KR102341347B1 - 암 치료제에 대한 내성 암의 진단을 위한 조성물, 키트 및 방법 - Google Patents

Abstract

암 치료제에 대한 내성 암의 진단을 위한 조성물, 키트 및 방법에 의하면, 암 치료제에 대한 내성 암을 효율적으로 진단하여 암 치료제를 이용한 치료 효과를 극대화할 수 있고, 암 치료제에 대한 내성 암을 치료할 수 있는 후보 물질을 효율적으로 선별할 수 있다.

Description

암 치료제에 대한 내성 암의 진단을 위한 조성물, 키트 및 방법{Compositions, kits and methods for diagnosing cancer resistant to cancer therapeutics}

암 치료제에 대한 내성 암의 진단을 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.

암치료 패러다임은 10년 주기로 변화되어왔다. 1990년대에는 paclitaxel 등 화학항암제가 주된 치료법이었다. 또한 전통적인 면역치료로서 싸이토카인 치료, 암백신 치료, 적응세포 치료 등이 사용되어 왔다. 가장 처음 시도된 싸이토카인 치료는 IFN-α으로 현재 일부 백혈병, 악성 흑색종 및 카포시육종(Kaposisarcoma) 환자에서 사용되고 있다. 두 번째로 시도된 IL-2는 악성 흑색종 또는 신장암 등에서 사용되고 있다. 또한 TNF-α, GM-CSF 등이 항암효과를 보임으로써 싸이토카인 치료법으로 제시되었다. 하지만 이러한 싸이토카인 치료는 그 효과가 종양 제한적이고 상당수의 환자에서 심각한 독성을 보인다는 점이 문제이다.

이후 유전자 기법의 발달과 암세포 자체에 대한 관심이 높아지면서 암세포의 특정 유전자를 표적으로 하는 표적항암제가 등장하였다. 1997년 rituximab과 2001년 imatinib 등을 시작으로 잇달아 등장한 표적항암제들이 항암치료에 본격적으로 사용되었다. 하지만 여러 표적항암제 또한 내성이 생긴다는 사실이 알려지면서 새로운 암치료 패러다임이 요구되었다.

바이오마커는 일반적으로 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등을 이용해 체내 변화를 알아 낼 수 있는 지표이다. 즉 특정 질병이나 암의 경우 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료 반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 의미한다. 바이오마커는 정상적인 생물학적 과정, 질병 진행상황, 그리고 치료 방법에 대한 약물의 반응성을 객관적으로 측정하고 평가할 수 있는 역할을 하여야 한다. 이는 활용도에 따라 약물 타깃의 존재를 확인하는 타깃 마커, 병의 유무를 진단하는 진단 마커, 특정 약물에 대한 반응군과 비반응군을 구별할 수 있는 예상 마커, 약물 치료효과를 모니터링 할 수 있는 대리표지자 마커, 질병의 예후를 알려주는 예후 바이오마커 등이 있다.

암세포는 지속적으로 변화하고 면역 체계도 다양하기 때문에 예측 마커를 개발하는 것은 상당히 어렵다. 하지만 사전에 약물 반응이 예측이 안된 환자의 경우 무의미한 약제 투여가 예상되기 때문에 바이오마커가 절실하게 필요하게 되었다.

일 양상은 PREX1(Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchanger 1), SNORA14B(small nucleolar RNA, H/ACA box 14B), GREB1(growth regulating estrogen receptor binding 1), ACLY(ATP citrate lyase), PRB4(proline rich protein BstNI subfamily 4) 및 SMPD1(Sphingomyelin phosphodiesterase 1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 암 치료제에 대한 내성을 예측하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 암 치료제에 대한 내성을 예측하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 개체로부터 분리된 시료로부터 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 유전자의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 정상 대조군 시료의 발현 수준 또는 돌연변이 여부와 비교하는 단계를 포함하는 개체의 암 치료제에 대한 내성을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 암 치료제 내성 암의 치료를 위한 후보 물질이 투여된 개체의 시료로부터 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 정상 대조군 시료의 발현 수준 또는 돌연변이 여부와 비교하는 단계를 포함하는 암 치료제 내성 암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 PREX1(Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchanger 1), SNORA14B(small nucleolar RNA, H/ACA box 14B), GREB1(growth regulating estrogen receptor binding 1), ACLY(ATP citrate lyase), PRB4(proline rich protein BstNI subfamily 4) 및 SMPD1(Sphingomyelin phosphodiesterase 1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 암 치료제에 대한 내성을 예측하기 위한 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "PREX1(Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchanger 1)"은 작은 GTP-결합 단백질 (RACs)의 RHO 패밀리에 대한 구아닌 뉴클레오티드 교환 인자로서 작용하는 단백질이다. free GTP에 대한 bound GDP를 교환함으로써 RAC1에 결합하고 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 주로 세포질에서 발견되고 이종삼량체 G 단백질의 포스파티딜이노시톨-3,4,5-트리포스페이트 및 베타-감마 서브 유닛에 의해 활성화된다고 알려져 있다. 상기 PREX1은 종양 조직이 발생할 수 있는 각종 동물 유래의 PREX1일 수 있으며, 특히 인간 유래의 PREX1일 수 있으며, 공지의 데이터베이스인 NCBI GeneBank에서 그 서열 정보를 알 수 있다. 예를 들어, NM_020820.4 또는 NM_177782.3을 포함하는 mRNA로부터 발현되는 단백질, NP_065871.3 또는 NP_808450.2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있다. 상기 mRNA 또는 상기 단백질과 일부 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 PREX1의 mRNA 또는 PREX1 단백질로 간주될 수 있다.

본 명세서에서 용어, "SNORA14B(small nucleolar RNA, H/ACA box 14B)"은 60-150 nt 길이의 비-코딩 RNA이고, C / D 박스 snoRNA 및 H / ACA 박스 snoRNA의 두 그룹을 포함한다. C / D 박스 snoRNA는 rRNA 또는 snRNA의 2'-O- 리보스 메틸화를 위한 가이드이다. H / ACA 박스 snoRNA는 우리딘 잔기를 슈도우리딘으로 이성질화하기 위한 가이드이다. 이 유전자는 H / ACA 박스 snoRNA의 그룹에 속하며, U966 위치에서 18S rRNA 슈도우리딜화에 기능하는 것으로 알려져 있다. 상기 SNORA14B는 종양 조직이 발생할 수 있는 각종 동물 유래의 SNORA14B일 수 있으며, 특히 인간 유래의 SNORA14B일 수 있으며, 공지의 데이터베이스인 NCBI GeneBank에서 그 서열 정보를 알 수 있다. 예를 들어, NR_002956.1을 포함하는 mRNA로부터 발현되는 단백질로 번역될 수 있다. 상기 mRNA 또는 상기 단백질과 일부 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 SNORA14B의 mRNA 또는 SNORA14B 단백질로 간주될 수 있다.

본 명세서에서 용어, "GREB1(growth regulating estrogen receptor binding 1)"은 에스트로겐 수용체 조절 경로에서 초기 반응 유전자인 에스트로겐 반응성 유전자이다. 호르몬 반응 조직과 암에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 GREB1은 종양 조직이 발생할 수 있는 각종 동물 유래의 GREB1일 수 있으며, 특히 인간 유래의 GREB1일 수 있으며, 공지의 데이터베이스인 NCBI GeneBank에서 그 서열 정보를 알 수 있다. 예를 들어, NM_014668.4, NM_001252071.1, NM_033090.3, NM_015764.4 또는 NM_148903.3을 포함하는 mRNA로부터 발현되는 단백질, NP_055483.2, NP_001239000.1, NP_149081.1, NP_056579.2 또는 NP_683701.2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있다. 상기 mRNA 또는 상기 단백질과 일부 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 GREB1의 mRNA 또는 GREB1 단백질로 간주될 수 있다.

본 명세서에서 용어, "ACLY(ATP citrate lyase)"는 동물에서 지방산 생합성에 중요한 단계를 나타내는 효소이다. ACLY는 구연산염을 아세틸-CoA로 전환함으로써, 중간체로서 구연산염을 생성하는 탄수화물의 대사와 아세틸-CoA가 필요한 지방산의 생성을 연결한다고 알려져 있다. 식물에서 ACLY는 왁스, 스테롤 및 폴리케타이드를 포함한 수천 개의 특수 대사 산물의 세포질 아세틸-CoA 전구체를 생성하는 것으로 알려져 있다. 상기 ACLY는 종양 조직이 발생할 수 있는 각종 동물 유래의 ACLY일 수 있으며, 특히 인간 유래의 ACLY일 수 있으며, 공지의 데이터베이스인 NCBI GeneBank에서 그 서열 정보를 알 수 있다. 예를 들어, NM_001096.3, NM_001303274.1, NM_001303275.1 또는 NM_198830.1을 포함하는 mRNA로부터 발현되는 단백질, NP_001087.2, NP_001290203.1, NP_001290204.1 또는 NP_942127.1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있다. 상기 mRNA 또는 상기 단백질과 일부 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 ACLY의 mRNA 또는 ACLY 단백질로 간주될 수 있다. 상기 ACLY는 서열번호 1의 서열을 포함하는 유전자일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 ACLY 유전자 및 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 ACLY 단백질에 돌연변이가 생길 수 있다.

본 명세서에서 용어, "PRB4(proline rich protein BstNI subfamily 4)"는 염기성이고 프롤린이 풍부한 인간 타액 당단백질의 이종 패밀리의 구성원을 인코딩한다. 인코딩된 전프로 단백질은 단백질 분해 처리를 수행하여 이하선으로부터 분비되기 전에 하나 이상의 성숙한 펩티드를 생성하는 것으로 알려져 있다. 상기 PRB4는 종양 조직이 발생할 수 있는 각종 동물 유래의 PRB4일 수 있으며, 특히 인간 유래의 PRB4일 수 있으며, 공지의 데이터베이스인 NCBI GeneBank에서 그 서열 정보를 알 수 있다. 예를 들어, NM_001261399.2 또는 NM_002723.6을 포함하는 mRNA로부터 발현되는 단백질, NP_001248328.1 또는 NP_002714.2의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있다. 상기 mRNA 또는 상기 단백질과 일부 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 PRB4의 mRNA 또는 PRB4 단백질로 간주될 수 있다. 상기 PRB4는 서열번호 2의 서열을 포함하는 유전자일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 PRB4 유전자 및 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 PRB4 단백질에 돌연변이가 생길 수 있다.

본 명세서에서 용어, "SMPD1(Sphingomyelin phosphodiesterase 1)"는 스 핑고미엘린을 세라마이드로 전환시키는 리소좀 산 스핑고미엘리나아제이고 포스 포리파아제 C 활성을 갖는다. 이 유전자의 결함은 Niemann-Pick 질병 유형 A (NPA) 및 Niemann-Pick 질병 유형 B (NPB)의 원인이라고 알려져 있다. 상기 SMPD1은 종양 조직이 발생할 수 있는 각종 동물 유래의 SMPD1일 수 있으며, 특히 인간 유래의 SMPD1일 수 있으며, 공지의 데이터베이스인 NCBI GeneBank에서 그 서열 정보를 알 수 있다. 예를 들어, NM_000543.5, NM_001007593.3, NM_001318087.2, NM_001318088.2 또는 NM_001365135.2를 포함하는 mRNA로부터 발현되는 단백질, NP_000534.3, NP_001007594.2, NP_001305016.1, NP_001305017.1 또는 NP_001352064.1의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 번역될 수 있다. 상기 mRNA 또는 상기 단백질과 일부 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열은 SMPD1의 mRNA 또는 SMPD1 단백질로 간주될 수 있다. 상기 SMPD1은 서열번호 3의 서열을 포함하는 유전자일 수 있다. 또한, 상기 서열번호 SMPD1 유전자 및 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 SMPD1 단백질에 돌연변이가 생길 수 있다.

본 명세서에서 용어 "암 치료제에 대한 내성"은 암 치료제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있으나 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미한다. 항암제 치료에 있어서 일반적인 치료 효과 판정은 고형 종양 그룹의 반응 평가 기준(RECIST　v1.1: New response evaluation criteria in solid tumours: Revised　RECIST　guideline (version 1.1))에 기초하여 결정할 수 있다 (EUROPEAN JOURNAL OF CANCER 45, (2009) 228-247). 상기 기준에 따라 암 치료의 효과는　종양의 크기 변화 등으로부터 완전 반응(Complete Response: CR), 부분 반응(Partial Response: PR), 진행(Progressive Disease: PD) 또는 안정(Stable Disease: SD) 그룹으로 분류할 수 있다. 예를 들어, RECIST v1.1에 따라 대상 병변(TL: target lesion)으로 결정된 경우, 상기 완전 반응 그룹(CR)은 모든 대상 병변이 소멸되고, 모든 대상 및 비-대상 병변에서 병리학적 림프절이 감소된(short axis <10 mm) 그룹을 의미할 수 있다. 상기 부분 반응 그룹(PR)은 베이스라인의 총 직경을 기준으로 하여 대상 병변의 직경의 합이 적어도 30% 감소된 그룹을 의미할 수 있다. 상기 진행 그룹(PD)은 연구에 따른 가장 작은 합계를 기준으로 하여 대상 병변의 직경의 합이 적어도 20% 증가되고, 이와 같은 직경의 합이 상대적으로 20% 증가할 뿐만 아니라, 절대적으로 적어도 5 mm가 증가된 그룹을 의미할 수 있다. 상기 안정 그룹(SD)은 연구에 따른 가장 작은 직경을 기준으로, 부분 반응 그룹으로 분류될 만큼 충분히 감소되지 않고, 진행 그룹으로 분류될 만큼 충분히 증가하지 않은 그룹을 의미할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "발현 수준의 측정"은 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4, SMPD1 또는 이들의 조합의 유전자 자체, 또는 상기 유전자가 발현된 수준, 즉, 상기 유전자에 의해 코딩 되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 또한, 용어 "돌연변이 여부 측정"은 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4, SMPD1 또는 이들의 조합의 유전자 자체의 돌연변이 여부를 확인함으로써 알 수 있다.

상기 제제는 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1 유전자의 mRNA 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 뉴클레오티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 단백질 또는 그 조합을 포함하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프라이머(primer)"는 자유 3-말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 특정 염기 서열에 대해 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 예를 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 또는 SMPD1 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 프라이머로서 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 개체의 암 치료제에 대한 내성을 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 프라이머는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "프로브(probe)"란 표적 핵산 예를 들면, mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 특정 mRNA의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있도록 라벨링(labeling)되어 있을 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA (single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들면 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 또는 SMPD1 유전자의 mRNA와 상보적인 핵산 서열을 갖는 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 mRNA의 발현량을 측정함으로써 개체의 암 치료제에 대한 내성을 예측할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 프로브는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.

또한, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트 (phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한 이러한 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형될 수 있다. 상기 표지의 예는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 또는 바이오틴을 포함할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "항체"란 당해 기술분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 또는 SMPD1 단백질 또는 이의 단편에 대해 특이적으로 결합할 수 있다. PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 또는 SMPD1의 단백질 단편은 예를 들면 면역원성 단편일 수 있다. 상기 단편은 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 또는 SMPD1 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프 (epitope)를 가지고 있는 단백질 단편을 의미한다. PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 또는 SMPD1 유전자를 발현벡터에 클로닝하고 그 유전자에 의해 코딩되는 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 또는 SMPD1 단백질을 수득하고, 수득된 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 항체를 제조할 수 있다.

상기 항체의 형태는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 또는 재조합 항체를 포함하며, 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2 개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태를 의미한다. 또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 폴리클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유 동물을 사용할 수 있다. 상기 면역원은 근내, 복강내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 아주반트(adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제할 수 있다.

단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성기술에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체의 제조 방법에 대해 간단히 설명하면, 상기 단백질을 정제하여 약 10 ㎍의 적당량을 Balb/C 마우스에 면역화를 시키거나, 상기 단백질의 폴리펩티드 단편을 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨 다음, 마우스에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리, 정제할 수 있다. 또한 단일클론 항체는 상업적으로 판매되는 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 또는 SMPD1 단백질에 대한 항체를 입수하여 사용할 수 있다.

이러한 항체들을 이용하여 당해 기술분야에 공지된 효소 면역측정법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역 측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴 겔상의 웨스턴 블롯팅 또는 면역 블롯팅 등의 방법에 의해 생물학적 샘플 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인할 수 있다.

본 명세서에서 용어 "단편"은 예를 들면 온전한 항체, 펩티드 또는 단백질의 구조를 갖지는 않지만, 항원성 부위에 대해 지시되는 특이적인 항원결합부위 또는 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 단편은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체가 아닌 항체 분자의 기능적 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂ 또는 Fv일 수 있다. 상기 결합 단편은 최소한 7개 이상의 아미노산, 예를 들면 9 개 이상의 아미노산, 12개 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 돌연변이는 단일염기변이(Single nucleotide variation, SNV), 프레임 시프트(frame shift) 변이, 삽입/결실변이(Indel), 복제수 변이(Copy number variation, CNV), 결실(deletion) 및 역위(Inversion)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 변이인 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "단일염기변이(Single Nucleotide Variation, SNV)"는 단일염기서열다형성(Single Nucleotide Polymorphism)이 하나의 종내 다수의 집단에서 나타나는 단일염기의 차이를 말하는 것에 비해, 하나의 서열 또는 종내 소수의 집단에서 나타나는 단일염기의 차이를 의미하고, 주로 시퀀싱 데이터에서 나타나는 표준염기서열과의 차이를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "삽입/결실변이(Indel)"는 유전자의 핵산 개수를 변화시킬 수 있는 삽입 또는 결실 변이를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "복제수 변이(copy number variation, CNV)"는 유전자의 복제수가 증가하거나 감소한 상태를 의미한다.

상기 유전자의 돌연변이는 임의의 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있고, 예를 들면, 상기 기재된 변이 뿐만 아니라, 절단형(truncating) 돌연변이, 미스센스(missense) 돌연변이(또는 과오 돌연변이), 넌센스(nonsense) 돌연변이, 프레임 시프트(frame shift) 돌연변이, 인프레임(in-frame) 돌연변이(또는 해독틀내 돌연변이), 스플라이스 돌연변이 및 스플라이스 사이트(splice_region) 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 돌연변이를 가질 수 있다. 상기 프레임 시프트 돌연변이는 프레임 시프트 삽입(frame shift insert, FS ins) 돌연변이 및 프레임 시프트 결실 돌연변이(frame shift delete, FS del) 중 적어도 하나일 수 있다. 상기 인-프레임 돌연변이는 인-프레임 삽입(in-frame insertion, IF ins) 돌연변이 및 인-프레임 결실(in-frame delete, IF del) 돌연변이 중 적어도 하나일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 암 치료제는 CDK4/6 억제제, 풀베스트란트(fulvestrant) 또는 이들의 조합인 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "CDK4/6 억제제"는 CDK(cyclin-dependent kinase)4 및 CDK6의 기능을 억제하는 물질이고, 암세포의 과다 증식을 예방하여 암을 치료하는데 사용될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "호르몬제"는 호르몬을 포함하고 있는 물질로서, 암을 치료하는데 사용될 수 있다. 호르몬제는 단독투여되거나 병용투여 될 수 있으며, 병용투여 되는 경우 암에 대하여 치료학적 상승 효과를 가질 수 있다.

상기 CDK4/6 억제제는 팔보시클립(palbociclib), 리보시클립(ribociclib) 및 아베마시클립(abemaciclib)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

상기 호르몬제는 풀베스트란트(fulvestrant)인 것일 수 있다.

상기 암은 난소암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 종양 세포 또는 조직 내 PREX1, SNORA14B 또는 GREB1의 발현 감소 및 ACLY, PRB4 또는 SMPD1의 돌연변이 형성은 유방암 치료제 내성과 연관성이 있는 것으로 밝혀졌다. ACLY는 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 ACLY의 아미노산 서열의 589번째 알라닌 이후의 프레임시프트 결실 돌연변이가 일어난 것이고, PRB4는 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 PRB4의 아미노산 서열의 209번째 알라닌이 프롤린으로 치환되는 돌연변이가 일어난 것이며, SMPD1은 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 SMPD1의 아미노산 서열의 508번째 글라이신이 아르기닌으로 치환되는 돌연변이가 일어난 것이다. 따라서, PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 또는 SMPD1의 발현 수준 또는 돌연변이 여부는 유방암 치료제 내성을 진단하는데 사용될 수 있다.

다른 양상은 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 암 치료제에 대한 내성을 예측하기 위한 키트를 제공한다.

상기 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

상기 키트는 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정함으로써, 암 치료제에 대한 내성을 진단할 수 있는 효과가 있다. 상기 키트에는 암 치료제에 대한 내성의 진단을 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브, 등 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치가 더 포함될 수 있으며, RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 칩 키트를 포함할 수 있다.

상기 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합 효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하기 위한 키트는 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 마이크로어레이 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으며, 상기 유전자를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이를 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine) 및 알데히드 (aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것일 수 있다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 상기 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하기 위한 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또 다른 양상은 개체로부터 분리된 시료로부터 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 유전자의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 정상 대조군 시료의 발현 수준 또는 돌연변이 여부와 비교하는 단계를 포함하는 개체의 암 치료제에 대한 내성을 예측하기 위한 정보제공방법을 제공한다.

상기 내성을 예측하기 위한 정보제공방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

본 명세서에서 용어 "개체"는 암 치료제에 대한 내성의 존재 여부를 확인 또는 예측하고자 하는 개체를 의미한다. 상기 개체는 척추동물일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등일 수 있으며, 보다 구체적으로 포유동물, 예를 들면, 인간(Homo sapiens)일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "시료"는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 세포, 조직 등을 포함할 수 있고, 예를 들어, 종양 세포 또는 종양 조직일 수 있다.

상기 "발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하는 방법"은 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 방법은, 상기 발현 수준 또는 돌연변이 여부가 대조군의 발현 수준 또는 돌연변이 여부와 비교하여 변화한 경우, 개체가 암 치료제에 대한 내성이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

상기 방법에서, 개체의 시료로부터 측정된 PREX1, SNORA14B 또는 GREB1의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 경우, 및 개체의 시료로부터 측정된 ACLY, PRB4 또는 SMPD1가 정상 대조군에 비해 돌연변이가 형성된 경우, 암 치료제에 대한 내성을 갖는 것으로 판단할 수 있다. 상기 발현 수준의 변화는 개체의 발현 수준이 정상 대조군 또는 양성 대조군에 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 이상 증가 또는 감소하는 것을 포함할 수 있다.

상기 방법에서, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합으로 수행하는 것일 수 있다.

또 다른 양상은 암 치료제 내성 암의 치료를 위한 후보 물질이 투여된 개체의 시료로부터 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 측정하는 단계; 및 상기 측정된 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 정상 대조군 시료의 발현 수준 또는 돌연변이 여부와 비교하는 단계를 포함하는 암 치료제 내성 암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 스크리닝하는 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물, 키트 또는 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물, 키트 또는 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

본 명세서에서 용어 "후보 물질"은 새롭게 합성된 또는 공지된 화합물로, 암 치료제 내성 암의 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질을 제한 없이 포함할 수 있다.

상기 후보약물의 "투여"는 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 상기 후보 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한, 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내, 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 등으로 투여될 수 있다.

상기 방법에서, 개체의 시료로부터 측정된 PREX1, SNORA14B 또는 GREB1의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 경우, 및 개체의 시료로부터 측정된 ACLY, PRB4 또는 SMPD1가 정상 대조군에 비해 돌연변이가 형성된 경우, 후보물질을 암 치료제 내성 암 치료제로 판단할 수 있다. 상기 발현 수준의 변화는 개체의 발현 수준이 정상 대조군 또는 양성 대조군에 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 이상 증가 또는 감소하는 것을 포함할 수 있다.

일 양상에 따른 암 치료제에 대한 내성 예측용 조성물, 키트 및 방법은 암 치료제에 대한 내성 암을 효율적으로 진단하여 암 치료제를 이용한 치료 효과를 극대화할 수 있고, 암 치료제에 대한 내성 암을 치료할 수 있는 후보 물질을 효율적으로 선별할 수 있다.

도 1은 암 치료제에 대한 내성 진단에 이용될 수 있는 유전자를 선별하기 위한 전체적인 실험 방법을 나타낸 도면이다.
도 2는 차별발현유전자(differentially expressed genes, DEG)를 선별하여 암 치료제에 대한 내성 진단에 이용될 수 있는 DEG인 PREX1, SNORA14B 및 GREB1를 선정한 과정을 나타낸 도면이다.
도 3은 전체 엑솜 시퀀싱(whole exome sequencing, WES)을 수행하여 암 치료제에 대한 내성 진단에 이용될 수 있는 ACLY, PRB4 및 SMPD1를 선정한 과정을 나타낸 도면이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 풀베스트란트 또는 팔보시클립 내성과 PREX1, SNORA14B 및 GREB1의 발현, ACLY, PRB4 및 SMPD1의 돌연변이 발생의 연관성 확인

풀베스트란트 또는 팔보시클립 내성과 PREX1, SNORA14B 및 GREB1의 발현, ACLY, PRB4 및 SMPD1의 돌연변이 발생의 연관성을 확인하기 위해, CDK4/6 억제제인 팔보시클립 감수성을 보이는 유방암 세포주 MCF7의 이종이식(PDTX: Patient-Derived Tumor Xenograft) 동물 모델에 유방암 항암제이자 CDK4/6 억제제인 팔보시클립 또는 풀베스트란트를 단독투여하거나 병용투여하여 상기 약물 내성 동물 모델을 구축하고, 이로부터 내성 종양 조직을 확보하여 마이크로어레이 및 전체 엑솜 시퀀싱(whole exome sequencing, WES)을 수행하였다. 전체적인 실험과정은 도 1, 2 및 3에 나타내었다.

구체적으로, Athymic 누드 마우스 12마리에 각각 팔보시클립에 감수성을 보이는 호르몬 수용체 양성인 유방암 세포주 MCF7을 피하 이식하였다. 이 중, 3마리는 약물을 투여하지 않은 대조군, 다른 3마리는 풀베스트란트를 투여한 실험군, 또 다른 3마리는 팔보시클립을 투여한 실험군, 나머지 3마리는 풀베스트란트와 팔보시클립을 병용하여 투여한 실험군으로 하였다. 상기 동물 모델에서 종양 크기가 약 100mm³가 되었을 때, 각각 상기 약물의 경구 투여를 시작하였다. 풀베스트란트는 250 mg/kg, 1일 1회 주당 5일 투여하였고, 팔보시클립은 100mg/kg, 1일 1회 매일 투여하였으며, 9~12개월간 투여하였다. 병용투여한 경우 두 약제 각각의 용량과 스케줄은 단독 투여시와 동일하였다. 이후, 1주에 3회씩 종양 크기를 측정하였다. 종양 크기가 최대 감소치에서 다시 증가하여 25% 이상 증가하면 획득 내성인 것으로 판단하였다(Nat Genet.　2012 Jul 1;44(8):852-60). 각각 풀베스트란트, 팔보시클립, 풀베스트란트와 팔보시클립을 병용하여 투여한 경우에 대한 획득 내성이 확인된 조직을 확보하였다. 상기 조직을 이용하여 mRNA 마이크로어레이와 전체 엑솜 시퀀싱을 수행하였다. mRNA 마이크로어레이 시, 사용된 프로브 서열은 하기 표 1에 나타내었다.

유전자명	유전자 프로브 서열	서열번호
PREX1	ACTTAGAACGAAGCTACCAAGAGGGCTTAGAACGAAGCTACCAAGAGGGT AGCACTTAGAACGAAGCTACCAAGA TTGGAAGCACTTAGAACGAAGCTAC TGGAAGCACTTAGAACGAAGCTACC CACTTAGAACGAAGCTACCAAGAGG CTTGGAAGCACTTAGAACGAAGCTA GAAGCACTTAGAACGAAGCTACCAA GCACTTAGAACGAAGCTACCAAGAG AAGCACTTAGAACGAAGCTACCAAG ATCTTGGAAGCACTTAGAACGAAGC TCTTGGAAGCACTTAGAACGAAGCT GGAAGCACTTAGAACGAAGCTACCA	4
SNORA14B	ACTTAGAACGAAGCTACCAAGAGGGCTTAGAACGAAGCTACCAAGAGGGT AGCACTTAGAACGAAGCTACCAAGA TTGGAAGCACTTAGAACGAAGCTAC TGGAAGCACTTAGAACGAAGCTACC CACTTAGAACGAAGCTACCAAGAGG CTTGGAAGCACTTAGAACGAAGCTA GAAGCACTTAGAACGAAGCTACCAA GCACTTAGAACGAAGCTACCAAGAG AAGCACTTAGAACGAAGCTACCAAG ATCTTGGAAGCACTTAGAACGAAGC TCTTGGAAGCACTTAGAACGAAGCT GGAAGCACTTAGAACGAAGCTACCA	5
GREB1	TTGAGACTGTCCAAAGAGTGGCACAAAGAACCTCTTGTCAACGGCGCACA GATTCGGTGCAAAAGCCTGGCTCCA GACCAACAGCCGGAACATCTCGGAG GAATTCCGTGAAGTAACAGAAGCCT CCAGGGATGCTGCTTTAGTGACAGA CATTTATTGAGACTTGGCCAAGGTC GAAAGGTGACTGAAGCTGGTCCCAC TGAGAAGGCTCTCGGAAAGAATCCG TGACTCTCATGGAAGCCACATCAGA TTAGACTGTTTCACTAGGAGCTGCC ACGTCCGGATTTCGTATTTGATGTG TGTCGTACACGAGCTTGGGCAAGAA TCTGTGAGCCGAACAAGCATCCTGG GATAGTGCGAACAAATCAGGCTGGC GATTAAAGAGCCCATGTTCGTGACG TGCTGAGCTCCCATCAGGATGCTGG GAATCTTTGCCGTTGAAAACAGCCG TGCAGTTGAGCAATCGGTCCACCAA GATTCAATAAACTCCGACAGCCCGA GATTAGCCAGCCAGAGCATGTCCAA TCTGCCGGACCAAGGGCTACCATTT GGTGAAGCTATCAAATCCTCTCGGG GTCTTGTGCACAGCTTACGGTCCCA TGGGAGCGGGACCTCTCCCTTTTCA CAGAACTTTCCATAGGGCTCCAGGT CACAAGATCCCAGTGCGCATGGTCA CGACCGCGGCAGAGTTATCAGACAC CACTGAACAGCAAGTCCGAGCAGCT TCACGCAGGAGTCATCAGAGATCAC TCAGAGGAATCCTGATGGCCTCCCA GAAGATCAGGATGCAAGGCAGACCC GGAGTTTATCAATCGCAGGTCACAG TGTCGTCCCGTCAGAAAAAAGAGCG CAGATTTTGGGTGCTGGAATCCGCA CACCCGCAGGTTGAAGTCTACATCG TACAAAAAGCTGGTCACTTCAGGCA TAAGAATGCATTCTGAGGCCAGGCG	6

구체적으로, 품질관리를 위하여, RNA 순도는 흡광도 260/280 비율로 평가하였고, Agilent 2100 Bioanalyzer 로 분석하였다. Affymetrix Whjole transcript Expression array 과정은 GeneChip Whole Transcript PLUS reagent Kit 의 protocol을 이용하여 분석하였다. cDNA는 GeneChip WT (whole transcript) Amplification kit을 사용하여 합성 하였고, 합성된 cDNA는 GeneChip WT terminal labeling kit를 이용하여 조각난 DNA 에 biotin이 라벨된 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase) 를 labeling 해주었다. 대략 5.5 μg 의 labeling 된 DNA target을 Affymetrix GeneChip Human or Mouse 2.0 ST Array 에 45°C 에서 16시간 하이브리드 시켰다. 하이브리드 된 array는 GeneChip Fluidics Station 450 으로 세척 및 염색을 시킨 후 GCS3000 scanner (Affiymetrix)로 이미지화 하였다. 시그널값은 Affymetrix® GeneChip™ Command Console software 를 사용하여 컴퓨터로 분석하였다.

마이크로어레이 결과를 분석하여, 군끼리 비교 시 발현이 3배 이상 차이나는 차별발현유전자(differentially expressed genes, DEG)을 찾은 뒤, 풀베스트란트와 팔보시클립을 병용투여한 군 및 팔보시클립을 단독투여한 군의 내성 조직에서 대조군 조직과 비교하여 공통적인 DEG인 PREX1, SNORA14B 및 GREB1을 내성 유전자로 선별하였다. 각 내성 유전자 발현의 배수 변화를 표 2에 나타내었다.

유전자	Fold Change
PREX1	-4.6
SNORA14B	-3.1
GREB1	-3.6

대조군, 풀베스트란트 단독투여군 및 풀베스트란트와 팔보시클립을 병용투여한 군의 내성 조직에서 전체 엑솜 시퀀싱을 수행하여 돌연변이 된 유전자를 스크리닝하였다.

구체적으로, 표준 엑솜 캡쳐 라이브러리의 생성을 위해, 1ug 입력 gDNA와 함께 Illumina paired-end 시퀀싱 라이브러리 (버전 C2, 2018년 12월) 를 위한 Agilent SureSelect Target Enrichment 방법을 사용하였다. 모든 경우에서, SureSelect Human All Exon V6 probe 세트가 사용되었다. DNA 정량과 DNA 품질은 PicoGreen과 Nanodrop으로 측정하였다. 게놈 DNA의 1ug 단편화는 adaptive focused acoustic 기술 (AFA; Covaris)을 사용하여 수행하였다. 단편화된 DNA가 수리되고, 'A'가 3' 말단에 붙게되고, 이 때 Agilent adaptor가 단편에 붙게 된다. 결합이 평가되면, 어댑터에 결합된 산물은 PCR을 증폭시켰다. 이 때 최종 정제된 생성물은 TapeStation DNA screentape (Agilent)를 사용하여 정량화되고 품질을 검증하였다. 엑솜 캡처를 위해, 표준 Agilent SureSelect Target Enrichment 방법에 따라서, DNA 라이브러리 250ng이 혼성화 완충용액, 블로킹 혼합물, RNase 차단물과 SureSelect 올 엑솜 캡처 라이브러리 5 ul를 혼합하였다. Capture baits에 대한 혼합화는 PCR 기계에서 24시간 동안 105°C에서 가열된 열 사이클러 뚜껑 옵션을 사용하여 65°C에서 수행하였다. 이 때 캡처된 DNA는 증폭되고, 마지막 정제된 생산물은 qPCR Qnantification Protocel Guide에 따라서 qPCR을 사용하여 정량하고 TapeStation DNA screentape (Agilent)를 사용하여 품질 확인을 하였다. 그리고 이 때 NovaSeq 플랫폼 (Illumina, San Diego, USA)을 사용하여 시퀀싱하였다.

모든 군에서 내성과 관련있는 유전자들을 먼저 선별한 뒤, 모든 군에서 겹치는 유전자들은 제외하였다. 그 다음, 표 3에 나타낸 바와 같이 풀베스트란트 또는 팔보시클립 투여 후 사라지는 돌연변이 유전자, 풀베스트란트 단독투여 후 유도되는 돌연변이 유전자 및 풀베스트란트 및 팔보시클립 병용투여 후 유도되는 돌연변이 유전자를 선별하고, 기존 문헌을 통해 암의 진행 및 약제 내성과 관련된 유전자로, ACLY, PRB4 및 SMPD1 유전자를 최종적으로 선별하였다. 여기서, ACLY는 ACLY 아미노산 서열의 589번째 알라닌 이후의 프레임시프트 결실 돌연변이가 일어났고, PRB4는 PRB4 아미노산 서열의 209번째 알라닌이 프롤린으로 치환되는 돌연변이가 일어났고, SMPD1은 SMPD1 아미노산 서열의 508번째 글라이신이 아르기닌으로 치환되는 돌연변이가 일어났다.

풀베스트란트 또는 팔보시클립 투여 후, 사라지는 돌연변이 유전자	풀베스트란트 단독투여 후, 유도되는 돌연변이 유전자	풀베스트란트 및 팔보시클립 병용투여 후, 유도되는 돌연변이 유전자
AES	CCDC40	ACLY
BLZF1	HSPB11	DDX60L
C20orf27	MTCH2	LRCH2
CD24	MYPOP	OTOA
CDC5L	POTEH	PRB4
CNTN5	RAPGEF2	RNF10
CNTNAP3B	ROBO2	SMPD1
CUX2	SLC3A2	ZDHHC8
LINC01193	TPSB2
RSPO2	TRIM64B
SPATA5L1	ZNF503
TIMEM217

상기 결과로부터, 정상 대조군 조직과 풀베스트란트 또는 팔보시클립이 투여된 양성 대조군 조직과 비교하여, 상기 약물 내성 조직에서 PREX1, SNORA14B 및 GREB1의 발현수준이 현저한 차이가 나고, ACLY, PRB4 및 SMPD1이 돌연변이가 발생함을 확인할 수 있다. 즉, PREX1, SNORA14B 및 GREB1의 발현수준 또는 ACLY, PRB4 및 SMPD1의 돌연변이 형성 여부 측정을 통해, 상기 약물의 내성을 효율적으로 진단하여 상기 약물을 이용한 치료 효과를 극대화할 수 있고, 상기 약물에 대한 내성 암을 치료할 수 있는 후보 물질을 효율적으로 선별할 수 있음을 확인하였다.

<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> Compositions, kits and methods for diagnosing cancer resistant to cancer therapeutics <130> PN130401 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 325 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acttagaacg aagctaccaa gagggcttag aacgaagcta ccaagagggt agcacttaga 60 acgaagctac caagattgga agcacttaga acgaagctac tggaagcact tagaacgaag 120 ctacccactt agaacgaagc taccaagagg cttggaagca cttagaacga agctagaagc 180 acttagaacg aagctaccaa gcacttagaa cgaagctacc aagagaagca cttagaacga 240 agctaccaag atcttggaag cacttagaac gaagctcttg gaagcactta gaacgaagct 300 ggaagcactt agaacgaagc tacca 325 <210> 2 <211> 891 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tgcagagttg ggagtgactc cagagcctcc agcgagatgc tgttgattct gctgtcagtg 60 gccctgctgg ccctgagctc agctgagagt tcaagtgaag atgtcagcca ggaagaatct 120 ctcttcctaa tatcaggaaa gccagaagga cgacgcccac aaggaggaaa ccagccccaa 180 cgtcccccac ctcctccagg aaagccacaa ggaccacccc cacaaggagg aaaccagtcc 240 caaggtcccc cacctcctcc aggaaagcca gaaggacgac ccccacaagg 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ggcgctggcg ctggcgctgg cgctggcgct ggctctgtct 240 gactctcggg ttctctgggc tccggcagag gctcaccctc tttctcccca aggccatcct 300 gccaggttac atcgcatagt gccccggctc cgagatgtct ttgggtgggg gaacctcacc 360 tgcccaatct gcaaaggtct attcaccgcc atcaacctcg ggctgaagaa ggaacccaat 420 gtggctcgcg tgggctccgt ggccatcaag ctgtgcaatc tgctgaagat agcaccacct 480 gccgtgtgcc aatccattgt ccacctcttt gaggatgaca tggtggaggt gtggagacgc 540 tcagtgctga gcccatctga ggcctgtggc ctgctcctgg gctccacctg tgggcactgg 600 gacattttct catcttggaa catctctttg cctactgtgc cgaagccgcc ccccaaaccc 660 cctagccccc cagccccagg tgcccctgtc agccgcatcc tcttcctcac tgacctgcac 720 tgggatcatg actacctgga gggcacggac cctgactgtg cagacccact gtgctgccgc 780 cggggttctg gcctgccgcc cgcatcccgg ccaggtgccg gatactgggg cgaatacagc 840 aagtgtgacc tgcccctgag gaccctggag agcctgttga gtgggctggg cccagccggc 900 ccttttgata tggtgtactg gacaggagac atccccgcac atgatgtctg gcaccagact 960 cgtcaggacc aactgcgggc cctgaccacc gtcacagcac ttgtgaggaa gttcctgggg 1020 ccagtgccag tgtaccctgc tgtgggtaac 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<400> 5 acttagaacg aagctaccaa gagggcttag aacgaagcta ccaagagggt agcacttaga 60 acgaagctac caagattgga agcacttaga acgaagctac tggaagcact tagaacgaag 120 ctacccactt agaacgaagc taccaagagg cttggaagca cttagaacga agctagaagc 180 acttagaacg aagctaccaa gcacttagaa cgaagctacc aagagaagca cttagaacga 240 agctaccaag atcttggaag cacttagaac gaagctcttg gaagcactta gaacgaagct 300 ggaagcactt agaacgaagc tacca 325 <210> 6 <211> 950 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GREB1 probe <400> 6 ttgagactgt ccaaagagtg gcacaaagaa cctcttgtca acggcgcaca gattcggtgc 60 aaaagcctgg ctccagacca acagccggaa catctcggag gaattccgtg aagtaacaga 120 agcctccagg gatgctgctt tagtgacaga catttattga gacttggcca aggtcgaaag 180 gtgactgaag ctggtcccac tgagaaggct ctcggaaaga atccgtgact ctcatggaag 240 ccacatcaga ttagactgtt tcactaggag ctgccacgtc cggatttcgt atttgatgtg 300 tgtcgtacac gagcttgggc aagaatctgt gagccgaaca agcatcctgg gatagtgcga 360 acaaatcagg ctggcgatta aagagcccat gttcgtgacg tgctgagctc ccatcaggat 420 gctgggaatc tttgccgttg aaaacagccg 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Claims (16)

1. PREX1(Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-dependent Rac exchanger 1)의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 개체의 암 치료제에 대한 내성을 예측하기 위한 조성물로서,
   상기 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 조성물은 개체의 팔보시클립(palbociclib) 또는 팔보시클립과 풀베스트란트(fulbestrant)의 조합에 대한 내성을 예측하기 위한 조성물인 것인, 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은
   1) SNORA14B(small nucleolar RNA, H/ACA box 14B) 및 GREB1(growth regulating estrogen receptor binding 1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준을 측정하기 위한 제제;
   2) ACLY(ATP citrate lyase), PRB4(proline rich protein BstNI subfamily 4) 및 SMPD1(Sphingomyelin phosphodiesterase 1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 여부를 측정하기 위한 제제;
   또는 이들의 조합을 추가로 포함하는, 조성물로서,
   상기 돌연변이는 ACLY 아미노산 서열의 589번째 알라닌 이후의 프레임시프트 결실 돌연변이, PRB4 아미노산 서열의 209번째 알라닌이 프롤린으로 치환되는 돌연변이 및 MPD1 아미노산 서열의 508번째 글라이신이 아르기닌으로 치환되는 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고,
   상기 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 조성물은 개체의 팔보시클립(palbociclib) 또는 팔보시클립과 풀베스트란트(fulbestrant)의 조합에 대한 내성을 예측하기 위한 조성물이고,
   상기 돌연변이 여부를 측정하기 위한 제제를 포함하는 조성물은 개체의 팔보시클립과 풀베스트란트의 조합에 대한 내성을 예측하기 위한 조성물인 것인, 조성물.
3. 청구항 2에 있어서, 상기 제제는 PREX1, SNORA14B, GREB1, ACLY, PRB4 및 SMPD1 유전자의 mRNA 또는 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 뉴클레오티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 단백질 또는 그 조합을 포함하는 것인 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 암은 난소암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 및 췌장암으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것인 조성물.
5. 청구항 1 또는 2의 조성물을 포함하는, 개체의 암 치료제에 대한 내성을 예측하기 위한 키트로서,
   상기 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 조성물은 개체의 팔보시클립(palbociclib) 또는 팔보시클립과 풀베스트란트(fulbestrant)의 조합에 대한 내성을 예측하기 위한 조성물이고,
   상기 돌연변이 여부를 측정하기 위한 제제는 팔보시클립과 풀베스트란트(fulbestrant)의 조합에 대한 내성을 예측하기 위한 조성물인 것인, 키트.
6. 개체로부터 분리된 시료로부터 PREX1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
   상기 측정된 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 개체의 암 치료제에 대한 내성을 예측하기 위한 정보제공방법으로서,
   상기 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 정보제공방법은 개체의 팔보시클립 또는 팔보시클립과 풀베스트란트의 조합에 대한 내성을 예측하기 위한 정보제공방법인 것인, 정보제공방법.
7. 청구항 6에 있어서, 상기 방법은
   개체로부터 분리된 시료로부터 SNORA14B 및 GREB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 여부를 측정하는 단계; 및
   상기 측정된 유전자의 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 정상 대조군 시료의 발현 수준 또는 돌연변이 여부와 비교하는 단계를 추가로 포함하는 정보제공방법으로서,
   상기 돌연변이는 ACLY 아미노산 서열의 589번째 알라닌 이후의 프레임시프트 결실 돌연변이, PRB4 아미노산 서열의 209번째 알라닌이 프롤린으로 치환되는 돌연변이 및 MPD1 아미노산 서열의 508번째 글라이신이 아르기닌으로 치환되는 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고,
   상기 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 정보제공방법은 개체의 팔보시클립 또는 팔보시클립과 풀베스트란트의 조합에 대한 내성을 예측하기 위한 정보제공방법이고,
   상기 돌연변이 여부를 측정하는 단계를 포함하는 정보제공방법은 개체의 팔보시클립과 풀베스트란트(fulbestrant)의 조합에 대한 내성을 예측하기 위한 정보제공방법인 것인, 정보제공방법.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 발현 수준 또는 돌연변이 여부가 대조군의 발현 수준 또는 돌연변이 여부와 비교하여 변화한 경우, 개체가 암 치료제에 대한 내성이 있는 것으로 결정하는 단계를 포함하는 정보제공방법.
9. 청구항 6에 있어서, 상기 시료는 종양 조직인 것인 정보제공방법.
10. 청구항 6에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합으로 수행하는 것인 정보제공방법.
11. 암 치료제 내성 암의 치료를 위한 후보 물질이 투여된 개체의 시료로부터 PREX1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 치료제 내성 암 치료제를 스크리닝하는 방법으로서,
    상기 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 방법은 개체의 팔보시클립 또는 팔보시클립과 풀베스트란트의 조합에 대한 내성을 갖는 암 치료제를 스크리닝하는 방법인 것인, 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 방법은
    암 치료제 내성 암의 치료를 위한 후보 물질이 투여된 개체의 시료로부터 SNORA14B, 및GREB1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 발현 수준 또는 ACLY, PRB4 및 SMPD1으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이 여부를 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 발현 수준 또는 돌연변이 여부를 정상 대조군 시료의 발현 수준 또는 돌연변이 여부와 비교하는 단계를 추가로 포함하는 암 치료제 내성 암 치료제를 스크리닝하는 방법으로서,
    상기 돌연변이는 ACLY 아미노산 서열의 589번째 알라닌 이후의 프레임시프트 결실 돌연변이, PRB4 아미노산 서열의 209번째 알라닌이 프롤린으로 치환되는 돌연변이 및 MPD1 아미노산 서열의 508번째 글라이신이 아르기닌으로 치환되는 돌연변이로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이고,
    상기 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 방법은 개체의 팔보시클립 또는 팔보시클립과 풀베스트란트의 조합에 대한 내성을 갖는 암 치료제를 스크리닝하는 방법이고,
    상기 돌연변이 여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법은 개체의 팔보시클립과 풀베스트란트(fulbestrant)의 조합에 대한 내성을 갖는 암 치료제를 스크리닝하는 방법인 것인, 방법.
13. 청구항 11에 있어서, 상기 시료는 종양 조직인 것인 스크리닝 방법.
14. 청구항 11에 있어서, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석 (Radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 질량분석, 자석비드-항체 면역 침강법, 단백질 칩 (protein chip), 또는 그 조합으로 수행하는 것인 스크리닝 방법.
15. 청구항 12에 있어서, 상기 측정된 PREX1, SNORA14B 또는 GREB1의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 낮은 경우, 및 상기 측정된 ACLY, PRB4 또는 SMPD1가 정상 대조군에 비해 돌연변이가 생긴 경우, 투여된 후보 물질을 암 치료제 내성 암 치료제로 판단하는 단계를 더 포함하는 것인 스크리닝 방법.
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