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KR102106710B1 - 인간 전분화능 줄기세포로부터 조혈모세포 및 대식세포 분화 증진 방법 - Google Patents

인간 전분화능 줄기세포로부터 조혈모세포 및 대식세포 분화 증진 방법 Download PDF

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KR102106710B1
KR102106710B1 KR1020180121220A KR20180121220A KR102106710B1 KR 102106710 B1 KR102106710 B1 KR 102106710B1 KR 1020180121220 A KR1020180121220 A KR 1020180121220A KR 20180121220 A KR20180121220 A KR 20180121220A KR 102106710 B1 KR102106710 B1 KR 102106710B1
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hematopoietic stem
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허혜련
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강원대학교산학협력단
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Abstract

본 발명은 인간 전분화능 줄기세포로부터 조혈모세포 및 대식세포 분화 증진 방법에 관한 것이다. 보다 자세하게는 혈청 및 피더가 없는 단계적 조혈 유도 프로토콜을 사용하여 인간 PSC와의 조혈 분화 과정에서 BMP4와 CyPA의 역할을 조사하였으며, 초기 2 일 동안 고농도 BMP4를 처리하면 미분화 사람 PSC를 초기 원시 중배엽 및 조혈 계통으로 강력하게 유도하고, 조혈모세포(HSC)의 미세환경을 구성하는 혈관외피세포(PVC)의 파라크린(paracrine) 메카니즘을 통해 조혈모세포 분화 단계에서 조혈 세포의 생산을 현저히 증가시키며, 이는 혈관외피세포에서 사이클로필린 A(Cyclophilin A, CyPA)가 작용하여 조혈모세포(HPC)에 대한 사이클로필린 A(Cyclophilin A, CyPA)의 단기 처리는 대식세포의 생산량을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 본 발명을 통해서 조혈 모세포 유도에서 CyPA 및 BMP4와 같은 환경 요인은 조혈 발달 과정 및 초기 조혈모세포 분화 향상과 및 혈액세포 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

인간 전분화능 줄기세포로부터 조혈모세포 및 대식세포 분화 증진 방법{hematopoietic differentiation of human pluripotent stem cells in a developmental stage-specific manner}
본 발명은 인간 전분화능 줄기세포로부터 조혈모세포 및 대식세포 분화 증진 방법에 관한 것이다.
인간 전분화능 줄기세포(Pluripotent stem cells, PSCs)는 인체를 구성하는 모든 세포로 분화가 가능한 세포로서, 다양한 질환치료를 위한 임상시험, 새로운 약물개발, 독성평가, 질환모델링 및 초기 배아발생 연구를 위해 매우 유용한 재료로 평가받고 있다.
백혈병 등 혈액질환 치료를 위한 골수 및 제대혈 유래 조혈모세포 수획 및 체외 증식의 어려움이 있어, 최근 인간 전분화능 줄기세포를 이용한 조혈모세포 분화기술이 개발되고 있으나, 인간 골수 내 미세환경(Microenvironment or Niche) 모사를 통한 조혈모세포 분화 향상 연구는 미비한 상황이다.
또한, 지속적인 염증반응으로 인한 다양한 호흡기질환 발병은 폐 또는 말초혈액에 존재하는 대식세포(Macrophage)의 분화 및 방어기전이 관여한다. 대식세포의 작용 기전 및 임상활용을 위해 인간 전분화능 줄기세포 유래 대식세포 분화능 및 생산기술 향상이 필요하다.
일반적으로 조혈줄기세포(Hematopoietic stem cells, HSCs)는 골수(bone marrow, BM)에서 전체 조혈 시스템을 재구성할 수 있는 자가 재생 및 다계통 분화 잠재성을 가진 세포집단이다(Badowski and Harris, 2012). 조혈줄기세포의 이러한 기능적 특성은 다양한 악성 및 비악성 조혈장애를 치료할 수 있게 한다(Attal et al., 1996; Gluckman et al., 1997).
현재, 골수, 가동원된 말초 혈액 및 제대혈은 자가 조직 및 이종 이식을 위한 임상적으로 이용 가능한 조혈줄기세포 공급원이다(Haspel and Miller, 2008). 그러나 자가 조혈 모세포 이식에서 HLA 일치 기증자의 부족, 적은 수의 HSCs, 낮은 생체 내 생착률 및 종양 오염과 같은 한계는 이식에 덜 적합하다 (Burt et al., 2004; Quesenberry et al., 2009). Sauvageau et al., 2004).
인간 배아줄기세포 (Human embryonic stem cells, ESCs)는 자가증식능과 전분화능을 보유하고 있어 성체 조직 유래 조혈모세포(hematopoietic progenitor cells, HPCs)의 대안으로 제시되고 있다(Burt et al., 2004). 또한, 체세포 핵 이식(SCNT)에 의해 유도된 배아줄기세포와 전사조절인자의 과발현에 의해 유도된 유도만능줄기세포(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)는 자가 조혈줄기세포(HSC) 또는 조혈모세포(HPC)를 생산하여 환자 맞춤형 재생의학을 실현할 수 있는 대안이 개발되었다(Slukvin, 2013; Tachibana et al., 2013). 결과적으로, 중배엽 및 조혈 계통에 대한 미분화 인간 전분화능줄기세포의 유도 효율을 향상시키고 이들의 이식성을 향상시키려는 다양한 전략이 개발되었다(Batta et al., 2016; Easterbrook et al., 2016).
조혈(Hematopoiesis)은 조혈모세포의 특정 환경과 발달 장소에서 접하게 되는 환경 요인에 의해 시공간적으로 조절된다(Oh and Kwon, 2010). 그러나 초기 유도 프로토콜은 시공간 조절을 고려하지 않고 초기 중배엽세포 유도에서 조혈모세포 생성 단계까지 조혈모세포 분화유도인자(사이토카인) 혼합물을 지속적으로 처리했다(Woods et al., 2011). 따라서 조혈 발생 과정에 관련된 조혈 사이토카인의 순차적 처리와 조혈줄기세포(HSC) 배양 및 발달을 조절하는 환경 요인에 대한 프로토콜을 정교하게 하는 것이 중요하다(Matsumoto et al., 2009). 최근 연구들은 조혈모세포의 다양한 조합의 순차적 보충을 적용하는 단계별 유도 프로토콜을 기반으로 한 인간 배아줄기세포 및 유도만능줄기세포의 효율적인 조혈 분화를 보고했다(Ivanovs et al., 2017; Niwa et al., 2011; Slukvin, 2013; Yanagimachi et al., 2013). 인간 전분화능 줄기세포와 마우스 골수 간질 세포(OP9 및 S17) 및, 마우스 대동맥 - 생식선 - 중뇌 골격(AGM) 영역과의 공동 배양은 조혈 분화를 증가시킨다는 것이 밝혀졌다 (Kyba et al., 2002). 또한 조혈줄기세포의 개발 및 유지에 관여하는 인자를 제공하는 인간 태아 및 성인 조직으로부터 분리된 몇 가지 유형의 세포가 이종 이체 오염에 대한 우려를 없애고 조혈줄기세포 발생을 모방하기 위해 평가되었다(Qiu et al., 2005). 이러한 모든 연구는 시공간적 조혈모세포 발생단계에 따른 시공간적 조절인자를 고려하여 미분화 인간 전분화능 줄기세포에서 조혈줄기세포(HSCs) 또는 조혈모세포(HPCs)를 생성해야 함을 강력히 시사하고 있다.
대한민국 공개특허 제10-2012-0099751호
따라서, 본 발명은 뼈 형태 형성 단백질 4(Bone morphogenetic protein 4, BMP4)의 단기 고농도 처치가 인간 전분화능 줄기세포의 초기 중배엽 유도를 충분히 개시하여 조혈모세포 분화를 증가시키는 것으로 나타났다. 조혈모세포(HPC)의 미세환경을 구성하는 혈관외피세포(PVC)는 파라크린(paracrine) 메커니즘을 통해 조혈모세포 분화 단계(hematopoietic commitment phase)의 조혈 세포의 생산을 현저히 증가시켰다. 또, 분비물 분석에서 사이클로필린 A(Cyclophilin A, CyPA)가 이 단계의 특정 조혈 조절에 관여함이 밝혀졌다. 더욱이 조혈모세포(HPC)에 대한 사이클로필린 A(Cyclophilin A, CyPA)의 단기 처리는 대식세포의 생산량을 증가시켰다. 따라서 본 발명자들은 BMP4와 CyPA가 발달 단계에 따라 인간 PSC의 조혈 분화를 조절하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일실시예에 따르면 (a) 전분화능 줄기세포를 전배양하는 단계; 및, (b) 상기 전분화능 줄기세포를 100 ng/ml BMP4를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 전분화능 줄기세포로부터 조혈모세포 분화 촉진 방법을 제공한다.
여기서, 상기 (a) 단계는 줄기세포에 인슐린(Insulin), 트랜스페린(Transferrin), 셀레늄(Selenium)을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 일실시예에서 줄기세포를 40 ng/ml VEGF 및, 50 ng / ml SCF를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 (a) 단계는 미분화 전분화능 줄기세포의 콜로니를 혈청 및 피더가 없는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 한다.
여기서, 상기 전분화능 줄기세포는 인간배아줄기세포(ESC) 또는 유도만능줄기세포(iPSC) 일 수 있다.
또한, 상기 (b) 단계는 CyPA를 더 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명의 일실시예에 따르면 배양된 조혈모세포를, 10% FBS, 1% penicillin 또는 streptomycin, 100ng/ml M-SCF 및, CyPA를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 대식세포 분화 촉진 방법을 제공한다.
전술한 바와 같은 본 발명에 따르면, 미세환경 조성을 통해 동정된 CyPA를 활용하고, 특정 단계에서의 BMP4 처리를 통하여 인간 전분화능 줄기세포의 조혈모세포 및 대식세포 분화율 및 생산능을 향상할 수 있으며, 다양한 혈액 및 호흡기질환의 발병 및 치료법 개발을 위해 안정적이고 기능적으로 향상된 혈액세포를 공급할 수 있는 효과가 있다.
이상에서의 본 발명에 따른 효과는 상기에 한정되는 것은 아니며, 기타 본 발명의 효과들은 후술할 실시예 및 청구범위에 기재된 사항을 통하여 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 분명하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 BMP4를 이용한 인간 전분화능 줄기세포의 조혈줄기세포 분화 실험을 나타낸 것이다.
(A) 인간 전분화능 줄기세포(hiPSC, DF6-9-9T 또는 hEF12-2)로부터 유래되는 HSC 분화의 실험 계획.
(B) BMP4 농도별(20ng/ml, 100ng/ml)로 처리한 조혈줄기세포 계통의 형태(스케일 바, 200 μm).
(C) 인간 전분화능 줄기세포에서 유래된 조혈줄기세포 계통의 빈도.
(D) 인간 전분화능 줄기세포에서 유래된 조혈줄기세포 계통의 세포 수. (평균 ± 표준 편차, * p <0.05, ** p <0.01 (20ng/ml, 100ng/ml의 BMP4).
도 2는 인간 전분화능 줄기세포와 배양 배지에서의 조혈줄기세포 분화 실험을 나타낸 것이다.
(A) 조혈줄기세포 분화과정에 따른 형태학적 변화. 스케일 바, 100 μm, 200 μm.
(B) 조혈줄기세포 발달의 빈도.
(C) 조혈줄기세포 전구세포로부터 유래된 CFUs의 수.
(D) CFUs의 분포.(CFU-E, 적혈구; CFU-G, 과립구; CFU-대식세포. 막대는 평균 ± 표준 편차)
도 3은 xeno-/feeder-free or feeder-free 상태에서 3개의 다른 인간전분화능 줄기세포로부터 분화된 CFU-E, CFU-M and CFU-G를 나타낸 것이다.
도 4는 PVC-CM 투입에 따른 조혈줄기세포 계통 생산의 영향을 나타낸 것이다.
(A) 발달 단계에 따른 CM으로 처리되는 인간전분화능줄기세포의 조혈줄기세포 분화 계획(hESC 및 hiPSC, 각각 CHA15 및 iPS-NT4-S1로 명명)
(B) 조혈줄기세포 발달 과정에서의 형태학적 변화. 스케일 바=50 μm.
(C) CM이 있거나, 없는 상태의 처리에서 조혈줄기세포 계통의 빈도.
(D) 조혈줄기세포 분화의 17 일째 조혈줄기세포 전구체로부터 분화된 CFUs의 수. 막대는 평균 ± 표준 편차* p <0.05, ** p <0.01 (대조군, CM 0-9 또는 CM 9-17).
도 5는 대조군, CM 0-9일 및 CM 9-17일에서 조혈줄기세포 전구체로부터 나타나는 CFU 서브타입의 분포를 나타낸 것이다.
도 6은 인간 탯줄 혈관으로부터 유래되는 혈관 외피 세포의 분리 및 특성을 나타낸 것이다.
(A) 인간의 탯줄 혈관에서 유래된 혈관 외피 세포의 분리. 스케일 바, 100 μm.
(B) 유동 세포 계측법을 사용하여 분리된 혈관 외피 세포의 특성.
(C) 지방 세포, 골 형성 세포 및 간엽 연골 세포 분화할 수 있는 기능성 혈관 외피 세포. 스케일 바, 100 μm, 200 μm.
도 7은 CyPA의 조혈줄기세포 분화 영향을 나타낸 것이다.
(A) LS-MS를 사용하여 PVC 유래 분비된 분자들의 동정. 음성 대조군으로 사용 된 MRC5. 흰색 원은 PVC-CM에서 별도로 분비된 요소임.
(B) PVC-CM에서 유래된 7개의 뚜렷한 후보 목록.
(C) PVC, BM-MSC 및 hESC-MSC 사이의 CyPA 단백질 발현 레벨.
(D) 미분화된 인간전분화능줄기세포에서 CD147의 발현(본 발명에서 사용된 인간전분화능 줄기세포는 iPS-NT4-S1이라 불리는 hiPSCs 임).
(E) 발달 과정에 따라 CyPA로 처리된 인간 전분화능 줄기세포의 조혈줄기세포 분화 계획. 조혈줄기세포 유도의 전체 계획은 CyPA 유무에 관계없이 5-8 일 동안 대식세포 분화에 따름.
(F) 조혈줄기세포 발달 계통과 관련되어 나타나는 빈도. 오차 막대는 평균 ± SD를 나타냄. * p <0.05 (대조군, CyPA 0-9일 또는 CyPA 9-18일).
(G) CyPA 유무에 따른 유도 세포 사이에서 단핵구와 대식세포 마커의 빈도 비교.
(I) CyPA의 유무에 따른 HSC 유래 대식세포의 세포 수 및 형태. 스케일 바, 50 μ
도 8은 인간 전분화능 줄기세포에서 유래된 대식세포-유사 세포의 특성을 나타낸 것이다.
(A) 인간 전분화능 줄기세포에서 유래된 대식세포-유사 세포의 형태. 스케일 바, 100 μm.
(B) 대식세포 유사 세포의 Diff -Quick staining. 스케일 바, 100 μm.
(C) 3 종의 인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 유도세포에서 발현되는 단핵구 및 대식세포 마커의 빈도.
(D) 적혈구 및 녹색 형광 비드를 빨아들이는 포식세포. 스케일 바, 100 μm.
(E) 인간 전분화능 줄기세포(CMC003, CMC009 및 CMC011)에서 유래된 포식세포의 특성.
도 9는 조혈줄기세포 발달 단계에 따라 CyPA로 처리된 발달 세포의 형태학적 변화를 나타낸 것이다. 초기 시간(d2), 조혈 중배엽(d4), 조혈 전 물질(d9) 및 조혈줄기세포 전구 세포(d13). 스케일 바, 50 μm.
이하, 본 발명에 대하여 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
BMP4의 단기 및 고농도 처리로 미분화 인간 전분화능 줄기세포(PSCs)를 조혈 계통으로 유도한다.
뼈 형태 형성 단백질 4(Bone morphogenetic protein 4, 이하 ‘BMP4‘)는 미분화 인간전분화능 줄기세포(PSCs)를 초기 중배엽 계통과 혈관 아세포를 용량 의존적으로 유도하는데 필수적인 역할을 한다. 그러나 혈청 및 피더가 없는 조혈 유도 조건에서 BMP4의 시간적(temporal) 역할은 완전히 평가되지 않았다. 이전 보고서에서는 24시간 동안의 단기 BMP4 처리가 초기 중배엽 계통을 유도하는 반면, 7일 까지의 장기간 BMP4 처리는 세포영양막(trophoblast) 분화를 야기하는 것을 보여주었다.
따라서, 본 발명자들은 먼저 수정된 혈청 및 피더가 없는 단계적 조혈 유도 프로토콜을 사용하여 인간 전분화능줄기세포(pluripotent stem cell, PSC)에서 단기 BMP4 처리의 중배엽 개시 효과에 대한 연구에 중점을 두었다.
도 1은 BMP4를 이용한 인간 전분화능 줄기세포의 조혈줄기세포 분화 실험을 나타낸 것이다.
도시된 바와 같이 본 발명에서는 Matrigel 코팅 접시에 무혈청(serum-free) mTeSR 배지에서 인간 전분화능 줄기세포 중에 인간 배아줄기세포(ESC) 계통 1 개와 유도 만능줄기세포(iPSC) 계통 2 개를 배양하였다. 조혈 유도시 초기 2 일 동안 저농도(20 ng/ml) 및 고농도(100 ng/ml)로 BMP4를 처리하고 17 일째에 형태학적 변화와 조혈 생성물을 조사하였다(도 1A). 단기간 BMP4 처리는 농도에 상관없이 평평하고 확장된 세포로의 형태학적 변화를 가져 왔으며, 이는 처음에는 콜로니 가장자리에서 나타났고, 중심부까지 확장되었다. 그러나, 고농도(100 ng/ml)의 BMP4로 처리된 콜로니는 저농도(20 ng/ml)의 BMP4 처리된 콜로니와 비교하여 더 넓고 평평한 영역을 가졌다(도 1B). 또한, 17 일째에 초기 조혈모세포(CD34 + CD45 + 또는 CD34 + CD43 +) 및 성숙한 혈액 세포(CD34 - CD45 + 또는 CD34 - CD43 +)의 빈도를 측정하여 BMP4로 처리한 세포의 수용 능력을 평가하였다. 100 ng/ml BMP4로 처리한 세포는 20 ng/ml BMP4로 처리한 세포와 비교하여 조혈모세포 및 성숙한 혈액세포가 높은 빈도가 측정되었다(도 1C). 또한 100 ng/ml BMP4로 처리한 세포는 20 ng/ml BMP4로 처리한 세포와 비교하여 보다 더 많은 조혈모세포와 성숙한 혈액 세포를 생성하였다(도 1D). 이러한 결과는 단기 및 고농도(100 ng/ml)의 BMP4 처리가 미분화된 인간 전분화능 줄기세포를 조혈 계통으로 보다 강력하고 충분하게 유도한다는 것을 보여준다.
메인터넌스(maintenance) 조건은 인간 전분화능 줄기세포 계통간의 조혈 분화 변화에 영향을 준다.
도 2는 인간 전분화능 줄기세포와 배양 배지에서의 조혈줄기세포 분화 실험을 나타낸 것이다.
도시된 바와 같이, 프로토콜의 재현성과 효능을 결정하기 위해, 다음과 같이 두가지 다른 메인터넌스 조건에서 배양되는 3개의 독립적인 인간 전분화능 줄기세포 계통(CMC003, CMC009 및 CMC011)을 가지고 테스트 하였다:Matrigel® (mTeSR + Mat)과 조합된 rhVitronectin XFTM (E8 + Vit) 및 feeder-free mTeSRTM 배지와 함께 xeno- and feeder-free E8 배지. 조혈 특수 단계 동안, 콜로니는 고원과 같은 중앙 영역과 평평한 가장자리 영역을 형성하고, 고원 영역의 가장자리를 따라 묵주 같은 구조가 형성하였다. 투입 단계가 진행됨에 따라, 떠있는 조혈 세포와 혈관 유사 구조가 12-14 일에 나타나고 19 일까지 점진적으로 증가하였다(도 2A). 전반적으로, E8 + Vit 조건 하에서 배양된 세포주는 mTeSR + Mat 조건 하에서 배양된 세포주와 비교하여 보다 균일한 형태학적 변화를 보였다(도 2A). 다음으로, 혈액 전구체(CD45-CD31 +), 조혈모세포 및 성숙한 혈액세포의 일시적인 빈도를 평가하였다. 두 배양 조건 하에서의 세포는 조혈 사이토카인의 순차적 자극에 반응하여 조혈 발생에 상응하는 각 세포 집단의 유사한 상승 및 하강을 나타내었다. E8 + Vit 조건에서 조혈모세포 빈도의 세포 변이가 관찰되었지만 성숙 단계에서는 세포 변이가 적었다. 반대로, mTeSR + Mat 조건에서 배양된 세포주는 성숙한 혈액 세포의 빈도에 큰 변동을 보였다(도 2B). 다음으로 CFU 분석을 사용하여 두 조건에서 유래된 조혈모세포의 조혈 가능성을 평가했다. E8 + Vit 조건에서 세포주 중 CFU 서브타입의 분포 수가 상대적으로 낮은 변화가 검출되었지만, mTeSR + Mat 조건에서는 세포주 사이의 넓은 편차가 발견되었다(도 2C, 도 2D, 도 3).
도 3에서는 CFU-E, CFU-M 및 CFU-G를 함유한 CFU의 형태는 조혈줄기세포 전구체로 분화되었다. 데이터는 xeno- / feeder-free 또는 feeder-free 조건에서 세 가지 인간 전분화능 줄기세포 계통(CMC003, CMC009 및 CMC011)에서 분화된 CFU로 나타났다.
이러한 결과는 본 발명에서 최적화된 조혈모세포 프로토콜이 다양한 세포주 및 배양 조건에 적용 가능하고, 조혈 발달 후반 단계에서 재현성 및 동등한 잠재력 측면에서 E8 + Vit 배양 조건보다 적합함을 시사한다.
혈관 외피 세포(PVCs)는 paracrine 메커니즘을 통해 단계별로 인간전분화능 줄기세포의 조혈 분화를 증대시킨다.
도 4는 PVC-CM 투입에 따른 조혈줄기세포 계통 생산의 영향을 나타낸 것이다.
도 5는 대조군, CM 0-9일 및 CM 9-17일에서 조혈줄기세포 전구체로부터 나타나는 CFU 서브타입의 분포를 나타낸 것이다.
도 6은 인간 탯줄 혈관으로부터 유래되는 혈관 외피 세포의 분리 및 특성을 나타낸 것이다.
혈관 외피 세포(PVC)는 골수에서 조혈줄기세포(Hematopoietic stem cells, HSCs)의 자가 재생 및 분화를 조절하는 특수 미세 환경을 생성한다. 최근 연구에 따르면 비조혈 지방 세포(nonhematopoietic adipose tissue) 유래의 혈관 외피 세포는 체외에서 인간 조혈모세포를 장기간 배양할 수 있을 뿐 아니라, 생체 내에서의 생착 효율을 향상시킬 수 있다. 따라서 본 발명자들은 최적화된 유도 프로토콜을 기반으로 인간 전분화능 줄기세포의 조혈 분화에서 혈관외피세포의 영향을 조사하였다.
도 5에서 조혈줄기세포 전구체로부터의 CFUs의 분포는 CM 0-9일 및 CM 9-17일로 나타내었다. 도 5에서와 같이 조혈줄기세포의 분화는 3종의 인간전분화능 줄기세포로부터 유래되는 것으로 나타났다.
본 발명자들은 인간의 탯줄에서 혈관 외피 세포(PVC)를 분리하고(도 6), 조혈전구세포 형성(hemogenic specification) 단계(phase I, CM 0-9일) 또는 조혈모세포 결정(hematopoietic commitment) 단계(phase II, CM 9-17일)에서 효과적인지 여부를 조사하기 위해, 특정 단계에서 PVC 조건 배지(conditioned medium, PVC-CM)를 인간 전분화능 줄기세포에 투입 처리하였다(도 4A).
흥미롭게도, phase I에서 PVC-CM의 처리시 대조군에 비해 조혈모세포의 생성이 유의하게 감소하였다. 반면, phase II에서 처리된 세포에서는 조혈에 대한 증가된 효과가 관찰되었다(도 4B 및 4C). CFU-G, CFU-M 및 총 CFUs의 수 역시 phase II에서 처리된 세포에서만 조혈모세포 생성에서 유의하게 증가했다(도 4D). phase I 상 세포와 phase II 상 처리 세포 사이의 CFU 서브타입의 분포는 유사했다(도 4D). 이러한 결과는 혈관 외피 세포(PVC)가 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell)와의 조혈 분화에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 의미하며, 특히 파라크린 메커니즘을 통한 투입 단계에서 긍정적인 영향을 미치는 것을 나타낸다.
CyPA는 혈구 전구체의 조혈 생산을 높이고, 이어서 대식세포의 생산을 향상시킨다.
도 7은 CyPA의 조혈줄기세포 분화 영향을 나타낸 것이다.
도 8은 인간 전분화능 줄기세포에서 유래된 대식세포 유사 세포의 특성을 나타낸 것이다.
도 9는 조혈줄기세포 발달 단계에 따라 CyPA로 처리된 발달 세포의 형태학적 변화를 나타낸 것이다.
본 발명에서 혈관 외피 세포(PVC)가 파라크린(Paracrine) 메커니즘을 통해 조혈 생산을 증가시키는 것을 확인하였으며, 이어서 PVC-CM의 분비물을 분석하여 2D 겔 전기영동(2D gel electrophoresis, 2DE)-액체 크로마토 그래피-질량 분석법(liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS)을 사용하여 잠재적인 조혈 조절제를 분석하였다. PVC-CM과 음성 대조군 (human fibroblast-CM) 사이의 차등적으로 나타나는 부위를 2DE로 분석하였으며, 음성 대조군과 비교하여 PVC-CM에서 7 개의 점들이 더 높게 나타났다(도 7A). 상기 선택된 표적 단백질들은 LC-MS 분석을 사용하여 확인되었고, 도 7B에 표시하였다. 본 발명자들은, CyPA가 혈관 신생과 조혈모세포의 유통 및 증식을 조절하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 목표 중 본 연구는 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell)의 조혈 분화에서 CyPA의 역할에 중점을 두었다.
본 발명에서 CyPA 단백질이 혈관 외피 세포(PVC)에서 검출되었는데, 이것은 BM-derived mesenchymal stem cells(BM-MSC) 및 human ESC-derived MSCs(도 7C) 보다 더 풍부하였다. 게다가, CyPA의 수용체인 CD147이 높은 빈도로 미분화된 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell)에서 검출되었다(도 7D). CyPA가 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell)의 조혈 분화에 PVC-CM의 단계 특이적 효과에 기여하는지 여부를 결정하기 위해 우리는 각각 hemogenic specification phase(CyPA 0-9일) 및 hematopoietic commitment phase(CyPA 9-17일)에서 처리했다(도 7E). phase I 에서 CyPA의 처리는 대조군에 비해 조혈 세포의 생성에는 영향을 미치지 않았지만, CD34 + CD45 + 및 CD34-CD45 + 세포의 빈도는 phase II에서 처리한 세포에서 유의하게 증가했다(도 7F).
Sanchez-Tillo 등은 CyPA가 결합 분자 sanglifehrin A를 사용하여 마우스 골수 유래 대식세포 증식에 관여한다고 보고했다. 따라서, 본 발명자들은 CyPA가 인간 전분화능 줄기세포(human pluripotent stem cell) 유래의 단핵구(hPSC-derived monocytes)로부터의 대식세포의 수율에 영향을 주는지 더 알아보았다. 본 발명에서 먼저 3 개의 독립적인 인간 전분화능 줄기세포 계통인 CMC003, CMC009 및 CMC011을 사용하여 우리의 최적화된 조혈 유도 프로토콜에 연결된 기능성 대식세포 생성 프로토콜을 개발하였다. 우리는 조혈 분화 17일째에 떠있는 단핵구를 수집하였고, 5일 동안 M-CSF를 첨가하여 대식세포로 유도하였다.
인간 전분화능 줄기세포 유래 대식세포(Human PSC-derived-macrophages, hPSC-MACs)는 현미경 검사 및 Diff-quick 염색(도 8A 및 8B)에 나타난 것처럼 성숙한 인간 대식세포와 유사한 형태를 가지고 있다. 우리는 단핵구(monocyte)/대식세포(macrophage) 마커 (CD45, CD14, CX3CR1, F4 / 80 및 CD11b)로 적극적으로 발현하고 T 세포 마커(CD19)를 음성으로 발현한 인간 전분화능 줄기세포 유래 대식세포의 표현형을 확인하였다(도 8C). 또한, 우리는 인간 전분화능 줄기세포 유래 대식세포가 기능적으로 식균 작용을 할 수 있음을 확인했다(도 8D 및 8E). 기능적 인간 전분화능 줄기세포 유래 대식세포의 생성을 위한 강력하고 재현가능한 프로토콜을 기반으로, 우리는 인간 전분화능 줄기세포 유래 대식세포의 생산에 대한 CyPA의 효과를 조사하였다. CyPA의 첨가는 표현형 빈도를 변화시키지 않았으나(도 7G), 대식세포의 수는 약 2 배 증가시켰다(도 7H, 7I). 종합하면 이러한 결과는 CyPA가 조혈줄기세포 미세환경 요인 중에 하나로서 혈관 외피 세포에서 분비되기 때문에 대식 세포의 생산을 위한 자연적인 요소가 됨을 보여준다. 이렇게 조혈줄기세포와 대식세포의 발달 환경을 재현하는 것은 의미가 있다.
본 발명의 일실시예에서 인간 전분화능 줄기세포로부터의 조혈 계통 세포의 강력하고 재현성있는 생성은 초기 배아 및 성인 골수에서 조혈모세포의 발달을 조절하는 필수 조절 경로를 시험 관내에서 정확하게 반복하는 것에 의존한다. 따라서, 이러한 조건에서 조혈 프로토콜을 최적화하는 것은 적절한 단계에서 특정 신호 전달 경로를 자극하는 외인성 요인뿐만 아니라 골수에서 조혈줄기세포의 기능 및 항상성을 조절하는 미세 요인을 필요로 한다. 본 발명에서는 혈청 및 피더가 없는 단계적 조혈 유도 프로토콜을 사용하여 인간 전분화능 줄기세포의 조혈 분화 과정에서 BMP4와 CyPA의 역할을 조사하고 조혈 발생 단계별로 각기 다른 작용을 확인하였다.
BMP4는 인간 전분화능 줄기세포를 중배엽 및 조혈 계통 세포로 분화하는데 널리 사용 되어온 주요 조혈 유발 인자 중 하나이다. 초기의 조혈 프로그램은 발달 단계를 고려하지 않고 중배엽 개시에서 조혈 성숙 단계까지 낮은 농도(20 ~ 40 ng/ml)에서 BMP4의 지속적인 노출을 수행하였다. 그러나 최근 연구에 따르면 BMP 신호 전달은 발달 단계에 따라 조혈줄기세포의 이질성 및 계통 출현에 차별적으로 영향을 미친다고 보고되었다. AGM 영역에서 초기에 생체 내에서 출현하는 조혈줄기세포는 BMP4에 의해 활성화되는 반면, 발달 단계가 진행됨에 따라 BMP4 의존성 조혈줄기세포가 성인 골수에서 우세하다. 이 결과는 조혈줄기세포 인자에 따라 가변적인 BMP 농도가 있고 조혈줄기세포 발달에서 BMP에 대한 반응의 정도가 변화함을 나타낸다(Crisan et al., 2015). 몇몇 연구는 인간 전분화능 줄기세포로부터의 늦은 조혈 공약 및 성숙 단계 동안 BMP4 처리의 필요성을 보여 주었다.
따라서 본 발명에서 인간 전분화능 줄기세포 유래 조혈 기간 동안의 BMP4 노출 기간과 농도가 조혈 모세 혈관 배출에 결정적인 영향을 미칠 것으로 예상하였다. 본 발명에서 초기 2 일 동안 BMP4를 많이 처리하면 미분화된 인간 전분화능 줄기세포를 초기 중배엽 및 조혈 계통으로 강력하게 유도하고, mTeSR + Mat와 비교하여 E8 + Vit 조건하에 유지되는 세포주에서 조혈 모세포를 더 낮게 만든다. 이 수정된 조혈 프로그램은 다른 유전적 배경, 기증자 세포 유형 및 재프로그램 방법을 가진 공여자로 인해 인간 전분화능 줄기세포로부터의 조혈 생산량의 변화를 줄이는 데 기여할 수 있다.
조혈줄기세포는 난황낭, AGM 부위, 태아 간 및 골수와 같은 다양한 미세환경을 가진 혈관 근처에서 생산되고 성장한다.(Corselli et al., 2013). 많은 연구자 팀들은 혈관에 인접한 CD146 + PVC가 HSC의 증식과 유지를 촉진하고, 노치(Notch) 활성화를 통해 세포 간의 상호 작용을 통해 혈통 계통의 전구 세포를 제공하도록 조절하고 있음을 입증했다(Boulais and Frenette, 2015; Corselli et al., 2013). 또 다른 연구에 따르면 혈관 주변 미세환경에서 조혈줄기세포는 조혈줄기세포 메인터넌스(maintenance)를 자극할 수 있는 요인을 가진 미세환경에 여러 세포의 영향을 받는 것으로 나타났다(Ding et al., 2012). 결국, 조혈줄기세포와 미세환경의 상호 작용은 파라크린(paracrine) 신호 전달을 통한 조혈줄기세포 발달에 대한 결정적인 조건을 제공하는 것으로 보인다. 따라서 본 발명자들은 개선된 조혈줄기세포 발달 환경과 같이, 인간 전분화능 줄기세포의 시험관 내 조혈줄기세포 분화에서 혈관 외피 세포의 긍정적인 파라크린(paracrine) 효과를 기대하였다. 그리고 혈관 외피 세포에서 분비된 요인이 조혈줄기세포 전구체의 초기 전구체와 성숙에 대한 조혈줄기세포의 발달에 기여한다는 것을 발견하였다.
혈관 외피 세포의 분비물 중 이뮤노필린(immunophilin)으로 알려진 CyPA는 in vitro에서 혈관 신생을 유도하고 CD117 + 세포 부착 및 이동을 강화하여 생체 내에서 골수 세포의 발달을 촉진한다고 보고되었다(Perrucci et al., 2016). 또한, CyPA는 Raf-1 / MEK / ERK 및 Cdk 활성을 통한 세포주기 진행을 조절함으로써 대식세포 증식을 증가시킨다(Sanchez-Tillo 외., 2006). 이러한 이전 연구 결과는 혈관 외피 세포와 CyPA가 중배엽 분화 및 혈구 생성을 포함하는 조혈이 아니라 조혈 발달 및 말기 혈액 생성을 포함하는 조혈 후기에 영향을 미칠 수 있다고 제안했다. 이것이 혈관 외피 세포 및 CyPA의 조건 배지가 조혈줄기세포 전구체 및 성숙한 혈액 세포의 결과를 향상시키는 이유이다.
궁극적으로, 본 발명은 조혈모세포 유도 및 CyPA에서의 BMP4와 같은 환경 요인의 조혈 발달 과정 및 조혈 생성 및 말기 혈액 생산에 대한 지원을 고려하는 측면에서 의미가 있다. 이것이 시험 관내의 이러한 외부 인자가 조혈줄기세포 발달을 유도하는 배아 신호와 유사한 환경을 되풀이하는 이유이다. 따라서 본 발명은 현재까지 조혈줄기세포(HSC) 생성의 한계를 극복하기 위한 발판을 마련했다고 판단된다.
이하, 본 발명의 실시예를 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<실시예 1> HUCPVCs의 분리 및 배양
인간 제대(Human umbilical cord, HUC)는 기증자로부터 동의서(IRB No. 2012-11-003-003, 강원 대학교 병원)를 받아 10개월을 모두 채운 분만에서 제왕 절개를 통해 얻은 것이다. 이후, 인간의 제대(HUC)에서 2 개의 동맥과 정맥을 분리 한 후, 각각의 혈관들을 접시에 놓고 배지를 바꾸지 않고 10 일간 유지한 다음 제거했다. 인간 재대 유래-혈관 외피 세포를 14 일째에 콜로니를 관찰하였다. 인간 재대 유래-혈관 외피세포의 다중화 분화 가능성은 앞 절에서 평가되었고, 유도 배지는 모든 분화 분석을 위해 3 일마다 교체되었다.
지방 세포 분화를 위해, HUCPVCs는 12-웰 조직 배양 플레이트에 cm2 당 5Х103 cells로 접종하고 StemXVivo 지방세포 배지(R & D 시스템)에서 21 일 동안 배양하였다. 21 일째에, 세포를 4 % PFA로 5 분간 고정시키고 오일 레드 O (Lifeline Cell Technology)로 염색하여 지질 액포의 세포내 축적을 가시화 하였다.
조골 세포 분화를 위해, HUCPVCs를 12웰 조직 배양 플레이트에서 cm2 당 5Х103 cells로 접종하고 StemXVivo 조골세포 보조제(R & D systems)에서 21 일 동안 배양하였다. 21 일째에, 세포를 4 % PFA에서 10 분간 고정시키고 Alizarin Red S(Lifeline Cell Technology)로 염색하여 조골세포 배양물의 무기화(mineralization)를 가시화 하였다.
연골 세포 분화를 위해, 2.5Х105 cells를 15 mL 폴리프로필렌 튜브에서 1,200 rpm으로 15 분간 원심분리 하였다. 그 후, 펠렛을 StemPro 연골 형성 분화 키트(Gibco)에서 21일 동안 배양하였다. 21 일째, 펠렛을 4 % PFA에 고정하여 탈수시키고, Alcian Blue 염색에 의해 조직학적으로 황산화된 프로테오글리칸을 검출하기 위해 파라핀에 담구었다.
<실시예 2> 인간 전분화능 줄기세포의 배양
인간 전분화능 줄기세포(CAH15 및 iPS-NT4-S1)는 한국 CHA 대학에서 제공받았다. 또한, 인간 전분화능 줄기세포(CMC lines; CMC003, CMC009 및 CMC011)는 한국 보건 연구원(National Institute of Health)에서 제공받았다. 세포들은 Matrigel(BD Bioscience, USA)로 코팅한 접시에서 serum-free 및 feeder-free 조건에서 mTeSR1 배지(Stem Cell Technologies, 캐나다)로 배양되거나, xeno-free, serum-free 및 feeder-free 조건에서 vitronectin(Stem cell Technology, #07180)으로 코팅된 접시에서 E8 배지(Stem cell Technologies, # 07180)로 배양하였다. 세포들은 5일 마다 기계적 분리시키면서 80 % confluency 되게 계대 배양 하였다. 모든 세포는 5 % CO2의 가습 분위기에서 37 °C로 배양하였다.
<실시예 3> 인간 전분화능 줄기세포(hPSCs)의 단계적 조혈 분화
단계별 직접 조혈줄기세포(HSC) 분화는 이전의 설명과 같이 약간 수정하여 수행하였다(Niwa et al., 2011 ). 미분화된 인간 전분화능 줄기세포의 콜로니들은 웰당 5 콜로니 미만의 밀도로 제조되었다. 콜로니가 직경 약 500 μm까지 성장하면, 배양 배지는 인슐린 - 트랜스페린 - 셀레늄(Insulin-Transferrin-Selenium, ITS)(Gibco, # 51500-056)이 보충 된 Stemline II HSC expansion medium (Sigma, # S0192) 기반의 조혈모세포 분화 배지(Hematopoietic Differentiation Medium, HDM)로 교체되었다. 콜로니를 20-100ng / ml BMP4 (R & D, # 314-BP-050)를 포함하는 HDM과 함께 4 일 동안 배양 하였다(0-4 일). 배지는 48시간 마다 교체되었다. 이어서, 2 일 (4-6 일) 동안 40 ng/ml VEGF (R & D, # 293-VE-050) 및 50 ng/ml SCF(R & D, #255-SC-050) 을 함유하는 HDM과 함께 항온 배양했다.
조혈줄기세포(HSC) 분화 6 일 후에, 유도 세포를 50 ng/ml of SCF (R&D, #255-SC-050), 10 ng/ml of TPO (R&D, #288-TPN-025), 50 ng/ml of IL-3 (R&D, #203-IL-050), 50 ng/ml of IL-6 (R&D, #206-IL-050), 50 ng/ml of FIt-3L (R&D, #308-FK-025)로 사이토카인을 함유하는 HDM와 함께 배양하였다. 배지는 72시간마다 교체되었다.
HPSC 유래 hPSCs 효율은 유세포 분석을 사용하여 12-18 일째에 CD45-CD31 +, CD34 + CD45 + 또는 CD34 + CD43 + 및 CD34-CD45 + 또는 CD34-CD43 + 세포의 빈도를 측정하였다.
<실시예 4> 콜로니 형성 단위 분석
콜로니 형성 단위(Colony-Forming Units, CFU) 분석은 IL-3 (10 ng/mL), EPO (3 U/mL) 및 GM-CSF (10 ng/mL)가 첨가된 메틸셀룰로오스 H4434(Stem Cell Technologies)에 10,000 개의 조혈 모세포를 도말하여 수행하였다. 37 ℃, 5 % CO2에서 14 일 동안 배양 한 후, 표준 형태학적 기준을 사용하여 조혈 모세포 수를 계산하였다.
<실시예 5> 대식세포 분화
인간 전분화능 줄기세포에서 유래된 대식세포는 이전에 기술된 바와 같이 변형된 형태로 수행되었다(Yanagimachi et al., 2013).
조혈줄기세포(HSC) 분화 12 ~ 18 일째에, 현탁 세포를 따로 분리하여, 10% of FBS (Hyclone, SH30919.03), 1% of penicillin, streptomycin (Gibco, 17504-063) and 100ng/ml M-SCF (Peprotech, #300-25)를 함유하는 RPMI1640 (Gibco, #22400089) 대식세포 유도 배지로 대체하였다. 배지는 5-8 일 동안 72 시간마다 교체되었다.
유도 대식세포의 빈도는 CD14-BV421 (BD Bioscience, #563743) /CX3CR1-FITC (BioLegend, #341605) /F4/80 (Abcam, ab100790) /CD11b (Abcam, ab8878) and CD45-APC (BD, #555485)를 포함하는 단핵구 및 대식세포 특이 마커와 CD3-FITC (BioLegend, # 300305) / CD19-FITC (BioLegend, # 302205) 및 CD45-APC를 음성 마커를 사용하는 유세포 분석기로 측정하였다.
<실시예 6> 식균 작용 분석
식세포 작용 분석은 이전에 기술된 바와 같이 사소한 변형으로 수행되었다(Triboulet et al., 2013). 본 발명에서는 황색과 적색과 같은 색이 다른 두 개의 형광 비드들을 사용하였다(Sigma; # L4655, # L3030). 상기 비드는 37 ℃에서 30분 동안 인간 혈청의 10 %가 보충된 RPMI1640에서 미리 배양되었고, 그 농도는 1㎍ / ㎕였다. 비드들을 37 ℃에서 2 시간 동안 1 ml의 대식세포 배지에서 104 cells 당 5 μg으로 배양하였다. 상기 세포들은 수집하여 PBS로 세척하고, 단핵구 및 대 식세포 특이적 항체로 배양하였다. 최종적으로, 식균 세포를 유동 세포 계측법을 사용하여 분석하였다.
<실시예 7> Diff - Quik 염색
인간 전분화능 줄기세포로부터 유래된 대식세포의 형태는 Differntial Quik Stain Kit (Modified Giemsa) (EMS, # 26096)를 사용하여 확인하였다. 먼저 cytospin (Hanil, 한국)을 사용하여 3000 rpm에서 5 분 동안 세포를 여러 슬라이드 글라스에 부착시키고 실온에서 건조시켰다. 키트 프로토콜에 따라 고정을 수행한 다음 세포질과 핵을 염색하였다. 상기 슬라이드들은 증류수로 세척하고 충분히 건조시켰다. 최종적으로 상기 슬라이드들은 고정 배지(Sigma, # C1795)를 사용하여 커버 글래스로 덮었다.
<실시예 8> 유세포 분석
조혈줄기세포(HSC) 분화 12 내지 18 일째에, 현탁 세포는 별도로 수거하고, CD34-FITC (BD, # 555821), CD45-APC (BD, # 555485) 및 CD43-APC (CD31-PE (BD, # 555446))에서 형광으로 접합된 항체에서 4 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 접착 세포를 콜라게나제B(collagenase B)(Roche, # 11088815001)와 함께 2 시간 동안 배양한 후, 세포 해리 완충액 (Gibco)을 처리하였다. 상기 세포를 70 μm 세포 스트레이너에 통과시키고 4 ℃에서 1 시간 동안 형광과 결합 된 항체로 배양하였다. 죽은 세포는 7-아미노액티노마이신D(aminoactinomycin D)(BD Pharmingen)로 염색한 것을 근거로 제외 하였다. HSC 마커의 빈도는 FACSCantoTMII 유동 세포 계측기 (BD Bioscience)를 사용하여 측정하였고, 획득된 데이터는 FlowJo 소프트웨어 (Tree star)로 분석 하였다.
<실시예 9> PVC 조건 배지(PVC-CM) 제조
혈관 외피 세포(PVC) 배양 4 일째에, 100 mm 접시에서 포화상태의 80-90 %에 이르렀을 때 배지를 흡인하고 PBS를 사용하여 세포를 헹구었다. 혈관 외피 세포(PVC)는 5 % CO2의 가습 분위기에서 37 °C에서 24시간 동안 FBS가 없는 알파 MEM만을 PVC용 기초배지로 하여 배양하였다. 다음날, 상등액을 수집하고, 0.22 μm 필터 (Sartorius, # 16534)를 통과시키고, 4 ℃ 및 6000 g에서 1 시간 동안 초원심 분리기를 사용하여 3 kDa 차단막(Amicon)으로 응축시켜 조건 배지를 제조하였다. 응축된 조건 배지의 단백질을 BCA 분석 키트 (Thermo scientific, # 23225)를 사용하여 정량화하였다.
<실시예 10> 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석
SDS-PAGE 겔로부터 단백질 밴드를 제거하고 기존의 절차 (Bahk et al., 2004)에 따라 트립신으로 겔에서 분해시켰다. 요약하면, 단백질 밴드는 얼룩진 젤에서 절제되어 조각으로 절단된다. 상기 추출된 용액을 원심 분리 농축기를 사용하여 농축하였다. 여기서 질량 분석을 하기 전에, 펩타이드 용액을 reversed-phase column (Gobom et al., 1999)을 사용하여 탈염 처리 하였다. LC-MS / MS 분석은 ACQUITY UPLC 및 LTQ-orbitrap-mass spectrometer (Thermo Electron, San Jose, CA)를 통해 수행되었다. 컬럼은 BEH C18 1.7 μm, 100 μm × 100 mm 컬럼 (Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였다. LC 분리를 위한 이동상 A는 탈 이온수(deionized water) 중 0.1 % 포름산(formic acid)이었고, 이동 상 B는 아세토니트릴(acetonitrile) 중 0.1 % 포름산(formic acid)이었다. 상기 크로마토그래피 구배는 21 분 동안 10 % B에서 40 % B로, 7 분 동안 40 % B에서 95 % B로 그리고 10 분 동안 90 % B에서 10 % B로 선형 증가를 제공하도록 설정되었다. 유속은 0.5 uL / min이었다. 탠덤 질량 분석을 위해, 전체 질량 스캔 (300-2000 m / z) 및 MS / MS 스캔으로 데이터 의존적 획득을 사용하여 질량 스펙트럼을 획득하였다. 획득 한 각 MS / MS 스캔은 LTQ에서 평균 1 개의 마이크로 스코프였다. 이온 전달 튜브의 온도는 160 ℃로 조절되었고 스프레이는 1.5-2.0kV로 조절되었다. 정규화된 충돌 에너지는 MS / MS의 경우 35 %로 설정되었다. MS / MS의 개별 스펙트럼을 SEQUEST 소프트웨어 (Thermo Quest, San Jose, CA, USA)를 사용하여 처리하고, 피크리스트를 사용하여 MASCOT 프로그램(Matrix Science Ltd., London, UK) 생성하였다. 우리는 MS 분석을 위한 메티오닌, 시스테인, 아르기닌의 메틸화, 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화를 설정하고 펩타이드 질량의 내성은 2 Da였다. MS / MS 이온 질량 허용 오차는 1 Da 였고 분열 누락 허용치는 1이었고 데이터 분석을 위해 충전 상태 (+1, +2, +3)가 고려되었다. 우리는 MASCOT 확률 분석에 의해 정의된 중요한 히트만을 얻었다.
<실시예 11> 웨스턴 블랏
차가운 PBS로 세포를 씻고 트리톤 -X 용해 완충액으로 용해시켰다. 용해물을 10 또는 12 % SDS-PAGE 겔에서 분리하고 polyvinyldifluoride 멤브레인에 옮겼다. 멤브레인을 4 ℃에서 primary antibodies against anti-CyPA (Abcam, ab58144) 및 anti-α-tubulin (Simga, T9026)에서 밤새 프로브하고, 이어서 HRP-conjugated secondary goat anti-mouse IgG (Santa Cruz, sc-2005)에서 배양하였다. Immunoblot을 시각화하기 위해 Clarity ™ Western ECL Substrate (Bio-Rad)와 ChemiDOC ™ XRS + 시스템 (Bio-Rad)을 사용하였다.
<실시예 12> PVC-CM과 CyPA 처리
PVC-CM와 CyPA (100 ng/mL)에 의한 인간 전분화능 줄기세포의 조혈모세포 분화 효율 평가를 위해 PVC-CM과 CyPA를 “조혈전구세포 형성” (hemogenic specification, CM 0-9일) 단계와 “조혈계통 결정” (hematopoietic commitment, CM 9-17일) 단계에 각각 처리하였다. HPC 분화 효율을 분화 17일째 유세포기를 이용하여 분석하였다(도 4).
CyPA(100 ng/mL)에 의한 인간 전분화능 줄기세포 유래 대식세포 생산능 평가를 위해 분화 17일째 CD34+CD45+ 또는 CD34+CD45+ 조혈모세포를 회수하였다. 조혈모세포의 대식세포 분화 유도시 M-CSF 단독 처리(대조군) 및 M-CSF와 CyPA 혼합(실험군)하여 5일 간 처리 후 세포를 회수하여 계수하였다(도 7).
<실시예 13> 통계 분석
모든 측정 값은 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 통계적 유의성은 Student 's t-test를 사용하여 결정하였고 p <0.05는 통계적으로 유의하다고 간주되었다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. (a) 전분화능 줄기세포를 전배양하는 단계;
    (b) 상기 전분화능 줄기세포를 1 내지 2일 동안 인슐린, 트렌스페린, 셀레늄 및 100 ng/ml BMP4를 포함하는 배지에서 1차배양한 후 인슐린, 트렌스페린, 셀레늄 및 20 ng/ml BMP4를 포함하는 배지에서 2차배양하고, 인슐린, 트렌스페린, 셀레늄, 40 ng/ml VEGF 및, 50 ng/ml SCF를 포함하는 배지에서 3차배양하여 초기 중배엽 및 조혈계통으로 유도하는 조혈전구세포 형성 단계(phase I); 및,
    (c) 상기 (b)단계에서 배양된 전분화능 줄기세포를 사이클로필린 A(Cyclophilin A)를 포함하는 배지에서 배양하는 조혈모세포 결정 단계(phase II);
    를 포함하는 전분화능 줄기세포로부터 조혈모세포 분화 촉진 방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계는 미분화된 전분화능 줄기세포의 콜로니를 혈청 및 피더가 없는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 전분화능 줄기세포로부터 조혈모세포 분화 촉진 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 전분화능 줄기세포는 인간배아줄기세포(ESC) 또는 유도만능줄기세포(iPSC) 인 것을 특징으로 하는, 전분화능 줄기세포로부터 조혈모세포 분화 촉진 방법.
  6. 삭제
  7. 상기 제1항의 방법에 의해 배양된 조혈모세포를, 10% FBS, 1% penicillin 또는 streptomycin, 100ng/ml M-CSF 및 사이클로필린 A(cyclophilin A)를 포함하는 배지에서 배양하는 단계;
    를 포함하는 대식세포 생산능 촉진 방법.
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