KR102384992B1

KR102384992B1 - 대장암 환자의 연령 특이적 바이오마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102384992B1
Application number: KR1020200061631A
Authority: KR
Inventors: 조용범; 홍혜경; 김태원; 정제균; 박웅양
Original assignee: 사회복지법인 삼성생명공익재단
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2022-04-08
Also published as: KR20210144365A

Abstract

본 발명은 대장암 환자의 연령 특이적 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 40세 이하의 피검자에 대한 PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 대장암 진단 또는 예후 예측용도 및 40세 이하의 대장암 환자 맞춤형 항암제 선별방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 PDGFRA 유전자는 높은 연령의 대장암 환자군과 비교하여 40세 이하의 낮은 연령의 환자군에서 발현이 유의하게 증가되어 있고, 예후가 나쁜 CMS4 유형의 환자군 간에서도 상기 낮은 연령의 환자군에서 유의하게 발현이 증가되어 있으며, EMT 및 혈관 신생 인자들의 발현과도 연관이 있음을 확인하였다. 또한, 40세 이하의 환자군에서 유래된 세포(PDCs)는 PDGFRA의 발현을 저해하거나 또는 이를 표적하는 항암제를 처리한 경우 민감성을 나타내는 것을 확인하였는바, PDGFRA 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질은 40세 이하의 피검자에서 대장암의 진단, 예후예측 용도로 이용될 수 있으며, 또한 상기 연령대 대장암 환자의 맞춤형 항암제를 선별하는 치료 전략을 결정에도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

대장암 환자의 연령 특이적 바이오마커 및 이의 용도{Age-specific biomarker of a patient with colorectal cancer and use thereof}

본 발명은 대장암 환자의 연령 특이적 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 40세 이하의 피검자에 대한 대장암 진단 또는 예후예측 용도 및 40세 이하의 대장암 환자 맞춤형 항암제 선별방법에 관한 것이다.

대장암(Colorectal cancer; CRC)은 전 세계에서 가장 흔한 암 중 하나이며 암 관련 사망의 주요 원인이다. 그러나 대장암에 대한 특이적 치료 전략 및 적절한 약물 개발에 대한 연구들에서 성공적인 결과는 보고되지 못하고 있는 실정이다. 대장암은 주로 평균 연령 60세 이상에서 진단되어 왔으나, 최근 인구 기반 연구에 따르면 50세 보다 더 낮은 연령에서 대장암 발생률이 증가하는 경향이라고 보고되었다. 더욱이, 많은 연구들을 통해 연령이 낮은 환자는 연령이 높은 환자에 비해 예후가 나쁘고 조기 진단이 어렵다고 보고되었으며, 연령이 낮은 대장암 환자의 치료적 어려움에도 불구하고 상기 환자군에 특이적이고 효과적인 치료 전략은 거의 없는 실정이다.

초기에 발병하는 대장암의 많은 경우에는 유전적인 유전자 돌연변이에 의해 유발되는 반면, 선별된 유전자 세트를 이용한 연구는 유전성 암 증후군을 제외하고 대장암 환자에서 몇 가지 체세포 돌연변이가 빈번하게 나타나는 경향이 있음을 보여주었다. 또한, 가족력이 없는 젊은 환자에서의 유전자 발현 연구 결과는 건강한 대조군과 비교하여 상향 조절된 유전자들이 다양한 생물학적 과정에 관여되어 있음을 보여주었다(Clin. Cancer. Res. 13, 1107-1114 (2007)). 그러나 이전 연구들은 충분하지 않은 유전자 세트와 환자로부터 도출된 결과라는 점에서 한계가 있다. 최근 높은 효율의 게놈 및 전사체 서열분석 기술은 다수의 종양 유전자를 보다 민감하게 검출할 수 있고 고해상도로 유전자 발현 수준을 정량화할 수 있다. 따라서 게놈 및 전사체 수준의 비교 분석은 젊은 대장암 환자의 분자적 기전에 대한 보다 상세한 통찰력을 제공할 수 있다.

최근에는 대장암에 대하여 보다 상세한 유전자 발현수준에 기반한 4개 유형의 생물학적으로 구별되는 합의 분자 아형(consensus molecular subtypes; CMS)으로 제안되었다; CMS1 (미세부수체 불안정성(microsatellite instable; MSI) 및 면역 활성화), CMS2 (상피형 및 표시된 WNT 신호 전달), CMS3 (상피형 및 대사 조절 이상) 및 CMS4 (간엽형 및 활성화된 TGF-β 신호 전달). 더욱이, 임상적 측면에서 CMS4는 불량한 예후와 관련이 있고 나머지 유형들은 비교적 좋은 예후를 나타낸다고 알려져 있다. CMS는 기존의 분류법보다 더욱 상세하고 정확한 분류가 가능하므로 최근 많은 연구에서 대장암 환자의 진단 및 치료에 이용되어 왔다. 따라서 개인에 대한 CMS 분류는 대장암 환자에게 보다 정밀하고 진보된 치료를 가능하게 한다.

이에, 본 발명자들은 종양 조직 및 이와 매치되는 정상 조직을 이용한 엑솜 서열분석 및 RNA 서열분석을 통해 49명의 대장암 환자를 대상으로 분자적 특성에 대한 종합적인 분석을 실시하였다. 나아가 낮은 연령의 대장암 환자에 대한 특이적 바이오마커를 발굴하기 위해, 대장암 환자들을 낮은 연령(young), 중간 연령(middle) 및 높은 연령(old)의 3 그룹으로 분류하고, 이들 그룹 간의 비교를 통해 분자적 서브타입 및 게놈 변이 등에 대하여 낮은 연령 및 높은 연령 간의 차이를 분석하였다. 그 결과, 낮은 연령의 대장암 환자유래 종양에 대한 심층적인 이해와 함께 상기 환자군에 대한 특이적인 바이오마커를 최종 발굴하였다.

이에, 본 발명은 PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 40세 이하 피검자에서의 대장암 진단 또는 예후예측용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 40세 이하 피검자에서의 대장암 진단 또는 예후예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 키트를 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 40세 이하의 대장암 환자 유래 샘플로부터 PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 40세 이하의 대장암 환자 맞춤형 항암제 선별방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha; GenBank 접근(accession) 번호: XM_006714041) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 40세 이하 피검자에서의 대장암 진단 또는 예후예측용 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha; GenBank 접근(accession) 번호: XM_006714041) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 40세 이하 피검자에서의 대장암 진단 또는 예후예측용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 40세 이하 피검자에서의 대장암 진단 또는 예후예측용 키트를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 40세 이하의 대장암 환자 맞춤형 항암제 선별방법을 제공한다.

(a) 40세 이하의 대장암 환자 유래 샘플로부터 PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha; GenBank 접근(accession) 번호: XM_006714041) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및

(b) 61세 이상의 대장암 환자에 비해 상기 40세 이하의 대장암 환자에서 PDGFRA mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준이 증가한 경우, PDGFRA 표적 항암제를 결정하는 단계.

본 발명의 일구현예로, 상기 항암제는 레고라페닙(Regorafenib)일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 mRNA의 발현수준은 염기서열 분석, 나노스트링 엔카운터 분석(NanoString nCounter analysis), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray) 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 PDGFRA 유전자는 높은 연령의 대장암 환자군과 비교하여 40세 이하의 낮은 연령의 환자군에서 발현이 유의하게 증가되어 있고, 예후가 나쁜 CMS4 유형의 환자군 간에서도 상기 낮은 연령의 환자군에서 유의하게 발현이 증가되어 있으며, EMT 및 혈관 신생 인자들의 발현과도 연관이 있음을 확인하였다. 또한, 40세 이하의 환자군에서 유래된 세포(PDCs)는 PDGFRA의 발현을 저해하거나 또는 이를 표적하는 항암제를 처리한 경우 민감성을 나타내는 것을 확인하였는바, PDGFRA 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질은 40세 이하의 피검자에서 대장암의 진단, 예후예측 용도로 이용될 수 있으며, 또한 상기 연령대 대장암 환자의 맞춤형 항암제를 선별하는 치료 전략을 결정에도 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 대장암 환자를 연령에 따라 3개 그룹으로 분류하고 각 그룹에서 CMS 유형의 분포를 원형 도표로 나타낸 결과이다(Young Age CRC: 40세 이하의 환자로 구성; Middle Age CRC: 41-60세 환자로 구성; Old Age CRC: 61세 이상의 환자로 구성).
도 2는 낮은 연령의 대장암 환자(Young CRC)와 높은 연령의 대장암 환자(Old CRC)의 종양 조직 간에 차등적으로 나타나는 mRNA 발현 및 유전자 프로파일링을 분석한 결과로서, 도 2a는 상기 두 그룹의 종양 조직 간에 차등적으로 발현되는 유전자(Young Tumor vs Old Tumor) 및 정상 조직 간에 차등적으로 발현되는 유전자(Young Normal vs Old Normal)를 각각 Volcano plot으로 나타낸 결과이고, 도 2b는 상기 두 그룹의 종양 조직 간 또는 정상 조직 간에 차등적으로 발현되는 유전자를 벤다이어그램으로 나타낸 결과이며, 도 2c는 상기 두 그룹의 종양 조직에서만 차등적으로 발현되는 180개 유전자에 대한 발현 프로파일을 히트 맵으로 나타낸 결과이고, 도 2d는 네트워크 기반 경로 분석 툴을 이용해 상기 발현이 유의하게 변한 유전자들과 관련된 경로 분석을 실시한 결과이며, 도 2e는 대장암 관련 돌연변이(미스센스, 넌센스 및 스플라이싱)의 Oncoprint 결과이고, 도 2f는 상기 두 그룹(Young CRC 및 Old CRC)에서 빈번하게 검출되는 복제 수 증폭 및 결실을 보여주는 결과이다.
도 3은 낮은 연령의 대장암 환자(young) 및 높은 연령의 대장암 환자(Old) 그룹 간의 PDGFRA의 발현 수준을 비교분석한 결과로서, 도 3a는 PDGFRA mRNA와 연령의 상관관계를 분석하기 위해 연령에 따른 PDGFRA mRNA의 발현수준을 측정하여 산점도로 나타낸 결과이고, 도 3b는 상기 두 그룹 간의 PDGFRA mRNA 발현 수준을 비교하여 나타낸 결과이며, 도 3c는 상기 두 그룹에서 CMS4 유형인 환자만을 대상으로 하여 PDGFRA mRNA 발현 수준을 비교하여 나타낸 결과이다.
도 4는 PDGFRA의 EMT 및 혈관신생 인자들과의 공동 발현 여부를 분석한 결과로서, 도 4a는 PDGFRA와 EMT 관련 마커 사이의 유전자 발현 수준을 산점도로 나타낸 결과이고, 도 4b는 PDGFRA와 혈관 신생 관련 마커 사이의 유전자 발현 수준을 산점도로 나타낸 결과이다.
도 5는 대장암 환자 유래 세포(PDCs)에서 PDGFRA의 발현 및 PDGFRA 표적 약물에 대한 반응성을 분석한 결과로서, 도 5a는 낮은 연령의 대장암 환자에서 분리된 세포(Young PDCs) 및 높은 연령의 대장암 환자에서 분리된 세포(Old PDCs) 각각에서 PDGFRA mRNA의 발현수준을 RT-qPCR로 측정하여 나타낸 결과이고, 도 5b는 낮은 연령의 대장암 환자에서 분리된 세포(#1, #2) 및 높은 연령의 대장암 환자에서 분리된 세포(#3, #4) 각각에서 웨스턴 블롯을 통해 PDGFRA 단백질의 발현 수준을 분석한 결과이며, 도 5c는 상기 도 5b와 동일한 PDCs 각각에 상이한 2종류의 PDGFRA siRNA를 형질감염시켜 PDGFRA의 발현을 저해한 후 세포의 생존능을 분석한 결과이고, 도 5d는 상기 각 PDCs에 PDGFRA 표적 약물인 레고라페닙(Regorafenib)을 처리한 후 세포 생존능을 측정하여 약물에 대한 민감성을 분석한 결과이다.

본 발명자들은 대장암 환자군을 연령에 따라 분류하고 그룹 간에 차등적으로 발현되는 유전자를 발굴하였으며, 최종적으로 40세 이하의 대장암 환자군에서 유의하게 발현이 증가하고 나쁜 예후와 관련된 인자들과의 상관관계를 갖는 것으로 확인된 대장암 환자의 연령 특이적 바이오마커로 PDGFRA를 최종 선별하였는바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha; GenBank 접근(accession) 번호: XM_006714041) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 40세 이하 피검자에서의 대장암 진단 또는 예후예측용 마커 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “진단(diagnosis)”이란 넓은 의미로는 환자의 병의 실태를 모든 면에 걸쳐서 판단하는 것을 의미한다. 판단의 내용은 병명, 병인, 병형, 경중, 병상의 상세한 양태, 및 합병증의 유무 등이다. 본 발명에서 진단은 대장암의 발병 여부 및 진행단계 수준 등을 판단하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, “예후(prognosis)”란, 병세의 진행, 회복에 관한 예측을 의미하는 것으로, 전망 내지는 예비적 평가를 말한다. 본 발명에서 예후는 대장암의 재발, 생존(overall survival), 또는 무병생존(disease-free survival)을 의미하는 것이나, 이것으로 한정되는 것은 아니다.

상기 mRNA 발현을 검출할 수 있는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프라이머(Primer)”란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로서, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어, “프로브(Probe)”란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기 길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소나 효소 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.

상기 단백질을 검출할 수 있는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하며, 단클론(monoclonal) 항체 및 다클론(polyclonal) 항체를 모두 포함한다. 또한, 상기 항체는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 양특이성 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.

본 발명의 대장암 진단 또는 예후예측용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.

예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl₂를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고, 기판은 정량구조 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 본 발명의 마커 유전자가 고정화되어 있는 기판을 갖는 마이크로어레이 형태일 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함하며, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다. 상기 ELISA 키트는 “항원-항체 복합체”를 형성한 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소, 및 그의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “항원-항체 복합체”란 유전자가 코딩하는 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미세입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 구체적인 실시예를 통해 PDGFRA가 40세 이하의 피검자를 대상으로 대장암을 진단하거나 예후를 예측하고, 40세 이하의 대장암 환자에서 치료 전략을 결정하기 위한 바이오마커로 유효함을 확인하였다.

본 발명의 일실시예에서는, 49명의 대장암 환자를 연령에 따라 3개 그룹으로 분류하고 각 대장암 환자를 CMS에 따라 분류한 결과, 40세 이하의 낮은 연령의 환자들로 구성된 그룹에서 나쁜 예후를 나타내는 CMS4의 비율이 가장 높게 나타난 반면, 61세 이상의 높은 연령의 환자들로 구성된 그룹에서 CMS4의 비율이 가장 낮게 나타나, CMS4는 대장암 환자의 연령이 낮을수록 빈도가 증가하는 경향을 보이는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, 40세 이하의 낮은 연령의 대장암 환자로 구성된 그룹과 61세 이상의 높은 연령의 환자들로 구성된 그룹 간에 차등적으로 발현되는 유전자들을 분석하였다. 결과적으로 정상조직이 아닌 상기 두 환자군의 종양 조직에서만 발현이 상이하게 나타나는 180개 유전자를 확인하였으며, 이 중에서 낮은 연령의 환자군에서 상향 조절되거나 하향 조절되는 발암유전자 및 암 억제 유전자를 추출하였다(표 2 및 3 참조). 나아가 네트워크 기반 경로 분석 툴을 이용해 차등적으로 발현된 유전자들로부터 유의하게 변화된 경로를 확인하였으며, 이들 경로 중 CMS4와 관련된 경로가 낮은 연령의 환자군에서 높게 나타났고 상기 경로들은 낮은 연령의 환자군에서 유의하게 상향 조절된 PDGFRA 유전자와 일반적으로 관련이 있는 것을 확인하였다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 연령에 따라 분류된 상기 두 대장암 환자군에서 PDGFRA의 발현수준을 분석한 결과 환자의 연령과 음의 상관관계를 가지며, 낮은 연령의 환자군에서 유의적으로 발현수준이 증가되어 있는 것을 확인하였다. 또한, CMS4 유형의 샘플 내에서 두 연령 그룹간에 발현 수준을 비교한 결과 CMS4 유형만을 고려하더라도 낮은 연령의 환자군에서 발현수준이 더 높은 것을 알 수 있었다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, CMS4가 간엽 유형이며 침윤 및 혈관 생성 시 활성화됨에 따라, PDGFRA가 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 마커 및 혈관 신생 마커와 밀접하게 연관되어 있는지를 분석하였다. 그 결과, PDGFRA가 EMT 마커 및 혈관 신생 마커와 양의 상관관계를 나타내는 것을 확인하였다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 각각 낮은 연령의 대장암 환자 및 높은 연령의 대장암 환자에서 분리한 PDCs를 이용하여 PDGFRA의 발현수준을 측정한 결과, 낮은 연령의 환자군에서 PDGFRA mRNA 및 단백질이 현저한 수준으로 증가되어 있는 것을 확인하였다. 나아가 상기 각 환자군의 PDC에서 PDGFRA의 발현을 저해한 결과 낮은 연령의 환자 유래 PDC에서 세포 생존능이 감소하는 것으로 나타났으며, PDGFRA를 표적하는 항암제인 레고라페닙(Regorafenib)에 대하여 낮은 연령의 환자 유래 PDC만이 민감성을 나타내 세포 생존능이 감소하는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 40세 이하 피검자 유래 샘플로부터 PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha; GenBank 접근(accession) 번호: XM_006714041) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 40세 이하 피검자에서의 대장암 진단 또는 예후예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 및 뇨 등을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 조직 또는 세포일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.

상기 mRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 염기서열 분석, 나노스트링 엔카운터 분석(NanoString nCounter analysis), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단백질 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 또는 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 “대장암의 진단 또는 예후예측을 위한 정보제공방법”은 진단 또는 예후예측을 위한 예비적 단계로써 대장암의 진단 또는 예후예측을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다.

본 발명의 또 다른 양태로서, PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha; GenBank 접근(accession) 번호: XM_006714041) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 40세 이하의 대장암 환자 맞춤형 항암제 선별용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 항암제는 PDGFRA 표적 항암제일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 40세 이하의 대장암 환자 맞춤형 항암제 선별방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 PDGFRA 표적 항암제는 바람직하게는 레고라페닙(Regorafenib)일 수 있으나, PDGFRA를 표적하여 암 치료효과를 나타낼 수 있는 물질이라면 그 종류가 제한되지 않는다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험준비 및 실험방법

1-1. 시료 수집 및 TCGA 대장암 데이터 세트

본 실험은 삼성의료원의 IRB(Institutional Review Board)에 의해 승인되었으며(IRB 승인 번호 SMC 2013-11-007-001), 각 환자로부터 서면 동의를 받은 후 진행하였다. 실험은 서울 삼성의료원에서 대장암 진단을 받은 49명의 환자들을 대상으로 하였으며, 종양 및 이에 매칭되는 정상 조직을 수술 표본으로부터 수득하였다.

한편, cBioPortal(https://www.cbioportal.org/, TCGA, PanCancer Atlas)로부터 594개의 mRNASeq 대장 선암종(colorectal adenocarcinoma; COAD) 샘플의 유전자 발현 프로파일을 얻어 검증 실험에 이용하였다.

1-2. DNA 및 RNA 분리

AllPrep DNA/RNA 미니 키트(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 조직 내의 게놈 DNA 및 RNA 정제하였다. 말초 혈액에서 게놈 DNA는 QIAamp DNA 혈액 미니 키트를 사용하여 추출하였다. 게놈 DNA의 농도 및 순도는 NanoDrop 8000 UV-Vis 분광계(Thermo Scientific Inc., Wilmington, USA) 및 Qubit 2.0 Fluorometer(Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA)를 사용하여 측정하였다. DNA 분해는 2200 TapeStation 기기(Agilent Technologies, CA, CA, USA) 및 실시간 PCR(Agilent Technologies)로 각각 평균 DNA 크기 및 ΔCt 값을 측정함으로써 추정하였다. RNA의 경우에는 NanoDrop 및 Bioanalyzer(Agilent Technologies)로 농도 및 순도를 측정하였다.

1-3. 전체-엑솜 서열분석(Whole-exome sequencing)

Covaris S220(Covaris, MA, USA, MA, USA)을 사용하여 각 샘플 유래 게놈 DNA(1㎍)를 절단하고, SureSelect XT Human All Exon V5 및 SureSelect XT 시약 키트, HSQ(Agilent Technologies)를 사용하여 라이브러리를 구축하였다. 상기 키트는 인간 게놈의 ~71 Mb를 포함하는 21,058개 유전자의 335,756개의 엑손을 포획한다. 농축된 엑솜 라이브러리를 다중화한 다음, 라이브러리에 대하여 HiSeq 2500 플랫폼(Illumina, San Diego, CA, USA)에서 서열분석을 실시하였다. 간략하게, 페어드-말단 DNA 서열분석 라이브러리는 gDNA 절단, 말단 수리, A-테일링, 페어드-말단 어댑터 연결 및 증폭을 통해 제조하였다. 16시간 동안 베이트 서열로 라이브러리를 혼성화한 후, 포획된 라이브러리를 정제하고 인덱스 바코드 태그로 증폭시킨 다음 라이브러리 품질 및 양을 측정하였다. 이어서 TruSeq Rapid PE 클러스터 키트 및 TruSeq Rapid SBS 키트(Illumina)의 100-bp 페어드-엔드 모드에서 서열분석을 수행하였다.

1-4. 엑솜-서열분석 데이터 분석

원시 서열분석 판독은 기본 설정으로 BWA(Browrows-Wheeler Aligner) 버전 0.7.5a를 이용하여 UCSC hg19 참조 게놈(http://genome.ucsc.edu에서 다운로드)에 정렬하였다. 다음으로, Picard-tools-1.93(http://picard.sourceforge.net/)을 이용하여 PCR 복제물을 표시하고, GATK로 데이터 정리를 수행한 후, GATK-3.5로 변이체를 식별 하였다. 이후 MuTect을 사용하여 샘플 쌍으로 점 돌연변이를 확인하였고, ANNOVAR을 사용하여 변이체에 주석을 달았으며, Excavator 툴을 사용하여 체세포 수 변이를 확인하였다. 샘플 전체에서 유의하게 증폭되거나 결실 된 게놈 영역은 GISTIC 툴로 검출하였다.

1-5. RNA 서열분석

RNA 서열분석을 위한 라이브러리 구축은 Truseq RNA 샘플 제조 v2 키트(Illumina)로 수행하였다. 분리된 총 RNA는 SuperScript^TM Ⅱ 역전사효소(Invitrogen/Life Technologies)를 사용하여 폴리(dT) 프라이머와의 역전사 반응에 이용하였다. 간략하게, RNA 서열 분석 라이브러리는 cDNA 증폭, 말단 수리, 3' 말단의 아데닐화(adenylation), 어댑터 결찰(ligation) 및 증폭을 통해 제조하였다. 라이브러리 품질 및 양은 Bioanalyzer 및 Qubit을 이용하여 측정하였다. RNA 라이브러리의 서열 분석은 TruSeq Rapid PE Cluster Kit 및 TruSeq Rapid SBS Kit (Illumina)의 100-bp 페어드-엔드 모드에서 수행하였다.

1-6. RNA-서열분석 데이터 분석

FASTQ 파일의 판독은 STAR 정렬기 버전 2.5.0a를 사용하여 hg19 인간 기준 게놈에 맵핑되었고, 각 유전자에 대한 판독 수는 RSEM 프로그램을 사용하여 백만(TPM) 당 전사체 값으로 보정하였다. 차등적으로 발현된 유전자(DEG)는 컷오프(|log2 폴드-체인지|> 2 및 False Discovery Rate (FDR) < 0.001)를 갖는 DESeq R 패키지를 사용하여 확인하였다. DEGs는 ReactomeFI Cytoscape를 사용하여 경로에 맵핑하였고, 대장암 환자 코호트에서의 CMS는 R 패키지 CMS 분류기와 함께 유전자 발현 프로파일에 기초하여 예측되었다.

1-7. 오가노이드 배양

오가노이드(Organoid) 배양 배지는 2일마다 교체해주었다. 오가노이드를 계대하기 위해, 피펫팅으로 BME를 분해하고 오가노이드를 튜브에 수집하였다. 수집된 오가노이드를 1,000 rpm에서 3분 동안 원심분리하고 배지를 제거한 다음, 5 ml Triple Express(Invitrogen)를 첨가하고 오가노이드를 37℃에서 약 5분 동안 배양하였다. 매 분마다 육안으로 관찰하여 크기 또는 오가노이드를 확인하였으며, 오가노이드에 Triple Express를 오랫동안 처리하지 않도록 주의하였다. 다음으로, FCS 및 배지를 첨가하고 세포를 3분 동안 1,500 rpm에서 회전시킨 후, 펠렛을 BME에 재현탁시키고 세포를 각각 5-10 ㎕의 방울로 떨어뜨렸다. BME를 고체화시킨 후, 10 uM LY27632가 보충된 HICS(일반 오가노이드의 경우) 또는 Wnt가 없는 HICS(종양의 경우)를 플레이트에 첨가하고 오가노이드를 37℃에서 배양하였다.

1-8. 세포 형질감염(transfection)

일시적 형질감염 분석을 위해, PDGFRA siRNA (#1: 5’ CCUCUAUCCUUCCAAAUGAUU 3’ (서열번호 1), 5’ UCAUUUGGAAGGAUAGAGGUU 3’ (서열번호 2), #2: 5’ CCGUCAAAGGAAAGAAGUUUU 3’ (서열번호 3), 5’ AACUUCUUUCCUUUGACGGUU 3’ (서열번호 4), Genolution, Seoul, Korea)를 리포펙타민 RNAiMAX(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 PDCs 내로 형질감염시켰다.

1-9. RT-qPCR 분석

환자 조직에서 총 RNA를 추출하고, 역전사 키트(Bioneer)를 사용하여 500 ng RNA를 역전사시켰다. 이후 RT-PCR 시스템(ABI, USA)을 이용하여 SYBR Green(ABI)으로 실시간 정량적 PCR을 수행하였다. PDGFRA 및 GAPDH 유전자들의 발현수준을 분석하기 위해 인간-특이적 PCR 프라이머(Bioneer)를 사용하였으며, 이후 특정 유전자의 mRNA 수준을 ΔΔCt로 계산하고 GAPDH로 보정하였다.

1-10. 세포 용해 및 웨스턴 블롯 분석

전체 세포 추출물을 제조하기 위해, 프로테아제 억제제를 포함하는 프로-프렙 버퍼(Intron Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 세포를 용해시켰다. 총 10 ~ 40 ㎍의 단백질 추출물을 이용해 SDS-PAGE를 실시하고 분리된 단백질 밴드를 PVDF(polyvinylidene fluoride) 막으로 이동시켰다. 다음으로, 상기 멤브레인에 PDGFRA(ab65258, Abcam) 및 β-액틴(#3700, Cell Signaling Technology)에 대한 1차 항체를 처리하여 반응시킨 후 홀스레디쉬 퍼옥다아제(horseradish peroxidase; HRP)가 접합된 2 차 항체를 처리하고 배양하였다. 이때, β-액틴은 웨스턴 블롯에서 로딩 대조군으로 이용하였다.

실시예 2. 대장암 환자의 연령에 따른 CMS 분류

연령에 따른 대장암 환자간의 분자적 특성의 차이를 규명하기 위해, 본 발명자들은 49명의 대장암 환자를 연령에 따라 3개의 그룹으로 분류하였으며, 보다 상세한 정보는 하기 표 1에 나타내었다.

		Young CRC	Middle CRC	Old CRC
피험자 수(Number)		13	23	13
연령		<=40	41~60	>60
성별	남성	5 (38.5%)	8 (34.8%)	10 (76.9%)
성별	여성	8 (61.5%)	15 (65.2%)	3 (23.1%)
종양 위치	대장	9 (69.2%)	19 (82.6%)	12 (92.3%)
종양 위치	직장	4 (30.8%)	4 (17.4%)	1 (7.7%)
세포 분화 (Cell Differentiation)	선암(Adenocarcinoma) W/D	2 (15.4%)	1 (4.3%)	3 (23.1%)
	Adenocarcinoma M/D	10 (76.9%)	18 (78.4%)	9 (69.2%)
	Adenocarcinoma P/D	0 (0%)	3 (13.0%)	0 (0%)
	점액암(Mucinous carcinoma)	1 (7.7%)	1 (4.3%)	1 (7.7%)
병기단계	Ⅱ	2 (15.4%)	6 (26.1%)	1 (7.7%)
	Ⅲ	4 (30.8%)	2 (8.7%)	3 (23.1%)
	Ⅳ	7 (53.8%)	15 (65.2%)	9 (69.2%)
MSI status	MSS	13 (100%)	20 (87%)	13 (100%)
MSI status	MSI	0 (0%)	3 (13%)	0 (0%)

구체적으로, 낮은 연령의 그룹 (n=13)은 40세 이하의 환자로 구성되었고, 중간 연령 그룹 (n=23)은 41세에서 60세 사이이며, 연령이 높은 그룹 (n=13)은 60세를 넘는 환자로 구성되었다. 환자를 분류한 후, 유전자 발현 프로파일을 이용하여 각 대장암 환자를 CMS에 따라 분류하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 낮은 연령의 환자로 구성된 그룹(Young Age CRC)에서는 특히 CMS4 (53.85%)가 가장 빈번하게 나타났고, CMS3 (38.46%) 및 CMS2 (7.69%)가 뒤를 이었으며 CMS1으로 분류된 환자는 없었다. 중간 연령의 대장암 환자 그룹(Middle Age CRC)에서는 각 CMS 분류의 빈도에 따른 순서는 상기 낮은 연령의 환자 그룹과 동일하였지만 CMS2 (21.74%)와 CMS1 (13.04%)의 빈도가 더 높게 나타났다. 높은 연령의 환자로 구성된 그룹(Old Age CRC)에서는 CMS4 (23.08%)의 빈도가 가장 낮았으며 CMS2 (38.46%)와 CMS3 (38.46%)는 동일한 빈도로 나타났다. 상기 연령에 따른 CMS 분류의 결과, CMS4는 연령이 낮을수록 빈도가 더욱 증가하였으며, CMS2는 연령이 높은 그룹에서 더욱 빈번하게 나타났다.

종합적으로, 상기 결과들을 통해 낮은 연령의 대장암 환자가 가장 나쁜 예후를 나타내는 유형으로 간주되는 CMS4와 밀접한 관련이 있으며, 한편 다른 CMS보다 예후가 좋은 CMS2와는 관련성이 적은 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 낮은 연령과 높은 연령의 대장암 환자간에 차등적으로 발현되는 유전자 프로파일링 분석

낮은 연령의 대장암 환자와 관련된 특정 유전자의 발현 패턴을 체계적으로 확인하기 위해, 49개의 대장암 조직 및 이와 매칭되는 인접한 정상 조직에 대한 RNA 서열분석 데이터를 이용하여 차등적으로 발현되는 유전자를 알아보고자 하였다.

먼저, 본 발명자들은 도 2a에서 볼 수 있는 바와 같이 낮은 연령과 높은 연령의 환자 그룹의 정상 조직간에 유의한 차이를 보이는 연령과 관련된 유전자를 확인하였다(log2 FC(fold change)≥±1, FDR≤0.05). 또한, 상기 두 그룹의 종양 조직에서 발현되는 유전자들을 비교해 차이를 보이는 유전자들을 확인하였다(log2 FC≥±1, FDR≤0.05). 구체적으로, 정상 조직간에는 155개 유전자가 차등적으로 발현되었고 종양 조직에서는 204개 유전자가 차등적으로 발현되는 것으로 나타났다. 다음으로, 도 2b에 도시된 바와 같이 종양 조직에서 차등적으로 발현된 204개 유전자 중에서 정상 조직에서도 차이를 보인 24개의 중복된 유전자를 제거하였다. 결과적으로 상기 두 연령 그룹의 종양 조직에서만 차등적으로 발현되는 180개 유전자를 암에 특이적인 연령-관련 유전자로 간주하였다. 보다 상세하게, 도 2c에 나타낸 바와 같이 상기 180개 유전자 중에서 105개 유전자는 유의하게 상향 조절되었고 나머지 75개 유전자는 하향 조절된 것으로 나타났다(log2 fold change≥±1, p-value≤0.05, FDR≤0.05).

다음으로, 낮은 연령의 대장암 환자에 대한 바이오마커로써 암 관련 유전자를 발굴하기 위해, 본 발명자들은 발암유전자(oncogene)과 암 억제 유전자(tumor suppressor gene)만을 추출하였다. 그 결과, 하기 표 2 및 3에서 볼 수 있는 바와 같이 낮은 연령의 대장암 환자 그룹에서 많은 발암유전자 및 암 억제 유전자들이 상향 조절되거나 하향 조절된 것으로 나타났으며, 구체적으로 8개의 발암유전자 및 6개의 암 억제 유전자가 상향 조절되었고, 4개의 발암유전자 및 5개의 암 억제 유전자가 하향 조절된 것을 확인하였다.

유전자	Fold Change	q-value	Cancer associate	Full Name
WNT11	4.33	0.012	Suppressor Gene	Wnt family member 11
HSPB7	3.28	0.023	Suppressor Gene	heat shock protein family B (small) member 7
FBLN1	3.14	0.001	Suppressor Gene	fibulin 1
CNN1	2.94	0.037	Suppressor Gene	calponin 1
CENPW	2.34	0.021	Oncogene	centromere protein W
LCK	2.3	0.032	Oncogene	LCK proto-oncogene, Src family tyrosine kinase
CLU	2.24	0.01	Suppressor Gene	clusterin
AQP1	2.23	0.033	Oncogene	aquaporin 1
S100A4	2.22	0.019	Oncogene	S100 calcium binding protein A4
TAGLN	2.22	0.031	Suppressor Gene	transgelin
GREM1	2.18	0.01	Oncogene	gremlin 1, DAN family BMP antagonist
PDGFRA	2.18	0.001	Oncogene	platelet derived growth factor receptor alpha
MMP12	2.18	0.028	Oncogene	matrix metallopeptidase 12
SMO	2	0.028	Oncogene	smoothened, frizzled class receptor

유전자	Fold Change	q-value	Cancer associate	Full Name
ZIC2	0.23	0.006	Oncogene	Zic family member 2
PPP1R1B	0.4	0.009	Suppressor gene	protein phosphatase 1 regulatory inhibitor subunit 1B
NDRG2	0.43	0.001	Suppressor gene	NDRG family member 2 [Homo sapiens]
FEZF1	0.44	0.039	Oncogene	FEZ family zinc finger 1 [Homo sapiens]
NFIB	0.48	0.001	Oncogene	nuclear factor I B
ZNF292	0.48	0.001	Suppressor gene	zinc finger protein 292
PHLDA2	0.48	0.001	Suppressor gene	pleckstrin homology like domain family A member 2
CEACAM6	0.49	0.021	Oncogene	carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 6
CEACAM1	0.49	0.001	Suppressor gene	carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 1

다음으로, 네트워크 기반 경로 분석 툴을 이용하여 차등적으로 발현된 유전자들로부터 유의하게 변화된 경로를 확인하였다(상향 조절에서 34개, 하향 조절에서 26개). 이들 경로 중에서, 도 2d에서 볼 수 있는 바와 같이 다수의 CMS4 관련 경로 즉, 'PDGFR-알파 신호전달', 'VEGF-활성화 혈소판 유래 성장인자(PDGF) 수용체 신호전달에 의한 세포 증식의 양성적 조절', '세포 화학 주성', '화학 주성의 조절', '포스포리파제 C(PLC) 활성의 양성적 조절', '포스파티딜이노시톨 인산화'가 낮은 연령의 대장암 환자 그룹에서 높게 나타났다. 이러한 경로는 CMS4와 관련된 전이(metastasis), 신생 혈관 생성(angiogenesis), 증식 및 화학-저항성(chemo-resistance)과 밀접한 관련이 있다는 점은 주목할만한 가치가 있다. 또한 흥미롭게도, 상기 경로는 일반적으로 PDGFRA와 관련이 있는 것을 확인하였다.

이에 더하여, 본 발명자들은 도 2e에 나타낸 바와 같이 대장암 환자의 일차 대장 종양에서 미스센스(missense), 넌센스(nonsense) 및 스플라이싱 돌연변이(splicing mutations)를 포함하는 수많은 체세포 돌연변이를 확인하였다. 돌연변이 프로파일은 TP53 돌연변이가 높은 연령의 환자 그룹 (23%, 3/13) 보다 낮은 연령의 그룹 (76.9%, 10/13)에서 더욱 빈번하게 나타남을 보여주었다. 더욱이, 상기 두 그룹 사이의 복제 수 증폭 및 결실된 게놈 영역을 비교한 결과, 도 2f에 나타낸 바와 같이 염색체 5q22.2에서 복제 수가 낮은 연령의 대장암 환자 그룹에서만 유의하게 결실되어 있는 것을 확인하였다.

실시예 4. 낮은 연령의 대장암 환자에서 PDGFRA의 발현수준 분석

PDGFRA가 대장암 환자의 연령과 상관관계가 있는지 여부를 조사하기 위해, PDGFRA와 연령 사이의 상관관계를 조사하였다.

먼저, 대장암 환자의 연령에 따른 PDGFRA의 발현 수준을 분석한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 해당 코호트에서 PDGFRA의 발현 수준은 환자의 연령과 음의 상관관계를 가지는 것으로 나타났다(spearman’s correlation coefficient; p=0.0001, R=-0.5264). 또한, TCGA 데이터 분석 결과 대장암 환자에서 상기 유전자의 발현과 연령 사이에 일관된 역 상관성이 나타나는 것을 확인하였다(p=0.0113, R=-0.1697). 또한 두 연령 그룹을 비교할 때, 도 3b에서 볼 수 있는 바와 같이 낮은 연령의 대장암 환자 그룹에서 PDGFRA의 발현 수준이 높은 연령의 그룹에서 보다 더 높은 것으로 나타났으며(p=0.0001), TCGA 데이터 또한 이와 유사한 결과를 나타내었다(p=0.2796).

다음으로, PDGFRA가 대장암 환자의 낮은 연령에 대한 인자인지 검증하기 위해, CMS4 유형의 샘플 내에서 두 연령 그룹간에 발현 수준을 비교하였다. 그 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이 실험을 위한 표본의 수가 적어 통계적으로 유의미하지는 않았으나 PDGFRA가 CMS4 유형만을 고려하더라도 높은 연령의 대장암 환자에서 보다 낮은 연령의 환자 그룹에서 더 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다(p=0.0708).

실시예 5. PDGFRA와 CMS4 관련 인자의 공동발현 여부 분석

CMS4는 간엽 유형이며 기질 침윤 및 혈관 생성에서 활성화된다. 본 발명자들은 PDGFRA가 상피간엽이행(epithelial mesenchymal transition; EMT) 마커 및 혈관 신생 마커와 밀접하게 연관되어 있는지 여부를 조사하고자 하였다.

먼저 PDGFRA와 EMT 마커와의 관련성을 분석한 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 EMT 마커인 Vim, ZEB1, ZEB2, Twist1, Twist2 및 MMP2가 PDGFRA와 양성적으로 공동 발현되는 것을 확인하였다. 또한 이들의 발현 수준은 두 연령 그룹간에 상이한 별도의 분포를 나타냈다. PDGFRA와 마찬가지로 CMS4로 확인된 샘플은 높은 발현을 보였다. 혈관 신생 마커의 경우에는 도 4b에서 볼 수 있는 바와 같이, FLT1, FLT4, ICAM1, TIE1 및 KDR을 포함한 5개 마커가 유전자 발현에서 PDGFRA와 양의 상관관계를 나타내는 것을 확인하였다. 또한 TCGA 데이터를 통해서도 상기와 동일한 결과를 확인하였다.

실시예 6. PDGFRA 발현 및 PDGFRA-표적 약물 반응성 분석

낮은 연령의 대장암 환자 그룹에서 PDGFRA의 주요 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 각각 낮은 연령의 대장암 환자와 높은 연령의 대장암 환자에서 유래된 세포(PDCs)를 이용하여 실험을 진행하였다.

먼저 RT-qPCR을 통해 상기 두 그룹에서 PDGFRA의 발현수준을 분석한 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이 낮은 연령의 환자에서 유래된 PDC(Young PDCs)에서 PDGFRA가 더 높은 수준으로 발현되는 것을 확인하였다. 도 5b의 웨스턴 블롯 분석 결과를 통해서도 PDGFRA 단백질이 낮은 연령의 환자에서 유래된 PDC에서 현저히 높은 수준으로 발현되는 것을 알 수 있었다.

다음으로, 본 발명자들은 낮은 연령의 대장암 환자에서 PDGFRA의 가능한 역할을 평가하고자 하였다. 구체적으로, 본 발명자들은 세포 역가 GLO 증식 검정을 이용하여 증식 능력을 비교하기 위해 PDGFRA에 대해 2개의 상이한 siRNA를 각 PDC에 형질감염시켰다. 그 결과, 도 5c에 나타낸 바와 같이 낮은 연령의 환자에서 유래된 PDC(#1, #2)에서 PDGFRA를 넉다운 시킨 경우 세포의 생존능이 유의하게 감소하였다. 이에 반해 높은 연령의 환자에서 유래된 PDC(#3, #4)에서는 대조군(Control)과 비교하여 세포 생존능에 변화가 나타나지 않았다.

나아가 상기 결과를 토대로 낮은 연령의 대장암 환자에 대한 PDGFRA-표적 약물을 결정하기 위해, 약물 민감성과 유전자 발현 간의 상관관계를 분석하였다. Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE) 데이터는 PDGFRA를 표적하는 소라페닙(Sorafenib)이 대장암에서만 약물 반응성을 가짐을 나타낸다. 그러나 본 발명의 결과에 따르면 소라페닙은 대장암 환자유래 세포에서 PDGFRA 발현 또는 대장암 환자의 연령에 따라 구별되는 약물 반응성을 나타내지 않았다. 한편, 레고라페닙(Regorafenib)은 PDGFRA를 포함하는 저분자 멀티-키나아제 억제제로서, 최근 전이성 대장암 환자의 치료 용도로 FDA 승인을 받았다. 본 발명자들은 낮은 연령의 대장암 환자에 대한 치료 전략을 조사하기 위해, PDCs에서 레고라페닙을 사용하여 실험을 진행하였다. 그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이 낮은 연령의 대장암 환자에서 유래된 PDCs에 레고라페닙을 처리한 결과 민감성을 나타내었으며, 이에 반해 높은 연령의 환자에서 유래된 PDCs는 상기 약물에 민감성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> SAMSUNG LIFE PUBLIC WELFARE FOUNDATION <120> Age-specific biomarker of a patient with colorectal cancer and use thereof <130> PD20-057 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFRA siRNA #1_1 <400> 1 ccucuauccu uccaaaugau u 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFRA siRNA #1_2 <400> 2 ucauuuggaa ggauagaggu u 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFRA siRNA #2_1 <400> 3 ccgucaaagg aaagaaguuu u 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDGFRA siRNA #2_2 <400> 4 aacuucuuuc cuuugacggu u 21

Claims

PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha; GenBank 접근(accession) 번호: XM_006714041) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질을 포함하는, 40세 이하 피검자에서의 대장암 진단 또는 예후예측용 마커 조성물.
PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha; GenBank 접근(accession) 번호: XM_006714041) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 40세 이하 피검자에서의 대장암 진단 또는 예후예측용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항에 있어서,
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제2항의 조성물을 포함하는, 40세 이하 피검자에서의 대장암 진단 또는 예후예측용 키트.
하기의 단계를 포함하는, 40세 이하의 대장암 환자 맞춤형 항암제 선별방법:
(a) 40세 이하의 대장암 환자 유래 샘플로부터 PDGFRA(platelet derived growth factor receptor alpha; GenBank 접근(accession) 번호: XM_006714041) 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 61세 이상의 대장암 환자에 비해 상기 40세 이하의 대장암 환자에서 PDGFRA mRNA 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질 수준이 증진된 경우, PDGFRA 표적 항암제를 결정하는 단계.
제6항에 있어서,
상기 PDGFRA 표적 항암제는 레고라페닙(Regorafenib)인 것을 특징으로 하는, 선별방법.
제6항에 있어서,
상기 mRNA의 발현수준은 염기서열 분석, 나노스트링 엔카운터 분석(NanoString nCounter analysis), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 선별방법.
제6항에 있어서,
상기 단백질 발현수준은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony), 보체 고정 분석법(complement fixation assay), 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 선별방법.