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KR102277907B1 - 증가된 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 미생물 및 이를 이용한 1,4-부탄디올 생산방법 - Google Patents

증가된 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 미생물 및 이를 이용한 1,4-부탄디올 생산방법 Download PDF

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KR102277907B1
KR102277907B1 KR1020167026993A KR20167026993A KR102277907B1 KR 102277907 B1 KR102277907 B1 KR 102277907B1 KR 1020167026993 A KR1020167026993 A KR 1020167026993A KR 20167026993 A KR20167026993 A KR 20167026993A KR 102277907 B1 KR102277907 B1 KR 102277907B1
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남태욱
조광명
조화영
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삼성전자주식회사
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Abstract

증가된 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 4-히드록시부티레이트 또는 1,4-부탄디올을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

증가된 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 미생물 및 이를 이용한 1,4-부탄디올 생산방법{MICROORGANISM HAVING INCREASED Α-KETOGLUTARATE DECARBOXYLASE ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING 1,4-BUTANEDIOL USING SAME}
증가된 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성을 갖는 미생물 및 이를 이용하여 1,4-부탄디올을 생산하는 방법에 관한 것이다.
1,4-부탄디올(1,4-BDO)은 용매로서 플라스틱, 섬유 및 폴리우레탄 등의 제조에 사용될 수 있다. 또한, 1,4-BDO는 테트라히드로퓨란(THF)을 경유하여 스판덱스 섬유의 원료인 폴리테트라메틸렌 에테르 글리콜(PTMEG)로 변환될 수 있다.
1,4-BDO는 현재 아세틸렌과 포르말린을 원료로 하는 Reppe 공정 또는 부탄(butane)을 원료로 하는 Davy Mckee 공정에 의해 제조된다. 그러나, 화학적인 방법을 통한 1,4-BDO 생산은 가스 및 석유 관련 원료를 사용하므로, 생산비 절감 및 환경 보호 측면에서 대안적인 생산방법이 요구되고 있다.
따라서, 미생물을 이용하여 1,4-BDO를 효율적으로 제조하는 방법이 요구된다.
일 양상은 4HB 또는 1,4-BDO 생산능이 향상된 미생물을 제공한다.
다른 양상은 상기 미생물을 이용하여 4HB 또는 1,4-BDO를 효율적으로 생산하는 방법을 제공한다.
일 양상은 알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 활성이 증가되어 있는 미생물을 제공한다. 본 명세서에서 "알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 활성"은 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제(EC 4.1.1.71)에 의해 촉매되는 반응과 동일한 반응 활성을 의미할 수 있다.
상기 미생물은 유전적으로 조작되지 않은 상태에서는 알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 대사 경로가 결여되어 있는 미생물일 수 있다. 예를 들면, 상기 미생물은 원핵생물, 진핵생물 세포 또는 유기체, 효모 및 진균과 같은 진핵 미생물 또는 모든 종의 세균, 고세균 및 진정세균일 수 있다. 상기 미생물은 에세리키아(Escherichia) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 유래의 미생물일 수 있다. 상기 에세리카 속 미생물은 에세리키아 콜라이(E. coli), 에세리키아 알베르티(E. albertii), 에세리키아 블라태(E. blattae), 에세리키아 퍼구소니(E. fergusonii), 에세리키아 허르만니(E. hermannii), 또는 에세리키아 불너리스(E. vulneris)일 수 있다. 상기 미생물은 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다.
상기 알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 활성은 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제(α-ketoglutarate decarboxylase)의 발현 증가 및/또는 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분(E1 component)의 발현 증가에 의해 증가된 것일 수 있다. 상기 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제는 EC. 4.1.1.71로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분은 유전적으로 조작되지 않은 미생물에서 트란스숙시닐라제 성분(transsuccinylase component, E2) 및 디히드로리포일 데히드로게나제 성분(dihydrolipoyl dehydrogenase component, E3)과 함께 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 복합체(α-ketoglutarate dehydrogenase complex: α-KGDH complex)를 구성하는 서브유닛으로 존재할 수 있다. 상기 α-KGDH 복합체는 EC.1.2.4.2로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 α-KGDH 복합체는 알파-케토글루타레이트를 숙시닐 CoA로 전환하는 반응을 촉매하는 활성을 가질 수 있다. 상기 α-KGDH 복합체는 또한, 옥소글루타레이트 데히드로게나제 복합체(oxoglutarate dehydrogenase complex)로 명명될 수 있다.
상기 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분은 에세리키아 속 또는 코리네박테리움 속 유래일 수 있다. 상기 에세리키아 속 유래 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분은 대장균(Escherichia coli) 유래일 수 있다. 상기 대장균 유래 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 상기 코리네박테리움 속 유래 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) 유래일 수 있다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분은 서열번호 3의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
상기 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분의 발현 증가는, 상기 E1 성분을 코딩하는 내재적(endogenous) 폴리뉴클레오티드의 발현 증가에 의한 것일 수 있다. 상기 내재적 폴리뉴클레오티드의 발현 증가는 발현 조절 영역(regulatory region)의 변이에 의한 것일 수 있다. 또한, 상기 E1 성분의 발현 증가는, 상기 E1 성분을 코딩하는 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오티드의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 에세리키아 속 또는 코리네박테리움 속 유래일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있다. 상기 대장균 유래 폴리뉴클레오티드는 sucA일 수 있다. 상기 sucA는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 폴리뉴클레오티드는 kgd(NCgl1084)일 수 있다. 상기 kgd는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드의 도입은 발현 카세트(expression cassette) 형태로의 도입 또는 상기 폴리뉴클레오티드 자체의 도입일 수 있다. 상기 발현 카세트는 상기 폴리뉴클레오티드가 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 상기 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 프로모터, 전사 종결 신호, 리보좀 결합 부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 상기 도입은 형질전환일 수 있다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포의 염색체 내 및/또는 상기 염색체 외에 위치할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA를 포함한다.
또한, 상기 미생물은 알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 활성이 증가되어 있고 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 미생물은 유전적으로 조작되지 않은 상태에서는 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 대사 경로가 결여되어 있는 미생물일 수 있다. 예를 들면, 상기 미생물은 에세리키아 속 또는 코리네박테리움 속 유래의 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 상기 알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 활성 및 그의 증가에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성은, 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제(4-hydroxybutyrate dehydrogenase: 4HBd)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의한 것일 수 있다. 상기 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제는 전자 수용체로서 NAD+ 또는 NADP+를 사용하는 옥시도리덕타제 (EC.1.1.1), 예를 들면, 케톤을 히드록실로 전환 또는 알데히드를 알코올로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 도입된 것일 수 있다. 상기 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 유래의 것일 수 있다. 상기 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다.
또한, 상기 미생물은 알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 활성이 증가되어 있고, 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성 및 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성을 갖는 것일 수 있다. 상기 미생물은 유전적으로 조작되지 않은 상태에서는 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 대사 경로 및/또는 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 대사 경로가 결여되어 있는 미생물일 수 있다. 예를 들면, 상기 미생물은 에세리키아 속 또는 코리네박테리움 속 유래의 미생물일 수 있다. 상기 미생물은 대장균 또는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있다. 상기 알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 활성 및 그의 증가와, 상기 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성은, 4-히드록시부티레이트의 4-히드록시부티릴-CoA로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드의 발현 및/또는 4-히드록시부티릴-CoA의 1,4-부탄디올로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드의 발현에 의한 것일 수 있다.
상기 4-히드록시부티레이트의 4-히드록시부티릴-CoA로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드는 CoA-트란스퍼라제 (EC.2.8.3.a)로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 4-히드록시부티레이트의 4-히드록시부티릴-CoA로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드는 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트란스퍼라아제(4-hydroxybutyryl CoA:acetyl-CoA transferase: Cat2)일 수 있다. 상기 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트란스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 도입된 것일 수 있다. 상기 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트랜스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 포르피로모나스 긴기발리스 유래의 것일 수 있다. 상기 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트란스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티는 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 것일 수 있다. 상기 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트란스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 4-히드록시부티릴-CoA의 1,4-부탄디올로의 전환을 촉매하는 폴리펩티드는 알데히드 데히드로게나제 및 알코올 데히드로게나제일 수 있다. 상기 알데히드 데히드로게나제 및 알코올 데히드로게나제는 2단계로 아실-CoA를 알코올로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 알데히드 데히드로게나제 및 알코올 데히드로게나제는 4-히드록시부티릴-CoA로부터 4-히드록시부티르알데히드를 거쳐 1,4-BDO로 전환시킬 수 있다. 상기 알데히드 데히드로게나제는 예를 들면, 부티르알데히드 데히드로게나제(butyraldehyde dehydrogenase: Bld)를 포함한다. 상기 부티르알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰(Clostridium saccharoperbutylacetonicum)에서 유래한 것일 수 있다. 상기 부티르알데히드 데히드로게나제는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 부티르알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 유래의 것일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 12의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 미생물은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성, 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 활성, 아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 활성, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 활성, 호기성 호흡 제어를 조절하는 활성, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 용어 “감소”는 조작되지 않은 미생물에 비하여 조작된 상기 미생물에서의 활성을 상대적으로 나타낸 것일 수 있다. 상기 활성은 적절한 대조군 종에 비하여, 상기 활성이 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85%이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 100% 감소된 것일 수 있다.
상기 미생물은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드, 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 폴리펩티드, 아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드, 호기성 호흡 제어를 조절하는 인자를 코딩하는 폴리펩티드, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드, 또는 그 조합의 발현이 제거되거나 감소된 것일 수 있다. 상기 미생물은 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 피루베이트로부터 포르메이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 호기성 호흡 제어를 조절하는 인자를 코딩하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 조합이 불활성화되거나 감쇄된 것일 수 있다.
피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 EC.1.1.1.27 또는 EC.1.1.1.28으로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드는 대장균 유래의 것일 수 있다. 상기 폴리펩티드는 대장균 W 염색체 (Escherichia coli W chromosome) 유래의 것일 수 있다. 상기 피루베이트로부터 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 12753486의 Gene ID 를 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 락테이트 데히드로게나제(NADH-linked lactate dehydrogenase)를 코딩하는 대장균 ldhA일 수 있다. 상기 ldhA유전자는 서열번호 13의 아미노산 서열 및 서열번호 14의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
피루베이트를 포르메이트로 전환하는 폴리펩티드는 피루베이트를 포르메이트로 가역적으로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 피루베이트 + CoA ↔ 포르메이트 + 아세틸 CoA 반응을 촉매하는 것일 수 있다. 상기 효소는 대장균 피루베이트 포르메이트 리아제(pyruvate formate lyase: Pfl)일 수 있다. 상기 Pfl은 EC.2.3.1.54로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 12752499의 Gene ID를 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 포르메이트 리아제를 코딩하는 대장균 pflB일 수 있다. 상기 pflB유전자는 서열번호 15의 아미노산 서열 및 서열번호 16의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드는 알코올 데히드로게나제(alcohol dehydrogenase: Adh)일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제는 NADH의 NAD+로의 산화와 함께 아세틸 CoA를 에탄올로 가역적으로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 알코올 데히드로게나제는 EC.1.1.1.1로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 12753141의 Gene ID 를 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 adhE일 수 있다. 상기 adhE유전자는 서열번호 17의 아미노산 서열 및 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드는 NAD+의 NADH로의 환원을 이용하여 옥살로아세테이트를 말레이트로의 전환을 촉매하는 효소일 수 있다. 상기 효소는 말레이트 데히드로게나제(malate dehydrogenase: Mdh)일 수 있다. 상기 말레이트 데히드로게나제는 EC 1.1.1.37로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 12697256의 Gene ID 를 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 NADH-연결된 말레이트 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 mdh일 수 있다. 상기 mdh유전자는 서열번호 19의 아미노산 서열 및 서열번호20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
호기성 호흡 제어를 조절하는 인자의 폴리펩티드는 ArcA일 수 있다. 상기 ArcA는 DNA-결합 반응 조절자(DNA-binding response regulator)일 수 있다. 상기 ArcA는 2인자 시스템(two component system)의 DNA-결합 반응 조절자일 수 있다. 상기ArcA는 2인자 (ArcB-ArcA) 신호-전달 체계 집단에 속하고, 동족 감각 키나아제 (sensory kinase) ArcB와 공조하여 다양한 오페론의 발현을 부정적으로 또는 긍정적으로 제어하는 전면적인 조절 시스템(global regulation system)을 형성할 수 있다. 상기 ArcA는 미세호기성 조건 하에서 작용하여 낮은 산소 수준에 민감한 중심 대사 효소들의 활성을 허용하는 유전자 산물의 발현을 유도하는 것일 수 있다. 미세호기성 하에서 arcA/arcB의 결실은 ldh, icd, gltA, mdh, 및 gdh 유전자의 비 활성을 증가시킬 수 있다. 상기 arcA유전자는 서열번호 21의 아미노산 서열 및 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드는 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제(succinate semialdehyde dehydrogenase: Ssadh)일 수 있다. 상기 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제는 NAD+ 또는 NADP+ 의 NADH 또는 NADPH로의 환원과 함께 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 효소일 수 있다. 상기 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제는 EC.1.2.1.24 또는 EC.1.2.1.16로 분류되는 효소일 수 있다. 상기 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 12695413 또는 12696616의 Gene ID를 갖는 것일 수 있다. 상기 유전자는 각각 NAD-연결된 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 sad 및 NADP-연결된 숙시네이트 세미알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 대장균 gabD일 수 있다. 상기 sad 유전자는 서열번호 23의 아미노산 서열 및 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 gabD 유전자는 서열번호 25의 아미노산 서열 및 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 미생물은 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 변이체, NADH 둔감성 시트레이트 신타제 변이체, 또는 그 조합을 발현하는 것일 수 있다.
외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛은 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia) 유래일 수 있다. 상기 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛은 LpdA일 수 있다. 클럽시엘라 뉴모니아 유래의 LpdA는 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 상기 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 발현은 외래 유전자의 도입에 의한 것일 수 있다. 상기 외래 유전자는 클렙시엘라 뉴모니아 유래의 lpdA이고 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일수 있다. 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 변이체는 서열번호 27에서 354번째 Glu가 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 상기 다른 아미노산은 Lys일 수 있다. 상기 미생물은 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 변이체는 서열번호 29의 아미노산 서열 및 서열번호 30의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
NADH 둔감성 시트레이트 신타제(NADH insensitive citrate synthase)는 GltA일 수 있다. 상기 GltA는 서열번호 31의 아미노산 서열 및 서열번호 32의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다. NADH 둔감성 시트레이트 신타제 변이체는 서열번호 31에서 164번째 Arg이 다른 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 상기 다른 아미노산은 Leu일 수 있다. 상기 미생물은 NADH 둔감성 시트레이트 신타제 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 시트레이트 신타제 변이체는 서열번호 33의 아미노산 서열 및 서열번호 34의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 미생물은 알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 활성이 증가되어 있고, 상기 활성 증가는 알파-케토글루타레이트 E1 성분의 발현 증가에 의한 것이고; 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성을 갖고; 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성, 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 활성, 아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 활성, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 활성, 호기성 호흡 제어를 조절하는 활성, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 활성 또는 그 조합이 제거 또는 감소되어 있고; 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛, NADH 둔감성 시트레이트 신타제, 또는 그 조합을 발현하는 것일 수 있다.
상기 미생물은 알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 활성이 증가되어 있고, 상기 활성 증가는 알파-케토글루타레이트 E1 성분의 발현 증가에 의한 것이고; 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성 및 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성을 갖고; 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성, 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 활성, 아세틸-CoA를 에탄올로 전환하는 활성, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 활성, 호기성 호흡 제어를 조절하는 활성, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 활성 또는 그 조합이 제거 또는 감소되어 있고; 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛, NADH 둔감성 시트레이트 신타제, 또는 그 조합을 발현하는 것일 수 있다.
상기 각 활성의 증가, 도입, 제거, 또는 감소를 위해 도입, 불활성화, 또는 감쇄되는 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같다.
다른 양상은 상기 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양물로부터 4-히드록시부티레이트 또는 1,4-부탄디올을 회수하는 단계;를 포함하는, 4-히드록시부티레이트 또는 1,4-부탄디올을 생산하는 방법을 제공한다.
상기 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 배양은 발효일 수 있다. 상기 발효는 유가 발효(fed-batch fermentation) 및 회분 분리(batch separation), 유가 발효 및 연속 분리, 또는 연속 발효 및 연속 분리일 수 있다.
상기 미생물의 배양은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미생물에 따라 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 상기 배양의 방법은 회분식, 연속식, 및 유가식 배양으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양을 포함할 수 있다.
상기 배양에 사용되는 배지는 특정한 미생물의 요구조건을 만족시킬 수 있는 배지일 수 있다. 상기 배지는 탄소원, 질소원, 미량원소 성분, 또는 이들의 조합을 포함하는 배지일 수 있다.
상기 탄소원은 탄수화물, 지방, 지방산, 알코올, 유기산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 탄수화물은 포도당, 자당, 유당, 과당, 말토오스, 전분, 셀룰로오스, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방은 대두유, 해바라기유, 파자마유, 코코넛유, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 지방산은 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 알코올은 글리세롤 또는 에탄올일 수 있다. 상기 유기산은 아세트산을 포함할 수 있다. 상기 질소원은 유기 질소원, 무기 질소원, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 유기 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액(CSL), 대두밀, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 무기 질소원은 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄, 질산암모늄, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 배지는 인, 금속염, 아미노산, 비타민, 전구체 또는 이들 조합을 포함할 수 있다. 상기 인의 공급원은 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 또는 이들에 상응하는 소듐-함유염을 포함할 수 있다. 상기 금속염은 황산마그네슘 또는 황산철일 수 있다.
상기 배지 또는 이를 이루는 개별 성분은 회분식, 연속식, 또는 유가식 배양으로 첨가될 수 있다.
상기 배양 방법에 있어서, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 상기 pH의 조정은 상기 배양물에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 또는 황산을 첨가하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 배양 방법은 기포 생성 억제를 포함할 수 있다. 상기 기포 생성 억제는 소포제의 사용을 통하여 이루어질 수 있다. 상기 소포제는 지방산 폴리글리콜 에스테르를 포함할 수 있다. 또한, 상기 미생물을 배양하는 단계는 실질적 혐기성 조건에서 배양하는 것일 수 있다. 상기 실질적 혐기성 조건은 배양 또는 생육 조건과 관련하여 사용될 때, 산소의 양이 액체 배지 중의 용존 산소 포화의 약 10% 미만임을 의미한다. 또한, 상기 실질적 혐기성 조건은 약 1% 미만의 산소 분위기에서 유지되는 액체 또는 고체 배지의 밀폐된 챔버에 의해 형성되는 조건을 의미할 수 있다.
상기 배양에 있어서, 배양물의 온도는 20 내지 45℃, 예를 들면, 22 내지 42℃, 또는 25 내지 40℃일 수 있다. 배양기간은 원하는 1,4-부탄디올의 생성량을 획득할 때까지 지속될 수 있다.
일 양상에 따른 미생물은 4HB 또는 1,4-BDO 생산능을 가질 수 있다.
다른 양상에 따른 4HB 또는 1,4-BDO를 생산하는 방법에 따르면, 4HB 또는 1,4-BDO를 효율적으로 생산할 수 있다.
도 1은 pTac15k 4hbd-kdc 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 2는 4종의 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제(kdc) 유전자 중 하나와 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제(4hbd) 유전자가 도입된 대장균, 및 kdc 유전자가 도입되지 않은 대장균을 배양하여 4HB의 생산량을 측정한 결과를 나타낸다.
도 3은 pTac99a bld-cat2 벡터의 개열지도를 나타낸다.
도 4는 4종의 kdc 유전자 중 하나와, 4hbd 유전자, cat2 유전자 및 bld 유전자가 도입된 대장균과, kdc 유전자가 도입되지 않은 대장균을 배양하여 1,4-BDO의 생산량을 측정한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성이 증가된, 4-히드록시부티레이트 생산능을 갖는 미생물의 제작
1.1. 부산물 (Lactate, Formate, Ethanol, Succinate) 생성 차단 및 혐기 조건에서 세포의 성장과 탄소원 소모를 위해 대사경로가 조작된 미생물의 제작
1.1.1. ldhA, pflB, adhE, mdh, arcA, sad, 및 gabD 유전자의 결실
대장균 W (ATCC 9637)에서 one-step inactivation 방법 [Warner et al., PNAS,6;97(12):6640-6645, 2000; lee, K.H. et al., Molecular systems biology 3, 149, 2007]을 이용하여, ldhA, pflB, adhE, mdh, arcA, sad, 및 gabD 유전자를 결실시켰다.
ldhA 유전자를 결실시키기 위해, pMloxC 벡터 [lee, K.H. et al., Molecular systems biology 3, 149, 2007]를 주형으로 하여 서열번호 35 및 36의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 수득된 DNA 절편을 람다-레드 리콤비나제(λ-red recombinase)가 발현되는 W 균주의 컴피턴트 세포(competent cell)에 일렉트로포레이션(electroporation)하여 ldhA 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였다. 상기 ldhA 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 37 및 38의 프라이머로 콜로니 PCR을 수행하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhA를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 39 및 40의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 pflB 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 pflB 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 41 및 42의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflB를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 43 및 44의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 adhE 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 adhE 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 45 및 46의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhE를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 47 및 48의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 mdh 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 mdh 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 49 및 50의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdh를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 51 및 52의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 arcA 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 arcA 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 53 및 54의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcA를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 55 및 56의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 sad 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 sad 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 57 및 58의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsad를 얻었다.
또한, 위와 동일한 방법으로 서열번호 59 및 60의 프라이머를 이용하여 수득된 PCR 절편을 도입하여 gabD 유전자가 결실된 돌연변이 균주를 제작하였고, 상기 gabD 유전자의 결실을 확인하기 위해 서열번호 61 및 62의 프라이머를 사용하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsadΔgabD를 얻었다.
1.1.2. 대장균 lpdA 유전자의 클렙시엘라 뉴모니아 유래 lpdA 유전자의 돌연변이로의 치환
대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsadΔgabD 균주에서 one-step inactivation 방법을 이용하여, 대장균의 lpdA 유전자를 클렙시엘라 뉴모니아 유래 lpdA 유전자의 돌연변이로 치환하였다.
클렙시엘라 뉴모니아 유래 lpdA 유전자의 돌연변이 K.lpdA(E354K)는, 서열번호 63 및 64의 프라이머를 이용한 위치-특이적 돌연변이 유발(site direct mutagenesis)을 통해 수득하였다. pSacHR06 벡터 [미국 특허공보 제2013-0164805호]를 주형으로 하여 서열번호 65 및 66의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 수득된 DNA 절편을 람다-레드 리콤비나제가 발현되는 W 균주의 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하여 lpdA 유전자를 sacB-Km cassette로 대체시켰다.
이후, 상기 수득한 클렙시엘라 뉴모니아 유래 lpdA 유전자의 돌연변이 K.lpdA(E354K)를 주형으로 하여 서열번호 67 및 68의 프라이머로 PCR을 수행하고 one-step inactivation 방법을 한번 더 수행하여, lpdA 유전자가 sacB-Km cassette로 대체된 부분을 K.lpdA(E354K)로 치환하였다. 치환된 유전자를 확인하기 위해 서열번호 69 및 70의 프라이머로 콜로니 PCR을 수행하였다. 그 결과, 대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsadΔgabD ΔlpdA::K.lpdA(E354K)를 얻었다.
1.1.3. 대장균 gltA 유전자의 돌연변이 도입
대장균 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsadΔgabD ΔlpdA::K.lpdA(E354K) 균주에 one-step inactivation 방법을 이용하여, 대장균 gltA 유전자의 돌연변이인 gltA(R164L)를 도입하였다.
대장균 gltA 유전자의 돌연변이 gltA(R164L)는, 서열번호 71 및 72의 프라이머를 이용한 위치-특이적 돌연변이 유발을 통해 수득하였다. pSacHR06 벡터를 주형으로 하여 서열번호 73 및 74의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 수득된 DNA 절편을 람다 레드 리콤비나제가 발현되는 W 균주의 컴피턴트 세포에 일렉트로포레이션하여 gltA 유전자를 sacB-Km cassette로 대체시켰다. 이후, 상기 수득한 대장균 gltA 유전자의 돌연변이 gltA(R164L)를 주형으로 하여 서열번호 75 및 76의 프라이머로 PCR을 수행하고 one-step inactivation 방법을 한번 더 수행하여 gltA 유전자가 sacB-Km cassette로 대체된 부분을 gltA(R164L)로 치환하였다. 치환된 유전자를 확인하기 위해 서열번호 77 및 78의 프라이머로 콜로니 PCR을 수행하였다. 상술한 방법으로 제작된 대장균 W 유래 돌연변이 균주의 유전형은 W ΔldhAΔpflBΔadhEΔmdhΔarcAΔsadΔgabD ΔlpdA::K.lpdA(E354K) gltA(R164L)이고, 이를 W026으로 명명하였다.
1.2. 4HBd 및 Kdc 발현 벡터의 제조
4-히드록시부티레이트 데히드로게나제(4hbd) 유전자와 함께 4종의 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제(kdc) 유전자를 각각 발현시키기 위한 벡터를 제조하였다. kdc 유전자는 미생물에 따라 sucA 또는 kgd 유전자로 명명된다.
포르피로모나스 긴기발리스(P. gingivalis) 유래 4hbd 유전자, 미코박테리움 보비스(M. bovis) 유래 sucA 유전자 및 유글레나 그라실리스(E. gracilis) 유래 sucA 유전자는 공지된 서열을 대장균 코돈에 맞게 변형하여 합성 제작하였다((주)코스모진텍, 한국). 상기 포르피로모나스 긴기발리스 유래 4hbd 유전자는 서열번호 79의 아미노산 서열 및 서열번호 80의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 상기 미코박테리움 보비스 유래 sucA 유전자는 서열번호 81의 아미노산 서열 및 서열번호 82의 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 상기 유글레나 그라실리스 유래 sucA 유전자는 서열번호 83의 아미노산 서열 및 서열번호 84의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
상기 얻어진 4hbd 유전자를 제한효소 SacI 및 XbaI을 사용하여 pTac15k [Qian, Z. -G. et al., Biotechnol. Bioeng. 104(4):651-662 (2009)]에 도입하여, pTac15k 4hbd 벡터를 제작하였다. pTac15k 4hbd 벡터를 제한효소 XbaI으로 자른 후 이를 벡터 DNA 조각으로 사용하고, 서열번호 85 및 86으로 PCR 증폭된 M. bovis 유래 sucA, 서열번호 87 및 88로 PCR 증폭된 E. gracilis 유래 sucA, 서열번호 89 및 90으로 PCR 증폭된 대장균 유래 sucA, 및 서열번호 91 및 92로 PCR 증폭된 C. glutamicum 유래 kgd를 각각 삽입 DNA 조각으로 사용하여 InFusion Cloning Kit (Clontech Laboratories, Inc., USA)를 통해 연결함으로써 4종의 pTac15k 4hbd-kdc 벡터, 즉, pTac15k 4hbd-MbosucA, pTac15k 4hbd-EglsucA, pTac15k 4hbd-EcosucA, 및 pTac15k 4hbd-Cglkgd를 제작하였다. 이 때, 대장균 유래 sucA 유전자 (서열번호 1 및 2) 및 코리네박테리움 글루타미쿰(C. glutamicum) 유래 kgd 유전자(NCgl1084) (서열번호 3 및 4)는 각 미생물의 게놈 DNA를 주형으로 사용한 PCR 증폭을 통해 확보하였다.
도 1은 pTac15k 4hbd-kdc 벡터의 개열지도를 나타낸다.
1.3. 4hbd 및 kdc 유전자의 도입
실시예 1.1에서 제작된 대장균 W 유래 돌연변이 균주 W026에 실시예 1.2에서 제조된 4종의 pTac15k 4hbd-kdc 벡터를 각각 열 충격(heat shock) 방법 (Sambrook, J & Russell, D.W., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)으로 도입함으로써, 4HB 생성능을 가진 균주를 제작하였다. 상기 형질전환 균주는 50 ㎍/mL 카나마이신이 포함된 LB 평판 배지에서 선별하여 수득하였다.
그 결과, 재조합 미생물 E.coli W026 (pTac15k 4hbd-MboBCGsucA), E.coli W026 (pTac15k 4hbd-EglsucA), E.coli W026 (pTac15k 4hbd-EcosucA), 및 E.coli W026 (pTac15k 4hbd-Cglkgd)을 얻었다. 또한, E.coli W026 (pTac15k 4hbd)를 제작하여 하기 실시예에서 4HB 생산성 비교를 위한 대조군으로 사용하였다.
실시예 2: 실시예 1에서 제작된 미생물을 이용한 4-히드록시부티레이트의 생산
실시예 1에서 제작된 미생물을, 대조군인 발현벡터를 포함하지 않은 W026 및 W026 (pTac15k 4hbd)와 함께 50 ㎍/mL 카나마이신을 함유한 10 mL LB 배지에 접종하여 30℃에서 12시간 동안 전 배양을 수행하였다. 발현벡터를 포함하지 않은 W026의 경우, 카나마이신을 포함하지 않은 배지에서 배양하였다.
그 후, 20 g/L 글루코스, 1 g/L 효모 추출물(yeast extract), 100 mM MOPS, 10 mM NaHCO3, 및 50 ㎍/mL 카나마이신을 함유한 MR 배지 30 mL을 함유한 125 mL 플라스크에 상기 전 배양액 0.3 mL를 접종하여 30℃에서 220 rpm으로 진탕하면서 24시간 배양하였다. 상기 MR 배지는 증류수 1L당 6.67g KH2PO4, 4g (NH4)2HPO4, 0.8g 시트르산, 0.8g MgSO4ㆍ7H2O, 5 mL trace metal solution (증류수 1L당 10g FeSO4ㆍ7H2O, 1.35g CaCl2, 2.25g ZnSO4ㆍ7H2O, 0.5g MnSO4ㆍ4H2O, 1g CuSO4ㆍ5H2O, 0.106g (NH4)6Mo7O24ㆍ4H2O, 0.23g Na2B4O7ㆍ10H2O, 35% HCl 10 mL 포함)의 성분이 있고 10N NaOH로 pH를 7.0으로 맞춘 것이다. 도입 유전자의 발현을 유도하기 위해 OD600이 0.5가 될 때까지 성장시키고, OD600이 0.5가 되었을 때 0.25 mM IPTG를 배지에 첨가하였다.
생산된 4HB의 분석 과정은 다음과 같다: 30 mL 배지에서 1 mL을 취하여 13000 rpm에서 30분 동안 원심분리를 하고, 상등액을 다시 한번 같은 조건으로 원심분리 후 800 ㎕를 0.45 ㎛ 필터로 여과하여 샘플을 준비하였다. 이 중에서 10 ㎕의 샘플을 UHPLC(Ultra High Performance Liquid Chromatography, Water)를 이용하여 1,4-BDO의 양을 분석하였다. UHPLC는 Refractive index detector(RID)가 장착된 Agilent 1100 장치를 사용하였다. 4 mM H2SO4 용액을 이동상으로 사용하고 BIO-RAD Aminex HPX-87H Column을 고정상으로 사용했으며, 이때의 유속은 0.7 ml/min이었다. 컬럼과 검출기의 온도는 모두 50℃였다.
도 2는 4종의 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제(kdc) 유전자 중 하나와 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제(4hbd) 유전자가 도입된 대장균, 및 kdc 유전자가 도입되지 않은 대장균을 배양하여 4HB의 생산량을 측정한 결과를 나타낸다.
그 결과, E.gracilis 유래 sucA가 도입된 대장균은 M.bovis 유래 sucA가 도입된 대장균에 비해 4HB 생산성이 1.2배 증가하였다. 또한, E.coli 유래 sucA 또는 C.glutamicum 유래 kgd가 도입된 대장균에서 4HB가 생성됨을 처음으로 확인하였고, 이들 대장균은 M.bovis 유래 sucA가 도입된 대장균에 비해 각각 1.7배 또는 2.9배 증가된 생산성을 나타내었다.
실시예 3: 알파-케토글루타레이트 데카르복실라제 활성이 증가된, 1,4-부탄디올(1,4-BDO) 생산능을 갖는 미생물의 제작
3.1. Cat2 및 Bld 발현 벡터의 제조
4HB로부터 1,4-BDO 생성경로 구축을 위해, 4-히드록시부티릴 CoA:아세틸 CoA 트란스퍼라제(cat2) 및 부티르알데히드 데히드로게나제(bld) 유전자를 발현시키기 위한 벡터를 제조하였다.
포르피로모나스 긴기아발리 유래인 서열번호 7 및 8의 cat2 유전자를 합성하였다((주)코스모진텍, 한국). 얻어진 cat2 유전자를 제한효소 EcoRl와 HindⅢ를 사용하여 pTrc99a (AP Biotech 社)에 도입하여 pTrc99a cat2를 제작하였다.
클로스트리듐 사카로퍼부틸아세토니쿰의 gDNA를 주형으로 하여 서열번호 61 및 62의 프라이머 서열을 이용하여 PCR하여 서열번호 9 및 10의 부티르알데히드 데히로게나제 유전자를 증폭하였다. 수득된 부티르알데히드 데히도로게나제 유전자를 제한효소 NcoI/EcoRl를 이용하여 pTrc99a cat2 벡터에 삽입하여 pTrc99a bld-cat2를 제작하였다. 이때 사용된 Bld 유전자는 활성이 증가된 변이체로서, 서열번호 93의 아미노산 서열 및 서열번호 94의 뉴클레오티드 서열을 갖는 bldI(M227L) 유전자이다.
도 3은 pTac99a bld-cat2 벡터의 개열지도를 나타낸다.
3.2. cat2 및 bld 유전자의 도입
실시예 1에서 제작된 미생물에 실시예 3.1에서 제작된 pTac99a bld-cat2 벡터를 열 충격 방법으로 도입함으로써, 1,4-BDO 생성능을 가진 균주를 제작하였다. 상기 형질전환 균주는 50 ㎍/mL 카나마이신 및 100 ㎍/mL 암피실린이 포함된 LB 평판 배지에서 선별하여 수득하였다.
그 결과, 재조합 미생물 E.coli W026 (pTac15k 4hbd-MboBCGsucA + pTrc99a bld-cat2), E.coli W026 (pTac15k 4hbd-EglsucA + pTrc99a bld-cat2), E.coli W026 (pTac15k 4hbd-EcosucA + pTrc99a bld-cat2), 및 E.coli W026 (pTac15k 4hbd-Cglkgd + pTrc99a bld-cat2)을 얻었다. 또한, E.coli W026 (pTac15k + pTrc99a bld-cat2) 및 W026 (pTac15k 4hbd + pTrc99a bld-cat2)을 제작하여 하기 실시예에서 1,4-BDO 생산성 비교를 위한 대조군으로 사용하였다.
실시예 4: 실시예 3에서 제작된 미생물을 이용한 1,4-부탄디올의 생산
실시예 3에서 제작된 미생물을, 대조군인 W026 (pTac15k + pTrc99a bld-cat2) 및 W026 (pTac15k 4hbd + pTrc99a bld-cat2)과 함께 50 ㎍/mL 카나마이신과 100 ㎍/mL 암피실린을 함유한 10 mL LB 배지에 접종하여 30℃에서 12시간 동안 전 배양을 수행하였다.
그 후, 실시예 2에서와 같은 방법으로 24시간 진탕 배양한 후, 생산된 1,4-BDO의 양을 측정하였다. 1,4-BDO의 분석 방법은 실시예 2의 4HB 분석 방법과 동일하다.
도 4는 4종의 kdc 유전자 중 하나와, 4hbd 유전자, cat2 유전자 및 bld 유전자가 도입된 대장균과, kdc 유전자가 도입되지 않은 대장균을 배양하여 1,4-BDO의 생산량을 측정한 결과를 나타낸다.
그 결과, E.gracilis 유래 sucA가 도입된 대장균은 M.bovis 유래 sucA가 도입된 대장균에 비해 1,4-BDO 생산성이 1.5배 증가하였다. 또한, E.coli 유래 sucA 또는 C.glutamicum 유래 kgd가 도입된 대장균에서 1,4-BDO가 생성됨을 처음으로 확인하였고, 이들 대장균은 M.bovis 유래 sucA가 도입된 대장균에 비해 각각 1.5배 또는 2.3배 증가된 생산성을 나타내었다.
<110> SAMSUNG ELECTORNICS CO., LTD. <120> A microorganism having enhanced activity of alpha-glutarate decarboxylase and a method of producing 1,4-butanediol using the same <130> PN101340 <160> 94 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 933 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Gln Asn Ser Ala Leu Lys Ala Trp Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Ser 1 5 10 15 Gly Ala Asn Gln Ser Trp Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr 20 25 30 Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Asn Trp Arg Ser Thr Phe Gln Gln Leu 35 40 45 Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Asp Gln Phe His Ser Gln Thr Arg Glu 50 55 60 Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Ser Ser Thr Ile 65 70 75 80 Ser Asp Pro Asp Thr Asn Val Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile 85 90 95 Asn Ala Tyr Arg Phe Arg Gly His Gln His Ala Asn Leu Asp Pro Leu 100 105 110 Gly Leu Trp Gln Gln Asp Lys Val Ala Asp Leu Asp Pro Ser Phe His 115 120 125 Asp Leu Thr Glu Ala Asp Phe Gln Glu Thr Phe Asn Val Gly Ser Phe 130 135 140 Ala Ser Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Gly Glu Leu Leu 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Val Gln Glu 355 360 365 Thr Leu Asn Met Ser Lys Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr Val 370 375 380 Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro Leu 385 390 395 400 Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val Gln 405 410 415 Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala Phe 420 425 430 Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Phe Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp Val 435 440 445 Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala Asp 450 455 460 Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys His 465 470 475 480 Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Lys Leu Glu Gln Glu Lys Val 485 490 495 Ala Thr Leu Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp Ala 500 505 510 Leu Asp Ala Gly Asp Cys Val Val Ala Glu Trp Arg Pro Met Asn Met 515 520 525 His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu Glu 530 535 540 Tyr Pro Asn Lys Val Glu Met Lys Arg Leu Gln Glu Leu Ala Lys Arg 545 550 555 560 Ile Ser Thr Val Pro Glu Ala Val Glu Met Gln Ser Arg 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180 caaacgcgtg aatatttccg ccgcctggcg aaagacgctt cacgttactc ttcaacgatc 240 tccgaccctg acaccaatgt gaagcaggtt aaagtcctgc agctcattaa cgcataccgc 300 ttccgtggtc accagcatgc gaatctcgat ccgctgggac tgtggcagca agataaagtg 360 gccgatctgg atccgtcttt ccacgatctg accgaagcag acttccagga gaccttcaac 420 gtcggttcat ttgccagcgg caaagaaacc atgaaactcg gcgagctgct ggaagccctc 480 aagcaaacct actgcggccc gattggtgcc gagtatatgc acattaccag caccgaagaa 540 aaacgctgga tccaacagcg tatcgagtct ggtcgcgcga ctttcaatag cgaagagaaa 600 aaacgcttct taagcgaact gaccgccgct gaaggtcttg aacgttacct cggcgcaaaa 660 ttccctggcg caaaacgctt ctcgctggaa ggcggtgacg cgttaatccc gatgcttaaa 720 gagatgatcc gccacgctgg caacagcggc acccgcgaag tggttctcgg gatggcgcac 780 cgtggtcgtc tgaacgtgct ggtgaacgtg ctgggtaaaa aaccgcaaga cttgttcgac 840 gagttcgccg gtaaacataa agaacacctc ggcacgggtg acgtgaaata ccacatgggc 900 ttctcgtctg acttccagac cgatggcggc ctggtgcacc tggcgctggc gtttaacccg 960 tctcaccttg agattgtaag cccggtagtt atcggttctg ttcgtgcccg tctggacaga 1020 cttgatgagc cgagcagcaa caaagtgctg ccaatcacca tccacggtga cgccgcagtg 1080 accgggcagg gcgtggttca ggaaaccctg aacatgtcga aagcgcgtgg ttatgaagtt 1140 ggcggtacgg tacgtatcgt tatcaacaac caggttggtt tcaccacctc taatccgctg 1200 gatgcccgtt ctacgccgta ctgtactgat atcggtaaga tggttcaggc cccgattttc 1260 cacgttaacg cggacgatcc ggaagccgtt gcctttgtga cccgtctggc gctcgatttc 1320 cgtaacacct ttaaacgtga tgtcttcatc gacctggtgt gctaccgccg tcacggccac 1380 aacgaagccg acgagccgag cgcaacccag ccgctgatgt atcagaaaat caaaaaacat 1440 ccgacaccgc gcaaaatcta cgctgacaag ctggagcagg aaaaagtggc gacgctggaa 1500 gatgccaccg agatggttaa cctgtaccgc gatgcgctgg atgctggcga ttgcgtagtg 1560 gcagagtggc gtccgatgaa catgcactct ttcacctggt cgccgtacct caaccacgaa 1620 tgggacgaag agtacccgaa caaagttgag atgaagcgcc tgcaggagct ggcgaaacgc 1680 atcagcacgg tgccggaagc agttgaaatg cagtctcgcg ttgccaagat ttatggcgat 1740 cgccaggcga tggctgccgg tgagaaactg ttcgactggg gcggtgcgga aaacctcgct 1800 tacgccacgc tggttgatga aggcattccg gttcgcctgt cgggtgaaga ctccggtcgc 1860 ggtaccttct 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gcccggcctc cgcctctccg gcggtagggt atatgtccgt tcaccagaaa 2760 cagcaacaag atctggttaa tgacgcgctg aacgtcgaat aa 2802 <210> 3 <211> 1221 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 3 Met Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu 1 5 10 15 Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp 20 25 30 Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Thr Thr Pro Ala Thr 35 40 45 Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro 50 55 60 Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro 65 70 75 80 Ala Asp Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln 85 90 95 Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys 100 105 110 Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr 115 120 125 Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met 130 135 140 Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr 145 150 155 160 His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp 165 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acctgctggg ttatgccctg gtgcaggcgg tgaagaaatt cccgaacatg 480 aaccgtcact acaccgaagt cgacggtaaa ccgactgccg tgaccccggc acacaccaac 540 ctgggcctgg caattgacct gcagggcaag gatggcaagc gttccctggt agtagctggt 600 attaaacgtt gcgaaaccat gcgctttgca cagttcgtaa ccgcgtacga agatatcgta 660 cgtcgcgcac gtgatggcaa actgactacc gaagacttcg cgggtgtgac catttccctg 720 accaacccgg gcaccatcgg tactgtacat agcgtaccac gtctgatgcc gggtcagggt 780 gcgattatcg gcgttggtgc tatggagtat ccggccgagt ttcagggtgc ttccgaagag 840 cgtatcgcgg aactgggtat tggtaaactg attaccctga cgagcaccta cgaccaccgc 900 atcatccagg gcgccgaaag cggtgacttc ctgcgtacca tccatgaact gctgctgtcc 960 gatggtttct gggatgaagt cttccgcgaa ctgtctattc cgtacctgcc ggtccgttgg 1020 tccaccgata acccggattc tattgtagac aaaaacgccc gcgttatgaa cctgatcgca 1080 gcgtatcgta atcgtggcca cctgatggca gacacggacc ctctgcgtct ggacaaagcg 1140 cgttttcgca gccacccgga cctggaagtt ctgactcatg gcctgactct gtgggatctg 1200 gatcgcgtat ttaaagtgga tggctttgca ggtgcccagt acaagaaact gcgtgatgtt 1260 ctgggcctgc tgcgtgacgc ctattgccgc catattggtg ttgaatacgc gcacatcctg 1320 gacccagagc agaaagaatg gctggagcag cgtgtggaaa ccaaacacgt taagccgacc 1380 gtagcgcagc agaaatacat cctgtctaag ctgaacgctg ccgaggcttt cgaaaccttt 1440 ctgcagacga aatatgttgg tcagaaacgc ttctccctgg agggtgcaga atctgtgatc 1500 ccgatgatgg atgctgcgat cgaccagtgc gctgaacacg gcctggacga ggtagtgatc 1560 ggtatgccgc accgtggccg tctgaacgtt ctggctaaca tcgttggtaa accgtacagc 1620 cagatcttta ctgaattcga aggcaacctg aacccgtccc aggctcatgg ttccggcgac 1680 gtgaaatacc atctgggcgc aactggtctg tacctgcaga tgttcggtga taatgacatc 1740 caggtatctc tgaccgctaa tccgtcccac ctggaagcgg ttgacccggt actggaaggc 1800 ctggttcgtg caaaacaaga tctgctggac cacggtagca tcgattctga cggtcagcgt 1860 gccttctctg tggttccgct gatgctgcac ggcgatgcgg cttttgcagg ccagggtgtt 1920 gttgctgaaa cgctgaacct ggcgaacctg ccgggctacc gtgttggtgg cactatccat 1980 atcatcgtta acaaccagat cggcttcacg accgcgccgg aatactctcg ctctagcgaa 2040 tactgcactg atgtggctaa gatgattggc gccccaatct tccacgttaa cggtgacgac 2100 ccggaagcgt gtgtgtgggt 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ccagctgtcc aacgtcgtgc tgctgctgcc acacggccat 3000 gaaggtcagg gtccggatca tacttctgcg cgcatcgagc gtttcctgca gctgtgggcc 3060 gagggctcca tgaccatcgc catgccgtcc accccgtcta attattttca cctgctgcgc 3120 cgtcacgcgc tggacggtat ccagcgcccg ctgattgttt tcaccccgaa atccatgctg 3180 cgccacaaag cggcagtcag cgagattaaa gatttcaccg aaatcaaatt ccgctccgtc 3240 ctggaagaac cgacctatga agacggcatc ggtgaccgca acaaggtaag ccgcattctg 3300 ctgacctccg gcaaactgta ttacgagctg gcagctcgca aggcgaagga taaccgcaac 3360 gatctggcaa tcgtgcgcct ggaacagctg gcgccgctgc cgcgtcgccg tctgcgtgaa 3420 accctggatc gctatgaaaa cgtaaaagag ttcttctggg ttcaagaaga gccggcaaac 3480 cagggcgctt ggccgcgttt tggcctggag ctgccggagc tgctgccgga caagctggcc 3540 ggtatcaaac gtatctcccg tcgtgctatg agcgcccctt ctagcggttc ttctaaagtt 3600 catgctgttg aacagcaaga aatcctggac gaagcgttcg gctaa 3645 <210> 83 <211> 633 <212> PRT <213> Euglena gracilis <400> 83 Met Tyr Arg Leu Lys Asn Leu Gln Ala Val Pro Trp Lys Ala Pro Thr 1 5 10 15 Arg Ala Ile Arg Gly Ile Ala Leu Asp Gly Pro Asp Arg 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ccccaacccg cgcgattcgc 60 ggcatcgcgc tggatggtcc ggatcgtgat cgtatgttca acgcgtacct gcattcttct 120 cgcccttcct tcggcccggc cactgacgtt ttcgttcagt gcctggaagc tgaaaaaatc 180 gactggatct tcggcattcc gggcgaagaa aacctggatc tgctgcacag cctggcaaag 240 gcgcaccgtc gtgaaggtgg tgaaactatg aaactggtcg taacccgtca tgaacaggcg 300 gcaggtttca tggcagcaac cgttggtcgt ctgactggtc atccggcagc gtgcctgtct 360 accctgggtc caggtgctac caattttacc accgcgctgg cttacagcaa actgggcggc 420 ttcccgctga tctgtatcac tggccagaaa ccgatccgtc actctaagca gggtgcgttt 480 cagattctgg acatttgtgg ccacttccgc gacgtggtca aatccaccaa gtccattgaa 540 gacccggacc tgattccgtc taccattcgt aacgcggtgc tgcaggcacg tgaagagaag 600 ccgggtccgg tacacatcga actggctgaa gatattgcgg ctctggaagt gtctaaagaa 660 ggtggctggg tgtttccggc tccaacccgt accccgatcg cacgtggtcg tcgccctctg 720 gtggaaccaa aatgcatcga acatgcggtt actctgatcc acgcagcgaa acgtccgctg 780 atttgtatcg cagcgggtgc taaccgtaaa aacacgcatc acgctatgga agtactgatg 840 cgtaaaaccg gcctgatggt tgtttgtacc cagatgggca aaggtgttgt gtacgaagac 900 aacctgggct acatcggctg taccgccctg tccgacaaag acctggttca cgttgcaatc 960 aacaccgcgg atctgatcgt gaacgtaggt cacgacatca gcgaaaaacc gccgttcatt 1020 atgaaccaca acaaacctcc gctggtaatt cacgcgaact tcactcgccc gctggttgat 1080 ccggtgtatt tcccgcatct ggtcctggtt ggtgacatta acgattgcct gtggcagctg 1140 gctacccgca tccgtccgca gccgcattgg gatttcaatc cgttccaaat ggttcgtcgt 1200 gagatcgaac gcaccgtttg gaactcccca tatgcccaat ctgacgcgtt tcctctgact 1260 gttcagcgcc tggtttctga cgttcgcaaa gccatgccgg ttgacggcat cgtgagcctg 1320 gataacggca tgtacaaaat ctggtttgct cgtcagtaca aaaccatgat gggtaacacg 1380 ctgctgctgg ataatgcgct ggcaacgatg ggtgctggtc tgccgtcttg catcgcagcc 1440 aaactggttt atccggaacg tgtctgcatc gccgtatgcg gcgatggtgg cttcatgatg 1500 aactcccagg agatcgagac tgcactgcgc ctgaacctgc acatcgtagt tatcgtactg 1560 aacaacaact cctacggcat gatcgcttgg aaggccactg cgatgggcat ggacgatttt 1620 ggcctgaact acggtaaccc ggacttcgct cagtatgcac gtgcttacgg tgctatcggt 1680 cacaatgtga aatctaccgc ggaattcctg ccgacgctgg agaaagctat caaagaacac 1740 ggtgtccaca tcattgatct gccgattagc tacgaaacta gcgataaagc actgttcgaa 1800 gacctgccga aagaggtcga ggaactgaaa aaggcagtgg cgaaagcgat ctccgaggaa 1860 aaaaagtttg attgggacgc cgtgacggcc gctcagagct aa 1902 <210> 85 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M. bovis sucA F <400> 85 agacgactgt actaatctag tcacacagga aacagaattc atgtaccgta aattccgtg 59 <210> 86 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M. bovis sucA R <400> 86 ttgcatgcct gcaggtcgac tctagttagc tctgagcggc cgtcac 46 <210> 87 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E. grac sucA F <400> 87 agacgactgt actaatctag tcacacagga aacagaattc atgtatcgtc tgaaaaatc 59 <210> 88 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E. grac sucA R <400> 88 ttgcatgcct gcaggtcgac tctagttagc tctgagcggc cgtcac 46 <210> 89 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E. coli sucA F <400> 89 agacgactgt actaatctag tcacacagga aacagaattc atgcagaaca gcgctttgaa 60 60 <210> 90 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E. coli sucA R <400> 90 ttgcatgcct gcaggtcgac tctagttatt cgacgttcag cgcgt 45 <210> 91 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cgl kgd F <400> 91 agacgactgt actaatctag tcacacagga aacagaattc atgagcagcg ctagtacttt 60 c 61 <210> 92 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cgl kgd R <400> 92 ttgcatgcct gcaggtcgac tctagttaag cctcgaaagc ctcgtc 46 <210> 93 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BldI <400> 93 Met Ile Lys Asp Thr Leu Val Ser Ile Thr Lys Asp Leu Lys Leu Lys 1 5 10 15 Thr Asn Val Glu Asn Ala Asn Leu Lys Asn Tyr Lys Asp Asp Ser Ser 20 25 30 Cys Phe Gly Val Phe Glu Asn Val Glu Asn Ala Ile Ser Asn Ala Val 35 40 45 His Ala Gln Lys Ile Leu Ser Leu His Tyr Thr Lys Glu Gln Arg Glu 50 55 60 Lys Ile Ile Thr Glu Ile Arg Lys Ala Ala Leu Glu Asn Lys Glu Ile 65 70 75 80 Leu Ala Thr Met Ile Leu Glu Glu Thr His Met Gly Arg Tyr Glu Asp 85 90 95 Lys Ile Leu Lys His Glu Leu Val Ala Lys Tyr Thr Pro Gly Thr Glu 100 105 110 Asp Leu Thr Thr Thr Ala Trp Ser Gly Asp Asn Gly Leu Thr Val Val 115 120 125 Glu Met Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Ile Thr Pro Ser Thr Asn 130 135 140 Pro Thr Glu Thr Val Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Ile Ala Ala Gly 145 150 155 160 Asn Thr Val Val Phe Asn Gly His Pro Gly Ala Lys Lys Cys Val Ala 165 170 175 Phe Ala Val Glu Met Ile Asn Lys Ala Ile Ile Ser Cys Gly Gly Pro 180 185 190 Glu Asn Leu Val Thr Thr Ile Lys Asn Pro Thr Met Asp Ser Leu Asp 195 200 205 Ala Ile Ile Lys His Pro Ser Ile Lys Leu Leu Cys Gly Thr Gly Gly 210 215 220 Pro Gly Leu Val Lys Thr Leu Leu Asn Ser Gly Lys Lys Ala Ile Gly 225 230 235 240 Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Val Ile Val Asp Asp Thr Ala Asp Ile 245 250 255 Glu Lys Ala Gly Lys Ser Ile Ile Glu Gly Cys Ser Phe Asp Asn Asn 260 265 270 Leu Pro Cys Ile Ala Glu Lys Glu Val Phe Val Phe Glu Asn Val Ala 275 280 285 Asp Asp Leu Ile Ser Asn Met Leu Lys Asn Asn Ala Val Ile Ile Asn 290 295 300 Glu Asp Gln Val Ser Lys Leu Ile Asp Leu Val Leu Gln Lys Asn Asn 305 310 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ttatacaaaa 180 gaacaaagag aaaaaatcat aactgagata agaaaggccg cattagaaaa taaagagatt 240 ctagctacaa tgattcttga agaaacacat atgggaagat atgaagataa aatattaaag 300 catgaattag tagctaaata cactcctggg acagaagatt taactactac tgcttggtca 360 ggagataacg ggcttacagt tgtagaaatg tctccatatg gcgttatagg tgcaataact 420 ccttctacga atccaactga aactgtaata tgtaatagta taggcatgat agctgctgga 480 aatactgtgg tatttaacgg acatccaggc gctaaaaaat gtgttgcttt tgctgtcgaa 540 atgataaata aagctattat ttcatgtggt ggtcctgaga atttagtaac aactataaaa 600 aatccaacta tggactctct agatgcaatt attaagcacc cttcaataaa actactttgc 660 ggaactggag ggccaggact cgtaaaaacc ctcttaaatt ctggtaagaa agctataggt 720 gctggtgctg gaaatccacc agttattgta gatgatactg ctgatataga aaaggctggt 780 aagagtatca ttgaaggctg ttcttttgat aataatttac cttgtattgc agaaaaagaa 840 gtatttgttt ttgagaacgt tgcagatgat ttaatatcta acatgctaaa aaataatgct 900 gtaattataa atgaagatca agtatcaaag ttaatagatt tagtattaca aaaaaataat 960 gaaactcaag aatactctat aaataagaaa tgggtcggaa aagatgcaaa attattctta 1020 gatgaaatag atgttgagtc tccttcaagt gttaaatgca taatctgcga agtaagtgca 1080 aggcatccat ttgttatgac agaactcatg atgccaatat taccaattgt aagagttaaa 1140 gatatagatg aagctattga atatgcaaaa atagcagaac aaaatagaaa acatagtgcc 1200 tatatttatt caaaaaatat agacaaccta aataggtttg aaagagaaat cgatactact 1260 atctttgtaa agaatgctaa atcttttgcc ggtgttggtt atgaagcaga aggctttaca 1320 actttcacta ttgctggatc cactggtgaa ggaataactt ctgcaagaaa ttttacaaga 1380 caaagaagat gtgtactcgc cggttaa 1407

Claims (19)

  1. 알파-케토글루타레이트를 숙시닉 세미알데히드로 전환하는 활성이 증가되어 있고, 상기 활성 증가는 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분(E1 component)의 발현 증가에 의한 것인 미생물로서, 상기 발현 증가는 대장균 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드, 코리네박테리움 글루타미쿰 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드, 또는 유글레나 글라실리스 알파-케토글루타레이트 데히드로게나제 E1 성분을 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드의 도입에 의한 것인 대장균 미생물.
  2. 삭제
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  8. 청구항 1에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 4의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 미생물.
  9. 청구항 1에 있어서, 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성을 갖는 것인 미생물.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의한 것인 미생물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 코딩하는 것인 미생물.
  12. 청구항 1에 있어서, 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성 및 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성을 갖는 것인 미생물.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 숙시닉 세미알데히드를 4-히드록시부티레이트로 전환하는 활성은 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의한 것이고, 상기 4-히드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 활성은 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트란스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의한 것인 미생물.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 4-히드록시부티레이트 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 4-히드록시부티릴 조효소 A:아세틸 조효소 A 트란스퍼라아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 알데히드 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 알코올 데히드로게나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 각각 서열번호 5, 7, 9, 11의 아미노산 서열을 코딩하는 것인 미생물.
  15. 청구항 1에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 활성, 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 활성, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 활성, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 활성, 호기성 호흡 제어를 조절하는 활성, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 활성, 또는 그 조합이 제거되거나 감소된 것인 미생물.
  16. 청구항 15에 있어서, 피루베이트를 락테이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 피루베이트를 포르메이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 아세틸 CoA를 에탄올로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 옥살로아세테이트를 말레이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 호기성 호흡 제어를 조절하는 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 숙시닉 세미알데히드를 숙시네이트로 전환하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 조합이 불활성화 또는 감쇄된 것인 미생물.
  17. 청구항 1에 있어서, 외래 피루베이트 데히드로게나제 서브유닛의 변이체, NADH 둔감성 시트레이트 신타제 변이체, 또는 그 조합을 발현하는 것인 미생물.
  18. 청구항 1의 미생물을 배양하는 단계; 및
    상기 배양물로부터 4-히드록시부티레이트 또는 1,4-부탄디올을 회수하는 단계;를 포함하는, 4-히드록시부티레이트 또는 1,4-부탄디올을 생산하는 방법.
  19. 청구항 18에 있어서, 상기 배양은 혐기성 조건에서 수행되는 것인 방법.
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