KR101602391B1

KR101602391B1 - 해수온 변화 및 해양산성화에 대응하는 분홍바다맨드라미의 유전자 및 이를이용한 해양 생태계 진단방법

Info

Publication number: KR101602391B1
Application number: KR1020140022726A
Authority: KR
Inventors: 우선옥; 염승식
Original assignee: 한국해양과학기술원
Priority date: 2014-02-26
Filing date: 2014-02-26
Publication date: 2016-03-10
Also published as: KR20150101247A

Abstract

본 발명은 해수온 상승 및 해양산성화 여부에 반응하여 차등 발현하는 분홍바다맨드라미(Scleronephthya gracillimum) 유래 유전자 마커, 이를 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스를 탐지하는 바이오센서 및 탐지방법에 관한 것이다.

Description

해수온 변화 및 해양산성화에 대응하는 분홍바다맨드라미의 유전자 및 이를이용한 해양 생태계 진단방법{Seawater temperature change and ocean acidification responsive genes in Scleronephthya gracillimum and method for diagnosing marine ecosystem using the same}

본 발명은 해수온 상승 및 해양산성화 여부에 반응하여 차등 발현하는 분홍바다맨드라미(Scleronephthya gracillimum) 유래 유전자 마커, 상기 유전자 마커를 이용하여 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스를 탐지하는 바이오센서 및 탐지방법에 관한 것이다.

산업혁명 이후 인간 활동에 의해 대기 중 이산화탄소 농도가 100 ppm 이상 증가하였으며, 해양은 이렇게 대기로 추가 방출된 이산화탄소의 약 1/4 가량을 흡수하는 매우 중요한 이산화탄소 흡수원의 역할을 수행하고 있다.　 해양으로 흡수된 이산화탄소는 해수 내에서 탄산(H₂CO₃)을 형성하게 되며 추가적으로 흡수된 이산화탄소는 해수의 산성도 및 해수온도를 증가시키고 있다.

해양 산성화로 인해 해수의 산성도(수소이온농도)가 증가하면 탄산이온(CO₃ ^2-)의 농도가 감소하기 때문에 탄산계 골격으로 이루어진 해양생물에 큰 영향을 미치게 된다.　 미래에 해양 산성화로 인해 표층해수의 탄산이온 농도가 지속적으로 감소하여 탄산염 불포화 상태에 이르게 되면 탄산염 골격을 이용하는 생물종들은 더 이상의 생명활동을 지속하지 못하고 멸종할 가능성이 있다.

또한, 최근 인간의 활동에 의한 온실 가스의 대기 중 농도 증가로 인하여 지구온난화가 가속화되고 있으며, 온실효과로 인하여 지구온난화의 지표인 지구표면 온도는 지난 100년 동안(1906~2005) 0.74±0.18℃ 상승한 것으로 파악된다. 지구온난화에 의해 해수온이 상승하고 있으며, 극지방을 제외한 전 세계의 빙하가 감소하는 현상이 관측되고 있다. 이러한 급격한 수온 변화는 해양 생태계에 큰 영향을 주며, 특히, 해양 생물의 대사를 변화시켜, 결과적으로는 해양 어장 및 해양 동식물종을 교란시키게 된다.

작년 한 해 동안 인류가 배출한 이산화탄소 양은 316억 톤으로 2010년에 비해 약 10억 톤 증가하였으며, 이산화탄소 양의 생태계 임계점을 넘어서면 생태계는 다시 돌아올 수 없는 심각한 변화를 가져온다.　 최근에 우리나라 동해에서도 산업혁명 이후에 급속한 산성화가 진행되고 있다고 보고되었다.　이는 한국 근해에서도 해양 산성화가 심각하게 진행되고 있으며, 이는 앞으로 탄산칼슘을 골격으로 하는 생물상의 서식지가 줄어들 수 있음을 암시한다.　

이러한 환경의 변화에 대응하기 위해, 해양 생물은 자신의 특정 유전자의 발현량을 조절하여 생리 또는 대사를 변화시킴으로써 능동적으로 환경변화에 대처하는 성질을 나타낸다. 이와 같은 유전자 발현 변화를 이용한, 외부 환경 스트레스에 대한 생물 내 반응을 분자수준에서 진단하는 방법과 관련하여, 아직 해양 산성화, 해수온 상승 또는 기후변화 등과 관련된 환경 변화에 대한 지표에 관한 연구는 거의 없는 실정이며, 특히, 분홍바다맨드라미(Scleronephthya gracillimum)를 이용하여 해수온 상승 및 해양 산성화 이중 스트레스 관련 연구에 대해서는 보고된 바 없다.

이에 따라, 기후변화에 의한 생태계의 교란에 대한 위험성이 제기되고 있는 현 상황에서, 해수온상승, 해양산성화와 같은 외부 환경변화에 따라 발현량이 변화되는 유전자들을 발굴하여 생체지표로 이용하여 환경변화의 영향과 생태계 파급효과를 정확히 진단하는 첨단기술 개발의 필요성이 절실한 실정이다.

본 발명의 목적은 해수온 상승 및 해양산성화에 대응하는 분홍바다맨드라미의 유전자, 이를 이용한 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스 탐지용 조성물, 마이크로어레이, 탐지용 키트 및 탐지방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 해수온 상승 및 해양산성화에 대응하는 분홍바다맨드라미의 유전자를 포함하는, 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스 탐지용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위한 일구현예는,

서열번호 1 내지 33의 핵산염기서열로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 포함하는 상보체; 상기 폴리뉴클레오타이드의 단편내의 연속하여 위치하는 20 내지 200개 염기의 폴리뉴클레오타이드 단편; 및 상기 폴리뉴클레오타이드 단편의 상보체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는, 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스 탐지용 조성물에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 프로브는 분홍바다맨드라미(Scleronephthya gracillimum) 유래인 것일 수 있다.

본 발명에서 '프로브' 란, 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드의 상보체, 상기 폴리뉴클레오타이드의 단편, 및 폴리뉴클레오타이드의 단편에 대한 상보체일 수 있다. 또한, 마이크로어레이 상에 고정되어 시료 내 함유된 상동의 DNA와 혼성화되는 물질로서, DNA, RNA, cDNA 또는 mRNA일 수 있으며, DNA의 경우 올리고머일 수 있다. 프로브는 염기서열 내 반복서열 함유비율이 최대 85%일 수 있으며, 바람직하게는 최대 70%, 더욱 바람직게는 최대 50 %, 가장 바람직하게는 최대 40%일 수 있다. 프로브의 크기는 상기 유전자 전체 서열일 수도 있으나, 올리고머인 경우 20 내지 200 bp, 바람직하게는 20 내지 100 bp, 또는 20 내지 60 bp, cDNA 또는 RNA인 경우 30 bp 내지 150 bp일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 마이크로어레이의 목적에 따라 적절한 종류를 선택하여 사용할 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명의 프로브는, 해수온 상승 및 해양산성화에 노출된 분홍바다맨드라미와 노출되지 않은 분홍바다맨드라미에서 발현양의 변화를 나타내는 유전자, 유전자의 단편, 상기 유전자로부터 유래되는 핵산, 및 핵산의 단편일 수 있으며 상기 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.

본 발명의 ‘분홍바다맨드라미(Scleronephthya gracillimum)’는 제주 연안해역, 특히 서귀포 남쪽 연안의 연산호 군락에 널리 서식하고 있는 연산호의 일종으로, 일본 남부에서 동중국해까지 분포한다. 군체(몸)는 신축성이 매우 심하여 펼쳤을 때는 관목상이지만 수축했을 때는 퉁퉁한 덩어리 모양으로 변한다. 병부의 표면에는 가로 주름이 있으며, 관부에는 수축력이 심한 폴립(polyp)들이 덩어리 모양으로 모여 나 있다. 몸은 연노란색, 적황색, 주황색 또는 분홍색 등이며, 폴립 덩어리는 분홍색 또는 주황색 등으로 다양하다. 수직벽이나 경사가 심한 암반에 무리지어 살며, 수심 3 ~ 4 m부터 15 m 전후에 분포한다. 다른 생물들의 서식처를 제공함으로써, 우리나라 해양생물 다양성에 큰 공헌을 하고 있는 생물이다. 특히, 본 발명에서는 분홍바다맨드라미가 실시예 3의 마이크로어레이 분석을 통해서 온도상승 및 산성화 이중스트레스에 대해 유전자의 발현정도가 달라지는 것을 관찰하였는바, 해수온 변화 및 해수 산성화 여부에 대한 해양지표로 활용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서, ‘해수온 상승’이란, 해수온도가 평균 온도에 비해 상승한 것을 의미할 수 있으며, 구체적으로 여름 최고 수온인 26℃ 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 28℃ 이상 30℃ 이하일 수 있다. 28℃ 미만의 해수온도의 경우, 본 발명의 조성물을 이용한 탐지에 있어서, 온도변화에 의한 발현변화의 차이가 미미하여 결과해석의 명확도가 낮아지는 문제가 있을 수 있고, 30℃ 초과인 경우 분홍바다맨드라미 생존률이 급격히 낮아져 탐지가 어려운 문제가 있을 수 있다.

또한, ‘해양산성화’란, 해양의 평균 pH 값이 감소하는 것 및 pH 감소에 의해 파생되는 모든 영향을 의미하며, 평균 해수면의 pH는 약 8.2 인 것으로 알려져있는바, 본 발명에서의 해양산성화는 해양의 평균 pH가 7.8 이하인 것일 수 있다. 보다 구체적으로, pH 7.5 이상 pH 7.8 이하일 수 있다. 해수의 산성도가 pH 7.5 미만의 산성에서는 26℃ 이상의 상승된 온도와 이중적으로 노출된 경우 분홍바다맨드라미 생존율이 낮아지게 되어 탐지가 어려운 문제가 있을 수 있고, pH 7.8 초과인 경우, 본 발명의 조성물을 이용한 탐지에 있어서, 산성화도에 의한 발현변화의 차이가 미미하여 결과해석의 명확도가 낮아지는 문제가 있을 수 있다.

본 발명은 특히 해수온 상승 및 해양산성화 이중 스트레스에 반응하는 유전자를 이용하여, 해수온이 상승하고, 산성화가 발생된 해수 또는 해양을 탐지하는 것이라 할 수 있다. 해수온 상승이 나타나거나, 대기 중의 이산화탄소가 해수에 녹아들어감에 따라 해양산성화가 나타나거나 또는 해수온 상승과 해양산성화가 동시에 발생할 수 있는데, 종래에는 해수온 상승만을 탐지하여 해양산성화가 발생하였는지 여부는 탐지할 수 없거나, 해양산성도 변화를 탐지하여 해양 산성화 여부만을 탐지할 수 밖에 없는 문제가 있었다. 그러나, 본 발명의 일구현예는 온도 상승 및 산성도 증가 이중스트레스에 반응하는 유전자를 이용하여 해수온 상승 및 해양산성화가 이중적으로 발생하였는지 여부를 탐지하는 것이다. 특히, 이중 스트레스의 경우 해수온 상승 또는 해양산성화 단일 스트레스와는 전혀 다른 유전자가 해수온 상승 및/또는 해양산성화가 없는 조건에서 발현되는 양에 비해, 현저히 많이 발현되거나 현저히 낮게 발현하여, 예를 들면 5배 이상, 10배 이상 또는 15배 내지 100배까지 현저히 많이 발현되거나, -5배 이상, -10배 이상 또는 -15배 내지 -100배까지 현저히 적게 발현되어, 해수온 및 산성도가 미세하게 변화하였더라도, 이중적으로 변화하였다면 탐지해낼 수 있는 장점이 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예는, 서열번호 1 내지 33의 핵산염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열을 포함하는 상보체; 상기 폴리뉴클레오타이드의 단편내의 연속하여 위치하는 20 내지 200개 염기의 폴리뉴클레오타이드 단편; 및 상기 폴리뉴클레오타이드 단편의 상보체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하는, 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스 탐지용 마이크로어레이에 관한 것이다. 상기 서열번호 1 내지 33의 유전자는 하기 표 1에 기재한 바와 같다.

서열 번호	Gene
1	dermatopontin (derm gene)
2	Glutathione S-transferase
3	spermatogenesis associated 17-like protein
4	snRNA-associated Sm-like protein
5	Olfactomedin and related extracellular matrix glycoproteins
6	TRPC channel interacting protein (enkur)
7	sll1483 precursor mRNA
8	SNF8 mRNA Css39.8 (clona9 gene)
9	Transcription elongation factor 1 homolog mRNA
10	Dynein light chain
11	ATP-dependent Clp-type protease (AAA+ ATPase superfamily)
12	GDP dissociation inhibitor
13	Phosphoserine aminotransferase
14	methyltransferase
15	Glycosyl transferase, family 8 - glycogenin
16	G protein-coupled receptor
17	Ca2+/Mg2+-permeable cation channels (LTRPC family)
18	Collagens type IV and related proteins
19	Guanidinoacetate N-methyltransferase mRNA
20	E3 ubiquitin ligase
21	relaxin 3c precursor (Rln3c) mRNA
22	Triglyceride lipase-cholesterol esterase
23	HMG box-containing protein
24	Splicing factor, arginine/serine-rich 3 mRNA
25	Response gene to complement 32 protein
26	Retinol-binding protein I
27	DNA-binding protein jumonji/RBP2/SMCY, contains JmjC domain
28	Vacuolar-sorting protein SNF8 mRNA (clona9 gene)
29	LIM domain related protein
30	Neurexin IV
31	Protein related to short-chain alcohol dehydrogenases
32	acyltransferase
33	Low-density lipoprotein receptors containing Ca2+-binding EGF-like domains

상기 프로브의 고정은, 통상의 DNA 마이크로어레이 제조방법에서 취하는 방법을 통하여 실시할 수 있으며, 예컨대 포토리소그래피(photolithography) 방법, 압전 인쇄(piezoelectric printing) 방법, 마이크로 피펫팅 또는 스폿팅(spotting) 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 이러한 방법은 게놈 DNA 마이크로어레이 제조시에 통상적인 방법이므로 본 발명이 속하는 기술분야의 해당업자라면 용이하게 실시할 수 있다.

프로브는 마이크로어레이 상의 하나의 스팟당 2 내지 100 pg으로 고정시킬 수 있으며, 또한 스팟당 동일한 염기서열로 이루어진 1종의 프로브를 고정시키거나 2종 이상의 프로브를 혼합하여 고정시킬 수 있다. 또한 마이크로어레이 상의 스팟은 1배수 이상일 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 3배수로 구성될 수 있다. 이 때 스팟은 원형일 수 있으며, 직경 50 내지 500 마이크로미터, 스팟간 간격은 10 내지 500 um 일 수 있다. 그러나 스팟의 크기 및 조밀도는 마이크로어레이 분석 시스템의 해상도에 따라 적절히 조절하는 것이 바람직하다.

본 발명의 마이크로어레이는 마이크로웰 플레이트, 예컨대 96웰 플레이트의 웰에 위치시켜, 기존의 96웰 플레이트를 이용한 자동장비(예, Biomek, Genetix robo)로 시료 분지, 표지, 혼성화 및 세척과정을 기계적으로 처리할 수 있다.

본 발명의 또 다른 일구현예는, 상기 마이크로어레이를 포함하고, 상기 마이크로어레이상에 고정된 프로브에, 검출가능한 제1 표지물질로 표지된 검체 핵산과 검출가능한 제2 표지물질로 표지된 표준 핵산을 동일 비율로 혼합시킨 혼합물을 반응시키고, 상기 검체 핵산과 표준 핵산 각각의 혼성화 비율을 측정하여 그 결과로부터 해수온 상승 및 해양산성화 여부를 탐지하는, 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스 탐지용 키트에 관한 것이다.

상기 ‘표준 핵산’이란, 그 크기나 서열 등을 이미 알고 있는 핵산으로, 해수온 상승 및 해양산성화에 노출되지 않은 분홍바다맨드라미의 핵산을 의미한다. 바람직하게는 상기 표준 핵산은 해수온 상승 및 해양산성화에 노출되는 않은 분홍바다맨드라미에서 얻어지며, 상기 서열번호 1 내지 33으로 이루어지는 군에서 선택된 프로브에 해당된다.

상기 검체 핵산은 검체 분홍바다맨드라미로부터 통상의 방법으로 추출 및 분리된 핵산일 수 있으며, 탐지 가능한 범위는 분홍바다맨드라미가 생존 가능한 다양한 수질환경일 수 있으며, 예를 들면 연안의 해수일 수 있다.

상기 제1 표지물질 및 제2 표지물질은 동일하거나 서로 다른 물질일 수 있으며, 예컨대 서로 독립적으로 형광물질, 방사능 동위원소, 화학발광체 또는 효소일 수 있다. 그 예로는 Cy3, Cy5, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 658, 시아닌(Cyanine)-3, 시아닌-5, 플루오레세인(fluorescein), 보디피(bodipy), 텍사스 레드(Texas red), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine), d-NTP (including d-UTP), 아미노-알릴 수정된 dNTPs를 갖는 반응성 염료, 양고추냉이 과산화효소, 바이오틴 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 일구현예는, (a) 마이크로어레이에 고정된 프로브에, 검출가능한 제1 표지물질로 표지된 검체 핵산과 검출가능한 제2 표지물질로 표지된 표준 핵산을 동일 비율로 혼합시킨 혼합물을 반응시키고, (b) 상기 검체 핵산과 표준 핵산 각각의 상기 프로브에 대한 혼성화 정도를 측정하여, 상기 검체 핵산과 표준 핵산의 혼성화 정도를 비교하는 단계를 포함하는, 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스를 탐지하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 상기 단계(a)에서, 검체 분홍바다맨드라미의 핵산은, 검체 분홍바다맨드라미로부터 통상의 방법 또는 공지된 키트를 이용하여 추출할 수 있으며, 상기 추출된 RNA로 부터 cDNA를 제조할 수 있다. cDNA제조는 통상의 RT-PCR 방법으로 적절한 프라이머쌍을 이용하여 수행될 수 있다.

상기 추출된 검체 분홍바다맨드라미의 cDNA 와 표준 cDNA는 랜덤 프라이밍을 통하여 각각 서로 다른 표지물로 표지시켜, 표지된 검체 및 표준 cDNA를 수득할 수 있다. 일예로, 검체 cDNA는 Cy3(푸른색)로 표지하고, 표준 cDNA는 Cy5(붉은색)로 표지가능하다. 상기 표지된 검체 및 표준 게놈 DNA는 1:1 중량비로 혼합한 후 그 혼합물을 마이크로어레이에 처리하여 반응시킨 후 세척할 수 있다.

마이크로어레이에 처리하는 혼합물의 DNA 양은 200 ng 내지 2 ug 일 수 있으며, 처리시 혼합물은 혼성화 완충액에 현탁하여 처리할 수 있다. 혼성화 완충액은 공지의 용액을 포함한다.

상기 단계 (b) 는, 혼성화 반응이 완료된 마이크로어레이를 표지물질의 검출가능한 스캐너에 넣어 스캔한 후, 마이크로어레이 상에 올려진 프로브 정보 및 스팟 위치가 입력된 프로그램을 이용하여 혼성화 여부를 분석함으로써 수행할 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이, 탐지용 키트 및 탐지방법에 있어서도 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스 범위는 상기 기재된 바와 동일하며, 프로브 및 검체 핵산은 분홍바다맨드라미 유래인 것일 수 있다.

본 발명은 기후변화에 따른 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스에 대응하는 분홍바다맨드라미 유래 특정 유전자의 발현량 변화를 측정함으로써, 해수온 상승 및 해수의 산성도의 복합적 변화 여부를 확인할 수 있는 바이오 센서 및 키트로 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 대조군 pH 8.0 및 온도 산성화 이중 실험군(28℃ 및 pH7.5, 28℃ 및 pH7.8)에서 추출한 RNA를 이용한 마이크로어레이 실험결과, 2배 이상 차등 발현한 유전자들 중 공통 유전자를 그룹화하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 분홍바다맨드라미( Scleronephthya gracillimum )의 배양

본 발명자들은 서귀포 연안에서 분홍바다맨드라미 시료를 채취하여 연구소에서 배양하였다.

구체적으로, 서귀포 연안에서 채취한 분홍바다맨드라미를 100, 10 및 1 ㎛ 세 종류의 필터를 거친 자연해수에 배양하였다. 이때, 수온은 수중 히터를 사용하여 24℃로 고정하여 1주 이상 순치시켰고, 광주기는 14:10으로 조절하였다.

실시예 2. 해수온 상승 및 산성화된 해수에의 노출

상기 실시예 1의 방법으로 배양된 분홍바다맨드라미를 해수온 상승 및 산성화된 해수에 노출시켰다.

구체적으로, 분홍바다맨드라미를 두 개의 군으로 나누어 각각 28℃, pH7.5의 이중스트레스 및 28℃, pH7.8의 이중스트레스에 노출하여 24시간 동안 배양하였다.

대조군은 자연해수(pH 8.0, 24℃)에서 24시간 동안 배양하였다.

실시예 3. 해수온 상승 및 산성화에 의한 분홍바다맨드라미의 유전자 변화 측정

3-1. RNA 의 추출

상기 실시예 2에 의해 해수온이 상승하고, 산성화된 해수에 노출된 분홍바다맨드라미의 유전자변화를 측정하기 위하여, 본 발명자들에 의해 개발된 방법에 따라 RNA를 분리하였다.

구체적으로, 상기 실험군 및 대조군의 분홍바다맨드라미 조직을 막자사발에서 액체질소를 이용하여 분말로 만들고, 용해(lysis) 용액[35 mM EDTA, 0.7 M LiCl, 7% SDS, 200 mM Tris-Cl(pH 9.0)] 700 ㎕를 첨가하여 균질화하였다.　 상기 균질화된 시료에 동량의 페놀 용액을 첨가하고 잘 섞은 후, 10분간 원심분리하였고, 상층액을 취해 새 튜브로 옮기고 총 용량의 1/3의 8M 염화리튬(LiCl)을 첨가하여 이를 잘 섞은 후에 4℃에서 2시간 이상 방치하였다.　 상기 방치한 시료를 약 30분간 원심분리하여 상등액을 제거하고 침전물을 취하여 300 ㎕의 DEPC-처리수에 녹이고, 1/10 용량의 3M 아세트산나트륨(pH 5.2)과 동량의 이소프로판올 (isopropanol)을 첨가하여 약 30분간 원심분리 후 상등액을 제거하고 침전물을 취하였다.　 상기 침전물에 70% 에탄올 용액 50 ㎕를 넣어 5분간 원심분리한 뒤, 에탄올 용액을 제거하고 침전된 RNA를 건조시켜, 건조된 RNA를 적당량의 DEPC-처리수에 용해하였다.

3-2. cDNA 의 합성

상기 3-1의 방법으로 추출한 분홍바다맨드라미 RNA에서 cDNA를 합성하였다. 구체적으로, 산성화된 해수에 대응하는 특이적인 유전자의 분리를 위하여 Tri-reagent(Molecular Research Center Inc., 미국)를 사용하였다.　 상기 추출된 전체 mRNA(3.0 ㎍)를 주형으로 dT-ACP1을 프라이머로, MMLV RT-ase를 반응 효소로 사용하여 대조군과 실험군의 cDNA를 합성하였다.

3-3. Microarray 분석

본 발명자들은 상기 3-2에서 합성한 cDNA 마이크로 어레이를 제조하고 이를 혼성화시켜 스캐닝하였다.

구체적으로, 형광물질로 표지된 분홍바다맨드라미의 cDNA 시료를 PCR 정제 키트(PCR purification kit, Qiagen, 독일)을 사용하여 정제하고, 증류수로 용출하였다.　정제된 형광표지-cDNA 시료를 혼성화 완충액(hybridization buffer)[3x SSC, 0.3% SDS, 50% 포름아미드(formamide), 20 ㎍ Cot-1 DNA, 20 ㎍ yeast tRNA]에 첨가한 후, microcon YM-30으로 농축하여 혼성화 혼합물을 만들었다.　 상기 혼성화 혼합물을 95℃로 3분 동안 가열하여 변성시키고, 12,000 g에서 30초간 원심분리하여 가열된 혼성화 화합물의 온도를 떨어뜨렸다.　제조된 분홍바다맨드라미 cDNA 마이크로어레이(microarray)에 커버슬립(coverslip)을 덮고, 변성시킨 혼성화 혼합물을 파이펫팅(pipetting)하였다.　이후 마이크로어레이를 GT-Hyb 챔버(Chamber)에 넣고 65℃에서 16시간 동안 반응시켰다.　 혼성화가 끝난 후, 챔버에서 마이크로어레이를 꺼내어 세척과정을 수행하고, 마이크로어레이를 회전하여 건조한 후 스캐닝(scanning)할 때까지 암실에서 보관하였다.　 실험이 완료된 분홍바다맨드라미 마이크로어레이를 액손 진픽스 4000B 스캐너(Axon GenePix 4000B scanner, Axon Instrument, 미국)를 사용하여 스캔하였다.　 진픽스 프로 6.0 프로그램(GenePix Pro 6.0 program)에서, 스캔 이미지로부터 각 점을 그리딩 파일(gridding file)을 이용하여 그리딩하고, 정량화하여 각 점의 Cy5/Cy3 강도 및 비율 등의 분석 값이 포함된 GPR 파일(GPR file)을 얻었다.

상기 진픽스 프로 프로그램에서 얻어진 GPR 파일로부터, 분석 프로그램인 진스프링 7.3.1(GeneSpring 7.3.1, Agilent Technologies, 미국)를 이용하여 아래와 같이 분석을 수행하였다. 표준화(normalization)는 LOWESS(locally weighted regression scatterplot smoothing)를 이용하여 수행하였고, 신뢰할 수 있는 유전자(reliable gene)는 중앙값의 합이 배경(background)값보다 낮거나 각 화소(pixel) 값의 표준편차가 유의하지 않은 점(spot)을 플래그 아웃(flag-out) 함으로써 유의한 유전자를 얻었다.　 또한, 유의한 유전자(Significant genes)는 평준화된 비율(normalized ratio) 값이 2 배 이상 차이를 보이는 점을 선별하였다.

그 결과, 표 2 및 표 3에 나타난 바와 같이, 대조군과 비교하여 온도상승 및산성화 실험군(28℃ 및 pH7.5, 28℃ 및 pH7.8)에서 발현량이 2배 이상 유의하게 증가한 유전자 16종(표 2) 및 감소한 유전자 17종(표 3)을 발굴하여 총 33종의 유전자를 서열번호 1 내지 33으로 기재하였다.　아울러, 도 1에 나타난 바와 같이, 실험군에서 2배 이상 차등 발현한 상기 유전자들 중 공통 유전자를 그룹화하였다(도 1).

	Gene	Fold change
1	dermatopontin (derm gene)	267.88
2	Glutathione S-transferase	59.00
3	spermatogenesis associated 17-like protein	54.17
4	snRNA-associated Sm-like protein	48.92
5	Olfactomedin and related extracellular matrix glycoproteins	46.12
6	TRPC channel interacting protein (enkur)	33.05
7	sll1483 precursor mRNA	29.98
8	SNF8 mRNA Css39.8 (clona9 gene)	28.12
9	Transcription elongation factor 1 homolog mRNA	27.48
10	Dynein light chain	27.08
11	ATP-dependent Clp-type protease (AAA+ ATPase superfamily)	24.19
12	GDP dissociation inhibitor	22.84
13	Phosphoserine aminotransferase	19.15
14	methyltransferase	18.30
15	Glycosyl transferase, family 8-glycogenin	16.85
16	G protein-coupled receptor	15.21

	Gene	Fold change
1	Ca2+/Mg2+-permeable cation channels (LTRPC family)	-100.00
2	Collagens type IV and related proteins	-100.00
3	Guanidinoacetate N-methyltransferase mRNA	-100.00
4	E3 ubiquitin ligase	-100.00
5	relaxin 3c precursor (Rln3c) mRNA	-100.00
6	Triglyceride lipase-cholesterol esterase	-100.00
7	HMG box-containing protein	-94.42
8	Splicing factor, arginine/serine-rich 3 mRNA	-70.11
9	Response gene to complement 32 protein	-69.40
10	Retinol-binding protein I	-67.49
11	DNA-binding protein jumonji/RBP2/SMCY, contains JmjC domain	-46.13
12	Vacuolar-sorting protein SNF8 mRNA (clona9 gene)	-45.00
13	LIM domain related protein	-44.05
14	Neurexin IV	-38.32
15	Protein related to short-chain alcohol dehydrogenases	-37.12
16	acyltransferase	-36.26
17	Low-density lipoprotein receptors containing Ca2+-binding EGF-like domains	-35.00

<110> Korea Institute of Ocean Science and Technology <120> Seawater temperature change and ocean acidification responsive genes in Scleronephthya gracillimum and method for diagnosing marine ecosystem using the same <130> DPP20140373KR <160> 33 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 775 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(775) <223> dermatopontin (derm gene) <400> 1 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg aatcattcgc atcttgcccg 60 gaacaaagaa taagctcaga gtgaattttg actttttgtt aaaagatacc agaagaattt 120 ttttcagtac acgacaatga agatcatttt agtgcaaatc ctgttggtat cgttgtttgt 180 tcttgctcaa acaatgagca tttgtgcttc gacacaattt ggcgcaaaga tcgatgaaca 240 atgtccacct aatcattata tgtatcgtgt gcgaagctct ttcagcagat atcgtaagga 300 ccgttcgtgg tctatcaatt gtcgatatag tcgttccgtg actacgtcat gtcatgacag 360 tgggtatgtg aatgaatacg acggagaaat gttgtaccaa tgtccacttg gagttatcgc 420 aggttttaaa gcgatataca agaaaaataa tcacgaccga agatttcagt acaggtgttg 480 ctacaccaag tataaagtcc accgatactg tacttggtct agttataaga acgctctgga 540 aggatatttg caattcagta gtggtaacta tgctgtggtt ggagtattta gcaagcacta 600 taacgaaaaa ggggacagga tctggaaatt cttgaaatgt tcttttcaat aaatggggaa 660 ttgttgacga aataatgcaa ctattcattt cagttataat tatacgttat tttaatacgt 720 actttatgta acaatttttg gcttttttcg cacaataaaa atatcattca aagac 775 <210> 2 <211> 590 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(590) <223> Glutathione S-transferase <400> 2 ctaagttgtt acgttttgaa aagtatcttg gtgacaaacc ataccttgct ggtgacaagt 60 tgaccttccc tgattttatg ctgtatgaca tgatcgacca acataaaatc tttgatgaga 120 agttgctgga gccattcgag aagctgttgg cttatgctga tagaatcgag gttattccac 180 aaattgctgc ttacaagaaa tcagacaagt tccttgagcg tcctataaat cacccaattg 240 cttcatttac atagactctt ctgctaatgg aaagtcagtc atattgcttg gtaatcagaa 300 ttgttcaact aataggacca atttgtatgc ttgtgtatta gtgcataaaa atcattaatt 360 gtgacgtcgt gtgcaaacga agaattagtt aaaaagtttt attataacaa tattatataa 420 tgtattatga actcttagaa gaaaggcttc gttacccttc actggattgg 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gtatcccgat gagaaggaat attacctaaa gaattttaaa ccgtgcatgc caccaaagaa 660 ggaaaagagc aaattttacg atcccacttg caagcgttac gaccacccta ccagagatcc 720 cttacctcca atatgtccta agcctcaggg accattcagg gattctaggg cagtgcaaag 780 acagagatac aaaccgttta aaccaaccct cagagtagaa acatcttacc aatcactcga 840 agatgcacgc caaaaaaatg aaagatgaag agtgggtcac acgactcaac gatgatgttt 900 tccaaccgtt tacgagaaaa tcatatccat ttgaaccaac gttacaccag tcaacgcagt 960 ttgggcacat accatacgga aacaaattct tcagacacga atacatagat aaatttgtca 1020 taccacagaa tttcaagacc gtcgttcctc cgataccaat tttcgacaag ttaaacggta 1080 cttattccca aggtgaagtc tgaggtgaag tctcatagta tattgatttt ccaaaactaa 1140 attttaagtt gaaaacaaca tatgaactga taacttcttt atttcttgtt ccaagaaaaa 1200 cataaatcgt gtta 1214 <210> 4 <211> 394 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(394) <223> snRNA-associated Sm-like protein <400> 4 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg agattgccca acagacaact 60 gataagagaa gaagagaatt catagcagaa tcgaccaaga agtttattat aagtcaaaga 120 attttcgaaa gagtttgcaa tgaatatgaa gatcgttcaa gtttttgtgc tggtattggt 180 attttctata atatactcgg gtgaaacatc tagtttgggt gaaccaaatg gtcattatgt 240 agctaaacca gcggttgctc cgtttggctg ctcctttcat cctaattggg tctattatta 300 ctgttgggga tcttgcggcc ccgatggtac agactggtgt tggattaacg tccattgtgg 360 tttcgatgcc aatgtctgcc aaaatttgga atct 394 <210> 5 <211> 460 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(460) <223> Olfactomedin and related extracellular matrix glycoproteins <400> 5 aatttttgca gttattttaa tgaaaaacac agcatacatt ctaatgagga ccaaaacatg 60 tggagtaaag aacactatac acgtctatac atgtaggcct atactataac ttatatactg 120 agtggtgaac aaaatgaaat acccattttc tagatcgcta tgcatgtcta agatactacg 180 gattatggaa gattgcatct aataggtttt gttaattgaa aaaatgttcg tttcgtccat 240 tcttttctat ttgggctgtt tcagtttgct tcagtcttcg aattccagtg ggtaggttat 300 ttggcgattt ctgtcccagg cgtacaggac cttctcgcgt ggattgtaag taaccatgct 360 gttgtaacca aacttgttga caaacggaat gtctggattg atcgcagatt tggtagttgt 420 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gaaatcttag caggactgaa agccaattgg gagcaaattc 720 accatgaata tcagggtttg tcggttgtca ctgatactgc gccgaagaaa aacagaaagg 780 aaaggatgga ggcggagatg aaacaattag aaagagacat tgaaactata gaaaaacatc 840 gagtcattta catcgcaaac tgaggatgat ctgttgtttg gtaccgttat tgaatcattg 900 ttcaaaatct atttgtttta ccgaagtttg ctagtgcgta agctatgcct ttgtcctgtt 960 aacaaatgta catgcaatag agtttacatg taaagaaata ataaaatctg tgatgcccca 1020 aagaaaaaaa aaaaaaaaaa aggcgcctcg gccactctgc gttgatacca ctgctt 1076 <210> 7 <211> 421 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(421) <223> sll1483 precursor mRNA <400> 7 aagcagtggt atcaacgcag agtggccgag gcggcctttt tttttttttt tttttttttt 60 tgtgttaact ttcgattcta tttttcaaac taactatatt acacaactga tctagaatag 120 tttcggtgaa gcagatccat aaatctgtca aattttagtt gtcgtggcta ccaaggctcg 180 gtttacaacg gattttaaag aaaccttttg cccaagtgag gtggtttggg gtttgccaat 240 attctctttt caaacaattg aagccaatat tttggtttcc ccttctaatt ctcattttct 300 tcgagatgca aagttgacgt tagagtttgc tctgattctg gaattatccc gttctctttc 360 tcagtctcag acacgggaag tattattccg tctttttcaa tgctgttggc tcgttcactg 420 t 421 <210> 8 <211> 420 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(420) <223> SNF8 mRNA Css39.8 (clona9 gene) <400> 8 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg attcttcaac agctgtctga 60 ccagagtcgt acagatcagt agcctctaga ttacgctcca taacatcaca acgtttgaat 120 tgctgaatct tgatttctca caatgaagat gacaagtata gtattgtcgc tatgttcagg 180 tatcctgctt ctatcgactt tagcaaaagg tgaacctggc aggccaggga agttacctgc 240 caagggaaca agacccaaag gcaaggccaa gagccttcca ttttgtccaa tagacaagaa 300 aacatcaaaa caacttgaag caatcagggc tattttaaaa gagagaacac ctattaaatc 360 agctattgca caacaagaaa agactagtgc caggagggtt gctcgtgatg ctaagagttg 420 420 <210> 9 <211> 447 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(447) <223> Transcription elongation factor 1 homolog mRNA <400> 9 tttcttgcat tttcgtgaga atttgtaaag acttcaggtc gttctctagt tttgcgatct 60 tctttgcctg gtctgctact ttcaagatac attctgatgc aggatttgat tccgagcctc 120 cttgacacga gaattgactc ataatgtttg actgagcatg gacaagattt gtcaaaattt 180 ctacttgttt ttccaatttt tcaaccttgc tatcaggtga cgagccccga gcctcggcga 240 taacaagcgc aattaccaaa aatacccaaa acatctcgac tcgattcttc tctatattgt 300 ctgagtgtct tcacaagtta agatcgttta gttaagacgt ccaatgacga aatggtataa 360 tctgtagtgt tactgatttc cctcagttgc ctcgagttta tatatcctcc ccggccgtaa 420 tggcactctg cgttgatacc actgctt 447 <210> 10 <211> 929 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(929) <223> Dynein light chain <400> 10 atccgaaaac ttcacatcat atttatttgt ttttgaagaa atttgcagta acattacgcc 60 atggatgact ttcaaagtgg agaagagact gcgttcgtag tagatgaagt gagcaacatt 120 atcaaagagt caatagaagg aacgataggc ggtaacgctt accagcacaa caaagtgaac 180 caatggactt ccaacgtcgt agaacaatgt ctcaatcaac taaccaaact aggaaaacct 240 ttcaaataca tagtaacatg tgtgatcatg cagaaaaacg gtgcagggct ccatacagca 300 agttcttgct tctgggataa cacaacagac ggaagctgca cggtgaggtg ggagaacaag 360 acgatgtact gtatagtcag tgtctttggg cttgccatct agaaactgcg ctttgtgcac 420 cgaactaaca aaaacgtatc tcaactgaag tattggttct cccatctaga atatgcaccg 480 attttccgaa tattttttta aatatttaca caacgtacat aaaagcatgc tatgagttat 540 aaatttgtag ggaaaataat ttagttacaa aatgtcctgc ttaccctcta aaaacagcgc 600 ttacaaagaa ctgtcaaaaa cctatctcaa ctgaagtatt gttttcccat ccagaaacta 660 caccttaaca ccgatttaac aaaatagtat ctcaacttaa gtattgctat gtaaaaaatg 720 cactttttac accgaattga agatttttag tattttttag aggcagcttc ggtgccaaat 780 atgcaattga gtctcttgct gctacttgaa taatataatt tattcgttta aaaaataaac 840 tgccttataa aggggttagt aaaatagtag aaagttaata tcattttgag aaagtgcaaa 900 aagtatgttg aagggtattc catgtttga 929 <210> 11 <211> 614 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(614) <223> ATP-dependent Clp-type protease (AAA+ ATPase superfamily) <400> 11 aattcgtggg acgtttccca gctgtagtgc ccttccagtc tctaagagag gacatgttaa 60 tgcgaatctt gaccgaaccc aggaatgccc ttgtaccgca gtaccaggct ttgtttagta 120 tggacaagtg caatttggag ttcacagatg atgcgctcag 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cacaaacatt gataaagttc 300 ctgttaatgt cagaataacg tcgttacctt cagctcattt ggactttgaa gatgccatga 360 gtgaggctaa ggatatcttc acctctatat gtccaaatga agatttctta ccagctgttc 420 ctaacccaga agacataata tgggatgata ttggaagttg ttcgaaggag gaaccatgtg 480 aacaagctag tggtgaagtc attcctgcca ttgacgcacc aagttcagaa gtcctaactg 540 aagagtctgt tgaagactct tacgatgatc cattagaaat gaatgataaa gaagtgtcaa 600 actctgaaga tatatcaagt tctgagaaca gacccgagac agagattgaa aaatgaagta 660 taattgtgcg gttgcatctc aagcttttcg gcccgaaagg tttttaacct ttaattttag 720 caataagcaa tccttgtggc gaaggactat aaatgattac atgtgatttt cgtgcctctg 780 gctaaaaatg gaaaaccagt aggaaaccac tagtattaaa aaattagata aaggctgttt 840 tttatatgtc gtaatttaat ggcatagtcc gttggtaatt agtgcataat tatgatgaat 900 tgtctgtcgg aaaaaattca gcttcattga tcatggtgtg gacaatcgat cgcagaacag 960 caccgatgaa ttatgacatg tgaacaccag tggtgaacac agacaatgtt gctctgcaaa 1020 taatttagtt tatccataaa ttagtgaaga taattagtct atagaaatgt ctgtgaggca 1080 aaaattaaaa gtcatc 1096 <210> 13 <211> 1301 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(1301) <223> Phosphoserine aminotransferase <400> 13 gtgtattctg gacatcgaat tattaccctt ctcctgatcc gaattttaag tgtatttttg 60 tctttaaaaa tagtcaatca cacgctatat atcgcaatct gggactaagt tagatgatga 120 taccaacaat taatgatgct accgaccacg gattgtctac ggattctaaa tccgttttgg 180 cgccagcaaa gcgttgacac tgcctatagg gccattaggt aatgtcgcag aatagccact 240 ggatcactcg catcagcagt acgttagata tgacataaga atacaatatt atgtggaaat 300 gctattcgat tttcgttatg tgagttatcc tctgaaagtg tttcagtacg tgaataaatt 360 attagaattt tacttaattt aaaacaattc cctcatattt ctacaatctt tacttgctgt 420 atttttcctg gaaattcttc atgaattcta tcaaatgttc aacctcatgt aacatcactg 480 cattatacag ggacactctt aaaccaccaa cagatctgtg tccgttaacg tgcttatatc 540 cctgttcgtc tgcttcagca acaaatttct tttccagatc ctcatttggt aatcgaaaca 600 caacgttcat tcttgaacga gctttgcttt cgaccagggg gttgtaaaat ccgtttgaat 660 tttccaaaaa gtggtacatt gtagaagact tctcgtcaca tcgtttcgcc atttctgtca 720 gaccgccttc ttttatgatc cattttaata caagccccat gatgtaaaca ctatatgttg 780 gcggcgtgtt aaacacagaa tttgcatcag caacaacctt ataattaaaa cttgtgggac 840 aacatggtaa gcttctgtcg agtaaatcct cacgaacaat aacaaccgtt actccagggc 900 atccgatatt cttttgagca ccagctatga tacacccaaa ctttgacacg tccacaggcc 960 tcgtcaaaaa gttcgaagac atatcacaaa ccaaaggaac gccgtttgtc tcgggtataa 1020 aatcaaattc aactccgtga actgtctcgt ttgcacagta ataaacatac gaggcgtctt 1080 tattcaactt ccagtctttc tcatcaggga ttgtggtgaa agtcttaggc tttggaaaaa 1140 cgtaattgac ctgaccatat tttgctgcct cgttagcagc cttggatgac catgttccgg 1200 tgacaagata gtctgcactg cccccctcct tcataagatt cattgggaca aatgaaaact 1260 gcccatatcc accaccttga cagaaaatga ccttgtagtt g 1301 <210> 14 <211> 306 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(306) <223> methyltransferase <400> 14 aaaatatcac gcattgcaaa tttttgtcag gagattggga atatgcaaaa tcattgctag 60 aacctatgtc atttgatgtt attctcactt cagagactat ttataacagt gatgtacaaa 120 aatcattgta cgaacttata aagttctcaa tgaaggcctc tggcgtggcc ttcgttgcgg 180 ctaagagtta ttattttggc gtgggtggtg gcatagacca gttttccaag ctggttaagc 240 aagatggggc atttgatatt tctagtgtta caatgagttg tgaaggagtg aaaagagaaa 300 tattag 306 <210> 15 <211> 203 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(203) <223> Glycosyl transferase, family 8 - glycogenin <400> 15 ctccaggatg cttcttttgc tgatggaaaa atcctaaaag ctttttaagt ctagaggcca 60 ttgagttcct tccatttcgc tgagcatgaa taccatgaaa catcaaatct tgaaggcaaa 120 acatttcaat tttctcaaga tatacatctt ttgcagcgcg ccatgctttg aaatagatct 180 caccgtatac aaccagtgtt cct 203 <210> 16 <211> 1771 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(1771) <223> G protein-coupled receptor <400> 16 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg atacgaggca gggttactct 60 aagggcacac gcgcgcatca attgacttat ccgttcagtt taattcaacg taaataaagt 120 tcgtgacaca tgcagagttt ggaaaattgc acgggttgtt ccaatacaac tggcaacaac 180 acagaatcgg cggtctacaa caagcttttc tccgtggcga tattcataac catttacgtg 240 ttgttcctgc tattcgcagt cattggtaat ggccttgtat gttggattgt cctcacaaac 300 cgtagaatgc acgattcgac aaatattctt ttggttaatt tggctttaag cgatttactc 360 ttggctgtcg ccagcacatt tcaagttgcg gattttgctg tcaaggattt aaatcttggt 420 gatgttggct gtaaattcca aatcaacatg gtgaatattc cttacggtgc ttcttgtttg 480 acgatcgcct ttatttcctt cgagcgatac tatgccatat gccgacctat ggacttagat 540 tatgttaagg aacggttgaa atatatcatt ccgtcaatat ggcttctttc gtttacgata 600 tactttccaa ctttgtatta ttgtggtagt aatctgaagc gtgaaggtga tcaactcagc 660 tgtgactgca catatcgttg gccgagtctg aaagcgaaga atattcacgg tgttttgatt 720 gttgtgtttt tgtatttcat accattcacg gtcgcatcat gtttttattc tgtcgttgta 780 cgtagattga agaaggtaat ccctggggag aatcaaggaa atattgctgt gtataaatca 840 agacgcgggg ttgttagaat ggtcatggtt acgttgatcg tattttttat tgcttggaca 900 ccttacaaca ttctttactt gctgaaaaga ttggaggttg actttcgcag tgtctaccca 960 ttcgtgtggt atccagccct tttgttagct ataattcact gtatatgtaa cccgatcata 1020 tattgtctac ttggaagtaa ctttcgaaag gctttcaaga caatattatg ttgtcgtagt 1080 tgtcacgtcc ctggcttcgt tcaagatttc cttggtcaga gttccactgg gaggacaaca 1140 cgtcaggcaa cgcgtcaagt acacagcaat gacgtgcaga tagaaacttg attctaacat 1200 acagtctgta ccgaatatat ttgaggtatt tcgaatcgga agaagccatc ctatttggac 1260 gtcagttttt gagaatctgc gcatgcatgt gttgtaaaag aattactttc tacagatcca 1320 cgaaagttat ttcgtaataa aggaccgaaa caaatagagg aacaatattt tagttaaaaa 1380 acttaacgca gtagagtaga aatttgacag atgcaaccac agtgaaattt gttgaaattg 1440 ccatttaaca tgtacacttt tataccccat gttcaaacaa tattgataca gatattaaag 1500 gtaaatgtca agaattgaaa tacatcaaag ttttaaatat tttggaatta aatcatttta 1560 aattttaaag tctacatgca acagaggcca gaaaagtctc ttcttgcctt cgtcacccat 1620 cgcatttggt gccagttttt tttccagatc taactcgtca atttgttgac aagctcgcta 1680 caaagtgttg cggcataaat cgggtataat gtgatctatg tggtatgaag atgatgggtc 1740 actaatatcc accttctcca tcatgcctac c 1771 <210> 17 <211> 1138 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(1138) <223> Ca2+/Mg2+-permeable cation channels (LTRPC family) <400> 17 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg gtctgaaagg gaaagacaga 60 aataattaaa acgtaaacaa caaacgcaat agatttatca cggttaacgg tgacttccaa 120 atagctgtaa aacaaggttg gttttgtgaa tatcgtgctt ttaaagtcat gggaaatagt 180 agctcacacg aaacatactc ttcttcaaac gctcacaaag acggctatca ttactgggca 240 aagtttgaga ccgagccttt tgatgagggg gcttctcgat atgcttttaa aggcacctat 300 ataggagaag gcccaatgaa tggccgtacc tgtgtcacta aggtgttcaa aaagaagtac 360 gaaaagaatt ttgacatgtg ggtgcctgat ttggcttcaa gcaagaaagc tcagatgttc 420 gcagagaagt tcaatactaa agaactttac caacttgata ttgagccgaa acgagagttg 480 aattatgtta ttcctcttat tgccaaaaca gacgcactat cacggtttta tttgctttgg 540 tttatcccat ttgggtctga ggataaaaga tatgttatgc cacaagagta tgtagctatt 600 gagccgtata tagatggaga ctatgaaaag ttcaactcta acggggggtt tgaggatcag 660 aacctaagtt cactactacc agccttctct cactggactt gggaaatcag tggtcataaa 720 tatatggtat gtgacttgca aggagtaaaa ggcgatggtg aatataagct cacggacccc 780 gtggtgcact caatagatca gattttcggc aaaaccgatt tgggtgtggt cggcatggag 840 aaagtcctgg ctaatcatga gtgtaacttc atttgtcaag agctggggct acagaatccg 900 atgaaacatg tctatttgcc agctttagca agaagtacca cctattcctt tcaactaaca 960 gaggaagaaa agttaagaaa taagatagga gtaagccgcc atttccaagt catgacggcc 1020 attctggaat aaatcatgac ttagttgcta ttagttgcta tctccatgca taccaaaaga 1080 gacttgacat gtatatttgg tgttgtttca agctaaaata ataaaagaaa ggtacttt 1138 <210> 18 <211> 1074 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(1074) <223> Collagens type IV and related proteins <400> 18 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg actatagacc tgcacattgg 60 ttggaaccac cccaagaaga aagaagacac tcagttaatc atgaaatcga agacattcct 120 atcactggtg attttctact ggtttatacc aaagtacagt catcaagcat gcggtccagc 180 atcagctccg acattgccat cagatccaaa tgctccgatt taccagagac taaaaaagat 240 tccttcgcct aaaacaactg cccaaaagat tttggacaat tttataaagt ttactccagg 300 agtcgcaaag agacgaataa ggaccgaaga tatcattttt gtaatggatg gatcaggttc 360 agttggtcaa tgtgaatttg atgaaggaaa gaacggtttg attagtttga taaagatatg 420 ccagaaaaca ggttattctt gcgtacatgc tgggattacc tttgcctcgt ctgcacagag 480 gaactttaag ttcttaccaa gagcgcaagc aattcaaaaa atgagagcag taccatatcc 540 tggtgggtgg acaaatacag cagcaggttt ggaagaagca cgcaaacttt ttcttgacag 600 gaattcagga gggcgacgcc gagcaaaaga gatggttttt cttatgactg acggacagtc 660 gaacacaaat tcccacctta ccgtaccgaa cgcgaaaaag ctcaaagata tgggtgtgga 720 aatttttgtt gtagctgttg gtggttttag ctcaggtatt aaagaaattg ctgaagttgc 780 ttcatatcca ccagagaagc atgtttaccg aatttataaa aatggagact tcccatgggt 840 catgaaatta gttctagaga aagtgtcacg gggaaggtat aaagcgatca aaactccatc 900 ccagtgcagc taaagagatt tctacctgaa ctcatgagct ttcgtacaga taaaaagtag 960 tataacatga ataattcaca aaatatgatt aagtaatgaa ataaaaacgt agagcaatag 1020 atccagcctg catgacgact taataaattt gtattgaaga aataataaat ttat 1074 <210> 19 <211> 1249 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(1249) <223> Guanidinoacetate N-methyltransferase mRNA <400> 19 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg gccatgaatt cgatgagagc 60 aaagcgtttt aagaatatcg ttcgaatgta ggcagtacat atttaaagat tttttgctca 120 tatggaaggc gaagccgaaa gggaggaaac tctaggcaga gcagacgccg cagagcaaca 180 aggcgagagg attaattttg tgtccaggga tggccaagaa acatgcgaag gccagccatc 240 ttcgacacct tcaatgtcgt tgaattctat gcctgccaat tccgaaacac atgtggacac 300 cagtgctata actttaaatg aggagcaagc atcgcaacag tttgctgctg aatcagaaaa 360 gaaatctgta gaaaaatacg gtaatgccga ttgggttgaa ggtgcaacgt cacaaagtga 420 acgtggaaat ggtactgaac taaatgcatc cgttgctgaa aacatcatgt ctgccaacac 480 cgagacaact tcaaatcaag tgactgttat ggggaggaat attgatgatg ttcaacgagt 540 tgtggtgcaa gaaacagtta ctggtatagt tgaggtagat tctggaaaat ccaggtatgc 600 tgacgaattg tcgagagatc ctgacttttc aattgaggaa gagaaaacaa ccatttcaaa 660 gagtggaata aaagcagatc aaaacgaggt tttagacaaa tgcttttaca atcttagaaa 720 acctacaaac ggatgaagca agaaacgttg atgatgggca agttacgcag gaaattgtaa 780 agcaaccaag cgagaagaaa aagagcgaga gtaacaattt acctttagcg tttaatgtta 840 ttggcacaaa ttttgacggc aagagtggca taactgagga ggataattcg ggcttgagat 900 gtgctgctga gttgaagagt cctccgtgtg ttgaagaaat tgaatatacc atttcaaaaa 960 gtgaaaaacc gggtttgaat gaggttttag acaaatgtta taaagccgta caagagatgc 1020 aaataggtgg gtcattaaat actcataacg ttgtgcagca atcaaaagtg aacaaagaag 1080 gaaagaacaa ggcgggcgag aatacaaaga gcacaaagaa aggcgtggag aacaaaaagg 1140 ataccaagaa agacgacgaa agaaaaaagg atgcaaaaaa agatgacgag aagaaaaagg 1200 actgcagaga aagacgccaa aaaagaaaaa gaaatacaaa gaaagacgg 1249 <210> 20 <211> 1701 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(1701) <223> E3 ubiquitin ligase <400> 20 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg gactgatttg tatcatgtat 60 gagaactgaa tgcgaatttt aatttttaac ttcgaaatca gtgttggcgt gtagtaagtt 120 tgtgtggaca cgtttaatac agtattttga aaggtttttg taaacattac gtggaaggaa 180 tgaagtttat caaaaaaaag ctgaaataat tctttgttgc gaaatggaag aggcaatcac 240 ttgcaaggtt tgtgcagaaa aattttgtga cgaagaagga cttattccaa ggatactaac 300 cgcttgtggg catagtttct gtgagtcttg tctaagtaaa ctacaaaata agaagtctat 360 acgtattaaa ggtgttactc tgtatcaata tgagataaaa tgtccaaaat gtaaaacaga 420 cacgatttct gacaaacgca gtagctatct tccaaagaac tatgcttact tagacttact 480 cgatgaagtt gtaagaagtg gaagagatca tttaaaattt tgtcatgtac acccaaacta 540 tgtcctagac atgttctgtc atgaagaaga ggaagcagtt tgtatgtatt gtacaacata 600 tggcaagcat aagacacaca agatgtctaa attgtcatgg ttttcagaca agcaagcaga 660 atctatacag tacaaaattg attgtataga tgatgtcatc agtcattata atgatcttag 720 tttatctctg gaagcaagga agcataacct taagcataaa tctgaacata ttcaagatgc 780 aataaactca agattttgcc atatacgatc agagttaaac aatatccttg atgcaaagca 840 agaatctgtg ttgagtcagt tgaataagtt ctccacttct caaatgtctt tgttgaaaat 900 gcaagaagaa gctgcaatga atttcacctc caaacttgat gaaaagagaa attgtgctaa 960 atatttcctt ggcacagctg aagaatgcag tattgcaaaa gaaaaaaaat tacatgatga 1020 catgctgaag tgccttgatg atgcacaaag tcataaaatg ttaacaaata atatgtatga 1080 ggtacagatg gataactcag atcacattgt caatagtgtt agggagatgg tcaatgattg 1140 ggtttgcaag gttgaagaaa caaagctaga accatcactg gaatctgtgt ctacattgtt 1200 ggagcaacaa acaccttctt ttggagacag aatggatgtt ctgtttggtg atgctagcga 1260 aatcaccatg aagaatttat ttgaagaaat tgattgtcaa ttatggtgtg atggtaagct 1320 gcaacattgg gaaatagact gtgatggaaa aacagagtgt ggtctagaaa cagagccatc 1380 agatgaagag tccaacatag aatgtgttgc aagtgatgag gatgactaag aatatagtta 1440 aacacgtaga attttctggt tgtttataac accaacacaa ttgttataaa gaaagctgtt 1500 aagagatgaa gagatgaacc ttcataggtt tattactttg ggctattggt tacagccccc 1560 ggctgataga caaaaagtaa tgaaaccagg ctatgtatat taagttgcca tatatttcat 1620 ttatatacct tcactttagt ttttcccatg tgcactgatt ataaatacat gattggaata 1680 gacttttttc tgaaatatag t 1701 <210> 21 <211> 348 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(348) <223> relaxin 3c precursor (Rln3c) mRNA <400> 21 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg atataacaga aaactgcggt 60 tgaatttggg tgaagaaagg cgattaaaca accgtaaaga tgttaaagat ttgtctgttt 120 gttgttgcaa ttacatgctc catatttgct gatgcaggaa ggcttgatga atactttcgg 180 aatgatgaca acgaaaacga tgtcacgttc agagaaattg aacaaacaag gcgtggcata 240 cccggacatc tcttctgcga aagaaatggt gctggttgta aactaaagac tcaagctact 300 gcttacataa aagatcaata cacggatgga gcagtattct gtcaaaaa 348 <210> 22 <211> 472 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(472) <223> Triglyceride lipase-cholesterol esterase <400> 22 tactcctaaa aaatatgatg tttccaaaat ccgggtaccc gtggcgctgt tttccgctga 60 ccaggactgg ctggcaactc ccaaagatgt ttccttacta gaagctaaac tccaaacggt 120 ggttttcaac aaaaatctta cgtcttggga ccaccttgat ttcatttggg gaatggatgc 180 caccactttg atttatgaag acataaatgt tctgctgaaa aaatatggac cacgaggaat 240 atgatcggga gtgtgaactt ggatgtcgcc ttggttttta agcttagaca ggatacttaa 300 gctattattg agaccagggg tttccacaaa gcttttgttg taacgttgct gataccttct 360 actagcgcgt atttttagtt ttttttacta actagtatcg tcttagggga ttcatggatt 420 aggttaaatg ctttttacca taactttggt gtaatttggg ttatatagtg tc 472 <210> 23 <211> 1123 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(1123) <223> HMG box-containing protein <400> 23 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg attctttttc gaaagtaaac 60 aaagtaaaca cattttgtaa agagttggtt gtaaaaatgc tttcttttac gaggttttgt 120 acgagatctt gtggtcctat cttgcagcaa tgtgcagtga gatgcacagc tgttttacaa 180 gtgaggtatg caagagctaa agtattgcat gaccttcctg agaagccgaa aagaccgcca 240 agcacttggg tcttattcct gaaagaacgc cgtaatgaac tgcgacaaca gcccgaatac 300 gaggacttgt ctctgatgga aatgacggca aagataagcg aagaatggcg gaattttgac 360 gagcttgata agataccgta cagggaaaaa tatgacgaat ctttgggcga ttatagacgg 420 cgaatacaag agtacaacat gaatttaacg tcagatgata aacgtatttt acgcaatatt 480 aagaaagatg gaaagcgaga tatacgtgca tttgagaaag agtttccaaa gccaaaatat 540 cacggcaatg gttatatttt gtttgtgaag tcttgtcata aagaaagtcc gcgcagagag 600 ggtgaagata tgaaggactg gatccgagag tgtgctcaga aatggaaaaa tcttgatgaa 660 gaaacgaaag ataagtttaa cgagcaagcg tcgactttat tggggcaata cagagaagaa 720 atgagagaat ggaaagataa atataaaggg tggaaaaaaa gtggcgcatc tcacaactaa 780 cttacaaaag ttaaaatcta tgtccataaa aacacttcat atgtaaagga atatgatatt 840 tgtaaataga aaaaactcag ttttgttgca gttttcacat tgaactacca ttgacatgca 900 cctaaccacc ttggtttcaa tttggttgtg aaatcccaat catatcaaac aagaggtatt 960 aacctagggg ttgtagtctg tgataaaagt atccccagaa aaatatagat aaattagaac 1020 atggttcata gccctggtgg atatatatat taaaagttca gattggcata tttggagaaa 1080 ttgcatggga aagacattac catacacagc aaagattcct aaa 1123 <210> 24 <211> 877 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(877) <223> Splicing factor, arginine/serine-rich 3 mRNA <400> 24 gcagtggtat caacgcagag tggccattac ggccggggac ttgatcttag cacttcaagc 60 aagaaacagt ttgaagaaga gcacaagaac gatgaagagt tttgcgctgt tttgtttcct 120 attgttggct tcggcctgcg tttttgtcgc tcgagcggag gaagaaactc ccgcagtcga 180 tgacgctccc aaaatggagg atcagcctga gacagctgac gtaacagctg acgaggagca 240 agccgatgaa gaggaggcgg aatccgatga agaaaaagag gaagaagacg aagaagagaa 300 agaagccgac gaagaaaacg aagatgaaga gaccgaagaa gatgaagaag aaacaactga 360 tgttgccgat gacgagcccg agaagcgagg ttggaaatgc aaatactaca ggaagggaag 420 gctcaggtgc aaggcctgtg gatgcagacg tgtgtgcaaa gccagatggt gcgtccgacg 480 tgtgtgcaga cgatatagat gtggtaccag gagggtgtgt cgtttggtga ccagatacag 540 aaccatcaga tacaaatact acttccctta ctaccgtgga tatgggcctc gctggatatg 600 gaagaccaaa cgagttgcat acaaagtcag acactgcgta aatgtaccca gattctgcac 660 ccggtgccgc aacgttcgtt accgatgtgg aaatatctgc aagactgtgt gcagatacag 720 aaagtgcttc ccatactacc gcggataaac ggtcacactt cgtgaaagat acctggttaa 780 attacggata attatgattg gaaaatattt actttactag cattgcatgt agaacaaagc 840 acagaattgt caagtaattt tgtgttgagg aaatata 877 <210> 25 <211> 557 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(557) <223> Response gene to complement 32 protein <400> 25 aagcagtggt atcaacgcag agtagccatt acggccgggg gagattcaag atatcttaac 60 tgaacgtcct cgcagttttg acatggaggt gagaaggtat agagaaaatc aacgagatcc 120 tctgtcaaaa acgttcatgg gaatacgact aaaatggagc gtgtggcgag aagcaatggt 180 tccacaaaat gtcggtgctg taaacccatg gctttattct cctcgtactt ctcgccaggg 240 tgttacaaca cattattaca acaagaacac tcgtcaggaa cttgcccaac aatgtcctga 300 gaacgaaaat tgttgtggtg tttacgaatt caaagttgaa agaaactatg gagaagcggt 360 tgtgtacatt ggctctacac acagacgagc agggagatct atgtatcgac ggataagcga 420 atatctcacc aacggaagcc atataagaag gatcattcag agagctcttg ataggcagtt 480 taaaatctat gtacgatgga tgaaaataag agcacccttt tatcattggg caaacgggag 540 acaactagcg gaacggc 557 <210> 26 <211> 719 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(719) <223> Retinol-binding protein I <400> 26 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg agagttcctc gaccatctga 60 agagacaaaa gtcaactgca acgaaatcaa atttggtgtt tgacaattcc cccaagcaat 120 cattatgaac gttcaatttt tggtgtcatt cgttattgca ttatcgcttg ttcccggtcg 180 cgaagcggtg cgctgcagaa aaatagaaga aggcgtgtgc tgtggaaatg gtaaatgcga 240 tacatcctgt ggcgattgtg atggtggctg caatgacctg tgccagttta ctcattgtaa 300 ccccttagaa tggttgaaat gtgccggtaa agtggctgca tgtgcaggtg cctgtatacc 360 taatatcaga tctccagcgt gtattgcgtg cctcggtccg ttgtggaaca catgtaaaaa 420 gtgtttttca aaagaagtta gtgtacaagc agttttggaa gataacaaat acatgttaac 480 tgcttatcac gattatttat atgacatata tagaaagaaa tgagccatga acgaaatttc 540 accagtggca atggctcacg agaacaaaga aaaggcgaac agttaaaatg aacgttaagc 600 atttacaact ttattatttc agtagcatta atattttagt aaggaattaa tagcatgaag 660 ctaaaattct ttctttagca tgcatgttaa tcacatgatc atattaaata tattgtaac 719 <210> 27 <211> 2040 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(2040) <223> DNA-binding protein jumonji/RBP2/SMCY, contains JmjC domain <400> 27 agccattaac agtgaatgtc ttaacgtctt cttcgggtag tgttagtagt ccgccactaa 60 tatcaccttc actaatgtca cccggattgt tatctccatc gagacattac tcgctactct 120 cgccgtccga actaaagaag accagtcaac agggtactgg ctttagcgct cttggaagtg 180 ttaaagtaag tttgctcttg gaacctggtg ccttaccgca accaccagcc ttacctcaga 240 cgccttgtcc tcgtgagaaa ttgtcgccac caacacccag cattcgtgtc gaaactaaat 300 ctgaagctta ttcgactgag ctacaaaatc tatgcctttc tccatcccaa ccaatcacag 360 ttataagagg actcgataaa gcacttggca tagatcttag tttattctca acaaaagcat 420 tgttggatgc tcatgcagac cacgaagttg aagttcgaac acagaaacag cagttgtcag 480 acgaaaatat tgacgatgaa ggacgaaagg tttggctttg tgaaagtagc agatcgtatt 540 ccactattgc taaatatgct caataccagg ctacgacctt tcaagagtct ttggagcagg 600 aagatcaaga acgtaatctg tcagacagtg attcatcgtc atctggtcag aaaaggaaga 660 aacgaggaac ccgaaaaatt ataaagtttg gtacaaactg tgatctttcc gatgaaaaga 720 aatggaaagc gcaattcctt gaacttaata aactgcctcc gtttttaaga gtcttctcac 780 ctggcaacat gcttagtcat gtcgatcacg ttatcttggg aatgaattca gttcagttat 840 acatgaagat tccaggatgt cgtactccag gtcatcaaga aaacttgaac tttagctccg 900 ttaatatcaa tattggtcct ggagattgtg agtggtttgg tgtgcctttt gaatattggg 960 gagctattca caatttttgt gagaggaata atgttgactt cttaatggga tcttggtggc 1020 caattcttga agatttgttt gaagagcggg tcccggtgta tcggttcatt cagaaacccg 1080 gtgacttagt atgggtgaat gctggtacag tgcattgggt gcaagctgtt ggatggtgta 1140 ataatgtcgc ctggaacgtt ggaccattaa cagaatttca gtacaatatg gccgtcgaaa 1200 gatacgagtg gaacaaacta caaggaaata gatctattgt tcctatgatt ttattgacgt 1260 ggaatttagc ccgaaatata aaaatttcgg aaaagaaact gtatgaacac atgaggcaag 1320 tgctggcacg agtgttgaaa tactgtcagg taactttgga ttgcttgaag gaagctggtg 1380 tgacagtgac actacaaaga cgagttgagc acgaagctgc ccattattgt tctgtatgcg 1440 agactgaagt gtttaacatt ctatttgtaa caaacaataa gaaacaccag gttcactgtc 1500 aggattgtgc aagaaagacc agcgatgttc ttcaaggatt tgttgtctta caacagtttc 1560 ccatggaaga gctgtataaa acgtacaatg acttcaggtt gtaccagcag tcttcgacaa 1620 gtgtgatcca accatagttg taagtgttgg cttgcagtgt cttagaagtc taacgatttt 1680 ttgtcgtgag aatagcgtta acgagagtat aaattacgaa cattttgtta tatagtaggg 1740 tttattttcg tagtttgctt ggtcccacca accatacatg tagatagcga ttttcagaat 1800 tgaactgacg acggtgatta catgctgatg accaactcga ggatattttg gccgaccaag 1860 attaagattc ggtcaaaatc gtcatttcca ccaatgttaa ccgtaatatt tatactactt 1920 ctcactacgg taaaccttga tatacctttc attacacaag cacatatttt acatggttaa 1980 aagcaccctt tttgattgag aaaacggaag catgacttag gtctagtaca tcacattgca 2040 2040 <210> 28 <211> 140 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(140) <223> Vacuolar-sorting protein SNF8 mRNA (clona9 gene) <400> 28 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg attcttttaa ctatcgcaac 60 caaaaacgag gctaaaaatt gcatagagaa aaaaaatatg tgaattccaa gcaaataatc 120 caaaagcaca gctttttttt 140 <210> 29 <211> 786 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(786) <223> LIM domain related protein <400> 29 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccgggg atcaaattat ttgacactga 60 gtatatacgg ctacaacgca aggaggtgaa aacaatgtct tacaggagcg gtgccggctc 120 aacaagccgt tgtacacact gtcggcgtca aattcaacct gaagagaaga agttgaatta 180 tcaagatcaa cctttccatg ctgattgttt catctgtgaa cactgccgta atcctcttgg 240 aactgatagt tttgtgaaga gggatgataa acgctattgc caaaaatgtt ttgagcgcct 300 atttgcaaag aactgcaatg cttgtggtga catcataaag actacttccg ttgattatga 360 aggtaacgcc taccacagtg attgcttcac atgtagcgaa tgccgcaatc ctttggctgg 420 aaagaagttc cataaaatgg gaagaaagct ggtgtgtaaa gcatgttacc gtgataagta 480 cgccaaaatg tgcgattact gcaagcaagt gattgaagct aacatcaagt tcgttgtgga 540 tgatgagaaa acctatcatc gtgagtgctt cacttgcagc aagtgtggtc gacctattga 600 tggagagaaa tacaacatca agggggacaa ccgtatctgt ttgaagtgtc ctacctagga 660 tttcacaaaa ggaactacct taatgattct acacctctgt atcgaaaatt gctgtataca 720 atatctcctc gttgttagtt tatatccaga aagtagttaa aattaaaagc aatgttttca 780 atacct 786 <210> 30 <211> 481 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(481) <223> Neurexin IV <400> 30 taacagtgta ttattgaacc cgcagtacgg ttggtgggtg tcacgtcaag gttcaaagat 60 gaattactgg ggtggagcgg cagtcaacag tggaaaatgt gcatgtggaa tgaccaacag 120 ctgtgcaggg ggaagacaat gtaattgtga caagaatgat gtaaaatggc gtgaagacag 180 tggatacctg acagacaaga aaacgctgcc tgttactgga ctgagatttg gagatgctga 240 cggtactcta tattatacat ggcaaagaga gtctggttat catacactgg gaaaattgcg 300 ttgctggggt taagagatgg aacgccagaa aacgatgtga ttaatatgat ttcttcatta 360 atccaacttt gattaatttt agtttagatt tgtgttatta tacacaaaat aatcaaagac 420 tataatcctt gatctcgatt gatcataaac aggaattgtt ttagacttca atatagtatt 480 c 481 <210> 31 <211> 459 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(459) <223> Protein related to short-chain alcohol dehydrogenases <400> 31 attagtcgta atgttggcac tatcgaagca attgctatgc gatttttatt tctgtttttc 60 aaaactccca aagaaggtgc tcaaactaat atttatctgg cagtgtctga ggaagtggaa 120 ggtgttactg gcttgtattt cactgattgt aaagtcaagg aaccatcacc gggagctcta 180 gatgacgaag cagccaagaa actgtgggat atcagcgcca agtctgtagg actggattga 240 aaaaatacca atctcattgt ggagtatgcc agtttgctgt ttgaactttc ttgtgagccc 300 aaagtggtcc ttgcatcgtg gattattgag gtggatttta tgcttcgaaa tatgaatttg 360 ttatcaagtc aaatgtgtta tctaacattc ggatgtttaa attagattcc aagctgtaaa 420 aatatgtata tttgtagctg tatgtactat ctatcataa 459 <210> 32 <211> 504 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(504) <223> acyltransferase <400> 32 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acggccggga agcattgcga ggataaatgg 60 tggaccaact tactgtacat caataatttt taccccgaga attttaacga ccagtgtgtt 120 ggttggacgt ggtatttggc taatgatatg caattctttg ttatatcacc aatcctgttg 180 attttggcat acaagtacgg atggcgtggg ttgatgagca gtacgggagt gttgttgttg 240 atcagttcca ttgtcattgc ggtaatcatt ggttcctatg acgtggatcc cgttgttaac 300 ctcaaagcgc ttgttcgtgg tacagatgaa cttaagaaaa agtcagaaga actcgataag 360 tatgtctaca gcaaaccgta ctgtcgcatt caaccgtatc ttgttggatt tatcctcggc 420 tatgccgtat acatgaagta tcgcgtgcct attagaagac acggttggtt gcttgctgtg 480 attggttggt ccgtggcatt tgcg 504 <210> 33 <211> 1644 <212> DNA <213> Scleronephthya gracillimum <220> <221> gene <222> (1)..(1644) <223> Low-density lipoprotein receptors containing Ca2+-binding EGF-like domains <400> 33 aagcagtggt atcaacgcag agtggccatt acgccgggag agcacgttgg taaagaaaac 60 aaaaccaggc gttgtcagtg tttatgatta ttatgatcca gaaagtgaag cgagaataat 120 gtacaacatc acagacgaag attgttatga gcaaatggca tcatacgctg agccattcat 180 acttttctgc gcgagaaatg aaatcctggc aatggatatg gcaacttttg acacacaagt 240 tctcattcgt ggtctttata attccgtctc tgtgttggat attgatacgg tggatagaaa 300 aatgtacttt gttgatgatg aacatatata tcaggcgaat tttaacgggt cagatatgaa 360 gattgttgtg aagaatgctt atcccgagga tataacaatt gattggatag gacatcgtat 420 attttggacc aattggggtg aaaataggat tcatgtggcg aattcagatg gtaaagaaag 480 tagggtacta atcaatactc gccatccctc gtgtatagcg gtggatccaa ttgtaggatt 540 cttattttgg gctgaaactg aactctttgg ttactccacc ttgaatcgaa gacaaatgac 600 cagcaataaa ataaaaattt tgatcagatc gcgccattgg tacacaagac taattctgga 660 ccacataaac aggcgagtgt acttggccga tgtcagtggg aacgtgctgt caatggatta 720 cgaaggtgga gacagaattg caatattcgg ttatggatat ggttcgtttt atgctgtttc 780 tttcgatgtc tttggagatt caatttattt caagaaacaa ggatcatctg acattggtga 840 aatgaatgca ttcagcagaa atatttcgcg ttatatttct ccaaatattt cccatatcaa 900 ccggtttatc gtcgtcgaga aatctcggca acctgaagaa ggatgcccat cgctaccatg 960 tggtccttat ggttactgta caaatgtcaa tgattcatac tcatgtcagt gtgaattggg 1020 tttcgcatca tcagatggtg gacggtcttg tacagatatc gatgaatgca ctttgtctaa 1080 atgtaatttt acgggaattc aatcatgcca gaataaccaa ggatcttacc agtgtatatg 1140 taagaaagga tttacactta acggattgac atgttctgaa gtgtacatca gattaaatgg 1200 ttcaaataat aacagtggaa gagtggaaat ctttcatccc tcatttggct ggggtttgat 1260 atgtgatcac aaatgggata ttactgatgg tggcgtggtc tgtcgacagt taggtttcat 1320 aggagcgtta aagacgagac gtgaagacca aacaagtggt cctatgctgc ttgataaagt 1380 taaatgcacc ggtgatgaaa catacatttg ggattgcagt cacagtggat ggaatgttca 1440 tgactgtagc aatttcgaag ttgcaggcgt tgagtgttat tagcatctcg actatttgaa 1500 aataagaaga ctgaatttac aagatgacta cattttatcg aaaagtttta aatcgtattt 1560 catattatga aataatcccc cattttacag catagaatta tttttgcatt aaaattgatt 1620 tcgaaataaa aatattaatt tctt 1644

Claims

유효성분으로서, 분홍바다맨드라미(Scleronephthya gracillimum) 유래의 서열번호 1 내지 33의 핵산염기서열로 이루어지는 군에서 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드;
상기 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열의 상보체;
상기 폴리뉴클레오타이드의 단편내의 연속하여 위치하는 20 내지 200개 염기의 폴리뉴클레오타이드 단편; 및
상기 폴리뉴클레오타이드 단편의 상보체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 필수적으로 포함하고,
해수온이 28 내지 30℃가 되는 해수온 상승 및 pH가 7.5 내지 7.8가 되는 해양산성화를 탐지하는 것을 특징으로 하는, 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스 탐지용 조성물.
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유효성분으로서, 분홍바다맨드라미(Scleronephthya gracillimum) 유래의 서열번호 1 내지 33의 핵산염기서열로 이루어진 군에서 선택된 하나의 폴리뉴클레오타이드;
상기 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 염기서열의 상보체;
상기 폴리뉴클레오타이드의 단편내의 연속하여 위치하는 20 내지 200개 염기의 폴리뉴클레오타이드 단편; 및
상기 폴리뉴클레오타이드 단편의 상보체로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 프로브를 포함하고,
해수온이 28 내지 30℃가 되는 해수온 상승 및 pH가 7.5 내지 7.8가 되는 해양산성화를 탐지하는 것을 특징으로 하는, 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스 탐지용 마이크로어레이.
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제5항에 있어서, 상기 마이크로어레이는 하나 이상의 스팟을 포함하고, 상기 하나의 스팟에 1종 이상의 프로브가 고정된 것인, 마이크로어레이.
제5항 또는 제9항의 마이크로어레이를 포함하는, 해수온 상승 및 해양산성화 여부 탐지용 키트.
제10항에 있어서, 검출가능한 제1 표지물질로 표지된 검체 핵산 및 검출가능한 제2 표지물질로 표지된 표준 핵산이 동일 비율로 혼합된 혼합물을 추가로 포함하는, 탐지용 키트.
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제11항에 있어서, 상기 제1 표지물질 및 제2 표지물질은 서로 동일하거나 상이한 물질이며, 방사선 동위원소, 형광물질, 화학발광체 및 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 탐지용 키트.
제13항에 있어서, 상기 제1 표지물질 및 제2 표지물질은 각각 독립적으로 Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 658, 시아닌(Cyanine)-3, 시아닌-5, 플루오레세인(fluorescein), 보디피(bodipy), 텍사스 레드(Texas red), FITC(Fluorescein Isothiocyanate), 로다민(rhodamine), d-NTP (including d-UTP), 아미노-알릴 수정된 dNTPs를 갖는 반응성 염료, 양고추냉이 과산화효소 및 바이오틴으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상인, 탐지용 키트.
(a) 제5항 또는 제9항에 따른 마이크로어레이에 고정된 프로브에, 검출가능한 제1 표지물질로 표지된 검체 핵산과 검출가능한 제2 표지물질로 표지된 표준 핵산을 동일 비율로 혼합시킨 혼합물을 반응시키고,
(b) 상기 검체 핵산과 표준 핵산 각각의 상기 프로브에 대한 혼성화 정도를 측정하여, 상기 검체 핵산과 표준 핵산의 혼성화 정도를 비교하는 단계를 포함하는, 해수온 상승 및 해양산성화의 이중 스트레스 탐지 방법.
제15항에 있어서, 상기 단계 (a)에서, 검체 핵산과 표준 핵산은 검체 분홍바다맨드라미(Scleronephthya gracillimum)유래 프로브의 RNA 및 표준 분홍바다맨드라미(Scleronephthya gracillimum)유래 프로브의 RNA로부터 합성된 cDNA인, 탐지 방법.
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