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KR102206831B1 - 메로터페노이드계 화합물 및 그의 용도 - Google Patents

메로터페노이드계 화합물 및 그의 용도 Download PDF

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KR102206831B1
KR102206831B1 KR1020190053883A KR20190053883A KR102206831B1 KR 102206831 B1 KR102206831 B1 KR 102206831B1 KR 1020190053883 A KR1020190053883 A KR 1020190053883A KR 20190053883 A KR20190053883 A KR 20190053883A KR 102206831 B1 KR102206831 B1 KR 102206831B1
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meroterpenoid
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compound
hydrogen
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왕웨이홍
이주성
손영진
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서울대학교산학협력단
순천대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염 및 이를 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

메로터페노이드계 화합물 및 그의 용도{Meroterpenoids and Their Use}
본 발명은 골다공증 예방 및 치료에 사용될 수 있는 메로터페노이계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 약제학적으로 허용되는 염 및 이를 포함하는 의약, 기능성 식품, 기능성 음료 및 동물용 사료로서의 용도에 관한 것이다.
인체의 골조직은 조골세포에 의한 골 재형성(Bone formation)과 파골세포에 의한 골 재흡수(Bone resorption) 과정과 같은 골의 리모델링(Bone remodeling)이 평생동안 끊임없이 반복되어 이루어지는 역동적인 기관이다. 골조직은 연골과 골격계를 구성하며 기계적 기능으로 지지와 근 부착의 역할을 하고, 생체기관 및 골수를 보호하는 기능을 하며, 칼슘과 인 이온의 항상성 유지를 위해 이들을 보존하는 기능을 담당한다. 이와 같은 기능을 하는 골 조직은 교원질, 당단백질과 같은 세포 기질과 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 및 골세포 등 여러 종류의 세포들로 이루어진다. 이들 중 파골세포는 조혈모세포로부터 유래한 세포로서 노화된 골의 흡수를 담당하며, 조골세포는 골수 내 간질세포(bone marrow stromal cell)로부터 유래한 세포로서 골 형성에 주된 역할을 담당한다.
이 중 파골세포는 단핵구 세포가 RANKL(receptor activator of nuclear factor-κB (RANK) ligand)에 의해 다핵 파골세포(multinucleated osteoclasts)로 분화된다. 이러한 분화 과정은 세포 외부의 RANKL이 RANK에 결합하여 미토겐 활성 단백질 키나아제(mitogen-activated protein kinase, MAPK)의 활성을 촉진하고, 이는 NF-κ라는 전사 인자가 핵 내로 들어가서 파골세포 분화와 관련된 TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase), MMP-9(matrix metalloproteinase-9), c-Src 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 등의 발현을 증가시킴으로써 가능한데, 이러한 과정으로 형성된 다핵 파골세포는 무기질 골(mineralized bone)을 흡수하는 역할을 한다. 또한, RANKL이 RANK에 결합하면 TRAF6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)의 활성을 촉진시켜 MAPK, 또는 NF-κAP-1, NFATc1과 같은 전사인자들의 활성을 촉진시킨다(Biochem and Biophys. Res. Commun. 2003, 305, p211-214). 따라서 RANKL에 의해 활성화되는 신호전달 경로의 차단은 골다공증을 비롯한 골 질환의 치료를 위한 치료적 접근 방법 중의 하나로 인지되고 있다.
골 질환의 대표적인 예인 골다공증은 골의 재흡수와 재형성 사이의 균형이 깨어져서 골 재흡수 속도가 빨라짐에 따라 골의 칼슘이 빠져 일어나게 되는 골 소실로 초래되는 질병이다. 문헌에 의하면 65세 이상에서 잘 오는 노인성 골다공증과 성 호르몬 부족에서 오는 폐경 후 골다공증뿐만 아니라 요즘은 젊은 학생에게도 편식 등으로 칼슘 섭취가 부족하게 되어 골다공증이 초래되는 것으로 알려져 있다. 그리고 스테로이드나 위장약을 장기 복용하는 자, 술, 담배, 커피가 심한 자, 고기 많이 먹는 사람, 운동 잘 안하는 사람, 왜소한 사람, 앉아 일하는 사람, 위 수술받은 사람, 요통, 관절염, 근육통이 있는 사람, 오래 누워 있는 사람, 피로를 잘 느끼는 사람 등은 골다공증 발생의 위험이 높아진다. 그러나 그 작용기전은 아직 명확하지 않은 상황이다. 골다공증은 그 증세 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골 골절은 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고, 결과적으로 노인층 사망의 15%에 대한 원인제공을 하는 것으로 알려져 있다.
골다공증 치료제를 개발하기 위한 통상적인 실험방법은 일차적으로 파골세포의 활성을 억제시키거나, 조골세포의 활성을 증가시키는 물질을 선택한 후, 인간에서 나타나는 골다공증과 유사한 증상을 보이는 동물을 사용하여 골량이 얼마만큼 회복되고, 골강도가 얼마만큼 회복되었는지 정도로 약효를 평가한다.
골다공증의 원인은 다양하게 생각할 수 있지만, 가장 많은 것이 나이가 드는 것(노화) 또는 여성의 폐경 후의 호르몬 불균형이기 때문에, 현재의 치료는 주로 에스트로겐, 비타민 D나 칼시토닌의 투여가 행해지고 있다. 그러나, 호르몬의 투여는 암(특히, 유방암, 자궁암 등)을 유발할 위험이 있어 안전한 치료 방법이라고는 할 수 없다. 또한, 제2 세대 치료제로서, 비스포스포네이트의 투여도 행해지고 있지만, 투여를 중단하면 리바운드가 발생하는 문제점을 가지고 있다. 또한, 어느 쪽의 방법도 골다공증의 진행을 지연시킬 수는 있어도 일단 감소한 골을 재생시키기는 어려운 단점을 가지고 있다.
또한, 골 질환을 치료하기 위해서는 파골세포와 조골세포의 균형을 조절하는 것이 필요하기 때문에, 이에 대한 치료제로 크게 골흡수 억제제와 골형성 자극제가 있다. 이들 중 골 형성 자극제에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나 골 형성 자극제로 인한 골밀도 강화가 반드시 골절의 감소를 의미하지는 않으므로 임상적으로 널리 사용되기 위해서는 좀 더 많은 연구가 필요하다. 뿐만 아니라 골 형성을 자극하기 위한 제제로서 조골세포를 활성화시키기 위한 촉진제 및 파골세포의 골 흡수를 억제하기 위한 억제제는 일반적으로 환자에게 장기 투여하여야 하기 때문에 독성이 적고 경구투여가 가능한 것이 바람직하므로 이에 대한 연구가 절실히 필요한 실정이다.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003, 305, p211-214
이에, 본 발명자들은 천연물로부터 독성이 적고, 파골세포의 분화를 억제하고 조골세포의 분화를 촉진할 수 있는 화합물을 찾고자 예의 노력한 결과, 메로터페노이드계 화합물이 파골세포의 분화를 현저하게 억제하고 조골세포의 분화를 촉진함으로써 골다공증의 예방 및 치료제로 사용될 수 있는 것을 확인하고 발명을 완성하였다.
본 발명은 골다공증 예방 및 치료용 의약, 기능성 식품, 기능성 음료 및 동물용 사료 등의 유효성분으로 이용될 수 있는 이차대사 화합물을 곰팡이로부터 분리 정제하고자 하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 의약, 기능성 식품, 기능성 음료 및 동물용 사료의 유효성분으로서의 메로터페노이드계 화합물의 용도를 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 신규한 메로터페노이드계 화합물을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 메로터페노이드계 화합물을 생산하는 곰팡이 Penicillium rudallense 균주를 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112019047095054-pat00001
상기 화학식 1에서,
R1은 수소, 하이드록시 또는 아세톡시이고;
Figure 112019047095054-pat00002
는 하기 구조에서 선택되고;
Figure 112019047095054-pat00003
R5는 수소, 메톡시, 아세톡시 또는 하이드록시이고;
R6은 수소 또는 메틸이다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 기능성 식품 보조제, 기능성 음료, 식품첨가물 및 동물용 사료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 파골세포의 분화를 억제하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 조골세포의 분화를 촉진하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 하기에서 선택되는 신규한 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 제공한다.
Figure 112019047095054-pat00004
또한, 본 발명은 상기 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물을 생산하는 곰팡이 Penicillium rudallense 균주를 제공한다.
본 발명에 따른 메로터페노이드계 화합물은 파골세포의 분화를 효과적으로 억제함으로써 과도한 골 재흡수를 억제하고, 조골세포의 분화를 효과적으로 촉진함으로써 새로운 골형성을 촉진하여, 궁극적으로 골다공증의 예방 및 치료용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 - 메로터페노이드계 화합물의 TRAP 염색 결과를 나타낸 그림 및 메로터페노이드계 화합물 처리에 따른 TRAP 염색에 양성을 나타낸 세포수 계수한 결과를 나타낸 그래프
도 2 - 메로터페노이드계 화합물 157의 파골세포(osteoclast)에 대한 독성 실험결과를 나타낸 그래프
도 3 - 메로터페노이드계 화합물 157의 일수별 처리에 따른 TRAP의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 그래프
도 4 - 메로터페노이드계 화합물 157의 처리에 따른 파골세포 분화 표지 마커들의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 그래프
도 5 - 메로터페노이드계 화합물 157의 처리에 따른 NFATc1 단백질 발현을 웨스턴 블롯 실험으로 확인한 결과
도 6 - 메로터페노이드계 화합물 157의 처리에 따른 ALP 염색 결과를 나타낸 그림(C; control, 음성 대조군)
도 7 - 메로터페노이드계 화합물 157의 osteoblast 세포에 대한 독성 실험결과를 나타낸 그래프
도 8 - 메로터페노이드계 화합물 157의 6일간 처리에 따른 조골세포 분화 표지 마커인 ALP의 mRNA 발현 수준을 RT-PCR로 확인한 그래프
도 9 - 메로터페노이드계 화합물 157의 3일간 처리에 따른 조골세포 분화 표지 마커들의 mRNA 발현수준을 RT-PCR로 확인한 그래프
도 10 - 메로터페노이드계 화합물 157의 6일간 처리에 따른 조골세포 분화 표지 마커들의 mRNA 발현수준을 RT-PCR로 확인한 그래프
도 11 - 메로터페노이드계 화합물 157의 처리에 따른 마우스 대퇴골의 골소실 감소 양상을 확인한 micro-CT 사진
도 12 - 메로터페노이드계 화합물 157의 처리에 따른 뼈를 정량적으로 측정한 결과를 나타낸 그래프
본 발명은 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염, 곰팡이로부터 이를 생산, 분리·정제하는 방법 및 이를 포함하는 의약, 기능성 식품, 기능성 음료 및 동물용 사료로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태는 하기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
Figure 112019047095054-pat00005
상기 화학식 1에서,
R1은 수소, 하이드록시 또는 아세톡시이고;
Figure 112019047095054-pat00006
는 하기 구조에서 선택되고;
Figure 112019047095054-pat00007
R5는 수소, 메톡시, 아세톡시 또는 하이드록시이고;
R6은 수소 또는 메틸이다.
일 실시예에 있어, 상기 메로터페노이드계 화합물은 골다공증 예방 또는 치료용, 기능성 식품, 기능성 음료 및 동물용 사료로서의 용도로 사용될 수 있다.
일 실시예에 있어, 상기 메로터페노이드계 화합물은 하기 화학식 2로 표시될 수 있다:
[화학식 2]
Figure 112019047095054-pat00008
상기 화학식 2에서,
R1은 수소 또는 하이드록시이고;
Figure 112019047095054-pat00009
는 하기 구조에서 선택되고;
Figure 112019047095054-pat00010
R6은 수소 또는 메틸이다.
일 실시예에 있어, 상기 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물은 구체적으로 하기 구조에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
Figure 112019047095054-pat00011
상기 R1은 수소 또는 하이드록시이고; R6은 수소 또는 메틸이다.
일 실시예에 있어, 상기 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물은 곰팡이 Penicillium rudallense 균주, 구체적으로는 해양곰팡이 Penicillium rudallense 균주의 배양물의 추출물로부터 수득될 수 있다.
일 실시예에 있어, 상기 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물은 해양곰팡이 Penicillium rudallense 균주를 액체 영양배지에서 배양하고 그 배양액와 균체를 추출 및 정제하여 수득될 수 있다.
일 실시예에 있어, 상기 메로터페노이드계 화합물은 보다 구체적으로 하기 구조에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
Figure 112019047095054-pat00012
Figure 112019047095054-pat00013
Figure 112019047095054-pat00014
Figure 112019047095054-pat00015
Figure 112019047095054-pat00016
본 명세서 내 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"은 화합물이 투여되는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고 화합물의 생물학적 활성과 물성들을 손상시키지 않는 화합물의 제형을 의미한다. 상기 약학적으로 허용가능한 염은, 약학적으로 허용되는 음이온을 함유하는 무독성 산부가염을 형성하는 산, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 인산, 브롬화수소산, 요드화수소산 등과 같은 무기산, 타타르산, 포름산, 시트르산, 아세트산, 트리클로로아세트산, 트리플루오로아세트산, 글루콘산, 벤조산, 락트산, 푸마르산, 말레인산, 살리신산 등과 같은 유기 카본산, 메탄설폰산, 에탄술폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산 등과 같은 설폰산 등에 의해 형성된 산부가염이 포함된다. 예를 들어, 약학적으로 허용되는 카복실산 염에는, 리튬, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등에 의해 형성된 금속염 또는 알칼리 토금속 염, 라이신, 아르지닌, 구아니딘 등의 아미노산 염, 디시클로헥실아민, N-메틸-D-글루카민, 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디에탄올아민, 콜린 및 트리에틸아민 등과 같은 유기염 등이 포함된다.
본 명세서 내 용어, "골다공증"이란 뼈에 구조상 아무런 이상이 없으면서 뼈를 구성하는 무기질과 기질의 양이 과도하게 감소하여 뼈에 스펀지처럼 작은 구멍이 많이 나서 무르고 쉽게 부러지는 상태를 말하며, 다른 용어로 '골조소증' 또는 '골소공증'이라고도 한다. 상기 골다공증은 일반적으로 골량의 저하, 즉 골밀도의 저하나 골조직이 열화되는 증상을 수반한다.
상기 골다공증은 예컨대, 여성에서의 폐경에 따른 골다공증, 노인성 골다공증 및 난소 적출술에 따른 골다공증 등의 원발성 골다공증; 글루티코르티코이드 유발성 골다공증, 갑상선 기능 항진성 골다공증 고정 유발성 골다공증, 헤파린 유발성 골다공증, 면역 억제 유발성 골다공증, 신부전에 따른 골다공증, 염증성 골다공증, 쿠싱 증후군에 따른 골다공증 및 류마티스성 골다공증 등의 이차성 골다공증; 등과 같은 골 질환 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서 내 용어, "예방"이란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골다공증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, 본 명세서 내 용어, "치료"란 본 발명의 조성물의 투여에 의해 골다공증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
바람직하게 본 발명의 약제학적 조성물은 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하고 있어 파골세포의 분화 표지 마커로 알려져 있는 NFATc1, DC-STAMP, cathepsin K, 및 TRAP의 발현을 효과적으로 억제하고, 조골세포의 활성 촉진 표지 마커로 알려져 있는 OCL, OPN, Runx2 및 ALP의 발현을 촉진시키므로, 골다공증의 예방 또는 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.
구체적인 실시예에서, 상기 메로터페노이드계 화합물이 파골세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자, 5주령의 수컷 마우스 넙다리뼈와 정강뼈 속의 골수세포를 분리하여, 배양한 후, 메로터페노이드계 화합물을 처리하고 파골세포의 형성양상을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 메로터페노이드계 화합물의 처리 농도 증가에 따라 파골세포 형성이 감소하였으며, 특히 3 μM 이상의 농도에서는 파골세포의 분화를 현저하게 감소시켜 파골세포 형성을 효과적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(도 1).
또한, 구체적인 다른 실시예에서, 상기 메로터페노이드계 화합물이 파골세포 분화에서 핵심적인 역할을 담당하는 NFATc1의 발현을 억제하는지 확인하기 위하여 real-time PCR, western blot 실험을 수행하였다. 그 결과, 메로터페노이드계 화합물 10 μM 이상의 농도에서 RANKL로 증가된 NFATc1의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 4 내지 도 5).
또 다른 구체적인 실시예에서, 상기 메로터페노이드계 화합물이 조골세포의 분화에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자, C2C12 세포를 배양한 후, 메로터페노이드 유도체를 처리하고 조골세포의 형성양상을 확인하였다. 그 결과, 메로터페노이드계 화합물의 처리 농도 증가에 따라 조골세포 형성이 증가하였으며, 특히 10 μM 이상의 농도에서는 조골세포의 형성이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 6 및 도 8).
또 다른 구체적인 실시예에서, 상기 메로터페노이드계 화합물이 조골세포 분화 촉진에서 핵심적인 역할을 담당하는 Runx2의 발현을 촉진하는지 확인하기 위하여 확인 실험을 수행하였다. 그 결과, 메로터페노이드계 화합물 10 μM 이상의 농도에서 Runx2의 발현이 현저하게 증가되는 것을 확인할 수 있었다(도 9 내지 도 10).
또 다른 구체적인 실시예에서, 상기 메로터페노이드계 화합물의 골 소실 감소 효과를 마우스를 이용하여 생체 실험을 수행하였다. 그 결과, 메로터페노이드 유도체를 처리하지 않은 control과 비교하였을 때 메로터페노이드계 화합물을 2 mg/kg 또는 4 mg/kg 처리하였을 때 골 소실이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(도 11 내지 12).
상기와 같이 본 발명의 메로터페노이드계 화합물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 증가된 파골세포의 분화인자들의 발현을 억제함으로써 파골세포의 형성 및 분화를 억제하고, 조골세포 분화인자들의 발현을 촉진함으로써 조골세포의 형성 및 분화를 증가시켜, 궁극적으로 파골세포에 의한 골 재흡수를 제어하고, 조골세포에 의한 골 생성을 촉진하여 골다공증 질환을 효과적으로 치료할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 다른 양태는 상기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 파골세포의 분화를 억제하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 조골세포의 분화를 촉진하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 양태는 상기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에게 투여하여 골다공증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 명세서 내 용어, "개체"란 골다공증이 이미 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 구체적으로 인간을 포함한 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명에서 개체는 인간이 제외될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있다.
본 명세서 내 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약제학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 사용된 용어, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있으나, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 약학 투여에 이용가능한 비히클 또는 매체로서 이 분야에서 통상적으로 사용되는 것을 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 명세서 내 용어, "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 건강기능식품은 종류에는 특별한 제한은 없으며, 구체적인 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.
상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또한 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, "식품첨가물"로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품첨가물공전"에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀롤로오스, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류들을 들 수 있다.
상기 건강기능식품을 제조하는 과정에서 음료를 포함한 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 상기 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물을 생산하는 곰팡이 Penicillium rudallense 균주를 제공한다.
일 실시예에 있어, 상기 곰팡이 Penicillium rudallense 균주는 해양곰팡이 Penicillium rudallense 균주일 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 곰팡이 Penicillium rudallense 로부터 상기 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물을 생산, 분리·정제하는 방법을 제공한다.
상기 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물은 곰팡이 Penicillium rudallense 균주, 구체적으로는 해양곰팡이 Penicillium rudallense 균주의 배양물로부터 생산, 분리할 수 있다. 상기 화학식 1의 메로터페노이드계 화합물은 해양곰팡이 Penicillium rudallense 균주를 액체 영양배지에서 배양하고 그 배양액와 균체를 추출 및 정제하여 수득될 수 있다.
일 실시예에 있어, 상기 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물은 해양곰팡이 Penicillium rudallense 균주의 배양물을 아세톤 및 메탄올로 추출하여 감압 하에서 용매를 증발시킨 후, 물과 에틸아세테이트로 분배 추출하여 얻어진 에틸아세테이트 층의 용매를 다시 증발시킨 잔류물로부터 분리되는 것으로, 상기 잔류물은 클로로포름과 메탄올 배합을 단계적으로 달리 해준 용리액을 사용하여 실리카 순상 플래시 컬럼 크로마토그래피로 1차 정제된 후, 아세토니트릴과 물의 배합을 단계적으로 달리 해준 용리액을 사용하여 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 2차 정제되어 상기 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물이 수득될 수 있다.
일 실시예에 있어, 바람직하게는 상기 잔류물은 1 내지 2% 메탄올 및 98 내지 99% 클로로포름으로 이루어진 용리액을 사용하여 실리카 순상 플래시 컬럼 크로마토그래피로 1차 정제된 후, 용출속도 1 mL/분 기준으로 65% 아세토니트릴 수용액을 용리액으로 사용하여 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 2차 정제되어 머무름 시간 45 분에서 상기 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물이 수득될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 하기에서 선택되는 신규한 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체, 생체 내에서 가수분해 가능한 그의 전구체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 제공한다:
Figure 112019047095054-pat00017
상기 구조의 메로터페노이드계 화합물은 골다공증 예방 또는 치료용, 기능성 식품, 기능성 음료 및 동물용 사료로서의 용도로 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 한정되지 않고 다양하게 수정 및 변경될 수 있다.
[실시예 1] 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물의 추출, 정제 및 동정
본 발명에 따른 화학식 2의 메로터페노이드계 화합물은 해양곰팡이 Penicillium rudallense의 배양물로부터 분리되었다. 해양 토양을 채집 직후 곰팡이 분리용 고체평판배지 (PDA, Difco)에 올려 한 달간 배양 후 자란 곰팡이들 중에서 Penicillium rudallense를 분리하였다. 분리한 Penicillium rudallense를 일 주일간 PDB 액체배지(해수 또는 민물)에서 배양하여 그 배양물 및 균체(mycelia)를 아세톤 및 메탄올로 추출하고 감압 하에서 용매를 증발시킨 다음, 상기 잔류 추출물을 물과 에틸아세테이트로 분배추출하고 상기 분배추출된 에틸아세테이트 층을 감압 하에서 용매를 증발시켰다. 상기 잔류물을 클로로포름과 메탄올 배합을 단계적으로 달리해 준 용액을 용리액으로 사용하여 실리카 순상 플래시 컬럼 크로마토그래피로 1차 정제하였다. 메탄올 1% 및 2% 분획을 C18 역상 고성능 액체 크로마토그래피(Luna 2 C18, 입자직경 5um, 250 × 10 mm, 자외선검출기, 용출 속도 1 ml/min) 상에서 65% 아세토니트릴 수용액으로 용리시켜, 머무름시간 45분 용출물을 감압 하에서 용매를 제거하여 무정형 고체 상태로 메로터페노이드계 화합물 151 내지 161을 얻었다.
상기 얻어진 신규한 메로터페노이드계 화합물들의 분자구조는 1H, 13C, COSY (correlated spectroscopy), HSQC (heteronuclear single quantum coherence), HMBC (heteronuclear multiple-bond correlation), NOESY (nuclear overhauser effect spectroscopy), ROESY (rotating-frame　nuclear overhauser effect　spectroscopy), CD (circular dichroism) 등의 1D 및 2D NMR (nuclear magnetic resonance)법 및 UV (ultraviolet-visible), IR (infrared), HRESIMS (high-resolution electrospray ionisation mass spectrometry), HRFABMS (high resolution fast-atom bombardment mass spectrometry) 등의 분광학적 방법으로 확인하였다.
(a) 메로터페노이드계 화합물 151 (austalide H)
하기 화합물151 (austalide H)은 Penicillium rudallense로부터 위의 방법에 따라 분리 정제하였다.
Figure 112019047095054-pat00018
무정형의 고체로 분리되었고, 분자식은 HRESIMS 데이터를 기초로 하여 C26H36O8로 결정되었다. UV 스펙트라의 최대 흡수 파장(λmax 223, 268 nm)은 프탈라이드(phthalide) 부분구조가 존재함을 보였다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 1개의 방향족 메틸(aromatic methyl) 그룹, 2개의 메톡시(methoxy) 그룹, 4개의 지방족(aliphatic) 그룹 등 총 7개의 메틸기 시그널을 확인하였다. 또한, 4개의 메틸렌(methylene)과 1개의 산화된 메틸렌(oxygenated methylene)을 확인하였고, 2개의 메틴(methine) 그룹과 1개의 산화된 메틴(oxygenated methine), 11개의 비양성자화 탄소(non-protonated carbon)를 확인하였다. 13C NMR 스펙트럼의 δ 176.5과 171.9에서 2개의 에스테르 카복실 탄소(ester carboxyl carbon)가 있음을 확인하였다. 상기 화합물 151의 NMR 데이터와 HMBC 시그널 확인을 통하여 고리구조를 확인하였고, 고리를 연결하여 사환구조를 결정하였다.
1H NMR (700 MHz, CD3OD) : δ 5.12 (s), 4.56 (br s), 4.05 (s), 3.68 (s), 3.06 (d, 18.5), 2.81 (dd, 18.5, 8.1), 2.47 (m), 2.43 (dd, 15.5, 2.4), 2.34 (m), 2.33 (m), 2.07 (s), 1.94 (dd, 15.5, 4.0), 1.83 (m), 1.78 (d, 8.1), 1.52 (d, 2.0), 1.45 (s), 1.24 (s), 1.42 (s), 0.98 (s); 13C NMR (175 MHz, CD3OD) : δ 176.5, 171.9, 159.7, 156.5, 147.5, 108.4, 117.4, 116.0, 78.4, 76.8, 70.0, 62.3, 52.2, 51.9, 46.0, 42.1, 41.5, 35.9, 32.9, 31.8, 30.1, 28.2, 21.8, 18.5, 10.8.
(b) 메로터페노이드계 화합물 152 (austalide W)
하기 화합물 152 (austalide W)은 Penicillium rudallense 로부터 위의 방법에 따라 분리 정제하였다.
Figure 112019047095054-pat00019
무정형의 고체로 분리되었고, 분자식은 HRFABMS 데이터를 기초로 하여 C25H32O6로 결정되었다. 산화된 메틴(oxygenated methine) (δ H 4.38, δC 68.5)과 메톡시(methoxy) 그룹 (δH 4.05, δC 62.3)을 제외하고는 화합물 157의 구조양상과 동일하였다. IR 스펙트라는 1748 cm- 1와 1700 cm-1에서 흡수를 보였으며, 이로부터 각각 에스테르 카보닐(ester carbonyl) 그룹과 케톤(ketone) 그룹이 존재함을 확인하였다. UV 스펙트라의 최대 흡수 파장(λmax 216, 267 nm)은 프탈라이드(phthalide) 부분구조가 존재함을 보였다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 상기 화합물 152의 오환구조를 확인하였다. NOE를 통해 H-13/H3-25, H-14/H3-25, H3-26/H3-27의 상대 배열(relative configuration)이 각각 11S*, 13R*, 14R*, 20S*, 21R* 임을 확인하였다.
1H NMR (700 MHz, CD3OD) : δ 5.23 (s), 4.38 (br s), 4.05 (s), 3.05 (d, 18.4), 2.90 (dd, 18.4, 8.1), 2.76 (ddd, 15.7, 13.7, 6.4), 2.48 (dd, 15.4, 2.5), 2.30 (ddd, 15.7, 5.1, 2.9), 2.12 (ddd, 13.4, 7.0, 3.6), 2.09 (s), 2.00 (dd, 15.4, 3.8), 1.72 (d, 8.1), 1.56 (br s), 1.52 (td, 13.4, 5.3), 1.36 (s), 1.24 (s), 1.17 (s), 1.06 (s); 13C NMR (175 MHz, CD3OD) : δ 218.9, 171.8, 159.6, 156.7, 147.6, 117.2, 116.2, 108.6, 78.6, 69.9, 68.5, 62.3, 56.4, 49.6, 48.0, 47.3, 41.4, 38.5, 35.2, 27.7, 26.7, 24.4, 19.0, 17.0, 10.8.
(c) 메로터페노이드계 화합물 153 (austalide L)
하기 화합물 153 (austalide L)은 Penicillium rudallense 로부터 위의 방법에 따라 분리 정제하였다.
Figure 112019047095054-pat00020
무정형의 흰색 고체로 분리되었고, 분자식은 HRESIMS 데이터를 기초로 하여 C25H32O6로 결정되었다. IR 스펙트라는 1700 cm-1에서 흡수를 보였으며, 이로부터 육원자 고리 내 카보닐(carbonyl) 그룹이 존재함을 확인하였다. UV 스펙트라의 최대 흡수 파장(λmax 221, 267 nm)은 프탈라이드(phthalide) 부분구조가 존재함을 보였다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 상기 화합물 153의 오환구조를 확인하였고, 1개의 방향족 메틸(aromatic methyl) 그룹, 1개의 메톡시(methoxy) 그룹, 4개의 지방족(aliphatic) 그룹 등 총 6개의 메틸기 시그널을 확인하였다. 또한, 5개의 메틸렌(methylene)과 1개의 산화된 메틸렌(oxygenated methylene)을 확인하였고, 1개의 메틴(methine) 그룹과 12개의 비양성자화 탄소(non-protonated carbon)를 확인하였다. 13C NMR 스펙트럼의 δ 169.3와 216.2에서 각각 1개의 에스테르 카복실 탄소(ester carboxyl carbon)와 카보닐 탄소(carbonyl carbon)가 존재함을 확인하였다. 중수소 치환 실험을 통하여 C-14에 하이드록시(hydroxy) 그룹이 존재함을 확인하였고, HMBC 시그널 확인을 통하여 고리구조를 확인하였고, 오환구조를 연결하여 구조를 결정하였다.
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) : δ 5.077 (s), 1.167 (s), 1.467 (ddd, 13.4, 4.0, 4.0), 1.747 (d, 12.9), 1.970-2.028 (m), 2.015 (s), 2.075 (ddd, 13.4, 13.4, 4.0), 2.156 (ddd, 13.4, 13.4, 4.0), 2.254 (dd, 7.0, 1.9), 2.736-2.829 (m), 4.064 (s), 0.781 (s), 1.092 (s), 1.128 (s); 13C NMR (125 MHz, chloroform-d) : δ 10.61, 18.04, 18.26, 21.62, 23.57, 24.19, 26.81, 33.06, 33.39. 33.3, 40.72, 41.23, 56.62, 61.85, 68.16, 76.12, 79.64, 107.23, 114.40, 115.84, 145.41, 155.29, 158.59, 169.35, 216.
(d) 메로터페노이드계 화합물 154 (13-deacetoxyaustalide I)
하기 화합물 154 (13-deacetoxyaustalide I)은 Penicillium rudallense 로부터 위의 방법에 따라 분리 정제하였다.
Figure 112019047095054-pat00021
무정형의 흰색 고체로 분리되었고, 분자식은 HRESIMS 데이터를 기초로 하여 C25H32O6로 결정되었다. IR 스펙트라는 1748 cm-1에서 흡수를 보였으며, 이로부터 에스테르 카보닐(ester carbonyl) 그룹이 존재함을 확인하였다. UV 스펙트라의 최대 흡수 파장(λmax 221, 267 nm)은 프탈라이드(phthalide) 부분구조가 존재함을 보였다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 화합물 154의 오환구조를 확인하였고, 1개의 방향족 메틸(aromatic methyl) 그룹, 1개의 메톡시(methoxy) 그룹, 4개의 지방족(aliphatic) 그룹 등 총 6개의 메틸기 시그널을 확인하였다. 또한, 5개의 메틸렌(methylene)과 1개의 산화된 메틸렌(oxygenated methylene)을 확인하였고, 2개의 메틴(methine) 그룹과 11개의 비양성자화 탄소(non-protonated carbon)를 확인하였다. 13C NMR 스펙트럼의 δ 175.2과 169.7에서 2개의 에스테르 카복실 탄소(ester carboxyl carbon)가 존재함을 확인하였고, HMBC 시그널 확인을 통하여 고리구조를 확인하였고, 오환구조를 연결하여 구조를 결정하였다.
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) : δ 5.12 (s), 2.24 (td, 2.7, 14.0), 1.66 (m), 1.92 (m), 1.54 (m), 1.84 (dd, 1.5, 13), 2.67 (ddd, 2.7, 10.9, 15.7), 2.59 (ddd, 2.7, 8.5, 15.7), 1.95 (m), 1.68 (m), 1.54 (d, 8.1), 2.95 (d, 18.5), 2.82 (dd, 8.0, 18.5), 2.05 (s), 1.20 (s), 1.41 (s), 1.51 (s), 0.82 (s), 4.12 (s); 13C NMR (125 MHz, chloroform-d) : δ 169.9, 158.9, 155.4, 145.4, 115.8, 114.1, 107.1, 78.9, 76.5, 68.3, 61.8, 54.2, 48.1, 40.4, 38.8, 38.2, 38.1, 28.5, 27.3, 27.1, 18.0, 17.9, 15.7, 14.3, 10.6.
(e) 메로터페노이드계 화합물 155 (austalide Q)
하기 화합물 155 (austalide Q)은 Penicillium rudallense 로부터 위의 방법에 따라 분리 정제하였다.
Figure 112019047095054-pat00022
무정형의 흰색 고체로 분리되었고, 분자식은 HRESIMS 데이터를 기초로 하여 C26H34O7로 결정되었다. UV 스펙트라의 최대 흡수 파장(λmax 222, 268 nm)은 프탈라이드(phthalide) 부분구조가 존재함을 보였다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 화합물 155의 구조를 확인하였고, 1개의 방향족 메틸(aromatic methyl) 그룹, 2개의 메톡시(methoxy) 그룹, 3개의 지방족(aliphatic) 그룹 등 총 6개의 메틸기 시그널을 확인하였다. 또한, 5개의 메틸렌(methylene)과 1개의 산화된 메틸렌(oxygenated methylene)을 확인하였고, 2개의 메틴(methine) 그룹과 1개의 산화된 메틴(oxygenated methine), 11개의 비양성자화 탄소(non-protonated carbon)를 확인하였다. 13C NMR 스펙트럼의 δ 178.1과 171.8에서 2개의 에스테르 카복실 탄소(ester carboxyl carbon)가 존재함을 확인하였고, NMR 데이터와 HMBC 시그널 확인을 통하여 고리구조를 확인하였고, 고리를 연결하여 사환구조를 결정하였다.
1H NMR (700 MHz, CD3OD) : δ 5.22 (s), 5.05 (d, 1.9), 4.97 (s), 4.06 (s), 4.06 (br s), 3.68 (s), 2.94 (d, 18.4), 2.86 (dd, 18.4, 7.8), 2.42 (dd, 15.3, 2.3), 2.37 (m), 2.21 (d, 2.0), 2.09 (s), 2.03 (dd, 15.3, 4.1), 1.82 (d, 7.8), 1.66 (m), 1.26 (s), 1.91 (s), 0.87 (s); 13C NMR (175 MHz, CD3OD) : δ 176.1, 171.8, 159.6, 156.7, 147.6, 147.0, 117.2, 116.2, 116.2, 108.6, 79.1, 72.1, 69.9, 62.3, 53.5, 52.2, 45.9, 40.7, 40.7, 36.1, 29.8, 27.9, 26.5, 20.8, 18.9, 10.8.
(f) 메로터페노이드계 화합물 156 (austalide P)
하기 화합물 156 (austalide P)은 Penicillium rudallense 로부터 위의 방법에 따라 분리 정제하였다.
Figure 112019047095054-pat00023
무정형의 흰색 고체로 분리되었고, 분자식은 HRESIMS 데이터를 기초로 하여 C26H36O7로 결정되었다. IR 스펙트라는 1748 cm-1에서 흡수를 보였으며, 이로부터 에스테르 카보닐(ester carbonyl) 그룹이 존재함을 확인하였다. UV 스펙트라의 최대 흡수 파장(λmax 223, 267 nm)은 프탈라이드(phthalide) 부분구조가 존재함을 보였다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 화합물 156의 구조를 확인하였고, 1개의 방향족 메틸(aromatic methyl) 그룹, 2개의 메톡시(methoxy) 그룹, 4개의 지방족(aliphatic) 그룹 등 총 7개의 메틸기 시그널을 확인하였다. 또한, 5개의 메틸렌(methylene)과 1개의 산화된 메틸렌(oxygenated methylene)을 확인하였고, 2개의 메틴(methine) 그룹과 11개의 비양성자화 탄소(non-protonated carbon)를 확인하였다. 13C NMR 스펙트럼의 δ 171.1과 177.7에서 2개의 에스테르 카복실 탄소(ester carboxyl carbon)가 존재함을 확인하였고, NMR 데이터와 HMBC 시그널 확인을 통하여 고리구조를 확인하였고, 고리를 연결하여 사환구조를 결정하였다.
1H NMR (500 MHz, Methanol-d) : δ 5.21 (s), 1.61 (dt, 3.8, 14.3), 1.52 (t, 10.7), 1.83 (m), 2.14 (dd, 3.4, 13.7), 2.32 (m), 2.60 (m), 1.80 (m), 2.42 (m), 1.70 (d, 8.1 ), 2.78 (dd, 8.1, 18.5), 3.03 (d, 18.6), 2.08 (s), 1.20 (s), 1.19 (s), 5.05 (d, 1.8), 1.27 (s), 0.70 (s), 3.68 (s), 4.04 (s); 13C NMR (150 MHz, Methanol-d) : δ 177.7, 172.1, 160.0, 158.1, 148.0, 118.0, 117.3, 108.0, 78.3, 75.7, 69.8, 62.1, 52.0, 41.6, 41.2, 40.2, 40.1, 34.9, 33.2, 30.0, 28.0, 27.9, 22.4, 19.5, 18.5, 10.6.
(g) 메로터페노이드계 화합물 157 (austalide K)
하기 화합물 157 (austalide K)은 Penicillium rudallense 로부터 위의 방법에 따라 분리 정제하였다.
Figure 112019047095054-pat00024
무정형의 고체로 분리되었고, 분자식은 HRFABMS 데이터를 기초로 하여 C25H32O5로 결정되었다. IR 스펙트라는 1748 cm- 1와 1700 cm-1에서 흡수를 보였으며, 이로부터 각각 에스테르 카보닐(ester carbonyl) 그룹과 케톤(ketone) 그룹이 존재함을 확인하였다. UV 스펙트라의 최대 흡수 파장(λmax 216, 267 nm)은 프탈라이드(phthalide) 부분구조가 존재함을 보였다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 화합물 157의 오환구조를 확인하였고, 1개의 방향족 메틸(aromatic methyl) 그룹, 1개의 메톡시(methoxy) 그룹, 4개의 지방족(aliphatic) 그룹 등 총 6개의 메틸기 시그널을 확인하였다. 또한, 5개의 메틸렌(methylene)과 1개의 산화된 메틸렌(oxygenated methylene)을 확인하였고, 2개의 메틴(methine) 그룹과 11개의 비양성자화 탄소(non-protonated carbon)를 확인하였다. 13C NMR 스펙트럼의 δ 169.6과 216.8에서 각각 에스테르 카복실 탄소(ester carboxyl carbon)와 카보닐 탄소(carbonyl carbon)가 존재함을 확인하였고, HMBC 시그널 확인을 통하여 고리구조를 확인하였고, 오환구조를 연결하여 구조를 결정하였다.
1H NMR (700 MHz, chloroform-d) : δ 5.12 (s), 4.11 (s), 1.48 (d, m), 1.49 (m), 2.29 (dt, 14.1, 2.80), 1.66 (td, 14.1, 4.3), 2.10 (ddd, 11.7, 7.0, 3.8), 1.51 (m), 2.53 (ddd, 16.1, 11.7, 7.0), 2.41 (ddd, 16.1, 6.4, 3.8), 1.19 (s), 1.12 (s), 1.03 (s), 1.81 (qd, 13.0, 3.5), 1.52 (m), 2.93 (d, 18.5), 2.81 (dd, 18.5, 8.1), 0.72 (s), 2.04 (s); 13C NMR (175 MHz, chloroform-d) : δ 216.8, 169.6, 158.8, 155.5, 145.7, 115.4, 114.6, 107.5, 76.3, 68.4, 62.1, 54.3, 47.4, 47.2, 39.9, 38.5, 37.8, 34.2, 27.2, 26.8, 21.8, 19.2, 18.4, 14.3, 10.8.
(h) 메로터페노이드계 화합물 158 (austalide X)
하기 화합물 158 (austalide X)은 Penicillium rudallense로부터 위의 방법에 따라 분리 정제하였다.
Figure 112019047095054-pat00025
무정형의 흰색 고체로 분리되었고, 분자식은 HRESIMS 데이터를 기초로 하여 C26H34O6로 결정되었다. UV 스펙트라의 최대 흡수 파장(λmax 223, 268 nm)은 프탈라이드(phthalide) 부분구조가 존재함을 보였다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 화합물 158의 구조를 확인하였고, 1개의 방향족 메틸(aromatic methyl) 그룹, 2개의 메톡시(methoxy) 그룹, 3개의 지방족(aliphatic) 그룹 등 총 6개의 메틸기 시그널을 확인하였다. 또한, 6개의 메틸렌(methylene)과 1개의 산화된 메틸렌(oxygenated methylene)을 확인하였고, 2개의 메틴(methine) 그룹과 11개의 비양성자화 탄소(non-protonated carbon)를 확인하였다. 13C NMR 스펙트럼의 δ 176.1과 171.8에서 2개의 에스테르 카복실 탄소(ester carboxyl carbon)가 존재함을 확인하였고, NMR 데이터와 HMBC 시그널 확인을 통하여 고리구조를 확인하였고, 고리를 연결하여 사환구조를 결정하였다.
1H NMR (700 MHz, CD3OD) : δ 5.22 (s), 4.90 (s), 4.70 (s), 4.05 (s), 3.68 (s), 2.90 (d, 18.3), 2.83 (dd, 18.3, 7.9), 2.46 (ddd, 15.5, 11.3, 4.9), 2.36 (ddd, 15.5, 11.1, 6.6), 2.23 (m), 2.15 (dt, 16.2, 3.4), 2.10 (qd, 13.4, 3.6), 2.07 (s), 1.75 (s), 1.73 (m), 1.73 (m), 1.70 (m), 1.65 (m), 1.43 (ddt, 13.4, 4.2, 2.4), 1.22 (s), 0.59 (s); 13C NMR (175 MHz, CD3OD) : δ 171.8, 160.4, 156.7, 148.5, 147.5, 117.1, 116.0, 114.6, 108.3, 78.2, 69.8, 62.3, 52.2, 50.9, 41.2, 40.3, 39.9, 34.6, 29.5, 27.5, 25.1, 24.0, 19.0, 18.8, 10.7.
(i) 메로터페노이드계 화합물 159 (austalide V)
하기 화합물 159 (austalide V)은 Penicillium rudallense로부터 위의 방법에 따라 분리 정제하였다.
Figure 112019047095054-pat00026
무정형의 흰색 고체로 분리되었고, 분자식은 HRFABMS 데이터를 기초로 하여 C24H30O5로 결정되었다. UV 스펙트라의 최대 흡수 파장(λmax 223, 267 nm)은 프탈라이드(phthalide) 부분구조가 존재함을 보였다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 한 개의 방향족 메틸(aromatic methyl) 그룹과 4개의 지방족(aliphatic) 메틸 그룹을 확인하였다. 그리고 6개의 메틸렌(methylene), 2개의 메틴(methine)을 확인하였다. HSQC 시그널을 통하여 3개의 지방족 4차 탄소(aliphatic quaternary carbon), 방향족 탄소(aromatic carbon), 케톤 카보닐(ketone carbonyl), 에스테르 카보닐(ester carbonyl) 그룹을 확인하였다. 분자식을 통해 화합물 159는 총 5개의 고리를 가지는 것으로 유추하였다. COSY와 HMBC 데이터를 통해 산화된 벤질릭 메틸렌(oxygenated benzylic methylene)이 방향족 탄소(aromatic carbone)와 에스테르 카보닐 탄소(ester carbonyl carbon)와 연결되어 있으며, 부분입체 이성질성 자리의 벤질릭 메틸렌(diastereotopic benzylic methylene)이 방향족 탄소(aromatic carbon)와 연결되어, 프탈라이드(phthalide) 부분구조를 가지는 것을 확인하였고, 오환구조를 연결하였다. 화합물 159의 상대 구조는 ROESY 스펙트럼을 분석하여 11S*, 14R*, 20S*, 21R*으로 결정하였고, CD 측정을 통하여 화합물 159의 절대구조를 11S, 14R, 20S, 21R로 확인하였다.
1H NMR (700 MHz, CD3OD) : δ 5.22(s), 2.89 (d, 18.3), 2.79 (dd, 18.3, 8.0), 2.56 (ddd, 16.2, 11.3, 7.2), 2.43 (ddd, 16.2, 6.8, 3.9), 2.26 (dt, 13.9, 2.9), 2.10 (ddd, 10.1, 7.1, 3.9), 2.03 (s), 1.83 (qd, 12.8, 3.4), 1.75 (td, 13.9, 4.1), 1.64 (d, 8.0), 1.60 (m), 1.57 (m), 1.21 (s), 1.12 (s), 1.03 (s), 0.74 (s); 13C NMR (175 MHz, CD3OD) : δ 219.7, 174.1, 160.7, 153.9, 145.5, 112.6, 111.0, 103.1, 77.7, 70.6, 55.0, 48.3, 47.9, 40.7, 39.3, 38.8, 35.1, 27.3, 27.2, 22.1, 20.2, 18.7, 14.7, 10.6.
(j) 메로터페노이드계 화합물 160 (austalide P acid)
하기 화합물 160 (austalide P acid)은 Penicillium rudallense로부터 위의 방법에 따라 분리 정제하였다.
Figure 112019047095054-pat00027
무정형의 흰색 고체로 분리되었고, 분자식은 HRESIMS 데이터를 기초로 하여 C25H36O7로 결정되었다. UV 스펙트라의 최대 흡수 파장(λmax 223, 268 nm)은 프탈라이드(phthalide) 부분구조가 존재함을 보였다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 화합물 160의 구조를 확인하였고, 1개의 방향족 메틸(aromatic methyl) 그룹, 1개의 메톡시(methoxy) 그룹, 4개의 지방족(aliphatic) 그룹 등 총 6개의 메틸기 시그널을 확인하였다. 또한, 5개의 메틸렌(methylene)과 1개의 산화된 메틸렌(oxygenated methylene)을 확인하였고, 2개의 메틴(methine) 그룹과 11개의 비양성자화 탄소(non-protonated carbon)를 확인하였다. 13C NMR 스펙트럼의 δ 172.0과 184.4에서 각각 에스테르 카복실 탄소(ester carboxyl carbon), 카복실릭 카보닐 탄소(carboxylic carbonyl carbon)가 있음을 확인하였고, NMR 데이터와 HMBC 시그널 확인을 통하여 고리구조를 확인하였고, 고리를 연결하여 사환구조를 결정하였다.
1H NMR (700 MHz, CD3OD) : δ 5.22 (s), 4.02 (s), 3.05 (d, 18.5), 2.77 (dd, 18.5, 7.9), 2.43 (m), 2.42 (m), 2.18 (m), 2.12 (dt, 14.0, 3.0), 2.06 (s), 1.86 (m), 1.83 (m), 1.74 (d, 7.9), 1.63 (m), 1.60 (m), 1.54 (m), 1.30 (s), 1.21 (s), 1.21 (s), 0.69 (s); 13C NMR (175 MHz, CD3OD) : δ 184.4, 172.0, 160.5, 156.5, 147.5, 117.4, 115.9, 108.2, 78.3, 76.0, 70.0, 62.2, 51.6, 42.9, 41.1, 40.4, 35.9, 33.3, 32.9, 28.2, 27.8, 22.8, 19.7, 18.8, 10.7.
(k) 메로터페노이드계 화합물 161 (17S-dihydroaustalide K)
하기 화합물 161 (17S-dihydroaustalide K)은 Penicillium rudallense 로부터 위의 방법에 따라 분리 정제하였다.
Figure 112019047095054-pat00028
무정형의 흰색 고체로 분리되었고, 분자식은 HRESIMS 데이터를 기초로 하여 C25H34O5로 결정되었다. UV 스펙트라의 최대 흡수 파장(λmax 223, 266 nm)은 프탈라이드(phthalide) 부분구조가 존재함을 보였다. 1D 및 2D NMR 스펙트라를 바탕으로 화합물 161의 오환구조를 확인하였고, 1개의 방향족 메틸(aromatic methyl) 그룹, 1개의 메톡시(methoxy) 그룹, 4개의 지방족(aliphatic) 그룹 등 총 6개의 메틸기 시그널을 확인하였다. 또한, 5개의 메틸렌(methylene)과 1개의 산화된 메틸렌(oxygenated methylene)을 확인하였고, 2개의 메틴(methine) 그룹과 1개의 산화된 메틴(oxygenated methine), 10개의 비양성자화 탄소(non-protonated carbon)를 확인하였다. 13C NMR 스펙트럼의 δ 169.9에서 에스테르 카복실 탄소(ester carboxyl carbon)가 있음을 확인하였고, HMBC 시그널 확인을 통하여 고리구조를 확인하고, 오환구조를 연결하여 구조를 결정하였다.
1H NMR (500 MHz, chloroform-d) : δ 5.11 (s), 2.27 (m), 2.24 (m), 1.64 (m), 1.60 (m), 0.93 (d, 11.5), 3.24 (dd, 4.5, 11.7), 1.57 (m), 1.68 (m), 1.91 (m), 0.88 (m), 1.39 (d, 8.8), 2.91 (d, 18.6), 2.73 (dd, 8.3, 18.6), 2.03 (s), 1.16 (s), 0.78 (s), 1.03 (s), 0.61 (s), 4.10 (s); 13C NMR (125 MHz, chloroform-d) : δ 175.2, 169.7, 158.4, 155.5, 145.9, 115.3, 114.2, 107.6, 85.9, 76.1, 68.3, 62.2, 54.0, 47.5, 40.6, 39.5, 37.4, 32.5, 31.8, 27.3, 25.8, 22.3, 18.7, 16.8, 10.7.
[실시예 2] 파골세포의 배양 및 분화
5주령 생쥐의 넙다리뼈와 정강뼈를 분리하고 뼈속질 공간을 1 cc 주사기로 수세하여 골수세포를 얻었다. 분리된 골수세포는 10 % FBS, 항생제, M-CSF (30 ng/㎖)가 포함된 α-minimum essential medium (α-MEM)배지에서 3일 간 배양하였다. 3일 후, 부착된 세포를 포식세포(bone marrow macrophage, BMM)로 사용하였다. 포식세포는 M-CSF (30 ng/㎖)와 RANKL (10 ng/㎖)을 첨가하여 배양하고 메로터페노이드계 화합물을 농도별로 처리하였다. 4일 후, 배양한 세포는 TRAP (tartarate resistance acid phosphatase) 용액(Sigma Aldrich, USA)으로 염색하고 붉은색으로 염색된 세포는 파골세포로 간주하였다.
[실시예 3] TRAP (tartarate resistance acid phosphatase) 염색 및 활성도 분석
다핵 파골세포는 10분 동안 3.7 % 포르말린으로 고정하고 10분간 0.1 % Triton X-100으로 세포막의 투과성이 높아지면 TRAP 용액의 처리에 의해 붉게 염색된다. 붉게 염색된 파골세포는 3개 이상의 핵을 갖는 것만 파골세포로 인정하였다. TRAP 활성도는 TRAP이 염색된 파골세포에 3 mM p-nitrophenyl phosphate (Sigma-Aldrich)가 함유된 TRAP 완충용액(100 mM sodium citrate pH 5.0, 50 mM sodium tartrate)을 처리하여 37 ℃에서 5분간 반응시키고 반응된 상층액을 새로운 플레이트에 옮긴 후 0.1 N NaOH를 동량으로 첨가해 405 nm에서 흡광도를 확인하였다.
그 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 메로터페노이드계 화합물(152, 153, 154, 156, 157, 159, 161)을 처리하면 농도 의존적으로 TRAP 활성도를 억제하면서 붉게 염색된 파골세포 수를 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다. 특히, 메로터페노이드계 화합물(152, 153, 154, 156, 157, 159, 161)은 3 μM 이상의 농도에서 TRAP 활성을 현저히 감소시켜 파골세포의 수를 현저하게 감소시킴을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 메로터페노이드계 화합물은 파골세포의 분화를 효과적으로 억제하므로 골다공증과 같은 골 질환에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 4] 세포독성 분석
포식세포는 1 × 104 cells/well의 밀도로 96-well plate에서 메로터페노이드계 화합물, 그리고 M-CSF (30 ng/㎖)를 첨가하여 3일간 배양하였다. 3일 후, CCK 용액 50 ㎕를 각각의 well에 첨가하고 4시간 배양 후 ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.
그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 대조군의 생존률 100%에 대하여, 메로터페노이드계 화합물 157을 농도별로 처리하여도 세포 생존률이 크게 감소하지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 메로터페노이드계 화합물은 세포독성이 거의 없는 것을 확인하였다.
[실시예 5] RT-PCR 분석
파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커들의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였고, 구체적으로 NFATc1, TRAP, DC-STAMP 및 Cathepsin K의 양상을 확인하였다. 먼저 RANKL을 처리하여 파골세포의 분화를 유도하고 난 다음, 메로터페노이드계 화합물을 처리하였으며, 실험을 실시하기 위한 RNA는 상기 실시예 2에서 배양한 세포들에서 TRIzol (Invitrogen) 용액으로 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 1 ㎍은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 프라이머를 이용하여 SYBR green을 이용한 real-time PCR 증폭으로 결과를 얻었다.
그 결과, 파골세포의 분화를 유도하는 RANKL은 시간이 지날수록 TRAP의 유전자 발현을 증가시켰으나, 메로터페노이드계 화합물 157은 TRAP 유전자 발현 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 3). 또한, 파골세포의 분화를 유도하는 RANKL 처리시 모든 마커들의 발현 양상이 증가하는 반면, 본 발명에 따른 메로터페노이드계 화합물 157을 처리한 경우, 증가한 파골세포 분화 마커들의 발현을 현저하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(도 4).
[실시예 6] 웨스턴 블롯 분석
파골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커 NFATc1의 단백질 발현 양상을 확인하고, 메로터페노이드계 화합물이 어느 경로를 경유하여 파골세포의 분화에 작용하는 것인지를 확인하기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다.
구체적으로 실시예 2에서 배양한 세포는 용해 버퍼(50 mM tris-Cl, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 1 mM sodium fluoride, 1 mM sodium vanadate, 1 % deoxycholate, and protease inhibitors)를 이용하여 용해하였고, 원심분리(14,000 rpm)를 수행하여 순수한 단백질을 얻었다. 단백질은 DC Protein assay kit (BioRad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 정량하고 동량의 단백질은 10 % SDS-polyacrilamide gel에서 분리하였다. 분리된 단백질은 PVDF 막 (Amersham Biosciences)으로 옮기고 항체를 이용하여 단백질 발현 정도를 확인하였다.
그 결과, 도 5에 도시된 바와 같이 NFATc1의 단백질 발현은 RANKL의 처리로 증가하였으며, 메로터페노이드계 화합물, 특히 화합물 157의 처리로 3일차에서 유의하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
[실시예 7] 조골세포의 배양 및 분화
C2C12 세포는 10 % FBS (fetal bovine serum), 항생제 및 α-minimum essential medium (α-MEM)이 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 배양하였다. 1일 후, 세포는 10 % FBS, rh-BMP2 (100 ng/mL)을 첨가하여 분화시켰다. 그리고 메로터페노이드계 화합물 157을 농도별로 처리하였다. 배지는 매 3일마다 교환하여 주었다.
[실시예 8] ALP (Alkaline phosphatase) 염색 및 활성도 분석
조골세포는 30초 동안 10 % 포르말린으로 고정하고 PBS (phosphate-buffered saline)으로 두 번 세척하였다. 증류수로 한번 더 세척한 후에 암실에서 ALP 염색 kit (Sigma-Aldrich)를 사용하여 염색하였다.
도 6에 도시된 바와 같이 BMP-2만 넣은 것에 비해 메로터페노이드계 화합물 157을 4일간 처리하면 농도 의존적으로 조골세포가 더 많이 생긴 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 메로터페노이드계 화합물은 조골세포의 분화를 효과적으로 증가시키므로 골다공증과 같은 골 질환에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
[실시예 9] 세포독성 분석
C2C12 세포를 4 × 103 cells/well의 밀도로 96-well plate에서 메로터페노이드계 화합물을 첨가하여 배양하였다. 3일 후, Cell Counting Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, ML)를 사용하여 ELISA reader (Molecular Devices, CA, USA)로 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.
그 결과, 도 7에 도시된 바와 같이 아무것도 처리하지 않은 대조군의 생존률 100 %에 대하여, 메로터페노이드계 화합물 157을 농도별로 처리하여도 세포 생존률이 크게 감소하지 않았다.
따라서, 본 발명에 따른 메로터페노이드계 화합물은 세포독성이 거의 없는 것을 확인하였다.
[실시예 10] RT-PCR 분석
조골세포의 분화 과정에 관여하는 핵심적인 분화 마커들의 mRNA 발현 양상을 확인하기 위하여 RT-PCR 분석을 수행하였고, 구체적으로 ALP, Runx2, OCL 및 OPN의 유전자 발현 양상을 확인하였다. 실험을 실시하기 위하여 RNA는 상기 실시예 7의 조건에서 메로터페노이드계 화합물을 농도별로 처리한 세포들과 메로터페노이드계 화합물을 3일간 및 6일간 처리한 세포들을 TRIzol (Invitrogen) 용액으로 제조사의 방법에 따라 분리하였다. 분리한 RNA 1 ㎍은 oligo dT primer, dNTP, buffer, dithiothreitol, RNase inhibitor와 Superscript II reverse transcriptase를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 합성된 cDNA는 프라이머를 이용하여 SYBR green을 이용한 real-time PCR 증폭으로 결과를 얻었다.
그 결과, 메로터페노이드계 화합물 157의 처리 6일차에서 조골세포의 분화 마커인 ALP의 발현 및 메로터페노이드계 화합물 157의 처리 3일 및 6일차에서 또 다른 분화 마커인 Runx2, OCL과 OPN 유전자의 발현이 유의미하게 증가됨을 확인하였다(도 8 내지 도 10).
[실시예 11] 마우스 대퇴골 모델을 이용한 in vivo 실험 (LPS induced bone erosion 실험)
마우스 대퇴골의 bone erosion을 유도하기 위해 LPS (lipopolysaccharide; 5 mg/kg of body weight)를 마우스 복강 내 주사(intraperitoneal)하였다. 본 발명에 따른 메로터페노이드계 화합물 157 (2 또는 4 mg/kg of body weight)은 5 % Kolliphor EL (in PBS(phosphate buffer saline))에 녹여서 사용하였다. LPS에 의한 born erosion이 유도된 마우스는 메로터페노이드계 화합물 157을 7일 동안 매일 1회 복강 투여하였다. 대조군에는 PBS(phosphate buffer saline)가 투여되었다. 메로터페노이드계 화합물 157의 투여 7일 후에 골 소실 정도를 측정하기 위해 마우스를 부검하였다(n=6). 대퇴골의 골 소실 측정은 micro-CT를 이용하여 사진을 촬영하였다.
그 결과, 도 11에 도시된 바와 같이, 메로터페노이드계 화합물 157은 2 mg/kg에서 LPS에 의한 마우스 대퇴골의 골 소실을 크게 감소시켰다. 또한, 메로터페노이드계 화합물은 투여량 4 mg/kg에서는 2 mg/kg보다 더 크게 감소시키는 경향을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 메로터페노이드계 화합물은 투여량 의존적으로 골 소실을 감소시킴을 확인하였다.
또한, 도 12에 도시된 바와 같이, 메로터페노이드계 화합물 157은 (1) LPS 유도에 의한 골 밀도(bone mineral density) 감소를 3배 이상 회복시켰고; (2) LPS 유도에 의한 해면골(trabecular) 손상을 현저히 회복시켰고; (3) LPS유도에 의한 뼈 부피(bone volume) 감소를 3배 이상 크게 회복시켰고; (4) 해면골 두께를 다소 회복 및 증가시켰음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 메로터페노이드계 화합물은 LPS에 의한 마우스 대퇴골의 골 소실을 효과적으로 감소시키므로 골다공증과 같은 골 질환에 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure 112020140183744-pat00029

    상기 화학식 1에서,
    R1은 수소, 하이드록시 또는 아세톡시이고;
    Figure 112020140183744-pat00030
    는 하기 구조에서 선택되고;
    Figure 112020140183744-pat00031

    R5는 수소, 메톡시, 아세톡시 또는 하이드록시이고;
    R6은 수소 또는 메틸이다.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 메로터페노이드계 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 것인, 골다공증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure 112019047095054-pat00032

    상기 화학식 2에서,
    R1은 수소 또는 하이드록시이고;
    Figure 112019047095054-pat00033
    는 하기 구조에서 선택되고;
    Figure 112019047095054-pat00034

    R6은 수소 또는 메틸이다.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 메로터페노이드계 화합물은 하기 구조에서 선택되는 어느 하나 이상인, 골다공증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물:
    Figure 112019047095054-pat00035

    상기 R1은 수소 또는 하이드록시이고; R6은 수소 또는 메틸이다.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 메로터페노이드계 화합물은 곰팡이 Penicillium rudallense의 추출물로부터 수득되는 것인, 골다공증 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  5. 하기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 골다공증 예방 또는 개선용 기능성 식품 보조제, 기능성 음료, 식품첨가물 또는 동물용 사료용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112020140183744-pat00036

    상기 화학식 1에서,
    R1은 수소, 하이드록시 또는 아세톡시이고;
    Figure 112020140183744-pat00037
    는 하기 구조에서 선택되고;
    Figure 112020140183744-pat00038

    R5는 수소, 메톡시, 아세톡시 또는 하이드록시이고;
    R6은 수소 또는 메틸이다.
  6. 하기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 파골세포의 분화를 억제하는 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112020140183744-pat00039

    상기 화학식 1에서,
    R1은 수소, 하이드록시 또는 아세톡시이고;
    Figure 112020140183744-pat00040
    는 하기 구조에서 선택되고;
    Figure 112020140183744-pat00041

    R5는 수소, 메톡시, 아세톡시 또는 하이드록시이고;
    R6은 수소 또는 메틸이다.
  7. 하기 화학식 1로 표시되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염을 유효성분으로 포함하는 조골세포의 분화를 촉진하는 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112020140183744-pat00042

    상기 화학식 1에서,
    R1은 수소, 하이드록시 또는 아세톡시이고;
    Figure 112020140183744-pat00043
    는 하기 구조에서 선택되고;
    Figure 112020140183744-pat00044

    R5는 수소, 메톡시, 아세톡시 또는 하이드록시이고;
    R6은 수소 또는 메틸이다.
  8. 삭제
  9. 하기에서 선택되는 메로터페노이드계 화합물, 그의 수화물, 그의 용매화물, 그의 입체 이성체 또는 그의 약학적으로 허용 가능함 염:
    Figure 112020140183744-pat00048
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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J. Nat. Prod. 2014, 77, 6, 1390-1395
J. Org. Chem. 2019, 84, 9, 4961-4970
Journal of Natural Products, Vol. 2014, 77, pp. 1390-1395(2014.05.22.) 1부.*
Mar. Drugs 2016, 14(7), 131
Phytochemistry Letters, Vol. 15, pp. 7-12(2015.11.21.) 1부.*
Phytochemistry Letters, Volume 15, Pages 7-12
Studies in Mycology, Vol. 78, pp. 373-451(2014.09.22.) 1부.*

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