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KR102385078B1 - 길경 추출물을 포함하는 외막형 바이러스(enveloped viruses)의 예방 및 치료용 약학 조성물 - Google Patents

길경 추출물을 포함하는 외막형 바이러스(enveloped viruses)의 예방 및 치료용 약학 조성물 Download PDF

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KR102385078B1
KR102385078B1 KR1020210099561A KR20210099561A KR102385078B1 KR 102385078 B1 KR102385078 B1 KR 102385078B1 KR 1020210099561 A KR1020210099561 A KR 1020210099561A KR 20210099561 A KR20210099561 A KR 20210099561A KR 102385078 B1 KR102385078 B1 KR 102385078B1
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South Korea
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sars
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platycodin
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이창준
김태영
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기초과학연구원
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Abstract

본 발명은 길경(桔梗) 추출물 및 플라티코딘 D(Platycodin D)를 유효성분으로 함유하는 COVID-19의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 길경에 함유된 성분인 플라티코딘 D의 코로나 바이러스 19에 대한 세포 감염 억제 및 세포 내 감염성 바이러스의 생산 저해를 통한 COVID-19의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 이용한 COVID-19의 예방 및 치료방법에 관한 것으로, 본 발명의 길경 추출물 또는 이의 유효성분인 플라티코딘 D는 코로나 바이러스의 세포 진입 및 세포 감염에 대해 현저한 억제 효과를 나타내며, 코로나 바이러스의 세포 진입 및 세포 감염의 억제를 통한 치료 후보 물질인 클로로퀸 (Chloroquine), 카모스타트(Camostat), 나파모스타트 (Nafamostat)보다 현저한 효과를 나타냄을 확인하였다. 이를 통해, 코로나 바이러스를 예방하거나, 감염 초기 단계의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 길경 추출물 또는 플라티코딘 D는 코로나바이스의 패키징 시 감염에 중요한 스파이크 단백질의 절단을 억제함으로써, 세포 내 감염성 코로나 바이러스의 증식 및 확산을 억제하는 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성믈은 코로나 바이러스의 예방 및 치료에 유용하다.

Description

길경 추출물을 포함하는 외막형 바이러스(enveloped viruses)의 예방 및 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of Envelopled viruses comprising taining Platycodon grandiflorus root extracts}
본 발명은 길경(桔梗) 추출물, 및/또는 플라티코딘 D(Platycodin D)를 유효성분으로 함유하는 COVID-19의 예방 및 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 길경에 함유된 성분인 플라티코딘 D의 코로나 바이러스 19에 대한 세포 감염 억제 및 세포 내 감염성 바이러스의 생산 저해를 통한 COVID-19의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 이용한 COVID-19의 예방 및 치료방법에 관한 것이다.
코로나 바이러스(Corona Virus)는 RNA 바이러스의 한 종류로서, 유전 정보가 리보핵산(RNA)으로 이루어진 바이러스로, 사람과 동물의 호흡기와 소화기 계통의 감염을 유발한다. 코로나 바이러스는 주로 점막 전염, 비말 전파 등을 통해 쉽게 감염될 수 있으며, 사람에게는 일반적으로 경미한 호흡기 감염을 일으키나, 드물게 치명적 감염을 일으켜 사망에 이르게 하기도 한다.
상기 코로나 바이러스의 일종인 중증 급성 호흡기 증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2)는 중국 우한에서 출현하여 전 세계로 빠르게 확산되었으며, 세계보건기구(WHO)는 해당 바이러스에 감염된 질환을 COVID-19로 명명하였다. 최근 보고에 따르면, 감염의 일반적인 증상으로 발열(98.6%), 피로감(69.6%), 마른 기침(59.4%), 림프구 감소증(70.3%), 프로트롬빈 시간의 연장(58%) 및 젖산 탈수소효소의 증가(39.9%) 등을 들 수 있다(Wang, D. et al., JAMA, 2000).
상기 SARS-CoV-2는 기침 및 재채기로 형성된 호흡기 비말을 통한 사람과 사람의 접촉, 기침 또는 재채기에 의해 오염된 물체의 표면을 통해 주로 전염되는 것으로 보고된 바 있으며(CDC, C.f.d.c.a.p., How COVID-19 Spreads, Coronavirus Disease 2019 (COVID-19), 2020), 심지어 무증상 감염 또한 가능한 것으로 보고된 바 있다(Yu, P., et al., J Infect Dis, 2020; Hoehl, S., et al., N Engl J Med, 2020; Bendix A., Science Alert, 2020)
SARS-CoV-2 사례가 전 세계적으로 급증하면서, WHO는 2020년 1월 30일 '국제적 공중보건 비상사태'(PHEIC)를 선포했으며, 코로나 바이러스 감염 확진자가 전 세계에서 속출하자, WHO는 3월 11일 홍콩독감(1968), 신종플루(2009)에 이어 사상 세 번째로 COVID-19에 대해 팬데믹(세계적 대유행)을 선포했다.
현재, 미국, 영국을 비롯한 여러 국가의 제약회사에서 SARS-CoV-2의 예방 또는 치료를 위한 백신 및 치료제를 개발해 왔으며, 그 중 일부는 일부 국가에서 승인되어 일반인에게 투여되고 있다. 그러나, 상기 백신의 경우 심한 부작용을 유발하거나, 심한 경우 백신 투여를 받은 사람이 사망하기도 하는 등 완벽한 임상 절차를 거치지 않은 백신의 사용으로 인한 문제점이 다수 대두되고 있으며, 변종 바이러스의 출현 및 확산으로 인해 백신의 효용성에 대한 논란이 발생하고 있다.
따라서, 환자의 특징, 면역력, 상태 등에 관계없이 임상적 효과가 균일하게 우수하고, 특히 기저질환을 앓고 있는 환자, 또는 어린 아이와 노인을 포함하는, 면역력이 약한 노약자에 대한 치료 효과가 우수한, COVID-19에 특이적이며 치료 효과가 임상적으로 입증된 치료제 개발의 필요성이 절실한 상황이다.
Giulio N. et al., Eur J. Pharmacol. 882:173328 (2020.6.27.)
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명자들이 경의 노력한 결과, 길경 추출물에 포함된 유효성분인 플라티코딘 D(platycodin D)가 호흡기 질환과 관련하여 종래 알려진 기관 면역 강화, 기관지 관련 각종 항염, 및 배농 효과 외에도, 코로나바이러스 세포 내 진입의 두개의 주요 경로 i) 라이소솜의 카텝신 (cathepsins) 및, ii) 세포막의 TMPRSS2에 의한 코로나바이러스 스파이크 단백질 절단에 이은 코로나바이러스-세포간의 막 융합에 대한 억제능을 나타내며, 추가적으로, 플라티코딘 D가 바이러스 패키징 과정에서 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 절단을 억제하여, 바이러스 재조합 및 방출을 막음으로써, 세포 내 감염성 바이러스 생산을 저해하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 목적은 코로나 바이러스의 세포 진입 또는 세포 감염을 억제하는 길경 뿌리추출물, 또는 유효성분으로 플라티코딘 D(platycodin D)를 함유하는 조성물 및 이를 이용한 코로나 바이러스 감염증-19 (COVID-19)의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 플라티코딘 D(Platycodin D)를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 플라티코딘 D(Platycodin D)는 SARS-CoV-2의 세포 진입 억제 및/또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과의 결합을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 플라티코딘 D(Platycodin D)는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2)의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물을 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 SARS-CoV-2의 세포 진입 억제 및/또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과의 결합을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는 의약용 제제를 제공한다.
본 발명의 일 예에 따른 의약용 제제에 있어서, 상기 의약용 제제는 고상 투여형 또는 액상 투여형일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 의약용 제제에 있어서, 상기 의약용 제제는 경구, 비경구, 비내, 구소, 구강, 설하, 기도 분사 또는 직장 투여용일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 의약용 제제에 있어서, 상기 의약용 제제는 캡슐제, 환제, 정제, 용액제, 현탁제, 분무제, 발포제, 패치제 또는 페이스트제의 제형일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물 및/또는 플라티코딘 D(Platycodin D)를 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물, 플라티코딘 D(Platycodin D) 또는 그 혼합물은조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법은 대상에게 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물 및/또는 플라티코딘 D(Platycodin D)를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 투여는 경구, 비경구, 비내, 구소, 구강, 설하, 기도 분사 또는 직장을 통하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 투여가 기도 분사로 수행되는 경우, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물 및/또는 플라티코딘 D(Platycodin D)이 기도에 도포되어 SARS-CoV-2 감염 예방 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 기도 분사으로 수행 시, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물, 플라티코딘 D(Platycodin D) 또는 그 혼합물은 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 20 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 과립 또는 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 기도 분사용 과립 또는 분말의 형태일 수 있다.
본 발명의 길경 추출물 또는 이의 유효성분인 플라티코딘 D는 코로나 바이러스의 세포 진입 및 세포 감염에 대해 현저한 억제 효과를 나타내며, 코로나 바이러스의 세포 진입 및 세포 감염의 억제를 통한 치료 후보 물질인 클로로퀸 (Chloroquine), 렘데시비르(Remdesivir), 카모스탯(Camostat), 나파모스탯(Nafamostat) 보다 현저한 효과를 나타냄을 확인하였다. 이를 통해, 코로나 바이러스를 예방하거나, 감염 초기 단계의 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 길경 추출물 또는 플라티코딘 D는 코로나바이스의 패키징 시 감염에 중요한 스파이크 단백질의 절단을 억제함으로써, 세포 내 감염성 코로나 바이러스의 증식 및 확산을 억제하는 효과를 나타낸다. 따라서, 본 발명의 조성믈은 코로나 바이러스의 예방 및 치료에 유용하다.
도 1은 본 발명에 따른 렌티 바이러스 기반 코로나바이러스 스파이크 단백질을 발현하는 슈도바이러스(pseudovirus) 제작 및 코로나 바이러스 수용체인 ACE2를 안정적으로 발현하는 모(parental) H1299 세포에 감염을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 2는 녹색　형광 단백질(Green Fluorescent Protein,　GFP) 및 반딧불이 루시퍼라제 유전자를 포함하는 SARS-CoV-2 스파이크 유사형 렌티바이러스 입자로 형질도입된 ACE2발현 H1299 세포에서 형광단백질 발현 (도 2a) 및 루시퍼라제 생체 발광활성 (도 2b)을 확인한 결과이다.
도 3은 녹색형광단백질 발현양을 통해 플라티코딘 D(platycodin D)의 SARS-CoV-2 슈도바이러스의 세포 내 진입 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 루시퍼라제 생체발광량을 통해 플라스코딘 D가 세포독성 없이 SARS-CoV-2 슈도바이러스의 세포 내 진입 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 5는 인삼에 포함된 사포닌은 SARS-CoV-2 세포 내 진입 억제 효과가 없음을 나타낸 결과이다.
도 6은 ACE2 단독발현에 의한 라이소솜을 통한 코로나바이러스 진입 또는 ACE2/TMPRSS2동시발현에 의한 TMPRSS에 의한 코로나바이러스 진입 모두를 플라스코딘 D가 기존의 세포 진입 및 세포 감염의 억제를 통한 치료 후보 물질인 클로로퀸 (Chloroquine), 카모스탯(Camostat), 나파모스탯(Nafamostat) 보다 효과적으로 억제한 결과이다.
도 7은 길경 뿌리 가루를 포함하는 천연물 약제 (용각산)의 SARS-CoV-2 슈도바이러스의 세포 내 진입 억제 효과를 확인한 결과이다(도7a). 용각산의 짧은시간 전 처리만으로도 SARS-CoV-2 슈도바이러스의 세포 내 진입 억제 효과를 확인한 결과이다 (도7b). 용각산에 함유된 감초가루의 성분들이 SARS-CoV-2 슈도바이러스의 세포 내 진입 억제 효과가 없음을 확인한 결과이다 (도 7c).
도 8은 길경으로 만든 식품 (도라지 청)의 의 SARS-CoV-2 슈도바이러스의 세포 내 진입 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 9는 용각산 및 길경으로 만든 천연물 약제 및 식품에서 플라티코딘 D (platycodin D)만이 SARS-CoV-2의 세포 내 진입 억제 효과를 보인다는 사실을 액체크로마토그래피 (HPLC) 분석등을 통해 확인한 결과이다
도 10은 플라티코딘 D의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)에 대한 ACE2 결합 억제능에 대한 분석 결과이다.
도 11은 플라티코딘 D의 SARS-CoV-2 바이러스 패키징 동안 스파이크 단백질 절단 억제효과를 확인한 결과이다.
도 12는 면역형광 검정에 의한 살아있는 감염성 SARS-CoV-2 바이러스 및 용량-반응 곡선을 분석한 결과이다.
도 13은 플라틴코딘D가 세포 내 콜레스테롤의 위치 및 양을 변화시키는 것을 염색한 결과이며 (도13a) 세포 내 콜레스테롤의 변화가 코로나바이러스 진입 억제에 중요한 역할을 한다는 사실을 보여주는 결과이다 (도13b).
도 14는 플라틴코딘D가 콜레스테롤 보다 높은 친화성으로 메틸-베타-사이클로덱스트린 (MβCD)와 복합체를 형성한다는 것을 모델링을 통해 확인한 결과이다.
도 15는 분자 모델링을 통해 플라티코딘D가 세포막에 안쪽에 콜레스테롤과 함께 놓일수 있음을 확인한 결과이다.
도 16은 플라틴코딘D가 세포 막융합을 저해함을 확인한 결과이다.
도 17은 다른 유형의 세포에서 플라티코딘D (platycodin D)가 자가포식작용 (autophagy)를 통해 SARS-CoV-2 슈도바이러스의 진입을 저해하는 결과이다.
도 18은 플라틴코딘D가 ACE+ 및 ACE2/TMPRSS2+ 세포에서 바이러스-세포간 세포막 융합을 방해하여 SARS-CoV-2의 세포내 진입을 억제하는 기작을 개략적으로 나타낸것이다
도 19는 코로나 바이러스의 세포감염 메커니즘에서, 기존의 연구 개발된 약물이 작용하는 위치 및 본 발명의 플라티코딘 D가 갖는 코로나 바이러스의 세포 진입 및 세포 감염성 바이러스의 생산 억제능을 개략적으로 나타낸 것이다.
이하 첨부한 표 또는 도면들을 참조하여 본 발명의 길경 추출물을 유효성분으로 포함하는 COVID-19의 예방 및 치료용 약학 조성물에 대해 상세히 설명한다.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다. 또한 “실질적으로…로 구성된다”는 표현은 특정된 요소, 재료 또는 공정과 함께 열거되어 있지 않은 다른 요소, 재료 또는 공정이 발명의 적어도 하나의 기본적이고 신규한 기술적 사상에 허용할 수 없을 만큼의 현저한 영향을 미치지 않는 양으로 존재할 수 있는 것을 의미한다. 또한 “구성된다”는 표현은 기재된 요소, 재료 또는 공정만이 존재하는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어, "성분", "조성물", "화합물의 조성물", "화합물", "약물", "약학적 활성제", "활성제", "치유" "치료법" "치료" 또는 "약제"는 대상체(인간 또는 동물)에 투여될 때 국소 및/또는 전신 작용에 의해 원하는 약학적 및/또는 생리학적 효과를 유도하는 화합물 또는 화합물(들) 또는 물질의 조성물을 의미하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
본 발명의 명세서에서 사용된 용어 "치료" 또는 "치료법"(뿐만 아니라 그의 상이한 형태)는 예방적 (예: 예방적 치료), 치유적 또는 경감성 치료를 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "치료하는"은 상태, 질환 또는 장애의 적어도 하나의 유해 또는 부정적 효과 또는 증상을 경감시키거나 감소시키는 것을 포함한다. 본 발명의 용어 "예방", “개선” 및 "치료"는 최광의의 개념으로 해석되어야 하며, "예방"이란, 질환에 노출되거나 질환에 걸리기 쉬울 수 있으나 질환의 증상을 아직 경험하거나 드러내지 아니한 환자에게서 질환의 임상적 증상 중 하나 이상이 진행되지 아니하도록 하는 것을 의미한다. "치료"란, 질환 또는 이의 하나 이상의 임상적 증상의 발달을 저지 또는 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어 “샘플” 또는 “시료”는 분석을 위한 대상을 나타내는 것으로, 명세서에 걸쳐 동일한 의미로 사용되었다.
본 발명에 있어 “플라티코딘 D(platycodin D)”는 명세서 전반에서 “PD”와 동일한 의미로 상호 호환적으로 사용되었다.
이하 본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 플라티코딘 D(Platycodin D)를 유효성분으로 포함한다.
길경(桔梗, 도라지, Platycodon grandiflorus)은 한국, 중국 및 일본에서 널리 사용되는 식용 전통 약초이다. 길경은 사포닌(saponin), 플라보노이드(flavonoids), 페놀산(phenolic acid) 등의 여러 화합물이 풍부하며, 저혈압, 지질 감소, 죽상동맥경화증, 염증성 기침 및 가래 완화 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 특히 배농 작용이 뛰어나, 폐결핵의 농양(膿瘍), 해수(咳嗽), 인후염 등에 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 상기와 같은 효능으로 인해, 길경은 인후통, 감기로 인한 기침, 가래, 코막힘, 천식, 기관지 염증, 흉막염, 두통, 오한, 편도선염 등에 사용되어 왔다.
트리테르페노이드 사포닌(triterpenoid saponins)은 길경(Platycodon grandiflorus)에 풍부한 사포닌 성분 중 하나의 그룹으로, 현재 75개의 트리테르페노이드 글리코시드(triterpenoid glycosides)가 길경으로부터 분리 동정되었다.
이 중에서도, 플라티코딘 A(platycodin A)는 길경의 주된 사포닌 성분으로 간주된다. 플라디코딘 D는 항염증, 항비만, 콜레스테롤 저하, 혈당 강하 효과 등이 있는 것으로 알려져 있으며, 면역력 증진과도 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 길경 추출물, 특히 플라티코닌 D(platyconin D; PD)의 항바이러스 효과, 특히 코로나 바이러스에 특이적인 항바이러스 효과에 대해서는 전혀 밝혀진 바가 없었다.
본 발명은 길경 뿌리 추출물, 특히 길경의 뿌리 및 뿌리 껍질에 많이 포함된 플라티코딘 D가 갖는 코로나 바이러스의 세포 진입 억제 효과 및 바이러스 패키징 단계에서, 감염에 중요한 코로나 바이러스 스파이크 단백질의 절단을 억제하는 효과를 처음으로 밝혀내, 이를 코로나 바이러스의 예방 또는 치료의 용도로 적용하는 것에 특징이 있다. 특히, 본 발명의 일 실시예에서는 플라티코딘 D가 다른 바이러스인 VSV(vesicular stomatitis virus)의 진입을 억제하지는 못하는 반면, 코로나 바이러스 스파이크 단백질 및 이의 수용체의 상호 작용을 억제하여, 코로나 바이러스 특이적인 세포 진입 억제 효과를 갖는다는 것을 새롭게 확인하였다.
본 발명의 용어 “추출물”이란, 길경(Platycodon grandiflorum) 등으로부터 분리하여 얻은 물질을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 길경의 잎, 뿌리, 줄기 등을 물, C1∼C4의 알콜 및 물과 C1∼C4의 알콜과의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 용매로 추출하여 수득된 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 본 발명의 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 물을 용매로 추출하여 수득하는 것일 수 있다.
상기 혼합용매는 바람직하게는 약 70% 에탄올 수용액을 사용할 수 있다. 추출은 당 분야에 알려진 추출방법, 예컨대, 냉침, 열수추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등의 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 추출 온도는 당업자가 추출 방법에 적절한 다양한 온도 범위를 채택할 수 있으며, 예를 들어, 20℃ 내지 100℃ 등에서 수행될 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 또한, 추출 시간은 추출방법에 따라 상이하며, 당업자가 적절한 추출시간을 채택할 수 있으며, 이에 국한되지 않으나, 약 1시간 내지 10일의 범위에서 단회 또는 복수회로 수행될 수 있다. 바람직하게는 상기 추출은 실온에서 약 2일씩 2∼3회 상기한 추출용매로 추출함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 추출물의 제조방법에는 제한이 없으며, 공지되어 있는 어떠한 방법도 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물에 포함되는 추출물은 상기한 열수 추출 또는 용매 추출법으로 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다. 따라서 본 발명에 있어서 추출물은 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.
본 발명에 있어서, 상기 길경 추출물은 바람직하게는, 과립, 분말, 펠렛과 같은 제형인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 길경 추출물은 길경의 뿌리 및/또는 뿌리 껍질에서 추출된 추출물인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니며, 잎, 줄기 등에서도 추출된 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 길경 추출물 또는 플라티코딘 D외 에도, 투여, 효과의 작용 등에 필요한 추가 성분을 포함할 수 있으며, 다른 코로나 바이러스 감염억제제, 치료제, 백신, 중화항체 등과 병용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 플라티코딘 D(Platycodin D)를 유효성분으로 함유하고 있다.
본 발명의 용어 “플라티코딘 D(Platycodin D)”는 특히 길경의 뿌리 부근에 많이 포함된 사포닌 성분 중에 하나로, 구체적인 화학구조는 하기 화학식 I과 같다.
[화학식 I]
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본 발명의 용어 “염”은 화합물의 무기산염, 유기산염, 또는 금속 염의 부가염을 말하며, 약학 조성물에 사용되는 경우 “약학적으로 허용되는 염”일 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 염일 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용가능한 염"이란, 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 등과 같은 무기산, 타르타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플로로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카르복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(히드록시메틸) 메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다. 옥살산 (oxalic)과 같은 산은 약학적으로 허용되는 것은 아니지만 본 발명의 화합물 및 이에 약학적으로 허용되는 염을 얻기 위한 중간체로서, 유용한 염의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 길경 추출물 및 이의 유효성분인 플라티코딘 D는 코로나 바이러스의 스파이크 단백질을 통한 세포진입과 관련된 i) ACE2에 의한 내세포작용 경로(endocytosis) 및 ii) TMPRSS2 및 ACE2에의한 직접 융합 경로를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 길경 추출물 및/또는 플라티코딘 D는 상기 TMPRSS2 및/또는 ACE2와 코로나바이러스, 특히 코로나바이러스의 스파이크 단백질과의 상호작용을 억제 또는 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 코로나바이러스는 COVID-19를 발병시키는 바이러스인 SARS-CoV-2 바이러스를 사용하였으나, 상기 SARS-CoV-2 바이러스의 스파이크단백질과 유사한 스파이크 단백질을 발현하도록 재조합된 렌티바이러스의 세포진입을 억제하는 것도 확인하였다. 따라서, 본 발명의 길경 추출물 및/또는 플라티코딘 D는 SARS-CoV-2 뿐만 아니라, SARS-CoV-2와 유사한 스파이크 단백질을 발현하여, ACE2 및/또는 TMPRSS2와 상호작용을 통해 세포 내로 진입하는 다른 코로나바이러스 또는 다른 속의 바이러스의 세포진입을 억제하고, 해당 바이러스 감염증을 예방 또는 치료능을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, MERS 바이러스, SARS-CoV1 바이러스 등의 세포진입을 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 "세포"는 바이러스, 특히 코로나바이러스에 감염될 수 있는 세포를 의미한다. 상기 세포는 식물 또는 동물세포일 수 있으며, 분리된 세포 또는 살아있는 유기체, 기관, 조직에서 분리되지 않은 세포일 수 있다. 바람직하게는 포유동물 세포, 더욱 바람직하게는 인간세포인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 세포는 호흡기 세포인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 세포는 인간 폐 상피 세포(H1299, A549, Calu-3)를 포함할 수 있으며, 일예로 인간 폐 섬유 아세포 (MRC-5), 인간 결장 (CaCo2), 인간 신장 (HEK293T), 원숭이 신장 (Vero) 세포 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 따른 유효성분 또는 조성물의 투여에 의해 SARS-CoV-2 진입 차단 효과를 얻을 수 있는 세포라면 상기 범주에 포함된다 할 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 플라티코딘 D(Platycodin D)는 SARS-CoV-2의 세포 진입 억제 및/또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과의 결합을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 플라티코딘 D(Platycodin D)는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2)의 예방 또는 치료용 약학 조성물은 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 길경 추출물은 더덕 추출물, 행인 추출물, 세네가 추출물, 감초 추출물 등을 포함하는 한방 성분을 추가로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 SARS-CoV-2 세포 진입 차단을 통한 감염 예방 또는 치료 효과를 얻을 수 있는 성분이라면 적의 추가하여 사용할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일 예에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 SARS-CoV-2의 세포 진입 억제 및/또는 SARS-CoV-2 스파이크 단백질과의 결합을 억제하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 있어서, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%, 더욱 좋게는 1 내지 30 중량%, 더욱 좋게는 3 내지 20 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 부작용을 일으키지 않는 범위에서 최대한의 예방 또는 치료 효과를 볼 수 있다면 적절히 조절하여 사용될 수 있음은 물론이다.
상기 약학 조성물은 상기 플라티코딘 D를 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비제한적 으로 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형이 바람직하며 이 중에서도, 과립, 분말 펠렛의 제형이 가장 바람직하다. 길경 추출물을 포함하는 경구형 의약품의 예로 용각산 등이 있다. 이외의 제형으로, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들 을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물은 코로나 바이러스 감염증을 예방 또는 치료에 효과가 있는 것으로 당업자에게 인식될 수 있는 각종 치료법 및 다른 코로나바이러스 감염증 치료용 약학 조성물 등과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 경구 복용될 수 있다. 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명은 상기 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는 의약용 제제를 제공한다.
본 발명의 일 예에 따른 의약용 제제에 있어서, 상기 의약용 제제는 고상 투여형 또는 액상 투여형일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 의약용 제제에 있어서, 상기 의약용 제제는 경구, 비경구, 비내, 구소, 구강, 설하, 기도 분사 또는 직장 투여용일 수 있다.
본 발명의 일 예에 따른 의약용 제제에 있어서, 상기 의약용 제제는 캡슐제, 환제, 정제, 용액제, 현탁제, 분무제, 발포제, 패치제 또는 페이스트제의 제형일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염의 예방 또는 개선용 식품 조성물은 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물 및/또는 플라티코딘 D(Platycodin D)를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 상기 길경 추출물은 더덕 추출물, 행인 추출물, 세네가 추출물, 감초 추출물 등을 포함하는 한방 성분을 추가로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 SARS-CoV-2 세포 진입 차단을 통한 감염 예방 또는 치료 효과를 얻을 수 있는 성분이라면 적의 추가하여 사용할 수 있음은 물론이다.
본 발명의 일 예에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 있어서, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물, 플라티코딘 D(Platycodin D) 또는 그 혼합물은조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%, 더욱 좋게는 1 내지 30 중량%, 더욱 좋게는 3 내지 20 중량%로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 부작용을 일으키지 않는 범위에서 최대한의 예방 또는 치료 효과를 볼 수 있다면 적절히 조절하여 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 길경 추출물, 플라티코딘 D(Platycodin D)를 포함하는 코로나바이러스 감염의 예방 또는 개선용 식품에 관한 것이다.
코로나바이러스 감염의 예방 또는 개선용 식품은 코로나바이러스의 세포 진입을 억제하거나, 바이러스 패키징과정에서 감염에 중요한 스파이크 단백질의 절단을 억제함으로써, 코로나바이러스의 감염 및 세포 내 감염섬 코로나바이러스의 증식을 억제하는 효과를 통해 코로나바이러스의 감염을 예방하거나, 증상을 개선하는 활성을 갖는 건강기능식품인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "식품" 또는 “식품조성물”은 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 건강기능식품 및 건강식품 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다.
상기 건강기능(성) 식품(functional food)이란, 특정보건용 식품(food for special health use, FoSHU)과 동일한 용어로, 영양 공급 외에도 생체조절기능이 효율적으로 나타나도록 가공된 의학, 의료효과가 높은 식품을 의미한다. 여기서 "기능(성)"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있 다. 또한 상기 식품의 제형 또한 식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료의 형태일 수 있다.
상기 건강식품(health food)은 일반식품에 비해 적극적인 건강유지나 증진 효과를 가지는 식품을 의미하고, 건강보조식품(health supplement food)은 건강보조 목적의 식품을 의미한다. 경우에 따라, 건강 기능 식품, 건강식품, 건강 보조식품의 용어는 혼용된다.
상기 식품조성물은 생리학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는데, 담체의 종류는 특별히 제한되지 않으며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 식품 조성물에 통상 사용되어 냄새, 맛, 시각 등을 향상시킬 수 있는 추가 성분을 포함할 수 있다. 예들 들어, 비타민 A, C, D, E, B1, B2, B6, B12, 니아신(niacin), 비오틴(biotin), 폴레이트(folate), 판토텐 산(panthotenic acid) 등을 포함할 수 있다. 또한, 아연(Zn), 철(Fe), 칼슘(Ca), 크롬(Cr), 마그네슘(Mg), 망간(Mn), 구리(Cu), 크륨(Cr) 등의 미네랄을 포함할 수 있다. 또한, 라이신, 트립토판, 시스테인, 발린 등의 아미노산을 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 방부제(소르빈산 칼륨, 벤조산나트륨, 살리실산, 데히드로초산나트륨 등), 살균제(표백분과 고도 표백분, 차아염소산나트륨 등), 산화방지제(부틸히드록시아니졸(BHA), 부틸히드록시톨류엔(BHT) 등), 착색제(타르색소 등), 발색제(아질산 나트륨, 아초산 나트륨 등), 표백제(아황산나트륨), 조미료(MSG 등), 감미료(둘신, 사이클레메이트, 사카린, 나트륨 등), 향료(바닐린, 락톤류 등), 팽창제(명반, D-주석산수소칼륨 등), 강화제, 유화제, 증점제(호료), 피막제, 검기초제, 거품억제제, 용제, 개량제 등의 식품 첨가물(food additives)을 포함할 수 있다. 상기 첨가물은 식품의 종류에 따라 선별되고 적절한 양으로 사용될 수 있다.
본 발명의 길경 추출물 및 플라티코딘 D 중 어느 하나 이상과 함께 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법은 대상에게 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물 및/또는 플라티코딘 D(Platycodin D)를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 투여는 경구, 비경구, 비내, 구소, 구강, 설하, 기도 분사 또는 직장을 통하는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 투여가 기도 분사로 수행되는 경우, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물 및/또는 플라티코딘 D(Platycodin D)이 기도에 도포되어 SARS-CoV-2 감염 예방 효과를 나타내는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 기도 분사으로 수행 시, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물, 플라티코딘 D(Platycodin D) 또는 그 혼합물은 조성물 총 중량에 대하여 1 내지 20 중량%로 포함되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 과립 또는 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염증의 예방 또는 치료 방법에 있어서, 상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 기도 분사용 과립 또는 분말의 형태일 수 있다.
본 발명에서, 길경 추출물 및/또는 플라티코딘 D의 SARS-CoV-2에 대한 작용 기전과 관련된 사항은 본 발명의 원출원 이후 발표되어 공지된 논문의 내용을 모두 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
[바이러스, 세포, 플라스미드 및 프로토콜]
- SARS-CoV-2 (βCoV/KOR/KCDC03/2020)의 대한민국 균주는 기관(Korea Centers for Disease Control and Prevention (KCDC))으로부터 제공받았다.
- H1299, A549, MRC-5, 및 CaCo2 세포는 대한민국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)에서 수득하였다.
- HEK293T 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection) (ATCC, USA, CRL-3216)으로부터 수득하였다. SARS-CoV-2 스파이크-유사 렌티바이러스의 제작을 위해, HEK293T 세포는 3개의 플라스미드로 감염시켰다. (반딧불리 루시퍼라제 및 GFP 발현 카세트를 포함하는 렌티바이러스 백본; Gag, Pol, Rev 및 Tat를 포함하는 psPAX2 패킹 플라스미드, SARS-CoV-2 스파이크 플라스미드).
- pCEP4-myc-ACE2 플라스미드는 에릭 프록코(Erik Procko)로부터 기증받았다 (Addgene 플라스미드 #141185).
- pHR-CMV 렌티바이러스 발현 벡터는 에이. 라두 아리세스쿠(A. Radu Aricescu)로부터 기증받았다 (Addgene 플라스미드 # 113888).
- TMPRSS2 렌티바이러스 발현 벡터, RRL.sin.cPPT.SFFV/TMPRSS2 (변이체 1).IRES-neo.WPRE (MT130)는 카롤린 고존 (Caroline Goujon)으로부터 기증받았다 (Addgene plasmid # 145843).
[시약]
- 플라티코딘 D(Platycodin D; PD), U18666A, E64d, 클로로퀸, 카모스타트 메실레이트 (camostat mesylate), 나파모스타트 메실레이트 (nafamostat mesylate), 진세노사이드(ginsenoside) Rb1, 진세노사이드 Rb3, 진세노사이드 믹스(ginsenoside mix), 글리시르히진 (glycyrrhizin), 이소리쿠이리티게닌 (isoliquiritigenin), 에키노시스트산 (echinocystic acid), 올레아놀산 (oleanolic acid), 우르솔산, 및 메틸-베타-사이클로덱스트린은 Sigma-Aldrich Co. (USA)로부터 구입하였다.
[프로토콜]
단백질 추출 및 면역블롯 분석
세포 용해물은 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(Thermo Fisher Scientific, USA)이 보충된 빙냉 RIPA 용해 완충액(Rockland Immunochemicals, USA)으로 세포를 가용화한 후, 20분 동안 13,000 rpm에서 원심분리하여 제조하였다.
투명한 세포 용해물을 적당한 용적의 5x SDS 샘플 완충액과 혼합하고, SDS-PAGE로 분리한후 니트로셀룰로스 막으로 전달하였다.
실온 (RT)에서 1시간 동안 TBST(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20)에서 5% 스킴 밀크로 차단시킨 후, 막은 하기의 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 TBST에서 항온처리하였다: 토끼 항-NPC1 (Novus, NB400-148), 토끼 항-NPC2 (Novus, NBP1-84012), 토끼 항-ACE2 (Abcam, ab15348), 토끼 항-TMPRSS2 (Abcam, ab92323), 및 마우스 항-GAPDH (Abcam, ab8245).
상응하는 서양 고추냉이 퍼옥시다제-접합된 2차 항체 (KPL, USA)는 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다.
항체-단백질 복합체는 ECL 웨스턴 블롯팅 기질(Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 검출하였다.
필리핀 III 콜레스테롤 염색
커버슬립 상에서 성장시킨 H1299 세포는 10분 동안 실온에서 4% PFA로 고정시키고 이어서 실온의 암실에서 2시간 동안 PBS/1% FBS 용액에서 5 μg/ml filipin-III(Cayman, USA)을 사용하여 염색하였다. 염색된 세포는 LSM700 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)으로 조사하였다.
유세포 측정 분석(flowcytometry)
Expi293F 세포는 제조사의 지침에 따라 ExpiFectamine™ 293 형질감염 키트(Thermo Fisher Scientific, USA)를 사용하여 pcDNA3-SARS-CoV-2-S-RBD-sfGFP (에릭 프록코(Erik Procko)로부터 기증, Addgene plasmid # 141184)를 사용하여 형질감염시켰다.
세포는 4 내지 5일 동안 배양한 후, 800 x g에서 5분간 원심분리하여 제거하였고, 배양 배지는 -4°C에 저장하였다.
CoV-2-RBD-GFP의 세포 표면 ACE2와의 결합에 대한 PD의 효과를 분석하기 위해, ACE2를 발현하는 H1299 세포는 1시간 동안 DMSO 또는 5 μM PD로 처리하고 얼음이 담긴 PBS-BSA로 세척하였다.
이후, 얼음에서 30분 동안 CoV-2-RBD-GFP를 함유하는 배지 1/10 희석물로 항온처리하였다. H1299 세포는 이어서 PBS-BSA로 2회 세척하고 BD LSRFortessa™ 유세포 측정기로 분석하였다.
HPLC 분석
길경(Platycodon grandiflorum)의 뿌리 또는 용각산(YGS) 분말을 증류수에 용해시키고 RS Tech HECTOR-M C18 컬럼(4.6 x 250 mm, 5 마이크론 입자 크기, RS Tech Corp, Cheongju, South Korea)으로 203nm에서 HPLC 시스템 (Agilent 1100)을 사용하여 분석하였다.
컬럼은 용매 A인 물과 용매 B인 아세토니트릴의 혼합물로 25 °C에서 용출하였다.
농도 구배 용출 시스템은 1mL/분의 유속으로 0 내지 22분의 82:18 (A:B), 22분 내지 32분의 82:18 (A:B) 내지 70:30 (A:B), 32분 내지 60분의 70:30 (A:B) 내지 50:50 (A:B)로 이루어졌다.
세포 생존능 검정
96-웰 플레이트에 분주된 H1299, Calu-3, Vero 세포(5×103 세포/웰)는 PD의 지정된 농도를 사용하여 처리하였다.
24시간 처리 후, WST-8 용액 (Biomax, Korea)을 첨가하고 2시간 동안 항온처리하였다.
배양 배지에서 형성된 수용성 포마르잔은 450nm 흡광도에서 SpectraMax iD5 다중-방식 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices, USA)에 의해 측정하였다.
상대적 세포 생존능(%)은 DMSO-처리된 대조군 세포에 대한 상대적 비율로 나타내었다.
MβCD 포함 복합체의 분자 모델링
슈로딩거 마에스트로 소프웨어(Schrodinger Maestro software) 2017 슈트(Maestro, Schrodinger, LLC, New York, NY)를 사용하여 MβCD 결합 복합체를 제조하고 점수화(scoring)하였다. 소프트웨어 도구는 하기 달리 지적되지 않는 경우 디폴트 세팅 및 pH 7.4를 사용하여 적용하였다.
결합 복합체 모델은 β-사이클로덱스트린(βCD) 콜레스테롤 포함 복합체(CSD 엔트리: KEXQUC)의 결정 구조를 기초로 제조하였다. 테트라데카-2,6-O-메틸-β사이클로덱스트린 (CSD 엔트리: BOYFOK03)의 결정 구조를 사용하여 결합 복합체에서 MβCD를 나타낸다. 두 결정 구조는 모두 Cambridge Structural Database (CSD)로부터 취득하였고, 모든 물 분자는 제거하였다.
리간드 콜레스테롤 및 PD는 ChemDraw Professional 16.0로 나타내고 구조 데이터 파일로서 마에스트로 LigPrep 모듈에 도입하였다. Ligprep 모듈을 사용하여 추가 사용을 위해 모든 리간드를 제조하였고: 리간드 부분 전하의 결정, 기하학적 구조의 최적화, OPLS3 역장(force field)을 사용한 에너지 최소화를 수행하였다.
MβCD 결합 복합체는 주형으로서 βCD-콜레스테롤 복합체를 사용하여 제조하였다.
먼저, 2개의 주형 βCD 유닛의 원자 좌표는 2개의 상응하는 MβCD 유닛상에 복사하였다. 콜레스테롤은 주형 탐구 콜레스테롤 분자의 원자 좌표를 복사하여 복합체 내부에 첨가하는 반면, PD는 강성 정렬(rigid alignment), 최대 통상의 구조 분자 오버레이 도구(maximum common structure molecular overlay tool)를 사용하여 배치하였다.
분자 제한(molecular strain) 및 원자 범프(atomic bump)를 제거하고 결합 복합체 구조를 릴랙스시키는 것뿐만 아니라 매크로사이클 크기의 증가를 설명하기 위해, 제한된 에너지 최소화 알고리즘(restrained energy minimization algorithm)은 OPLS3 역장 및 2Å의 중 원자(heavy atom) RMSD 제한을 사용하여 적용하였다.
수득된 리간드 결합 포즈는 Glide SP (표준 정밀도) 도크 스코어에 의해 원위치에서 점수화 (scoring)하고, 이후 가변 유전체 일반화 본 (variable-dielectric generalized Born; VDGB) 연속 용매화 모델 및 OPLS3 역장을 사용하여 프라임 MM-GBSA 도구로 상대 리간드 결합 친화성을 추정하였다.
결합 친화성은 하기의 수학식을 사용하여 계산하였다.
G결합=E복합체(최소화된)-(E리간드(최소화된) + E호스트(최소화된)).
더 큰 음의 점수는 보다 강한 결합을 의미한다.
결합 복합체 시각화는 디스커버리 스튜디오 클라이언트 2020 팩키지(Dassault Systemes; BIOVIA. Discovery Studio Modeling Environment; Release 2020; Dassault Systemes: San Diego, CA, 2020)를 사용하여 수행하였다.
세포막에서 PD 및 콜레스테롤 배향
디스커버리 스튜디오 클라이언트 2020 팩키지(Dassault Systemes; BIOVIA. 디스커버리 스튜디오 모델링 환경; Release 2020; Dassault Systemes: San Diego, CA, 2020)를 사용하여 1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(POPE) 지질 분자로 이루어진, 외향 막 이중층(explicit membrane bilayer)에서 PD 및 콜레스테롤의 위치 및 배향을 최적화하였다.
막 첨가 및 분자 배향 알고리즘을 전개하기 전에, PD 및 콜레스테롤의 3D 형태는 표준 리간드 제조 프로토콜 및 일반 CHARMm 역장을 사용하여 최소화된 에너지를 사용하여 제조하였다.
분자는 먼저 charmm36 역장 및 GBIM(Generalized Born Implicit Membrane) 모듈로 계산된, 분자의 최소 용매화 에너지에 대한 단계적 검색을 수행하여 내향 막(implicit membrane)으로 재배향하였다. 이 때, 막 두께는 35Å로 설정하였다.
내향 막에서 최적 분자 위치를 찾은 후, 지질 이중층은 시스템 평형화를 수행하지 않고, POPE 지질 분자, 물 분자 및 반대이온 (Na+ 및 Cl-)을 첨가하여 구축하였다.
전기생리학
급성 뇌 절단을 위해, 5주령 C57BL / 6J 마우스를 이소 플루란으로 마취시키고 참수하였다.
해마의 300 μm 횡단 슬라이스는 얼음처럼 차가운 NMDG-기반 절단 용액(93 mM NMDG; 2.5 mM KCl; 1.2 mM NaH2PO4; 30 mM NaHCO3; 20 mM HEPES; 25 mM 글루코스; 5 mM 나트륨 아스코르베이트, 2 mM 토우레아, 3 mM 나트륨 피루베이트, 10 mM MgCl2, 0.5 mM CaCl2, HCl을 사용한 pH 7.3으로의 조정, 310 mOsm) 내에서 D.S.K 선형 슬라이서 프로 7 (Dosaka EM Co., Ltd)로 제작하였고, 32℃의 동일 용액에서 15분 후 회수하였다.
수득한 슬라이스는 산소화된 ACFS 용액(126 mM NaCl; 24 mM NaHCO3; 2.5 mM KCl; 1 mM NaH2PO4; 2 mM MgCl2; 10 mM 글루코스)에서 재회수하였다.
자발적 IPSC는 전체-셀 전압-클램프(whole-cell voltage clamp)로 산소화된 ACFS 용액 하에 기록하였다.
표준-벽 보로실리케이트 유리(GC150F-10, Warner Instrument Corp., USA)로부터 조립된 기록 전극 (6-8 MΩ)에 CsCl-기반 내부 용액(135 mM CsCl; 4 mM NaCl; 0.5 mM CaCl2; 10 mM HEPES; 5 mM EGTA, 0.5 mM Na2-GTP; 2 mM Mg-ATP; 1 mM QX-314)을 충전시켰다.
급성 PD 처리(acute PD treatment) 및 sIPSC 기록을 위해, 10 μM PD 함유-ACSF는 기준선을 설정한 후 적용하였다.
장기 PD 처리(long-term PD treatment) 및 sIPSC 기록을 위해, 슬라이스는 동일한 용액에서 적어도 1시간 동안 PD 함유-ACSF (각각 0, 0.3, 1, 3, 10, 30 μM)에서 항온처리하였고, 전체-셀 전압-클램프로 기록하였다.
sIPSC는 적어도 5분에 기록하였다. sIPSC 주파수 및 진폭 분석을 위해, 소형 분석 프로그램 소프트웨어(Synaptosoft)를 사용하였다. 기준 데이터에서 -300 pA 미만의 전류 유지는 분석을 위해 배제하였다.
통계 분석
본 발명에서 데이터는 3개의 샘플과 함께 2개 또는 3개의 독립적 실험을 대표하고 평균 ±SEM으로서 나타낸다. 통계학적 분석은 학생 t-시험(student t-test) 또는 단방향 ANOVA(one-way ANOVA)에 이어, 투키 포스트 혹(Tukey's post hoc) 시험을 사용하여 수행하였다.
이 ?, 0.05 미만의 p-값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다(*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001; NS, 유의적이지 않음).
모든 통계적 분석은 Prism v.9.0.0(GraphPad Software)을 사용하였다.
[제조예 1] 세포 배양
H1299 및 A549 세포는 RPMI-1640(Gibco, USA)에서 배양하고 MRC-5, CaCo2, 및 HEK293T 세포는 10% 태아 소 혈청(FBS; Gibco, USA) 및 1X 페니실린-스트렙토마이신 용액(HyClone, USA)이 보충된 DMEM 배지(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; Corning, USA)에서 5% CO2를 함유하는 습화된 37°C 항온 배양기에서 배양하였다. 지질단백질-부재 조건하에서의 세포 배양을 위해, 지질단백질이 결여된 FBS(Kalen biomedical, USA)를 사용하였다.
실제 SARS-CoV-2 실험을 위해, Vero 세포는 ATCC(CCL-81)로부터 수득하였고 FBS 및 1X 항생제-항진균제 용액(Gibco, USA)이 보충된 DMEM에서 5% CO2와 함께 37°C에서 유지하였다.
본 발명에 사용된 Calu-3은 클론성 단리물(clonal isolate)이고, 이는 ATCC(HTB55)로부터 수득된 모 Calu-3과 비교하여 보다 높은 성장률을 나타낸다. Calu-3은 10% FBS 및 1X 항생제-항진균제 용액이 보충된 EMEM 배지(Eagle’s Minimum Essential Medium; ATCC)에서 5% CO2와 함께 37°C로 유지하였다.
[제조예 2] 플라스미드 및 세포주 확립
pCEP4-myc-ACE2로부터 ACE2 서열 전장(full length)을 EcoRI 및 Agel의 인식 부위를 이용하여 pHR-CMV 렌티바이러스 발현 벡터에 클로닝하였다.
유전자 사일런싱(gene silencing)을 위해, shRNA 서열 표적화 NPC1 (5’CCAGGTTCTTGACTTACAA -3’), NPC2 (5’-CGGTTCTGTGGATGGAGTTAT-3’) 및 비특이적 (NS) (5’-CAACAAGATGAAGAGCACCAA-3’)을 함유하는 올리고뉴클레오타이드를 pLKO.1 puro 렌티바이러스 shRNA 플라스미드에 클로닝하였다. 안정한 세포주 생성을 위해, 상기 플라스미드를 제조사 지침에 따라 리포펙타민 3000 형질감염 시약(Thermo Fisher, USA)을 사용하여 팩키징 플라스미드 psPAX2 및 외피 플라스미드 pMD2.G를 갖는 HEK293T 세포에 일시적으로 형질감염시켰다.
형질감염 후 24 시간 및 48 시간에, 바이러스 입자 함유 상등액을 수거하고, 0.45 μm-공극-크기 필터를 통해 여과하고 이를 사용하여 6웰 플레이트 상에서 스크리닝된 H1299 세포를 감염시키고 70 내지 80% 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 배양하였다. 1 ml 바이러스 상등액을 4 μg/ml의 최종 농도로 폴리브렌(Merck, Germany)의 존재하에 세포 상에 직접 오버레이하였다. 24시간 후, 상등액을 새로운 배지로 갈아주고 2 내지 3일 동안 배양하였다.
[실시예 1] SARS-CoV-2 스파이크-유사형 (Spike-pseudotyped) 렌티바이러스 생성 및 형질도입
SARS-CoV-2 스파이크-유사형 렌티바이러스 생성
SARS-CoV-2 스파이크 (S)-유사형 렌티바이러스는 제2 세대 렌티바이러스 팩킹 시스템을 사용하여 생성하였다.
6-웰 플레이트에 70 내지 80% 컨플루언시에 도달한 HEK293T 세포는 제조사의 지침에 따라 리포펙타민 3000 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여1 μg의 형광단백질 발현 및 반딧불이 루시퍼라제 발현 카세트, 0.75 μg의 psPAX2 팩킹 플라스미드 및 0.5 μg의 SARS-CoV-2 스파이크 플라스미드(팡 리(Fang Li)로부터 기증, Addgene plasmid #145032)를 형질주입 (transfection)시켰다.
pMD2.G 플라스미드를 사용하여 VSV-G를 갖는 유사형의 대조군 렌티바이러스를 생성하였다. 형질주입 후 24시간 및 48시간에, SARS-CoV-2 스파이크-유사형 바이러스 입자를 함유하는 상등액을 수거하고, 0.45 um 공극 크기 필터를 통해 여과한 후, 사용할 때까지 4°C에 저장하였고, 장기 보관용은 -80에 보관하였다.
ACE2 또는 ACE2 + TMPRSS2를 안정하게 발현하는 H1299 세포는 다음과 같이 제작하였다. H1299 세포를 70 내지 80% 컨플루언스(confluence)에 도달할 때까지 48-웰 플레이트에서 배양하였다.
바이러스 상등액을 4 μg/ml의 최종 농도로 폴리브렌(Merck, Germany)의 존재하에 H1299세포 상에 직접 오버레이하고 4일 이상 배양였다.
약물 실험을 위해, H1299 세포는 형질도입 전 각각의 약물로 24시간 동안 전처리하였다. 형질전환 48시간 경과 후, GFP(green fluorescnece protein) 이미지는 Olympus 형광 현미경(Olympus)를 이용하여 측정하였고, 형질도입 효율은 루시퍼라제 검정 시스템 (Promega, USA) 및 SpectraMax iD5 다중-방식 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, USA)를 사용하여 세포 용해물에서 반딧불이 루시퍼라제의 활성을 측정하여 정량하였다(도 1).
형질도입 분석
상기 방법을 통해 측정한 형광 현미경 측정 및 형질 도입 효율 측정 결과를 도 2에 도시하였다.
형광 현미경 관찰 결과, 소수의 H1299 세포가 슈도바이러스(pseudovirus)로 형질 도입되어, GFP 형광을 나타내는 것을 확인하였다. 반면 ACE2(H1299-ACE2)를 안정적으로 발현하는 H1299 세포에서는 GFP 양성(GFP-positive) 세포가 급격히 증가하여(도 2a), SARS-CoV-2 스파이크 단백질이 슈도바이러스 표면에 잘 통합되어, 실제 바이러스의 세포 진입을 모방할 수 있다는 점을 확인하였다.
또한, 루시퍼라제 활성을 측정하여 슈도바이러스의 형질 도입 효율을 측정한 결과, H1299 및 H1299-ACE 세포에서의 루시퍼라제 활성이 형질전환되지 않은 세포 대비 각각 94배 및 4.4 x 104배 증가함을 확인하였으며(도 2b), 이로부터, H1299-ACE2 세포가 H1299 모세포 대비 SARS-CoV-2-S-유도된 숙주 세포 진입(host cell entry)에 보다 효과적임을 확인하였다.
[실시예 2] 플라티코딘 D(platycodin D)의 SARS-CoV-2의 세포 내 진입 억제 효과 분석
플라티코딘 D가 SARS-CoV-2의 세포 진입을 저해하는지 여부를 확인하기 위해, SARS-CoV-2 스파이크-함유(spike-bearing) 슈도바이러스를 이용하였다.
먼저, H1299-ACE2 세포를 DMSO 또는 10 μM 플라티코딘 D(PD)의 존재 하에 SARS-CoV-2 스파이크 유사형 렌티바이러스 입자로 형질도입하였다.
24시간 배양 후, 상기 바이러스가 포함된 상등액을 신선한 배지로 교체하고, 추가로 48시간 동안 배양하였다.
배양 후 형광 이미지는 Nikon eclipse Ts2R 형광 현미경으로 촬영하였으며, PD의 처리로 인해 GFP양성 세포가 감소함을 관찰하여 PD가 코로나 슈도바이러스의 진입을 저해하였음을 알수 있었으며 그 결과를 도 3에 도시하였다.
또한, H1299-ACE2 세포에 DMSO또는 플라티코딘 D(PD)를 0.1, 0.3, 1, 3, 10 μM 로 1시간 처리 후에 각 농도의 PD 존재하에 수포성 구내염 바이러스(VSV) 당단백질(glycoprotein)- 또는 SARS-CoV-2 스파이크 유사형 렌티바이러스 입자로 형질도입하였다.
형질도입 효율은 세포 용해물(cell lysates)에서 반딧불이 루시퍼라제의 활성을 측정하여, 처리되지 않은 대조군 세포에 대한 정규화를 통해 형질 도입 후 24시간에 정량화하였다.
그 결과를 도 4에 도시하였다.
루시퍼라제 활성 측정 결과, 플라티코딘 D의 처리량에 의존적으로 SARS-CoV-2의 세포 진입이 감소하는 것을 확인하였으며 IC50은 0.69 μM인 것으로 측정되었다.
또한, 플라티코딘 D는 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 당 단백질에 의한 세포 진입을 차단하지 않으며, 대조군 실험을 통해 H1299 세포에 대한 세포독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
인삼에 포함된 사포닌의 SARS-CoV-2의 세포 내 진입 억제 효과 여부 비교
길경에 포함된 사포닌 성분인 플라티코딘 D과의 비교를 위해, 인삼(Panax ginseng)에 포함된 대표적인 사포닌 성분인 진세노사이드 Rb1, Rb3, 및 이들을 포함하는 진세포사이드 믹스(ginsenoside mix) 실험군에 대해, 상기와 같이 SARS-Cov-2 슈도바이러스(pseudovirus) 형질도입하여 SARS-CoV-2의 세포 내 진입에 대한 억제 효과를 나타내는지를 측정하였다.
그 결과는 도 5에 도시하였다.
결과로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 인삼에 포함된 사포닌 성분들 또는 그 조합 성분은 SARS-CoV-2의 세포 내 진입을 억제하지 못하는 것을 확인하였다.
플라티코딘 D에 의한 숙주 세포 진입 억제 경로 확인
플라티코딘 D에 의해 차단되는 SARS-CoV-2의 세포 진입 경로 확인을 위해, ACE2 및 TMPRSS2 를 모두 발현하는 H1299 세포(ACE2 / TMPRSS2 +), 및 ACE2 단독 발현 세포(ACE2 +)를 각각 제작한 후, 이들 세포에 대한 플라티코딘 D의 효과를 측정하였다.
형질도입 효율은 세포 용해물에서 반딧불이 루시퍼라제의 활성을 측정하여, 처리되지 않은 대조군 세포에 대한 정규화를 통해 형질 도입 후 24시간에 정량화하였다.
그 결과를 도 6에 도시하였다.
루시퍼라제 분석 결과, 리소좀 카텝신의 저해제인 E64d 및 클로로퀸(chloroquine)은 ACE2+ 세포에서만 SARS-CoV-2 진입을 효율적으로 차단하였으며, ACE / TMPRSS2 + 세포에서는 진입을 차단하지 못하였다. TMPRSS2 억제제인 카모스타트(camostat), 나파모스타트(nafamostat)의 경우, 반대로 ACE / TMPRSS2 + 세포에서만 SARS-CoV-2 진입을 효율적으로 차단하였으며, ACE2+ 세포에서는 진입을 차단하지 못하였다 플라티코딘 D는 ACE2+ 세포 및 ACE / TMPRSS2 + 세포에서 모두 SARS-CoV-2의 진입을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. (도 6).
이와 같은 결과는 H1299 대신 HEK239T 세포에 대해 ACE2+ 및 ACE2 / TMPRSS2 + 세포에서도 유사한 형태로 나타남을 확인하였다.
ACE2 및 TMPRSS2 (ACE2 / TMPRSS2 +)를 모두 발현하는 H1299 세포에서 플라티코딘 D의 IC50은 각각 0.72 μM 으로 측정되었다.
[실시예 3] 용각산의 SARS-CoV-2의 세포 내 진입 억제 효과
용각산(YGS) 분말(함유성분: 길경 추출물 11.7mg, 세네가(Polygala senega) 뿌리 추출물 0.5mg, 행인유(apricot kernel oil) 0.83mg 및 감초가루 8.3mg)을 10 ml DMEM 배지에 녹여 30분간 상온에서 진탕기(shaker)에 놓아 15 mg/ml 용각산 원액(Yonggaksan stock solution)을 제조하였다. 2,000 rpm으로 5분간 원심분리 한 후, 상등액은 0.45 mm-구멍 크기의 시린지 필터로 여과하여 용액에서 입자성 물질들을 추가로 제거하였다.
15 mg/ml 용각산 용액을 순차적으로 희석하여 때 ACE2+ 및 ACE / TMPRSS2 + H1299세포에 1시간 처리 후에 SARS-CoV-2 스파이크 유사형 바이러스로 형질도입하였고 형질도입 시 용각산을 동일농도로 추가하였다. 24시간 이후에 반딧불이 루시퍼라제의 활성을 측정하였다.
그 결과를 도7a에 도시하였다.
상기 용각산 희석액은 용량 의존적으로 ACE2+ 및 ACE / TMPRSS2 + 세포에 대한 SARS-CoV-2의 진입을 효과적으로 억제하였으며, 각 경우에 대한 IC50는 3.17 및 3.72 mg/ml였다.
용각산의 연속 희석 후 처리 시 효과
용각산 제제의 성인에 대한 1일 권장량이 3-6회 0.3g으로, 이에 대한 모사를 위해 SARS-CoV-2 슈도바이러스를 가하기 전, H1299-ACE2 세포에 4시간 간격으로 20분간 4회 희석된 용각산을 처리하였다. 이후 형질도입시 용각산을 추가하지 않았다.
형질도입 효율은 세포 용해물에서 반딧불이 루시퍼라제의 활성을 측정하여, 처리되지 않은 대조군 세포에 대한 정규화를 통해 형질 도입 후 24시간에 정량화하였다.
이와같이 짧은 시간동안 전처리를 반복적으로 할 경우도, 효과적으로 SARS-CoV-2 감염을 차단하는 것을 확인하였으며, 이 때 ACE2+ 및 ACE / TMPRSS2 + 세포에 대한 IC50는 13.49 및 15.26 mg/ml . 으로 측정되었다. 그 결과를 도7b에 도시하였다.
상기 결과로부터, 용각산이 SARS-CoV-2 진입 차단에 매우 효과적인 것을 확인하였다.
용각산의 함유된 길경추출물 외 물질의 SARS-CoV-2의 세포 내 진입 억제 여부측정
용각산에 길경가루 외의 주성분인 감초가루의 활성 물질로 알려진 글리시르히진 및
이소리퀴리티제닌의 SARS-CoV-2의 세포 내 진입 억제여부를 알아보았으나 전혀 효과가 없고 플라티코딘 D의 항코로나바이러스 활성을 증진시키는 효과도 없음을 확인하였다.
그 결과를 도7c에 도시하였다.
[실시예 4] 도라지청의 SARS-CoV-2의 세포 내 진입 억제 효과
15 mg/ml의 농도로 도라지 뿌리가 함유된 도라지청의 용액을 순차적으로 희석하여 때 ACE2+ 및 ACE / TMPRSS2 + H1299세포에 1시간 처리 후에 SARS-CoV-2 스파이크 유사형 바이러스로 형질도입하였고 형질도입 시 동일농도의 도라지청 용액을 추가하였다. 24시간 이후에 반딧불이 루시퍼라제의 활성을 측정하였다.
그 결과를 도8에 도시하였다.
상기 용각산 희석액은 용량 의존적으로 ACE2+ 및 ACE / TMPRSS2 + 세포에 대한 SARS-CoV-2의 진입을 효과적으로 억제하였으며, 각 경우에 대한 IC50는 2.91 및 3.69 mg/ml 였다.
상기 결과로부터 도라지 청과 같이 도라지뿌리가 함유된 식품이 SARS-CoV-2 진입 차단에 매우 효과적인 것을 확인하였다
[실시예 5] 용각산 및 도라지 뿌리에서 플라티코딘D ?유량 및 SARS-CoV-2의 세포 내 진입 억제에 플라티코딘 D이 주요성분인지 여부 측정
용각산 750mg, 도라지뿌리 660mg과 플라티코딘D 0.25mg을 이용하여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)분석을 수행하여 플라티코딘D의 피크를 확인하고 피크면적값을 구하였다. (도 9a).
외부표준물법 (External Standard method)을 통해 플라티코딘D의 정량화 곡선을 그려 수식값 “Y=2356*X-220.1”을 구하였고 이때 결정계수 (R2)는 0.9989였다 (도 9b).
이 수식값에 HPLC에서 얻은 플라티코딘D의 면적값을 대입하여 용각산 및 도라지 뿌리에 함유된 플라티코딘D의 함유량을 구하였으로 결과는 각각 0.02%와 0.018%로 계산되었다 (도 9a).
동일한 용각산 및 도라지뿌리 추출용액으로 H1299 (ACE2+) 세포에 대한 SARS-CoV-2진입 어세이를 수행하고 위에서 구한 플라티코딘D 함유량을 대입하여 "환산 IC50"를 구하였다.
용각산 및 도라지뿌리 추출용액에서 환산 IC50는 0.99 μM과 0.7 μM로 계산되었고 이는 플라티코딘 D 단일물질에서 얻은 IC50 0.69 μM과 거의 동일하였다.
이를 통해, 용각산 및 도라지뿌리에서 코로나바이러스 진입을 억제하는 주요물질이 플라티코딘 D라는 사실을 확인하였다.
[실시예 6] 플라티코딘 D의 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)에 대한 ACE2 결합 억제능 분석
플라티코딘 D가 SARS -CoV-2 스파이크 단백질 수용체 결합 도메인(RBD)에 ACE2가 결합하는 것을 억제하는지 여부를 확인하기 위해 하기 절차로 실험을 수행하였다.
먼저 H1299-ACE2 세포를 GFP와 융합된 SARS-CoV-2의 수용체 결합 도메인(receptor binding domain)을 포함하는 배지에서 배양하였다.
CoV-2-RBD-GFP의 생산을 위한 플라스미드는 제조사의 지침에 따라 엑스피펙타민(Expifectamine)을 이용하여 Expi293F 세포 내로 형질도입(transfect)시켰다. 형질도입 증강제(transfection enhancer)를 형질도입 18시간 후에 첨가하고, 세포를 4~5일간 배양하였다. 세포를 800 x g에서 5분간 원심분리하여 제거하고, 배지를 -4℃에 보관하였다.
세포 표면 ACE2에 대한 CoV-RBD-GFP의 결합을 분석하기 위해, H1299-myc-ACE2 세포를 차가운 PBS-BSA로 세척하고, 1/10로 희석한 CoV-2-RBD-GFP 함유 용액 및 1/240로 희석한 항-myc Alexa 647의 희석액을 첨가하여 얼음에서 30분 동안 배양하였다. 세포는 PBS-BSA로 2회 세척하고, BD LSRFortessaTM 유세포 분석기로 분석하였다.
그 결과를 도 10에 도시하였다.
유세포 분석을 통해 95%의 SARS-CoV-2-RBD-GFP가 H1299-ACE2 세포에 결합할 수 있음을 확인하였으며, 특히 10 μM 플라티코딘 D 전처리를 통해, H1299-ACE2 세포에 대한 SARS-CoV-RBD-GFP 결합을 상당부분 감소시켰음을 확인하였다.
또한 이중 색상 유세포 분석 결과로부터, 플라티코딘 D(PD) 처리를 통해 세포 표면에 ACE2가 감소되었으며, 이를 통해 H1299-ACE2 세포에 대한 SARS-CoV-RBD-GFP의 결합이 감소될 수 있음을 확인하였다.
[실시예 7] 플라티코딘 D의 SARS-CoV-2 바이러스 패키징 동안 스파이크 단백질 절단 억제효과 확인
퓨린 프로테아제(furin protease)는 바이러스 패키징 과정에서, S1/S2 서브유닛 경계 위치에서 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질(spike protein)을 절단하며, 이 절단 과정이 SARS-CoV-2 감염성에 중요한 역할을 담당한다.
상기 플라티코딘 D가 상기 퓨린 프로테아제에 미치는 영향 분석을 위해, 세포가 SARS-CoV-2 슈도바이러스를 생산할 때, HEK293T 세포에 플라티코딘 D를 처리한 후, 바이러스 진입을 분석하여 그 결과를 도 11에 도시하였다.
5μM PD를 바이러스 벡터의 형질감염 6시간 후 HEK293T 세포에 첨가하였다. SARS-Cov-2 슈도바이러스(pseudovirus)를 포함하는 상등액은 48시간 추가 배양 후 수집하였다. PD 처리된 HEK293T 세포에서 얻은 바이러스는 슈도바이러스 진입 분석(pseudovirus entry assay)에 적용하였다. PD 처리된 HEK293T 세포를 스파이크 단백질의 C-말단 C9 태그를 표적으로 하는 항-C9 항체를 이용하여 SARS-CoV-2 스파이크 (적색 화살표)의 절단을 검출하기 위해 웨스턴 블롯(western blot) 분석하였다. 대조군으로는 DMSO만 처리한 실험군을 사용하였다.
상기 결과로부터, 플라티코딘 D가 바이러스의 감염을 현저히 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 이에 대한 웨스턴 블롯 시험으로부터, 플라티코딘 D가 바이러스 패키징 HEK293T 세포에서 SARS-CoV-2 단백질의 절단을 억제하는 것을 확인하였다.
[실시예 8] 면역형광 검정에 의한 실제 SARS-CoV-2 바이러스 및 용량-반응 곡선 분석
SARS-CoV-2(βCoV/KOR/KCDC03/2020)의 한국 균주는 KCDC에서 제공받아 사용하였으며, 바이러스 역가는 Vero (TMPRSS2-) 세포에서 플라크 검정을 통해 결정하였다. SARS-CoV-2를 사용한 모든 실험은 KCDC에 의해 사용을 위해 승인된 연구소에서 증진된 생물안전 수준 3(BSL-3) 제한 과정을 사용하여, KNH의 가이드라인을 준수하여 대한민국 파스퇴르 연구소(Institut Pasteur Korea)에서 수행하였다.
실험 24시간 전에 검정 384-웰, μ클리어 플레이트(μClear plate) (Greiner Bio-One, Austria)에서 Vero (TMPRSS2-) 세포는 웰 당 1.2 × 104 세포로 분주하고 Calu-3 (TMPRSS2+) 세포는 웰 당 2.0 × 104 세포로 분주하였다.
10점 DRC(dose-dependent curve)는 0.02-10 μM 및 0.05-24 mg/ml 범위의 화합물 농도를 사용하여 생성하였다. 단, 클로로퀸 및 렘데시비르는 0.1-150 μM 범위로 사용하였다.
바이러스 감염을 위해, 플레이트는 BSL-3 제한 설비로 옮기고, SARS-CoV-2는 Vero 세포에서 0.0125 및 Calu-3 세포에서 0.5의 감염 다중도 (MOI)로 첨가하였다.
세포는 4% 파라포름알데하이드 (PFA)를 사용하여 24 hpi로 고정시키고, SARS-CoV-2 뉴클레오캡시드 단백질(N protein)로 염색시키고, 면역형광 분석법으로 분석하였다.
획득한 이미지는 콜럼버스 소프트웨어(Columbus software) (PerkinElmer, Inc. Waltham, MA)로 분석하여 세포수 및 감염 비율을 정량하였고, 항바이러스 활성은 각각의 검정 플레이트에서 양성(모사체) 및 음성(0.5% DMSO) 대조군으로 정규화하였다.
DRC는 하기의 수학식과 함께 S자형 용량-반응 모델에 의해 XLfit 4 소프트웨어 또는 프리즘 6을 사용하여 회귀 모델을 수립하였다.
Y = 하부 + (상부 하부)/(1 + (IC50/X)사면 (Hillslope)).
최대 절반 억제 농도 (IC50) 값은 정규화된 활성 데이터세트-회귀(regression)로부터 계산하였다. IC50은 2회 측정하고 각각의 검정의 질은 Z'-인자 및 퍼센트 변화 계수 (%CV)에 의해 제어하였다.
이 때 클로로퀸, 로피나비르, 렘데시비르가 각각 IC50 값이 7.91, 22.65, 및 10.67 μM의 수치를 갖는 참조 약물로서 활용되었다. 클로로퀸은 TMPRSS2-인 Vero 세포에만 효과가 있으며, TMPRSS2 저해제인 카모스탯과 나파모스탯은 TMPRSS2+인 Calu-3 세포에는 강력한 항 바이러스 효과를 나타냈지만, Vero 세포에는 거의 효과가 없음을 확인하였다.
반면, 본 발명에 따른 플라티코딘 D는 Vero 및 Calu-3 세포 모두에서 IC50 값이 각각 1.19 μM 및 4.76 μM 인 SARS-CoV-2에 대한 항 바이러스 효과를 보여, 플라티코딘 D가 리소좀 및 TMPRSS2에 의해 구동되는 SARS-CoV-2 진입 경로(entry pathway)를 효과적으로 차단하는 효과가 있음을 새롭게 확인하였다(도 12).
실험 약물에 대한 IC50 측정 결과를 하기 표 1에 도시하였다.
Drug IC 50 in Vero (μM) IC 50 in Calu3 (μM)
Platycodin D 1.19 4.76
Chloroquine 7.91 > 50a
Camostat > 50a 0.187a
Nafamostat 13.88a 0.0022a
Remdesivir 10.67 1.74
Lopinavir 22.65 21.7a
aKo M et al. J Med Virol. 2020 Aug 7:10.1002/jmv.26397.
[실시예 9] 플라티코딘 D의 세포 내 콜레스테롤 변화를 통한 SARS-CoV-2 진입억제확인
H1299 (ACE2+) 세포에서 PD 처리시 세포 내 콜레스테롤의 위치 및 양이 변화함을 filipin 염색법에 의해 확인 하였고 그 결과를 도 13a에 도시하였다.
세포 내 콜레스테롤 변화가 SARS-CoV-2 진입을 저해할 수 있음은 세포 내 콜레스테롤 분배에 중요한 역할을 하는 라이소솜 내에 위치한 NPC1단백질을 shRNA를 통해 소실시키거나 NPC1저해제인 U18666A을 처리하여 기능을 저해할 경우 SARS-CoV-2 감염능이 떨어지는 것을 관찰하여 확인하였고 그 결과를 도 13b에 도시하였다.
또한 H1299 (ACE2+) 세포에서 PD의 SARS-CoV-2 진입억제능이 콜레스테롤 킬레이트 (chleate) 물질인 Mβ(메틸베타 사이클로 덱스트린)에 의해 완전히 저해됨을 관찰하였다 (도 13a).
Mβ가 콜레스테롤 뿐만 아니라 플라티코딘 D를 킬레이트 할 수 있음을 Mβ포함 복합체의 분자 모델링을 통해 확인하였으며 Glide G 스코어를 통해 Mβ가 콜레스테롤 보다 플라티코딘 D에 대해 결합 친화성이 더욱 높은것으로 측정되었다. 플라티코딘 D가 Mβ에 킬레이트되어 있는 모습은 도 14에 도식화하였다.
[실시예 10] 플라티코딘 D 세포막 배향 분자모델링
분자 모델링을 통해 플라티코딘 D가 세포막에 안쪽에 놓일수 있음을 확인하였으며 세포막에서 플라티코딘 D 및 콜레스테롤 배향은 도 15에 도식화하였다.
[실시예 11] 플라티코딘 D의 막융합 저해 활성
잘 알려진 막융합 현상인 뇌 절편에서 억제성시냅스후 전류 (sIPSC)에 대한 PD의 효과를 테스트하였다. 해마 CA1 피라미드 뉴런에서 슬라이스 패치 클램프 레코딩을 수행하고 PD처리 전후에 sIPSC를 측정하였다. 결과로 PD가 진폭에 영향을주지 않고 sIPSC의 주파수를 효과적으로 억제한다는 것을 확인하였고, 이 때 PD의 IC50는 6.724 μM이었다.
그 결과를 도 16에 도시하였다
이는 pSARS-CoV-2-entry에 대한 PD의 억제 작용이 막 융합을 방해하는 능력 때문이라는 사실을 뒷받침한다.
[실시예 12] 플라티코딘 D의 자가포식작용 조절을 통한 SARS-CoV-2 바이러스 진입차단효과 확인
자가 포식 유도제인 라파마이신(rapamycin)을 A549 세포 및 H1299 세포에 처리한 결과, H1299 세포에서는 SARS-CoV-2 진입 차단 효과가 나타나지 않았으며, A549 세포에서는 일부 차단 효과가 있는 점을 확인하였다.
또한 자가포식체 (autophagosome)형성에 매우 중요한 ATG5의 발현을 shRNA를 통해 H1299세포에 소실시켰을 경우 PD의 SARS-CoV-2의 세포 진입억제효과에는 어떠한 영향도 없었으나 A549세포 ATG5를 소실 시킬경우 PD의 SARS-CoV-2의 세포 진입억제효과가 거의 완전히 상쇄되는 결과를 확인하였다.
그 결과를 도 17에 도시하였다.
상기 결과는 PD에 의한 SARS-CoV-2 진입억제에 자가포식작용이 관여함을 보인것이며 A549세포에만 이러한 현상이 관찰되어 감염 메커니즘의 세부적인 사항이 세포마다 다를 수 있다고 유추할 수 있다.
상기 결과로부터, 플라티코딘 D의 바이러스 진입 및 감염 억제 메커니즘은 크게 i) ACE2와 SARS-CoV-2의 상호작용 억제, ii) SARS-CoV-2의 세포 내 진입 과정 억제, 및 iii) SARS-CoV-2의 세포 내 바이러스 패키징(virus packaging) 과정에서, 스파이크 단백질 절단의 억제를 통한 감염성 SARS-CoV-2의 생산 억제로 나뉘며, ii) SARS-CoV-2의 세포 내 진입 과정 억제에 있어서, 다시 (a) TMPRSS2에 의한 스파이크 단백질의 절단 및 (b) 내세포 작용(endocytosis) 후 리소좀에서 카텝신 B/L-매개 스파이크 단백질의 절단에 의한 바이러스와 세포간의 막 융합의 억제 효과의 효능을 나타내는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Institute for Basic Science <120> Pharmaceutical composition for the prevention and treatment of Envelopled viruses comprising taining Platycodon grandiflorus root extracts <130> P20091651130 <150> KR 10-2020-0099311 <151> 2020-08-07 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 12289 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lentiviral backbone that contains expression cassettes for firefly luciferase and GFP <400> 1 ctagaattaa ttccgtgtat tctatagtgt cacctaaatc gtatgtgtat gatacataag 60 gttatgtatt aattgtagcc gcgttctaac gacaatatgt acaagcctaa ttgtgtagca 120 tctggcttac tgaagcagac cctatcatct ctctcgtaaa ctgccgtcag agtcggtttg 180 gttggacgaa ccttctgagt ttctggtaac gccgtcccgc acccggaaat ggtcagcgaa 240 ccaatcagca gggtcatcgc tagccagatc ctctacgccg gacgcatcgt ggccggcatc 300 accggcgcca caggtgcggt tgctggcgcc tatatcgccg acatcaccga tggggaagat 360 cgggctcgcc acttcgggct catgagcgct tgtttcggcg tgggtatggt ggcaggcccc 420 gtggccgggg gactgttggg cgccatctcc ttgcatgcac cattccttgc ggcggcggtg 480 ctcaacggcc 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cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 7620 cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 7680 cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt 7740 tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 7800 cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 7860 cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 7920 gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 7980 gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 8040 gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 8100 ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 8160 atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 8220 agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 8280 ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 8340 tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 8400 ggcttcattc 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Claims (13)

  1. 플라티코딘 D(Platycodin D)를 유효성분으로 포함하는, 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 플라티코딘 D(Platycodin D)는 상기 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2)의 세포 진입을 억제하는 것인, 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 플라티코딘 D(Platycodin D)는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 포함되는 것인, 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물을 포함하는 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2)의 세포 진입 억제 및/또는 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2)의 세포 내 바이러스 패키징 시 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 스파이크 단백질의 절단을 억제하는 것인, 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제 5항에 있어서,
    상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 포함되는 것인, 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 제 1항 및 제 3항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는 의약용 제제.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 의약용 제제는 고상 투여형, 스프레이 투여형 또는 액상 투여형인 의약용 제제.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 의약용 제제는 경구, 비경구, 비내, 구소, 구강, 설하, 기도 분사 또는 직장 투여용인 의약용 제제.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 의약용 제제는 캡슐제, 환제, 정제, 용액제, 현탁제, 분무제, 발포제, 패치제 또는 페이스트제의 제형인 의약용 제제.
  12. 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물 및/또는 플라티코딘 D(Platycodin D)를 포함하는 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 길경(Platycodon grandiflorum) 추출물, 플라티코딘 D(Platycodin D) 또는 그 혼합물은조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50 중량%로 포함되는 것인, 중증 급성 호흡기증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2) 감염 예방 또는 개선용 식품 조성물.
KR1020210099561A 2020-08-07 2021-07-29 길경 추출물을 포함하는 외막형 바이러스(enveloped viruses)의 예방 및 치료용 약학 조성물 KR102385078B1 (ko)

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