KR101332074B1

KR101332074B1 - 에스큘레틴을 유효성분으로 함유하는 골 손실 억제용 조성물

Info

Publication number: KR101332074B1
Application number: KR1020120076532A
Authority: KR
Inventors: 최순영; 윤유나; 정유선; 이명석
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단
Priority date: 2011-07-14
Filing date: 2012-07-13
Publication date: 2013-11-22
Also published as: KR20130009685A

Abstract

본 발명은 에스큘레틴을 유효성분으로 함유하는 골 손실 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 에스큘레틴은 RANKL의 자극에 인해 유발되는 파골세포 형성을 억제하는 효과가 있으며, 이렇게 파골세포 형성을 억제시킴으로써 궁극적으로 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하는 효과를 갖게 된다. 더욱 자세하게는, 본 발명에 따른 에스큘레틴은 RANKL의 자극에 의해 유도된 분자적 신호경로(signal pathway)에서 파골세포 분화를 조절할 수 있는 핵심 전사인자인 NFAT의 발현을 억제하는 기전을 통하여 파골세포의 분화를 억제시키는 효과를 갖는다. 따라서 상기와 같은 효과를 갖는 에스큘레틴을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 골 손실로 일어나는 골대사 질환 예방 또는 치료에서 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 골 손실에 따른 골다공증 개선 및 치료하기 위한 용도로 널리 사용할 수 있다.

Description

에스큘레틴을 유효성분으로 함유하는 골 손실 억제용 조성물{Composition Comprising Esculetin for Inhibition of Bone Loss}

본 발명은 골 손실을 효과적으로 개선시킬 수 있는 조성물에 관한 것으로서, 에스큘레틴(esculetin)을 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 조성물에 관한 것이다.

뼈(bone)는 인체의 연조직과 체중을 지탱해주고 내부기관을 둘러싸서 내부 장기를 외부의 충격으로부터 보호한다. 또한 근육이나 장기를 구조적으로 지탱할 뿐만 아니라 체내의 칼슘이나 다른 필수 무기질 즉 인이나 마그네슘과 같은 물질을 저장하는 인체의 중요한 부분 중 하나이다. 따라서 성장이 끝난 성인의 뼈는 멈추지 않고 죽는 날까지 오래된 뼈는 제거하고 새로운 뼈로 대체하는 생성과 흡수과정을 매우 역동적, 지속적으로 반복 재생하면서 균형을 유지하게 된다. 이를 뼈의 재형성(bone remodeling)이라고 한다. 이러한 뼈의 재형성은 성장과 스트레스에 의해서 일어나는 뼈의 미세한 손상을 회복시키고 적절히 뼈의 기능을 유지하는데 필수적이다.

뼈의 재형성에는 크게 두 종류의 세포가 관여하는 것으로 알려져 있다. 두 세포 중 하나는 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)이고, 다른 하나는 뼈를 파괴하는 파골세포(osteoclast)이다. 조골세포는 RANKL(receptor activator of NF-κB ligand: 이하 간략하게 ‘RANKL’이라 함)과 이것의 유도 수용체(decoy receptor)인 OPG(osteoprotegerin)를 생성한다. RANKL이 파골 전구세포(osteoclast progenitor cells) 표면에 있는 수용체인 RANK(receptor activator of NF-κB: 이하 간략하게 ‘RANK'라 함)에 결합하면 파골 전구세포가 파골세포로 분화되어 골 흡수(resorption)가 일어난다. 자세하게는 RANKL 자극에 의한 세포내 칼슘 신호 전달로 파골 전구세포에서 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자로 알려져 있는 NFAT(nuclear factor of activated T cells: 이하 간단하게 ‘NFAT'라 함)의 발현이 유도되고, 그 후 세포외 신호조절인산화효소(extracellular signal-regulated kinase: 이하 간단하게 ‘ERK'라 함), NF-κB, p38 MAP kinase 등의 활성화가 NFAT의 자가증폭(autoamplification)을 유발하여 활성이 지속되는 것이다.

따라서 오래된 뼈의 흡수 또는 파괴는 상기와 같은 기작을 통해 파골세포에 의해 이루어지며, 이는 뼈에 구멍을 내어 적은 양의 칼슘이 혈류로 방출되어 신체기능을 유지하는데 사용된다(William J. et al., NATURE., 423, pp.337342, 2033). 파골세포는 실제적인 뼈의 흡수작용을 할 때는 다핵세포로 융합된 후 그 구조가 변하여 주름진 테두리를 형성하며, 골 기질 표면에 흡착하여 산성화 환경에서 카텝신(cathepsin) K 나 H+-ATPase 등 많은 효소의 작용으로 뼈를 흡수한다. 이에 반해, 조골세포는 교원질로 구멍을 채우고 칼슘과 인의 침적물(hydroxyapatite)을 덮어서 단단한 새로운 뼈를 만들어 골격을 재건하게 된다.

성인의 경우 매년 골격의 약 10-30%가 이런 과정을 통하여 재형성되며, 파골속도와 조골속도가 동일해야만 전과 같은 골밀도를 유지할 수 있다. 정상 성인에서는 골흡수 양과 골형성 양 사이에는 항상 균형이 유지되고 있다. 이와 같이 중요한 뼈에 균형이 깨질 경우 많은 질병이 야기될 수 있는데, 이러한 질환을 하기에서는 ‘골대사 질환’이라 하였다.

골대사 질환 중 고령사회에서 큰 문제로 대두되고 있는 골다공증은 골의 화학적 조성에는 큰 변화 없이 단위 용적내의 골량이 감소하여 경미한 충격에도 쉽게 골절을 일으킬 수 있는 질환이다. 노인 특히 폐경 후 여성들의 경우 에스트로겐의 분비부족으로 인하여 가장 그 발생빈도가 높게 나타난다고 알려져 있다. 현재 에스트로겐이나 천연에 존재하면서 약한 에스트로겐 활성을 나타내는 식물 유래의 피토에스트로겐이 폐경 후 골다공증 예방에 매우 유용하다는 연구가 보고되었다. 그러나 이러한 방법은 폐경성 골다공증 이외의 원인에는 제한적으로 사용된다는 한계점을 가진다. 이 밖에 칼슘염, 우골분 등의 칼슘 보강제, 비타민 D 대사산물 요법 등이 비 폐경성 골다공증 치료에 이용되고 있으나, 이들은 용해성이나 흡수성, 미각적 측면에서 문제점을 가지고 있다. 또한 약물 투여에는 비스포스포네이트 (bisphosphonates)나 칼시토닌 제제 등이 사용되며 골다공증의 치료에 유효하다고 알려져 있으나, 이러한 약물은 전문의약품이고, 식도에 협착될 수 있는 등의 부작용이 있어 복용에 매우 주의를 요하며, 이명, 두통, 식욕 부진 등의 부작용도 나타낼 수 있다고 보고된 바 있다.

한편 매실, 레몬, 인진쑥 등을 포함한 다양한 식물에 많이 함유되어 있는 쿠마린(coumarin) 유도체인 에스큘레틴(6,7-dihydroxycoumarin)은 혈소판응집과 잔틴 옥시데이스(Xanthin oxidase) 활성 억제, N-메틸-N-니트로소유레아(N-methyl-N-nitrosourea)에 의해 의하여 유도된 유방암 및 benzo[a]pyrene plus 4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone에 의하여 유도된 폐암의 억제효과를 가지는 등 약리학 및 생화학적 활성이 뛰어난 것으로 보고되어지고 있다. 그러나 이러한 에스큘레틴 화합물이 골 손실과 관련한 질환 치료에 효과를 가진다는 내용에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다.

이에 본 발명자들은 에스큘레틴 화합물이 골 손실을 억제함으로써 골 손실에 따른 질환 치료에 효과가 있는지 연구하던 중, 본 화합물이 RANKL에 의한 파골세포 분화를 억제하는 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 파골세포 형성 억제효과가 우수한 에스큘레틴 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골 손실 억제용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 파골세포 형성 억제효과가 우수한 에스큘레틴 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골 손실 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 에스큘레틴(esculetin) 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골 손실 억제용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화합물은 파골세포 형성 억제 효능을 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 파골세포 형성 억제는 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 NFAT의 발현을 억제하는 기전을 통하여 파골세포의 분화를 억제시키는 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 골 손실 억제를 통해 치료할 수 있는 질환은 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증 및 퇴행성 골질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.

또한, 본 발명은 에스큘레틴(esculetin) 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골 손실 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종일 수 있다.

본 발명에 따른 에스큘레틴은 RANKL의 자극에 인해 유발되는 파골세포 형성을 억제하는 효과가 있으며, 이렇게 파골세포 형성을 억제시킴으로써 궁극적으로 파골세포에 의한 골 흡수를 억제하는 효과를 갖게 된다. 더욱 자세하게는, 본 발명에 따른 에스큘레틴은 RANKL의 자극에 의해 유도된 분자적 신호경로(signal pathway)에서 파골세포 분화를 조절할 수 있는 핵심 전사인자인 NFAT의 발현을 억제하는 기전을 통하여 파골세포의 분화를 억제시키는 효과를 갖는다. 따라서 상기와 같은 효과를 갖는 에스큘레틴을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 골 손실로 일어나는 골대사 질환 예방 또는 치료에서 유용하게 사용될 수 있으며, 특히 골 손실에 따른 골다공증 개선 및 치료하기 위한 용도로 널리 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 에스큘레틴 화합물의 처리에 따른 BMM 세포 생성 억제(파골세포 형성 억제)정도를 TRAP 염색을 통해 나타낸 사진이다.
도 2는 본 발명의 에스큘레틴 화합물의 처리에 따른 BMM 세포 생성 억제(파골세포 형성 억제)정도를 TRAP 활성을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 에스큘레틴 화합물의 처리에 따른 세포 생존률을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 에스큘레틴 화합물의 처리에 따른 파골세포 특이적 마커 유전자(CathepsinK, MMP9, TRAP, V-ATPase, C-Fos, NEATc1, c-SRC)의 발현량을 측정하기 위하여 역전사-중합효소연쇄반응법(RT-PCR)을 수행한 결과이다.
도 5는 본 발명의 에스큘레틴 화합물의 처리에 따른 파골세포 발생의 전사 인자의 발현에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 에스큘레틴 화합물 처리에 따른 파골세포 발생의 신호 분자의 활성화에 미치는 영향을 나타내는 도면이다.
도 7은 성숙한 파골세포의 뼈 흡수 활성에 미치는 본 발명의 에스큘레틴 화합물의 영향을 나타내는 도면이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 에스큘레틴(esculetin) 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골 손실 억제용 조성물을 제공함에 그 특징으로 한다.

<화학식 1>

본 발명의 에스큘레틴 화합물은 매실, 레몬, 인진쑥 등을 포함한 다양한 식물에 많이 함유되어 있는 쿠마린(coumarin) 유도체로서, 6,7-Dihydroxycoumarin으로 명명되며, 이 물질의 분자식은 C₉H₆O₄이고, 분자량은 178.14이다.

본 발명에 따른 상기 에스큘레틴 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있는데, 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하며, 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 에스큘레틴 화합물은 천연으로부터 분리되거나 또는 당업계에 공지된 화학적 합성법으로 제조하여 사용할 수 있으며, 시중에서 판매되고 있는 에스큘레틴 화합물이라면 모두 사용 가능하다.

본 발명의 에스큘레틴 화합물을 천연으로부터 분리할 경우, 종래의 물질을 추출 및 분리하는 방법을 사용하여 에스큘레틴을 함유하고 있는 모든 종류의 식물로부터 수득할 수 있는데, 즉, 적절한 용매를 사용하여 식물의 추출물을 수득한 다음, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 상기 추출물로부터 에스큘레틴을 정제할 수 있다.

또한, 상기 추출을 위한 적절한 용매로는 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 식물 추출물로부터 에스큘레틴 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그래피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그래피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 에스큘레틴 화합물은 순수하게 분리·정제된 화합물의 형태로 사용될 수 있으며, 또한 이를 함유하는 추출물의 형태로도 사용될 수 있다.

본 발명의 하기 실시예에서는 Sigma-Aldrich에서 판매하고 있는 에스큘레틴 화합물을 구입하여 사용하였다.

한편, 쿠마린(coumarin) 유도체인 에스큘레틴 화합물은 혈소판응집과 잔틴 옥시데이스(Xanthin oxidase) 활성 억제, N-메틸-N-니트로소유레아(N-methyl-N-nitrosourea)에 의해 의하여 유도된 유방암 및 benzo[a]pyrene plus 4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone에 의하여 유도된 폐암의 억제효과를 가지 는 등 약리학 및 생화학적 활성이 뛰어난 것으로 알려져 있다. 그러나 이러한 에스큘레틴 화합물이 골 손실과 관련한 질환 치료에 효과를 가진다는 내용에 대해서는 전혀 보고된 바가 없다.

본 발명에서는 상기 에스큘레틴 화합물이 우수한 파골세포의 형성 억제 활성을 가지고 있다는 사실을 확인함으로써, 파골세포의 형성에 의해 유발될 수 있는 골 손실 질환 개선 및 치료에 유용하다는 사실을 최초로 규명하였다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 에스큘레틴 화합물은 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 NFAT의 발현을 억제하는 기전을 통하여 파골세포의 분화를 효과적으로 억제할 수 있는 특징이 있다.

하기 실시예<1-2>에서는 파골세포 분화인자인 RANKL를 마우스 골수세포에 처리하여 파골세포 형성을 유도하는 과정에서, 본 발명의 에스큘레틴 화합물을 첨가한 처리군의 경우 에스큘레틴 농도 의존적으로 파골세포 형성이 억제(BMM 세포 생성 억제)되는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 에스큘레틴 화합물이 파골세포 형성을 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.

또한, 하기 실시예<1-4>에서는 파골세포 분화인자인 RANKL를 마우스 골수세포에 처리하여 파골세포 분화를 유도하는 과정에서, 본 발명의 에스큘레틴 화합물을 첨가한 처리군의 경우 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 NFAT의 발현을 억제할 수 있는지 실험하였는데, 그 결과 본 발명의 에스큘레틴 화합물을 처리한 처리군에서 NFATc1의 발현량이 확실히 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 에스큘레틴 화합물이 NFAT의 발현을 억제하는 기작을 가지며, 이러한 기작으로 파골세포 분화가 억제되는 것을 유추할 수 있었다.

따라서 상기와 같은 특징을 갖는 에스큘레틴 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 파골세포의 형성(분화) 억제를 통하여 골 손실로 인해 발생되는 골대사 질환 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 골대사 질환으로는 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증, 퇴행성 골질환등과 같은 질환일 수 있으나, 가장 바람직하게는 골 손실에 따른 골다공증일 수 있다.

그러므로 본 발명은 에스큘레틴을 유효성분으로 포함하는 골 손실 억제용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 약제학적 조성물이나 식품 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 에스큘레틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 에스큘레틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

본 발명의 식품 조성물은 유효성분인 에스큘레틴 화합물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 에스큘레틴 화합물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

본 발명의 유효성분인 에스큘레틴 화합물은 천연유래물질로서 독성 및 부작용은 거의 없으므로 골 손실로 인해 발생되는 골대사 질환 예방 또는 치료 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 에스큘레틴 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골 손실 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 건강기능식품은 골강화 또는 골 손실 개선을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 “건강기능식품”이라 함은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 에스큘레틴 화합물(또는 그의 염)을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 에스큘레틴 화합물(또는 그의 염)을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 에스큘레틴 화합물(또는 그의 염)을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 에스큘레틴 화합물(또는 그의 염)과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 에스큘레틴 화합물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 에스큘레틴 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 골 손실을 억제하므로 골 손실로 야기되는 골대사 질환 예방 또는 개선에 효과적이다. 본 발명의 골대사 질환은 골대사와 관련된 질환이면 이의 종류를 특별히 한정하는 것은 아니나, 본 발명의 일실시예에 따르면 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증, 퇴행성 골질환등과 같은 질환일 수 있으나, 가장 바람직하게는 골 손실에 따른 골다공증일 수 있다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

본 발명은 또한 골 손실 억제용 의약 또는 식품의 제조를 위한 에스큘레틴을 유효성분으로 포함하는 조성물의 용도를 제공한다. 상기한 에스큘레틴을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 골 손실과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 의약 또는 식품의 제조를 위한 용도로 이용될 수 있다.

또한 본 발명은 포유동물에게 에스큘레틴 화합물을 투여하는 것을 포함하는 골 손실에 의한 골대사 질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.

여기에서 사용된 용어 "포유동물"은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

여기에서 사용된 용어 "치료상 유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다. 본 발명의 유효 성분에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 치료방법에 있어서, 성인의 경우, 본 발명의 에스큘레틴 화합물을 1일 1회 내지 수회 투여시, 1㎎/kg~250㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 치료방법에서 본 발명의 에스큘레틴 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 경구, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

본 발명의 실시예를 위해 사용한 시약 및 이들의 구입처는 다음과 같다.

대식세포증식자극인자(macrophage colony stimulating factor : 이하 간략하게 ‘M-CSF’이라 함)는 R&D system (Minneapolis, MN, USA)로부터 구입하였다. RANKL은 Dr. Lee(University of Ewha Women's University, Korea)로부터 제공받았다. 에스큘레틴은 sigma Aldrich로 부터 구입하였으며, DMSO(dimethylsulfoxide)에 녹여 최종 DMSO 농도가 0.1%가 되게 하였다.

< 실시예 1>

에스큘레틴에 의한 파골세포 분화 억제 효과 ( in vitro )

<1-1> 마우스 골수 단핵세포의 배양 및 파골세포 형성 유도

골수세포는 4주령 C57BL/6 수컷 마우스(Sam tako, Korea)의 장골(long bone)로부터 분리되었으며, 37℃ 인큐베이터(humidified incubator: 5% CO₂ in air) 에서 10% α-minimal essential medium(MEM), % 소태아혈청(FBS), 항생제 및 M-CSF(10ng/ml)가 첨가된 배지에서 배양하였다. 배양 후 24시간이 지난 다음, 부유 세포들을 수집한 후 10% FBS 및 10ng/ml M-CSF가 첨가된 α-MEM 배지에서 3일 동안 배양한 다음, 부착된 세포들을 BMMs(Bone marrow Macrophages)로 사용하였다. 파골세포 분화 실험을 위하여 BMM 세포를 24-웰 플레이트(1×10⁵/well)에서 배양한 후, 96-웰 플레이트(3×10⁴/well)로 옮겨 M-CSF 20ng/ml가 첨가된 배지로 배양하였고, 파골세포분화인자인 RANKL 200ng/ml로 6일 동안 자극시켜 파골세포 형성을 유도하였다. 이때 에스큘레틴은 RANKL과 동시에 처리하여 배양하였다.

<1-2> TRAP 염색 및 TRAP 활성 측정

상기 실시예<1-1>에 따라 분화 유도가 끝난 세포들은 3.7% 포르말린으로 10분 동안 고정한 후 PBS로 두 번 세척하였다. 세포들은 제조자의 지시에 따라 키트(sigma)를 이용하여 TARP(tartrate-resistant acid phosphatase) 염색을 수행하였다. TRAP 활성의 측정을 위해, 세포들을 3.7% 포르말린에서 10분 동안 고정시켰으며, 그 후 아세톤 및 포르말린(1:1, v/v) 혼합물에서 1분 동안 침지시킨 후, 건조시켰다. 세포들은 37℃ 온도 조건에서 10분 동안 100μl 포스포타아제 기질 용액(3.7mM ρ-니트로페닐 포스페이트 및 10mM 주석산나트륨[sodium tartrate]을 포함하는 50mM 시트레이트 버퍼[pH4.6]) 내에서 배양되었다. 배양 후 효소반응 혼합물을 다른 플레이트로 옮긴 후 100μL의 0.1N NaOH로 반응을 정지시켰다. ELISA reader를 이용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과 도 1 및 도 2에서 보이는 바와 같이, 본 발명의 에스큘레틴 화합물을 처리한 실험군에서 농도 의존적으로 파골세포 형성이 억제되는 것(BMM세포의 생성 억제)을 확인할 수 있었으며, 특히 40μM 농도에서는 파골세포로의 분화가 이루어지지 않는 것으로 나타나, 에스큘레틴의 파골세포 형성 억제 효능이 뛰어남을 알 수 있었다.

<1-3> 에스큘레틴에 대한 골수세포의 세포 생존률 측정

파골세포 형성 억제 효과가 에스큘레틴 화합물의 세포 독성에 의한 것인지를 확인하기 위하여 세포 생존율을 측정하였다.

에스큘레틴의 세포독성은 CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 평가하였다. M-CSF 및 RANKL 존재 하에서 3×10⁴cells/well 농도로 96 웰 플레이트에 BMM세포를 분주 한 후, 5μM, 10μM 및 20μM의 에스큘레틴을 처리하고 일정 시간 동안 배양하였다.

그 결과 도 3에서 나타난 바와 같이, 에스큘레틴 미처리 군(대조군)과 비교하여 에스큘레틴을 처리한 실험군에서 세포 생존률이 거의 차이를 보이지 않는 것을 통해, 본 발명의 에스큘레틴 화합물은 세포 독성을 유발하지 않는 것을 알 수 있었으며, 따라서 파골세포의 형성 억제는 에스큘레틴의 세포 분화 조절에 의한 것이지 세포 독성으로 인한 억제가 아님을 알 수 있었다.

<1-4> 에스큘레틴 처리에 따른 파골세포 특이적 마커 유전자의 발현에 미치는 영향

앞서 수행한 실시예들을 통해 에스큘레틴이 파골세포 형성을 억제한다는 사실을 확인하였으므로, 본 발명자들은 에스큘레틴이 파골 세포 특이적 마커 유전자의 발현에 영향을 미치는 지를 조사하기 위해 역전사-중합효소연쇄반응법(RT-PCR)을 수행하였다.

각 세포로부터 총 RNA의 수득은 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 분리하였으며, 제조자의 지시에 따라 ImPROM-Ⅱ Reverse Transcription System(Promega)로 역전사하였다. PCR 프라이머 서열은 하기와 같은 것을 사용하였다.

프라이머의 서열

유전자	프라이머 서열		서열번호
Cathepsin K	포워드	5’-GGCCAACTCAAGAAGAAAAC-3’	1
Cathepsin K	리버스	5’-GTGCTTGCTTCCCTTCTGG-3’	2
MMP9	포워드	5’-AGTTTGGTGTCGCGGAGCAC-3’	3
MMP9	리버스	5’-TACATGAGCGCTTCCGGCAC-3’	4
TRAP	포워드	5’GACAAGAGGTTCCA-3’	5
TRAP	리버스	5’-AGCCAGGACAGCTGAGTG-3’	6
V-ATPase	포워드	5’-ATGGCGCTCAGTGATGCAGATGTACA-3’	7
V-ATPase	리버스	5’-TTGCACAAGGCGACCTTTCT-3’	8
C-Fos	포워드	5’-CTGGTGCAGCCCACTCTGGTC-3’	9
C-Fos	리버스	5’-CTTTCAGCAGATTGGCAATCTC-3’	10
NFATc1	포워드	5’-CAACGCCCTGACCACCGATAG-3’	11
NFATc1	리버스	5’-GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3’	12
c-SRC	포워드	5’-CCAGGCTGAGGAGTGGTACT-3’	13
c-SRC	리버스	5’-CAGCTTGCGGATCTTGTAGT-3’	14
β-Actin	포워드	5’CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’	15
β-Actin	리버스	5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’	16
GAPDH	포워드	5’-CCTGTTCCAGAGACGGCCGCATCTT-3’	17
GAPDH	리버스	5’-TGGCAACAATCTCCACTTTGCCA-3’	18

그 결과 도 4에서 나타난 바와 같이, RANKL에 의해 파골세포로 분화된 세포는 마커 유전자로 알려진 칼시토닌 카셉신 K(cathepsin K), MMP-9(Matrix metalloproteinase-9), TRAP, V-ATPase, C-Fos, NFATc1, c-SRC 유전자 발현이 모두 증가되는 것을 알 수 있었다. 그러나 에스큘레틴을 첨가한 실험군에서는 cathepsin K, TRAP, NFATc1 및 c-SRC의 유전자 발현이 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

파골세포 분화에 관한 RANKL 자극을 매개하는 다양한 신호전달 경로가 밝혀진바 있다. 특히 RANKL의 자극은 파골전구세포에서 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자로 알려져 있는 NFAT(nuclear factor of activated T cells)의 발현을 유도한다. NFAT는 RANKL 자극에 의한 세포내 칼슘 신호 전달로 초기 유도되며, 그 후 ERK(extracellular signal-regulated kinase), NF-κB, MAPK(p38 MAP kinase), c-Fos 등의 활성화가 NFAT의 자가증폭(autoamplification)을 유발하여 활성이 지속된다. 핵심 전사인자인 NFAT 단백질은 현재까지 5 종류가 확인되었다. 즉, NFAT family는 NFAT1 (NFATp 또는 NFATc2), NFAT2 (NFATc 또는 NFATc1), NFAT3 (NFATc4), NFAT4 (NFATx 또는 NFATc3) 및 NFAT5으로 구성되어 있다.

활성화된 NFAT에 의해 NF-κB 등이 핵 내에서 전사인자로 작용하게 되면 파골세포 분화와 관련된 c-SRC 티로신 키나아제 등의 발현이 증가되게 된다. 또한 골 기질을 흡수하기 위한 탈산수소효소 활성을 가지게 되는 TRAP의 활성을 높아지게 되며 활성화된 파골세포의 주름진 막의 프로톤 펌프를 통해 프로톤이 세포 밖으로 보내 파골세포 둘레가 산성 조건으로 유지되게 되며 라이소조말 단백질분해효소인 cathepsin K가 발현되게 되어 유기성 뼈 기질층이 분해, 골 기질이 흡수되게 된다.

본 발명의 에스큘레틴의 처리는 RANKL에 의한 cathepsin K, TRAP, NFATc1 및 c-SRC의 발현을 유의성 있게 감소시키는 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 에스큘레틴이 NFATc1의 발현의 감소를 통하여 파골세포 분화를 억제하는 것을 시사한다.

<1-5> 에스큘레틴 처리에 따른 파골세포 발생의 전사 인자의 발현에 미치는 영향

파골세포 발생의 전사 인자인 NFATc1과 c-Fos의 발현에 대한 본 발명의 에스큘레틴의 영향을 평가하기 위하여 하기와 같은 western blot analysis를 실행하였다.

우선, RIPA 버퍼(50mM Tris pH 7.4, 1% NP-40, 0.1% SDS, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1mM Na₃VO₄, 1mM NaF, 1㎍/㎖ aprotinin, 1㎍/㎖ leupeptin)를 이용하여 세포를 용해한 후, 4℃ 13,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 DC Protein Assay Kit(Bio-Rad)방법으로 정량하였다.

동일한 양의 단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)에서 전기영동하여 gel상의 단백질을 semi-dry transfer unit-TE 70(Amersham Biosciences)을 이용하여 PVDF membrane(Millipore)에 단백질을 이동시켰다. 상기 PVDF membrane을 5% BSA로 블로킹한 후, 1차 항체와 반응시키고 이와 반응한 2차 항체를 ELC reagent를 이용하여 형광 표지한 것을 LAS-3000(FUJI FILM)을 이용하여 단백질의 발현을 확인하였다.

즉, BMMs을 본 발명에 따른 에스큘레틴(20μM)으로 처리한 군과 미처리한 군으로 나누어 각각 M-CSF 및 RANKL로 일정시간(1일, 2일, 3일) 배양하였다. 그런 다음, 모든 세포 용해물을 NFATc1, c-Fos 및 β-actin 항체들을 각각 사용하여 상기한 western blot 분석을 실시하였다.

그 결과 도 5에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 에스큘레틴에 의해 파골세포 발생의 전사 인자인 NFATc1과 c-Fos의 발현이 대조군에 비해 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 에스큘레틴은 RANKL에 의해 발현이 유도되는 NFATc1 및 c-Fos를 억제함을 알 수 있다.

<1-6> 에스큘레틴 처리에 따른 파골세포 발생의 신호 분자의 활성화에 미치는 영향

본 발명에 따른 에스큘레틴(20μM)으로 2시간 동안 예비처리하거나 그렇지 않은 BMMs을 3시간 동안 혈청이 결핍된 상태로 방치한 다음, 일정시간(0분, 5분, 15분, 30분) RANKL(500 ng/㎖)로 자극하였다. 그런 다음 세포 용해물을 p38, JNK 및 ERK 항체들을 각각 사용하여 상기한 <1-5>에서처럼 western blot 분석을 실시하였다.

그 결과 도 6에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 에스큘레틴에 의해 파골세포 발생의 신호 분자 중 p38의 인산화가 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 즉, 본 발명의 에스큘레틴은 RANKL에 의해 활성화되는 p38을 억제함을 알 수 있다.

<1-7> 성숙한 파골세포의 뼈 흡수 활성에 미치는 에스큘레틴의 영향

성숙한 파골세포의 뼈 흡수 활성에 대한 본 발명의 에스큘레틴의 영향을 평가하기 위하여, BMMs을 BioCoat plate(BD, bone culture system)에 깔고, M-CSF(20 ng/㎖)와 RANKL(200 ng/㎖), 그리고 에스큘레틴(20μM)을 처리하여 10일 동안 분화를 유도하였다. 그 후, BioCoat plate를 5% sodium hypochlorite로 5분 동안 처리하여 세포를 처리한 후 흡수된 영역을 현미경 하에서 촬영하였다.

그 결과 도 7에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 에스큘레틴에 의해 파골세포 활성을 나타낼 수 있는 뼈 흡수 활성이 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

즉, 도 7에서 성숙한 파골세포에 의해 흡수된 영역은 화살표로 표기되었는데, 본 발명의 에스큘레틴이 처리되지 않은 경우 다수의 뼈 흡수 영역이 존재함을 명백히 알 수 있다. 반면 본 발명의 에스큘레틴이 처리된 경우 뼈 흡수 영역이 발생하지 않았다.

상기의 실시예를 종합해 보면, 파골세포로 분화 과정 중인 세포에 본 발명의 에스큘레틴을 처리한 경우 파골세포로의 형성이 억제되는 것이 증명되었으며; 이러한 파골세포의 형성을 억제하는 기작은 RANKL의 자극에 의해 유도된 분자적 신호경로(signal pathway)에서 파골세포 분화를 조절할 수 있는 핵심 전사인자인 NFAT의 발현 억제와 연계되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 상기와 같은 특징을 가진 에스큘레틴을 이용하는 경우 파골세포로의 형성을 억제하여 골 손실 개선에 효과적일 것으로 판단되었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 에스큘레틴(esculetin) 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골 손실 억제용 조성물;
<화학식 1>

.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 파골세포 형성 억제 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 골 손실 억제용 조성물.
제2항에 있어서,
상기 파골세포 형성 억제는 파골세포의 분화를 조절하는 핵심 전사인자인 NFAT의 발현을 억제하는 기전을 통하여 파골세포의 분화를 억제시키는 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 골 손실 억제용 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 골 손실 억제를 통해 치료할 수 있는 질환은 골다공증, 파제트 골질환, 구루병, 골연화증 및 퇴행성 골질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 골 손실 억제용 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 에스큘레틴(esculetin) 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 함유하는 골 손실 개선용 건강기능식품;
<화학식 1>

.
제5항에 있어서,
상기 화합물은 파골세포 형성 억제 효능을 갖는 것을 특징으로 하는 골 손실 개선용 건강기능식품.
제5항 또는 제6항에 있어서,
상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 골 손실 개선용 건강기능식품.