을 위해 사용될 수 있다. 종양은, 특히 종양 항원에 특이적인 T-세포에 대한 면역-내성 메커니즘으로서 면역관문 단백질 기능을 하향조절할 수 있다. 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포는 하나 이상의 면역관문 좌위(좌위들), 예컨대 PD-1, CTLA-4, LAG3, ICOS, BTLA, KIR, TIM3, A2aR, CEACAM1, B7-H3, 및 B7-H4를 결여하도록 추가로 조작될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포 내 내인성 면역 관문 유전자의 발현은 유전자 편집 기법에 의해 파괴될 수 있다.

면역 관문은 저해 신호전달 경로를 조절하는 분자(CTLA4, PD1 및 LAG3에 의해 예시됨) 또는 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포에서 자극 신호전달 경로를 조절하는 분자(ICOS에 의해 예시됨)일 수 있다. 연장된 면역글로불린 슈퍼패밀리에서의 몇몇 단백질은 면역관문에 대한 리간드일 수 있다. 면역관문 리간드 단백질의 비제한적 예는 B7-H4, ICOSL, PD-L1, PD-L2, MegaCD40L, MegaOX40L 및 CD137L을 포함한다. 일부 경우에, 면역관문 리간드 단백질은 종양에 의해 발현되는 항원이다. 일부 경우에, 면역관문 유전자는 CTLA-4 유전자이다. 일부 경우에, 면역관문 유전자는 PD-1 유전자이다.

PD1은 CD28/CTLA4 패밀리에 속하는 저해 수용체이고, 활성화된 T 림프구, B 세포, 단핵구, DC 및 T-reg 상에서 발현된다. T 세포, APC 및 악성 세포 상에서 발현되는 PD1, PD-L1 및 PD-L2에 대한 2가지의 알려진 리간드가 있으며, 자기 반응성 림프구를 억제하고 TAA-특이적 세포독성 T 림프구(CTL)의 효과기 기능을 저해하는 작용을 한다. 따라서, PD1을 결여하는 조작된 γδ T-세포는 종양 세포에 의한 PD-L1 및 PD-L2의 발현과 상관없이 그의 세포독성 활성을 보유할 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포는 PD-1 유전자에 대한 유전자 좌위를 결여한다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포 내 PD-1 유전자의 발현은 유전자 편집 기법에 의해 파괴된다.

CTLA4(세포독성 T-림프구 항원 4)는 또한 CD152(분화 152의 클러스터)로서 알려져 있다. CTLA4는 공자극 분자 CD28과 서열 상동성 및 리간드(CD80/B7-1 및 CD86/B7-2)를 공유하지만, 수용체로서 CTLA4를 발현시키는 T-세포에 저해 신호를 전달함으로써 상이하다. CTLA4는 리간드 둘 다에 대해 훨씬 더 큰 전반적 친화도를 가지며, 리간드 밀도가 제한될 때 결합에 대해 CD28보다 훨씬 뛰어날 수 있다. CTLA4는 종종 CD8⁺ 효과기 T-세포의 표면 상에서 발현되고, 그리고 천연과 기억 T-세포 둘 다의 초기 활성화 단계에서 기능적 역할을 한다. CTLA4는 T-세포 활성화의 초기 단계 동안 CD80 및 CD86에 대한 증가된 친화도를 통해 CD28의 활성에 대응한다. CTLA4의 주된 기능은 헬퍼 T-세포의 하향조절 및 조절 T-세포 면역억제 활성의 향상을 포함한다. 일부 예에서, 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포는 CTLA4 유전자를 결여한다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포 내 CTLA4 유전자의 발현은 유전자 편집 기법에 의해 파괴된다.

LAG3(림프구-활성화 유전자 3)은 활성화된 항원-특이적 세포독성 T-세포 상에서 발현되고, 조절 T-세포의 기능을 향상시킬 수 있으며, CD8⁺ 효과기 T-세포 활성을 독립적으로 저해한다. LAG3은 일부 상피암 상에서 상향조절되어 T 세포 증식 및 항상성을 야기하는 MHC 클래스 II 단백질에 대해 고친화도 결합을 갖는 CD-4 유사 음성 조절 단백질이다. LAG-3-IG 융합 단백질을 이용하는 LAG-3/클래스 II 상호작용의 감소는 항종양 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 조작된 γδ T-세포는 LAG3 유전자에 대한 유전자 좌위를 결여한다. 일부 예에서, 조작된 γδ T-세포 내 LAG3 유전자의 발현은 유전자 편집 기법에 의해 파괴된다.

비조작된 그리고 조작된 γδ T-세포의 표현형

조작된 γδ T-세포는 대상체의 신체 내 특정 신체 위치로 귀소할 수 있다. 조작된 γδ T 세포의 이동 및 귀소는 특정 케모카인 및/또는 접착 분자의 조합된 발현 및 작용에 의존할 수 있다. 조작된 γδ T 세포의 귀소는 케모카인과 그들의 수용체 사이의 상호작용에 의해 제어될 수 있다. 예를 들어, CXCR3(이의 리간드는 IP-10/CXCL10 및 6Ckine/SLC/CCL21으로 나타냄) CCR4+ CXCR5+(RANTES, MIP-1α, MIP-1β에 대한 수용체), CCR6+ 및 CCR7을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 사이토카인은 조작된 γδ T 세포의 귀소에 영향을 미친다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 염증 및 손상 부위로, 그리고 수선 기능을 수행하기 위해 병에 걸린 세포로 귀소할 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 암으로 귀소할 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포는 흉선, 골수, 피부, 후두, 기관, 흉막, 폐, 식도, 복부, 위, 소장, 대장, 간, 췌장, 신장, 요도, 방광, 고환, 전립선, 정관, 난소, 자궁, 유선, 부갑상선, 비장 또는 대상체 신체의 다른 부위로 귀소할 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 특정 TCR 대립유전자 및/또는 림프구 귀소 분자와 같은 하나 이상의 귀소 모이어티를 발현시킬 수 있다.

조작된 γδ T-세포는 특정 표현형을 가질 수 있고, 표현형은 세포-표면 마커 발현에 관해 기재될 수 있다. 다양한 유형의 γδ T-세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이 조작될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 조작된 γδ T-세포는 인간으로부터 유래되지만, 조작된 γδ T-세포는 상이한 공급원, 예컨대 포유류 또는 합성 세포로부터 유래될 수 있다.

확장된 세포 집단의 면역표현형은 CD27, CD45RA, CD45RO, CCR7 및 CD62L을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 마커를 이용하여 결정될 수 있다(Klebanoff et al., Immunol Rev.211: 214 2006). CD45RA는 항원과 만날 때 CD45RO로 대체되는 미경험 T 림프구 상에서 발현되지만, 후기 효과기 세포에서 재발현되고(Michie et al., Nature 360, 264 - 265 (1992); CD62L은 2차 림프구 조작에 들어가도록 귀소 분자로서 작용하는 세포 접착 분자이며, T-세포가 효과기 기능을 획득할 때 T-세포 활성화 후에 상실되고(Sallusto et al., Nature. 401:708 (1999);. CD27은 T 세포 분화 동안 상실되는 공자극 마커이다(Appay et al., Nat Med.8:379 (2002); Klebanoff et al., Immunol Rev.211: 214 2006).

항원

본 명세서에 개시된 발명은 항원 인식 모이어티를 발현시키는 조작된 γδ T-세포를 제공하되, 항원 인식 모이어티는 질환-특이적 에피토프를 인식한다. 항원은 면역 반응을 유발하는 분자일 수 있다. 면역 반응은 항체 생산, 특정 면역학적-적격 세포 또는 둘 다의 활성화를 유발할 수 있다. 항원은, 예를 들어, 펩타이드, 단백질, 합텐, 지질, 탄수화물, 박테리아, 병원소 또는 바이러스일 수 있다. 항원은 종양 항원일 수 있다. 종양 에피토프는 종양 세포 표면 상에서 MHC I 또는 MHC II 복합체에 의해 제시될 수 있다. 에피토프는 세포 표면 상에서 발현되고 종양 인식 모이어티에 의해 인식되는 항원의 부분일 수 있다.

조작된 γδ T-세포에 의해 인식되는 항원의 비제한적 예는 CD19, CD20, CD30, CD22, CD37, CD38, CD56, CD33, CD138, 　CD123, CD79b, CD70,　 CD75, CA6, 　GD2, 알파태아단백질(AFP), 암배 항원(CEA), RON, CEACAM5, CA-125, MUC-16, 5T4, NaPi2b, ROR1, ROR2, 　PLIF, Her2/Neu, EGFRvIII, GPMNB, LIV-1, 당지질F77, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), PSMA, STEAP-1, STEAP-2, 메소텔린, c-Met, CSPG4, PVRL-4, VEGFR2,　 PSCA, CLEC12a, L1CAM, GPC2, GPC3, 엽산 결합 단백질/수용체, SLC44A4, Cripto, CTAG1B, AXL, IL-13R, IL-3Rα2, SLTRK6,　 gp100,　 MART1, 타이로시나제, SSX2, SSX4, NYESO-1, WT-1, PRAME, 상피 종양 항원(ETA), MAGEA 패밀리 유전자(예컨대 MAGEA3. MAGEA4), KKLC1, 돌연변이된 ras, □□af, p53, MHC 클래스 I 쇄-관련 분자 A(MICA), 또는 MHC 클래스 I 쇄-관련 분자 B(MICB), 또는 HPV, CMV 또는 EBV 중 하나 이상의 항원을 포함한다.

항원은 세포의 세포내 또는 세포외 구획에서 발현될 수 있으며, 조작된 γδ T-세포는 세포내 또는 세포외 종양 항원을 인식할 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포 내 αβTCR은 세포내 또는 세포외 종양 항원 중 하나로부터 유래된 펩타이드를 인식한다. 예를 들어, 항원은 바이러스, 예컨대 HIV, EBV, CMV, 또는 HPV 단백질로 감염된 세포에 의해 세포내로 또는 세포외로 생성된 단백질일 수 있다. 항원은 또한 암성 세포에 의해 세포내로 또는 세포외로 발현되는 단백질일 수 있다.

항원 인식 모이어티는 암성 세포 또는 바이러스로 감염된 세포와 같이 고통에 있는 세포로부터의 항원을 인식할 수 있다. 예를 들어, 인간 MHC 클래스 I 쇄-관련 유전자(MICA 및 MICB)는 염색체 6의 HLA 클래스 I 영역 내에 위치된다. MICA 및 MICB 단백질은 인간 상피 내 "스트레스"의 마커가 되는 것으로 고려되며, 통상적인 자연 살해-세포 수용체(NKG2D)를 발현시키는 세포에 대한 리간드로서 작용한다. 스트레스 마커로서, MICA 및 MICB는 암성 세포로부터 고도로 발현될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 MICA 또는 MICB 종양 에피토프를 인식할 수 있다.

종양 인식 모이어티는 특정 아비디티를 갖는 항원을 인식하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, TCR 또는 CAR 작제물에 의해 암호화되는 종양 인식 모이어티는 적어도 적어도 10fM, 적어도 100fM, 적어도 1 피코몰(pM), 적어도 10pM, 적어도 20pM, 적어도 30pM, 적어도 40pM, 적어도 50pM, 적어도 60pM, 적어도 7pM, 적어도 80pM, 적어도 90pM, 적어도 100pM, 적어도 200pM, 적어도 300pM, 적어도 400pM, 적어도 500pM, 적어도 600pM, 적어도 700pM, 적어도 800pM, 적어도 900pM, 적어도 1 나노몰(nM), 적어도 2nM, 적어도 3nM, 적어도 4nM, 적어도 5nM, 적어도 6nM, 적어도 7nM, 적어도 8nM, 적어도 9nM, 적어도 10nM, 적어도 20nM, 적어도 30nM, 적어도 40nM, 적어도 50 nm, 적어도 60nM, 적어도 70nM, 적어도 80nM, 적어도 90nM, 적어도 100nM, 적어도 200nM, 적어도 300nM, 적어도 400nM, 적어도 500nM, 적어도 600nM, 적어도 700nM, 적어도 800nM, 적어도 900nM, 적어도 1μM, 적어도 2μM, 적어도 3μM, 적어도 4μM, 적어도 5μM, 적어도 6μM, 적어도 7μM, 적어도 8μM, 적어도 9μM, 적어도 10μM, 적어도 20μM, 적어도 30μM, 적어도 40μM, 적어도 50μM, 적어도 60μM, 적어도 70μM, 적어도 80μM, 적어도 90μM, 또는 적어도 100μM의 해리 상수로 항원을 인식할 수 있다.

일부 예에서, 종양 인식 모이어티는 최대 10fM, 최대 100fM, 최대 1 피코몰(pM), 최대 10pM, 최대 20pM, 최대 30pM, 최대 40pM, 최대 50pM, 최대 60pM, 최대 7pM, 최대 80pM, 최대 90pM, 최대 100pM, 최대 200pM, 최대 300pM, 최대 400pM, 최대 500pM, 최대 600pM, 최대 700pM, 최대 800pM, 최대 900pM, 최대 1 나노몰(nM), 최대 2nM, 최대 3nM, 최대 4nM, 최대 5nM, 최대 6nM, 최대 7nM, 최대 8nM, 최대 9nM, 최대 10nM, 최대 20nM, 최대 30nM, 최대 40nM, 최대 50 nm, at most 60nM, 최대 70nM, 최대 80nM, 최대 90nM, 최대 100nM, 최대 200nM, 최대 300nM, 최대 400nM, 최대 500nM, 최대 600nM, 최대 700nM, 최대 800nM, 최대 900nM, 최대 1μM, 최대 2μM, 최대 3μM, 최대 4μM, 최대 5μM, 최대 6μM, 최대 7μM, 최대 8μM, 최대 9μM, 최대 10μM, 최대 20μM, 최대 30μM, 최대 40μM, 최대 50μM, 최대 60μM, 최대 70μM, 최대 80μM, 최대 90μM 또는 최대 100μM의 해리 상수로 항원을 인식하도록 조작될 수 있다.

신규한 활성화제

본 발명의 발명자는 γδ TCR의 특정 아형에 결합함으로써 γδ T 세포의 특정 집단을 활성화시키는 활성화제를 동정하였다. 일 양상에서, 본 발명은 본 명세서의 실시예 14, 및 39, 및 도 23-30, 및 33-36에서 동정되고 기재되는 신규한 활성화 에피토프에 결합하는 신규한 활성화제를 제공한다. 활성화제는 MAb TS8.2, TS-1, 15D, B6, R9.12, δ1-05, δ1-08, δ1-18, δ1-22, δ1-23, δ1-26, δ1-35, δ1-37, δ1-39, δ1-113, δ1-143, δ1-149, δ1-155, δ1-182, δ1-183, δ1-191, δ1-192, δ1-195, δ1-197, δ1-199, δ1-201, δ1-203, δ1-239, δ1-253, δ1-257, δ1-278, δ1-282, δ1-285, δ2-14, δ2-17, δ2-22, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36, 및 δ2-37을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

이들 활성화제는 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 TS8.2, TS-1, 15D, B6, R9.12, δ1-05, δ1-08, δ1-18, δ1-22, δ1-23, δ1-26, δ1-35, δ1-37, δ1-39, δ1-113, δ1-143, δ1-149, δ1-155, δ1-182, δ1-183, δ1-191, δ1-192, δ1-195, δ1-197, δ1-199, δ1-201, δ1-203, δ1-239, δ1-253, δ1-257, δ1-278, δ1-282, δ1-285, δ2-14, δ2-17, δ2-22, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36, 및 δ2-37로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 MAb와 경쟁하는 활성화제를 추가로 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

이들 활성화제는 TS8.2, TS-1, 15D, B6, R9.12, δ1-05, δ1-08, δ1-18, δ1-22, δ1-23, δ1-26, δ1-35, δ1-37, δ1-39, δ1-113, δ1-143, δ1-149, δ1-155, δ1-182, δ1-183, δ1-191, δ1-192, δ1-195, δ1-197, δ1-199, δ1-201, δ1-203, δ1-239, δ1-253, δ1-257, δ1-278, δ1-282, δ1-285, δ2-14, δ2-17, δ2-22, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36, 및 δ2-37로 이루어진 군으로부터 선택되는 MAb의 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 가변 영역을 함유하는 활성화제를 추가로 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

본 발명은 또한 TS8.2, TS-1, 15D, B6, R9.12, δ1-05, δ1-08, δ1-18, δ1-22, δ1-23, δ1-26, δ1-35, δ1-37, δ1-39, δ1-113, δ1-143, δ1-149, δ1-155, δ1-182, δ1-183, δ1-191, δ1-192, δ1-195, δ1-197, δ1-199, δ1-201, δ1-203, δ1-239, δ1-253, δ1-257, δ1-278, δ1-282, δ1-285, δ2-14, δ2-17, δ2-22, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36, 및 δ2-37로 이루어진 군으로부터 선택되는 MAb의 (i) 상보성 결정 영역(CDR) 및/또는 가변 영역이거나; (ii) 이들과 동일한 에피토프에 결합하거나 또는 경쟁하거나; 또는 (iii) 이들인, 활성화제를 암호화하는 핵산을 제공한다. 일부 경우에, 핵산은 숙주 세포(예를 들어, 이종성 숙주 세포)이다. 일부 경우에, 핵산은 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결되거나 또는 이종성 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "이종성"은 천연에서 함께 자연적으로 존재하지 않는 두 성분을 지칭한다.

특정 실시형태에서, 활성화제(예를 들어, 항체)는 하나 이상의 γδ T-세포 집단(예를 들어, δ1 T-세포 또는 δ2 T-세포)을 확장시키거나 또는 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, 활성화제는 δ1 및 δ3 T-세포를 선택적으로 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, 활성화제는 δ1 및 δ4 T-세포를 선택적으로 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, 활성화제는 δ1 T-세포를 선택적으로 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, 활성화제는 δ1, δ3, δ5, 및 δ5 T-세포를 선택적으로 활성화시킨다. 특정 실시형태에서, 활성화제는 δ2 T-세포를 선택적으로 활성화시킨다.

본 발명은 또한 앞서 언급한 활성화제 중 하나 이상을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 활성화제를 암호화하는 핵산을 함유하는 숙주 세포는 앞서 언급한 활성화제 중 하나 이상을 생산하도록 배양될 수 있다.

APC

또한 본 명세서에서 조작된 또는 비조작된 γδ T-세포, 예컨대 γδ T-세포의 하나 이상의 하위집단의 확장을 위한 APC가 기재된다. 일부 실시형태에서, 앞서 언급한 활성화제 중 하나 이상을 암호화하는 이종성 핵산을 함유하는 APC가 본 명세서에 기재된다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 상에서 앞서 언급한 활성화제 중 하나 이상을 발현시키는 APC가 본 명세서에 기재된다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 상에서 하나 이상의 Fc 수용체를 발현시키는 APC가 본 명세서에 기재되되, Fc 수용체(들)는 앞서 언급한 활성화제 중 하나 이상과 접촉되고/되거나 결합된다.

일부 경우에, APC(예를 들어, 세포 표면 상에서 발현되거나 또는 세포 표면 상에서 발현된 Fc 수용체에 결합된 앞서 언급한 활성화제 중 하나 이상을 갖는 APC)는 HLA 클래스 I, HLA 클래스 I, 비변이체 쇄, 및/또는 HLA-DM을 발현시키지 않거나, 또는 이들의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 경우에, APC는 접착 분자, 예컨대 세포내 접착 분자-1, CD11a, CD18, CD54 및/또는 백혈구 기능-관련 항원-3을 발현시킨다. 일부 경우에, APC는 Fc 수용체, 예컨대 본 명세서에 기재된 γδ T-세포 확장 방법에서 사용되는 활성화제의 아이소타입에 특이적인 Fc 수용체를 발현시킨다. 일부 경우에, APC는 CD64, CD32A, CD32B, CD32C, CD16A, CD16B, FcRn, TRIM21, 또는 CD307, 또는 더 고친화도 또는 변경된 특이성을 갖는 이들의 조작된 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 Fc 수용체를 발현시킨다.

또한 앞서 언급한 APC 중 하나 이상을 포함하는 배양물이 본 명세서에 기재된다. 배양물은 확장된 또는 비확장된, 조작된 또는 비조작된, γδ T-세포를 추가로 함유할 수 있다. 배양물은 추가로 또는 대안적으로 본 명세서에 기재된 γδ T-세포 활성화제 중 임의의 하나를 포함하는 선택적 또는 비선택적 γδ T-세포 활성화제를 함유할 수 있다. 일부 경우에, 배양물은 IL-21을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 배양물은 IL-4, IL-2 또는 IL-15, 또는 이들의 조합을 함유하지 않는다. 일부 경우에, 배양물은 γδ T 세포의 하위 집단을 선택적으로 확장시키는 사이토카인을 함유하지 않는다.

에피토프 동정

본 발명의 발명자는 γδ TCR 활성화 MAb TS8.2, TS-1, 15D, B6, R9.12, δ1-05, δ1-08, δ1-18, δ1-22, δ1-23, δ1-26, δ1-35, δ1-37, δ1-39, δ1-113, δ1-143, δ1-149, δ1-155, δ1-182, δ1-183, δ1-191, δ1-192, δ1-195, δ1-197, δ1-199, δ1-201, δ1-203, δ1-239, δ1-253, δ1-257, δ1-278, δ1-282, δ1-285, δ2-14, δ2-17, δ2-22, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36 및 δ2-37의 에피토프 내의 결합 영역을 동정하였다. 예시적인 에피토프는 γδ TCR 활성화 MAb TS8.2, TS-1, 15D, B6, R9.12, δ1-05, δ1-08, δ1-18, δ1-22, δ1-23, δ1-26, δ1-35, δ1-37, δ1-39, δ1-113, δ1-143, δ1-149, δ1-155, δ1-182, δ1-183, δ1-191, δ1-192, δ1-195, δ1-197, δ1-199, δ1-201, δ1-203, δ1-239, δ1-253, δ1-257, δ1-278, δ1-282, δ1-285, δ2-14, δ2-17, δ2-22, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36, 및 δ2-37의 에피토프를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 γδ TCR 활성화 MAb TS8.2, TS-1, 15D, B6, R9.12, δ1-05, δ1-08, δ1-22, δ1-26, δ1-35, δ1-37, δ1-39, δ1-113, δ1-143, δ1-149, δ1-155, δ1-182, δ1-183, δ1-191, δ1-192, δ1-195, δ1-197, δ1-199, δ1-201, δ1-203, δ1-253, δ1-257, δ1-278, δ1-282, δ1-285, δ2-14, δ2-17, δ2-30, δ2-31, δ2-32, δ2-33, δ2-35, δ2-36, 및 δ2-37 중 하나 이상에 의해 특이적으로 결합되는 에피토프이다.

일 양상에서, 본 개시내용은 빠른 성장 속도로 조작된 그리고 비조작된 T 세포의 확장을 자극하는 제제의 에피토프를 동정하기 위한 방법을 제공한다. 에피토프는 독특한 공간적 입체배좌에서 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개의 아미노산을 포함할 수 있다. 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치되는 인접한 아미노산 또는 비인접 아미노산 둘다로부터 형성될 수 있다. 인접한 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 대한 노출 시 유지될 수 있는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성되는 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 의한 처리 시 상실될 수 있다.

에피토프 맵핑은 선형 또는 비선형, 불연속 아미노산 서열(들), 즉, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프, 예컨대 TS8.2, 15D, B6, TS-1, 및 R9.12, 항체인 에피토프를 동정하기 위해 수행될 수 있다. 에피토프 맵핑을 위한 일반적 접근은 관심 대상의 항체 또는 리간드뿐만 아니라 다양한 단편, 즉, 일반적으로 이종성 발현 시스템에서의 폴리펩타이드 서열의 절단된 형태에 의해 인식되는 전장 폴리펩타이드 서열의 발현을 필요로 할 수 있다. 이들 다양한 재조합 폴리펩타이드 서열 또는 이의 단편(예를 들어, N-말단 단백질(예를 들어, GFP)과 융합됨)은, 이어서, 관심 대상의 항체 또는 리간드가 폴리펩타이드 서열의 절단 형태 중 하나 이상에 결합할 수 있는지의 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드 서열은 2 이상의 상동성 모 폴리펩타이드의 결합된 단편을 함유하는 키메라이되, 적어도 하나의 모 폴리펩타이드는 관심 대상의 활성화제에 결합하고, 적어도 하나의 모 폴리펩타이드는 관심 대상의 활성화제에 결합하지 않는다. 예를 들어, 인간 δ1 쇄의 세그먼트는 상동성 돌고래 δ쇄 유전자의 세그먼트와 결합되는 유전자일 수 있고, 재조합 발현 시스템에서 키메라 TCR을 생성하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 세포 표면 상의 pan-γδ-TCR 항체에 의한 검출에 의해 나타내는 바와 같이 TCR을 형성하는 키메라 TCR 유전자는 이어서, 관심 대상의 활성화제에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 다른 예로서, 인간 δ2 쇄의 세그먼트는 상동성 마카크 δ쇄 유전자의 세그먼트와 결합되는 유전자일 수 있고, 재조합 발현 시스템에서 키메라 TCR을 생성하는 능력에 대해 시험될 수 있다. 세포 표면 상의 pan-γδ-TCR 항체에 의한 검출에 의해 나타내는 바와 같이 TCR을 형성하는 키메라 TCR 유전자는 이어서, 관심 대상의 활성화제에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다.

중복 아미노산 영역을 갖는 재조합 폴리펩타이드 서열의 반복적 절단 및 생성의 사용을 통해, 관심 대상의 항체에 의해 인식되는 폴리펩타이드 서열의 영역을 동정할 수 있다(예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Glenn E. Morris, Ed (1996)] 참조). 상기 방법은 막 지지체, 조합 파지 디스플레이 펩타이드 라이브러리 상의 합성 펩타이드 어레이로부터 유래된 에피토프 라이브러리, 예컨대 에피토프 라이브러리로부터 재생성된 서열에 결합하는 관심 대상의 항체와 같은 제제의 능력에 의존한다. 이어서, 에피토프 라이브러리는 항체에 대해 선별된 다양한 가능성을 제공한다. 추가적으로, 부위 특이적 돌연변이유발, 또는 무작위 Ala 스캔, 에피토프의 하나 이상의 잔기의 표적화는 에피토프의 정체를 확인하도록 추구될 수 있다.

에피토프의 라이브러리는 cDNA 작제물로서 γδ T-세포 수용체(γδ TCR)의 다양한 가능한 재조합을 합성적으로 설계함으로써 그리고 적합한 시스템에서 발현시킴으로써 생성될 수 있다. 예를 들어, Jδ1, Jδ2 및 Jδ3 유전자 세그먼트를 포함하는, Jδ 영역이 상이한 복수의 Vδ1 유전자 세그먼트가 합성적으로 설계될 수 있다. 대안적으로, Vδ2Jδ1 및 Vδ3Jδ1 쇄는 또한 합성 유전자로서 주문될 수 있고, 적합한 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 복수의 합성에 의해 클로닝된 δ TCR 쇄, 예컨대 Vδ1Jδ1, Vδ1Jδ2, Vδ1Jδ3, Vδ1Jδ4, Vδ2 및 Vδ3 쇄는 합성에 의해 클로닝된 γ TCR 쇄, 예컨대, Vγ2, Vγ3, Vγ4, Vγ5, Vγ8, Vγ9 및 Vγ10 합성에 의해 설계된 유전자 세그먼트를 이용하여 숙주 시스템 내로 공동형질감염될 수 있다. 다른 경우에, δ TCR 쇄, 예컨대 Vδ1Jδ1, Vδ1Jδ2, Vδ1Jδ3, Vδ1Jδ4, Vδ2 및 Vδ3 쇄는 인간 PBMC로부터 추출된 총 RNA 또는 인간 정상 및 악성 조직으로부터 단리된 γδ T-세포 중에서 증폭될 수 있다.

숙주 세포는 임의의 적합한 발현 시스템, 예컨대 293 세포, 곤충 세포 또는 적합한 시험관내 번역 시스템일 수 있다. 숙주 세포에 형질감염된 합성적으로 설계된 γδ T-세포 세그먼트의 복수의 다양한 가능한 재조합은, 예를 들어, γδ TCR의 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 또는 90개 초과의 가능한 짝짓기 조합을 제공할 수 있다. 앞서 기재된 라이브러리에서 에피토프 중 하나에 대한 제제의 결합은 표지된 항체, 예컨대 TS8.2, 15D, B6, TS-1 및 R9.12를 라이브러리의 에피토프와 접촉시킴으로써 그리고 표지로부터의 신호를 검출함으로써 검출될 수 있다.

에피토프 맵핑에 대해, 입체배되 불연속 에피토프를 맵핑하는 것으로 나타난 컴퓨터 알고리즘이 또한 개발되었다. 입체배좌 에피토프는, 예를 들어, x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명을 포함하는 방법을 이용하여 아미노산의 공간적 입체배좌를 결정함으로써 동정될 수 있다. 일부 에피토프 맵핑 방법, 예컨대, 항원 항체 복합체의 x-선 분석은 에피토프의 원자 분해능을 제공할 수 있다. 다른 경우에, 에피토프 맵핑을 위한 컴퓨터 조합 방법은 항체, 예컨대 TS-1 항체 또는 TS8.2 항체의 서열에 기반하여 잠재적 에피토프를 모델링하는 데 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 항체의 항원 결합 부분은 서열분석되고, 컴퓨터 모델은 항체의 잠재적 결합 부위를 재구성하고 예측하는 데 사용된다.

일부 경우에 본 개시내용은: (a) γδ T-세포 수용체로부터의 에피토플 라이브러리를 준비하는 단계; (b) 에피토프의 라이브러리를 항체와 접촉시키는 단계; 및 (b) 항체에 의해 결합되는 에피토프 라이브러리 내 적어도 하나의 에피토프의 아미노산 서열을 동정하는 단계를 포함하는, γδ T-세포 수용체의 에피토프를 결정하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 항체는 TS8.2, 15D, B6, TS-1 및 R9.12 항체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 예에서, 항체는 고체 지지체에 부착된다. 에피토프의 라이브러리는 T-세포 수용체, 예컨대 γ TCR 또는 δ TCR의 연속 및 불연속 에피토프에 대응하는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 에피토프의 라이브러리는 길이가 약 10개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산, 길이가 약 10개의 아미노산 내지 약 20개의 아미노산, 또는 길이가 약 5개의 아미노산 내지 약 12개의 아미노산의 범위인 γδ T-세포 수용체의 단편을 포함한다. 일부 경우에, 항체는 표지되며, 표지는 방사성 분자, 발광 분자, 형광 분자, 효소 또는 바이오틴이다.

δ1 에피토프 Bin

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1 (SKEMIFLIRQ GSDEQNA) 및 J1(TDKLIFGKGTRVTVEP) 또는 J2 (LTAQLFFGKGTQLIVEP)의 아미노산 47 내지 70을 포함하는 에피토프이되, 활성화제는 J1 또는 J2 내 K120T 돌연변이를 함유하는 에피토프에 결합하지 않는다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 1 δ1 에피토프로서 지칭된다. Bin 1 δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 TS-1; 및 δ1-18을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 인간 Vδ1 J 영역은 (D)(J) 재조합에 기인하여 다를 수 있고, Bin 1 δ1에피토프를 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄의 예시적인 Vδ1 J 영역은 SKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP이며; γδ TCR의 δ1의 다른 예시적인 Vδ1 J 영역 Bin 1 δ1에피토프는 SKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGEAPSAWGKHLTAQLFFGKGTQLIVEP이다.

일부 경우에, Bin 1 δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP; 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에는 결합하지 않는다:

AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDSWDTRQMFFGTGIKLFVEP.

Bin 1 δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 또한 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합할 수 있다:

AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGEAPSAWGKHLTAQLFFGKGTQLIVEP.

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1(SKEMIFLIRQ GSDEQNA) 및 J1(TDKLIFGKGTRVTVEP)의 아미노산 47 내지 70을 포함하는 에피토프이되, 활성화제는 J1에서 K120T 돌연변이를 함유하는 에피토프에 결합하지 않는다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 1b δ1 에피토프로서 지칭된다. Bin 1b δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ1-37을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Bin 1b δ1에피토프를 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄의 예시적인 Vδ1 J 영역은 SKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP이다.

일부 경우에, Bin 1b δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

Bin 1b δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지 않는다:

AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKS.GRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGEAPSAWGKHLTAQLFFGKGTQLIVEP.

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1의 아미노산 11 내지 21(VSMPVRKAVTL)을 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 2 δ1 에피토프로서 지칭된다. Bin 2 δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ1-285를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 경우에, Bin 2 δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

AQKVTQVQRAMSSQLGEAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEF.

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1의 아미노산 11 내지 21(VSMPVRKAVTL)을 포함하는 에피토프이되, 이 에피토프에 결합하는 활성화제는 Vδ1에서 R16의 돌연변이, 예컨대 R16N 돌연변이를 함유하는 에피토프에 결합하지 않는다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 2b δ1 에피토프로서 지칭된다. Bin 2b δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 R9.12를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 경우에, Bin 2b δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

AQKVTQAQSSVSMPVNKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP; 그리고/또는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에는 결합하지 않는다:

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1의 아미노산 11 내지 21(VSMPVRKAVTL)을 포함하는 에피토프이되, 이 에피토프에 결합하는 활성화제는 또한 δ3, δ4, 및 δ5 γδ TCR과 결합한다(교차 반응한다). 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 2c δ1 에피토프로서 지칭된다. Bin 2c δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ1-39를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 경우에, Bin 2c δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1의 아미노산 80 내지 95(FKKAAKSVALTISALQ) 또는 인간 Vδ1의 70 내지 95(AKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQ)을 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 3 δ1 에피토프로서 지칭된다. Bin 3 δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ1-08; 및 δ1-23을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 경우에, Bin 3 δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP

하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에는 결합하지 않는다:

AQKVTQVQRAMSSQLGEAVTLSCQYETSLSWYDIFWYKQLPSGEMTFLIHQISSDQNAKNGRYSVNFQERHKFISLTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEPRSQPHTKPSVFVMKNGTNVACLVKEFYPKD.

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1의 아미노산 1 내지 11(AQKVTQAQSSV) 및 J1 또는 J2를 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 4 δ1 에피토프로서 지칭된다. 일부 경우에, Bin 4 δ1 에피토프 결합 활성화제는 J1 또는 J2에서 K120T 돌연변이를 함유하는 에피토프에 결합하지 않는다. Bin 4 δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ1-35; 및 δ1-203를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 경우에, Bin 4 δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1의 아미노산 28 내지 47(SWWSYYIFWYKQLPS) 및 J1을 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 5 δ1 에피토프로서 지칭된다. Bin 5 δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ1-113; δ1-155; δ1-183; δ1-191; δ1-278; 및 δ1-282를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Bin 5 δ1에피토프를 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄의 예시적인 Vδ1 J1 영역은 SWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP이다.

일부 경우에, Bin 5 δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1의 아미노산 21 내지 28(LNCLYETS) 및 J1을 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 6 δ1 에피토프로서 지칭된다. Bin 6 δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 TS 8.2 및 δ1-143을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Bin 6 δ1에피토프를 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄의 예시적인 Vδ1 J1 영역은 LNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP이다.

일부 경우에, Bin 6 δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1의 아미노산 47 내지 70(SKEMIFLIRQGSDEQNA) 및 J1 또는 J2를 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 7 δ1 에피토프로서 지칭된다. Bin 7 δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ1-149; δ1-253, 및 δ1-257을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Bin 7 δ1에피토프를 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄의 예시적인 Vδ1 J 영역은 SKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP이며; γδ TCR의 δ1의 다른 예시적인 Vδ1 J 영역 Bin 7 δ1에피토프는 SKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGEAPSAWGKHLTAQLFFGKGTQLIVEP이다.

일부 경우에, Bin 7 δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1의 아미노산 70 내지 80(AKSGRYSVNF) 및 J1 또는 J2를 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 8 δ1 에피토프로서 지칭된다. Bin 8 δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ1-192를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. Bin 8 δ1에피토프를 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄의 예시적인 Vδ1 J 영역은 AKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP이며; γδ TCR의 δ1의 다른 예시적인 Vδ1 J 영역 Bin 8 δ1에피토프는 AKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGEAPSAWGKHLTAQLFFGKGTQLIVEP이다.

일부 경우에, Bin 8 δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ1의 아미노산 80 내지 95(FKKAAKSVALTISALQ)을 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 9 δ1 에피토프로서 지칭된다. Bin 9 δ1 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ1-201을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 경우에, Bin 9 δ1 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ1 쇄에 결합하지만:

AQKVTQVQRAMSSQLGEAVTLSCQYETSLSWYDIFWYKQLPSGEMTFLIHQISSDQNAKNGRYSVNFQERHKFISLTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP.

본 명세서에 기재된 δ1-특이적 항체는 δ2-함유 γδ-TCR 이상으로 δ1-함유 γδ-TCR에 선택적으로 결합한다. 이렇게 해서, 앞서 언급한 δ1-특이적 항체는, 예를 들어, 하기 서열 및/또는 하기 서열을 포함하는 γδ-TCR에 결합하지 않는다:

AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDPLGGPPDKLIFGKGTRVTVEP.

δ2 에피토프 Bin

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ2의 아미노산 83 내지 94(AKNLAVLKILAP)를 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 1 δ2 에피토프로서 지칭된다. 일부 경우에, Bin 1 δ2 에피토프에 결합하는 활성화제는 Vδ2에서의 K90 돌연변이, 예컨대 K90N 돌연변이를 함유하는 에피토프에 결합하지 않는다. Bin 1 δ2 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ2-17, 및 B6을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 경우에, Bin 1 δ2 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ2 쇄에 결합하지만:

AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDPLGGPPDKLIFGKGTRVTVEP; 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ2 쇄에는 결합하지 않는다:

AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFKDNFQGDIDFLNNQAVLNILEASERDEGSYYCACDPLGGPPDKLIFGKGTRVTVEP.

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ2의 아미노산 28 내지 38(EAIGNYY)를 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 2 δ2 에피토프로서 지칭된다. 일부 경우에, Bin 2 δ2 에피토프에 결합하는 활성화제는 Vδ2에서의 G35 돌연변이, 예컨대 G35S 돌연변이를 함유하는 에피토프에 결합하지 않는다. Bin 2 δ2 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 15D를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 경우에, Bin 2 δ2 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ2 쇄에 결합하지만:

AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFK.DNFQGDIDIAKNLAVLKILAPSERDEGSYYCACDPLGGPPDKLIFGKGTRVTVEP; 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ2 쇄에는 결합하지 않는다:

AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGDSISNYYTFWYRRTPGNTMTLIYREGGTYGPGFEDNLQGEIDFLNNQAVLNILEASERDEGSYYCACDPLGGPPDKLIFGKGTRVTVEP.

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ2의 아미노산 72 내지 83(KDNFQGDIDIA)를 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 3 δ2 에피토프로서 지칭된다. Bin 3 δ2 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ2-32를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 경우에, Bin 3 δ2 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ2 쇄에 결합하지만:

AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKGEAIGNYYINWYRKTQGNTMTFIYREKDIYGPGFEDNLQGEIDFLNNQAVLNILEASERDEGSYYCACDPLGGPPDKLIFGKGTRVTVEP.

일부 실시형태에서, 관심 대상의 활성화제에 의해 (예를 들어, 특이적으로) 인식되는 에피토프는 인간 Vδ2의 아미노산 1 내지 27(AIELVPEHQTVPVSIGVPATLRCSMKG)를 포함하는 에피토프이다. 이 에피토프는 본 명세서에서 Bin 4 δ2 에피토프로서 지칭된다. Bin 4 δ2 에피토프에 결합하는 예시적인 활성화제는 δ2-14; δ2-22; δ2-30; δ2-31; δ2-36; 및 δ2-37를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

일부 경우에, Bin 4 δ2 에피토프에 결합하는 활성화제는 하기의 서열을 갖는 γδ TCR의 δ2 쇄에 결합하지만:

AVTLVPQNQARSVSVGESVTLRCSMKGDSISNYYTFWYRRTPGNTMTLIYREGGTYGPGFEDNLQGEIDFLNNQAVLNILEASERDEGSYYCACDPLGGPPDKLIFGKGTRVTVEP.

본 명세서에 기재된 δ2-특이적 항체는 δ1-함유 γδ-TCR 이상으로 δ2-함유 γδ-TCR에 선택적으로 결합한다. 이렇게 해서, 앞서 언급한 δ2-특이적 항체는, 예를 들어, 하기 서열 및/또는 하기 서열을 포함하는 γδ-TCR에 결합하지 않는다:

AQKVTQAQSSVSMPVRKAVTLNCLYETSWWSYYIFWYKQLPSKEMIFLIRQGSDEQNAKSGRYSVNFKKAAKSVALTISALQLEDSAKYFCALGTGVRGLQDTDKLIFGKGTRVTVEP.

일반적으로, 본 명세서에 기재된 δ1- 및 δ2-특이적 항체는 γδ-TCR과 관련하여 입체배좌 에피토프를 인식한다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 δ1- 및 δ2-특이적 항체는 γδ1- 또는 γδ2- TCR 각각의 하나 이상의 쌍에 특이적이다. 예를 들어, 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 δ1-특이적 항체는 γ8δ1-TCR에 특이적이다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 δ1-특이적 항체는 γ8δ1-TCR에 결합하지만 γ9δ1-TCR에는 결합하지 않는다.

치료 방법

본 명세서에 기재된 바와 같은 비조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물은 예방적 및/또는 치료적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 적용에서, 조성물은 질환 또는 병태의 증상을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 저지하기에 충분한 양으로 질환 또는 병태를 이미 앓고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단 및/또는 이들의 혼합물은 또한 병태를 진행시키거나, 수축시키거나 또는 악화시킬 가능성을 줄이기 위해 투여될 수 있다. 치료적 용도를 위한 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단 및/또는 이들의 혼합물 집단의 유효량은 질환 또는 병태의 중증도 및 과정, 이전의 요법, 대상체의 건강 상태, 체중 및/또는 약물에 대한 반응, 및/또는 치료하는 의사의 판단에 기반하여 다를 수 있다.

본 개시내용의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 병태에 대한 치료가 필요한 대상체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 병태의 예는 암, 감염성 질환, 자가면역 장애 및 패혈증을 포함한다. 대상체는 인간, 비-인간 영장류, 예컨대 침팬지, 및 다른 유인원 및 원숭이 종, 농장 동물, 예컨대 소, 말, 양, 염소, 돼지; 가축, 예컨대 토끼, 개 및 고양이; 설치류를 포함하는 실험 동물, 예컨대 래트, 마우스 및 기닉픽 등일 수 있다. 대상체는 임의의 연령을 가질 수 있다. 대상체는, 예를 들어, 노인, 성인, 청소년, 사춘기전, 아동, 유아, 영아일 수 있다.

본 발명의 농축된 γδ T-세포 집단을 이용하여 대상체에서의 ㅣ병태(예를 들어, 질병)을 치료하는 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 다양한 요법(예를 들어, 시간, 농도, 투약량, 치료 사이의 간격 및/또는 제형)으로 투여될 수 있다. 대상체는 또한 본 개시내용의 농축된 γδ T-세포 집단 및/또는 이들의 혼합물을 받기 전에, 예를 들어, 화학요법, 방사선 또는 둘 다의 조합을 이용하여 사전조건화될 수 있다. 치료의 부분으로서, 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단 및/또는 이들의 혼합물은 제1 요법에서 대상체에게 투여될 수 있고, 대상체는 제1 요법에서의 치료가 치료 효능의 주어진 수준을 충족시키는지의 여부를 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 일부 경우에, 조작된 γδ T-세포 또는 다른 조작된 γδ T-세포는 제2 요법에서 대상체에게 투여될 수 있다. 도 2는 대상체를 치료하기 위한 방법을 개략적으로 도시한 도면. 제1 작업(201)에서, 적어도 하나의 조작된 γδ T-세포는 주어진 병태(예를 들어, 암)를 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여된다. 조작된 γδ T-세포는 제1 요법에서 투여될 수 있다. 제2 작업(202)에서, 대상체는, 예를 들어 의료인(예를 들어, 치료하는 의사 또는 간호사)에 의해 모니터링될 수 있다. 일부 예에서, 대상체는 대상체의 병태를 치료하는 데 조작된 γδ T-세포 효능을 결정하거나 또는 판단하기 위해 모니터링된다. 일부 상황에서, 대상체는 또한 대상체에서 γδ T-세포 집단의 생체내 확장을 결정하기 위해 모니터링될 수 있다. 다음에, 제3 작업(203)에서, 적어도 하나의 다른 조작된 γδ T-세포는 제2 요법에서 대상체에게 투여된다. 제2 요법은 제1 요법과 동일하거나 또는 제1 요법과 상이할 수 있다. 일부 상황에서, 예를 들어, 제1 작업(201)에서의 조작된 γδ T-세포의 투여가 유효한 것으로 발견된다면(예를 들어, 투여의 단일 라운드가 병태를 치료하기에 충분할 수 있다면), 제3 작업(203)은 수행되지 않는다. 그들의 동종이계 및 보편적 공여자 특징에 기인하여, 조작된 γδ T-세포의 집단은 상이한 MHC 단상형을 갖는 다양한 대상체에게 투여될 수 있다. 조작된 γδ T-세포는 대상체에게 투여되기 전에 냉동되거나 또는 동결보존될 수 있다.

γδ T-세포(즉, 조작된 또는 비조작된) 및/또는 이들의 혼합물의 농축 집단은 대상체에게 투여되기 전에 냉동되거나 또는 동결보존될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조작된, 농축된 γδ T-세포의 집단은 동일하거나, 상이한 또는 동일하고 상이한 종양 인식 모이어티의 조합을 발현시키는 2 이상의 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조작된, 농축된 γδ T-세포의 집단은 상이한 항원, 또는 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하도록 설계된 몇몇 별개의 조작된 γδ T-세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 흑색종의 피해를 입은 인간 세포는 NY-ESO-1 종양 유전자를 발현시킬 수 있다. 인간 내에서 감염된 세포는 the NY-ESO-1 종양단백질을 더 작은 단편으로 가공할 수 있으며, 항원 인식을 위한 NY-ESO-1 단백질의 다양한 부분을 제공한다. 조작된, 농축된 γδ T-세포의 집단은 NY-ESO-1 단백질의 상이한 부분을 인식하도록 설계된 상이한 종양 인식 모이어티를 발현시키는 다양한 조작된 γδ T-세포를 포함할 수 있다. 도 3은 흑색종 항원 NY-ESO-1의 상이한 에피토프를 인식하는 조작된 γδ T-세포 집단을 이용하여 대상체를 치료하는 방법을 개략적으로 도시한다. 제1 작업(301)에서, 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하는 조작된 γδ T-세포 집단이 선택된다. 예를 들어, 조작된 γδ T-세포의 집단은 NY-ESO-1 단백질의 상이한 부분을 인식하는 상이한 종양 인식 모이어티를 발현시키는 2 이상의 세포를 포함할 수 있다. 제2 작업(302)에서, 조작된 γδ T-세포 집단은 제1 요법에서 투여될 수 있다. 제2 작업(303)에서, 대상체는, 예를 들어 의료인(예를 들어, 치료하는 의사 또는 간호사)에 의해 모니터링될 수 있다.

본 개시내용의 농축된 γδ T-세포 집단, 즉, 비-조작된 또는 조작된 것 그리고/또는 이들의 혼합물이 다양한 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 고형 종양 및 혈액학적 악성종양을 포함하는 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 암의 비제한적 예는 급성 림프모구백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질암종, AIDS-관련암, AIDS-관련 림프종, 항문암, 맹장암, 성상 세포종, 신경아세포종, 기저세포암종, 담도암, 방광암, 골암, 뇌종양, 예컨대 소뇌성상세포종, 대뇌 별아교세포종/악성 뇌교종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 시각 경로 및 시상하부 신경교종, 유방암, 기관지 선종, 버킷 림프종, 미지의 원발성 유래의 암종, 중추 신경계 림프종, 소뇌성상세포종, 자궁경부암, 아동암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 결합 조직성 소원형세포 종양, 자궁내막암, 뇌실막세포종, 식도암, 유잉 육종, 생식 세포 종양, 담낭암, 위암, 위장유암종, 위장 기질 종양, 신경교종, 모양 세포성 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포(간)암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안구내 흑색종, 도세포 암종, 카포씨 육종, 신장암, 후두암, 입술 및 구강암, 지방육종, 간암, 폐암, 예컨대 비소세포 및 소세포 폐암, 림프종, 백혈병, 마크로글로불린혈증, 뼈의 악성 섬유조직구종/골육종, 수모세포종, 흑색종, 중피종, 잠복 원발성을 갖는 전이성 편평 경부암, 구강암, 다발 내분비 신생물 증후군, 골수형성이상증후군, 골수성 백혈병, 비강 및 부비동암, 비인두 암종, 신경아세포종, 비호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 구강암, 구인두암, 골육종/뼈의 악성 섬유조직구종, 난소암, 난소 상피암, 난소 생식 세포 종양, 췌장암, 췌장암 도세포, 부비강 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 갈색세포종, 성상세포종, 송과선 배세포종, 뇌하수체 선종, 흉막 폐 모세포종, 혈장 세포 신생물, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신세포 암종, 신우 및 요관 이행세포암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 피부암, 피부 암종 메르켈 세포, 소장암, 연조직 육종, 편평 세포 암종, 위암, T-세포 림프종, 인후암, 흉선종, 흉선 암종, 갑상선암, 영양막 종양(임신성), 미지의 원발성 부위의 암, 요도암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트륌 마크로글로불린혈증, 및 윌름 종양을 포함한다.

일부 경우에, 본 개시내용의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단 및/또는 이들의 혼합물은 감염성 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 감염성 질환은, 예를 들어, 병원성 박테리아에 의해 또는 바이러스에 의해 야기될 수 있다. 다양한 병원성 단백질, 핵산, 지질 또는 이들의 단편은 질환 세포에 의해 발현될 수 있다. 항원 제시 세포는 이러한 병원성 분자를, 예를 들어, 식세포 작용에 의해 또는 수용체-매개 내포작용에 의해 내재화할 수 있고, 적절한 MHC 분자에 결합되는 항원의 단편을 나타낸다. 예를 들어, 병원성 단백질의 다양한 9량체 단편은 APC에 의해 나타날 수 있다. 본 개시내용의 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단은 병원성 박테리아 또는 바이러스의 다양한 항원 및 항원 단편을 인식하도록 설계될 수 있다. 병원성 박테리아의 비제한적 예는 a) 보르데텔라(Bordetella) 속, 예컨대 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis) 종; b) 보렐리아(Borrelia) 속, 예컨대 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi) 종; c) 브루셀리아(Brucelia) 속, 예컨대 브루셀라 아보투스(Brucella abortus), 브루셀라 카니스(Brucella canis), 브루셀라 멜리테리시스(Brucela meliterisis), 및/또는 브루셀라 수이스(Brucella suis) 종; d) 캄필로박터(Campylobacter) 속, 예컨대 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 종; e) 클라미디아(Chlamydia) 및 클라미도필라(Chlamydophila) 속, 예컨대 클라미디아 뉴모니아(Chlamydia pneumonia), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및/또는 클라미도필리아 프시타치(Chlamydophila psittaci) 종; f) 클로스트리듐(Clostridium) 속, 예컨대 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile), 클로스트리듐 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani) 종; g) 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 예컨대 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria) 종; h) 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 예컨대 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis) 및/또는 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium) 종; i) 에스케리키아(Escherichia) 속, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 종; j) 프란시셀라(Francisella) 속, 예컨대 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis) 종; k) 헤모필루스(Haemophilus) 속, 예컨대 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) 종; l) 헬리코박터(Helicobacter) 속, 예컨대 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 종; m) 레지오넬라(Legionella) 속, 예컨대 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila) 종; n) 렙토스피라(Leptospira) 속, 예컨대 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans) 종; o) 리스테리아(Listeria) 속, 예컨대 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 종; p) 마이코박테리움(Mycobacterium) 속, 예컨대 마이코박테리움 레프라에(Mycobacterium leprae), 마이코박테리움 투베르쿨로시스(mycobacterium tuberculosis) 및/또는 마이코박테리움 울세란스(mycobacterium ulcerans) 종; q) 마이코플라즈마(Mycoplasma) 속, 예컨대 마이코플라즈마 뉴모니아(Mycoplasma pneumonia) 종; r) 네이세리아(Neisseria) 속, 예컨대 네이세리아 고노리아(Neisseria gonorrhoeae) 및/또는 네이세리아 메닌기티디아(Neisseria meningitidia) 종; s) 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 예컨대 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 종; t) 리케차(Rickettsia) 속, 예컨대 리케차 리케치(Rickettsia rickettsii) 종; u) 살모넬라(Salmonella) 속, 예컨대 살모넬라 티피(Salmonella typhi) 및/또는 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 종; v) 쉬겔라(Shigella) 속, 예컨대 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei) 종; w) 스타필로코커스(Staphylococcus) 속, 예컨대 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis) 및/또는 스타필로코커스 사프로피티쿠스(Staphylococcus saprophyticus) 종; x) 스트렙토코커스(Streptpcoccus) 속, 예컨대 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia) 및/또는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 종; y) 트레포네마(Treponema) 속, 예컨대 트레포네마 팔리듐(Treponema pallidum) 종; z) 비브리오(Vibrio) 속, 예컨대 비브리오 콜레라(Vibrio cholera); 및/또는 aa) 예르시니아(Yersinia) 속, 예컨대 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis) 종에서 찾을 수 있다.

일부 경우에, 본 개시내용의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단 및/또는 이들의 혼합물은 감염성 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있고, 감염성 질환은 바이러스에 의해 야기될 수 있다. 바이러스의 비제한적 예는 다음의 바이러스과에서 찾을 수 있으며, 예시적인 종: a) 아데노바이러스과, 예컨대 아데노바이러스종; b) 헤르페스바이러스과, 예컨대 1형 단순포진, 2형 단순포진, 수두-대상포진 바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 인간 거대세포바이러스, 8형 인간 헤르페스바이러스 종; c) 유두종바이러스과, 예컨대 인유두종바이러스 종; d) 폴리오마바이러스과, 예컨대 BK 바이러스, JC 바이러스 종; e) 폭스바이러스과, 예컨대 천연두 종; f) 헤파드나바이러스과, 예컨대 B형간염 바이러스 종; g) 파보바이러스과, 예컨대 인간 보카바이러스, 파보바이러스 B19 종; h) 아스트로바이러스과, 예컨대 인간 아스트로바이러스 종; i) 칼리시바이러스과, 예컨대 노르워크 바이러스 종; j) 플라비바이러스과, 예컨대 C형간염 바이러스(HCV), 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 웨스트 나일 바이러스 종; k) 토가바이러스과, 예컨대 루벨라 바이러스 종; l) 헤페바이러스과, 예컨대 E형 간염 바이러스 종; m) 레트로바이러스과, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 종; n) 오쏘믹소바이러스과, 예컨대 인플루엔자 바이러스 종; o) 아레나바이러스과, 예컨대 구아나리토 바이러스, 주닌 바이러스, 라싸 바이러스, 마쿠포 바이러스, 및/또는 사비아 바이러스 종; p) 분야바이러스과, 예컨대 크림-콩고 출혈열 바이러스 종; q) 필로바이러스과, 예컨대 에볼라 바이러스 및/또는 마르부르크 바이러스 종; 파라믹소바이러스과, 예컨대 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 메타뉴모바이러스, 헨드라 바이러스 및/또는 니파 바이러스 종; r) 랍도바이러스 속, 예컨대 광견병 바이러스 종; s) 레오바이러스과, 예컨대 로타바이러스, 오르비바이러스, 콜티바이러스 및/또는 반나 바이러스 종으로 예시된다. 일부 예에서, 바이러스는 바이러스과, 예컨대 D형 간염과 같은 바이러스과에는 부여되지 않는다.

일부 경우에, 본 개시내용의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 자가면역 질환과 같은 면역 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 자가면역 질환을 포함하는 염증성 질환은 또한 B-세포 장애와 관련된 질환의 부류이다. 자가면역 병태를 포함하는 질환 또는 병태의 예는 류마티스 관절염, 류마티스열, 다발성 경화증, 실험적 자가면역 뇌척수염, 건선, 포도막염, 진성 당뇨병, 전신 홍반 루푸스(SLE), 루푸스 신염, 습진, 피부경화증, 다발근염/피부경화증, 다발근염/피부근염, 궤양성 직장염, 중증 합병 면역결핍증 (SCID), 디조지 증후군, 모세혈관확장성 운동실조, 계절성 알레르기, 지속적 알레르기, 식품 알레르기, 과민증, 비만세포증, 알레르기성 비염, 아토피 피부염, 파킨슨병, 알츠하이머병, 비기능 항진증, 백혈구 접착 결핍증, X-연관 림프증식성 질환, X-연관 무감마글로불린증, 선택적 면역글로불린 A 결핍증, 고 IgM 증후군, HIV, 자가면역 림프구 증식 증후군, 비스코트-알드리치 증후군, 만성 육아종병, 공통 가변 면역결핍증(CVID), 고면역글로불린 E 증후군, 하시모토 갑상선염, 급성 특발성 혈소판감소성 자반, 만성 특발성 저혈소판 자반증, 피부근염, 시데남무도병, 중증근무력증, 다선성 증후군, 수포성 유사천포창, 헤노호스콘레인 자반증, 연쇄상구균감염 후 신염, 결절성 홍반, 다형 홍반, gA 신장병증, 타카야수 동맥염, 애디슨병, 사르코이드증, 궤양성 대장염, 결절성 다발동맥염, 강직성 척추염, 굿파스튜어 증후군, 폐색성 혈전 혈관염, 쇼그렌 증후군, 원발성 담도성 간경변증, 하시모토 갑상선염, 갑상선중독증, 만성 활동성 간염, 다발 연골염, 심상성 천포창, 베게너 육아종증, 막성 신장병증, 근위축 측삭 경화증, 척수매독, 거대세포 동맥염/다발근육통, 악성빈혈, 급속 진행 사구체신염, 건선, 섬유성폐포염 및 암을 포함한다.

본 개시내용의 γδ T-세포 집단, 및/또는 이의 혼합물을 이용하는 치료는 병태의 임상적 개시 전에, 동안에 그리고 후에 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 질환의 임상적 개시 후에 1일, 1주, 6개월, 12개월 또는 2년 후에 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 질환의 임상적 개시 후 1일, 1주, 1개월, 6개월, 12개월, 2년, 3년, 4년, 5년, 6년, 7년, 8년, 9년, 10년 이상 동안 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 질환의 임상적 개시 후에 1일, 1주, 1개월, 6개월, 12개월 또는 2년 미만 동안 대상체에게 제공될 수 있다. 치료는 또한 임상 시험에서 인간을 치료하는 것을 포함할 수 있다. 치료는 대상체에게 본 개시내용의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 포함하는 약제학적 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 대상체에게 본 개시내용의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 대상체 신체에서 내인성 림프구의 활성을 조절한다. 일부 경우에, 대상체에게 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 내인성 T-세포에 대한 항원을 제공하며, 면역 반응을 촉진시킬 수 있다. 일부 경우에, 기억 T-세포는 CD4⁺ T-세포이다. 일부 경우에, 기억 T-세포는 CD8⁺ T-세포이다. 일부 경우에, 대상체에 대한 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 다른 면역 세포의 세포 독성을 활성화시킨다. 일부 경우에, 다른 면역 세포는 CD8+ T-세포이다. 일부 경우에, 다른 면역 세포는 자연살해 T-세포이다. 일부 경우에, 대상체에 대한 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 조절 T-세포를 억제한다. 일부 경우에, 조절 T-세포는 Fox3+ Treg 세포이다. 일부 경우에, 조절 T-세포는 Fox3- Treg 세포이다. 본 개시내용의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물에 의해 활성이 조절될 수 있는 세포의 비제한적 예는 조혈 줄기 세포; B 세포; CD4; CD8; 적혈구 세포; 백혈구 세포; 수지상 세포(수지상 항원 제시 세포를 포함); 백혈구; 대식세포; 기억 B 세포; 기억 T-세포; 단핵구; 자연 살해 세포; 호중성 과립구; T-헬퍼 세포; 및 T-살해 세포를 포함한다.

대부분의 골수 이식 동안, 대상체 면역계에 의한 이식에서의 조혈 줄기 세포(HSC)의 거부를 방지하기 위해 사이클로포스파마이드와 전신 방사선 조사와의 조합이 통상적으로 사용된다. 일부 경우에, 생체외 인터류킨-2(IL-2)과 함께 공여자 골수의 인큐베이션은 공여자 골수 내 살해 림프구의 생성을 향상시키기 위해 수행된다. 인터류킨-2(IL-2)는 야생형 림프구의 성장, 증식 및 분화 동안 필요한 사이토카인이다. 인간에게 γδ T-세포의 입양 전달의 현재의 연구는 γδ T-세포와 인터류킨-2의 공동투여를 필요로 할 수 있다. 그러나, IL-2의 낮은 그리고 높은 투약량은 고도로 독성인 부작용을 가질 수 있다. IL-2 독성은 다중 기관/계, 가장 중요하게는, 심장, 폐, 신장 및 중추 신경계에서 나타날 수 있다. 일부 경우에, 본 개시내용은 사이토카인, 예컨대 IL-2, IL-15, IL-12 또는 IL-21의 공동 투여 없이 대상체에 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 투여하는 방법을 제공한다. 일부 경우에, 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 IL-2와의 공동 투여 없이 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 경우에, 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 IL-2의 공동 투여 없이 골수 이식과 같은 절차 동안 대상체에게 투여된다.

투여 방법

본 발명의 하나 또는 다중의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 임의의 순서로 또는 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 동시라면, 본 발명의 다중 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 단일의, 통일된 형태, 예컨대 정맥내 주사로, 또는 다중 형태로, 예를 들어, 다중 정맥내 주입, 피하 주사 또는 알약으로 제공될 수 있다. 본 발명의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 단일 패키지 또는 복수의 패키지로 함께 또는 별개로 패킹될 수 있다. 본 발명의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물 중 하나 또는 모두는 다회 용량으로 주어질 수 있다. 동시가 아니라면, 다회 용량 사이의 시간은 약 1주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 약 1년만큼 다를 수 있다. 일부 경우에, 본 발명의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 대상체에게 투여 후에 대상체의 신체 내, 생체 내에서 확장될 수 있다. 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 동일한 세포 제제에 의한 다중 치료를 위해 세포를 제공하기 위해 냉동될 수 있다. 본 개시내용의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물, 및 이를 포함하는 조성물은 키트로서 패키징될 수 있다. 키트는 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물, 및 이를 포함하는 조성물의 사용에 대한 설명서(예를 들어, 기재된 설명서)를 포함할 수 있다.

일부 경우에, 암을 치료하는 방법은 대상체에게 치료적 유효량의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 투여하는 단계를 포함하되, 투여는 암을 치료한다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 적어도 약 10초, 30초, 1분, 10분, 30분, 1시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 또는 1년 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 적어도 1주 동안 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료적 유효량의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 적어도 2주 동안 투여된다.

본 명세서에 기재된 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 질환 또는 병태의 발생 전에, 동안에 또는 후에 투여될 수 있고, 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물을 함유하는 약제학적 조성물의 투여 시간은 다를 수 있다. 예를 들어, 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 질환 또는 병태의 발생 가능성을 줄이기 위해 예방적으로 사용될 수 있으며, 병태 또는 질환에 대한 성향을 갖는 대상체에게 지속적으로 투여될 수 있다. 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 증상 개시 동안에 또는 증상 개시 후 가능한 빨리 대상체에게 투여될 수 있다. 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 증상 개시 직후에, 증상 개시의 처음 3시간 이내에, 증상 개시의 처음 6시간 이내에, 증상 개시의 처음 24시간 이내에, 증상 개시의 48시간 이내에 또는 증상 개시로부터 임의의 기간 내에 개시될 수 있다. 초기 투여는 본 명세서에 기재된 임의의 제형을 이용하여 임의의 일상적 실행을 통해, 예컨대 본 명세서에 기재된 임의의 경로에 의할 수 있다. 일부 예에서, 본 개시내용의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 투여는 정맥내 투여이다. 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 1회 또는 다회 투약량은 암, 감염성 질환, 면역 질환, 패혈증의 개시 후에, 또는 골수 이식과 함께 실행 가능하다면 바로, 그리고, 예를 들어, 약 24시간 내지 약 48 시간, 약 48시간 내지 약 1주, 약 1주 내지 약 2주, 약 2주 내지 약 1개월, 약 1개월 내지 약 3개월의 치료 동안 필요한 시간 길이 동안 투여될 수 있다. 암 치료를 위해, 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 1회 또는 다회 투약량은 암의 개시 후에 그리고 다른 치료 전에 또는 후에 몇년 동안 투여될 수 있다. 일부 예에서, 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 적어도 약 10분, 30분, 1시간, 2 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간, 적어도 48 시간, 적어도 72 시간, 적어도 96 시간, 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 적어도 10개월, 적어도 11개월, 적어도 12개월, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 3년, 적어도 4년 또는 적어도 5년 동안 투여될 수 있다. 치료 길이는 각각의 대상체에 대해 다를 수 있다.

투약량

본 명세서에 개시된 바와 같은 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 정확한 투약량의 단일 투여에 적합한 단위 투약 형태로 제형화될 수 있다. 일부 경우에, 단위 투약 형태는 추가적인 림프구를 포함한다. 단위 투약 형태에서, 제형은 하나 이상의 화합물의 적절한 양을 함유하는 단위 용량으로 나누어진다. 단위 투약량은제형의 별개의 양을 함유하는 패키지의 형태일 수 있다. 비제한적 예는 패키징된 정제 또는 캡슐 및 바이알 또는 앰플 내 분말이다. 수성 현탁액 조성물은 단일 용량의 다시 닫을 수 없는 용기에 패키징될 수 있다. 다회 용량의 다시 닫을 수 있는 용기는, 예를 들어, 보존제와 조합하여 또는 보존제 없이 사용될 수 있다. 일부 예에서, 약제학적 조성물은 보존제를 포함하지 않는다. 비경구 주사를 위한 제형은, 예를 들어, 보존제와 함께 앰플 내 또는 다회 용량 용기 내에서 단위 투약 형태로 제공될 수 있다.

본 명세서에 기재되는 바와 같은 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 적어도 5개의 세포, 적어도 10개의 세포, 적어도 20개의 세포, 적어도 30개의 세포, 적어도 40개의 세포, 적어도 50개의 세포, 적어도 60개의 세포, 적어도 70개의 세포, 적어도 80개의 세포, 적어도 90개의 세포, 적어도 100개의 세포, 적어도 200개의 세포, 적어도 300개의 세포, 적어도 400개의 세포, 적어도 500개의 세포, 적어도 600개의 세포, 적어도 700개의 세포, 적어도 800개의 세포, 적어도 900개의 세포, 적어도 1 x 10³개의 세포, 적어도 2 x 10³개의 세포, 적어도 3 x 10³개의 세포, 적어도 4 x 10³개의 세포, 적어도 5 x 10³개의 세포, 적어도 6 x 10³ 세포, 적어도 7 x 10³개의 세포, 적어도 8 x 10³개의 세포, 적어도 9 x 10³개의 세포, 적어도 1 x 10⁴개의 세포, 적어도 2 x 10⁴개의 세포, 적어도 3 x 10⁴개의 세포, 적어도 4 x 10⁴개의 세포, 적어도 5 x 10⁴개의 세포, 적어도 6 x 10⁴개의 세포, 적어도 7 x 10⁴개의 세포, 적어도 8 x 10⁴개의 세포, 적어도 9 x 10⁴개의 세포, 적어도 1 x 10⁵개의 세포, 적어도 2 x 10⁵개의 세포, 적어도 3 x 10⁵개의 세포, 적어도 4 x 10⁵개의 세포, 적어도 5 x 10⁵개의 세포, 적어도 6 x 10⁵개의 세포, 적어도 7 x 10⁵ 세포, 적어도 8 x 10⁵개의 세포, 적어도 9 x 10⁵개의 세포, 적어도 1 x 10⁶개의 세포, 적어도 2 x 10⁶개의 세포, 적어도 3 x 10⁶개의 세포, 적어도 4 x 10⁶개의 세포, 적어도 5 x 10⁶개의 세포, 적어도 6 x 10⁶개의 세포, 적어도 7 x 10⁶개의 세포, 적어도 8 x 10⁶개의 세포, 적어도 9 x 10⁶개의 세포, 적어도 1 x 10⁷개의 세포, 적어도 2 x 10⁷ 세포, 적어도 3 x 10⁷개의 세포, 적어도 4 x 10⁷개의 세포, 적어도 5 x 10⁷개의 세포, 적어도 6 x 10⁷개의 세포, 적어도 7 x 10⁷개의 세포, 적어도 8 x 10⁷개의 세포, 적어도 9 x 10⁷개의 세포, 적어도 1 x 10⁸개의 세포, 적어도 2 x 10⁸개의 세포, 적어도 3 x 10⁸개의 세포, 적어도 4 x 10⁸개의 세포, 적어도 5 x 10⁸개의 세포, 적어도 6 x 10⁸개의 세포, 적어도 7 x 10⁸개의 세포, 적어도 8 x 10⁸개의 세포, 적어도 9 x 10⁸개의 세포, 적어도 1 x 10⁹개 이상의 세포의 양으로 조성물 중에서 제공될 수 있다.

본 발명의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 치료적 유효 용량은 약 1개의 세포 내지 약 10 세포, 약 1개의 세포 내지 약 100개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 10개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 20개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 30개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 40개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 50개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 60개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 70개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 80개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 90개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 100개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10³개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10⁴개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁵ 개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10⁵ 개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10⁵ 개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10⁵ 개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10⁵ 개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10⁵ 개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10⁵개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10⁶개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10⁷개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 2 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 3 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 4 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 5 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 6 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 7 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 8 x 10⁸개의 세포, 약 1개의 세포 내지 약 9 x 10⁸ 세포 또는 약 1개의 세포 내지 약 1 x 10⁹개의 세포일 수 있다.

일부 경우에, 본 발명의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 치료적 유효 용량은 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10³개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10⁴개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10⁵개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 2 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 3 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 4 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 5 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 6 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 7 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 8 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 9 x 10⁸개의 세포 또는 약 1 x 10³개의 세포 내지 약 1 x 10⁹개의 세포일 수 있다.

일부 경우에, 본 발명의 비-조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 조작된, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물의 치료적 유효 용량은 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 2 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 3 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 4 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 5 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 6 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 7 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 8 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 9 x 10⁶개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 1 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 2 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 3 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 4 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 5 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 6 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 7 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 8 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 9 x 10⁷개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 1 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 2 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 3 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 4 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 5 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 6 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 7 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 8 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 9 x 10⁸개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 1 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 2 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 3 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 4 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 5 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 6 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 7 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 8 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁶개의 세포 내지 약 9 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 1 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 2 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 3 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 4 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 5 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 6 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 7 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 8 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁷개의 세포 내지 약 9 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 1 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 2 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 3 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 4 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 5 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 6 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 7 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 8 x 10⁹개의 세포, 약 1 x 10⁸개의 세포 내지 약 9 x 10⁹개의 세포 또는 약 1 x 10⁹개의 세포 내지 약 1 x 10¹⁰개의 세포일 수 있다.

보존

일부 실시형태에서, 농축된 γδ T-세포 집단, 및/또는 이들의 혼합물은 냉동 배지에서 제형화될 수 있고, 적어도 약 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 1년, 2년, 3년 또는 적어도 5년의 장기간 저장 동안 초저온 저장 장치, 예컨대 액체 질소 냉동기(-195C) 또는 초저온 냉동기(-65C, -80C 또는 -120C)에 놓인다. 냉동 배지는 약 6.0 내지 약 6.5, 약 6.5 내지 약 7.0, 약 7.0 내지 약 7.5, 약 7.5 내지 약 8.0 또는 약 6.5 내지 약 7.5의 pH를 유지하기 위해 생리적 pH 완충제와 함께 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 및/또는 염화나트륨(NaCl) 및/또는 덱스트로스 및/또는 황산덱스트란 및/또는 하이드록시에틸 전분(HES)을 함유할 수 있다. 초저온 보존된 γδ T-세포는 해동될 수 있고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체, 단백질, 펩타이드 및/또는 사이토카인을 이용하는 자극에 의해 추가로 가공될 수 있다. 동결보존된 γδ T-세포는 해동될 수 있고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터(레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 포함) 또는 비바이러스 수단(RNA, DNA 및 단백질을 포함)을 이용하여 유전자 변형된다. 대안적으로, 비-조작된 γδ T-세포는 본 명세서에 기재된 방법에 의해 확장되고, 유전자 변형되며, 초저온보존될 수 있다.

따라서, 유전자 조작되고/되거나 비-조작된 γδ T-세포는 냉동 배지에서 ㎖ 당 약 적어도 10¹, 10², 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 또는 적어도 약 10¹⁰개의 세포로 적어도 약 1, 5, 10, 100, 150, 200, 500개 바이알의 양으로 세포 은행을 생성하기 위해 추가로 초저온보존될 수 있다. 초저온보존된 세포 은행은 그들의 기능을 유지할 수 있고, 해동되고, 추가로 자극되고 나서 확장될 수 있다. 일부 양상에서, 해동 세포는 동종이계 세포 생성물로서 세포의 양을 생성하기 위해 적합한 폐쇄 용기, 예컨대 세포 배양물 백 및/또는 생물반응기에서 자극되고 확장될 수 있다. 초저온 보존된 γδ T-세포는 초저온 저장 조건 하에서 적어도 약 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 15개월, 18개월, 20개월, 24개월, 30개월, 36개월, 40개월, 50개월, 또는 적어도 약 60개월동안 그들의 생물학적 기능을 유지할 수 있다. 일부 양상에서, 제형에서 보존제는 사용되지 않는다. 초저온 보존된 γδ T-세포는 해동될 수 있고, 동종이계 표준 재고 세포 제품으로서 다수의 환자에게 주입된다.

본 명세서에 언급되는 모든 간행물 및 특허는, 예를 들어, 현재 기재되는 발명과 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 기재된 작제물 및 방법을 기재하고 개시하는 목적을 위해 그들의 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에서 논의되는 간행물은 본 출원의 출원일 전에 그들의 개시내용에 대해서만 제공된다. 본 명세서의 어떤 것도 본 명세서에 기재된 발명자가 선행 발명이기 때문에 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시내용보다 선행한다는 자격을 부여한다는 용인으로서 해석되어서는 안 된다.

본 발명은 다음의 비제한적 실시예에 의해 더 상세하게 설명한다.

실시예

실시예 1. 1차 세포 단리, 분해 및 배양물

1차 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 성분채집기를 이용하여 건강한 공여자로부터 수집한다. PBMC를 피콜-파크(Ficolll-Paque)(상표명) 플러스(스웨덴 웁살라에 소재한 GE 헬스케어 바이오-사이언시즈 AB(GE Healthcare Bio-Sciences AB)) 시스템 또는 유사한 시스템을 이용하여 정제한다. 이어서, 세포를 적절한 성분 배지에서 재현탁시킨다.

대안적으로, 1차 인간 세포를 말초 혈액, 제대혈, 골수, 건강한 조직, 또는 질환의 피해를 입은 조직, 예컨대 암성 조직으로부터 수집한다.

건강한 공여자로부터의 조직

건강한 공여자로부터의 신선한 조직을 협동 인간 조직 네트워크(The Cooperative Human Tissue Network: CHTN)로부터 받고, RPMI-1640 배지에서 실험실로 운반한다. 메스를 이용하여 조직을 1 내지 3 ㎣ 단편으로 슬라이싱한다. 2-5 개의 단편/웰을 글루타맥스(GlutaMAX), 25mM HEPES pH 7.2, 100U/㎖ 페니실린, 100U/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 인간 AB 혈청 및 100IU/㎖의 rhIL-2로 보충한 2㎖ RPMI-1640 내 24웰 플레이트(코스타(Costar))에 두거나 또는 이하에 기재하는 바와 같이 분해하였다. 플레이트를 공기 중에서 5% CO₂와 함께 37℃로 습한 인큐베이터에서 인큐베이션시킨다. 배양물을 매일 검사하여 림프구의 증식을 모니터링한다. 배양 개시 후 7일마다 배지의 절반을 모든 웰에 다시 둔다. 밀집한 림프구 카펫이 단편 주변을 뒤덮거나, 분해된 조직으로부터 유래된 림프구 집단이 이하에 기재하는 바와 같이 적절한 농도에 도달되었을 때 림프구를 수집한다.

조직 효소 분해

건강한 공여자로부터의 신선한 조직 샘플을 협동 인간 조직 네트워크(CHTN)로부터 받고, RPMI-1640 배지에서 실험실로 운반하였다. 2가지 효소 배합물 리버라제(Liberase)(상표명) DL 리서치 등급(미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마 알드리치 코포레이션(Sigma Aldrich Co.)) 또는 리버라제(상표명) 리서치 등급(미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마 알드리치 코포레이션) 또는 젠틀MACS(gentleMACS) 분해자를 이용하는 밀테니 종양 해리 키트(130-095-929)를 이용하여 효소 분해에 의해 림프구를 단리시켰다.

조직을 2 내지 3㎣ 단편으로 절단하고, 1시간 동안 37℃ 및 5% CO2에서 분해시킨다. 분해된 세포 현탁액을 40-마이크론 필터를 통해 통과시키고, 교반시키고 나서, RPMI-1640 배지로 세척하였다. 세포를 계수화하고 나서, 10% 인간 AB 혈청(코닝(Corning)) 및 100IU/㎖의 rhIL-2로 보충한 RPMI 배지(GIBCO BRL)에서 재현탁시켰다. 수집한 세포 집단을 24-웰 조직 배양 플레이트에서 0.5 내지 1 X 10⁶개의 세포/㎖로 파종하였다. 세포가 1.5 X 10⁶개의 세포/㎖의 농도를 초과하였을 때, 세포를 RPMI-IL2 함유 배지로 분할하였다.

종양 표본의 배양물

결장, 유방, 난소, 신장, 두경부, 구강, 췌장 및 간의 암을 포함하는 원발성 및 전이성 암을 갖는 환자로부터의 신선한 종양 표본을 인간 조직 네트워크(CHTN)로부터 받고, RPMI 배지에서 실험실로 운반하였다. 메스를 이용하여 종양 표본을 1 내지 3 ㎣ 단편으로 슬라이싱하였다. 2-5 개의 단편/웰을 글루타맥스(GlutaMAX), 25mM HEPES pH 7.2, 100U/㎖ 페니실린, 100U/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 인간 AB 혈청 및 100IU/㎖의 rhIL-2로 보충한 2㎖ RPMI-1640 내 24웰 플레이트(코스타(Costar))에 두었다. 플레이트를 공기 중에서 5% CO₂와 함께 37℃로 습한 인큐베이터에서 인큐베이션시켰다. 배양물을 매일 검사하여 림프구의 증식을 모니터링하였다. 배양 개시 후 7일마다 배지의 절반을 모든 웰에 다시 두었다. 밀집한 림프구 카펫이 단편 주변을 뒤덮었을 때, 림프구를 수집하였다.

신선한 종양 표본 효소 분해

결장, 유방, 난소, 신장, 두경부, 구강, 췌장 및 간의 암을 포함하는 원발성 및 전이성 암을 갖는 환자로부터의 신선한 종양 표본을 인간 조직 네트워크(CHTN)로부터 받고, RPMI 배지에서 실험실로 운반하였다. 효소 배합물 리버라제(상표명) DL 리서치 등급(미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마 알드리치 코포레이션(Sigma Aldrich Co.)), 리버라제(상표명) 리서치 등급(미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마 알드리치 코포레이션) 또는 젠틀MACS(gentleMACS) 분해자를 이용하는 밀테니 종양 해리 키트(130-095-929)를 이용하여 효소 분해에 의해 림프구를 단리시켰다. 조직을 2 내지 3㎣ 단편으로 절단하고, 1시간 동안 37℃ 및 공기 중의 5% CO₂에서 분해시킨다. 분해된 세포 현탁액을 40-마이크론 필터를 통해 통과시키고, 교반시키고 나서, RPMI-1640 배지로 세척하였다. 세포를 계수화하고 나서, 10% 인간 AB 혈청(코닝) 및 100IU/㎖의 rhIL-2로 보충한 RPMI 배지(GIBCO BRL)에서 재현탁시켰다. 수집한 세포 집단을 24-웰 조직 배양 플레이트에서 0.5 내지 1 X 10⁶개의 세포/㎖로 파종하였다. 세포가 1.5 X 10⁶개의 세포/㎖의 농도를 초과하였을 때, 세포를 RPMI-IL2 함유 배지로 분할하였다.

예시적인 혈청 보충 배지 내 1차 세포의 배양물

피콜-파크(Ficoll-Paque)(상표명) 플러스(미국 펜실베니아주에 소재한 GE 헬스케어 바이오 사이언시즈(Healthcare Bio-Sciences))를 이용하여 건강한 공여자로부터 유래된 연층으로부터의 분리에 의해 PBMC 집단을 생성하였다. 10% 소 태아 혈청(깁코(Gibco)), 2m㏖/ℓ L-글루타민, 100U/㎖ 페니실린, 100U/㎖ 스트렙토마이신, 및 100 IU rhIL-2/㎖으로 보충한 RPMI-1640(코닝 셀그로(Corning CellGro))에서 24-웰 조직 배양 플레이트에서 1 X 10⁶개의 세포/㎖로 PBMC를 배양시켰다.

말초 혈액, 제대혈, 골수, 건강한 조직, 또는 질환의 피해를 입은 조직, 예컨대 암성 조직으로부터 수집한 1차 인간 세포를 성장시키기 위해 유사한 조건을 사용할 수 있다.

예시적인 무혈청 배지 내 1차 세포의 배양물

피콜-파크(상표명) 플러스(미국 펜실베니아주에 소재한 GE 헬스케어 바이오 사이언시즈)를 이용하여 건강한 공여자로부터 유래된 연층으로부터의 분리에 의해 PBMC 집단을 생성하였다. CTS-OpTmizer 보충물을 갖는 CTS 무혈청 배지 내 24-웰 조직 배양 플레이트에서 1 X 10⁶개의 세포/㎖로 PBMC를 배양시켰다.

실시예 2: 접착 단핵구 및 대식세포 및 CD4+ 및 CD8+ αβT 세포의 결실

앞서 기재한 성분채집 방법을 이용하여 PMBC를 수집하고, 피콜 구배 원심분리를 이용하여 저긴장 처리 또는 밀도 분리에 의해 적혈구를 제거한다. 무 적혈구 PBMC를 대규모 조직 배양물 용기, 예컨대 10-스택 또는 40-스택셀 팩토리(Cell Factory)(눈크(Nunc)), 롤러 보틀(눈크)에서 인큐베이션시킨다. 대식세포 및 단핵구를 포함하는 접착 집단은 전형적으로 세포 배양물 용기 표면에 결합된 채로 남아있는다. 현탁액 집단에서 성장되는 세포 집단은 γδ T-세포에서 농축된다. 대략 10⁸, 10⁹ 또는 10¹⁰개의 PBMC를 항-인간 CD4 및 항-인간 CD8 코팅된 철-함유 마이크로비드(예를 들어, 밀테니 바이오테크 마이크로비즈(Miltenyi Biotech Microbeads))와 함께 인큐베이션시킨다. 인큐베이션시킨 세포 집단은 CD4⁺ 및 CD8⁺ T-세포가 유지되는 자기장을 유동하여 통과한다. "통과액" 세포 집단을 γδ T-세포에 대해 농축시킨다.

실시예 3: 단핵구 및 대식세포의 결실

앞서 기재한 성분채집 방법을 이용하여 PMBC를 수집하고, 피콜 구배 원심분리를 이용하여 저긴장 처리 또는 밀도 분리에 의해 적혈구를 제거한다. 무 적혈구 PBMC를 대규모 조직 배양물 용기, 예컨대 10-스택 또는 40-스택 셀 팩토리(Cell Factory)(눈크(Nunc)), 롤러 보틀(눈크)에서 인큐베이션시킨다. 패킹된 유리솜 칼럼을 거쳐서 적혈구-제거 PBMC를 유동시킴으로써 단핵구 및 대식세포를 제거한다. 추가 가공을 위해 "통과액" 세포 집단을 γδ T-세포에서 농축시킨다.

실시예 4: γδ T-세포의 농축

앞서 기재한 성분채집 방법을 이용하여 PMBC를 수집하고, 피콜 구배 원심분리를 이용하여 저긴장 처리 또는 밀도 분리에 의해 적혈구를 제거한다. 무 적혈구 PBMC를 대규모 조직 배양물 용기, 예컨대 10-스택 또는 40-스택 셀 팩토리(Cell Factory)(눈크(Nunc)), 롤러 보틀(눈크)에서 인큐베이션시킨다. 실시예 2에서 또는 실시예 3에서 기재한 방법을 이용하여 단핵구 및 대식세포를 고갈시킨다. 대략 10⁸, 10⁹ 또는 10¹⁰개의 PBMC를 CD4 및 CD8 코팅된 철-함유 마이크로비드(예를 들어, 밀테니 바이오테크 마이크로비즈)와 함께 인큐베이션시킨다. 인큐베이션시킨 세포 집단은 항인간 CD4⁺ 및 항인간 CD8⁺ T-세포가 유지되는 자기장을 유동하여 통과한다. "통과액" 세포 집단을 γδ T-세포에 대해 농축시킨다. 원치않는 세포, 예컨대 NK, γδ T-세포, B 세포, 단핵구 및 대식세포를 원치않는 세포 유형에 관련된 항체의 칵테일을 이용하여 면역자기 비드 분리(예를 들어, 밀테니 바이오테크 오토맥스 시스템(Miltenyi Biotech AutoMACS system))에 의해 제거한다.

대안적으로, 원치않는 세포 유형은 마우스 항 인간 αβTCR(IP26, BW242/412)항체, NK, αβT 세포, B 세포, 단핵구 또는 대식세포 상의 표면 수용체로 향하는 하나 이상의 다른 항체를 이용함으로써 제거되고, 항-마우스 IgG 마이크로비즈(밀테니 130-048-401), 또는 NK, αβT 세포, B 세포, 단핵구 또는 대식세포, 또는 이들의 조합물 상의 표면 수용체로 향하는 하나 이상의 사량체 항체 복합체 또는 이중특이성 항체에 부착된다.

항체를 이용하는 1차 세포로부터의 γδ T-세포의 단리

일 예에서, 천연 γδ T-세포는 양성(즉, γδ TCR) 또는 음성(즉, αβTCR, CD4, CD8, CD56) 세포 표면 마커의 발현에 기반하여 유세포 분석을 이용하여 1차 배양물로부터 단리된다.

실시예 5. 1차 종양으로부터 γδ T-세포의 단리

실시예 1에서 상술하는 방법에 따라 γδ T-세포를 단리시켰다. 간략하게, 신선하게 채취한 종양 표본을 NCI 협동 인간 조직 네트워크(CHTN)로부터 얻었다. 간에 대한 결장 선암종 전이(TIL 1) 및 신종양(TIL 2)을 RPMI-1640 배지에서 운송하였다. 종양 조직을 편평한 칼날을 이용하여 2㎣ 크기의 작은 조각으로 민싱한 후에 기재한 바와 같은 RPMI 및 3000 단위의 DNase에서 2mL 리버라제 효소 칵테일(미주리주 세인트 루이스에 소재한 시그마 케미컬 코포레이션)을 이용하여 분해시켰다. 분해 후에, 멸균 게이지 40-마이크론 나일론 메쉬를 통해 종양을 여과시키고, RPMI-1640에서 2회 세척하였다. 세포를 계수화하고 나서, l-글루타민, 및 100U/㎖의 rhIL-2로 보충한 10% 인간 AB 혈청을 함유하는 RPMI-1640에서 1x106/㎖로 24웰 플레이트에 두었다. 종양 침윤성 림프구를 배양물에서 6일 후에 수집하였다. γδ T 림프구의 존재를 유세포분석기 항-δ1 TCR(FITC 접합된 항 Vδ1TS8.2(써모 피셔(Thermo Fisher)) 및 항 -Vδ2B6(바이오레전드(Biolegend))에 의해 분석하였다. 데이터를 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.

도 4는 간에 대한 결장 선암종 전이(TIL 1) 및 신장 종양(TIL 2)로부터 단리된 γδ1 및 γδ2 림프구의 성장을 도시한다. 이들 림프구는 CCR4 및 CCR7을 발현시키는 것으로 나타났다(데이터 미제시). 도 4에 의해 도시하는 바와 같이, Vδ1 서브세트는 종양 유형 둘 다로부터 단리된 우세한 집단이었다.

실시예 6. γδ T-세포의 자극 및 확장

사이토카인 (IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, IL-12, IL-21, IL-23 또는 IL-33), 성장 인자(인슐린 및 트랜스페린, 인슐린 유사 성장 인자), 알부민, 지질(콜레스테롤, 지질 용액, 지질 전구체), 비타민, 구리, 철, 셀레늄, 단백질 가수분해물, 필수 아미노산, 비필수 아미노산 및 전단 보호제(플루로닉(Pluronic) F-68)를 함유하는 무혈청 배지, 예컨대 생체외 10(론자 04-380Q), 생체외 15(론자 04-744Q), 생체외 20(론자 04-448Q), AIMV 배지(써모피셔 사이언티픽 12055091), 옵티마이저 CTS(써모피셔 사이언티픽 A1048501)에서 γδ T-세포를 자극하고 확장시킨다.

본 명세서의 실시예에 기재한 무혈청 배지는 또한 현탁액 배양물(예를 들어, WAVE 생물반응기)에서 10⁵ 내지 2 x 10⁷개의 세포/㎖의 높은 세포 밀도γδ T-세포 성장을 지원하는 한편 γδ T-세포의 생물학적 기능을 유지하기 위한 첨가제로 보충할 수 있다.

강한 γδ T-세포 성장을 제공한 추가적인 첨가제는, 예를 들어, 염화칼슘, 무수물, 질산칼슘, 황산구리, 5수화물, 구연산제이철, 질산제이철, 황산제일철, 황산아연 및/또는 푸트레신을 포함한다.

암모늄 파라몰리브데이트, 바나듐, 망간, 니켈, 아셀렌산나트륨, 메타규산나트륨, 9수화물, 염화제일주석, 염화알루미늄, 아세트산바륨, 염화카드뮴, 염화크로뮴, 코발트, 이산화게르마늄, 브롬화칼륨, 요오드화칼륨, 염화루비듐, 질산은, 플루오린화나트륨 및/또는 염화 지르코닐을 포함하는, 혈청을 대체하기 위한 저수준의 원소 성분을 제공하기 위해 무혈청 배지에서 미량 금속을 제공하였다.

γδ T-세포의 강한 성장을 지원하는 세포 배양 배지에 첨가하는 다른 성분은, 예를 들어, 아데노신, 구아노신, 사이티딘, 유리딘, 베타인, 타우린, 폴린산, 에탄올아민, 리놀렌산, 올레산 하이드로코티손, 피루브산염, 식물 가수분해물, 효모 가수분해물 및/또는 베타-머캅토에탄올이다.

강한 γδ T 세포 성장을 촉진하기 위해 첨가하는 비타민은 바이오틴(B7), D-칼슘 판토텐산(B5), 염화콜린, 사이아노코발라민(B12), 엽산(B9), i-이노시톨(미오-이노시톨), 나이아신아마이드(B3), 피리독살, 모노하이드로클로라이드, 피리독신, 모노하이드로클로라이드(B6), 리보플라빈(B2), 티아민 및/또는 모노하이드로클로라이드(B1)를 포함한다.

실시예 7: 확장된 γδ T-세포의 특성규명: 면역표현형

확장된 T-세포 집단은, 예를 들어, 상이한 집단 간을 구별하는 세포 표면 마커에 대한 FACS 염색에 의해 특성규명할 수 있다. 2% 소 태아 혈청을 함유하는 HEPES 완충 식염수 용액(HBSS)에서 세포를 1회 세척하고 나서, 4℃에서 30분 동안 적절한 양의 MAb와 함께 인큐베이션시키고, HBSS에서 재세척하였다. 간략하게, CD2, CD3(바이오레전드(BioLegend), 클론 OKT3), CD4 (바이오레전드 클론 OKT4), CD7, CD8(바이오레전드, 클론 RPAT8), CD11a, CD16, CD18, CD19, CD27, CD28, CD38, CD45RA, CD56, CD57, CD69, CD71, CD95, CD107, ICAM-1, MICA/B, NKG2D DR5, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5 CCR6, CCR7, CCR10, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR5, CXCR5, CXCR6, CXCR7, IL-2R, IL-7R, Ki67, L-셀렉틴, VLA-4, JAML, PD1, PDL1, CTLA-4, Ox40, TCR Vδ1(써모피셔 사이언티픽, 클론 TS8.2) 또는 TCR Vδ2(바이오레전드, 클론 B6)로 향하는 플루오로아이소티오사이아네이트(FITC) 또는 피코에리트린(PE) 접합된 MAb 를 함유하는 100㎕ 용적의 FACS 염색 배지(FSM; 2% 소 태아 혈청을 함유하는 HBSS)에서 1 x 10⁶개의 세포를 염색한다.

표면 마커에 추가로, 예를 들어, TNF-α IFN-γ, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-17 또는 IL-21을 포함하는, 사이토카인 분비, 세포내 사이토카인 및/또는 막 결합 사이토카인이 당업계에 공지된 방법에 따라 특성규명될 수 있다.

본 명세서의 특정 예에서, 생세포는 좀비 바이올렛(zombie violet)(바이오레전드) 아민 염료의 부재 또는 낮은 혼입에 의해 결정하였다. 플루오레센스 마이너스 원(Fluorescence Minus One: FMO) 제어를 사용하여 각각의 항원의 표면 발현의 양성 및 음성 게이트 경계를 정한다. 소니(Sony) SH800 세포측정기 상에서 염색 세포를 수집하고 나서, 플로우조(FlowJo) v10.1을 이용하여 데이터를 분석한다. 유세포분석 데이터를 점 플롯으로서 시각화한다.

실시예 8. 혈청-함유 및 무혈청 배지에서의 δ 2 T-세포 확장

상이한 δ2 T-세포의 성장 및 확장 속도를 혈청-함유 배지 (R2:RPMI + 10% FBS), 및 무혈청 배지(AIMV + 소 알부민; CTS 무혈청 보충물)에서 평가하였다. 도 5는 δ2 T-세포의 성장을 도시하는 그래프를 도시한다. 현재의 실험에서 사용한 모든 배지는 100IU/㎖ IL-2, 2mM 글루타민 및 1x 페니실린/스트렙토마이신을 함유하였다. 추가로, 세포를 제0일에 1, 5 및 20μM의 졸레드론산을 이용하여 자극하였다. 졸레드론산의 추가적인 첨가 없이 2 내지 3일마다 배지를 보충하였다. 13일의 시간 기간 후에 10⁶개의 PBMC로부터 확장된 δ2 T-세포의 총 수 및 각각의 처리에 대한 확장 배수를 도 5에 나타낸다. 이들 결과는 δ2 T-세포가 무혈청 배지에서 확장될 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 9. 항-γδ TCR 항체 차단 및 경쟁 분석

도 6 및 도 7은 항-γδ TCR 항체 차단 실험을 도시하는 그래프를 도시하며 도 8 및 도 9는 항체 경쟁 분석을 도시한다. 도 6 및 도 7은 PBMC를 다양한 항체, 즉, 5A6.E9, B1, TS8.2, 15D, B3, B6, TS-1, γ3.20, 이뮤노510 또는 11F2와 함께 사전인큐베이션시킨 차단 실험의 결과를 도시한다. 세포를 후속적으로 세척하고 나서, 2차 TS8.2-FITC(δ1-특이적) 또는 B6-PE(δ2-특이적) 항체를 이용하여 염색하였다. 유세포분석에 의해 PBMC 샘플을 분석하였다. 형광 강도 기하평균(gMFI)의 감소를 사용하여 차단 정도를 평가하였다. 저해 수준을 TS8.2-FITC(도 6)에 대해 그리고 B6-PE(도 7)에 대해 도시한다.

1 x 10⁵개의 세포를 1, 2 또는 10㎍의 비표지 경쟁 항체(IgG1, 5A6.E9, B1, TS8.2, TS-1, R9.12, 이뮤노510 또는 11F2) 및 0.2㎍의 FITC 접합된 항-Vδ1 TCR 클론 TS8.2(도 8) 또는 항-Vδ1 TCR 클론 TS-1(도 9)와 함께 30분 동안 얼음 상에서 동시에 인큐베이션시킴으로써 γδ1 TCR-발현 세포주 BE13에 대한 결합에 대해 MAb TS-1 및 TS8.2와 항체 5A6.E9, B1, IMMU510, R9.12-2 또는 11F2 사이의 경쟁 연구를 수행하였다. 형광의 기하 평균의 변화를 형광의 기하평균의 최대 변화로 나눔으로써 경쟁%를 계산한다. 도 9에 도시하는 바와 같이, TS-1 항체는 TS8.2 항체 그자체만큼 효과적으로 세포에 대한 TS8.2 결합과 경쟁하였다. 시험한 다른 항체 중 어떤 것도 TS8.2 결합과 경쟁할 수 없었다. TS8.2 항체는 세포에 대한 TS-1 결합과 경쟁하였지만, TS-1 그 자체만큼 효과적이지 않았다. TS-1 결합과의 일부 경쟁 수준은 또한 11F2 항체를 이용하여 관찰하였다. 이들 결과는 TS-1과 TS8.2 항체가 γδ1 에 결합하지만, 동일한 에피토프에는 결합하지 않을 가능성이 있다는 것을 나타낸다.

실시예 10. 특정 γδ에피토프에 대한 종양 표본 및 γδ T-세포 확장의 효소 분해

0.5 내지 1㎍ 항-γδ TCR 항체를 이용하여 24 웰 플레이트를 코팅하였다. 실시예 4에 기재한 바와 같은 분해 종양 조직으로부터 단리한 세포를 계수화하고 나서, 10% 인간 AB 혈청 및 rhIL-2(100IU/㎖)로 보충한 RPMI 1640 배지에서 0.5 내지 1 X 10⁶개의 세포/㎖ 1로 항체 코팅 웰에 파종하였다. 배양물을 37℃, 5% CO₂에서 7 내지 21일 동안 인큐베이션시켰다.

실시예 11. 특정 γδ 에피토프에 대한 종양 표본 및 γδ T-세포 확장의 효소 분해

실시예 1의 "신선한 종양 표본 효소 분해" 부문에서 기재한 바와 같은 분해된 종양 조직으로부터 단리한 세포를 계수화하고 나서, 10% 인간 AB 혈청 및 rhIL-2(100IU/㎖)로 보충한 RPMI 1640 배지에서 0.5 내지 1 X 10⁶개의 세포/㎖로 3D 세포 배양물 플레이트(코닝(Corning)(등록상표) 코스타(Costar)(등록상표) 초저부착 다중 웰 플레이트)의 항체 코팅 웰에 파종하였다. 배양물을 37℃, 5% CO₂에서 7 내지 21일 동안 인큐베이션시켰다.

실시예 12. PBMC로부터의 γδ T-세포의 활성화 및 확장

활성화제를 가용화제로서, 또는 배양물 웰에 고정된 제제로서 시험하였다. 가용성 항원 및 항체를 1 X 10⁶개의 세포/㎖의 세포 밀도로 24웰 플레이트에서 배양시킨 인간 PBMC에 대해 0.1 내지 5㎍/㎖의 최종 농도로 첨가하였다. 대안적으로, 24-웰 배양물 플레이트의 웰을 코팅함으로써 동일한 항 γδ TCR 항체를 고정시켰다. 항 γδ TCR 항체를 0.1 내지 10㎍/㎖ 농도로 첨가하였다. PBS를 이용하여 웰을 2회 세척하였고, 이어서, PBMC를 플레이트에 옮기고 나서, 상기 기재한 바와 같이 RPMI-1640, AIM-V 또는 CTS-OpTmizer 배지 중 하나에서 배양시켰다. 배양시킨 배지를 100IU/㎖의 rhIL-2로 보충하였다.

특정 예에서, 공여자 B3으로부터의 1백만개 PBMC/㎖를 24-웰 플레이트에서 웰 당 0.5, 1 및 2㎍으로 고정시킨 다양한 항체를 이용하여 제0일에 자극하였다. 시험한 항체는 마우스 IgG1 아이소타입 대조군 클론 MG1-45(바이오레전드), UCHT-1, 5A6.E9, B1, TS8.2, 15D, B6, B3, TS-1, γ3.20, 7A5 및 졸레드로네이트였다. 도 10 및 도 11은 PBMC로부터의 δ1 및 δ2 T-세포의 활성화 및 확장을 각각 도시하는 그래프를 도시한다. 세포를 활성화시키고 나서, 10% FBS, 100IU/㎖ rhIL-2, 글루타민 및 1x 페니실린 스트렙토마이신과 함께 RPMI를 함유하는 배지에서 확장시켰다. 초기 자극 후 -제7일에, 세포를 신선한 배지에서 계대시키고 나서, 동일한 농도로 동일한 항체를 이용하여 새로 코팅한 24-웰 플레이트에 두었다. 재자극한 배양물 내 배지를 제13일까지 2 내지 3일마다 보충하고 나서 유세포분석에 의해 분석하였다.

도 12는 δ1 T-세포의 총 수를 도시하며, 도 13은 성장 및 확장의 13일 후에 δ2 T-세포의 총 수를 도시한다. δ1 및 δ2 T-세포의 백분율(TS8.2-FITC 및 B6-PE를 각각 이용하는 유세포분석에 의해 결정)에 총 생존 세포수를 곱하고, 비-특이적 마우스 IgG MG1-45(바이오레전드 401403)에 의해 활성화된 δ1 및 δ2 T-세포로부터의 음성 대조군 값을 차감함으로써 γδ T-세포의 총 수를 계산하였다.

항체를 배양 플레이트 상에 고정시켰을 때에만 세포 확장에 대한 활성화를 얻었고, 이들 항체가 전체 PBMC 세포 집단에서를 포함하는 가용성 형태로 배양물에 첨가되었을 때에는 검출된 확장이 없었다(데이터 미제시). Pan γδ TCR MAb 5A6.E9 및 B1은 δ1 및 δ2 세포 집단 둘 다의 성장을 활성화시켰다. MAb 15D 및 B6은 δ2 세포 집단의 선택적 성장을 유도하였다. MAb TS8.2 및 TS-1은 δ1 세포 집단의 선택적 성장을 유도하였다. MAb TS-1 및 TS8.2는 세포 표면 TCR에 대한 결합에서 서로 경쟁하지만, TS-1 유도 증식은 3배 더 높았다는 것은 관심 대상이다. 유사하게, 항체 B1, 5A6.E9, 15D, B6과 B3 사이에 상이한 정도의 δ2 세포 집단 증식 유도가 검출되었다. 이 데이터는 독특한 에피토프가 γδ세포 집단의 특정 및 강한 확장을 촉발시키는 데 필요하다는 것을 나타낸다.

실시예 13: PBMC로부터의 특정 γδ T 세포 집단의 활성화 및 확장

PBMC로부터의 Vδ1 T-세포의 활성화 및 확장

활성화 항체(TS1, TS8.2, R9.12, B6 및 15D)를 0.25 또는 1㎍/㎖(0.25㎍/㎖에 대한 데이터를 나타냄) 에서 플라스틱 24-웰 플레이트에 직접 고정시키거나 또는 24-웰 플레이트에서 플레이트-결합 염소 항-마우스 IgGFc(5㎍/㎖)에 의해 0.05 또는 0.1㎎/㎖(데이터를 0.05㎍/㎖에 대해 나타냄)에서 포획하였다. 인간 PBMC를 10% FBS, 100IU/㎖ rhIL-2와 함께 RPMI를 함유하는 배지에서 1 X 10⁶개의 세포/㎖로 활성화시켰다. 배양물 내 배지를 2 내지 3일마다 보충하였다. -제7일에 세포를 활성화 항체 없이 새로운 플레이트에 옮기고 나서, 총 14 또는 23일동안 2 내지 3일마다 신선한 배지를 보충함으로써 추가로 확장시켰다. 세포 계수 및 유세포 분석을 제0일, 제7일, 제14일 및 제23일에 수행하여 Vδ1 및 Vδ2 T-세포의 백분율 및 수를 결정하였다. 확장 배수는 γδ T-세포의 수를 각각의 웰에서 플레이팅한 출발 PBMC 내 동일한 γδ T-세포 유형의 수로 나눈 것으로 정한다. 도 16은 상이한 공여자로부터의 PBMC로부터의 Vδ1 T-세포의 활성화 및 확장을 도시하는 그래프를 도시한다. MAb TS-1. R9.12 및 TS8.2는 Vδ1 T-세포 집단의 상당한 선택적 성장 및 농축을 유도하였다. Vδ1 T-세포는 400 내지 14,500배로 확장되었고(도 16A, 도 16C) 14일에 총 세포집단의 약 95%를 포함하는 T 림프구 집단의 1.2%로부터 87.0%까지 농축되었다(도 16B). Vδ1 T-세포는 23일에 26,330배(도 16D)만큼 확장되었다.

PBMC로부터의 Vδ2 T-세포의 활성화 및 확장

활성화 항체(TS1, TS8.2, R9.12, B6 및 15D)를 0.25 또는 1㎍/㎖(0.25㎍/㎖에 대한 데이터를 나타냄) 에서 플라스틱 24-웰 플레이트에 직접 고정시키거나 또는 플레이트-결합 염소 항-마우스 IgGFc(5㎍/㎖)에 의해 0.05 또는 0.1㎍/㎖(데이터를 0.05㎍/㎖에 대해 나타냄)에서 포획하였다. 인간 PBMC를 10% FBS, 100IU/㎖ rhIL-2와 함께 RPMI를 함유하는 배지에서 1 X 10⁶개의 세포/㎖로 활성화시켰다. 배양물 내 배지를 2 내지 3일마다 보충하였다. -제7일에 세포를 활성화 항체 없이 새로운 플레이트에 옮기고 나서, 총 14일동안 2 내지 3일마다 신선한 배지를 보충함으로써 추가로 확장시켰다. 도 17은 상이한 공여자로부터 14일 후에 Vδ2 T-세포의 확장 배수 및 백분율을 도시한다. MAb B6 및 15D는 14일에 걸쳐 70배 내지 4,740배의 Vδ2 T-세포 집단의 선택적 확장을 유도하였고(도 17A, 도 17C 및 도 17e) 총 세포 집단의 약 95%를 포함한 T 림프구 집단의 80%까지 δ2 집단을 농축시켰다(도 17B 및 도 17D).

γδ TCR 활성화된 PBMC에서 αβ T-세포의 백분율의 감소

고정된 활성화제를 세포 배양물 웰에서 시험하였다. MAb(TS1, TS8.2, B6 및 15D)를 직접 코팅하거나(1㎍/㎖) 또는 24-웰 플레이트에서 염소-항-마우스 Fc(5㎍/㎖)를 이용하여 포획하였다(0.1㎍/㎖). 인간 PBMC를 10% FBS, 100IU/㎖ rhIL-2와 함께 RPMI를 함유하는 배지에서 1 X 10⁶개의 세포/㎖로 활성화시켰다. 배양물 내 배지를 2 내지 3일마다 보충하였다. -제7일에, 세포를 항체 없이 새로운 플레이트에 옮기고 나서, 제14일까지 2 내지 3일마다 배지를 보충함으로써 추가로 확장시키고, 유세포 분석에 의해 분석하였다. 도 18은 14일 후 T-세포의 확장 배수 및 백분율을 도시한다. MAb TS1, TS8.2, B6 및 15D와 함께 배양시킨 PBMC는 14일의 배양 기간에 걸쳐 92%로부터 9%만큼 낮게 T-세포의 상당한 감소를 야기하였다.

δ1 및 δ2 특이적 항체를 이용하는 활성화는 δ1 및 δ2 T-세포에 대한 집단 배가 시간을 감소시킨다

MAb를 직접 코팅하거나(1㎍/㎖) 또는 24-웰 플레이트에서 염소-항-마우스 Fc(5㎍/㎖)를 이용하여 포획하였다(0.1㎍/㎖). PBMC를 10% FBS 및 100IU/㎖ IL-2를 이용하여 RPMI에서 10⁶개의 세포/㎖로 플레이팅하였다. 세포를 제7일에 항체 없이 새로운 플레이트에 옮기고, 신선한 배지를 이용하여 10⁶개의 세포/㎖로 조절하였다. 항체 없이 배양물을 새로운 플레이트에 옮기고 나서, 제7일에 10⁶개의 세포/㎖로 조절하고, 2 내지 3일마다 신선한 배지로 보충하였다. 결과를 도 19에 도시한다. Vδ1 T-세포 집단 배가 시간은 활성화 세포의 부재 하에서 37시간으로부터 고정된 TS1 항체의 존재 하에서 24시간까지 감소되었다. Vδ2 T-세포 집단 배가 시간은 활성화 항체의 부재 하에서 125시간으로부터 고정된 15D 항체를 이용하여 활성화시켰을 때 27.5시간까지 감소되었다. 알파 베타 T-세포 집단 배가 시간은 γδ TCR 항체 활성화에 의해 상당하게 영향받지 않았다.

TS8.2 및 TS1 항체를 이용하는 활성화는 우세하게 미경험 및 중추 기억 표현형을 초래한다

항체 TS8, R9.12 및 이뮤노510을 1.0㎍/㎖의 농도로 플라스틱 웰에 직접 고정시켰다. 인간 PBMC를 1 X 10⁶개의 세포/㎖로 활성화시키고 나서, 10% FBS, 100IU/㎖ rhIL-2와 함께 RPMI를 함유하는 배지에서 배양시켰다. 배양물 내 배지를 제23일까지 2 내지 3일마다 보충하고 나서, 제0일, 제14일 및 제23일에 유세포 분석에 의해 분석하였다. 도 20은 유세포분석에 의한 CD45RA 및 CD27 발현 분석에 의해 결정하여 제14일 및 제23일에 Vδ1 T-세포의 표현형을 도시한다. 세포의 표현형을 미경험(CD45RA+/CD27+), 중추 기억(TCM, CD45RA-/CD27+), 효과기 기억(TEM, CD45RA-/CD27-) 및 효과기 기억 발현(TEMRA, CD45RA+/CD27-)으로서 정하였다. TS8.2 및 R9.12에 의한 활성화는 43% 내지 63% 미경험 집단 및 23% 내지 27% 중추 기억 집단에 의한 23일 확장 기간에 걸쳐 Vδ1 T-세포 표현형을 유지하였다. 대조적으로, pan-γδ 항체 이뮤노510에 의한 활성화는 47%로부터 8% 내지 33%까지 미경험 Vδ1-T 세포의 감소를 초래하였다.

MICA-Fc에 의한 Vδ1 T-세포 집단의 특이적인 향상된 확장

플레이트-결합 TS8.2 항체(1㎍/㎖) 또는 플레이트-결합 TS8.2 및 MICA-Fc 융합 단백질(각각 1 및 5㎍/㎖)을 이용하여 인간 PBMC를 활성화시켰다. 10% FBS, 100IU/㎖ rhIL-2를 함유하는 RPMI 배지에서 배양물을 확장시켰다. 도 21은 10일 후 세포 확장을 도시한다. TS8.2와 MICA-Fc의 조합은 αβ T-세포 집단 (B)에 대한 효과 없이 TS8.2-단독 대조군(A)에 대해 2배만큼 Vδ1 T-세포 집단의 확장을 향상시켰다.

제대혈로부터의 δ1 및 δ2 T-세포의 특이적 그리고 상당한 활성화

피콜(Ficol)을 이용하는 밀도 구배 원심분리에 의해 인간 제대혈로부터의 단핵 세포를 단리시키고, RPMI, 10% FBS, 100IU/㎖ rhIL-2를 함유하는 배지에서 항체 TS8.2, R9.12, B6 및 15D를 이용하여 활성화시켰다. 도 22는 Vδ1 T-세포가 δ1-특이적 항체를 이용하여 152배까지만큼 확장되고 Vδ2 T-세포는 7일에 걸쳐 δ2-특이적 항체를 이용하여 93배까지만큼 확장되었다는 것을 나타낸다.

실시예 14. γδ TCR MAb의 에피토프 맵핑

γδ TCR 활성화 항체의 에피토프 결합 도메인을 결정하였다. γδ TCR δ1 특이적 활성화 MAb TS8.2, TS1 및 δ2 특이적 활성화 MAb 15D 및 B6의 결합 에피토프를 야생형과 돌연변이된 γδ TCR 짝지어진 쇄의 상이한 조합을 이용하여 ELISA 결합 분석에서 결정하였다. TS1, TS8.2 및 R9.12는 유세포 분석에 의해 검출된 바와 같은 인간 T-백혈병 세포주 BE13 발현 δ1 TCR의 표면에 결합하는 δ1 특이적 MAb이다(데이터 미제시). BE13 TCR 쇄 δ1J1 및 γ8J2를 클로닝하고 나서, δ1 특이적 MAb의 에피토프 맵핑에 대해 사용하였다.

δ 및 γ 쇄의 세포외 V, 다양성 (D), 결합 (J) 및 C 영역 도메인을 함유하는 가용성 TCR 작제물을 클로닝하고 나서, 293 세포의 일시적 형질감염에 의해 발현되는 인간 IgG1 중쇄 융합 γδ TCR-FC 단백질의 힌지 영역, CH2 및 CH3 도메인에 융합시켰다.

δ1 특이적 MAb의 맵핑을 위해, Vδ1J1, Vδ1J2 및 Vδ1J3을 포함하도록 상이한 1 쇄를 발현시켰다. V 및 J 영역에서 돌연변이된 추가적인 Vδ1J1 쇄를 생성하였다. 모든 상이한 δ1 쇄를 BE13 세포주 밖으로 클로닝한 γ8 TCR 쇄와 짝지었고, δ1 특이적 MAb의 결합은 쇄와의 짝짓기에 의해 영향받지 않았다.

상이한 γδ TCR을 293 세포 내로 공동형질감염시키고 나서, 정확하게 조립하고, 정확하게 짝지어진 수용체 쇄로서 분비된, 이황화결합된 이형이량체를 형성할 수 있었다. 모든 γδ T 세포 수용체를 인식하는 B1.1(바이오레전드 #331202), 5E6.E9(써모피셔 사이언티픽 #TCR1061), 11F2(벡크만 쿨터#340884) 및 IMMU510(벡크만 쿨터#IM1349) 항체를 포함하는 항-TCR pan γδ항체를 이용하는 ELISA 결합 분석에 의해 TCR γδ -FC 이형이량체의 정확한 폴딩을 확인하였다.

모든 경우에, 모든 γδ TCR MAb의 결합은 γδ TCR 이형이량체로 제한되었는데, 이는 쇄와 δ1 및 δ2 쇄의 쌍이 적절한 결합 구조에 필수적이라는 것을 나타낸다.

293 세포의 일시적 형질감염 및 키메라 단백질의 생성. 10% 소 태아 혈청으로 보충한 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium: DMEM)에서 239 세포를 성장시켰다. 접착 293 세포를 형질감염 전날에 1X105개의 세포/웰로 24웰 플레이트 상에 플레이팅하고 나서, 37℃(5% CO2)에서 밤새 인큐베이션시켰다. 1㎍의 각각의 TCR γ -Fc 및 TCR δ -FC 플라스미드를 합하였다. 플라스미드 DNA 및 펙틴293 형질감염 시약(써모피셔 사이언티픽 # 12347019)을 5분 동안 무혈청 Opti-MEM 배지에서 희석시킨 후에 실온에서 20 내지 30분 동안 복합체화하였다. 형질감염 혼합물의 전체 용적을 준비한 세포에 적가하였다. 형질감염 293 세포를 48 내지 72시간 동안 37℃(5% CO2)에서 인큐베이션시켰다. 세포 상청액을 형질감염 후 48시간에 수집하였고, ELISA 분석에 의해 선택된 항 인간 γδ TCR 단클론성 항체에 대한 결합에 대해 시험하였다.

샌드위치 ELISA 분석. 세포 배양물 상청액을 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 시험하였다. 분석 플레이트(그레이너(Greiner) 바이오-원(Bio-One) 고결합 마이크로플레이트)를 100㎕의 1㎍/㎖ 염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적 항체(잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch) # 109-005-008)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 플레이트를 200㎕/웰의 차단 완충제(PBS 함유 3% BSA)를 이용하여 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 가용성 γδTCR을 함유하는 상청액을 PBS-트윈(PBS 중의 0.5㎖/ℓ로 트윈)에서 첨가하고 나서, 1시간 동안 실온에서 인큐베이션시킨 후에, 세척하고, 선택된 마우스 항 인간 γδ TCR 특이적 mab와 함께 인큐베이션시켰다. 1시간 동안 차단 완충제 중에서 1: 10,000로 희석시킨 HRP 접합된 염소 항 마우스 FC 특이성(잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈; 페록시다제-어피퓨어(Peroxidase-AffiniPure) 염소 항-마우스 IgG, Fcγ단편 특이적 # 115-035-008)을 이용하여 가용성 γδ TCR의 세트에 대한 γδ TCR mAb의 결합을 검출하였다. 이어서, 플레이트를 세척하고 나서, TMB 시약을 이용하여 진행시켰다. 빅터(Victor) X3 플레이트 판독기(퍼킨 엘머(Perkin Elmer)) 상에서 450㎚ 파장에서 플레이트 상의 색 변화를 측정하였다.

도 23에 나타내는 바와 같이, δ1 쇄가 Vδ1J1 및 Vδ1J2 서열을 포함하지만 Vδ1J3 쇄는 포함하지 않을 때 가용성 TCR에 대한 TS1 및 TS8.2의 결합을 검출하였는데, 이는 TS1 및 TS8.2의 결합이 델타 J3에서 상실된 델타 J1 및 델타 J2 영역에서의 중요한 잔기를 수반하였다는 것을 나타낸다. 데이터는 TS1 및 TS8.2가 δ1J1 및 δ1J2 TCR에 결합하고, R9.12가 δ1J1 δ1J2 및 δ1J3 TCR에 결합하며, J1 및 J2 세그먼트가 TS1 및 TS8.2 결합에 중요한 서열을 함유한다는 것을 나타낸다.

TS8.2 및 TS1 결합에 필수적인 J1/J2 영역 내 중요한 아미노산(들)을 동정하기 위해, 인간 델타 J 영역의 서열 정렬은 J1과 J2 사이에는 공유되지만 J3 서열에서는 상이한 4개의 가능한 잔기 9 J1/J2 잔기 Leu116, Lys120 및 Thr122를 시사한다. δJ1 서열은 선택된 위치에서 J3 서열에 따라 변형되었고; Leu116은 Met로 변형되었으며, Lys 120은 Thr 및 Ala으로 변형되었고, 그리고 Thr122는 Ile으로 대체되었다. Thr에 의한 Lys120의 변화는 TS8.2와 TS1 둘 다의 결합을 없앴지만, R9.12의 결합은 없애지 못하였다. 도 24 및 도 25에 나타내는 바와 같이, 델타 J1 및 델타 J2에서의 위치 120에서 라이신 잔기는 TS-1 및 TS8.2 항체 결합에 중요하다.

TS8.2 및 TS1 결합에 중요한 Vδ1 서열을 추가로 동정하기 위해, 추가적인 돌연변이된 Vδ1 TCR 작제물을 생성하였다. 도 26에서 나타내는 바와 같이, 6개의 돌연변이된 Vδ1 쇄를 작제하였다. 돌연변이는 고도로 상동성인 소 Vδ1S1과 인간 Vδ1 사이의 아미노산 서열 차이(68% 동일성)에 기반하여 설계하였다. 합성 유전자(통합된 DNA 기법)을 이용하여 돌연변이된 Vδ1 쇄를 생성하였다. 가용성 TCRS를 인간 γ8 TCR Fc 쇄와 짝지어진 Vδ1 쇄로서 발현시켰다.

도 27에 나타내는 바와 같이, TS-1 및 TS8.2 항체는 돌연변이된 Vδ1 쇄, Vδ1Mut1 및 Vδ1Mut6 중 2개에 결합하지 못하였다. Vδ1Mut1은 인간 δ1 쇄의 가변 영역의 Gly57 내지 Ala88 영역 사이의 잔기 신장에서 9개 잔기 변화를 나타내고, Vδ1Mut6은 위치 71 및 72에서 2개 잔기의 변화를 나타낸다(도 14에 나타낸 바와 같이 넘버링). Vδ1 MAb R9.12 및 pan δ쇄 불변 MAb 이뮤노510의 결합은 Vδ1에 대한 임의의 변화에 의해 영향받지 않았다. 따라서, J1/J2 영역에서 Lys120와 함께 위치 Arg71 및 Asp72에서의 Vδ1 잔기는 Ts-1 및 TS8.2 MAb 둘 다의 결합에 중요하다.

종합하면, 데이터는 TS-1과 TS8.2 둘 다의 중요한 결합 및 활성화 에피토프가 δ1 쇄의 V 및 J1/J2 영역 내에 위치된다는 것을 나타낸다.

Vδ2 특이적 활성화 MAb 15D 및 B6의 에피토프 맵핑

졸레드론산에 의해 활성화된 δ2 T 세포 집단에 대한 Mab B6 및 15D의 특이적 결합은 유세포 분석에 의해 검출된 반면, δ1TCR을 발현시키는 BE13 세포주에 대해서는 결합이 검출되지 않았다(데이터 미제시). 경쟁 결합 분석 데이터는 또한 B6 및 15D가 서로 경쟁하지 않으며, 상이한 에피토프를 인식한다는 것을 나타내었다.

γδ TCR 쇄 조합. 15D 및 B6 MAb에 대한 에피토프 결합을 동정하기 위해, 상이한 γδ2 TCR 작제물을 생성하였다. Vδ2 쇄를 γ3, γ4, γ8, γ9J1 및 γ9JP FC 융합 쇄를 이용하여 공동 형질감염시켰다. 분비된 δ2 TCR 이형이량체의 정확한 폴딩은 항-TCR PAN γδ항체 IMMU510(벡크만 쿨터 #IM1349)를 이용하고 γ9 특이적 MAb 7A5(써모피셔 사이언티픽 #TCR1720)을 이용하는 ELISA 결합 분석에 의해 확인하였다.

B6의 결합은 δ2 쇄와의 짝짓기를 위해 선택된 쇄에 의해 영향받았다. γ9 J 서열과 상관없이 δ2 쇄가 γ9 쇄와 짝지어질 때 B6의 결합이 검출되었다. γ3δ2 TCR 쌍에 대한 결합은 크게 감소되었고, γ8과 짝지어진 δ2 쇄에 대한 결합은 검출할 수 없었다. 도 28에 나타낸 바와 같이, B6 MAb의 가장 안정화된 결합은 δ2γ9 TCR에 대한 것이다. γ3과 γ8은 둘 다 감마 패밀리 1에 속하며, 서로 높은 서열 상동성(75%)을 공유하고, 감마 2 패밀리의 γ9 구성원은 γ3 및 γ8(대략 20%)과의 낮은 서열 상동성을 공유한다. B6의 높은 결합 친화도는 δ2와 γ9 쇄 둘 다에 대한 잔기와 연루된다. 양성 대조군 MAb는 δ쇄의 불변 영역에 결합하고 모든 γδ TCR, 및 7A5 MAb 9 특이적 MAb를 인식하는 불변 영역에 결합하는 IMMU510 pan γδTCR이었다. B6 MAb의 결합을 δ2γ9 TCR에 대해 검출하였다. B3은 Vγ9 항체이다.

최근에, 인간 및 레서스 γδ2 T 세포는 TCR 유전자 세그먼트의 높은 정도의 생식계열 서열 상동성 및 CDR3 영역의 다양성을 나타내는 것으로 나타났다(Daubenberger CA, et al., J Immunol 2001; 167:6421-30). 15D의 결합에 필요한 중요한 서열을 동정하기 위해, 특정 점 돌연변이가 인간 Vδ2 쇄의 CDR 도메인에 도입하였고, 부위 지정 돌연변이유발에 의해 위치 Gly35(Vδ2 CDR1) Asp65(Vδ2 CDR2) 및 Cys104(Vδ2 CDR3)에서 레서스 원숭이 서열로 대체하였다. 도 29는 인간(IMGT 인간 TRDV2) 및 레서스 원숭이(젠뱅크 AY190028.1) Vδ2 가변 영역의 단백질 서열 정렬을 나타낸다. CDR1(G35S), CDR2 (D65G) 및 CDR3 C104S(도 15에 나타내는 바와 같이 넘버링)에서의 변화가 있었다. Gly으로부터 Ser까지 인간 Vδ2의 CDR1에서 단일 잔기의 대체는 15D에 의한 결합 활성의 완전한 상실을 야기하였다. 도 30에 나타내는 바와 같이, Gly35는 15D의 결합을 위한 중요한 잔기로서 동정하였다. Vδ2의 CDR1, CDR2 및 CDR3에서의 변화는 B6, IMMU510 γδTCR pan MAb 및 7A5 γ9 특이적 Mab의 결합에 영향을 미치지 않았다.

실시예 15. γδ T-세포 활성화 및 확장의 신규한 조절자의 에피토프 맵핑

CD2 에피토프:

CD2 분자는 3개의 주요 면역학적 영역이 기재된 2개의 세포외 면역글로불린 수퍼패밀리 도메인 Ig-유형 V-형 도메인 및 Ig-유사 C-형 도메인으로 이루어진다(Davis et al., Immunol Today 1996; 17: 177-187). 영역 1 및 2는 제1 도메인에 위치되고, 영역 3은 제2 도메인에 위치된다. 영역 1을 인식하는 Mab는 남아있는 그리고 활성화된 T-세포 둘 다에 결합하고, CD2에 대한 CD58의 결합을 강하게 저해할 수 있다. 영역 2를 인식하는 단클론성 항체를 인식하는 단클론성 항체는 CD58 결합을 차단하는 데 효과적이지 않은 유사한 결합 특성을 가진다. 영역 3을 인식하는 단클론성 항체는 활성화된 T-세포 상에서만 CD2를 인식하고, CD58 결합을 차단하지 않는다.

CD2 작용제 MAb의 결합 에피토프의 맵핑은 CD2 및 활성화 분석의 천연 리간드인 CD58에 대해 경쟁적 분석에 의해 행해진다. 추가로, CD58의 결합 상실을 야기하는 중요한 CD2 결합 잔기의 부위 지정 돌연변이유발은 MAb 결합에 대해 시험한다. 돌연변이의 예는 위치 67(K에서 R로), 70(Q에서 K로), 110(Y에서 D로)에서 그리고 위치 111에서(D에서 H로) CD2 서열의 돌연변이유발을 포함한다. CD2의 결합 에피토프의 맵핑을 위한 작제물을 설계하기 위해 VectorNTI(써모 피셔(Thermo Fisher))를 이용하는 인간 및 마우스 CD2의 서열 정렬을 수행한다. 정렬은 인간 내지 마우스 CD2의 50% 서열 상동성을 나타낸다. 인간 CD2의 세포외 도메인에 결합하는 MAb는 마우스 CD2와 교차 반응하는 것으로 예상되지 않는다. 결합 에피토프를 동정하기 위해, 본 발명자들은 마우스/인간 키메라 CD2 작제물의 도메인 교환을 생성한다. 이러한 작제물에서, 인간 N-말단 Ig-유사 V-형 도메인(잔기 25-128)은 CD2의 세포외 도메인을 발현시키는 발현 벡터에서 마우스 잔기(23 내지 121)로 대체된다. 키메라 cDNA 종은 CHO 또는 293 세포로 일시적으로 형질감염된다. 인간 야생형 CD2 및 인간 마우스 키메라 작제물은 CHO 세포 표면 상에서 발현된다. 키메라 CD2 세포-표면 발현은 FACScanto에 의해 분석한다. 키메라 분자에 대한 결합 또는 결합 상실은 유세포분석에 의해 검출하고, 활성화 분석에 의해 입증한다.

NKG2D 에피토프:

NKG2D에 대한 활성화 Mab의 에피토프 맵핑은 그의 리간드(MICA/MICB) 중 하나 이상과의 NKG2D 상호작용을 감소시키거나 또는 차단시키는 항-hNKG2D의 능력에 의해, 또는 hNKG2D 리간드 상호작용을 차단하는 것으로 알려진 항체와의 경쟁에 의해 시험한다. 작용제 MAb는 NK 또는 T-세포의 NKG2D-매개 활성화를 감소시키는 그의 능력에 의해 동정한다. 이는 전형적인 세포독성 분석, 리간드-차단 항체의 첨가에 의해, 또는 용량-의존적 방식으로 MICA-발현 종양 세포의 γδ T-세포 매개 사멸을 차단함으로써 평가할 수 있다.

CD27 에피토프:

CD27에 대한 작용제 항체의 에피토프 맵핑은 기능성 분석 및 인간 CD27은 그의 천연 리간드 인간 CD70 사이의 상호작용을 차단하는 그들의 능력에 의해 행한다. CD27 발현 세포를 30분 동안 5㎍의 MAb와 함께 4℃에서 인큐베이션시키고, 이후에 1㎍의 바이오틴일화된 CD70을 관에 첨가한다. 혼합물을 다른 15분 동안 4℃에서 인큐베이션 시킨 후에 세척하였다. 다음에, 세포를 (CD70 리간드 결합의 결합을 위해) 30분 동안 스트렙타비딘-PE의 혼합물과 함께 인큐베이션시킨 후에 몇몇 세척 단계 및 FACS를 이용하는 분석을 하였다. CD70 결합의 차단은 MAb 및 CD70이 동일한 에피토프를 공유한다는 것을 나타낸다.

실시예 16: 확장된 γδ T-세포의 집단의 TCR Vδ 레퍼토리의 특성규명

개개 공여자로부터의 확장된 γδ T-세포의 클론 다양성은 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 평가한다. 건강한 공여자로부터 신선하게 단리한 PBMC의 클론 다양성은 항-TCR 특이적 항체, 리간드 및 렉틴을 포함하는, 본 명세서에 기재된 상이한 활성화제를 이용하여 7일 및 13일 동안 자극된 배양물의 클론 다양성과 비교한다.

앞서 언급한 γδ T-세포로부터의 RNA를 추출하고, cDNA로 역전사시키고 나서, Vδ1, Vδ2, 및 Vδ3 -특이적 프라이머 쌍을 이용하는 PCR에 의해 증폭시킨다. 500 bp DNA 단편을 증폭시키기 위해 Vδ1 정방향 프라이머(5'ATGCTGTTCTCCAGCCTGCTGTGTGTATTT 3'; 서열번호 1) Vδ2 정방향 프라이머(5'ATGCAGAGGATCTCCTCCCTCATCCATCT 3'; 서열번호 2) 및 Vδ3 정방향 프라이머(5'ATGATTCTTACTGTGGGCTTTAGCTTTTTG 3'; 서열번호 3)를 A Cδ 역방향 프라이머(5'CTTGGGGTAGAATTCCTTCACCAGACAAGC3'; 서열번호 4)와 조합하여 사용하였다.

Vγ2, Vγ3, Vγ4, 및 Vγ5(5' GGTGCTTCTAGCTTTCCTGTCTCCTGC3'(서열번호 10))를 증폭시키기 위해 분리된 RT-PCR 반응에서 γ 쇄를 증폭시켰고, Vγ8(5'ATGCTGTTGGCTCTAGCTCTGCTTCTA3'(서열번호 11)) 및 Vγ9(5'ATGCTGTCACTGCTCCACACATCAACG3'(서열번호 12)) Vγ 프라이머는 Cγ 역방향 프라이머(5'GGAAGAAAAATAGTGGGCTTGGGGGAA3'(서열번호 13))와 짝지었다. γ 역방향 프라이머는 Cγ1 및 Cγ2의 공통 서열을 기반으로 하였다. PCR 단편을 클로닝하고 나서, Vγ 삽입과 독립적인 80개의 뉴클레오타이드 서열을 얻는다. Vδ, Dδ 및 Jδ 병치 서열을 CDR3 서열 정렬과 함께 분석한다.

실시예 17: γδ T-세포의 조작을 위한 MAb 및 관련된 표적화 작제물

인간 CD20 유전자를 cDNA 클론(오리진 테크놀로지즈 인코포레이티드(Origene Technologies, Inc.), 메릴랜드주 20850 락빌 스위트 100 6 태프트 코트에 소재)으로부터 얻는다. 정방향 프라이머 (5' ATGACAACACCCAGAAATTCAGTAAATGG3' (서열번호 14)) 및 역방향 프라이머 (5' TCAAGGAGAGCTGTCATTTTCTATTGGTG3' (서열번호 15))를 이용하여 CD20 유전자를 증폭시키고, 증폭된 CD20 cDNA를 포유류 세포에 대한 고발현 벡터로서 pCDNA3.4 (써모 피셔 사이언티픽) 내로 혼입시키고, 숙주 세포로서 CHO 세포 내로 형질감염시켰다. CD20 분자를 그들의 세포 표면 상에서 고수준으로 발현시키는 재조합 CHO 세포(CD20/CHO 세포)를 FACS 분석에 의해 동정한다.

CD20/CHO 세포를 사용하여 문헌[Jakobovits and Bornstein (Jakobovits Curr. Opin. Biotechnol. 1995 6:561-6; Bornstein et al., Invest New Drugs. 2010 28:561-74.)]에 기재한 바와 같은 완전 인간 항체를 생성하도록 조작한 BALB/C 마우스 또는 유전자이식 마우스를 면역화시킨다. 인간 CD20에 대한 고친화도 및 특이성을 갖는 항체를 FACS 분석에 의해 선별한다. 마우스 항체를 CDR 접합에 의해 인간화한다(Kim and Hong Methods Mol Biol. 2012;907:237-45. 인간 단일 도메인 CD20 항체를 또한 인간 중쇄 단일 도메인 항체를 생성하도록 조작된 마우스 또는 래트로부터 생성한다(Janssens et al., PNAS 2006 vol. 103:15130).

상기 기재한 고친화도/특이성 CD20 항체에 대한 유전자 암호를 MSGV1 레트로바이러스 벡터 골격 또는 pCAG 렌티바이러스 벡터 내로 클로닝시킨다. VH 및 VL 도메인은 선택된 MAb를 발현시키는 마우스 하이브리도마로부터, 또는 인간화된 항체 쇄로부터 클로닝시킨다. γδ T-세포를 본 명세서에 기재된 CD20 MAb를 이용하여 조작한다.

실시예 18: γδ T-세포의 조작을 위한 TCR 작제물

고도로 반응성인 αβ TCR 쇄의 서열을 포함하는 TCR을 발현시키는 작제물을 NY-ESO-1-MHC 특이적 펩타이드 복합체를 발현시키는 T 림프구로부터 단리시킨다. NY-ESO-1-MHC 특이적 펩타이드 복합체는 다양한 NYESO-1-발현 종양에 대해 강한 시험관내 및 생체내 항종양 활성을 유도한다.

고도로 반응성인 αβ TCR 쇄를 흑색종, 육종 환자로부터 또는 인간 흑색종 또는 육종 종양으로부터 유래된 마우스 보유 환자-유래 이종이식편으로부터 단리시킨다. 대안적으로, TCR은 NY-ESO-1 펩타이드 또는 NYESO-1-펩타이드 복합체를 발현시키는 인간화된 면역계를 갖도록 변경된 마우스로부터 유래된다(문헌[Gonzales et al., Immunol Res. 2013 57: 326-334; Boucherma etal., J Immuno. 2013. 191; 583-593; Liang-PingL. Et al., Nature Med. 2010, 16:1029-1035] 참조). 우성 클래스 I 대립유전자 HLA-A*02 (예를 들어, 펩타이드 SLLMWITQC 잔기 157-167(서열번호 16)) 및 우성 HLA-A*01-관련 펩타이드와 관련하여 NY-ESO-1의 에피토프를 인식하는 T-세포를 동정한다.

TCRα 및 TCRβ전사체의 서열은 제조업자의 제안에 따라 1단계 RT-PCR 키트(독일에 소재한 퀴아젠 힐덴(Qiagen Hilden))를 이용하여 역전사-중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)에 의해 생성한다. 제1 가닥 cDNA를 반응성 T-세포로부터 단리한 RNA로부터 생성한다. 총 RNA를 CTL 클론으로부터의 TRIzol 총 RNA 단리 시약(인비트로젠 라이프 테크놀로지즈(Invitrogen Life Technologies))로 추출한다. 아미노산 위치 34 및 35(카바트 넘버링)에서 트립토판-타이로신 잔기 주변에 집중된 TCR α 및 β쇄 V 영역의 고도로 보존된 영역에 결합할 수 있고 α 및 β불변 영역 역방향 프라이머와 조합하여 사용하는 축퇴 프라이머 세트에 의해 TCR α 및 β쇄의 증폭을 행한다(Moonka and Loh Journal of Immunological Methods 169 (1994) 41-51). 증폭된 PCR 단편을 겔 정제하고 나서, 직접 서열분석한다. 서열 정보를 사용하여 개개 전장 cDNA의 클로닝에 적합한 PCR 프라이머를 설계한다.

TCR 유전자를 클로닝하고 나서, MSGV-기반 레트로바이러스 벡터 및 선택된 T 세포로부터 증폭된 전장 cDNA 내로 삽입한다. 야생형 NY-ESO-1-반응성 인간 TCR의 α쇄와 β쇄를 둘 다 암호화하는 레트로바이러스 벡터는 MSGV1 골격을 이용하여 작제한다. TCRα 및 TCRβ쇄의 연결은 하나의 작제물에서 내부 리보솜 유입 부위(IRES) 요소를 통해, 또는 절단 가능한 피코로바이러스 펩타이드 서열을 이용하는 분리에 의해 행한다.

각각의 MSGV1 TCR 벡터 및 앞서 기재한 바와 같은 리포펙타민 2000(인비트로젠)을 이용하거나 또는 뉴클레오펙터(Nucleofector)(론자(Lonza))를 이용하는 전기천공에 의해 내인성 바이러스 레트로바이러스 외피 단백질을 암호화하는 벡터를 이용하여 MMLV gag 및 pol 단백질을 안정하게 발현시킨 293 세포를 공동형질감염시킴으로써 레트로바이러스 상청액을 생성한다. 형질감염후 제2일 및 제3일에 상청액을 수집하고 나서, 10% FCS를 함유하는 신선한 DMEM을 이용하여 1:1로 희석시켰다. 조작된 γδ T-세포는 임의의 추가적인 조작 없이 TCR α 및 β 쇄를 암호화하는 유전자를 적절하게 발현시킬 수 있다.

실시예 19. αβ TCR 작제물을 이용하는 γδ T-세포의 조작

αβ TCR (종양 인식 모이어티)을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 표준 기법을 이용하는 목적으로 하는 항원에 특이적인 것으로 선택되는 T-세포로부터 클로닝시킨다. 단리된 내인성 야생형 γδ T-세포는 종양 인식 모이어티를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스를 이용하는 감염 전에 적어도 6 × 10⁶개의 세포로 이전의 예에 기재된 방법을 이용하여 성장시킨다. 야생형 γδ T-세포 내로 벡터 시스템을 도입하기 위해 바이러스 감염을 위한 표준 프로토콜을 사용할 수 있다. 선택 마커의 발현을 사용하여 성공적으로 형질감염된 세포를 선택한다.

조작된 αβ TCR의 발현을 유세포 분석에 의해 그리고/또는 정량적 QRT-PCR에 의해 그리고 세포독성 및 사이토카인 분비에 대해 표적 세포를 이용하는 기능성 분석에 의해 평가할 수 있다. 조작된 활성화 도메인의 발현을 또한 유세포분석에 의해 그리고/또는 정량적 qRT-PCR에 의해 평가할 수 있다. 관심 대상의 세포 표면 마커를 발현시키는 조작된 γδ T-세포의 수를 유세포분석에 의해 결정한다. 조작된 γδ T-세포는 본 명세서에 기재된 적합한 방법, 예컨대 CRISPR-Cas, talen, 메가뉴클레아제, 아연 핑거, 또는 잠자는 숲속의 미녀 트랜스포존 기법을 이용하여 추가로 조작되어 HLA 유전자 또는 β2M 유전자와 관련된 엑손을 결실시킨다.

실시예 20: CAR 및 TCR 작제물을 이용하는 γδ T-세포 조작

종양 세포를 특이적으로 인식하고 그를 사멸시키도록 활성화된 조작된 γδ T-세포를 보낼 수 있는 표적화 모이어티를 발현시키기 위한 레트로- 또는 렌티-바이러스 기반 벡터를 이용하여 γδ T-세포를 형질도입한다. 형질도입 표적화 모이어티는 종양-특이적 표면 단백질 또는 종양-특이적 세포내 펩타이드로 향하는 MAb를 포함한다. γδ T-세포는 또한 펩타이드-MHC 복합체로 향하는 고친화도 TCR을 이용하여 조작한다.

대안적으로, 세포는 비바이러스 벡터를 이용하는 형질도입을 통해 조작할 수 있다.

실시예 21: 표적화 모이어티를 이용하는 단리된 γδ T-세포의 조작

CAR 작제물 설계는 상이한 주요 기능성 도메인, 단백질을 인식하는 표적 모이어티 또는 종양 세포 상에 나타난 관심 대상의 MHC 관련 펩타이드, 세포막을 가로지르로 세포내 활성화 신호전달 도메인에 연결되는, 막관통 도메인에 세포외 수용체 표적화 요소를 연결시키는 짧은 스페이서를 포함한다.

γδ T-세포 표면 상에서 발현되는 표적 모이어티 수용체는 암세포 상에서 발현되는 표적 단백질에 특이적으로 결합하도록 설계될 것이다. 종양 인식 모이어티는 CD19, CD20, CD22, CD37, CD38, CD56, CD33, CD30, CD138, 　CD123, CD79b, CD70,　 CD75, CA6, GD2, 알파태아단백질 (AFP), 암배 항원(CEA), CEACAM5, CA-125, MUC-16, 5T4, NaPi2b, ROR1, ROR2, 5T4, 　PLIF, Her2/Neu, EGFRvIII, GPMNB, LIV-1, 당지질F77, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), PSMA, STEAP-1, STEAP-2, 메소텔린, c-Met, CSPG4, PVRL-4, VEGFR2,　 PSCA, 엽산 결합 단백질/수용체, SLC44A4, Cripto, CTAG1B, AXL, IL-13Rα2, IL-3R, 및 SLTRK6을 포함하는 표적에 대해 설계할 것이다.

표적 모이어티 수용체는 종양 세포 상에서 발현된 종양 당단백질에 특이적인 항체의 일부로부터 유래될 수 있거나 또는 대안적으로 조작된 수용체는 알려진 특이성을 갖는 TCR 수용체 또는 gp100,　 MART1, 타이로시나제, SSX2, SSX4, NYESO-1, 상피 종양 항원(ETA), MAGEA 패밀리 유전자(예컨대 MAGEA3. MAGEA4), KKLC1, 돌연변이된 N, 및 K 및 H ras, BRaf, p53,　 MHC 클래스 I 쇄-관련 분자 A(MICA), MHC 클래스 I 쇄-관련 분자 B(MICB), 또는 HPV, EBV 또는 CMV 중 하나 이상의 항원을 포함하는 MHC 복합체와 관련된 표면 상에 제시된 세포내 종양 특이적 항원으로부터 유래된 특이적 펩타이드 서열을 인식하는 항체로부터 유래될 수 있다. 이러한 고친화도 T-세포 수용체 유사 종양 인식 모이어티는 높은 정도의 특이성을 갖는 펩타이드-MHC 복합체를 인식할 것이다.

실시예 22: 스페이서 및 막관통 도메인을 갖는 표적화 모이어티 작제물

암세포에 대한 조작된 T-세포의 효능을 최적화하기 위해 종양 인식 모이어티 작제물 내로 상이한 스페이서를 조작할 것이다. 각각의 스페이서의 크기는 표적 단백질의 크기, 수용체에 의해 인식되는 에피토프, 조작된 종양 인식 모이어티의 크기 및 수용체의 친화도에 따라 다를 것이다. 인간 IgG, CD8a 및 CD4 힌지 영역의 서열을 포함하는 입체배좌적 변화를 수용할 수 있는 스페이서.

시험한 스페이서는 개선된 결합 친화도 특성을 갖는 키메라 수용체를 제공하기 위해 상이한 길이(19 내지 9개의 잔기)로 사용되는 Gly, Ser 및 Thr 아미노산으로 이루어진다. 각각의 작제물의 힌지 및 막관통 부분은 CD8a 서열(인간 CD8a의 잔기 117 내지 178) 또는 대안적으로 CD28 막관통 도메인을 갖는 인간 IgG1 힌지-Fc cDNA(잔기 153 내지 179)로부터 유래된다.

실시예 23: 공자극 도메인을 갖는 표적화 모이어티 작제물

상이한 공자극 도메인은 종양 인식 모이어티를 포함하는 작제물 내로 조작할 것이다. CD28, 4-1BB, CD2, CD27, NKG2D, DAP10, DAP12, CD161, CD30, JAML, TLR, CD244 또는 CD100 공자극 신호전달 도메인을 포함하는 공자극 도메인은 키메라 수용체를 통해 활성화를 증폭시켜 암세포를 증식시키고 사멸시키는 더 강한 신호를 야기하는 "제2 신호"를 모방하는 γδ T-세포 내로 조작된다.

세포질 영역은 CD28 (잔기 180-220), CD137 (잔기 214-255), ICOS (잔기 165-199) CD27 (잔기 213-260) NKG2D (잔기 1-51), JAML (잔기 297 - 394) CD2 (잔기 236 - 351), CD30 (잔기 408 - 595) OX40 (잔기 1 - 23), HVEM (잔기 224 - 283) 또는 CD46 분자를 포함하는 αβ 및/또는 γδ T-세포 공자극 분자의 엔도도메인으로부터 유래된다. 최적의 작제물은 유도된 세포 세포독성에 대해 조작된 γδ T-세포 집단의 활성화 정도에 기반하여 그리고 시험관내 및 생체내 사이토카인 분비 정도에 기반하여 선택된다.

실시예 24: CD3ζ 활성화 도메인을 포함하는 표적화 모이어티

3개의 ITAM 도메인(ITAM1: APAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKR(서열번호 5); ITAM 2: PQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGM(서열번호 6); 및 ITAM3: ERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQ(서열번호 7)를 함유하는 세포내 CD3ζ(잔기 52-164)을 클로닝시켰다.

프라이머 5' AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCA -3'(서열번호 8) 및 역방향 프라이머 5' CTCGAGTGGCTGTTAGCCAGA-3'(서열번호 9)을 이용하여 TCRζ의 세포내 도메인을 증폭시켰다.

다단계 중복 연장 PCR에 의해 CAR 작제물을 생성한다. 백금 태그 DNA 중합효소 고충실도 키트(인비트로젠)로 꼬리를 붙인 프라이머에 의해, 중복 연장 중합효소 연쇄 반응 프로토콜을 이용하여 유도된 별개의 PCR 반응에서 산물을 융합시키고, 전장 작제물을 암호화하는 DNA를 MSGV1 레트로바이러스 벡터 내로 결찰시켰다. 작제물은 CD3ζ 활성화 도메인을 포함하는 CAR 표적화 모이어티를 제공한다.

실시예 25: 1개 초과의 인식 모이어티를 이용하는 γδ T-세포의 조작

동일한 세포내 종양-특이적 단백질로 향하는 TCR 및 MAb를 포함하는 종양 인식 모이어티를 포함하는 1개 초과의 작제물을 이용하여 γδ T-세포를 형질도입한다. 각각의 작제물은 상이한 MHC 단상형, 예컨대 A2 및 A1, 동일한 종양 세포 상에서 발현되는 상이한 표적으로 향하는 항체 또는 동일한 표적 상에서 상이한 에피토프로 향하는 항체와 관련하여 특정 펩타이드를 인식하도록 선택한다.

실시예 26. 조작된 γδ T-세포의 시험관내 확장

조작된 γδ T-세포를 적절한 조직 배양 배지, 예컨대 이전의 예에 기재된 조직 배양 배지를 이용하여 성장 및 확장시킨다. 조작된 γδ T-세포를 외부 항원에 의한 자극에 의해 또는 자극 없이 그리고 APC 또는 아미노포스페이트와의 공동 배양 없이 37℃에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 1 x 10⁶개까지 기하급수적으로 성장시킨다.

실시예 27: 활성화된 조작 및 비조작 γδ T-세포에 의해 방출된 사이토카인의 기능적 특성규명

IFN-γTNF-α(알앤디 시스템즈(R&D Systems)), IL-1βIL-2(바이오소스 인터내셔날(Biosource International)), IL-12(다이아클론 리서치(Diaclone Research)), IL-6 및 IL-18의 발현을 상업적 효소-연결 면역흡착 분석(ELISA) 키트를 이용하여 측정할 것이다. 효소-연결 면역흡착 분석을 제조업자의 설명서에 따라 수행할 것이다. 사이토카인의 양을 0.05 M 중탄산나트륨 완충제 중에서 1㎍/㎖의 농도로 밤새 4℃에서 인간 사이토카인에 대해 단클론성 마우스 IgG1로 코팅된 폴리스타이렌 96-웰 플레이트(막시솝(Maxisorb), 눈크)에서 상이한 시점(24 내지 72시간)에 측정할 것이다. 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS를 이용하는 세척 후에, 플레이트를 PBST 중의 3% 소혈청 알부민(시그마에 소재한 BSA, wt/vol)을 이용하여 1시간 동안 37℃에서 차단시킬 것이다. 표준(알앤디로부터의 재조합 인간 사이토카인) 및 γδ배양물 샘플로부터의 상청액을 첨가하고 나서, 플레이트를 RT에서 2시간 동안 인큐베이션시킬 것이다. 재조합 인간 사이토카인 표준과 관련하여 매칭된 항체 쌍을 이용하여 검출을 수행한다.

실시예 28. 공자극제의 동정

전체 PBMC 또는 농축 조작된 그리고 비-조작된 γδ T-세포 집단에 공자극제를 첨가함으로써 조작된 그리고 비조작된 γδ T-세포의 활성화, 확장 및 생존도를 지원하기 위한 상이한 공자극제의 능력을 시험하였다. 공자극제는 항 γδ TCR 특이적 MAb를 포함하는 상이한 활성화제에 가용성 또는 고정된 형태로 첨가한다. CD2, CD27, CD28, CD30, CD137, ICOS, CD161, CD122, CD244, 및 NKG2D에 대한 가용성 또는 고정된 작용성 항체, 또는 CD70-FC(CD27에 대한 리간드) MICA, MICB 및 ULBP(NKG2D에 대한 리간드), 4-1BB (CD137에 대한 리간드) 및 Pilar 9(ligand to CD161에 대한 리간드)를 포함하는 자극 리간드의 존재 또는 부재 하에서 2 내지 10 ㎍의 항 γδ TCR 항체와 함께 24-웰 편평 바닥 조직 내 100IU/㎖ rhIl-2로 보충한 1㎖의 완전 RPMI-1640 배지에서 앞의 실시예에 기재한 바와 같은 건강한 공여자의 연층으로부터 정제한 인간 PBMC 또는 조직으로부터 단리시킨 림프구를 2 X 10⁶개로 플레이팅시킨다.

실시예 29. 사이토카인 지원 활성화

전체 PBMC 또는 농축 조작된 그리고 비-조작된 γδ T-세포 집단에 사이토카인을 첨가함으로써 조작된 그리고 비조작된 γδ T-세포의 활성화, 확장 및 생존도를 지원하기 위한 상이한 사이토카인의 능력을 시험하였다. 사이토카인 활성화 지원을 시험하기 위해, 다양한 사이토카인을 100IU/㎖로 3일마다 별개의 세포 배양물에 개별적으로 첨가한다. 시험한 사이토카인은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-33, IL-21, IL-18, IL-19, IL-4, IL-9, IL-23, IFN-γ및 IL1β를 포함한다. 선택 시험 기간의 종료 후에, 세포의 샘플을 채취하고 나서, 세포 집단의 조성, 즉, γδ T-세포, αβ T-세포, B-세포 및 NK 세포의 백분율을 유세포분석에 의해 결정한다.

세포를 배양물 내에서 유지하고 나서, 선택 집단의 확장을 제14일 및 제21일에 시험한다.

실시예 30: 활성화-유래 Vδ1+ Vδ2+ T 세포 집단은 종양 세포에 대해 세포독성이다

본 발명의 선택적으로 활성화된, 농축된 δ1 및 δ2 T-세포 집단의 세포독성을 결정하기 위해, 피콜 파크 플러스(Ficoll paque PLUS)(GE 헬스케어(GE Healthcare) #17-1440-02) 밀도 구배 원심분리를 이용하여 정상 공여자로부터 얻은 연층으로부터 PBMC를 단리시키고, R2 배지(페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민 및 100IU/㎖의 인간 재조합 IL2로 보충한 RPMI1640 중의 10% 소 태아 혈청)에서 1×106개의 세포/㎖로 24-웰 플레이트에서 플레이팅하였다.

제0일에, PBMC 집단 내에서 γδ 세포를 활성화시키기 위해 1㎍/㎖의 δ1 특이적 MAb(TS1, TS8.2) 또는 δ2 특이적 MAb(15D, B6) 중 하나로 코팅한 웰 상에서 세포를 플레이팅하였다. 제3일 및 제5일에 50% 배지 교환을 수행하였다. 제7일에, 활성화 세포를 임의의 MAb 코팅 없이 6-웰 배양물 접시로 이동하고, 제14일까지 대략 1×10⁶개의 세포/㎖로 확장시키고 유지하였다.

추가로 Vδ1+ 및 Vδ2+ 활성화된 T 세포 배양물에, αβ T 세포를 양성으로 선택하고, 항-마우스 IgG 마이크로비즈(MicroBeads)(밀테니(Miltenyi) # 130-048-401)에 결합된 IP26 단클론성 항체(Biolegend #306702)를 이용하여 δ1 및 δ2 활성화 배양물로부터 고갈시켰다. 이는 도 31에 나타나는 바와 같은 고도로 농축된 Vδ1+ 및 Vδ2+ T 세포 집단을 야기하였다. 양성 선택된 αβ T 세포를 또한 수집하였다(농축된 αβ). 이들 농축된 Vδ1+, Vδ2+ 및 αβ T 세포 배양물을 제22일까지 R2 배지에서 유지하였다.

제22일에, 농축 배양물의 γδ 및 αβ T 세포 조성을, δ1, δ2 및 αβ 각각에 대해 TS8.2, B6 및 IP26 항체를 이용하는 유세포분석 표면 TCR에 의해 결정하였다. 고도로 농축된 배양물은 각각 92%, 98% 및 99%의 Vδ1+(TS8.2+), Vδ2+ (B6+) 및 αβ(IP26+) T 세포를 함유하였다.

Vδ1+, Vδ2+ 및 αβ T 세포 집단을 이용하는 시험관내 세포독성 분석

Vδ1+, Vδ2+ 및 αβ T 세포 배양물의 세포 독성을 평가하기 위해, 효과기 세포를 6시간 동안 표적 세포주와 10:1 비로 인큐베이션시켰다. 이 시험에서 시험한 표적 세포주는 고형 종양 세포주 BxPc3(ATCC(등록상표)CRL-1687(상표명)) 췌장 선암종 및 SK-MEL-5(ATCC(등록상표) HTB-70(상표명)) 인간 흑색종뿐만 아니라 혈액학적 B 종양 세포주 RPMI 8226(ATCC(등록상표) CCL-155(상표명))을 포함하였다. 사이토톡스 글로(CytoTox Glo)시약(프로메가 카탈로그 번호)를 이용하여 세포사를 측정하였다. 다음의 식을 이용하여 특정 용해%를 계산하였다:

고도로 농축한 Vδ1+, Vδ2+ 및 αβ T 세포 배양물을 BxPC3, SKMEL5 및 RPMI8226 세포주의 사멸에 대해 시험하였다. 도 32에 나타내는 바와 같이, Vδ1+ T 세포는 상피 종양 세포주 BxPC3 및 SKMEL5뿐만 아니라 형질세포종 세포주 RPMI8226의 사멸을 나타낸다. (도 32A) 한편으로 Vδ2+ T 세포는 대부분 RPMI8226에 대해 효능을 나타내며 고형 종양 세포주에 대해 덜 효과적이었다. αβ T 세포는 임의의 세포독성 활성을 나타내지 않는다.

실시예 31: 시험관내 확장된 γδ T-세포의 항-종양 활성

다양한 종양 세포주 및 1차 종양 세포에 대한 세포독성 활성을 1:1 내지 40:1의 표적비로 효과기에서 시험한다. 종양 세포주 및 1차 종양 세포의 용해는 세포내 효소 젖산 탈수소효소의 방출을 검출함으로써 측정한다. 배양물 내 조작된 종양 인식 모이어티를 발현시키는 γδ T-세포의 백분율을 유세포분석, ELISA 및/또는 ELISPOT 분석에 의해 측정한다.

실시예 32: 생체내 항 종양 활성

인간 종양 이종이식편을 생착시킨 면역-결핍 마우스, 또는 huPBMC-NOG(타코닉(Taconic)) 마우스, 또는 상기 기재한 인간화된 면역계를 갖는 마우스의 코호트에 환자-유래 종양으로부터 유래된 세포 또는 결장, 유방, 난소, 신장, 두경부, 전립선, 방광, 구강, 췌장 및 간의 암을 포함하는 종양 세포주를 피하로 또는 정위로 주사하고 나서, 평균 크기가 50 내지 100㎣에 도달하도록 허용하였다. 미경험 또는 조작된 농축 또는 단리된 γδ T-세포는 마우스에 정맥내로 주사하거나 또는 다양한 용량으로 종양 내로 직접 주사한다. 종양 퇴행을 γδ T-세포 투약 후에 종양 용적의 감소로서 정의하며, 특정 적응증에 대한 비치료 및 표준 치료와 비교하였다. 일부 실험에서, 미경험 또는 조작된 γδ T-세포를 GFP 또는 루시퍼라제로 표지하고 나서, 그들의 지속성 및 귀소에 따르도록 종양-보유 마우스에 주사한다. 연구의 종료 시, 종양을 채취하고 나서, GFP 양성 세포를 유세포분석 및 면역조직화학에 의해 분석하였다.

실시예 33. 항체 특이적 활성화로부터 유래된 Vδ1 및 Vδ2 집단의 다클론성 TCR 다양성

TCR 쇄를 증폭시키고 나서, TS8.2 및 B6 활성화 집단 밖으로 클로닝시켰다. δ1 특이적 활성화 mAb TS8.2 및 δ2 특이적 MAb B6를 이용하는 특이적 활성화의 14일 후에 PBMC 배양물을 채취하였다. PBMC 배양물을 350㎕ RLT 완충제(퀴아젠) 중에 용해시키고 나서, 총 RNA를 제조업자의 설명서에 따라서 퀴아젠 RNeasy 미니 키트(퀴아젠, 카탈로그 번호 74106)를 이용하여 5X10⁵개의 세포로부터 정제하였다. 간략하게, 350㎕의 70% 에탄올을 세포 용해물에 첨가하여, 이상적인 결합 조건을 제공하였다. 이어서, 용해물을 RNeasy 실리카 막 스핀 칼럼 상에 장입하였다. 오염물질을 세척하였다. 농축된 RNA를 50㎕ 물 중에 용리시켰다.

1 단계 RT PCR: 전당 델타쇄를 3' 인간 Cδ(5' TTACAAGAAAAATAACTTGGCAGTCAAGAGAAA 3') 프라이머와 조합한, 5' δ1(5' GCCCAGAAGGTTACTCAAGCCCAGTC3') 및 5' δ2(5' GCCATTGAGTTGGTGCCTGAACACC 3') 프라이머를 이용하여 증폭시켰다. 전장 델타쇄의 800 bp PCR 단편을 pCI 발현 벡터(프로메가 카탈로그 번호 E1841) 내로 클로닝시켰다. 유사하게, 전장 감마쇄를 단일 3' C감마 프라이머(5' GGAAGAAAAATAGTGGGCTTGGGGGAA 3')와 조합한 5' 프라이머 γ2,γ3, γ4(5' TCTTCCAACTTGGAAGGGAGAACGAAGTC 3') γ5(5' TCTTCCAACTTGGAAGGGGGAACGA 3'), γ8(5' TCTTCCAACTTGGAAGGGAGAACAAAGTC 3') γ9(5' GCAGGTCACCTAGAGCAACCTCAAATTTCC 3')를 이용하여 증폭시켰다.

역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용하여 100 ng 총 RNA로부터 델타 및 감마 전사체를 증폭시켰다. TS8.2 MAb(δ1, γ2-γ4, γ5, γ8 및 γ9)를 이용하여 활성화시킨 각각의 샘플에 대해 총 5회의 RT-PCR 반응을 실행하였고, B6 MAb(δ2, 및 γ9)로 활성화시킨 각각의 샘플에 대해 2회의 RT-PCR 반응을 실행하였다. 퀴아젠 1단계 RT-PCR 키트를 증폭(퀴아젠 인코포레이티드)을 위해 사용하였다. 이 키트는 센시스크립트(Sensiscript) 및 옴니스크립트(Omniscript) 역전사효소, 핫스타 태그(HotStarTaq) DNA 중합효소, dNTP 혼합물, 완충제 및 Q-용액, "어려운"(예를 들어, GC-풍부) 주형의 효율적인 증폭을 가능하게 하는 신규한 첨가제의 배합물을 제공한다. 5㎕의 RNA, 델타 또는 감마 쇄 프라이머(IDT에 의해 합성된 상품 이용)의 0.5의 100μM, 5㎕의 5×RT-PCR 완충제, 1㎕ dNTP, 역전사효소 및 DNA 중합효소를 함유하는 1㎕의 효소 혼합물, 및 0.4㎕의 리보뉴클레아제 저해제 RNasin(1 단위)을 포함하는 반응 혼합물을 준비하였다. 반응 혼합물은 역전사와 PCR 둘 다에 필요한 시약 모두를 함유한다. 열 순환 프로그램은 실온에서 30분 동안 50℃, 15분 동안 95℃ 단계 다음에 30 주기(30초 동안 95℃, 30초 동안 48℃, 1.0분 동안 72℃)였다. 이어서, 72℃에서 1.0분 동안 최종 인큐베이션시켰다. 추출된 PCR 산물을 pCI 발현 벡터 내로 직접 클로닝시켰다. 가장 높은 서열 상동성을 갖는 생식계열 V, D 및 J 유전자 구성원을 동정하기 위해 IMGT를 이용하여 뉴클레오타이드 서열을 분석하였다.

TS8.2 CDR3에 의해 활성화된 V1쇄 서열의 예(접합 다양성을 볼드체 텍스트로 표시함):

TS8.2 Mab에 의해 활성화된 감마쇄의 예:

실시예 34. 추가 가공을 위해 세포 은행을 생성하기 위한 냉동 배지 내 γδ T-세포의 동결보존

비변형 γδ T-세포를 냉동 배지에서 제형화하고, 장기간 저장 동안 액체 질소 냉동기(-195℃) 또는 초저온 냉동기(-65℃, -80℃ 또는 -120℃)와 같은 극저온 저장 장치에 넣을 것이다. 냉동 배지는 6.5 내지 7.5 범위의 생리적 pH 완충제와 함께 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 염화나트륨(NaCl), 덱스트로스, 황산덱스트란 또는 하이드록시에틸 전분(HES)을 함유할 것이다.

초저온 보존된 γδ T-세포는 해동될 수 있고, 항체, 단백질, 펩타이드 및 사이토카인을 이용하는 자극에 의해 추가로 가공될 것이다. 저온보존된 γδ T-세포를 해동시키고, 본 출원에 앞서 기재한 바와 같이 유전자 변형시킬 것이다. 조작된 γδ T-세포를 냉동 배지에서 ㎖ 당 10⁶ 내지 10⁸개 세포로 10, 100, 200개 바이알의 양으로 세포 은행을 생성하도록 추가로 저온보존할 것이다. 비-조작된 및/또는 조작된 γδ T-세포를 냉동 배지에서 ㎖ 당 10⁶ 내지 10⁸개의 세포로 10, 100, 200, 500 및 1,000개 바이알의 양으로 세포 은행을 생성하도록 추가로 저온보존할 것이다.

실시예 35. 추가 가공을 위해 세포 은행을 생성하기 위한 냉동 배지 내 γδ T-세포의 대안의 동결보존

냉동 및 해동 과정 동안 용해에 대해 영양적 지원 및 생물물리적 세포 보호를 제공하기 위해 앞의 실시예에 기재한 동결보존 지원에 다른 동결보호제를 첨가한다. 이들은 D-글루코스, 만니톨, 수크로스, 아데닌, 구아노신, 재조합 인간 알부민, 시트레이트, 항응고제, 벤조나제, DNase, 프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 2-메틸-2,4-펜탄다이올을 포함한다. 높은 세포 밀도 냉동 산물에 대해 완충 능력을 제공하도록 설계된 추가적인 첨가제는 무기 인산염, 중탄산나트륨 및 HEPES를 포함한다.

실시예 36. 추가 가공을 위해 세포 은행을 생성하기 위한 냉동 배지 내 γδ T-세포의 동결보존

제어된 속도 냉동기(예를 들어, CryoMed 제어된 속도 냉동기) 또는 목적으로 하는 냉동 속도를 전달하기 위한 적절하게 절연된 래킹(racking) 시스템을 이용하는 기계적 -70℃ 냉동기를 이용하여 분 당 -0.1℃ 내지 -5℃의 냉동 속도를 달성하도록 설계된 온도 제어 램프에서 γδ T-세포의 초기 냉동을 수행한다. 냉동 세포를 30 내지 60일까지 단기간 저장 동안 -70℃ 냉동기에 둔다. 냉동 세포를 12, 24, 36 및 48개월까지 더 장기간의 저장을 위해 액체 N₂ 저장 탱크에 넣는 한편, 앞 부문에 기재한 방법에 의해 측정한 바와 같이 악화 없이 γδ T-세포 수 및 세포 기능을 유지한다.

본 실시예에 기재한 저온보존된 세포를 해동시키고, 추가로 자극하고 나서, 대상체에 대한 투여를 위해 적합한 양의 조작된 γδ T-세포를 생성하도록 세포 배양물 백 및/또는 생물반응기와 같은 적합한 폐쇄 용기에서 확장시켰다.

실시예 37. 환자 내로 직접 주입을 위한 γδ T-세포의 제형

조작된 γδ T-세포를 동결 방지용 부형제를 함유하는 생리적 완충제 중에서 5 x 10⁶개의 세포/㎖ 내지 10⁸개의 세포/㎖로 원심분리 및/또는 막 정용여과에 의해 농축시키고, 장기간 저장 동안 액체 질소, 또는 초저온 냉동기와 같은 극저온 저장 장치에 두었다.

실시예 38. 암에 걸린 인간 대상체의 치료

신선한 또는 냉동 조작된 그리고/또는 비-조작된 γδ T-세포를 침대옆에서 해동시키고 나서, 인간 대상체에게 정맥내로 주입한다. 약 1개의 세포/kg 내지 약 1 x 10¹⁰개의 세포/kg의 조작된 그리고/또는 비-조작된 γδ T-세포를 30 내지 60분의 시간 기간에 걸쳐 인간 대상체에 주입한다. 공자극 사이토카인 IL-2 또는 다른 사이토카인의 도움으로 또는 도움 없이 조작된 γδ T-세포를 투여한다. 선택적으로, 절차를 반복한다. 대상체에서 γδ T-세포의 생체내 확장을 유세포분석에 의해 측정한다.

실시예 39. 특정 γδ T 세포 활성체의 생성

뮤린 항체의 형태로 γδ T 세포 활성체를 재조합 가용성 인간 γδ TCR의 면역화에 의해 생성하였다. δ1-특이적 활성체를 γ8δ1 TCR- FC를 이용하는 면역화에 의해 생성하고, 그리고 δ2-특이적 활성체를 γ9δ2 TCR- FC를 이용하는 면역화에 의해 생성하였으며, 작제물 둘 다 인간 IgG1FC에 융합된 γδ TCR 쇄의 성숙 ECD를 포함한다. 마우스의 3가지 균주(Balb/c, CD-1 및 FVB)를 고친화도, 뮤린 단클론성 항체 활성체를 분비하는 하이브리도마를 제공하기 위해 인간 재조합 γδTCR로 접종하였다.

hγδTCR-Fc 융합 작제물을 PCR 증폭에 의해 생성하였다. γ8δ1 TCR 쇄를 BE13으로부터 단리시킨 RNA(DSMZ #ACC 396), 즉, γ8δ1 TCR을 발현시키는 T 세포 백혈병 세포주로부터 증폭시켰다. γ9δ2 TCR 쇄를 졸레드론산 활성화된 인간 PBMC로부터 단리시킨 RNA로부터 증폭시켰다. 가용성 δ1TCR-FC 및 δ2TCR-FC를 일시적으로 형질감염된 HEK 293 세포의 상청액으로부터 정제하였다. 10㎍의 가용성 TCR을 동일 용적의 TITERMAX(등록상표) 골드(Gold)(시그마 알드리치(Sigma Aldrich)) 또는 임제트 알룸 애주번트(Imject Alum Adjuvant)(써모 피셔)를 이용하여 유화시키고, 각각의 마우스의 면역화를 위해 사용하였다. 이어서, 얻어진 에멀션을 발바닥 경로를 통해 6마리 마우스(각각 2마리씩: Balb/c, CD-1 및 FVB) 내로 주사하였다.

고체상 ELISA 분석을 사용하여 인간 γδTCR에 특이적인 마우스 IgG 항체에 대한 마우스 혈청을 선별하였다. 간략하게, 96 웰 플레이트(VWR 인터내셔날(VWR International), 카탈로그 번호 610744)를 밤새 ELISA 코팅 완충제에서 1㎍/㎖로 재조합 γδTCR을 이용하여 코팅하였다. 0.02%(v/v) 트윈 20을 함유하는 PBS로 세척한 후에, 웰을 1시간 동안 실온(RT)에서 200㎕/웰로 PBS 중에서 3%(w/v) BSA를 이용하여 차단시켰다. 마우스 혈청을 적정하고 나서(1:100, 1:200, 1:400 및 1:800) 50㎕/웰로 γδTCR 코팅 플레이트에 첨가하고 나서, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고, 이어서, 1시간 동안 실온에서 3% BSA-PBS 또는 PBS 중의 2% FCS에서 1:10,000으로 희석시킨 50㎕/웰 HRP-표지 염소 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션시켰다. 플레이트를 다시 세척하고 나서, 40㎕/웰의 TMB 기질 용액(써모 사이언티픽 34028)을 15분 동안 실온에서 첨가하였다. 전개 후에, 동일 용적의 2N H2SO4를 첨가하여 기질 전개를 중단시키고, OD 450에서 플레이트를 분광광도계로 분석하였다.

혈청-양성 면역화된 마우스를 희생시키고 나서, 배수 림프절(슬와 및 서혜부)을 절단하고, 항체 생성 세포에 대한 공급원으로서 사용하였다. B 세포(766×106개의 세포)의 단일 세포 현탁액을 전기융합에 의해 1:1의 비로 비-분비 P3x63Ag8.653 골수종 세포(ATCC #CRL-1580)와 융합시켰다. 제조업자의 지시에 따라 BTX 하이브리뮨(Hybrimmune)(상표명) 시스템(BTX 하버드 장치(BTX Harvard Apparatus))를 이용하여 전기융합을 수행하였다. 융합 후에, 세포를 아자세린(Azaserine)(시그마 #A9666), 피루브산나트륨과 함께 15% 태아 클론 I 혈청(하이클론(Hyclone)), 10% BM 콘다임드(Condimed)(로슈 어플라이드 사이언시즈(Roche Applied Sciences)), 4mM L-글루타민, 100 IU 페니실린-스트렙토마이신 및 50μM 2-머캅토에탄올을 함유하는 고 글루코스 DMEM 배지(셀그로(Cellgro) 카탈로그 번호 15-017-CM)로 보충한 하이브리도마 선택 배지에서 재현탁시켰고, 이어서, 플라스크 당 50㎖ 선택 배지에서 3개의 T150 플라스크에 플레이팅하였다. 이어서, 플라스크를 5% CO2 및 95% 공기를 함유하는 습한 37℃의 인큐베이터에서 6 내지 7일 동안 두었다.

성장 6일 후에, T150 플라스크에서 대량으로 성장시킨 세포로 이루어진 라이브러리를 아리아(Aria) II 세포 분류기를 이용하는 팔콘(Falcon) 384 편평-바닥 플레이트에서 웰 당 1개의 세포로 플레이팅하였다. 이어서, 선택한 하이브리도마를 15% 태아 클론 I 혈청(하이클론), 10% BM-콘다임드(로슈 어플라이드 사이언시즈), 1mM 피루브산나트륨, 4mM L-글루타민, 100IU 페니실린-스트렙타마이신, 50μM 2-머캅토에탄올 및 100μM 하이포크산틴을 함유하는 90㎕의 배양 배지에서 성장시켰다. 임의의 남아있는 사용하지 않은 하이브리도마 라이브러리 세포를 장래의 라이브러리 시험을 위해 냉동시켰다. 성장 10일 후에, 플레이팅 세포의 각각의 웰로부터의 상청액을 ELISA 및 FACS 분석에 의해 δ1TCR에 대해 반응성인 항체에 대해 분석하였다.

FACS- 하이브리도마 웰에 의한 선별을 위해 분비 뮤린 면역글로불린을 유세포분석 기반 분석을 이용하는 인간 δ1/TCR 특이성에 대해 선별하였다. δ1γ8TCR을 발현시키는 BE13 세포, 또는 δ2γ9TCR을 발현시키는 졸레드론산 처리된 인간 PBMC를 25㎕ 하이브리도마 상청액과 함께 얼음 상에서 60분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 PBS, 2% FCS로 2회 세척하고, 이어서, PBS/2% FCS에서 1:300으로 희석시킨 PE에 접합된 50㎕의 염소-항-마우스 IgG Fc 단편 특이적 2차와 함께 인큐베이션시켰다. 15분의 접종 후에, 세포를 PBS/2% FCS를 이용하여 2회 세척하고 나서, DAPI와 함께 PBS/2% FCS 중에서 재현탁시키고 제조업자의 설명서에 따라 FACS 칸토(Canto)를 이용하여 유세포분석에 의해 분석하였다. BE13 세포에 우선적으로 결합된 면역글로불린을 함유하는 웰을 확장시키고, ELISA 분석에 의해 δ1 특이성에 대해 추가로 시험하였다. 졸레드론산 활성화 PBMC 세포에 우선적으로 결합하는 면역글로불린을 함유하는 웰을 확장시키고, ELISA 분석에 의해 δ2 특이성에 대해 추가로 시험하였다.

고결합 ELISA 96 웰 플레이트를 다음의 γδ TCR 쇄를 짝지음으로써 생성되는 가용성 γδ TCR 단백질로 코팅하였다: γ8δ1, γ8δ2, γ9δ1 및 γ9δ2. 가용성 TCR을 희석시키고 나서, 희석시키고, 탄산나트륨 완충제에서 밤새 4℃에서 1㎍/㎖로 사용하였다. 플레이트를 세척하고 나서, 37℃에서 1시간 동안 PBS/트윈 중의 3% BSA로 차단하고, 즉시 사용하거나 또는 4℃에서 유지하였다. 비희석 하이브리도마 상청액을 실온에서 1시간 동안 플레이트 상에서 인큐베이션시켰다. 플레이트를 세척하고 나서, 1시간 동안 실온에서 3% BSA-PBS 중에서 1:10,000으로 희석시킨 HRP 표지 염소 항 마우스 IgG를 이용하여 프로빙하였다. 이어서, 플레이트를 상기 기재한 바와 같이 기질 용액과 함께 인큐베이션시키고 나서, OD 450에서 판독하였다. 배경 초과의 신호에 의해 결정하는 바와 같이 인간 δ1 TCR 쇄에 우선적으로 결합된 면역글로불린을 함유하는 웰을 옮기고 나서, 확장시켰다.

얻어진 δ1 및 δ2 TCR 특이적 클론 하이브리도마를 CS-10 냉동 배지(바이오라이프 솔루션즈(Biolife Solutions))에서 저온보존하고 나서, 액체 질소에서 저장하였다.

실시예 40. δ1- 및 δ2-특이적 활성체의 서열분석

δ1 T 세포에 특이적으로 결합하고, 활성화시키며 확장시키는 예시적인 별개의 단클론성 항체를 서열분석 및 추가 분석을 위해 선택하였다. 이하의 표에 나타내는 바와 같이, 실시예 39에서 생성된 선택된 δ1-γδ TCR 특이적 단클론성 항체의 중쇄 가변 영역(도 33) 및 경쇄 가변 영역(도 34)의 서열분석은 신규한 상보성 결정 영역 및 신규한 VDJ 배열의 표시를 확인하였다. 도 33 내지 도 34에 제시한 바와 같은 상보성 결정 영역은 카바트에 의해 정한다. δ2 T 세포에 특이적으로 결합하고, 활성화시키며 확장시키는 예시적인 별개의 단클론성 항체를 서열분석 및 추가 분석을 위해 별개로 선택하였다. 이하의 표에 나타내는 바와 같이, 실시예 39에서 생성된 선택된 δ2-γδ TCR 특이적 단클론성 항체의 중쇄 가변 영역(도 35) 및 경쇄 가변 영역(도 36)의 서열분석은 신규한 상보성 결정 영역 및 신규한 VDJ 배열의 표시를 확인하였다. 도 35 내지 도 36에 제시한 바와 같은 상보성 결정 영역은 카바트에 의해 정한다.

RNeasy 단리 키트(RNeasy 미니 키트 퀴아젠 # 74106)을 이용하는 분비된 하이브리도마 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 10⁴개의 하이브리도마 세포를 350㎕ RLT 완충제에서 용해시키고, 동일 용적의 70% 에탄올을 첨가하고 나서, 샘플을 RNeasy 미니 스핀 칼럼에 장입하였다. 칼럼을 2회 세척하고 나서, 스핀 칼럼 막에 직접적으로 장입시킨 100㎕의 무 RNase 수에 의해 RNA를 용리시켰다. 1% 아가로스 겔 중의 3㎕로 분획화시킴으로써 RNA 제제의 양을 결정한 후에 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.

모든 마우스 Ig 아이소타입에 특이적인 3' 마우스 Cγ프라이머와 조합하여 완전 마우스 VH 레퍼토리를 표적화하도록 설계된 32개의 마우스 특이적 리더 서열 프라이머를 포함하는 5' 프라이머 혼합물을 이용하여 각각의 하이브리도마의 Ig 중쇄의 가변 영역을 증폭시켰다. VH의 400 bp PCR 단편을 동일한 PCR 프라이머를 이용하여 말단 둘 다로부터 서열분석하였다. 유사하게, 마우스 카파 불변 영역에 특이적인 단일 역방향 프라이머와 조합한 각각의 Vκ마우스 패밀리를 증폭시키도록 설계한 32개의 5' Vκ리더 서열 프라이머의 혼합물을 사용하여 카파 경쇄의 서열을 증폭시켰다. 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)을 이용하여 100ng 총 RNA로부터 VH 및 VL 전사체를 증폭시켰다.

각각의 하이브리도마에 대해 총 8회의 RT-PCR 반응을 실행하였다: Vκ경쇄에 대해 4개 및 V γ중쇄에 대해 4개. 증폭을 위해 1단계 원스텝 어헤드(OneStep Ahead) RT-PCR 키트를 사용하였다(퀴아젠 # 220213). 5㎕의 RNA, 100μM의 중쇄 또는 κ경쇄 프라이머(IDT에 의해 합성된 상품 이용) 중 하나의 0.5, DNA 중합효소, 완충제, dNTP를 갖는 12.5㎕의 마스터 믹스, 역전사효소 및 DNA 중합효소를 함유하는 1㎕의 효소 혼합물, 및 0.4㎕의 리보뉴클레아제 저해제 RNasin(1 단위)을 포함하는 반응 혼합물을 제조하였다. 반응 혼합물은 역전사와 PCR 둘 다에 필요한 시약 모두를 함유한다. 열 순환 프로그램을 RT 단계에서 10분 동안 50℃, 5분 동안 95℃ 다음에 PCR의 30 주기(30초 동안 95℃, 30초 동안 58℃, 1분 동안 72℃)로 설정하였다. 이어서, 72℃에서 10분 동안 최종 인큐베이션시켰다.

제조업자의 프로토콜에 따라 퀴아퀵(QIAquick)(상표명) PCR 정제 키트(퀴아젠)을 이용하는 직접 DNA 서열분석을 위해 PCR 산물을 준비하였다. 50㎕의 멸균수를 이용하여 스핀 칼럼으로부터 DNA를 용리시키고, 이어서, 특정 V 영역 프라이머를 이용하여 가닥 둘 다로부터 직접적으로 서열분석하였다. 가장 높은 서열 상동성을 갖는 생식계열 V, D 및 J 유전자 구성원을 동정하기 위해 VBase2를 이용하여 뉴클레오타이드 서열을 분석하였다.

도 33은 δ1-특이적 항체로부터의 중쇄 가변 영역의 인접 아미노산 서열을 도시한다. 도 34는 경쇄 가변 영역의 대응하는 인접 아미노산 서열을 도시한다. 종합하면, 도 33 내지 도 34는 동정된 작동 가능한 항δ1 TCR 항체의 주석달린 서열을 제공한다.

도 도 35는 δ2-특이적 항체로부터의 중쇄 가변 영역의 인접 아미노산 서열을 도시한다. 도 36은 경쇄 가변 영역의 대응하는 인접 아미노산 서열을 도시한다. 종합하면, 도 35 내지 도 36는 동정된 작동 가능한 항δ2 TCR 항체의 주석달린 서열을 제공한다.

실시예 41. δ1-특이적 활성체의 교차 반응성

제3 감마 델타 집단은 순환 T 세포의 약 0.2%를 차지하는 Vδ3 T 세포이다.

Vδ3 T 세포는 혈액에서 드물지만, 간에서 그리고 백혈병 및 일부 만성 바이러스 감염을 갖는 환자에서 풍부하다. 다른 부수적 서브세트는 Vδ4, Vδ5, Vδ6, Vδ7 및 Vδ8 γδ T 세포를 포함하며, 별개의 TCR 알파 및 델타 단백질을 암호화하는 Cδ에 대해 각각 스플라이싱된 VJα 유전자로 구성된다.

다른 γδ T 세포 집단과 교차 반응하는 δ1-특이적 활성체의 교차 반응성 및 능력을 8가지 상이한 델타쇄(Vδ1, Vδ2, Vδ3, Vδ4, Vδ5, Vδ6, Vδ7 및 Vδ8)로 구성된 가용성 TCR에 대한 δ1-특이적 활성제의 결합을 검출하는 맹검 분석에 의해 시험하였다. 모두 8가지 델타 쇄를 C-말단의 Fc-융합으로서 클로닝하고 나서, 293 세포 내로 γ-FC 쇄와 함께 공동 형질감염시키고 나서, 가용성 TCRs-FC를 배지 내로 분비하였다.

형질감염 전날에, 293 부착 세포 1 x 10⁵개의 세포/웰을 12 웰 플레이트에 플레이팅시켰다.

형질감염일에, 0.5㎍의 각각의 플라스미드(델타+ 감마쇄)를 무혈청 배지에서 293펙틴(상표명) 형질감염 시약(써모피셔 #12347019)을 이용하여 공동형질감염시켰다.

ELISA 분석에서 결합 분석을 위해 형질감염 3일 후에 분비된 TCR을 수집하였다.

ELISA 결합 분석.

가용성 TCR-FC 단백질을 1㎍/㎖ 염소 항 인간 FC(염소 항-인간 IgG, Fcγ 단편 특이적-잭슨 이뮤노리서치 # 109-005-098)를 이용하여 코팅한 ELISA 플레이트 표면에 대해 포획하였다. 결합을 4℃에서 밤새 수행하였다. 플레이트 상에 포획된 가용성 γδ TCR에 대한 δ1-특이적 활성체의 결합을 HRP 접합 2차 항체를 이용하는 검출에 의해 시험하였다: 염소 항 마우스 FC 특이성(잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈; 페록시다제-어피퓨어 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 단편 특이적 # 115-035-008)을 차단 완충제 중에서 1: 10,000로 희석시킨 후에, 웰 당 TMB 기질을 첨가하였다. 결과를 도 37에 나타낸다.

클론 확장된 TRDV4 및 TRDV8 T 세포가 AML로 향하는 면역 반응에 기여하는 것으로 나타난 반면, 재발을 겪는 환자에서 올리고클론 TRDV5 및 TRDV6이 일어날 수 있기 때문에 δ1 T 세포에 추가로 γδ T 세포의 다른 서브세트와 교차반응하고 활성화하는 능력은 중요성을 가질 수 있다. (Jin et al. Journal of Hematology & Oncology (2016) 9:126).

실시예 42. 활성화 및 증식 분석

δ1 및 δ2 TCR 특이적 항체를 γδ T 세포의 활성화 및 증식 유도에 대해 시험하였다. 간략하게, 48-웰 플레이트(코닝)을 50mM NaHCO3 또는 PBS 중에서 5㎍/㎖로 밤새 염소-항-마우스 Fc-γ 다클론성 항체로 코팅하였다. 웰을 PBS로 세척하고 나서, 1시간 동안 37C에서 PBS 중의 1% BSA로 추가로 차단시키고, γδ-TCR 특이적 항체를 2시간 동안 0.1% BSA 중에서 1㎍/㎖로 첨가하였다. 세포 표지를 위해, 완전 배지에서 밤새 둔 후에, 신선한 또는 냉동시킨 인간 PBMC를 세척하고, 5μM CFSE(PBS) 중에서 재구성하고 나서, 암실 내 실온에서 5분 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 FBS 함유 배지로 세척하고 나서, 10⁶/㎖로 10% FBS, 2mM 글루타민, 25mM HEPES 및 200IU/㎖의 rhIL-2를 함유하는 RPMI-1640 배양 배지에서 재구성하였다. CFSE-표지 PBMC를 0.5x10⁶/웰로 플레이팅하고 나서, 5일동안 배양시켰다.

5일 후에, 세포를 채취하고 나서 pan-γδ, Vδ1, Vδ2 및 αβ TCR에 대해 특정 표면 마커를 이용하여 염색하고, CFSE 형광에서의 진행적 변화에 의해 세포 증식을 평가하였다. 활성화의 결과로서 5일 동안 나누어진 세포의 백분율을 도 39에서 나타내고, 활성화 효능에 대해 항체의 순위를 매기는 역할을 하였다.

실시예 43. 특이적 MAb를 이용하는 인간 PBMC로부터의 Vδ1 및 Vδ2 T-세포의 1 단계 확장

선택된 활성화 δ1-TCR 및 δ2-TCR 항체(D1-08, D1-35, D1-39, D2-14, D2-17, D2-22, D2-30, D2-32, D2-33, D2-33, D2-35, D2-36, D2-37) 및 OKT3을 상기 실시예 2에서와 같이 24웰 플레이트에서 사전코팅된 염소-항-마우스 Fcγ 항체에 의해 2% FBS (PBS) 중의 1㎍/㎖로 포획하였다. 총 세포의 0.2 내지 0.28%의 초기 δ1 집단 및 총 세포의 대략 0.2 내지 4%의 Vδ2 집단을 갖는 몇몇 공여자로부터의 인간 PBMC를 10% FBS, 2mM 글루타민, 100IU/㎖의 rhIL-2를 함유하는 RPMI-1640 배지에서 10⁶/㎖/웰로 플레이팅하였다. 배지 보충에 의해 2 내지 3일마다 배양물 내 세포를 공급하였다. 제7일에, 세포를 채취하고 나서 활성화 항체 없이 새로운 플레이트 내로 10⁶/㎖로 재플레이팅하고, 계속된 공급 및 제14일에 10⁶/㎖ 세포 밀도로 재플레이팅함으로써 추가로 확장시켰다. 세포 분석(계수 및 유세포분석)을 제21일에 수행하여 δ1 및 δ2 세포의 순도 및 확장 배수를 결정하였다. 도 40은 PBMC 배양물 내 δ1(A) 및 δ2(B) 세포의 확장 배수를 나타낸다. Vδ1 및 Vδ2 MAb는 Vδ1에 대해 대략 12000배까지 그리고 Vδ2 T 세포에 대해 6700배까지 제21일에 δ1 및 δ2 T 세포의 확장을 유도하였다.

제21일에 확장된 δ1 세포의 표현형을 CD27 표면 마커 발현에 의해 평가하였다. 도 41은 제21일에 MAb를 이용하여 활성화시킨 Vδ1 T-세포의 표현형은 대부분 (50% 초과) CD27+CD45RA+ (미경험) 및 CD27+CD45RA- (중추 기억)라는 것을 나타낸다.

실시예 44. 제대혈로부터 δ1-T 세포의 1단계 확장

0.4%의 Vδ1 세포를 함유하는 인간 제대혈로부터의 단핵 세포를 피콜 밀도 구배에 의해 단리시키고 나서, 실시예 43에 기재한 바와 같은 포획된 δ1 TCR 특이적 항체를 이용하여 활성화시켰다. 이하의 표에 예시하는 바와 같이, Vδ1 T-세포는 δ1 특이적 MAb에 의한 활성화 후 21일에 1503배까지 확장되었다.

실시예 45. 피더 세포를 이용하는 Vδ1 T 세포의 2단계 확장

이 실시예에서, 인간 PBMC를 활성화시키고 나서, δ1 세포를 실시예 4에 기재한 프로토콜에 따라 14일 동안 확장시켰다. 간략하게, Vδ1 항체 TS-1, D1-08, D1-37, D1-39를 코팅된 염소-항-마우스 Fcγ 다클론성 항체를 통해 24웰 플레이트에서 포획하고 나서, 세포를 활성화시키고 기재한 바와 같이 확장시켰다. 제14일에 세포 배양물을 채취하고 나서, 바이오틴일화된 항-TCR αβ 항체 및 자기 마이크로비드(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))을 이용하는 αβ T 세포의 고갈에 의해 δ1 T 세포를 농축시켰다. 농축된 Vδ1 세포에 방사선 조사된 PBMC 피더 세포를 이용하는 제2 단계 활성화/확장을 실시하였다. 간략하게, 130,000개의 총 농축 세포를 200:1의 비로 방사선 조사된 인간 동종이계 PBMC의 존재 하에서 10% FBS, 2mM 글루타민, 100IU/㎖ IL-2 및 30 ng/㎖ D1-35 MAb를 함유하는 20㎖의 RPMI-1640에서 배양시켰다. 배양물을 T25 플라스크에 수직으로 넣었다. 제18일에, 70%의 배지를 대체함으로써 세포를 공급하였다. 그때부터, 50%의 배지를 교환함으로써 그리고 생세포 밀도를 1x10⁶/㎖로 조절함으로써 2 내지 3일마다 세포를 공급하고, 제28일에 채취하였다. 이하의 표에서 예시하는 바와 같이, δ1 세포를 2단계 확장 절차에서 약 28,000배까지 확장시켰다.

실시예 46. αβ T 세포 고갈 없이, 피더 세포를 이용하는 Vδ1 T 세포의 2단계 확장

본 실시예에서, 0.2%의 출발 Vδ1 집단을 갖는 인간 PBMC를 활성화시키고, 실시예 6에 기재한 프로토콜 후 7일 동안 δ1 세포를 확장시켰다. 간략하게, Vδ1 항체 TS-1, D1-08, D1-37, D1-39를 코팅된 염소-항-마우스 Fcγ 다클론성 항체를 통해 24웰 플레이트에서 포획하고 나서, 세포를 활성화시키고 기재한 바와 같이 확장시켰다. 제7일에 세포 배양물을 채취하고 나서, 확장된 세포에 방사선 조사 피더 세포를 이용하여 제2 단계 활성화/확장을 실시하였다. 간략하게, 130,000개의 총 세포를 200:1의 비로 방사선 조사된 인간 동종이계 PBMC의 존재 하에서 10% FBS, 2mM 글루타민, 100 IU IL-2 및 30ng/㎖ D1-35 MAb를 함유하는 20㎖의 RPMI1640에서 배양시켰다. 배양물을 T25 플라스크에 수직으로 넣었다. 제12일에, 70%의 배지를 대체함으로써 세포를 공급하였다. 그때부터, 제21일에 채취할 때까지, 50%의 배지를 교환함으로써 그리고 생세포 밀도를 10⁶/㎖로 조절함으로써 2 내지 3일마다 세포를 공급하였다. 이하의 표에서 예시하는 바와 같이, δ1 세포를 2단계 확장 절차에서 약 114,000배까지 확장시켰다.

실시예 47. αβ T 세포 고갈과 함께 피더 세포를 이용하는 Vδ1 T 세포의 2단계 확장

본 실시예에서, 0.36%의 출발 Vδ1 집단을 갖는 인간 PBMC를 활성화시키고, 실시예 4에 기재한 프로토콜 후 14일 동안 Vδ1 세포를 확장시켰다. 제14일에 세포 배양물을 채취하고 나서, 바이오틴일화된 항-TCR αβ항체 및 자기 마이크로비드(밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))을 이용하는 αβ T 세포의 고갈에 의해 δ1 T 세포를 농축시켰다. 농축된 Vδ1 세포에 방사선 조사된 피더 세포를 이용하는 제2 단계 활성화/확장을 실시하였다. 간략하게, 농축 세포를 49:1, 9:1 및 2:1의 비로 방사선 조사된 K562 세포의 존재 하에서 10% FBS, 2mM 글루타민, 100IU/㎖ IL-2 및 30ng/㎖ D1-35 MAb를 함유하는 20㎖의 RPMI-1640에서 배양시켰다. 구체화된 비(25x10⁶개의 각각의 총 생세포)로 배양물을 6-웰 G-Rex 플라스크(윌슨 울프(Wilson Wolf))에 넣었다. 제18일에, 75%의 배지를 대체함으로써 세포를 공급하였고, 제21일에 채취하였다. 이하의 표에서 예시하는 바와 같이, δ1 세포를 2단계 확장 절차에서 약 31,000배까지 확장시켰다.

실시예 48. Vδ1 MAb를 이용하여 활성화되고 확장된 δ1 T 세포는 종양 세포주에 대해 강한 세포독성을 나타낸다

인간 PBMC를 7일 동안 고정된 D1-08 MAb를 이용하여 활성화시키고, 정적 상태로 2일마다 공급함으로써 배양물을 확장시켰다. 확장의 종료 시, 항-TCRαβ항체 및 자기 마이크로비드(밀테니(Miltenyi))를 이용하는 αβT 세포의 고갈에 의해 δ1 T 세포를 농축시켰다. 정제된 δ1 세포를 Jurkat(백혈병) 및 Colo205(결장암) 세포주에 대한 세포독성 분석에서 사용하였다. 간략하게, 확장된 δ1 T 세포를 100IU/㎖ IL-2를 함유하는 완전 배지 내 96웰 둥근 바닥 플레이트(현탁액)에서 4시간 동안 10:1, 5:1, 2:1, 1:1 및 1:5 효과기:표적 세포비로 CFSE 표지 표적 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션의 종료 시, 세포 현탁액을 아넥신(Annexin)-V-APC 접합체 및 좀비 바이올렛 생존도 염료를 이용하여 염색하고 나서, 사멸된/사멸 중인 세포를 검출하기 위해 유세포분석에 의해 분석하였다. 도 42에 나타내는 바와 같이, Vδ1 세포는 45%까지 4시간 분석에서 다양한 비로 종양 세포주 둘 다에 대해 세포독성을 입증하였다.

실시예 49. 진탕과 함께 제2 단계를 포함하는 2단계 절차를 이용하여 활성화시키고 확장시킨 δ1 T 세포

말초혈액 단핵 세포의 단리

성분채집기로부터 수집한 신선한 혈액 산물을 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없이 PBS를 이용하여 1:3으로 희석시킨다. 이어서, 셉메이트(Sepmate)(스템셀(STEMCELL))을 이용하는 피콜-플라크(Ficoll-Paque)(상표명) 플러스(GE 헬스케어) 시스템을 이용하여 희석 혈액 산물을 정제한다. 이어서, 농축된 림프구 층을 농축시키고 2회 세척하고 나서, Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없이 PBS로 1회 세척하고, 이어서, Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없이 PBS 중의 0.25% 인간 혈청 알부민으로 세척하였다. 최종적으로, 정제된 혈액 산물을 1x10⁷개의 세포/㎖로 초저 부착 24-웰 플레이트, 6-웰 플레이트, 및 T-75 플라스크 상에서 소 태아 혈청 함유 및 무혈청 배지에 밤새 두었다.

T-세포 활성화

T-세포 활성화 전날에, 조직 배양물 처리된 24-웰 플레이트, 6-웰 플레이트, T75 플라스크 또는 기체 투과성 백을 포함하는 적절한 세포 배양물 용기를 항-Fc 항체를 이용하여 코팅한다. 초기 코팅 후에, 용기를 암실에서 밤새 2 내지 8℃에서 저장한다. 초기 항-Fc 코팅 후에, 용기를 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없이 PBS 중에서 5% 소 태아 혈청을 이용하여 차단시키고, 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 1시간 인큐베이션 후에, 용기를 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없이 PBS를 이용하여 1회 세척하고, Vδ1 특이적 단클론성 항체를 이용하여 용기를 포획한다. 이어서, 용기를 실온에서 4시간까지 동안 진탕하면서 그리고 진탕 없이 인큐베이션시킨다. 포획의 종료 시, 용기를 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없이 PBS를 이용하여 2회 세척하고, T-세포 활성화를 위한 준비를 한다.

밤새 둔 PBMC를 소 태아 혈청 함유 및 무혈청 배지 중 하나를 이용하여 0.5 x 10⁶ 내지 2 x 10⁶개의 세포/㎠로 희석시킨다. 이어서, 희석시킨 PBMC를 Vδ1 특이적 단클론성 항체 고정 용기에 첨가한다. PBMC를 3 내지 7일에 정적으로 유지한다. 신선한 세포 배양물 배지를 제3일에 시작해서 매일 첨가하여 충분한 영양소 수준, 예컨대 글루코스 및 글루타민을 유지하고, 락테이트 및 암모늄과 같은 독성 부산물의 축적을 희석시킨다. 초기 활성화의 종료 시, 기계적 또는 화학적 방법에 의해 세포를 채취한다. 이어서, 세포를 후속적 확장을 위해 새로운 플라스크에 옮긴다.

T-세포 확장

초기 T-세포 활성화 후에, 세포 배양물을 37℃CO₂ 인큐베이터에서 21일까지 동안 유지시킨다. 초기에, 활성화시킨 세포 배양물을 소 태아 혈청 함유 및 무혈청 배지 중 하나에서 1e6개의 세포/㎖로 희석시킨다. T-25, T-75, T-150 및 T-225 플라스크를 포함하는, 초저 부착 또는 조직 배양물 처리 표면을 갖는 정적 T-플라스크에서, 또는 125㎖, 250㎖, 500㎖, 1000㎖, 2000㎖ 및 3000㎖의 총 용기 용적을 포함하는 표준 비-베플(non-baffled) 또는 베플 진탕 플라스크에서 T-세포를 배양시킬 수 있다. 정적 T-플라스크에서, 작업 용적 대 표면적 비를 0.5㎖/㎠이하에서 유지시켜 충분한 배양물 산화를 보장한다. 진탕 플라스크에서, 작업 용적 대 총 용기 용적비를 오비탈 진탕 플랫폼 상에서 1 내지 2 또는 그 미만으로 유지시켜 충분한 혼합 및 통기를 보장한다.

생세포 배양물 밀도(VCD), 대사물질, pH 및 기체 측정을 매일 취한다. 대상물질 측정은 글루코스, 락테이트, 글루타민, 글루타메이트, 암모늄, 나트륨 이온, 칼륨 이온 및 칼슘 이온을 취한다. pH 및 산소, CO² 및 pH의 분압을 포함하는 기체 측정을 또한 취한다. 온도 보상과 함께 산소, CO² 및 pH 측정을 취한다. VCD 또는 대사물질에 기반한 피딩을 둘 다 사용하여 세포 배양물을 유지할 수 있다. VCD-기반 피딩 전략을 위해, VCD가 1.5 x 10⁶개 세포/㎖ 이상으로 증가된다면, 신선한 배지를 이용하여 배양물을 1 x 10⁶개의 세포/㎖로 희석시킨다. 대사물질-기반 피딩 전략을 위해, 글루코스 수준이 1g/ℓ 미만에서 1.5g/ℓ까지 증가할 때 신선한 배지를 첨가한다.

세포 채취 및 뱅킹

제19일 또는 제21일 확장의 종료 시 90% 초과의 세포 생존도가 항상 관찰된다. 세포 확장 후, 세포 배양물을 세척하고 나서, 세포 뱅킹 배지에서 재현탁시킨다. 이어서, 세포를 20 x 10⁶개 세포/㎖ 세포 밀도 초과에서 분취시킨다. 제어 속도 냉동기 또는 냉동 용기를 이용하는 제어 냉동에 의해 액체 질소의 수증기상 내 동결보존을 진행시킨다.

실시예 49a

본 실시예에서, 0.4%의 출발 Vδ1 조성을 갖는 공여자 A 신선한 혈액 산물을 피콜에 의해 정제하고 나서, 초저 부착 T75 플라스크에서 밤새 두었다. 제0일 내지 제5일에 고정된 δ1 특이적 단클론성 항체 δ1-35 및 δ1-08을 이용하는 활성화 후에, 배양물을 진탕 플라스크에 옮겼다. 제5일 내지 제19일에, 배양물을 매일 샘플링하고 나서, 영양소 및 폐기물 농도를 신선한 혈청 배지를 이용하는 VCD-기반 피딩 전략에 의해 유지하였다. δ1-35 및 δ1-08 활성화 배양물에 대한 Vδ1 확장 배수 및 순도를 도 43에서 도시한다.

실시예 49b

본 실시예에서, 0.1%의 출발 Vδ1 조성을 갖는 공여자 B 신선한 혈액 산물을 피콜에 의해 정제하고 나서, 초저 부착 T75 플라스크에서 밤새 두었다. 제0일 내지 제5일에 고정된 δ1 특이적 단클론성 항체 δ1-08을 이용하는 활성화 후에, 배양물을 진탕 플라스크에 옮겼다. 제5일 내지 제19일에, 배양물을 매일 샘플링하고 나서, 영양소 및 폐기물 농도를 신선한 혈청-함유 배지 또는 신선한 무혈청 배지 중 하나를 이용하는 VCD-기반 피딩 전략에 의해 유지한다. 혈청 함유 및 무혈청 배지 확장된 배양물에서 Vδ1 확장 배수 및 배가 시간(DT)(제0일 내지 제19일에 누적)을 도 44에 도시한다.

실시예 49c

본 실시예에서, 0.5%의 출발 Vδ1 조성을 갖는 공여자 C 신선한 혈액 산물을 피콜에 의해 정제하고 나서, 초저 부착 T75 플라스크에서 밤새 두었다. 제0일 내지 제7일(49c.1) 및 제0일 내지 제5일에 고정된 δ1 특이적 단클론성 항체 δ1-08을 이용하는 활성화 후에, 배양물을 진탕 플라스크에 옮겼다. 제7일 내지 제19일에, 배양물을 매일 샘플링하고 나서, 영양소 및 폐기물 농도를 신선한 혈청 배지를 이용하는 글루코스-기반 피딩 전략에 의해 유지하였다. 그리고 다른 두 배양물에 대해, 제7일 내지 제19일에, 배양물을 매일 샘플링하고 나서, 영양소 및 폐기물 농도를 신선한 혈청 배지를 이용하는 VCD 기반 피딩 또는 글루코스-기반 피딩 전략에 의해 유지하였다. Vδ1 확장 배수 및 배가 시간(DT)(제14일 내지 제19일에 누적)을 도 45에서 도시한다.

도 45 부문 49c.1은 제7일에 활성화되고, 이어서, 제7일 내지 제19일에 글루코스-기반 피딩 전략을 이용하여 유지된 배양물로부터의 Vδ1 확장 배수 및 DT(제14일 내지 제19일에 누적)를 도시한다. 도 45 부문 49c.2는 제5일에 활성화되고, 이어서, 제7일 내지 제19일에 VCD-기반 피딩 전략을 이용하여 유지된 배양물로부터의 Vδ1 확장 배수 및 DT(제14일 내지 제19일에 누적)를 도시한다. 도 45 부문 49c.3은 제5일에 활성화되고, 이어서, 제7일 내지 제19일에 VCD-기반 피딩 전략을 이용하여 유지된 배양물로부터의 Vδ1 확장 배수 및 DT(제14일 내지 제19일에 누적)를 도시한다.

실시예 50. 레트로바이러스 키메라 항원 수용체 작제물을 이용하는 Vδ1 T 세포의 형질도입

건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포를 고정된 항-Vδ1 특이적 단클론성 항체(δ1-08)를 이용하여 자극하고 나서, 실시예 49a에 기재된 바와 같이 rhIL-2로 보충한 배지에서 19일 동안 배양시켰다. 간략하게, 단리된 PBMC를 사전 코팅된 염소-항-마우스 Fcγ항체를 통해 포획되니 D1-08 Vδ1 MAb를 이용하여 24-웰 플레이트에서 활성화시켰다. 10% FBS, 25mM HEPES, 2mM 글루타민 및 100IU/㎖ IL-2를 함유하는 RPMI1640 배지에서 1e⁶/㎖/웰로 세포를 플레이팅하였다. 5일 후에, 세포를 진탕 플라스크에 옮기고 나서, 실시예 49a에 기재한 바와 같이 확장시켰다. 제19일에 세포를 채취하고 나서, 세척하고, 2일 동안 PHA(2㎍/㎖)를 이용하여 재자극한 후에, 항-CD20(리툭시맙) 유래키메라 항원 수용체(CD28-CD3ζ에 연결된 scFv)를 암호화하는 레트로바이러스 벡터를 이용하여 형질도입하였다. 간략하게, 24-웰 플레이트의 웰을 레트로넥틴(타카라 바이오(TaKaRa Bio))로 사전 코팅하고, 레트로바이러스를 함유하는 상청액(1㎖)을 4시간 동안 32C에서 인큐베이션시켜 바이러스 입자의 접착을 허용하고, 이 후에 상청액을 제거하였다(레트로넥틴 플레이트). 확장된 δ1 T 세포를 세척하고, 0.5x10⁶개의 세포/㎖로 IL-2의 100IU/㎖로 보충한 바이러스 상청액의 1㎖에서 재현탁시키고 나서 레트로넥틴 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 1800 rpm에서 10분 동안 원심분리시키고 나서, 37℃ 인큐베이터에 두었다. 세포를 2일마다 피딩하면서 추가 7일 동안 배양시키고, 이어서, T-세포 표면 상에서 발현된 CD20-특이적 CAR을 인식하는 형광 래트 항-리툭시맙 유전자형 항체(FITC 접합체를 이용하여 형질도입%에 대한 유세포분석에 의해 분석하였다. 34% 초과의 살아있는 Vδ1⁺ 세포는 도 46에 나타낸 CAR 작제물을 발현시켰다.

실시예 51. γδ T 세포 TCR에 대한 항체의 에피토프 맵핑

목적은 δ1-특이적 활성체의 에피토프 특이성을 맵핑하는 것이다. 모든 δ1-특이적 활성체는 γδ TCR의 δ1 쇄로 향한다. 인간 및 돌고래 δ1 TCR 쇄의 재조합 키메라 분자를 이용함으로써 맵핑을 행하였다. 인간과 돌고래 δ1 쇄 사이의 높은 아미노산 동일성에도 불구하고, δ1 특이적 활성체는 돌고래 δ1 쇄에 결합하지 않았다. 따라서, 본 발명자들은 서열의 유사성 및 재조합 키메라 분자를 작제하기 위한 인간 Vδ1과 돌고래 Vδ1(65% 서열 유사성) 사이의 입체배좌를 이용하였는데, 이때 본 발명자들은 인간 잔기의 상이한 세그먼트를 돌고래 δ1 TCR 쇄로부터의 그들의 상동성 상대로 대체하였다.

모든 mAb는 유세포분석에 의해 γδ TCR의 δ1 쇄의 가변영역에 특이적으로 결합하는 것으로 확인하였다. δ1γ8 TCR은 항 δ1 마우스 단클론성 항체(mAb)의 모든 패널에 결합함으로써 결정된 정확하게 폴딩된 입체배좌에서 가용성 FC 융합 단백질로서 발현되었다. 이들 mAb는 γδ TCR의 입체배좌적으로 의존적인 에피토프를 표적화하는 것을 나타났다.

인간 δ1 TCR의 별개의 에피토프를 발현시키기 위해, 7개의 재조합 키메라 δ1 쇄의 세트를 인간/돌핀 δ1-FC TCR 쇄를 생성하도록 클로닝하였따. 돌고래 잔기는 도 38에서 도시하는 바와 같이 T 세포 수용체 가변 도메인에 대한 IMGT 독특한 넘버링에 따라 각각 아미노산 1-11, 1-21, 1-28, 1-47, 1-70, 1-80 및 1-95를 포함하였다(Lefranc et al., Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55-77).

이들 δ1 특이적 결합 도메인은 잠재적 접촉 잔기의 사전 지식 없이 ELISA 결합 분석 및 결합 상실의 검출에 의해 확인하였다. 선택된 δ1 활성체의 결합에 영향을 미친 중요한 돌고래 잔기를 덮어씌움으로써, 본 발명자들은 δ1 TCR 쇄의 V 및 J 영역 내의 8개의 가능한 결합 bin을 동정하였다.

본 연구에서 사용하는 발현 벡터는 pCI-Neo 포유류 발현 벡터(프로메가 # E1841)이며, 가용성 TCR의 발현은 CMV 프로모터로부터 유래되었다. 마우스 IgH 신호 펩타이드는 배지에 가용성 TCR 단백질, 다음에 ELISA 플레이트에 대한 가용성 TCR의 포획을 위한 인간 FC 도메인을 내보내기 위해 사용하였다.

인간 δ1 쇄의 ECD를 γδ1 BE-13 T 세포주로부터 증폭시켰다. 돌고래 Vδ1 서열을 공개된 서열(T 세포 수용체 델타쇄(TRD 유전자)에 대한 큰돌고래 mRNA, 단리물 5R1D80)(젠뱅크: LN610748.1) 상의 합성 유전자 염기로서 지시하였다. 주형으로서 이들 cDNA를 이용하여, 신호 펩타이드에서 5' AgeI 부위 및 델타 불변 영역에서 3' 이콜라이(E.coRI) 내로 클로닝될 합성 단편(IDT DNA)으로부터 새로운 키메라 분자를 클로닝시켰다. 돌고래/인간δ1 쇄로 이루어진 6개의 작제물을 클로닝하고 나서, 293 세포 내 가용성 δ1γ8 TCR 단백질을 발현하도록 γ8-FC 쇄와 함께 공동형질감염시켰다.

HEK-293 세포를 10% 소 태아 혈청(하이클론(HyClone)(상표명) 페탈클론(FetalClone)(상표명) I 혈청(미국) - GE 헬스케어 라이프 사이언시즈(Healthcare Life Sciences))을 갖는 DMEM 배지(써모 피셔 사이언티픽) 내 90-mm 세포 배양물 플레이트에서 배양시켰다. 모든 작제물에 대해, 형질감염 시약으로서 293 펙틴을 이용하여 10㎍의 플라스미드로 1 × 10⁶개의 HEK-293 세포를 형질감염시켰다. 형질감염 후 72시간에 상청액을 채취하였다.

δ1 특이적 활성체- 단클론성 항체는 키메라에 대한 그들의 결합 패턴과 상이하였고, 별개의 결합 패턴을 ELISA 분석에서 시험한 바와 같이 각각의 단클론성 항체에 대해 동정할 수 있었다.

폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트(그레이너 바이오-원(Greiner bio-one) # 655061)을 ELISA 코팅 완충제(50 mm Na2CO3, 0.05% NaH3, pH 9.6)에서 1㎍/웰의 염소 항 인간 FC 특이적 항체(잭슨 이뮤노리서치 # 109-005-098)로 실온에서 밤새 코팅하였다. 플레이트를 세척 완충제(PBS 0.05% (v/v) 트윈 20)를 이용하여 3회 세척하고, 이어서, 1시간 동안 실온(RT)에서 100㎕/웰의 ELISA 차단 완충제(PBST 중의 3%BSA)를 이용하여 차단시켰다. 100㎖의 각각의 상청액을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킴으로써 차단된 플레이트에 대한 가용성 TCR의 결합을 행하였다. 각각의 항체를 ELISA 차단 완충제 중에서 1㎍/㎖로 희석시키고 나서, 각각의 γδ TCR 키메라 분자에 대한 결합에 대해 시험하였다.

100㎕/웰의 HRP 접합된 차단 완충제 중에서 1:10,000으로 희석시킨 2차 항체(염소 항 마우스 FC 특이적(잭슨 이뮤노리서치 래버러토리즈 인코포레이티드. 페록시다제-어피퓨어 염소 항-마우스 IgG, Fcγ 단편 특이적 # 115-035-008))를 첨가함으로써 결합의 검출을 행하였다. 결합된 항체의 양을 TMB 기질(써모 피셔 #34029 )의 사용에 의해 검출하였고, 10분 후에 450nm에서 색 전개를 분광학적으로 측정하였다. 모든 분석을 2회 중복하여 행하였다.

모든 작제물의 서열

돌고래/인간 키메라-가용성 TCR의 세트를 클로닝하였다-청색의 인간 서열

결과

기능성 TCR 유전자를 유전자 재조합에 의해 별개의 V, D 및 J 영역 세그먼트로부터 조립한다. TCR 델타 쇄 유전자가 조립될 때, D 유전자 세그먼트는 J 세그먼트에 병치되고, 이에 DJ 세그먼트 하류에 조립된 V 세그먼트의 재배열이 이어진다. TCR 쇄의 면역글로불린-유사 폴딩은 서로 근접하여 각각의 쇄로부터 3개의 루프 또는 상보성 결정 영역(CDR)을 위치시키고, 항원과 접촉될 결합면을 생성한다. 이들 CDR 루프 중 둘, 즉, 1 및 2는 V 유전자 세그먼트에 의해 암호화되고, Vδ1 영역 유전자 세그먼트에 의해 제공되는 다양성만을 가진다. 제3 CDR 루프는 V(D)J 세그먼트의 병치에 의해 생성되며, 암호 서열의 결합이 부정확하다는 사실에 의해 심각하게 된 각각의 V 세그먼트가 임의의 (D)J 세그먼트로 재배열하는 능력의 결과인 훨씬 더 많은 다양성을 제공한다. 뉴클레오타이드는 각각의 이들 접합에서 첨가되거나 또는 결실될 수 있다. 에피토프 결합 특이성은 ELISA에 의해 나타낸다(도 47A 내지 도 47B).

본 발명자들은 γδ TCR 분자의 δ1 쇄의 프레임워크 영역 상에서 상이한 에피토프에 결합하는 활성체를 동정하였다. 단클론성 항체의 하나의 그룹은 TCR의 델타쇄의 δ1 가변 영역과 반응성이다. 특히, 본 발명은 접합 다양성(모든 γδ TCR 조성 (D)J1, V(D)J2 및 V(D)J3의 병치)과 상관없이 δ1 쇄 가변 영역에 결합하는 단클론성 항체, 예컨대 d1-08, d1-39, d1-192, d1-201, d1-285를 제공한다. 이들 단클론성 항체는 델타 TCR의 "가변 영역"과 반응성이며, 따라서, V 영역의 에피토프와 반응성인 단클론성 항체이다.

다른 δ1 활성체는 δ1 쇄 가변 영역, 및 V(D)J1 세그먼트의 제한된 병치에 의해 생성된 CDR3 루프를 특이적으로 인식한다. 이들 단클론성 항체는 V-D 또는 V-D-J 영역의 에피토프(d1-37, d1-113, d1-155, d1-182, d1-183, d1-191, d1-278 및 d1-282)와 조합하여 TCR의 "가변 영역"과 반응한다.

다른 δ1 활성체는 δ1 쇄 가변 영역, 및 V(D)J1 및 V(D)J1의 병치에 의해 생성되지만 V(D)J3 세그먼트는 아닌 CDR3 루프(d1-35, d1-143, d1-149, d1-203)를 특이적으로 인식한다.

δ1에 특이적인 항체는 다음의 에피토프 Bin 내로 그룹화된다:

Bin1: VDJ 접합- JH1/JH2 : TS-1; 및 δ1-18

Bin 1b: VDJ 접합- J1(J3은 아님), K120T/A 돌연변이체에 대한 결합 상실:δ1-37

Bin2: (aa 11-21): δ1-285

Bin2b: (aa 11-21), R16N 돌연변이체에 대한 결합 상실: R9.12

Bin2c: (aa 11-21), δ3, δ4 및 δ5 γδ TCR과 교차 반응: δ1-39

Bin3: (aa 80-95 또는 70-95): δ1-08; δ1-23

Bin4: (aa 1-11), K120T/A 돌연변이체에 대한 결합 상실: δ1-35; δ1-203

Bin5: (aa 28-47+ J1 영역): δ1-113; δ1-155; δ1-183; δ1-191; δ1-278; δ1-282

Bin6: (aa 21-28+ J1 영역): TS8.2; δ1-143

Bin7: (aa 47-70+ J1/J2 영역): δ1-149; δ1-253, 및 δ1-257

Bin8: (aa 70-80) + J1/J2: δ1-192

Bin9: (aa 80-95): δ1-201.

d1 에피토프 맵핑과 유사: 문헌[Linguiti G. et al., 2016]에 기반함. 큰돌고래 T 세포 수용체 감마(TRG) 및 알파/델타(TRA/TRD) 좌위의 게놈 및 발현 분석은 유사한 기본적 공개 대상(돌고래 및 인간에서의 레퍼토리)를 나타낸다. BMC 게놈학. 5개 세트의 재조합 키메라 δ2 쇄를 클로닝하여 인간/돌고래 δ2-FC TCR 쇄를 생성하였다. 돌고래 잔기는 도 15에서 도시하는 바와 같이 T 세포 수용체 가변 도메인에 대한 IMGT 독특한 넘버링에 따라 각각 아미노산 28-94, 44-94, 72-94 및 82-94를 포함하였다(Lefranc et al., Developmental and Comparative Immunology 27 (2003) 55-77).

ELISA 결과는 다음의 에피토프 bin을 동정하는 도 48에서 나타낸다:

* * *

본 발명의 바람직한 실시형태를 본 명세서에 나타내고 기재하였지만, 이러한 실시형태는 단지 예로서 제공된다는 것이 당업자에게 분명할 것이다. 수많은 변형, 변화 및 치환은 이제 본 발명으로부터 벗어나는 일 없이 당업자에게 일어날 것이다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실행하는 데 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 다음의 청구범위가 본 발명의 범주를 정한다는 것과 이들 청구범위의 범주 내의 방법 및 구조 및 그들의 동등물이 이에 의해 아우러지는 것이 의도된다.

SEQUENCE LISTING <110> ADICET BIO, INC. <120> METHODS FOR SELECTIVE EXPANSION OF GAMMA DELTA T-CELL POPULATIONS AND COMPOSITIONS THEREOF <130> WO/2017/197347 <140> PCT/US2017/032530 <141> 2017-05-12 <150> US 62/335,572 <151> 2016-05-12 <160> 227 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 atgctgttct ccagcctgct gtgtgtattt 30 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 atgcagagga tctcctccct catccatct 29 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 atgattctta ctgtgggctt tagctttttg 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 cttggggtag aattccttca ccagacaagc 30 <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 5 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 1 5 10 15 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 20 25 <210> 6 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 6 Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln 1 5 10 15 Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 20 25 <210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 7 Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser 1 5 10 15 Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln 20 25 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 agagtgaagt tcagcaggag cgca 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 ctcgagtggc tgttagccag a 21 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 ggtgcttcta gctttcctgt ctcctgc 27 <210> 11 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 atgctgttgg ctctagctct gcttcta 27 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 atgctgtcac tgctccacac atcaacg 27 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 ggaagaaaaa tagtgggctt gggggaa 27 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 atgacaacac ccagaaattc agtaaatgg 29 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 15 tcaaggagag ctgtcatttt ctattggtg 29 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys 1 5 <210> 17 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn 1 5 10 15 Ala <210> 18 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 1 5 10 15 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Leu Thr Ala Gln Leu Phe Phe Gly Lys Gly Thr Gln Leu Ile Val Glu 1 5 10 15 Pro <210> 20 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn 1 5 10 15 Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser 20 25 30 Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr 35 40 45 Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys 50 55 60 Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 65 70 75 <210> 21 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 21 Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn 1 5 10 15 Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser 20 25 30 Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr 35 40 45 Phe Cys Ala Leu Gly Glu Ala Pro Ser Ala Trp Gly Lys His Leu Thr 50 55 60 Ala Gln Leu Phe Phe Gly Lys Gly Thr Gln Leu Ile Val Glu Pro 65 70 75 <210> 22 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 23 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 23 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Ser Trp Asp Thr Arg Gln Met Phe Phe Gly 100 105 110 Thr Gly Ile Lys Leu Phe Val Glu Pro 115 120 <210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu Ala 85 90 95 Pro Ser Ala Trp Gly Lys His Leu Thr Ala Gln Leu Phe Phe Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Gln Leu Ile Val Glu Pro 115 120 <210> 25 <211> 144 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 25 Ala Gln Lys Val Thr Gln Val Gln Arg Ala Met Ser Ser Gln Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val 115 120 125 Phe Val Met Lys Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe 130 135 140 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Val Ser Met Pro Val Arg Lys Ala Val Thr Leu 1 5 10 <210> 27 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 27 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Asn 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gln 1 5 10 15 <210> 29 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser 1 5 10 15 Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gln 20 25 <210> 30 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Ala Gln Lys Val Thr Gln Val Gln Arg Ala Met Ser Ser Gln Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Val Thr Leu Ser Cys Gln Tyr Glu Thr Ser Leu Ser Trp Tyr 20 25 30 Asp Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Gly Glu Met Thr Phe Leu 35 40 45 Ile His Gln Ile Ser Ser Asp Gln Asn Ala Lys Asn Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Gln Glu Arg His Lys Phe Ile Ser Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr Lys Pro Ser Val 115 120 125 Phe Val Met Lys Asn Gly Thr Asn Val Ala Cys Leu Val Lys Glu Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp 145 <210> 31 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Ser Trp Trp Ser Tyr Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser 1 5 10 15 <210> 32 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 32 Ser Trp Trp Ser Tyr Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys 1 5 10 15 Glu Met Ile Phe Leu Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys 20 25 30 Ser Gly Arg Tyr Ser Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala 35 40 45 Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys 50 55 60 Ala Leu Gly Thr Gly Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile 65 70 75 80 Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 85 90 <210> 33 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser 1 5 <210> 34 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr Tyr Ile Phe Trp 1 5 10 15 Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu Ile Arg Gln Gly 20 25 30 Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser Val Asn Phe Lys 35 40 45 Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gln Leu Glu 50 55 60 Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly Val Arg Gly Leu 65 70 75 80 Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val 85 90 95 Glu Pro <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser Val Asn Phe 1 5 10 <210> 36 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 36 Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser 1 5 10 15 Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr 20 25 30 Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys 35 40 45 Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 50 55 60 <210> 37 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 37 Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser 1 5 10 15 Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr 20 25 30 Phe Cys Ala Leu Gly Glu Ala Pro Ser Ala Trp Gly Lys His Leu Thr 35 40 45 Ala Gln Leu Phe Phe Gly Lys Gly Thr Gln Leu Ile Val Glu Pro 50 55 60 <210> 38 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 38 Ala Gln Lys Val Thr Gln Val Gln Arg Ala Met Ser Ser Gln Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Val Thr Leu Ser Cys Gln Tyr Glu Thr Ser Leu Ser Trp Tyr 20 25 30 Asp Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Gly Glu Met Thr Phe Leu 35 40 45 Ile His Gln Ile Ser Ser Asp Gln Asn Ala Lys Asn Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Gln Glu Arg His Lys Phe Ile Ser Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 39 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Pro 85 90 95 Leu Gly Gly Pro Pro Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val 100 105 110 Thr Val Glu Pro 115 <210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 41 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 41 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Phe Leu Asn Asn Gln Ala Val Leu Asn Ile Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Pro 85 90 95 Leu Gly Gly Pro Pro Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val 100 105 110 Thr Val Glu Pro 115 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Glu Ala Ile Gly Asn Tyr Tyr 1 5 <210> 43 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 43 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Asp Ser Ile Ser Asn 20 25 30 Tyr Tyr Thr Phe Trp Tyr Arg Arg Thr Pro Gly Asn Thr Met Thr Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Gly Gly Thr Tyr Gly Pro Gly Phe Glu Asp Asn Leu 50 55 60 Gln Gly Glu Ile Asp Phe Leu Asn Asn Gln Ala Val Leu Asn Ile Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Pro 85 90 95 Leu Gly Gly Pro Pro Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val 100 105 110 Thr Val Glu Pro 115 <210> 44 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Lys Asp Asn Phe Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala 1 5 10 <210> 45 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 45 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Glu Asp Asn Leu 50 55 60 Gln Gly Glu Ile Asp Phe Leu Asn Asn Gln Ala Val Leu Asn Ile Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Pro 85 90 95 Leu Gly Gly Pro Pro Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val 100 105 110 Thr Val Glu Pro 115 <210> 46 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly 20 25 <210> 47 <211> 116 <212> PRT <213> Tursiops truncatus <400> 47 Ala Val Thr Leu Val Pro Gln Asn Gln Ala Arg Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Asp Ser Ile Ser Asn 20 25 30 Tyr Tyr Thr Phe Trp Tyr Arg Arg Thr Pro Gly Asn Thr Met Thr Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Gly Gly Thr Tyr Gly Pro Gly Phe Glu Asp Asn Leu 50 55 60 Gln Gly Glu Ile Asp Phe Leu Asn Asn Gln Ala Val Leu Asn Ile Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Pro 85 90 95 Leu Gly Gly Pro Pro Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val 100 105 110 Thr Val Glu Pro 115 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 48 gcccagaagg ttactcaagc ccagtc 26 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 49 gccattgagt tggtgcctga acacc 25 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 50 ttacaagaaa aataacttgg cagtcaagag aaa 33 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 51 tcttccaact tggaagggag aacgaagtc 29 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 52 tcttccaact tggaaggggg aacga 25 <210> 53 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 53 tcttccaact tggaagggag aacaaagtc 29 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 54 gcaggtcacc tagagcaacc tcaaatttcc 30 <210> 55 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 55 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Pro Val 85 90 95 Val Ile Pro Lys Gly Lys Leu Ser Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr 100 105 110 Val Glu Pro 115 <210> 56 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 56 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu Leu 85 90 95 Cys Leu Gly Asp Thr Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 57 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 57 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Asp Pro 85 90 95 Lys Val Tyr Trp Gly Cys Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 58 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 58 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asp Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Ala Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 59 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 59 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Leu Leu Gly 85 90 95 Asp Thr Ser Phe Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg 100 105 110 Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 60 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 60 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Ala Leu Leu Pro 85 90 95 Phe Leu Pro Ser Asp Trp Gly Ile Pro Val Thr Asp Lys Leu Ile Phe 100 105 110 Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 115 120 <210> 61 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 61 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 62 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 62 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Gly Leu 85 90 95 Ser Ser Leu Asp Leu Gly Asp Thr Asp Asn His Tyr Thr Asp Lys Leu 100 105 110 Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 115 120 <210> 63 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 63 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly His Pro 85 90 95 Arg Ser Leu Met Gly Val Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly 100 105 110 Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 64 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 64 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu Gly Ser Thr Gly Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Leu 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ser Tyr Thr Ser Ser Val Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Asp Thr Tyr Gly Ser Thr Arg Lys Asn Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Trp Asp Asp Gly Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Val 100 105 110 Val Thr <210> 65 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 65 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Asp Asp Thr Arg Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe 100 105 110 Ala Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 66 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 66 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu Gly Ser Thr Gly Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Leu 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ser Tyr Thr Ser Ser Val Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Asp Thr Tyr Gly Ser Thr Arg Lys Asn Leu Arg Met 65 70 75 80 Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Trp Ser Asp Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Val Val 100 105 110 Thr <210> 67 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 67 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Ile His Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Val Val Thr 115 <210> 68 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 68 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Asn Thr Cys Asp Leu Ala Glu Gly Ser Asn Gly Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Thr Pro Gln Arg Leu Gln 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ser Tyr Asn Ser Lys Val Val Leu Glu Ser Gly Val Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Tyr Thr Tyr Ala Ser Thr Arg Asn Asn Leu Arg Leu 65 70 75 80 Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Trp Asp Cys His Tyr Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Val Val Thr 115 <210> 69 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 69 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Thr Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Thr Val Thr Asn Thr Phe Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Leu 35 40 45 Tyr Tyr Asp Val Ser Thr Ala Arg Asp Val Leu Glu Ser Gly Leu Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Tyr Thr His Thr Pro Arg Arg Trp Ser Trp Ile Leu 65 70 75 80 Arg Leu Gln Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Trp Asp Arg Arg Trp Ile Lys Thr Phe Ala Lys Gly Thr Lys Leu 100 105 110 Ile Val Thr Ser Pro 115 <210> 70 <211> 127 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 70 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu Gly Ser Asn Gly Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Gln 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ser Tyr Asn Ser Lys Val Val Leu Glu Ser Gly Val Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Tyr Thr Tyr Ala Ser Thr Arg Asn Asn Leu Arg Leu 65 70 75 80 Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Trp Asp Gly Leu Asp Ala Thr Cys Gly Val Asp Thr Thr Gly Trp 100 105 110 Phe Lys Ile Phe Ala Glu Gly Thr Lys Leu Ile Val Thr Ser Pro 115 120 125 <210> 71 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 71 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Thr Arg Pro Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Val Ile Thr Cys Asp Leu Pro Val Glu Asn Ala Val Tyr 20 25 30 Thr His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Arg Arg Leu Leu 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ser Tyr Thr Ser Ser Val Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Asp Thr Tyr Gly Ser Thr Arg Lys Asn Leu Arg Met 65 70 75 80 Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Val Val Thr 100 105 110 <210> 72 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 72 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Glu Ile Ala Ser Gln Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val 100 105 110 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 73 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 73 Ser Ser Asn Leu Gly Gly Arg Thr Lys Ser Val Thr Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Thr Val Thr Asn Thr Phe Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Leu 35 40 45 Tyr Tyr Asp Val Ser Thr Ala Arg Asp Val Leu Glu Ser Gly Leu Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Tyr Thr His Thr Pro Arg Arg Trp Ser Trp Ile Leu 65 70 75 80 Arg Leu Gln Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Trp Asp Arg Tyr Tyr Tyr Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Val Val Thr 115 <210> 74 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 74 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Thr Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Thr Val Thr Asn Thr Phe Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Leu 35 40 45 Tyr Tyr Asp Val Ser Thr Ala Arg Asp Val Leu Glu Ser Gly Leu Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Tyr Thr His Thr Pro Arg Arg Trp Ser Trp Ile Leu 65 70 75 80 Arg Leu Gln Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Pro Asn 85 90 95 Ser Ser Asp Trp Ile Lys Thr Phe Ala Lys Gly Thr Lys Leu Ile Val 100 105 110 Thr Ser Pro 115 <210> 75 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 75 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Gly Thr Lys Ser Val Thr Arg Pro Thr Arg 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu Arg Asn Thr Phe Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Gln 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ser Tyr Thr Ser Ser Val Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Asp Thr Tyr Gly Ser Thr Arg Lys Asn Leu Arg Met 65 70 75 80 Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Arg Asp Val Pro Asn Tyr Tyr Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Val Val Thr 115 <210> 76 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 76 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu Gly Ser Asn Gly Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Gln 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ser Tyr Asn Ser Lys Val Val Leu Glu Ser Gly Val Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Tyr Thr Tyr Ala Ser Thr Arg Asn Asn Leu Arg Leu 65 70 75 80 Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Trp Asp Gly Arg Val Ser Tyr Thr Thr Gly Trp Phe Lys Ile Phe 100 105 110 Ala Glu Gly Thr Lys Leu Ile Val Thr Ser Pro 115 120 <210> 77 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 77 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu Gly Ser Thr Gly Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Leu 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ser Tyr Thr Ser Ser Val Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Asp Thr Tyr Gly Ser Thr Arg Lys Asn Leu Arg Met 65 70 75 80 Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Trp Asp Lys Gly Arg Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu Val 100 105 110 Val Thr <210> 78 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 78 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Glu Thr His Tyr Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Val Val Thr 115 <210> 79 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 79 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu Gly Ser Asn Gly Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Gln 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ser Tyr Asn Ser Lys Val Val Leu Glu Ser Gly Val Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Tyr Thr Tyr Ala Ser Thr Arg Asn Asn Leu Arg Leu 65 70 75 80 Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Trp Asp Gly Arg Tyr Lys Lys Leu Phe Gly Ser Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Val Val Thr 115 <210> 80 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 80 Ser Ser Asn Leu Glu Gly Arg Thr Lys Ser Val Ile Arg Gln Thr Gly 1 5 10 15 Ser Ser Ala Glu Ile Thr Cys Asp Leu Ala Glu Gly Ser Thr Gly Tyr 20 25 30 Ile His Trp Tyr Leu His Gln Glu Gly Lys Ala Pro Gln Arg Leu Leu 35 40 45 Tyr Tyr Asp Ser Tyr Thr Ser Ser Val Val Leu Glu Ser Gly Ile Ser 50 55 60 Pro Gly Lys Tyr Asp Thr Tyr Gly Ser Thr Arg Lys Asn Leu Arg Met 65 70 75 80 Ile Leu Arg Asn Leu Ile Glu Asn Asp Ser Gly Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Thr Trp Gly Thr Thr Gly Trp Phe Lys Ile Phe Ala Glu Gly Thr Lys 100 105 110 Leu Ile Val Thr Ser Pro 115 <210> 81 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 81 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Lys 85 90 95 Val Leu Gly Val Pro Thr Ala Ser Tyr Thr Asp Asn Lys Leu Ile Phe 100 105 110 Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 115 120 <210> 82 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 82 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Ser Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr 85 90 95 Val Gly Ile Leu Pro Tyr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg 100 105 110 Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 83 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 83 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Ile 85 90 95 Leu Thr Val Leu Gly Asp Asn Arg Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys 100 105 110 Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 115 120 <210> 84 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 84 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Val 85 90 95 Val Gly Glu Gly Gly Ala Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg 100 105 110 Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 85 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 85 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr 85 90 95 Val Gly Gly Gly Glu Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 86 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 86 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr 85 90 95 Val Gly Thr Gly Asp Ile Arg Thr Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly 100 105 110 Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 115 120 <210> 87 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 87 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Ser 85 90 95 Leu Thr Gly Gly Ser Gly Leu Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly 100 105 110 Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 88 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 88 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Pro Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr 85 90 95 Gly Gly Tyr Ser Ser Trp Asp Thr Arg Gln Met Phe Phe Gly Thr Gly 100 105 110 Ile Lys Leu Phe Val Glu Pro 115 <210> 89 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 89 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Pro 85 90 95 Leu Lys Thr Leu Gly Thr Tyr Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly 100 105 110 Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 90 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 90 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Ala 85 90 95 Val Ile Ala Gly Gly Ser Phe Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly 100 105 110 Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 91 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 91 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Glu Asp Gln Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 92 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 92 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Ala Tyr Pro Pro Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val 100 105 110 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 93 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 93 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Ala Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Glu Val Gln Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 94 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 94 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Cys Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Glu Val Leu Gln Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val 100 105 110 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 95 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 95 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Lys Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Glu Val Arg Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 96 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 96 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Arg Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 <210> 97 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 97 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Glu Ala Gln Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 98 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 98 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Glu Thr Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe Gly 100 105 110 Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 99 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 99 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Glu Glu Val Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val Phe 100 105 110 Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 100 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 100 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Pro Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Glu Pro Pro Gln Ser Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val 100 105 110 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 101 <211> 355 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 gcccagaagg ttactcaagc ccagtcatca gtatccatgc cagtgaggaa agcagtcacc 60 ctgaactgcc tgtatgaaac aagttggtgg tcatattata ttttttggta caagcaactt 120 cccagcaaag agatgatttt ccttattcgc cagggttctg atgaacagaa tgcaaaaagt 180 ggtcgctatt ctgtcaactt caagaaagca gcgaaatccg tcgccttaac catttcagcc 240 ttacagctag aagattcagc aaagtacttt tgtgctcttg ggacgggggt gaggggactc 300 caggacaccg ataaactcat ctttggaaaa ggaacccgtg tgactgtgga accaa 355 <210> 102 <211> 367 <212> DNA <213> Tursiops truncatus <400> 102 gcccagaaag ttactcaagt ccagcgagcc atgtccagtc agctagggga ggcggtcacc 60 ttgagctgtc agtatgaaac aagcttgagc tggtacgata ttttttggta taagcagctt 120 cccagtggag agatgacttt ccttattcat cagatttctt ctgaccaaaa tgcaaagaat 180 ggccgctatt ctgtaaactt tcaggaaaga cataaattca tcagcctcac catttcagcc 240 ttactggtgg aagattctgc aaactacttc tgtgctctcc gggagcgcgt tgtccacgtc 300 gttttattca atacgcgcaa taagccactg ctattcggca aaggaaccta tctgaacgtt 360 gaaccaa 367 <210> 103 <211> 122 <212> PRT <213> Tursiops truncatus <400> 103 Ala Gln Lys Val Thr Gln Val Gln Arg Ala Met Ser Ser Gln Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Val Thr Leu Ser Cys Gln Tyr Glu Thr Ser Leu Ser Trp Tyr 20 25 30 Asp Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Gly Glu Met Thr Phe Leu 35 40 45 Ile His Gln Ile Ser Ser Asp Gln Asn Ala Lys Asn Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Gln Glu Arg His Lys Phe Ile Ser Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Leu Val Glu Asp Ser Ala Asn Tyr Phe Cys Ala Leu Arg Glu Arg 85 90 95 Val Val His Val Val Leu Phe Asn Thr Arg Asn Lys Pro Leu Leu Phe 100 105 110 Gly Lys Gly Thr Tyr Leu Asn Val Glu Pro 115 120 <210> 104 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 104 gcccagaaag ttactcaagt ccagcgagcc atgtccatgc cagtgaggaa agcagtcacc 60 ctgaactgcc tgtatgaaac aagttggtgg tcatattata ttttttggta caagcaactt 120 cccagcaaag agatgatttt ccttattcgc cagggttctg atgaacagaa tgcaaaaagt 180 ggtcgctatt ctgtcaactt caagaaagca gcgaaatccg tcgccttaac catttcagcc 240 ttacagctag aagattcagc aaagtacttt tgtgctcttg ggacgggggt gaggggactc 300 caggacaccg ataaactcat ctttggaaaa ggaacccgtg tgactgtgga accaa 355 <210> 105 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 105 Ala Gln Lys Val Thr Gln Val Gln Arg Ala Met Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 106 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 106 gcccagaaag ttactcaagt ccagcgagcc atgtccagtc agctagggga ggcggtcacc 60 ttgaactgcc tgtatgaaac aagttggtgg tcatattata ttttttggta caagcaactt 120 cccagcaaag agatgatttt ccttattcgc cagggttctg atgaacagaa tgcaaaaagt 180 ggtcgctatt ctgtcaactt caagaaagca gcgaaatccg tcgccttaac catttcagcc 240 ttacagctag aagattcagc aaagtacttt tgtgctcttg ggacgggggt gaggggactc 300 caggacaccg ataaactcat ctttggaaaa ggaacccgtg tgactgtgga accaa 355 <210> 107 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 107 Ala Gln Lys Val Thr Gln Val Gln Arg Ala Met Ser Ser Gln Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 108 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 108 gcccagaaag ttactcaagt ccagcgagcc atgtccagtc agctagggga ggcggtcacc 60 ttgagctgtc agtatgaaac aagctggtgg tcatattata ttttttggta caagcaactt 120 cccagcaaag agatgatttt ccttattcgc cagggttctg atgaacagaa tgcaaaaagt 180 ggtcgctatt ctgtcaactt caagaaagca gcgaaatccg tcgccttaac catttcagcc 240 ttacagctag aagattcagc aaagtacttt tgtgctcttg ggacgggggt gaggggactc 300 caggacaccg ataaactcat ctttggaaaa ggaacccgtg tgactgtgga accaa 355 <210> 109 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 109 Ala Gln Lys Val Thr Gln Val Gln Arg Ala Met Ser Ser Gln Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Val Thr Leu Ser Cys Gln Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 110 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 110 gcccagaaag ttactcaagt ccagcgagcc atgtccagtc agctagggga ggcggtcacc 60 ttgagctgtc agtatgaaac aagcttgagc tggtacgata ttttttggta taagcagctt 120 cccagtaaag agatgatttt ccttattcgc cagggttctg atgaacagaa tgcaaaaagt 180 ggtcgctatt ctgtcaactt caagaaagca gcgaaatccg tcgccttaac catttcagcc 240 ttacagctag aagattcagc aaagtacttt tgtgctcttg ggacgggggt gaggggactc 300 caggacaccg ataaactcat ctttggaaaa ggaacccgtg tgactgtgga accaa 355 <210> 111 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 111 Ala Gln Lys Val Thr Gln Val Gln Arg Ala Met Ser Ser Gln Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Val Thr Leu Ser Cys Gln Tyr Glu Thr Ser Leu Ser Trp Tyr 20 25 30 Asp Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 112 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 112 gcccagaaag ttactcaagt ccagcgagcc atgtccagtc agctagggga ggcggtcacc 60 ttgagctgtc agtatgaaac aagcttgagc tggtacgata ttttttggta taagcagctt 120 cccagtggag agatgacttt ccttattcat cagatttctg atgaacagaa tgcaaaaagt 180 ggtcgctatt ctgtcaactt caagaaagca gcgaaatccg tcgccttaac catttcagcc 240 ttacagctag aagattcagc aaagtacttt tgtgctcttg ggacgggggt gaggggactc 300 caggacaccg ataaactcat ctttggaaaa ggaacccgtg tgactgtgga accaa 355 <210> 113 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 113 Ala Gln Lys Val Thr Gln Val Gln Arg Ala Met Ser Ser Gln Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Val Thr Leu Ser Cys Gln Tyr Glu Thr Ser Leu Ser Trp Tyr 20 25 30 Asp Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Gly Glu Met Thr Phe Leu 35 40 45 Ile His Gln Ile Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 114 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 114 gcccagaaag ttactcaagt ccagcgagcc atgtccagtc agctagggga ggcggtcacc 60 ttgagctgtc agtatgaaac aagcttgagc tggtacgata ttttttggta taagcagctt 120 cccagtggag agatgacttt ccttattcat cagatttctt ctgaccaaaa tgcaaagaat 180 ggccgctatt ctgtaaactt taagaaagca gcgaaatccg tcgccttaac catttcagcc 240 ttacagctag aagattcagc aaagtacttt tgtgctcttg ggacgggggt gaggggactc 300 caggacaccg ataaactcat ctttggaaaa ggaacccgtg tgactgtgga accaa 355 <210> 115 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 115 Ala Gln Lys Val Thr Gln Val Gln Arg Ala Met Ser Ser Gln Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Val Thr Leu Ser Cys Gln Tyr Glu Thr Ser Leu Ser Trp Tyr 20 25 30 Asp Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Gly Glu Met Thr Phe Leu 35 40 45 Ile His Gln Ile Ser Ser Asp Gln Asn Ala Lys Asn Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu Gln Asp Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr 100 105 110 Arg Val Thr Val Glu Pro 115 <210> 116 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 116 gcccagaaag ttactcaagt ccagcgagcc atgtccagtc agctagggga ggcggtcacc 60 ttgagctgtc agtatgaaac aagcttgagc tggtacgata ttttttggta taagcagctt 120 cccagtggag agatgacttt ccttattcat cagatttctt ctgaccaaaa tgcaaagaat 180 ggccgctatt ctgtaaactt tcaggaaaga cataaattca tcagcctcac catttcagcc 240 ttacagctag aagattcagc aaagtacttt tgtgctcttg ggacgggggt gaggggactc 300 caggacaccg ataaactcat ctttggaaaa ggaacccgtg tgactgtgga accaa 355 <210> 117 <211> 367 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 gcaggtcacc tagagcaacc tcaaatttcc agtactaaaa cgctgtcaaa aacagcccgc 60 ctggaatgtg tggtgtctgg aataacaatt tctgcaacat ctgtatattg gtatcgagag 120 agacctggtg aagtcataca gttcctggtg tccatttcat atgacggcac tgtcagaaag 180 gaatccggca ttccgtcagg caaatttgag gtggatagga tacctgaaac gtctacatcc 240 actctcacca ttcacaatgt agagaaacag gacatagcta cctactactg tgccttgtgg 300 gaggtaaagc aagagttggg caaaaaaatc aaggtatttg gtcccggaac aaagcttatc 360 attacag 367 <210> 118 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 118 Ala Gly His Leu Glu Gln Pro Gln Ile Ser Ser Thr Lys Thr Leu Ser 1 5 10 15 Lys Thr Ala Arg Leu Glu Cys Val Val Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ala 20 25 30 Thr Ser Val Tyr Trp Tyr Arg Glu Arg Pro Gly Glu Val Ile Gln Phe 35 40 45 Leu Val Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Val Arg Lys Glu Ser Gly Ile 50 55 60 Pro Ser Gly Lys Phe Glu Val Asp Arg Ile Pro Glu Thr Ser Thr Ser 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile His Asn Val Glu Lys Gln Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Leu Trp Glu Val Lys Gln Glu Leu Gly Lys Lys Ile Lys Val 100 105 110 Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr 115 120 <210> 119 <211> 349 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 gccattgagt tggtgcctga acaccaaaca gtgcctgtgt caataggggt ccctgccacc 60 ctcaggtgct ccatgaaagg agaagcgatc ggtaactact atatcaactg gtacaggaag 120 acccaaggta acacaatgac tttcatatac cgagaaaagg acatctatgg ccctggtttc 180 aaagacaatt tccaaggtga cattgatatt gcaaagaacc tggctgtact taagatactt 240 gcaccatcag agagagatga agggtcttac tactgtgcct gtgaccctct tggcggaccc 300 cccgataaac tcatctttgg aaaaggaacc cgtgtgactg tggaaccaa 349 <210> 120 <211> 349 <212> DNA <213> Tursiops truncatus <400> 120 gctgtcacgt tggtgcctca aaaccaagca aggagtgtgt ctgtggggga atctgtcacc 60 ctcaggtgct ccatgaaagg agactccatc agtaactatt ataccttctg gtacaggaga 120 acaccgggta acacaatgac tctcatatac cgagaagggg gcacatatgg ccctggtttc 180 gaagacaacc tccaaggtga aattgatttt ttaaacaacc aggctgtgct gaatatcctg 240 gaggcatcag agagagatga aggatcttac tactgtgcct gtgaccctct tggcggaccc 300 cccgataaac tcatctttgg aaaaggaacc cgtgtgactg tggaaccaa 349 <210> 121 <211> 349 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 121 gccattgagt tggtgcctga acaccaaaca gtgcctgtgt caataggggt ccctgccacc 60 ctcaggtgct ccatgaaagg agactccatc agtaactatt ataccttctg gtacaggaga 120 acaccgggta acacaatgac tctcatatac cgagaagggg gcacatatgg ccctggtttc 180 gaagacaacc tccaaggtga aattgatttt ttaaacaacc aggctgtgct gaatatcctg 240 gaggcatcag agagagatga aggatcttac tactgtgcct gtgaccctct tggcggaccc 300 cccgataaac tcatctttgg aaaaggaacc cgtgtgactg tggaaccaa 349 <210> 122 <211> 349 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 122 gccattgagt tggtgcctga acaccaaaca gtgcctgtgt caataggggt ccctgccacc 60 ctcaggtgct ccatgaaagg agaagcgatc ggtaactact atatcaactg gtacaggaga 120 acaccgggta acacaatgac tctcatatac cgagaagggg gcacatatgg ccctggtttc 180 gaagacaacc tccaaggtga aattgatttt ttaaacaacc aggctgtgct gaatatcctg 240 gaggcatcag agagagatga aggatcttac tactgtgcct gtgaccctct tggcggaccc 300 cccgataaac tcatctttgg aaaaggaacc cgtgtgactg tggaaccaa 349 <210> 123 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 123 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Arg Thr Pro Gly Asn Thr Met Thr Leu 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Gly Gly Thr Tyr Gly Pro Gly Phe Glu Asp Asn Leu 50 55 60 Gln Gly Glu Ile Asp Phe Leu Asn Asn Gln Ala Val Leu Asn Ile Leu 65 70 75 80 Glu Ala Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Pro 85 90 95 Leu Gly Gly Pro Pro Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val 100 105 110 Thr Val Glu Pro 115 <210> 124 <211> 349 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 124 gccattgagt tggtgcctga acaccaaaca gtgcctgtgt caataggggt ccctgccacc 60 ctcaggtgct ccatgaaagg agaagcgatc ggtaactact atatcaactg gtacaggaag 120 acccaaggta acacaatgac tttcatatac cgagaaaagg acatctatgg ccctggtttc 180 gaagacaacc tccaaggtga aattgatttt ttaaacaacc aggctgtgct gaatatcctg 240 gaggcatcag agagagatga aggatcttac tactgtgcct gtgaccctct tggcggaccc 300 cccgataaac tcatctttgg aaaaggaacc cgtgtgactg tggaaccaa 349 <210> 125 <211> 349 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 125 gccattgagt tggtgcctga acaccaaaca gtgcctgtgt caataggggt ccctgccacc 60 ctcaggtgct ccatgaaagg agaagcgatc ggtaactact atatcaactg gtacaggaag 120 acccaaggta acacaatgac tttcatatac cgagaaaagg acatctatgg ccctggtttc 180 aaagacaatt tccaaggtga cattgatttt ttaaacaacc aggctgtgct gaatatcctg 240 gaggcatcag agagagatga aggatcttac tactgtgcct gtgaccctct tggcggaccc 300 cccgataaac tcatctttgg aaaaggaacc cgtgtgactg tggaaccaa 349 <210> 126 <211> 349 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 gccattgagt tggtgcctga acaccaaaca gtgcctgtgt caataggggt ccctgccacc 60 ctcaggtgct ccatgaaagg agaagcgatc agtaactact atatcaactg gtacaggaag 120 acccaaggta acacaatgac tttcatatac cgagaaaagg acatctatgg ccctggtttc 180 aaagacaatt tccaaggtga cattgatatt gcaaagaacc tggctgtact taagatactt 240 gcaccatcag agagagatga agggtcttac tactgtgcct gtgaccctct tggcggaccc 300 cccgataaac tcatctttgg aaaaggaacc cgtgtgactg tggaaccaa 349 <210> 127 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 127 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Ser Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Pro 85 90 95 Leu Gly Gly Pro Pro Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val 100 105 110 Thr Val Glu Pro 115 <210> 128 <211> 349 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 gccattgagt tggtgcctga acaccaaaca gtgcctgtgt caataggggt ccctgccacc 60 ctcaggtgct ccatgaaagg agaagcgatc ggtaactact atatcaactg gtacaggaag 120 acccaaggta acacaatgac tttcatatac cgagaaaagg gcatctatgg ccctggtttc 180 aaagacaatt tccaaggtga cattgatatt gcaaagaacc tggctgtact taagatactt 240 gcaccatcag agagagatga agggtcttac tactgtgcct gtgaccctct tggcggaccc 300 cccgataaac tcatctttgg aaaaggaacc cgtgtgactg tggaaccaa 349 <210> 129 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 129 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Pro 85 90 95 Leu Gly Gly Pro Pro Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val 100 105 110 Thr Val Glu Pro 115 <210> 130 <211> 349 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 gccattgagt tggtgcctga acaccaaaca gtgcctgtgt caataggggt ccctgccacc 60 ctcaggtgct ccatgaaagg agaagcgatc ggtaactact atatcaactg gtacaggaag 120 acccaaggta acacaatgac tttcatatac cgagaaaagg acatctatgg ccctggtttc 180 aaagacaatt tccaaggtga cattgatatt gcaaagaacc tggctgtact taagatactt 240 gcaccatcag agagagatga agggtcttac tactgtgcct ctgaccctct tggcggaccc 300 cccgataaac tcatctttgg aaaaggaacc cgtgtgactg tggaaccaa 349 <210> 131 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 131 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Ser Asp Pro 85 90 95 Leu Gly Gly Pro Pro Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val 100 105 110 Thr Val Glu Pro 115 <210> 132 <211> 287 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(285) <400> 132 gcc cag aag gtt act caa gcc cag tca tca gta tcc atg cca gtg agg 48 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 aaa gca gtc acc ctg aac tgc ctg tat gaa aca agt tgg tgg tca tat 96 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 tat att ttt tgg tac aag caa ctt ccc agc aaa gag atg att ttc ctt 144 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 att cgc cag ggt tct gat gaa cag aat gca aaa agt ggt cgc tat tct 192 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 gtc aac ttc aag aaa gca gcg aaa tcc gtc gcc tta acc att tca gcc 240 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 tta cag cta gaa gat tca gca aag tac ttt tgt gct ctt ggg gaa ct 287 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu 85 90 95 <210> 133 <211> 95 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 133 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu 85 90 95 <210> 134 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(288) <400> 134 gcc att gag ttg gtg cct gaa cac caa aca gtg cct gtg tca ata ggg 48 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 gtc cct gcc acc ctc agg tgc tcc atg aaa gga gaa gcg atc ggt aac 96 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 tac tat atc aac tgg tac agg aag acc caa ggt aac aca atc act ttc 144 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Ile Thr Phe 35 40 45 ata tac cga gaa aag gac atc tat ggc cct ggt ttc aaa gac aat ttc 192 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 caa ggt gac att gat att gca aag aac ctg gct gta ctt aag ata ctt 240 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 gca cca tca gag aga gat gaa ggg tct tac tac tgt gcc tgt gac acc 288 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr 85 90 95 <210> 135 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 135 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Ile Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr 85 90 95 <210> 136 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(288) <400> 136 gcc att gag ttg gtg cct gaa cac caa aca gtg cct gtg tca ata agg 48 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 atc cct gcc acc ctc agg tgc tcc atg aaa gga gaa gcg atc ggt aac 96 Ile Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 tac tat atc aac tgg tac agg aag acc caa ggt aac aca atg act ttc 144 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 ata tac cga gaa aag gac atc tat ggc cct ggt ttc aaa gac aat ttc 192 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 caa ggt gac att gat att gca aag aac ctg gct gta ctt aag ata ctt 240 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 gca cca tca gag aga gat gaa ggg tct tac tac tgt gcc tgt gac acc 288 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr 85 90 95 <210> 137 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 137 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Ile Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr 85 90 95 <210> 138 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 138 Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly Val Arg Gly Leu Gln Asp 1 5 10 15 Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 20 25 30 Arg Ser Gln Pro His Thr 35 <210> 139 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 139 Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Leu Pro Phe Leu Pro Ser Asp Trp Gly 1 5 10 15 Ile Pro Val Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Arg Val Thr 20 25 30 Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr 35 40 <210> 140 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 140 Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu Ala Pro Ser Ala Trp Gly Lys 1 5 10 15 His Leu Thr Ala Gln Leu Phe Phe Gly Lys Gly Thr Gln Leu Ile Val 20 25 30 Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr 35 40 <210> 141 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 141 Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu Ala Pro Ser Ala Trp Gly Lys 1 5 10 15 His Ser Trp Asp Thr Arg Gln Met Phe Phe Gly Thr Gly Ile Lys Leu 20 25 30 Phe Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr 35 40 <210> 142 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 142 Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly Val Arg Gly Leu Gln Asp 1 5 10 15 Thr Asp Lys Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Arg Val Thr Val Glu Pro 20 25 30 Arg Ser Gln Pro His Thr 35 <210> 143 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 143 Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Glu Ala Pro Ser Ala Trp Gly Lys 1 5 10 15 His Ser Trp Asp Thr Arg Gln Met Phe Phe Gly Lys Gly Ile Lys Leu 20 25 30 Phe Val Glu Pro Arg Ser Gln Pro His Thr 35 40 <210> 144 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 144 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu 100 <210> 145 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 145 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Tyr Ser Asp Asp Gly Asn Ala Arg Asp Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Gln Lys Ala Gln Lys Ser Ile Asn Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu 100 <210> 146 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 146 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Gly Gln Met Thr Tyr Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu 100 <210> 147 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 147 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Glu Leu Glu Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Val Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu 100 <210> 148 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 148 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Pro Asp Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu 100 <210> 149 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 149 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Asp Gly Asn Ala Lys Ser Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu 100 <210> 150 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 150 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val Ser Met Pro Val Arg 1 5 10 15 Lys Ala Val Thr Leu Asn Cys Leu Tyr Glu Thr Ser Trp Trp Ser Tyr 20 25 30 Tyr Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Lys Glu Met Ile Phe Leu 35 40 45 Ile Arg Gln Gly Ser Asp Glu Gln Asn Ala Arg Asp Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Lys Lys Ala Ala Lys Ser Val Ala Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Gln Leu Glu Asp Ser Ala Lys Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu 100 <210> 151 <211> 96 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 151 Ala Ile Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Pro Val Ser Ile Gly 1 5 10 15 Val Pro Ala Thr Leu Arg Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Gly Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Ile Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Asp Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Ile Ala Lys Asn Leu Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Cys Asp Thr 85 90 95 <210> 152 <211> 96 <212> PRT <213> Macaca mulatta <400> 152 Ala Val Glu Leu Val Pro Glu His Gln Thr Val Ile Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Pro Ala Thr Leu Lys Cys Ser Met Lys Gly Glu Ala Ile Ser Asn 20 25 30 Tyr Tyr Ile Asn Trp Tyr Arg Lys Thr Gln Gly Asn Thr Met Thr Phe 35 40 45 Ile Tyr Arg Glu Lys Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Phe Lys Asp Asn Phe 50 55 60 Gln Gly Asp Ile Asp Thr Glu Glu Asn Gln Ala Val Leu Lys Ile Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ser Glu Arg Asp Glu Gly Ser Tyr Tyr Cys Ala Ser Asp Arg 85 90 95 <210> 153 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 153 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Met Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Gly Gly 20 25 30 Tyr Asp Trp His Trp Ile Arg His Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp 35 40 45 Met Ala Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Ile Ser Val Thr His Asp Thr Ser Lys Asn Leu Phe Phe 65 70 75 80 Leu Asn Leu Thr Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Gly Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 154 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 154 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Val Tyr Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Arg Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Ala Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Lys Ser Gly Arg Tyr Tyr Gly Asp Leu Phe Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 155 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 155 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Asp 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Arg Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Tyr Pro Lys Asn Val Gly Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Leu Trp Asp Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 156 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 156 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gln Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Ser Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Met Asp Asp Tyr Asp Asp Gly Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 157 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 157 Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr His Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu 35 40 45 Trp Met Gly Tyr Ile His Asn Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Ser Phe 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Val Ala Tyr Tyr Ser Asn Ser Arg Glu Phe Trp Tyr Ala Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 158 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 158 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Tyr Gly Tyr Tyr Val Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 159 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 159 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Pro Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Lys Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Asp Asn Tyr Asp Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 160 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 160 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Gln Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Asp Asp Tyr Asp Glu Gly Tyr Phe Phe Asp Gln Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 161 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 161 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ala Glu Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 65 70 75 80 Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Leu Asp Tyr Gly Ser Ile Gly Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 162 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 162 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Ile Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Thr Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Ala Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Asn Ser Ala Tyr 65 70 75 80 Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ser Asn Asp Val Cys Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 163 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 163 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Lys Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Glu Met Tyr Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ala Val Pro Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 164 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 164 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Gly Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Ala Tyr Ala Ser Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Asn Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 165 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 165 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Ile Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Asp Leu Asp Pro Gly Thr Gly Val Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Val Trp Ser Ala Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 166 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 166 Glu Val Gln Leu Gln Met Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 167 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 167 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Asp Phe Asn Ile Lys Asp Asp 20 25 30 Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Glu Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Glu Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 168 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 168 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Asp Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Val Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ser Tyr Asp Tyr Asp Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 169 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 169 Glu Val Lys Phe Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ala Glu Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 65 70 75 80 Val Phe Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Gly Leu Asp Tyr Gly Ser Val Gly Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 170 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 170 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Val Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ile Arg Pro Arg Gly Gly Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 171 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 171 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Asp 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Arg Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Glu Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 172 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 172 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Asp Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Pro Arg Gly Gly Ser His Phe Asp His Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Pro Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 173 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 173 Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Asn Leu Glu 35 40 45 Trp Met Gly Tyr Ile Ser His Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Val Tyr Tyr Gly Asp Tyr Glu Val Trp Tyr Thr Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 174 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 174 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Asp Tyr Lys Phe Thr Asp Ser 20 25 30 Glu Met Tyr Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Ala Val Pro Pro Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 175 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 175 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly His Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn His Ile Tyr Tyr Tyr Asp Gly Gly Tyr Phe Tyr Tyr Ala 100 105 110 Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 176 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 176 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe Pro Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly Arg Thr Ala Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Tyr Gly Ile Gln Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 177 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 177 Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser 1 5 10 15 Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser 20 25 30 Asp Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu 35 40 45 Trp Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Phe Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 178 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 178 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser 20 25 30 Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Tyr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Ser Arg Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Arg Gly Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 179 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 179 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Arg Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 180 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 180 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Gly Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 181 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 181 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Phe Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 182 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 182 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Tyr Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Ile Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 183 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 183 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Val Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Lys Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala 85 90 95 Thr His Phe Pro Leu Thr Cys Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 184 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 184 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110 Lys <210> 185 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 185 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Asn Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ser Ile Pro Cys 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 186 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 186 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Gly Ala Arg Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Phe Cys Gln His Phe Trp Asp Thr Thr Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 187 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 187 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Val Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Val Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Leu Gln Val 85 90 95 Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 <210> 188 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 188 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Leu Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 189 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 189 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Arg Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 190 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 190 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 191 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 191 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Phe Leu Gln Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 192 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 192 Ser Asp Val Val Arg Pro Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 193 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 193 Asp Val Val Met Thr Gln Ile Pro Val Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Phe 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 194 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 194 Ala Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser His Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 195 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 195 Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr Asn Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln His His Asn Glu Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 196 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 196 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Val Val His Arg 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Phe Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 197 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 197 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser His Gln Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 198 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 198 Ala Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser His Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 199 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 199 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Arg Tyr Ile 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Trp Tyr Ser Asp Thr Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 200 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 200 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Ala Leu Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ile Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Asn Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Thr Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 201 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 201 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ala Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 202 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 202 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Pro Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Leu Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 100 105 <210> 203 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 203 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Phe Trp Ile Tyr 35 40 45 Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Thr Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asp Ser Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 204 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 204 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp His Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Arg Ile Tyr 35 40 45 Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 205 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 205 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Met Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 206 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 206 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp 20 25 30 Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 207 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 207 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Gly Glu Asp Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ser Met Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 208 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 208 Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser 1 5 10 15 Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser 20 25 30 Gly Ser Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu 35 40 45 Trp Met Gly Tyr Ile His Asn Ser Gly Ser Thr Thr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Phe Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ser Thr Gly Pro Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 209 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 209 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Gly Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Phe Pro Gly Thr Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Gly Val Phe Gly Asn Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 210 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 210 Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Phe 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Leu Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Ser Ser Pro Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Gly Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Ser Tyr Gly Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 211 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 211 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Glu Ser Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Val Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Ser Ser Lys Pro Gly Trp Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 212 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 212 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Pro Glu Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Thr Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Ala Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Gly Glu Asp Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ser Met Asp Phe Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 213 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 213 Asp Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Thr Ile Ser Asn Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Asn Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Glu Tyr Asp Phe Asp Gly Glu Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 214 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 214 Gln Val Gln Leu Leu Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Tyr Pro Gly Ser Ser Ser Pro Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Phe Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Ile Gln Leu Ser Ser Leu Pro Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly Thr Phe Gly Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 215 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 215 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn His 20 25 30 Trp Ile Ser Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Phe Pro Gly Ser Ser Ser Pro Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Ala Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Trp Gly Asn Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 216 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 216 Asp Ile Val Leu Ile Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 217 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 217 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys 100 105 110 <210> 218 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 218 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Gly Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 219 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 219 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val 35 40 45 Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Gly Asp Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 220 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 220 Asp Leu Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Phe 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 221 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 221 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Ser Ser Ser Phe Ser Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asp Ile Tyr Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Gly Ala Thr Ser Leu Glu Ala Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Asn Asp Tyr Thr Leu Ser Ile Thr Ser Leu Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Tyr Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 222 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 222 Asp Ile Val Leu Ile Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Val Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 223 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 223 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Arg His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 224 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 224 Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Phe 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Ile Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 225 <211> 105 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 225 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Glu Ile Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Arg Val Asn Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Phe Tyr Ser Leu Thr Ile Ile Ser Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Asp Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Thr Phe 85 90 95 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 226 <211> 100 <212> PRT <213> Tursiops truncatus <400> 226 Ala Gln Lys Val Thr Gln Val Gln Arg Ala Met Ser Ser Gln Leu Gly 1 5 10 15 Glu Ala Val Thr Leu Ser Cys Gln Tyr Glu Thr Ser Leu Ser Trp Tyr 20 25 30 Asp Ile Phe Trp Tyr Lys Gln Leu Pro Ser Gly Glu Met Thr Phe Leu 35 40 45 Ile His Gln Ile Ser Ser Asp Gln Asn Ala Lys Asn Gly Arg Tyr Ser 50 55 60 Val Asn Phe Gln Glu Arg His Lys Phe Ile Ser Leu Thr Ile Ser Ala 65 70 75 80 Leu Leu Val Glu Asp Ser Ala Asn Tyr Phe Cys Ala Leu Gly Thr Gly 85 90 95 Val Arg Gly Leu 100 <210> 227 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 227 Ala Gln Lys Val Thr Gln Ala Gln Ser Ser Val 1 5 10

Claims

단리된 혼합 세포 집단으로부터 농축된 γδT-세포 집단을 생성하는 생체외 방법이며,
상기 혼합 세포 집단을, δ1TCR 또는 δ2TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1T-세포 또는 δ2T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제와 직접 접촉시켜서, 농축된 γδT-세포 집단의 임상적으로 적절한 수준을 제공하는 단계를 포함하고;
여기서 δ1T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제가 서열번호 153/180, 154/181, 156/183, 157/184, 158/185, 159/186, 160/187, 161/188, 163/190, 168/195, 172/199, 173/200, 175/202, 176/203, 및 179/206으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 서열 쌍의 6개 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체로부터 선택되거나;
δ2T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제가 서열번호 207/216, 209/219, 210/220, 211/221, 212/222, 213/223, 214/224, 및 215/225로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍의 6개 CDR을 포함하는 항체로부터 선택되는 것인,
생체외 방법.
제1항에 있어서,
상기 1종 이상의 제제가 δ1 TCR, δ3 TCR, δ4 TCR 및 δ5 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1 T-세포, δ3 T-세포, δ4 T-세포 및 δ5 T-세포를 선택적으로 확장시키거나, 또는
상기 1종 이상의 제제가 δ1 TCR 및 δ4 TCR의 특이적인 활성화 에피토프에 결합함으로써 δ1 T-세포 및 δ4 T-세포를 선택적으로 확장시키는 것인
방법.
제1항에 있어서,
(i) 상기 농축된 γδT-세포 집단이 항원 제시 세포 또는 아미노포스페이트에 의해 확장되지 않는 것;
(ii) δ1 T-세포 또는 δ2T-세포를 선택적으로 확장시키는 상기 1종 이상의 제제가 표면 상에 고정되는 것;
(iii) 상기 단리된 혼합 세포 집단이 말초 혈액 샘플, 제대혈 샘플 또는 종양으로부터 선택되는 것;
(iv) 상기 농축된 γδT-세포 집단이 다클론성 TCR 다양성을 포함하는 것;
(v) 상기 농축된 γδT-세포 집단이 대상체에 대한 투여를 위해 추가로 제형화되는 것;
(vi) 상기 농축된 γδT-세포 집단이 치료적 유효량의 γδT-세포를 포함하는 것; 및
(vii) 상기 γδT-세포 집단이 하나 이상의 항원 인식 모이어티를 안정하게 발현하도록 조작되는 것
중 하나 이상의 특징을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 농축된 γδ T-세포 집단의 적어도 일부를 (a) γδ T-세포를 확장시키고/거나 (b) αβ T-세포를 고갈시키는 1종 이상의 제제와 직접 접촉시켜 제2 농축된 γδ T-세포 집단을 생성하는 단계를 추가로 포함하되, 여기서 제2 농축된 γδ T-세포 집단이 임상적으로 적절한 수의 γδ T-세포를 포함하는 것인 방법.
제4항에 있어서,
제2 γδ T-세포 확장이 농축된 γδ T-세포 집단의 적어도 일부를 항원 제시 세포(APC)와 직접 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제4항에 있어서,
제2 γδ T-세포 확장이 농축된 γδ T-세포 집단의 적어도 일부를 δ1 T-세포; δ1 T-세포, δ3 T-세포, δ4 T-세포 및 δ5 T-세포; δ1 T-세포 및 δ4 T-세포; 또는 δ2 T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제와 직접 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서,
δ1T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제가 서열번호 154/181, 158/185, 160/187, 172/199, 및 175/202로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍의 6개 CDR을 포함하는 항체로부터 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서,
δ1T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제가 서열번호 158/185로 이루어진 HCVR/LCVR 서열 쌍의 6개 CDR을 포함하는 항체이거나;
서열번호 158/185로 이루어진 HCVR/LCVR 서열 쌍을 포함하는 항체인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 농축된 γδT-세포 집단 내 δ1T-세포의 백분율이 δ1T-세포의 60% 초과이거나, 또는
상기 농축된 γδT-세포 집단 내 δ2T-세포의 백분율이 δ2T-세포의 60% 초과 또는 80% 초과인
방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
무혈청 배양물 조건 및/또는 현탁액 세포 배양물 조건을 포함하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
- 제1 확장의 개시 단계,
- 공여자 샘플을 제공하는 단계, 또는
- 상기 혼합 세포 집단을 1종 이상의 제제와 직접 접촉시키는 제1 단계
로부터 90일 미만, 60일 미만, 30일 미만, 21일 미만 또는 19일 미만 내에 상기 단리된 혼합 세포 집단으로부터 확장된 적어도 10⁸개의 γδT-세포를 달성하는
방법.
제3항에 있어서,
농축된 γδT-세포 집단이 2개 이상의 항원 인식 모이어티를 발현하도록 조작되는 것인 방법.
제12항에 있어서,
2개 이상의 항원 인식 모이어티가 서로 상이하고, 각각의 상이한 항원 인식 모이어티가 동일한 항원의 상이한 에피토프를 인식하거나 상이한 항원의 상이한 에피토프를 인식하도록 조작되는 것인 방법.
제3항에 있어서,
항원 인식 모이어티가 종양 항원, 자가면역 질환 관련 항원, 또는 병원성 항원을 인식하는 것인 방법.
제14항에 있어서,
항원 인식 모이어티가 (i) 세포 표면 종양 항원, (ii) MHC와의 복합체(펩타이드-MHC 복합체)로서 세포 표면 상에서 발현되는 종양 항원으로부터 유래되는 펩타이드, (iii) 자가면역 질환 또는 병원소 관련 세포 표면 항원, 또는 (iv) MHC와의 복합체(펩타이드-MHC 복합체)로서 세포 표면 상에서 발현되는 자가면역 질환 또는 병원소 관련 항원으로부터 유래되는 펩타이드에 결합하는, TCR, αβ TCR, γδ TCR, 키메라 항원 수용체(CAR), 전체 항체 또는 그들의 항원-결합 단편, 단일쇄 가변 단편(scFv), 중쇄 또는 경쇄 단일 도메인 항체(sdAb), Fab, F(ab)₂, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제14항에 있어서,
병원성 항원이 박테리아 항원 또는 바이러스 항원인 방법.
제3항에 있어서,
조작된 γδT-세포가 적어도 하나의 HLA 좌위로부터의 유전자 발현을 결여하도록 추가로 조작되는 것인 방법.
제3항에 있어서,
조작된 γδT-세포가 보편적 공여자 세포인 방법.
제1항 내지 제8항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
단리된 혼합 세포 집단이 단핵구, αβ T-세포, B-세포, 및 NK 세포의 사전 고갈 없이 전체 PBMC(말초 혈액 단핵세포) 집단을 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
δ1 γδ T-세포 또는 δ2 γδ T-세포를 선택적으로 확장시키기 전에, 적혈구 세포, NK 세포, αβ 세포, B 세포, 단핵구, 및 대식세포 중 하나 이상을 제거하는 것을 추가로 포함하는 방법.
제1항 내지 제8항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
혼합 세포 집단을 δ1T-세포 또는 δ2T-세포를 선택적으로 확장시키는 1종 이상의 제제와 직접 접촉시키는 것이, IL-2, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 및 IL-33으로부터 선택되는 사이토카인을 포함하는 배양 조건을 추가로 포함하는 것인 방법.
제21항에 있어서,
사이토카인이 IL-2, IL-7, 및 IL-15로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제8항 및 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된, 각각 적어도 1 x 10⁸개의 δ1T-세포 또는 δ2T-세포를 포함하는 확장된 δ1 γδT-세포 집단 또는 확장된 δ2 γδT-세포 집단.
제23항에 따른 확장된 δ1 γδT-세포 집단 또는 확장된 δ2 γδT-세포 집단을 포함하는, 암, 자가면역 질환, 또는 염증성 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 암, 자가면역 질환, 또는 염증성 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물이며, γδT-세포가 항원 인식 모이어티를 발현하도록 조작되고, 항원 인식 모이어티가 각각 종양 항원, 자가면역 질환 관련 항원, 또는 병원성 항원을 인식하는 것인 약제학적 조성물.
제24항에 있어서,
항원 인식 모이어티가 (i) 세포 표면 종양 항원, (ii) MHC와의 복합체(펩타이드-MHC 복합체)로서 세포 표면 상에서 발현되는 종양 항원으로부터 유래되는 펩타이드, (iii) 자가면역 질환 또는 병원소 관련 세포 표면 항원, 또는 (iv) MHC와의 복합체(펩타이드-MHC 복합체)로서 세포 표면 상에서 발현되는 자가면역 질환 또는 병원소 관련 항원으로부터 유래되는 펩타이드에 결합하는, TCR, αβ TCR, γδ TCR, 키메라 항원 수용체(CAR), 전체 항체 또는 그들의 항원-결합 단편, 단일쇄 가변 단편(scFv), 중쇄 또는 경쇄 단일 도메인 항체(sdAb), Fab, F(ab)₂, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
(i) 서열번호 153/180, 154/181, 156/183, 157/184, 158/185, 159/186, 160/187, 161/188, 163/190, 168/195, 172/199, 173/200, 175/202, 176/203, 및 179/206으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역/경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 서열 쌍을 포함하거나;
(ii) 서열번호 153/180, 154/181, 156/183, 157/184, 158/185, 159/186, 160/187, 161/188, 163/190, 168/195, 172/199, 173/200, 175/202, 176/203, 및 179/206으로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍의 6개 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하거나;
(iii) 서열번호 207/216, 209/219, 210/220, 211/221, 212/222, 213/223, 214/224, 및 215/225로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍을 포함하거나; 또는
(iv) 서열번호 207/216, 209/219, 210/220, 211/221, 212/222, 213/223, 214/224, 및 215/225로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍의 6개 CDR을 포함하는
항체.
제26항에 있어서,
서열번호 154/181, 158/185, 160/187, 172/199, 및 175/202로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍을 포함하거나; 또는
서열번호 154/181, 158/185, 160/187, 172/199, 및 175/202로 이루어진 군으로부터 선택되는 HCVR/LCVR 서열 쌍의 6개 CDR을 포함하는
항체.
제27항에 있어서,
서열번호 158/185로 이루어진 HCVR/LCVR 서열 쌍을 포함하거나; 또는
서열번호 158/185로 이루어진 HCVR/LCVR 서열 쌍의 6개 CDR을 포함하는
항체.
제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는 핵산이며, 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 핵산.
제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 항체를 암호화하는, 이종성 프로모터에 작동 가능하게 연결되는 핵산; 및/또는 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 숙주 세포.
제30항에 있어서,
상기 핵산은 막 앵커(anchor) 또는 상기 항체에 융합된 막관통 도메인을 암호화하고, 상기 항체는 숙주 세포의 세포외 표면 상에 제시되는 것인 숙주 세포.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제