KR102283527B1

KR102283527B1 - 곡류 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102283527B1
Application number: KR1020180170689A
Authority: KR
Inventors: 황영재; 변희국; 이정근; 김용재; 윤동규; 최유석; 최영리
Original assignee: 강일코스팜 주식회사
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2021-07-30
Also published as: KR20200081600A

Abstract

본 발명은 곡류 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명에 따른 조성물은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2로 발효한 곡류 발효 추출물을 이용하며, 상기 곡류 발효 추출물은 항산화, 주름개선, 미백 등 다양한 효과를 나타내어 기능성 화장품 또는 건강기능식품 소재로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

곡류 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising cereal fermented extract}

본 발명은 곡류 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 의학의 발달과 생활환경의 개선에 의해 인간의 수명이 크게 연장됨에 따라 노화에 대한 관심이 높아져 많은 노화 관련 연구가 이루어지고 있다. 그 중에서도 경제적, 사회적 여유가 생기게 되면서 외모에 대한 관심이 많아져 젊고 깨끗한 피부를 갖고 싶어 함에 따라 피부의 노화 현상을 지연 또는 방지할 수 있는 소재 개발에 많은 관심이 집중되고 있다.

노화로 인해 피부의 구성 성분인 표피, 진피 및 피하조직의 두께가 얇아지고 피부에 탄력을 주는 세포외 기질(Extracellular matrix, ECM) 성분이 변화하게 되는데, 그중 세포외 기질(ECM)의 70~80%를 차지하는 콜라겐은 나이가 들면서 그 생성이 급격하게 저하되어 피부가 탄력을 잃고 주름이 과도하게 형성되면서 노인성 피부로 변화되어 간다.

나이가 들면서 피부 결합조직 내의 콜라겐 함량이 줄어드는 것은 콜라겐 합성의 저하와 분해의 촉진에 의한 것이다. 따라서 콜라겐 생합성의 저하와 콜라겐 분해 촉진은 피부 주름 형성의 가장 큰 원인이라 할 수 있다. 콜라겐 생합성 과정은 전사 수준(Transcription level)과 해독 후 수준(Post-translation level)에 관여하는 많은 인자(Factor)들에 의해 조절을 받아 변화를 일으키며, 콜라겐 분해는 자외선 등에 의해 콜라겐을 분해하는 콜라게네이즈(Collagenase)와 같은 기질금속단백질 분해 효소들(Matrix metalloproteases, MMP)의 발현의 촉진으로 콜라겐 분해가 촉진되어 콜라겐 함량이 줄어든다. 아울러 외부 환경에 의해 콜라겐의 변형이 가속화되면서 피부는 주름이 많아지고 깊어지게 된다.

또, 세포 내에서 티로시네이즈에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거처 생성되어지는 멜라닌은 피부에 존재하여 자외선 등으로부터 신체를 보호하는 중요한 기능을 가지고 있다. 그러나 멜라닌이 과잉 생산됨으로써 기미, 주근깨 등을 형성하고, 피부노화를 촉진하며, 피부암 유발에 중요한 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 또한 과실류나 채소류등의 식품에서의 과잉 축적으로 인해 갈변화 현상을 일으키는 주요 원인으로 작용하기도 한다.

이에, 항산화, 주름개선 및 미백 효과를 갖는 기능성 화장품 소재 개발에 대한 관심이 높아졌으나, 아직까지 곡류를 첨가하고 특정 균주로 상온 발효한 곡류 발효 추출물의 기능성 화장품 소재에 대한 상용화는 부족한 실정이며, 곡류 발효 추출물을 이용한 기능성 화장품 소재 개발이 여전히 필요하다.

한국공개특허 제10-0864786호 (2008.10.15.등록)

상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 특정 균주로 발효한 곡류 발효 추출물을 이용한 기능성 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 특정 균주로 발효한 곡류 발효 추출물을 이용한 건강기능식품 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2로 발효한 곡류 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2로 발효한 곡류 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2로 발효한 곡류 발효 추출물을 이용하며, 상기 곡류 발효 추출물은 항산화, 주름개선, 미백 등 다양한 효과를 나타내어 기능성 화장품 또는 건강기능식품 소재로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 곡류 발효 추출물 제조공정을 도시한 것이고,
도 2는 본 발명에 따른 곡류 발효 추출물의 티로시네이즈 억제 효과를 나타낸 것이고,
도 3은 본 발명에 따른 곡류 발효 추출물의 DPPH 라디칼 소거 효과를 나타낸 것이고,
도 4 및 도 5는 각각 본 발명에 따른 곡류 발효 추출물의 콜라게네이즈 억제 효과 및 엘라스테이즈 억제 효과를 나타낸 것이고,
도 6 및 도 7은 각각 본 발명에 따른 곡류 발효 추출물의 총 폴리페놀 함량 분석 및 총 플라보노이드 함량 분석를 나타낸 것이고,
도 8은 본 발명에 따른 곡류 발효 추출물의 발효 시간별 pH 변화를 나타낸 것이고,
도 9 및 도 10은 각각 본 발명에 따른 곡류 발효 추출물 처리에 따른 멜라닌 함량 분석 및 세포성 티로시네이즈 활성 분석을 나타낸 것이고,
도 11 및 도 12는 각각 본 발명에 따른 곡류 발효 추출물 처리에 따른 멜라노마 세포 및 섬유아세포의 생존률을 나타낸 것이고,
도 13은 본 발명에 따른 곡류 발효 추출물 처리에 따른 티로시네이즈 및 TRP-1의 단백질 발현 수준 분석을 나타낸 것이고,
도 14는 본 발명에 따른 곡류 발효 추출물 처리에 따른 MMP-1 및 MMP-12의 단백질 발현 수준 분석을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자는 곡류를 이용한 기능성 화장품 소재 개발을 위해 연구노력한 결과, 팥과 같은 곡류에 상온 발효가 가능한 특정 균주인 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2로 발효한 곡류 발효 추출물이 탁월한 항산화, 미백 및 주름개선 효과를 나타내는 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 "추출물"은 추출 방법, 추출 용매, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 천연물의 성분을 뽑아냄으로써 얻어진 물질을 모두 포함하는 것이며, 또한 천연물의 성분을 뽑아내어 얻어진 물질을 추출 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질을 모두 포함하는 광범위한 개념이다.

본 발명에서 "화장료"는 피부 노화 등의 예방 또는 개선의 효과를 가지는 기능성 화장료를 포함할 수 있고, 상기 기능성 화장료는 화장품법에 정의된 바에 따라 특정 효능과 효과가 강조된 화장료로 피부의 주름 개선에 도움을 주거나 피부의 기능 약화로 인한 건조함을 방지하는 것 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다.

상기 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2은 기탁번호 KCTC 12795BP로 기탁된 기탁 균주일 수 있고, 상온 발효 균주이다.

상기 곡류 발효 추출물은 팥, 조, 수수 및 기장으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 곡류 발효 추출물일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 곡류 발효 추출물은 항산화, 보습, 미백, 주름개선 및 항노화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 기능성을 갖는다.

상기 곡류 발효 추출물은 곡류 물 추출물을 엔테로코쿠스파에시움 MSS2로 상온 발효하여 얻을 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 식품 의약품 안전청에 등록된 화장품 원료 리스트 및 ICID(국제화장품 원료집)에 등재되어 있는 성분 중에서 1종 이상을 더 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 유기 용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 방향제, 계면활성제, 유화제, 충전제, 금속이온 봉쇄제, 방부제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 염료 및 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 하나 이상 더 포함할 수 있다.

상기 비타민은 수용성 또는 유용성 비타민을 포함할 수 있고, 상기 수용성 비타민은 수용성 비타민으로서 화장품에 배합 가능한 것으로, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 보다 바람직하게는 콜라겐 합성이 도움을 주는 비타민 C를 포함할 수 있다. 또한, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체(아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 포함될 수 있고, 상기 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 겔, 크림, 로션, 밀크로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지 크림 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 상세하게는, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 선로션, 선크림, 메이크업 프라이머, 메이크업 베이스, 비비크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징 워터, 팩, 스틱상 제품, 밤(Balm) 타입 제품, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 단독 또는 중복으로 도포하여 사용하거나, 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복 도포하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

또한, 본 발명은 자연 건조한 곡류에 물을 첨가하고 100~130℃에서 추출하는 단계; 상기 추출된 추출물에 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2을 접종하고 상온 발효하는 단계; 및 상기 발효된 발효물을 원심분리 하여 상층액을 회수하고 필터로 여과하여 균체와 곡류 분말을 제거한 발효물을 제조하는 단계를 포함하는, 곡류 발효 추출물의 제조방법을 제공한다.

상기 추출 단계에서는 물 100 중량부에 대하여 곡류를 0.1 내지 10 중량부로 포함하여 추출하며, 바람직하게는 121℃에서 10~20분 동안 추출할 수 있다.

상기 발효 단계에서는 추출물에 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2을 접종하고 상온 발효를 수행하며, 바람직하게는 15~30℃에서 48~72시간 동안 발효할 수 있다.

상기 원심분리는 800~1200 rpm에서 10~20분 동안 수행하여 상층액을 회수할 수 있다.

상기 제조방법은 제조된 발효물을 -50℃에서 5~10 mmHg 조건 하에서 동결 건조하여 분말 형태로 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료 등으로 제조될 수 있고, 본 발명에 따른 곡류 발효 추출물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 제조될 수 있다. 즉, 상기 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하고, 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한 없이 제조될 수 있다. 또한, 상기 건강기능식품 제조 시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있으며 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품은 일반 약품과는 달리 곡류를 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진 또는 피부 미백 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취될 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 조성물에서, 유효성분인 상기 곡류 발효 추출물의 혼합양은 그의 사용 목적, 예를 들어, 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품이 취할 수 있는 형태에는 제한이 없으며, 통상적인 의미의 식품을 모두 포함할 수 있고, 기능성 식품 등 당업계에 알려진 용어와 혼용 가능하다. 아울러 본 발명에 따른 천연 추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 당업자의 선택에 따라 식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조성분과 공지의 첨가제를 혼합하여 제조할 수 있다. 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 본 발명에 따른 천연 추출물을 주성분으로 하여 제조한 즙, 차, 젤리 및 주스 등에 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 동물을 위한 사료로 이용되는 식품도 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 팥을 이용한 발효 추출물 제조

곡류 팥(V. angularis)을 상온에서 자연 건조하여 얻은 팥 건조물 0.5 g과 증류수(Distilled water) 50 ml을 잘 섞이게 혼합하여 혼합물을 제조하였다. 상기 혼합물 중에서 유효성분을 추출하기 위해 121℃에서 15분 정도 추출을 진행하였다. 상기 추출된 추출물에 엔테로코쿠스 파에시옴(Enterococcus Faecium) MSS2 균주(기탁번호: KCTC 12795BP) 1 X 10⁶ CFU/ml를 접종하고 발효가 잘 일어나도록 진탕 배양기를 이용하여 30℃에서 50 rpm 조건으로 72시간 동안 발효시켰다. 발효 과정을 거쳐서 수확한 팥(V. angularis) 액상 발효물은 원심 분리기를 이용하여 1000 rpm에서 10 ~ 20 분간 원심 분리시켜 상층액을 회수하였다. 상기 회수한 팥(V. angularis) 발효물은 필터 페이퍼(0.072 mm)를 이용하여 균체 및 팥(V. angularis) 분말을 제거하고, 얻어진 발효물은 -50℃, 5 ~ 10 mmHg 조건에서 동결 건조하여 분말 형태로 제조하였다(도 1의 공정도 참조).

상기 제조한 분말 형태의 팥(V. angularis) 추출물 분말 10 mg/증류수 1 ml을 혼합하고 충분히 볼텍싱(vortexing) 하여 이하 실험의 화장품 원료로 사용하였다.

<실험예 1> 팥을 이용한 발효 추출물의 기능성 분석

1. 티로시네이즈 억제 효과

본 발명의 팔 발효 추출물이 티로시네이즈에 미치는 효과를 분석하기 위하여, 팔 발효 추출물 10 μl, 티로시네이즈(110 units/ml) 20 μl, 그리고 1.5 mM L-DOPA 용액, 50 mM 인산나트륨 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 6.5) 및 증류수가 10:10:1의 비율로 함유된 혼합물 170 μl을 각각 첨가하여 혼합하였다. 이후, 혼합물을 37℃에서 10분간 반응시킨 다음 Tecan F-200 멀티 웰 플레이트 판독기(Mannedorf, Zurich, Swit-Zerland)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2와 같이, 팥을 이용한 발효 추출물이 처리 후 48시간까지 농도의존적으로 티로시네이즈 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

2. DPPH 라디칼 소거 효과

팔 발효 추출물이 DPPH 라디칼 소거 활성에 미치는 효과를 분석하기 위하여, DPPH 9 mg을 메탄올 30 ml에 녹인 후, 팥 발효 추출물 40 μl, DPPH 용액 40 μl, MeOH 120 μl를 혼합하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 이후, 멀티 웰 플레이트 판독기(Tecan F-200)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 3과 같이, 팥을 이용한 발효 추출물이 처리 후 48시간까지 농도의존적으로 DPPH 라디칼 소거 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

3. 콜라게네이즈 억제 효과

팔 발효 추출물이 콜라게네이즈에 미치는 효과를 분석하기 위하여, collagenase activity colorimetric assay kit(K792, Biovision, USA)를 사용하였으며, 제조사에서 제공된 프로토콜을 참조하여 실험을 수행하였다. 멀티 웰 플레이트 판독기(Tecan F-200)를 사용하여 345 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 4와 같이, 팥을 이용한 발효 추출물이 처리 후 48시간까지 농도의존적으로 콜라게네이즈 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

4. 엘라스테이즈 억제 효과

팥 발효 추출물이 엘라스테이즈에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 96 웰 플레이트에 0.1 M Tris-HCl buffer 80 μl, 팥 발효 추출물 40 μl, 3 mM N-succinyl-(Ala)₃-P-nitroanilide 30 μl, 0.2 unit Elastase 20 μl를 첨가한 후, 30℃에서 20분 동안 반응시키고, 멀티 웰 플레이트 판독기(Tecan F-200)를 사용하여 410 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 5와 같이, 팥을 이용한 발효 추출물이 처리 후 48시간까지 농도의존적으로 엘라스테이즈 억제 효과를 나타내는 것을 확인하였다.

5. 총 폴리페놀 함량 분석

팥 발효 추출물이 총 폴리페놀 함량에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 96 웰 플레이트에 팥 발효 추출물 10 μl 및 0.2 N Folin-Ciocalteu reagent 50 μl를 첨가하고 혼합한 다음 5분 동안 반응시켰다. 이후, 7.5% 탄산나트륨 용액 40 μl를 첨가하고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, 멀티 웰 플레이트 판독기(Tecan F-200)를 사용하여 730 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 0 - 90 μg/ml 범위의 갈산(Galic acid) 표준 용액을 사용하여 설정하였다.

그 결과, 도 6과 같이, 팥을 이용한 발효 추출물은 처리 후 48시간까지 농도의존적으로 총 폴리페놀의 함량이 증가되는 것을 확인하였다.

6. 총 플라보노이드 함량 분석

팥 발효 추출물이 총 플라보노이드 함량에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 96 웰 플레이트에 팥 발효 추출물 50 μl 및 2% AlCl₃ 시약 50 μl를 첨가하고 혼합한 다음 암실에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, 멀티 웰 플레이트 판독기(Tecan F-200)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 0 - 90 μg/ml 범위의 케르세틴(Quercetin) 표준 용액을 사용하여 설정하였다.

그 결과, 도 7과 같이, 팥을 이용한 발효 추출물은 처리 후 48시간까지 농도의존적으로 총 플라보노이드의 함량이 증가되는 것을 확인하였다.

7. 발효 시간별 팥 발효 추출물의 pH 변화 분석

팥 발효 추출물의 pH 변화를 분석하기 위하여, filter paper(0.072 mm)를 이용하여 균체 및 팥 분말을 제거하고 pH meter기를 사용하여 pH를 측정하였다.

그 결과, 도 8과 같이, 팥을 이용한 발효 추출물은 처리 후 72시간까지 농도의존적으로 pH가 감소하는 것을 확인하였다.

8. 멜라닌 함량 분석

팥 발효 추출물이 멜라닌 함량에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 24 웰 플레이트에 B16F10 흑색종 세포(1 X 10⁵ cell/ml)를 접종한 후 100 μM α-MSH의 존재 또는 부재 하에 배양을 수행하였다. 이후, 세포를 다양한 농도의 팥 발효 추출물(10, 50, 100 μg/ml)과 72시간 동안 배양하였다. 세포를 회수하고 PBS로 2회 세척한 다음 100 μl의 1 N NaOH를 이용하여 세포를 용해시켰다. 용해시킨 세포는 80℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 멀티 웰 플레이트 판독기(Tecan F-200)를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 9와 같이, 팥 발효 추출물 처리군은 대조군 대비 농도 의존적으로 멜라닌 함량을 감소시키는 것을 확인하였다.

9. 세포성 티로시네이즈 활성 분석

팥 발효 추출물이 세포성 티로시네이즈 활성에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 24 웰 플레이트에 B16F10 흑색종 세포(1 X 10⁵ cell/ml)를 접종한 후 100 μM α-MSH의 존재 또는 부재 하에 배양을 수하였다. 이후, 세포를 다양한 농도의 팥 발효 추출물(10, 50, 100 μg/ml)과 72시간 동안 배양하였다. 이후, 상층액을 제거하고 1% Triton X-100(Sigma-Aldrich, MO, USA) 및 0.1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)가 함유된 50 mM 인산나트륨 버퍼(pH 6.5) 100 μl 분주하여 세포를 회수하였다. 이후, -80℃에서 30분간 냉동 후 해동을 3회 반복하였다, 세포 추출물을 4℃, 12,000 rpm에서 30분 동안 원심분리 하여 상등액을 획득하였으며, 단백질 농도는 BCA Protein Assay kit를 사용하여 Bradford 법으로 측정하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰에 0.1 μM PBS(pH 6.8)에 용해한 50 μg/100 μl의 단백질과 1.5 mM L-DOPA 100 μl로 구성된 반응 혼합물을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 멀티 웰 플레이트 판독기(Tecan F-200)를 사용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 10과 같이, 팥 발효 추출물 처리군은 대조군 대비 농도 의존적으로 세포성 티로시네이즈 활성을 감소시키는 것을 확인하였다.

10. 흑색종 세포의 생존률 분석

팥 발효 추출물이 흑색종 세포 생존률에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 96 웰 플레이트에 B16F10 흑색종 세포를 1 X 10⁵ cell/ml의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 다양한 농도의 팥 발효 추출물(10, 50, 100 μg/ml)과 24시간 동안 배양한 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고 100 ㎕의 MTT 용액(5 mg/ml)을 각 웰에 첨가하여 3시간 동안 반응시켰다. 이후, MTT용액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 100 ㎕를 첨가한 후, 멀티 웰 플레이트 판독기(Tecan F-200)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 11과 같이, 팥 발효 추출물 처리군은 대조군 대비 농도 의존적으로 흑색종 세포의 생존률을 감소시키는 것을 확인하였다.

11. 섬유아세포의 생존률 분석

팥 발효 추출물이 섬유아세포 생존률에 미치는 영향을 분석하기 위하여, 96 웰 플레이트에 CCD-986SK 섬유아세포를 1 X 10⁵ cell/ml의 농도로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 다양한 농도의 팥 발효 추출물(10, 50, 100 μg/ml)과 24시간 동안 배양한 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고 100 ㎕의 MTT 용액(5 mg/ml)을 각 웰에 첨가하여 3시간 동안 반응시켰다. 이후, MTT용액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 100 ㎕를 첨가한 후, 멀티 웰 플레이트 판독기(Tecan F-200)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 11과 같이, 팥 발효 추출물 처리군은 대조군 대비 농도 의존적으로 섬유아세포의 생존률을 감소시키는 것을 확인하였다.

12. 티로시네이즈 및 TRP-1의 단백질 발현 수준 분석

팥 발효 추출물이 티로시네이즈 및 TRP-1 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여, B16F10 흑색종 세포에 팥 발효 추출물(10, 25, 50, 100 μg/ml) 및 α-MSH(1 μM)를 처리하고 72시간 동안 반응시킨 뒤 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 RIPA buffer(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM Nacl, 1% sodium deoxycholate, 1 mM Na₂EDTA, 1mM EGTA, 1 % NP-40, 2.5 mM Sodium pyrophophate, 1mM β-glycerophosphate, 1M Na₃VO₄, 1ug/ml leupeptin)를 첨가하고 4°C에서 20분간 반응시켰다. 이후, 세포 추출물을 4°C, 14,000 g에서 20분 동안 원심분리 하여 상등액을 획득하였으며, 단백질 농도는 BCA Protein Assay kit를 표준으로 사용하여 Bradford 법으로 측정하였다. 단백질은 10% SDS-polyacylamaid gel 전기영동으로 분리한 후, PVDF transfer membrane(Millipore, Billerica, Ma, USA)으로 이동시켰다. 이후, membrane을 5% Skim milk[TBS-T buffer(20 mM Tris-HCl pH 7.6, 136 mM NaCl, 0.1 % Tween-20) 이용]와 실온에서 90분 동안 반응시켰다. 이후, membrane을 TBS-T buffer로 3회 세척한 다음 1차 항체(tyrosinase, TRP-1: Santa Cruz Biotechnology, CA)(1:1000 희석. 1% Skim milk 이용)와 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후, membrane을 TBS-T buffer로 3회 세척한 후, 2차 항체(1:1000 희석)와 실온에서 90분 동안 반응시켰다. 이후, membrane을 TBS-T buffer로 4회 세척한 후, ECL-plus western blotting substrate(Thermo Scientific Inc., Bremen, Germany)로 전개시켰으며, ChemiDoc MP imager(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하여 블롯 밴드를 시각화 하였다.

그 결과, 도 13과 같이, 팥 발효 추출물 처리군은 대조군 대비 농도 의존적으로 티로시네이즈 및 TRP-1의 발현 수준을 감소시키는 것을 확인하였다.

13. MMP-1 및 MMP-12의 단백질 발현 수준 분석

팥 발효 추출물이 MMP-1 및 MMP-12 발현에 미치는 영향을 분석하기 위하여, CCD-986SK 섬유아세포에 팥 발효 추출물(10, 50, 100 μg/ml) 및 자외선을 처리하고 72시간 동안 반응시킨 뒤 세포를 회수하였다. 회수된 세포에 RIPA buffer(20 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM Nacl, 1% sodium deoxycholate, 1 mM Na₂EDTA, 1mM EGTA, 1 % NP-40, 2.5 mM Sodium pyrophophate, 1mM β-glycerophosphate, 1M Na₃VO₄, 1ug/ml leupeptin)를 첨가하고 4°C에서 20분간 반응시켰다. 이후, 세포 추출물을 4°C, 14,000 g에서 20분 동안 원심분리 하여 상등액을 획득하였으며, 단백질 농도는 BCA Protein Assay kit를 표준으로 사용하여 Bradford 법으로 측정하였다. 단백질은 10% SDS-polyacylamaid gel 전기영동으로 분리한 후, PVDF transfer membrane(Millipore, Billerica, Ma, USA)으로 이동시켰다. 이후, membrane을 5% Skim milk[TBS-T buffer(20 mM Tris-HCl pH 7.6, 136 mM NaCl, 0.1 % Tween-20) 이용]와 실온에서 90분 동안 반응시켰다. 이후, membrane을 TBS-T buffer로 3회 세척한 다음 1차 항체(MMP-1, MMP-12: Santa Cruz Biotechnology, CA)(1:1000 희석. 1% Skim milk 이용)와 4℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후, membrane을 TBS-T buffer로 3회 세척한 후, 2차 항체(1:1000 희석)와 실온에서 90분 동안 반응시켰다. 이후, membrane을 TBS-T buffer로 4회 세척한 후, ECL-plus western blotting substrate(Thermo Scientific Inc., Bremen, Germany)로 전개시켰으며, ChemiDoc MP imager(Bio-Rad, CA, USA)를 사용하여 블롯 밴드를 시각화 하였다.

그 결과, 도 14와 같이, 팥 발효 추출물 처리군은 대조군 대비 농도 의존적으로 MMP-1 및 MMP-12의 발현 수준을 감소시키는 것을 확인하였다.

하기에 본 발명에 따른 팥 발효 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

<제제예 1> 로션의 제조

프로필렌글리콜 3.0 중량부, 카르복시폴리머 0.1 중량부, 방부제 미량과 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 폴리솔베이트60 1.0 중량부, 솔비탄 세스퀴올레이트 0.5 중량부, 유동 파라핀 10.0 중량부, 솔비탄 스테아레이트 1.0 중량부, 친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5 중량부, 스테아린산 1.5 중량부, 글리세릴스테아레이트/PEG-400 스테아레이트 1.0 중량부, 트리에탄올아민 0.2 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 열 냉각한 뒤 향료 미량을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 색소 미량을 투입하고, 35℃에서 실시예 1에 따른 팥 발효 추출물을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

<제제예 2> 크림의 제조

카르복시폴리머 0.3 중량부, 부틸렌글리콜 5.0 중량부, 글리세린 3.0 중량부 및 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 스테아린산 2.0 중량부, 세틸알콜 2.0 중량부, 글리세릴모노스테아레이트 2.0 중량부, 폴리옥시에틸렌솔비탄모노스테아레이트 0.5 중량부, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량부, 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 1.0 중량부, 왁스 1.0 중량부, 유동파라핀 4.0 중량부, 스쿠알란 4.0 중량부, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 트리에탄올아민 0.5 중량부를 투입하여 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각한 뒤 실시예 1에 따른 팥 발효 추출물을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

<제제예 3> 워시폼의 제조

TEA-코코일 글루타메이트 30.0 중량부, 디소듐 라우레스 설포숙시네이트글리세린 10.0 중량부, 글리세린 10.0 중량부, 코카마이드 DEA 2.0 중량부, PEG-120 메칠글루코오스 디올리에이트 1.0 중량부, 메칠글루세스-20 0.5 중량부, PEG-150 펜타에리트리틸 테트라 스테아레이트 0.5 중량부, 테트라소듐 EDTA 0.05 중량부 및 방부제 미량을 순차적으로 제조부에 투입하고 60 내지 65℃로 가열한 후 15분 동안 교반하였다. 교반이 끝나면 정제수의 일부를 투입하여 30분 동안 교분한 후, 다시 정제수의 일부를 천천히 투입하고 30분 동안 교반한 후 35℃까지 냉각하고, 실시예 1에 따른 팥 발효 추출물과 향료를 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

<제제예 4> 건강식품 제조

실시예 1에 따른 팥 발효 추출물 1 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

<제제예 5> 건강음료 제조

실시예 1에 따른 팥 발효 추출물 1 ㎎, 구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 정제수를 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

엔테로코쿠스 파에시움 MSS2로 발효한 곡류 발효 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 보습, 미백 및 주름개선용 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 엔테로코쿠스 파에시움 MSS2은 기탁번호 KCTC 12795BP로 기탁된 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 곡류 발효 추출물은 팥, 조, 수수 및 기장으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 곡류 발효 추출물인 것을 특징으로 화장료 조성물.
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청구항 1에 있어서, 상기 곡류 발효 추출물은 곡류 물 추출물을 엔테로코쿠스파에시움 MSS2로 상온 발효한 것을 특징으로 화장료 조성물.
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