CN117247901B - 一种直接重编程抗炎型巨噬细胞为周细胞的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

一种直接重编程抗炎型巨噬细胞为周细胞的方法及其应用，属于再生技术领域。为了开发一种简便易行的方法以获得数量多且活性高的周细胞，本发明提供了一种联合声敏剂和低频低强度超声的作用，诱导抗炎型巨噬细胞直接重编程为周细胞的方法，利用该方法诱导抗炎型巨噬细胞一天后即可将其直接重编程为周细胞，且直接重编程获得的周细胞可有效降低内皮渗透性；在含不成熟新生血管的动脉粥样硬化模型中发现动脉粥样硬化斑块内的抗炎型巨噬细胞可直接重编程为周细胞，并促进动脉粥样硬化斑块内的新生血管成熟。本发明提供的方法简便易行，易于开展，可为缺血组织/器官的微循环重建、组织工程器官的血管化，及其它需要补充周细胞的领域提供新思路。

Description

一种直接重编程抗炎型巨噬细胞为周细胞的方法及其应用

技术领域

本发明属于再生技术领域，具体涉及一种直接重编程抗炎型巨噬细胞为周细胞的方法及其应用。

背景技术

周细胞是除内皮细胞外构成微血管的重要成分，覆盖于内皮细胞表面并嵌入基底膜内，是成熟微血管正常发育和稳态所必需的，也因此常被应用于组织工程器官的血管化过程和缺血组织/器官的微循环重建过程。

然而，目前周细胞的提取、纯化过程过于复杂，导致了周细胞的数量减少和质量降低。目前周细胞的获得方法主要分为两种：①经诱导型多能干细胞分化获得；②酶解和机械分离组织/器官(如心脏组织、肾组织、脑组织、肿瘤组织)后获得细胞池，而后通过荧光激活细胞分选术或磁性激活细胞分选术从中分离出表达周细胞表面标志物的细胞，如公开号为CN108715836A的发明专利公开了一种肿瘤组织中周细胞的分离和仿生培养方法，首次用10个抗体标记(5个阳性标记，5个阴性标记)针对周细胞进行了分离、纯化和鉴定。以上两种方法的共性问题是：①实验过程复杂，使获得的周细胞数量较少，且细胞活性易受影响；②缺乏统一的操作、鉴定标准。因此，亟需开发一种简便易行的方法以获得数量多且活性高的周细胞。

发明内容

为了开发一种简便易行的方法以获得数量多且活性高的周细胞，本发明提供了一种直接重编程抗炎型巨噬细胞为周细胞的方法及其应用，具体技术方案如下：

本发明的第一个目的是提供一种直接重编程抗炎型巨噬细胞为周细胞的方法，所述方法为如下任意一种：

方法A：利用声敏剂孵育抗炎型巨噬细胞，待细胞内的声敏剂达到有效浓度时，采用低频低强度超声对抗炎型巨噬细胞进行辐照；

方法B：向机体静脉注射声敏剂，待机体动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞内的声敏剂达到有效浓度时，采用低频低强度超声对机体动脉粥样硬化斑块进行局部辐照。

进一步地限定，所述声敏剂为具有声敏性的药物。

进一步地限定，所述声敏剂为有机分子声敏剂、无机纳米声敏剂或有机-无机杂化纳米声敏剂。

在本发明的一种实施方式中，所述声敏剂为华卟啉钠、5-氨基酮戊酸、姜黄素或大黄素。

在本发明的一种实施方式中，所述声敏剂为华卟啉钠；所述方法A中华卟啉钠的孵育浓度为0.1-0.5μmol/L，孵育时间为2-24h，所述方法B中华卟啉钠的孵育浓度为1-4mg/kg，孵育时间为4-24h。

在本发明的一种实施方式中，方法A所述低频低强度超声的超声频率为0.5MHz-1.5MHz，超声强度为0.4W/cm²-1.0W/cm²，辐照时间为3-7min。

在本发明的一种实施方式中，方法B所述低频低强度超声的超声频率为0.5MHz-1.5MHz，超声强度为0.6W/cm²-1.2W/cm²，辐照时间为10-20min。

本发明的第二个目的是提供上述方法在以非治疗目的地降低内皮渗透性中的应用。

本发明的第三个目的是提供上述方法在以非治疗目的地促进动脉粥样硬化斑块内的新生血管结构成熟中的应用。

本发明的第四个目的是提供上述方法在以非治疗目的地减少动脉粥样硬化斑块内的出血量中的应用。

本发明的第五个目的是提供上述方法在以非治疗目的地改善动脉粥样硬化斑块内新生血管的灌流功能中的应用。

本发明的第六个目的是提供上述方法在以非治疗目的地减轻动脉粥样硬化斑块内新生血管的渗漏程度中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提出了通过靶向诱导抗炎型巨噬细胞直接重编程为周细胞的方法。该方法的根据之一为直接重编程指细胞由一种谱系重编程为另一种谱系，存在于生理及病理情况下，也可利用实验手段实现，方法简单，对于补偿某些类型细胞的丢失/异常具有重要价值；根据之二为抗炎型巨噬细胞具有直接重编程为其它谱系细胞的能力，如间充质细胞。该方法具体为联合声敏剂和低频低强度超声的作用，即利用低频低强度超声激活聚集在抗炎型巨噬细胞内的声敏剂，诱导抗炎型巨噬细胞直接重编程为周细胞，以获得数量多且活性高的周细胞。

本发明通过多种评价手段(蛋白质印迹、细胞免疫荧光、实时荧光定量PCR、流式细胞术)证明抗炎型巨噬细胞孵育声敏剂后经低频低强度的超声辐照，一天后即可直接重编程为周细胞，且直接重编程获得的周细胞可有效降低内皮渗透性；在含不成熟新生血管的动脉粥样硬化模型中发现动脉粥样硬化斑块内的抗炎型巨噬细胞可直接重编程为周细胞并促进新生血管成熟，具体体现在促进动脉粥样硬化斑块内的新生血管结构成熟，减少动脉粥样硬化斑块内的出血量，改善动脉粥样硬化斑块内新生血管的灌流功能及减轻动脉粥样硬化斑块内新生血管的渗漏程度。

本发明提供的直接重编程抗炎型巨噬细胞为周细胞的方法简便易行，易于开展，可获得数量多且活性高的周细胞，并促进新生血管成熟，可为缺血组织/器官的微循环重建、组织工程器官的血管化，及其它需要补充周细胞的领域提供新思路。

附图说明

图1为抗炎型巨噬细胞的鉴定结果图；其中，图1中的A为抗炎型巨噬细胞的光镜图，标尺＝50μm，图1中的B为抗炎型巨噬细胞的CD163免疫荧光染色代表图，标尺＝50μm，图1中的C为Westernblot检测促炎型巨噬细胞与抗炎型巨噬细胞的CD163、CD206、iNOS和NF-κB的蛋白表达水平结果图，图1中的D为图1中的C的相对应的统计图，n＝3-4例/组，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001；

图2为低频低强度超声、卟啉类声敏剂及卟啉类声敏剂联和低频低强度超声对抗炎型巨噬细胞表达周细胞表面抗原蛋白的影响结果图；其中，图2中的A为Control组、Ultrasound组、DVDMS组及SDT组抗炎型巨噬细胞的α-SMA和NG2蛋白表达检测结果图，图2中的B为图2中的A对应的统计结果图，n＝3例/组，**代表P<0.01，***代表P<0.001；

图3为抗炎型巨噬细胞经卟啉类声敏剂联和低频低强度超声干预后不同时间表达的周细胞表面抗原蛋白的变化结果图；其中，图3中的A为抗炎型巨噬细胞经卟啉类声敏剂联和低频低强度超声干预后即刻、1天、2天及3天时α-SMA和NG2的蛋白表达水平检测结果图，图3中的B为图3中的A对应的统计结果图，n＝3-4例/组，*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001；

图4为卟啉类声敏剂联和低频低强度超声对抗炎型巨噬细胞中表达周细胞表面抗原α-SMA的细胞比例的影响结果图；其中，图4中的A为Control组与SDT组抗炎型巨噬细胞的细胞免疫荧光染色CD163与α-SMA的代表图，标尺＝50μm，图4中的B为图4中的A对应的统计结果图，n＝3例/组，***代表P<0.001；

图5为卟啉类声敏剂联和低频低强度超声对同时表达抗炎型巨噬细胞表面抗原CD163和周细胞表面抗原α-SMA的细胞比例的影响结果图；其中，图5中的A为Control组与SDT组抗炎型巨噬细胞的CD163、α-SMA的流式细胞分析代表图，图5中的B为图5中的A对应的统计结果图，n＝3例/组，**代表P<0.01；

图6为细胞追踪实验观察基质胶小管生成实验中抗炎型巨噬细胞与内皮细胞的位置关系图；其中，图6中的A为Negativecontrol组、Control组与SDT组的基质胶小管生成代表图，绿色为内皮细胞，红色为抗炎型巨噬细胞，标尺＝50μm，图6中的B为图6中的A对应的统计结果图，n＝3例/组，**代表P<0.01；

图7为经直接重编程获得的周细胞对内皮渗透性的影响结果图，n＝3例/组，*代表P<0.05；

图8为ApoE^-/-小鼠颈动脉解剖图及右侧颈动脉粥样硬化斑块图；其中，图8中的A为ApoE^-/-小鼠颈动脉解剖图，CCA代表颈总动脉，图8中的B为ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块H&E染色的代表图，标尺＝50μm，箭头所示为斑块内出血，Th代表血栓；

图9为ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块免疫组化TER119染色代表图，标尺＝50μm；

图10为ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块免疫组化CD31染色代表图；其中，图10中的A为ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块免疫组化CD31染色代表图，标尺＝50μm，图10中的B为图10中的A中方框内区域，黑色箭头所示为动脉粥样硬化斑块内新生血管，标尺＝10μm；

图11为ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块CD31与α-SMA及CD31与NG2的免疫荧光双染代表图，标尺＝20μm，白色箭头所示为动脉粥样硬化斑块内不成熟的新生血管；其中，图11中的A为ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块CD31与α-SMA的免疫荧光双染代表图，图11中的B为ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块CD31与NG2的免疫荧光双染代表图；

图12为卟啉类声敏剂联和低频低强度超声促进ApoE^-/小鼠动脉粥样硬化斑块内的抗炎型巨噬细胞直接重编程为周细胞结果图；其中，图12中的A为Control组与SDT组ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块免疫荧光染色CD163与α-SMA和CD163与NG2的代表图，白色箭头所示为未表达周细胞标志物的抗炎型巨噬细胞，黄色箭头所示为表达周细胞标志物的抗炎型巨噬细胞，标尺＝20μm，图12中的B为颈动脉粥样硬化斑块内CD163阳性抗炎型巨噬细胞中表达α-SMA的细胞比例统计图及颈动脉粥样硬化斑块内CD163阳性抗炎型巨噬细胞中表达NG2的细胞比例统计图，n＝6例/组，****代表P<0.0001；

图13为卟啉类声敏剂联和低频低强度超声对ApoE^-/小鼠动脉粥样硬化斑块内新生血管结构的影响结果图；其中，图13中的A为Control组与SDT组ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块免疫荧光染色CD31与α-SMA的代表图，白色箭头所示为无周细胞覆盖的新生血管，黄色箭头所示为有周细胞覆盖的新生血管，标尺＝20μm，图13中的B为Control组与SDT组ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块免疫荧光染色CD31与NG2的代表图，白色箭头所示为无周细胞覆盖的新生血管，黄色箭头所示为有周细胞覆盖的新生血管，标尺＝20μm，图13中的C为颈动脉粥样硬化斑块斑块内有α-SMA阳性周细胞覆盖的CD31阳性新生血管占总的CD31阳性新生血管的比例统计图，n＝6例/组，****代表P<0.0001，图13中的D为颈动脉粥样硬化斑块斑块内有NG2阳性周细胞覆盖的CD31阳性新生血管占总的CD31阳性新生血管的比例统计图，n＝6例/组，***P<0.001；

图14为卟啉类声敏剂联和低频低强度超声对ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块内出血量的影响结果图；其中，图14中的A为Control组与SDT组ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块免疫组化TER119染色的代表图，标尺＝50μm，图14中的B为图14中的A相对应的统计图，n＝6例/组，**代表P<0.01；

图15为卟啉类声敏剂联和低频低强度超声对ApoE^-/小鼠动脉粥样硬化斑块内新生血管灌注功能的影响结果图；其中，图15中的A为Control组与SDT组ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块488-Lectin与免疫荧光染色CD31的代表图，白色箭头所示为无灌注的新生血管，黄色箭头所示为有灌注的新生血管，标尺＝20μm，图15中的B为颈动脉粥样硬化斑块内Lecin与CD31均阳性的新生血管占总的CD31阳性新生血管的比例统计图，n＝6例/组，****代表P<0.0001；

图16为卟啉类声敏剂联和低频低强度超声对ApoE^-/小鼠动脉粥样硬化斑块内新生血管渗漏功能的影响结果图；其中，图16中的A为Control组与SDT组ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉粥样硬化斑块内FITC-Dextran的代表图，标尺＝50μm，图16中的B为图16中的A相对应的统计图，n＝8例/组，**代表P<0.01。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式及说明书附图对本发明进行进一步详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、方法和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、方法和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

本发明所用实验动物为6周龄的雄性ApoE^-/-小鼠(体重为18～20g)以及6周龄的雄性C57BL/6小鼠(体重为18～20g)，两种小鼠均购买于青紫兰科技有限公司。

实施例1：声敏剂联和低频低强度超声诱导抗炎型巨噬细胞直接重编程为周细胞

(1)抗炎型巨噬细胞模型的建立及鉴定：

提取C57BL/6小鼠的骨髓细胞，以2×10⁶个/mL的浓度在35mm细胞培养皿中培养，加入10ng/mL的GM-CSF使其分化为骨髓源性巨噬细胞，而后加入20ng/mL的IL-4刺激12～24小时使骨髓源性巨噬细胞极化为抗炎型巨噬细胞。

通过上述操作方法在体外建立了抗炎型巨噬细胞的模型，为验证建模是否成功，我们通过光学显微镜观察获得的抗炎型巨噬细胞的形态，并利用细胞免疫荧光方法检测获得的抗炎型巨噬细胞是否表达抗炎型巨噬细胞的特异性表面抗原CD163。

利用细胞免疫荧光方法检测抗炎型巨噬细胞表面抗原CD163的操作步骤如下：①将抗炎型巨噬细胞用PBS缓冲液洗涤3次后，再利用4％多聚甲醛固定10分钟。②再次用PBS缓冲液洗涤细胞2次，0.1％Triton透膜2分钟。③PBS缓冲液洗涤细胞2次，即用型山羊血清封闭液室温封闭30分钟。④用1％BSA配置的一抗工作液在4℃条件下对细胞进行孵育过夜。⑤第二天用PBS缓冲液洗涤细胞3次后，荧光二抗工作液对细胞在室温避光条件下孵育90分钟。⑥PBS缓冲液洗涤细胞后，DAPI染色10分钟。⑦在细胞爬片上滴加抗荧光淬灭剂，倒置于载玻片上，荧光显微镜采集图像，应用Image-ProPlus软件进行分析。

光镜观察结果见图1中的A，该图显示抗炎型巨噬细胞的形态呈圆形或梭形，细胞边缘光滑，胞质均匀，符合抗炎型巨噬细胞的形态特点。抗炎型巨噬细胞的CD163免疫荧光染色代表图见图1中的B，该图说明获得的抗炎型巨噬细胞能够表达抗炎型巨噬细胞的特异性表面抗原CD163。

本发明还建立了促炎型巨噬细胞模型，具体建模方法为提取C57BL/6小鼠的骨髓细胞，以2×10⁶个/mL的浓度在35mm细胞培养皿中培养，加入10ng/mL的GM-CSF使其分化为骨髓源性巨噬细胞，而后加入100ng/mL的LPS和10ng/mL的IFN-γ刺激12～24小时使骨髓源性巨噬细胞极化为促炎型巨噬细胞。为将促炎型巨噬细胞与抗炎型巨噬细胞作比较，通过蛋白质印迹法检测两种细胞中促炎型巨噬细胞标志物iNOS、核因子-κB(Nuclearfactor-κB,NF-κB)及抗炎型巨噬细胞标志物CD163、CD206的蛋白表达水平，操作步骤如下：①将从敷箱取出细胞置于冰板上，收集细胞上清，用4℃预冷的PBS缓冲液洗涤细胞后，依据细胞密度向培养皿中加入70μl～80μl含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液进行裂解，应用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度后，加入1/4蛋白样体积的5×蛋白上样缓冲液置于100℃金属浴中加热10分钟，即可获得细胞蛋白样品；②根据目的蛋白的分子量配制PAGE胶，根据蛋白样品浓度，计算蛋白上样体积，进行电泳1～2小时，当蓝色条带接近分离胶下缘时停止电泳；③转膜时，根据目的蛋白分子量准备0.45μm孔径或者0.2μm孔径的PVDF膜，并用甲醇激活，将PVDF膜、凝胶与滤纸组装于转膜夹内并放入转膜槽中进行转膜，转膜电流为300毫安，转膜时间根据目的蛋白分子量设置；④转膜结束后，将PVDF膜置于5％牛奶封闭液中，室温封闭2小时后，可将PVDF膜置于一抗工作液中，4℃条件下孵育过夜，第二天用PBST缓冲液洗涤PVDF膜3次后，将PVDF膜置于PBST配置的HRP标记二抗中在室温条件下孵育2小时，再次用PBST洗PVDF膜3次，每次10分钟；⑤而后将PVDF膜平铺在ChemiDocTMMP成像系统中，均匀滴加等超敏ECL显色液进行显色，应用ImageLab或ImageJ软件进行分析。

促炎型巨噬细胞与抗炎型巨噬细胞的比较结果如图1中的C和图1中的D所示，抗炎型巨噬细胞与促炎型巨噬细胞相比，表达的CD163、CD206显著增加(P<0.05，P<0.01)，而iNOS、NF-κB显著减少(P<0.001，**P<0.01)。以上结果共同表明，抗炎型巨噬细胞模型建立成功，可应用于后续细胞研究中。

(2)声敏剂和低频低强度超声的联合作用促进了抗炎型巨噬细胞直接重编程为周细胞

我们将抗炎型巨噬细胞分为：①对照组(Control)；②低频低强度超声组(Ultrasound)，即用低频低强度超声在常温下对抗炎型巨噬细胞进行干预5分钟，其中超声频率为1.0MHz，超声强度为0.5W/cm²；③卟啉类声敏剂组(0.5μmol/L华卟啉钠DVDMS)，即用0.5μmol/L华卟啉钠在37℃细胞敷箱中避光孵育抗炎型巨噬细胞6小时；④卟啉类声敏剂联合低频低强度超声组(SDT)，即用0.5μmol/L华卟啉钠在37℃细胞敷箱中避光孵育抗炎型巨噬细胞6小时后，用同实验组②的低频低强度超声在常温下对抗炎型巨噬细胞进行干预5分钟。SDT组在干预后1天提取细胞总蛋白，其余三组也在同一时间点提取细胞总蛋白。应用蛋白印记法检测周细胞表面标志物α-SMA和NG2的蛋白表达水平，结果如图2所示，Ultrasound组、DVDMS组的α-SMA和NG2与Control组相比均无显著差异(P>0.05，P>0.05；P>0.05，P>0.05)，而SDT组α-SMA和NG2显著增加(P<0.01，P<0.001)。表明，声敏剂和低频低强度超声的联合作用促进了抗炎型巨噬细胞直接重编程为周细胞，而并非是单独低频低强度超声或声敏剂的作用。

另外，分别于卟啉类声敏剂联合低频低强度超声干预抗炎型巨噬细胞后即刻(0d)、1天(1d)、2天(2d)、3天(3d)提取细胞总蛋白，应用蛋白印迹法检测α-SMA和NG2的蛋白表达水平。结果如图3所示，与干预后即刻相比，在干预后1天，α-SMA和NG2的蛋白表达显著增加(P<0.01，P<0.05)，在第3天效果依然显著(P<0.01，P<0.05)。该结果表明，抗炎型巨噬细胞经声敏剂联和低频低强度超声干预后1天即可直接重编程为周细胞，并且效果至少可持续至第3天。

进一步，我们将抗炎型巨噬细胞分为对照组(Control)及卟啉类声敏剂联和低频低强度超声组(SDT)。SDT干预后1天通过免疫荧光方法检测抗炎型巨噬细胞表达的α-SMA，Control组与SDT组在同一时间点进行观察。结果如图4所示，卟啉类声敏剂联和低频低强度超声干预后的抗炎型巨噬细胞中表达α-SMA的细胞比例显著增加(P<0.001)。

本发明将抗炎型巨噬细胞分为对照组(Control)及卟啉类声敏剂联和低频低强度超声组(SDT)，应用流式细胞术分析卟啉类声敏剂联和低频低强度超声对同时表达抗炎型巨噬细胞表面抗原CD163和周细胞表面抗原α-SMA的细胞比例的影响，具体步骤如下：①将细胞从敷箱取出轻柔消化后，用4％多聚甲醛重悬细胞固定10分钟，PBS缓冲液洗涤2次；②随后用0.1％Triton重悬细胞，进行透膜5分钟，PBS缓冲液洗涤2次；③使用1％BSA配置CD163及α-SMA抗体，在4℃条件下对细胞进行孵育过夜；④PBS缓冲液洗涤细胞3次，用荧光二抗工作液在室温避光条件下对细胞孵育90分钟；⑤PBS缓冲液洗涤细胞3次后，可进行上机检测，应用FlowJo软件进行分析。

结果如图5所示，同时表达抗炎型巨噬细胞表面抗原CD163和周细胞表面抗原α-SMA的细胞比例显著增加(P<0.01)。

以上结果表明，抗炎型巨噬细胞经声敏剂联和低频低强度超声干预后直接重编程为周细胞。

实施例2：经直接重编程获得的周细胞具有降低内皮渗透性的作用

将细胞共设置三组，分别为只有内皮细胞的阴性对照组(Negativecontrol组)、内皮细胞+未经干预的抗炎型巨噬细胞组(Control组)以及内皮细胞+经直接重编程获得的周细胞组(SDT组)，进行了基质胶小管生成实验，具体步骤如下：①将液态基质胶平铺在96孔板中的小孔中37℃孵箱至少凝固30分钟，用红色荧光细胞追踪染料孵育抗炎型巨噬细胞，绿色荧光细胞追踪染料孵育内皮细胞；②使细胞置于37℃敷箱中15～30分钟，将细胞浓度为4×10⁵/mL的抗炎型巨噬细胞与2×10⁵/mL的内皮细胞共同悬浮在无血清DMEM培养基中，或依实验目的单独将2×10⁵/mL的内皮细胞重新悬浮在无血清DMEM培养基中，在小孔中接种24小时；③使用荧光显微镜观察管形成并拍照，应用Image-ProPlus软件进行分析。

结果如图6所示，SDT组与对照组相比，经直接重编程获得的周细胞可更好地黏附在内皮细胞上(P<0.01)。

为观察经直接重编程获得的周细胞对内皮渗透性的影响，本发明进行了内皮细胞渗透性检测实验，具体步骤如下：①将内皮细胞以4×10⁵个/mL浓度种置于0.4μm的Transwell上层小室中，置入细胞孵箱中培养24小时至细胞贴壁并融合为细胞层；②下层则根据实验分组设置三组，分别为细胞培养基(Negativecontrol组)、未经干预的抗炎型巨噬细胞的条件培养基(Control组)以及经直接重编程获得的周细胞的条件培养基(SDT组)；③24小时后弃去上层小室培养基，并将含有1mg/mL40kDaFITC-Dextran的培养基添加至上室小室中，孵育2小时；④从Transwell下层收集100ul液体并通过荧光酶标仪在激发波长492nm，发射波长520nm检测荧光强度。

结果如图7所示，Control组与Negativecontrol组相比无显著差异(P>0.05)，而SDT组与Negativecontrol组、Control组相比显著减少(P<0.05，P<0.05)，表明经直接重编程获得的周细胞活性强，可降低内皮渗透性。

实施例3：声敏剂联和低频低强度超声诱导动脉粥样硬化斑块内的抗炎型巨噬细胞直接重编程为周细胞，并促进动脉粥样硬化斑块内的新生血管成熟

(1)建立含不成熟新生血管的动脉粥样硬化动物模型

本发明给予ApoE^-/-小鼠高脂饮食(0.15％胆固醇+22％脂肪)6周后行右侧颈动脉串联结扎术，而后继续给予高脂饮食9周，成功制备了ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化含不成熟新生血管的模型。

如图8中的A所示，ApoE^-/-小鼠右侧颈动脉与左侧颈动脉相比，外观呈现黄色。据文献报道，结扎线以下血管节段内的动脉粥样硬化斑块含有人不稳定型斑块的病理特征，包括不成熟的新生血管。因而，本发明对该血管节段(黄色线中间区域)进行取材，行进一步组织病理学检测。如图8中的B所示，通过H&E染色观察到动脉粥样硬化斑块几乎完全使管腔闭塞，同时观察到斑块内出血。

通过免疫组化检测动脉粥样硬化斑块内红细胞标志物TER119，具体操作步骤如下：①将冰冻切片从-80℃冰箱取出后，在室温条件下复温10-15分钟，用PBST洗涤1次，洗涤时间为5分钟；②将组织切片浸泡在3％过氧化氢溶液中，进行阻断15分钟，阻断结束后，用PBST洗涤1次，洗涤时间为5分钟；③将切片擦干后，将即用型山羊血清封闭液滴在组织上，使其均匀完全覆盖住组织，进行封闭30分钟；④封闭结束后，用1％BSA溶液配置一抗工作液，将切片置入湿盒内，放入4℃冰箱，一抗孵育24小时；⑤孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次5分钟，在室温条件下进行二抗孵育90分钟；⑥配置DAB工作液进行DAB显色，显微镜下确定显色时间，自来水终止；⑦将苏木素染液滴在组织上，使其均匀完全覆盖住组织，浸染细胞核30秒，自来水终止；⑧在脱水前用去离子水将切片浸洗一次，75％乙醇1次，80％乙醇1次，85％乙醇1次，90％乙醇1次，95％乙醇2次，100％乙醇2次，每次5分钟进行脱水；⑨脱水结束后，将切片浸入二甲苯两次，每次五分钟进行透明；⑩用中性树脂滴在组织上进行封片处理，随后将切片放入60℃烤箱烤24-48小时，使其固化，光学显微镜采集图像，应用Image-ProPlus软件进行分析。

结果如图9所示，进一步证明存在斑块内出血，说明动脉粥样硬化斑块内的新生血管功能不成熟。

动脉粥样硬化斑块内出血来源于新生血管。通过免疫组化检测动脉粥样硬化斑块中内皮细胞标志物CD31，结果如图10所示，ApoE^-/-小鼠颈动脉粥样硬化斑块内存在大量新生血管，且多数靠近中膜，这与文献报道相一致。

为进一步观察动脉粥样硬化斑块内新生血管的结构，本发明对动脉粥样硬化斑块进行免疫荧光染色，同时检测内皮细胞标志物CD31和周细胞标志物α-SMA和NG2，具体操作步骤如下：①将冰冻切片从-80℃冰箱取出后，在室温条件下复温10-15分钟，用PBST洗涤1次，洗涤时间为5分钟；②将0.1％浓度的Triton滴在组织切片上进行透膜10分钟，透膜结束后，PBST洗涤1次，洗涤时间为5分钟；③将切片擦干后，将即用型山羊血清封闭液滴在组织上，使其均匀完全覆盖住组织，进行封闭30分钟；④封闭结束后，用1％BSA溶液配置一抗工作液，将切片置入湿盒内，放入4℃冰箱，避光一抗孵育24小时；⑤孵育结束后，用PBST洗涤3次，每次5分钟，在室温黑暗条件下进行二抗孵育90分钟；⑥用PBST洗涤3次后，向切片上滴加DAPI，染核10分钟；⑦用PBST洗涤3次后，滴加抗荧光淬灭剂防止淬灭，盖玻片封片；⑧荧光显微镜采集图像，应用Image-ProPlus软件进行分析。

结果如图11所示，我们首次发现该模型中的动脉粥样硬化斑块内新生血管仅由单层内皮细胞构成，缺乏周细胞覆盖，证实了该模型中动脉粥样硬化斑块内的新生血管是不成熟的。

(2)声敏剂联和低频低强度超声诱导动脉粥样硬化斑块内的抗炎型巨噬细胞直接重编程为周细胞，并促进动脉粥样硬化斑块内的新生血管成熟

我们随机将ApoE^-/-小鼠分为对照组(Control组)和卟啉类声敏剂联和低频低强度超声组(SDT组)。SDT组的干预过程如下：ApoE^-/-小鼠经鼠尾静脉注射4mg/kg华卟啉钠，避光4小时后，使用低频低强度超声辐照其右侧颈动脉15分钟。在动物研究中，超声频率为1.0MHz，超声强度为0.8W/cm²。SDT组ApoE^-/-小鼠在干预后1周取材，Control组则不行干预，并与SDT组在同一时间取材。

①卟啉类声敏剂联和低频低强度超声诱导动脉粥样硬化斑块内的抗炎型巨噬细胞直接重编程为周细胞

本发明进行免疫荧光双染抗炎型巨噬细胞标志物CD163和周细胞标志物α-SMA或NG2，结果如图12所示，SDT组动脉斑块内CD163阳性抗炎型巨噬细胞中有71.08％的细胞同时是α-SMA阳性(P<0.0001)；有69.13％的细胞同时是NG2阳性(P<0.0001)。该结果表明，华卟啉钠联合低频超声诱导了动脉斑块内的抗炎型巨噬细胞直接重编程为周细胞。

②卟啉类声敏剂联和低频低强度超声促进动脉粥样硬化斑块内的新生血管结构成熟

动脉粥样硬化斑块内出血量的减少促使我们进一步对斑块内的新生血管进行检测。通过免疫荧光双染动脉粥样硬化斑块中内皮细胞标志物CD31和周细胞标志物α-SMA或NG2，观察新生血管的构成。结果如图13所示，SDT组动脉粥样硬化斑块内有α-SMA阳性周细胞覆盖的新生血管比例显著增加(P<0.0001)；用NG2标记周细胞也得到类似结果(P<0.001)。表明卟啉类声敏剂联和低频低强度超声可促进动脉粥样硬化斑块内的新生血管结构成熟。

③卟啉类声敏剂联和低频低强度超声促进动脉粥样硬化斑块内的新生血管功能成熟

通过免疫组化评估动脉粥样硬化斑块内的出血量，结果如图14所示，SDT组动脉粥样硬化斑块内TER119占比显著低于Control组(P<0.01)，表明卟啉类声敏剂联和低频低强度超声可减少动脉粥样硬化斑块内的出血量。

新生血管的灌注及渗漏程度是经典且被认可的反映血管功能的指标，也用来评价新生血管是否成熟。

为检测动脉动脉粥样硬化斑块内新生血管的灌注功能，我们在ApoE^-/-小鼠取材前10分钟通过鼠尾静脉注射488-Lectin，取右侧颈动脉后，立即包埋并行冰冻切片，同时对内皮细胞标志物CD31行免疫荧光染色。结果如图15所示，SDT组动脉粥样硬化斑块内Lecin与CD31均阳性的新生血管占总的CD31阳性新生血管的比例显著增加(P<0.0001)，表明卟啉类声敏剂联和低频低强度超声可改善动脉粥样硬化斑块内新生血管的灌流功能。

为检测新生血管的渗漏程度，我们在ApoE^-/-小鼠取材前10分钟通过鼠尾静脉注射70kDaFITC-Dextran，取右侧颈动脉后，立即包埋并行冰冻切片，并在显微镜下观察。结果如图16所示，SDT组动脉粥样硬化斑块内绿色荧光强度明显降低(P<0.01)，表明卟啉类声敏剂联和低频低强度超声可减轻动脉粥样硬化斑块内新生血管的渗漏程度。

发明人在细胞实验中选择的华卟啉钠孵育浓度为0.1-0.5μmol/L，孵育时间为2-24h，低频低强度超声的超声频率为0.5MHz-1.5MHz，超声强度为0.4W/cm²-1.0W/cm²，辐照时间为3-7min；在动物实验中选择的华卟啉钠的孵育浓度为1-4mg/kg，孵育时间为4-24h，低频低强度超声的超声频率为0.5MHz-1.5MHz，超声强度为0.6W/cm²-1.2W/cm²，辐照时间为10-20min。通过细胞实验和动物实验发明人发现，利用上述处理条件均能实现上述实施例记载的效果，且通过实验发现选用5-氨基酮戊酸、姜黄素或大黄素为声敏剂时也能获得同上述实施例相似的结论。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (6)

1.一种直接重编程抗炎型巨噬细胞为周细胞的方法，其特征在于，所述方法为利用声敏剂孵育抗炎型巨噬细胞，待细胞内的声敏剂达到有效浓度时，采用低频低强度超声对抗炎型巨噬细胞进行辐照；所述低频低强度超声的超声频率为0.5MHz-1.5MHz，超声强度为0.4W/cm²-1.0W/cm²。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述声敏剂为有机分子声敏剂、无机纳米声敏剂或有机-无机杂化纳米声敏剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述声敏剂为华卟啉钠、5-氨基酮戊酸、姜黄素或大黄素。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述声敏剂为华卟啉钠；所述方法中华卟啉钠的孵育浓度为0.1-0.5μmol/L，孵育时间为2-24h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辐照时间为3-7min。

6.权利要求1-5任意一项所述方法在以非治疗目的地降低内皮渗透性中的应用。