KR102080138B1

KR102080138B1 - 뮤신 및 콜라겐의 분별 추출 방법

Info

Publication number: KR102080138B1
Application number: KR1020147034260A
Authority: KR
Inventors: 다카유키 바바
Original assignee: 가부시키가이샤 구라게 겡큐쇼; 마루와 유시 가부시키가이샤
Priority date: 2012-08-23
Filing date: 2013-08-15
Publication date: 2020-02-21
Also published as: EP2889305A4; US20150152135A1; JP5775221B2; AU2013307163A1; JPWO2014030323A1; EP2889305B1; KR20150042151A; CN104379593A; CN104379593B; AU2013307163B2; WO2014030323A1; TWI605760B; TW201414427A; EP2889305A1

Abstract

이 발명의 과제는, 하나의 원료인 해파리로부터 뮤신과 콜라겐의 각각으로 분별 추출하는 분별 추출 방법을 제공하는 것이고, 해파리를 파쇄하여 이루어지는 함수 파쇄물을 고액 분리하여 얻어지는 액 성분과 탄소수 1∼4의 수용성 알코올을, 탄소수 1∼4의 수용성 알코올의 농도가 전체에 대하여 적어도 50용량%가 되도록, 혼합하여 얻어지는 혼합물을 고액 분리함으로써 고형분을 얻는 단백질 분리 공정(A)과, 상기 단백질 분리 공정(A)에서 얻어지는 고형분과 10∼40질량%의 알코올 농도인 탄소수 1∼4의 수용성 알코올 수용액을 혼합하고, 이어서 고액 분리함으로써 뮤신 함유 액 성분과 콜라겐 함유 고형 성분으로 고액 분획하는 분획 공정(B)을 갖는 것을 특징으로 하는 뮤신 및 콜라겐의 분별 추출 방법을 수단으로 한다.

Description

뮤신 및 콜라겐의 분별 추출 방법{METHOD FOR FRACTIONALLY EXTRACTING MUCIN AND COLLAGEN}

이 발명은 뮤신 및 콜라겐의 분별 추출 방법에 관한 것이고, 더욱 자세하게는 하나의 원료로서의 해파리로부터 뮤신과 콜라겐을 각각 효율적으로 분별 추출할 수 있는 뮤신 및 콜라겐의 분별 추출 방법에 관한 것이다.

종래, 특허문헌 1에는 「수(水)생물을 파쇄·세단하여 단편(斷片)으로 하고 상기 수생물로부터 효소를 유리(遊離)하는 제 1 공정과, 이 단편 중의 단백질에 상기 효소를 작용시켜 상기 단편을 분해하여 액상 물질로 하는 제 2 공정과, 상기 액상 물질로부터 유용 물질을 추출하는 제 3 공정을 구비하는 것을 특징으로 하는 수생물의 유용 물질의 추출 방법.」이 개시되어 있다. 이 특허문헌 1에 기재된 수생물은 해파리를 포함한다(특허문헌 1의 단락번호 0027∼0038 참조). 또, 이 특허문헌 1에서는 추출되는 유용 물질은 「알칼리 프로테아제나 콜라겐 등」이라고 예시되어 있지만(특허문헌 1의 단락번호 0020 참조), 유용 물질로서 「뮤신」이 예시되어 있지 않다.

특허문헌 2에는, 특정한 8개의 아미노산 배열로 이루어지는 반복 단위를 3∼2000회 포함하는 반복 구조를 갖고, 당해 구조에 있어서의 1 이상의 아미노산 잔기에 1 이상의 단당으로 이루어지는 당쇄(糖鎖)가 결합하고 있는 것을 특징으로 하는 뮤신형 당단백질이 개시된다(특허문헌 2의 청구항 1 참조). 이 특허문헌 2에 의하면, 이 뮤신형 당단백질은, 해파리의 고형 부분을 절단하는 공정, 절단한 해파리를 염(鹽)용액을 이용하여 추출하는 공정, 추출물로부터 원심 분리 및 투석에 의해 조(粗) 뮤신을 분리하는 공정, 및 뮤신형 당단백질을 정제하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 뮤신형 당단백질의 구체적인 제조 방법은, 해파리를 절단하여 얻어지는 단편을 물로 팽윤시키고, 팽윤된 단편을 농도가 연한 식염 수용액으로 진탕 추출하며, 얻어진 추출액에 3배량의 에탄올을 투입하여 겔 상의 침전물을 얻고, 침전물 함유물을 원심 분리함으로써 침전물을 분리하며, 침전물을 물에 용해함으로써 생성되는 상등액을 분리하고, 그 상등액을 투석 처리로 정제하며, 동결 건조함으로써, 얻을 수 있다(특허문헌 2의 단락번호 0088 참조). 이 특허문헌 2에는, 뮤신형 당단백질을 얻는 방법이 개시되어 있지만, 콜라겐 및 그 제조법에 대한 개시가 전혀 발견되지 않는다.

특허문헌 3에는, 「해파리류를 동결하는 동결 공정과, 해파리류 자신이 갖는 내인성 효소를 활성화하여 해파리류의 분해 반응을 개시하기 위해, 상기 동결한 해파리류를 해동하는 해동 공정과, 해파리류가 갖는 콜라겐을 미(未)변성의 상태에서 가용화하여 상기 미변성의 콜라겐을 포함하는 중성 염용액을 생성하기 위해, 상기 해동한 해파리류를 교반하는 교반 공정과, 상기 중성 염용액으로부터 상기 미변성의 콜라겐을 회수하는 회수 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 해파리류로부터의 콜라겐 회수 방법.」이 개시되어 있다(특허문헌 3의 청구항 참조). 특허문헌 3에는 뮤신의 분리 회수에 대한 기재가 없다.

특허문헌 4에는, 「해파리류 자신이 갖는 내인성 효소를 활성화하여 해파리류의 분해 반응을 개시시키고, 해파리류가 갖는 콜라겐을 미변성의 상태에서 가용화하여 상기 미변성의 콜라겐을 포함하는 중성 염용액을 생성하기 위해, 해파리류를 소정의 저온에서 저장하는 저온 저장 공정과, 상기 중성 염용액으로부터 상기 미변성의 콜라겐을 회수하는 회수 공정을 갖는 것을 특징으로 하는 해파리류로부터의 콜라겐 회수 방법.」이 개시되어 있다(특허문헌 4의 청구항 1 참조). 특허문헌 4에 개시된 콜라겐 회수 방법은, 「해파리의 저온 저장 시에 콜라겐을 가용화하는 효소가 작용한다」라는 발견에 의거한다(특허문헌 4의 단락번호 0019 참조). 저온 저장 시에 있어서의 저온은, 「-2℃로부터 25℃까지의 온도 범위로 하는 것이 바람직하다」라고 되어 있다(특허문헌 4의 단락번호 0021 참조).

일본 공개특허 특개2001-178492호 공보 국제공개 WO2007/020889호 공보 일본 공개특허 특개2007-051191호 공보 일본 공개특허 특개2008-31106호 공보

이 발명이 해결하고자 하는 과제는, 하나의 원료인 해파리로부터 뮤신과 콜라겐의 각각으로 분별 추출하는 분별 추출 방법을 제공하는 데에 있다.

상기 과제를 해결하기 위한 수단은,

(1) 해파리를 파쇄하여 이루어지는 함수(含水) 파쇄물을 고액(固液) 분리하여 얻어지는 액(液) 성분과 탄소수 1∼4의 수용성 알코올을, 탄소수 1∼4의 수용성 알코올의 농도가 전체에 대하여 적어도 50용량%가 되도록, 혼합하여 얻어지는 혼합물을 고액 분리함으로써 고형분을 얻는 단백질 분리 공정(A)과,

상기 단백질 분리 공정(A)에서 얻어지는 고형분과 10∼40질량%의 알코올 농도인 탄소수 1∼4의 수용성 알코올 수용액을 혼합하고, 이어서 고액 분리함으로써 뮤신 함유 액 성분과 콜라겐 함유 고형 성분으로 고액 분획하는 분획 공정(B)을 갖는 것을 특징으로 하는 뮤신 및 콜라겐의 분별 추출 방법이며,

(2) 상기 단백질 분리 공정(A)에 있어서의 고액 분리에 의해 얻어지는 고형분을 탄소수 1∼4의 수용성 알코올 및/또는 물로 세정하여 이루어지는 세정 고형분을, 상기 단백질 분리 공정(A)에서 얻어지는 고형분으로 하여, 상기 분획 공정(B)에 제공하는 것을 특징으로 하는 상기 (1)에 기재된 뮤신 및 콜라겐의 분별 추출 방법이고,

(3) 상기 탄소수 1∼4의 수용성 알코올 및/또는 물이, 상기 단백질 분리 공정(A)에 있어서의 고액 분리에 의해 얻어지는 고형분의 질량에 대하여 1∼4배 질량의 비율로, 상기 고형분과 혼합되는 상기 (2)에 기재된 뮤신 및 콜라겐의 분별 추출 방법이다.

이 발명에 의하면, 해파리로부터 뮤신과 콜라겐의 각각으로 분별 추출할 수 있는 방법을 제공할 수 있다. 이 발명에 의하면, 해파리로부터 뮤신을, 종래보다 향상된 뮤신 추출량으로, 분리할 수 있는 뮤신과 콜라겐의 분별 추출 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 이 발명에 관련된 분별 추출 방법의 일례를 나타내는 공정 흐름도이다.

이 발명에 있어서의 「해파리」는, 자포동물문에 속하는 해파리이다. 이와 같은 해파리로서, 무럼 해파리, 일본 대양 해파리(Chrysaora pacifica), 평면 해파리, 노무라입깃 해파리, 등 해파리, 숲뿌리 해파리(Rhopilema esculenta), 하브 해파리(Chironex yamaguchii) 등을 들 수 있다. 바람직한 해파리는, 사람에 대한 안전성이 확인되어 있는 해파리이고, 이미 식용으로 제공되어 있는 무럼 해파리, 숲뿌리 해파리, 노무라입깃 해파리 등이다.

이 발명의 방법에 제공되는 해파리의 형태에 대해서는 특별히 제한이 없고, 예를 들면 생(生) 해파리, 냉동 해파리, 건조 해파리, 염장 해파리 등을 사용할 수 있다.

이 발명의 방법으로 분리되는 뮤신은, 하기 식 (I)(배열 번호 1)으로 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 반복 단위를 3회 이상 포함하는 반복 단위 구조를 갖는다.

Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Pro (I)

(식 (Ｉ) 중, Xaa는 Val 또는 Ile이다.)

뮤신은, 부정(不定) 분자량인 고분자 화합물이다. 상기 단위의 반복 횟수는, 가령 동일한 종에 속하는 해파리를 원료로 하는 이 발명의 방법에 의해 얻어진 뮤신이어도, 개개의 분자에 따라 다르다. 겔 여과 분석의 결과, 이 발명의 방법의 일례인 구체적 방법에 의해 얻어지는 뮤신의 분자량은, 아미노산 배열 해석으로 얻어진 수(數)평균을 이용하여 겔 여과의 해석을 보정하면 10∼1400kDa였기 때문에, 후술하는 당쇄의 구조와 맞춰서 검토하면, 이 발명의 방법에 의해 얻어지는 분자량(반복 횟수가 3∼700회 정도)의 3배 정도의 크기의 고분자도 자연계에 존재한다고 예측되고, 그 뮤신이어도 물성이나 기능이 크게 변화된다고는 생각되지 않으므로, 이 발명에 있어서의 뮤신의 반복 횟수는, 약 3∼2000회 정도, 바람직하게는 3∼700회이다. 여기서, 트레오닌(Thr) 잔기의 전체에 당쇄가 결합하고, 또한 당쇄 부분이 가장 전형적인 -GalNac-Gal이라고 가정하면, 예를 들면 분자량 약 4.5kDa의 경우에는, 상기 단위의 반복 횟수가 약 3회, 분자량 약 750kDa의 경우에는, 상기 단위의 반복 횟수가 약 40회이다. 또한, 본 명세서에서는 분자량으로부터 반복 횟수를 산출하는 경우, 특별히 언급하지 않는 한 동일한 가정을 이용하는 것으로 한다.

상기 반복 단위는, 직접적으로 결합하고 있어도 되고, 또, 링커를 통해 결합하고 있어도 된다. 상기 링커는 특별히 제한되는 것은 아니지만, 상기 링커의 구체예로서 시스테인(cystein)을 이용한 S-S 결합을 들 수 있다.

이 발명의 방법에 의해 얻어지는 뮤신은, 상기 반복 구조 이외에, 그 뮤신으로서의 기능(예를 들면 점성, 항균성, 보습성 등)에 영향을 미치지 않을 정도의 다른 아미노산을 포함하고 있는 것도 있다. 또한, 반복 구조에 있어서의 반복 단위가 시프트하고 있는 것도 있다. 즉, 일본 대양 해파리 유래의 뮤신은, 그 반복 단위가 VEXXAAPV이고, 이것은 식 (I)로 나타내어지는 반복 단위가 1아미노산만큼 시프트한 것이다. 따라서, 이 발명의 방법에 의해 분리되는 뮤신은, 반복 구조의 N말단에 존재하는 1 또는 몇 개의 아미노산을 결손하고, 그 결과, 반복 단위가 시프트하고 있는 뮤신도 포함하며, 이와 같이 반복 단위가 시프트하는 뮤신 중에서도 바람직한 뮤신은, 반복 구조의 N말단에 존재하는 Val을 결손하는 뮤신이다.

또, 이 발명에 있어서의 뮤신은, 상술한 반복 구조의 1 이상의, 특히 1 이상 5 이하의 아미노산 잔기에 1 이상, 특히 1 이상 5 이하의 단당으로 이루어지는 당쇄가 결합하고 있는 것이 있다. 당쇄가 결합하는 아미노산 잔기의 종류는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 트레오닌 잔기(Thr)에 당쇄가 결합하고 있는 것이 바람직하다. 예를 들면, 이 발명의 방법에 의해 분리되는 뮤신은, 당쇄가 결합하는 아미노산 잔기의 전체의 98%∼100%가 트레오닌(Thr)인 것도 있다. 또, 상술한 바와 같이, 뮤신형 당단백질은 그 성질로서 부정 분자량의 고분자 화합물이므로, 당쇄가 결합하는 아미노산 잔기의 수는, 개개의 분자에 따라 다르다. 그러나, 상술한 반복 구조에 있어서의 2개의 트레오닌 잔기의 대략 전체에 당쇄가 결합하고 있다고 예측된다. 따라서, 이 발명의 방법에 의해 분리되는 뮤신에 있어서의 결합 당쇄의 수는, 상기 단위의 반복 횟수에 따라 다르다.

당쇄를 구성하는 단당은, 일반적인 뮤신에 있어서 발견되고 있는 단당이고, 예를 들면 N-아세틸갈락토사민, 갈락토오스, N-아세틸글루코사민, 시알산, 아라비노오스, 푸코오스 등을 예시할 수 있으며, 대부분의 경우, N-아세틸갈락토사민 및/또는 갈락토오스로 구성되는 당쇄이고, 구체적으로는, 상술한 반복 단위에 있어서의 트레오닌 잔기(Thr)에, N-아세틸갈락토사민 및 갈락토오스가 결합하여, Thr-GalNAc-Gal의 구조를 취하며, 혹은, N-아세틸갈락토사민만이 결합하여 Thr-GalNAc의 구조를 취한다. 예를 들면, 그와 같은 뮤신은, 하기 식 (Ⅱ)에 의해 나타낼 수 있다.

(식 (Ⅱ) 중, □는 GalNAc이고, ○는 Gal이다. ○로 나타내는 Gal은 결손되어 있어도 된다.)

또 당쇄는, 통상 1∼10개, 특히 1∼8개, 나아가서는 1∼5개의 단당이 직쇄형 또는 분지(分枝)형으로 연결되어 있다. 뮤신이 부정 분자량을 갖는다는 특질 때문에, 뮤신에 포함되는 당쇄의 수, 종류, 구조, 크기 등은, 개개의 뮤신에 따라 다르고, 또, 하나의 뮤신에 포함되는 당쇄도 개별적으로 다른 경우가 있다. 예를 들면, 어느 무럼 해파리로부터 분리된 뮤신과 다른 무럼 해파리로부터 분리된 뮤신을 비교하면, 펩티드 사슬의 반복 부분은 완전히 동일하지만, 당쇄를 구성하는 당의 종류와 그 성분비만이 서로 상이하다. 또한, 이와 같이 당쇄가 상이하지만 펩티드 사슬의 반복 부분이 동일한 뮤신은, 무럼 해파리 또는 일본 대양 해파리를 포함하는 자연계에 있어서 동일한 기능을 달성하는 것으로서 존재하고 있다고 생각된다. 이 2종의 해파리에 있어서의 뮤신의 작용에는 큰 차이가 없다고 생각되기 때문에, 당쇄 구조는 뮤신의 주된 성질을 바꾸지 않고, 오히려 특이성을 미(微)조절하는 역할을 하고 있다고 추측된다. 따라서, 당쇄 부분이 달라도 펩티드 사슬의 반복 구조를 갖는 뮤신은, 이 발명의 방법에 의해 분리되는 뮤신의 범위 내에 포함된다.

이 발명의 방법에 의해 분리되는 콜라겐은, 글리신이 총 아미노산량의 약 1/3을 차지하는 아미노산 조성을 갖는다. 따라서, 이 발명의 방법에 의해 분리한 물질 중에 포함되는 글리신의 양을 정량함으로써, 그 물질을 콜라겐이라고 하여 동정(同定)할 수 있다. 이 발명의 방법에 의해 분리되는 콜라겐은, 종래부터 공지된 콜라겐과 동일하게, 히드록시프롤린 및 히드록시리신을 특유의 아미노산으로서 함유한다. 해파리로부터 추출되는 콜라겐은, α1α2α3의 헤테로 3량체로 형성되어 있는 포유동물의 V형 모양 콜라겐과 유사 구조를 갖고, 타종(他種)의 콜라겐과 비교하여, 당 함량이 많으며, 히드록시프롤린에 비해 히드록시리신양이 많은 것이 하나의 특장(特長)이다.

이 발명에 관련된 분별 추출 방법에서는,

해파리를 파쇄하여 이루어지는 함수 파쇄물을 고액 분리하여 얻어지는 액 성분과 탄소수 1∼4의 수용성 알코올을, 탄소수 1∼4의 수용성 알코올의 농도가 전체에 대하여 적어도 50용량%가 되도록, 혼합하여 얻어지는 혼합물을 고액 분리함으로써 고형분을 얻는 단백질 분리 공정(A)(이하에 있어서, 이 단백질 분리 공정(A)을 단순히 공정(A)라고 칭하는 경우가 있다.)과,

상기 단백질 분리 공정(A)에서 얻어지는 고형분과 10∼40질량%의 알코올 농도인 탄소수 1∼4의 수용성 알코올 수용액을 혼합하고, 이어서 고액 분리함으로써 뮤신 함유 액 성분과 콜라겐 함유 고형 성분으로 고액 분리하는 분획 공정(B)(이하에 있어서, 이 분획 공정(B)을 단순히 공정(B)라고 칭하는 경우가 있다.)을 갖는다.

이 발명에 있어서의 공정(A)에서는, 먼저 해파리를 파쇄함으로써 함수 파쇄물을 얻는다. 파쇄되는 해파리는, 해양에서 채취한 해파리여도 되고, 또 해양에서 채취 후에 동결 보존되어 있었던 동결 해파리여도 된다. 동결 해파리는 해동하고나서 이 발명의 방법에 제공하는 것이 바람직하다.

어떻든 간에 원료로서의 해파리는 수세(水洗)하고, 고형물과 액체로 분리하는 것이 바람직하다. 고형물과 액체로 분리하는 수단으로서는, 예를 들면 원심 분리기, 스트레이너(strainer), 배수기, 탈수기를 적절예로서 들 수 있다.

해파리인 고형물은, 파쇄 수단, 예를 들면 가위, 호모지나이저(homogenizer), 블렌더(blender), 파쇄기에 의해 파쇄되어 함수 파쇄물이 된다. 함수 파쇄물은, 파쇄되어 형성된 입자의 집합체, 파쇄되어 형성된 실 형상 또는 직사각 형상의 단편의 집합체, 파쇄되어 형성된 5㎜∼1㎝ 사방(四方) 정도로서, 형상 불특정의 단편의 집합체 등의 어느 것이어도 된다.

공정(A)에서는, 상기 함수 파쇄물을 교반하고, 이어서 고액 분리하여 얻어지는 액 성분을 얻는다. 함수 파쇄물은 정치(靜置)해 두어도 되지만, 교반하는 것이 바람직하다. 정치할 때에는 정치 시간을 통상, 1∼24시간으로 한다. 이 혼합물을 정치하고, 또는 교반할 때의 혼합물의 온도를 0∼25℃로 유지해 두는 것이 바람직하다. 이 혼합물을 정치하고, 바람직하게는 교반함으로써 액 중에 해파리 중의 수용성 성분이 용해된다. 이 혼합물을 고액 분리하는 수단으로서는, 원심 분리 장치, 여과 장치, 압착 장치 등을 들 수 있다.

공정(A)에서는, 고액 분리되어 얻은 액 성분과 탄소수 1∼4의 수용성 알코올을, 탄소수 1∼4의 수용성 알코올의 농도가 전체에 대하여 적어도 50용량%가 되도록, 바람직하게는 60용량%∼80용량%가 되도록, 혼합한다.

탄소수 1∼4의 수용성 알코올로서는, 탄소수 1∼4의 1가 알킬알코올을 들 수 있고, 구체적으로는 메틸알코올, 에틸알코올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 알킬알코올을 들 수 있다. 이들 중에서도, 에틸알코올 및 프로필알코올이 바람직하다. 인체에의 독성이라는 관점에서 메탄올보다 에탄올이나 프로필알코올이 바람직하다.

상기 액 성분과 수용성 알코올의 혼합 비율이, 액 성분과 수용성 알코올의 혼합액 중의 수용성 알코올의 농도가 50용량% 미만이면, 뮤신이 고형분으로 이행하지 않고 액 성분에 머물러버려, 이 발명의 과제를 달성할 수 없다.

더욱 상술하면, 이하와 같은 실험 사실을 제시할 수 있다.

상기 액 성분과 수용성 알코올의 혼합액 중의 수용성 알코올의 농도가 20용량%가 되도록 상기 액 성분과 수용성 알코올을 혼합함으로써 생성하는 침전물은 콜라겐이 주성분이고, 그러나 그 침전물은 원래의 액 성분 중의 콜라겐의 전부는 아니며, 고액 분리 후의 액 성분(제 1 액 성분이라고 칭하는 경우가 있다.)에는 잔여의 콜라겐과 뮤신이 함유되어 있다. 따라서, 예를 들면 수용성 알코올의 농도가 20용량%가 되도록 액 성분과 수용성 알코올을 혼합하고나서 고액 분리하는 것 만으로는, 콜라겐과 뮤신을 효율적으로 분리할 수 없다.

수용성 알코올의 농도가 30용량%가 되도록 상기 제 1 액 성분과 수용성 알코올을 혼합함으로써 생성되는 침전물은 상기 액 성분에 있어서의 것과 동일하게 콜라겐이 주성분이며, 그러나 그 침전물은 제 1 액 성분 중에 포함되는 콜라겐의 전부는 아니고, 고액 분리 후의 액 성분(제 2 액 성분이라고 칭하는 경우가 있다.)에는 잔여의 콜라겐과 뮤신이 함유되어 있다. 따라서, 예를 들면 수용성 알코올의 농도가 30용량%가 되도록 제 1 액 성분과 수용성 알코올을 혼합하고나서 고액 분리하는 것 만으로는, 콜라겐과 뮤신을 효율적으로 분리할 수 없다.

수용성 알코올의 농도가 40용량%가 되도록 상기 제 2 액 성분과 수용성 알코올을 혼합함으로써 생성되는 침전물에는 몇 종류의 펩티드가 함유되어 있고, 따라서, 이 제 2 액 성분에는 콜라겐이 거의 포함되어 있지 않은 것을 알 수 있다. 고액 분리 후의 액 성분(제 3 액 성분이라고 칭하는 경우가 있다.)에는 뮤신이 함유되어 있다. 따라서, 예를 들면 수용성 알코올의 농도가 40용량%가 되도록 제 2 액 성분과 수용성 알코올을 혼합하고나서 고액 분리하는 것 만으로는, 콜라겐과 뮤신을 침전물로서 얻을 수 없어, 이들을 효율적으로 분리할 수 없다.

수용성 알코올의 농도가 50용량%가 되도록 상기 제 3 액 성분과 수용성 알코올을 혼합함으로써 생성되는 침전물에는 뮤신이 함유되어 있다. 따라서, 이 제 3 액 성분에는 콜라겐이 거의 포함되어 있지 않은 것을 알 수 있다.

이들의 실험 사실로부터, 해파리의 함수 파쇄물로부터 고액 분리에 의해 얻어지는 액 성분과 수용성 알코올을, 상기 액 성분과 상기 수용성 알코올의 혼합물 전체에 대하여 수용성 알코올의 농도가 적어도 50용량%가 되도록, 혼합하면, 콜라겐과 뮤신이 침전되고, 얻어지는 고형분을 수집함으로써 콜라겐과 뮤신을 효율적으로 분리할 수 있다.

이와 같은 실험 사실은 수용성 알코올, 예를 들면 에탄올 및 프로판올을 사용함으로써 본원 발명자에 의해 처음으로 발견되었다. 에탄올 및 프로판올에 있어서 관찰되는 현상은, 에탄올 및 프로판올과 동족이면서 또한 근연(近緣)의 알코올인 탄소수 1∼4의 저급 알코올에 있어서도 동일한 현상이 관찰된다.

이 발명은 이와 같은 실험 사실에 의거한다.

또한, 해파리의 함수 파쇄물로부터 고액 분리에 의해 얻어지는 액 성분과 수용성 알코올을, 상기 액 성분과 상기 수용성 알코올의 혼합물 전체에 대하여 수용성 알코올의 농도가 50용량% 미만이 되도록, 혼합함으로써 생성되는 침전물과 여과액으로 분리하면, 침전물에는 콜라겐이 포함되고, 여과액에는 뮤신이 포함될 것이기 때문에, 여과액에 수용성 알코올을, 수용성 알코올의 농도가 50용량% 이상이 되도록 첨가함으로써 뮤신을 침전시킬 수 있다는 생각도 있겠지만, 이 생각하에서는, 상기 여과액 중에 포함되는 콜라겐을 추출하기 위해 상기 여과액 중의 콜라겐을 수용성 알코올에서 추출하는 조작을 반복하지 않으면 안 되어 번잡하고, 또 상기 침전물 중에 콜라겐과 펩티드류가 함유되어버려, 이 침전물 중으로부터 상기 펩티드류를 제거하는 공정이 필요해져 콜라겐 취득의 효율이 나쁘다.

액 성분과 상기 수용성 알코올의 혼합은, 통상 0∼25℃의 온도 범위 내에서 행하는 것이, 바람직하다. 상기 온도 범위 내의 온도에서 혼합을 행하면, 뮤신 및 콜라겐에 영향을 주지 않아 바람직하다. 혼합 시간은, 통상 1∼48시간, 바람직하게는 12∼24시간이다.

이 공정(A)에서는, 상기 혼합 후에, 혼합물을 고액 분리하고, 이것에 의해 고형분을 얻는다. 고액 분리하는 수단으로서는, 원심 분리 장치, 여과 장치, 압착 장치 등을 들 수 있다.

고액 분리됨으로써 생성한 고형분을, 다음의 공정(B)에, 제공할 수 있지만, 고형분 중에는 염이나 지방질 등의 불순물이 포함되어 있으므로 이것을 제거하기 위해, 및 고형분 중에 포함되는 알코올 농도를 일정화시키기 위해, 세정 처리를 하는 것이 좋다. 이 세정 처리를 하는 공정을 세정 공정(A1)이라고 칭하는 경우가 있다.

세정 공정(A1)은, 상기 단백질 분리 공정(A)에 있어서의 고액 분리에 의해 얻어진 고형분과, 경제성을 고려하여 이 고형분의 질량에 대하여 1∼4배 질량의 탄소수 1∼4의 수용성 알코올 수용액을 혼합함으로써 행할 수 있다.

상기 수용성 알코올로서는, 탄소수 1∼4의 1가 알킬알코올을 들 수 있고, 구체적으로는 메틸알코올, 에틸알코올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 알킬알코올을 들 수 있다. 이들 중에서도, 에틸알코올 및 프로필알코올이 바람직하다.

고형분과 상기 수용성 알코올의 혼합물은, 정치해 두어도 되지만 세정을 효과적으로 행하기 위해서는 교반하는 것이 좋다. 또 혼합물을 계속해서 정치하는 시간 또는 교반하는 시간, 즉 세정 시간은 통상, 1시간 이내이고, 정치하거나, 또는 교반할 때의 온도는 통상 0∼25℃이다. 세정 조작을 할 때의 온도는, 통상 0∼25℃이다. 상기 온도 범위 내의 온도에서 세정 조작을 행하면, 뮤신 및 콜라겐에 영향을 주지 않아 바람직하다.

상기 혼합물을 정치하고, 또는 혼합 교반하고나서 나중에, 고액 분리 조작을 한다. 고액 분리 수단으로서는, 원심 분리 장치, 여과 장치, 압착 장치 등을 들 수 있다.

이 세정 공정(A1)에 있어서는, 고형분과 특정 농도의 수용성 알코올의 혼합 조작 및 그 후의 고액 분리 조작은 1회여도 되고, 또 복수 회 행하여도 된다. 반복하는 세정 횟수를 정하는 기준으로서, 고형분의 질량 변화가 5% 이하가 되었을 때에 세정 조작을 정지하고, 다음의 공정으로 이행한다.

이 세정 공정(A1)에서 얻어지는 고형분은, 세정 처리를 하기 전의 고형분이 포함하는 염분의 양보다 적은 양의 염분을 함유하므로, 이 세정 공정(A1)에 의해 얻어지는 고형분을 세정 처리하고 있지 않은 고형분과 언어상의 구별을 하기 위해, 「세정 고형분」이라고 칭하는 경우가 있다.

이 발명에 있어서는, 상기 공정(A1)에 의해 얻어진 세정 고형분 또는 상기 공정(A1)을 하지 않은 고형분을, 공정(B)에 제공한다.

공정(B)에서는, 상기 단백질 분리 공정(A)에서 얻어지는 고형분(세정 고형분, 또는 세정 공정(A1)을 하지 않은 고형분)과 10∼40질량%의 알코올 농도인 탄소수 1∼4의 수용성 알코올 수용액을 혼합하고, 이어서 고액 분리함으로써 뮤신 함유 액 성분과 콜라겐 함유 고형 성분으로 분리한다.

상기 수용성 알코올로서는 메틸알코올, 에틸알코올, 프로필알코올, 부틸알코올 등의 1가 알킬알코올을 들 수 있다. 이들 중에서도, 에틸알코올 및 프로필알코올이 바람직하다.

이 발명에 있어서는, 고형분과 혼합하는 상기 수용성 알코올의 알코올 농도가 10질량%∼40질량%이면, 그 후의 고액 분리 조작에 의해 생성하는 고형분 중에 콜라겐이 포함되고, 액 성분 중에 뮤신이 포함되게 된다. 또, 알코올 농도가 40질량%를 넘는 수용성 알코올 수용액을 고형분에 첨가 혼합하면, 혼합에 의해 생기는 고형분에는 콜라겐 이외의 펩티드의 함유량이 매우 적어 콜라겐이 고순도로 포함된다.

이 공정(B)에 있어서는, 공정(A)에서 얻어지는 상기 고형분과 상기 수용성 알코올의 혼합 조작은, 통상 0∼25℃의 온도하에서, 통상 1시간 이내 교반함으로써 행하여진다. 상기 온도 범위 내의 온도에서 혼합을 행하면, 뮤신 및 콜라겐에 영향을 주지 않아 바람직하다.

혼합 조작의 종료 후에 고액 분리 조작이 행하여져서, 뮤신이 함유되는 뮤신 함유 액 성분과 콜라겐이 함유되는 콜라겐 함유 고형 성분이 얻어진다.

뮤신 함유 액 성분은, 그것을 공지된 정제 조작, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피, 및 건조 조작, 예를 들면 동결 건조를 함으로써 뮤신을 단리할 수 있다. 뮤신 함유 액 성분 중에 포함되는 뮤신 또는 단리된 뮤신은, 그것을 아미노산 분석에 의해, 식 (I)(배열 번호 1)으로 나타내는 아미노산을 함유함으로써 동정할 수 있다.

콜라겐 함유 고형 성분은, 그것을 공지된 정제 조작, 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피, 및 건조 조작, 예를 들면 동결 건조를 함으로써 콜라겐을 단리할 수 있다. 콜라겐은, 아미노산 분석에 의해, Gly의 함유량을 정량함으로써 동정할 수 있다.

실시예

이하, 예시적이지만 한정적이지 않은 실시예를 설명함으로써 본 발명을 더 깊게 이해할 수 있다.

(실시예 1)

무럼 해파리(Aurelia aurita)로부터 하기의 방법으로 뮤신 및 콜라겐을 얻었다.

1) 냉장 상태에 있는 해파리 개체를 수세하고, 스트레이너에 의해 고형물과 액체로 분리했다.

2) 분리된 고형물을, 파쇄기로 세단했다. 세단하여 얻어진 세단편을 시료로 했다.

3) 2)에서 얻어진 시료와 물을, 추출 교반조에 장전하고, 4℃에서 교반 추출을 행하였다.

4) 3)에 있어서의 교반 추출에 의해 얻어진 수용액을 4℃인 채로 10000G에서, 10분간 원심 분리하여 액 성분을 얻었다.

5) 4)에서 얻어진 액 성분에, 이소프로필알코올 농도가 70용량%가 되도록, 이소프로필알코올을 투입하면 겔 상의 침전물이 생겼다.

6) 5)에 있어서 얻어진 겔 상의 침전물을 함유하는 액을 밤새 4℃로 유지하면서 교반한 후, 4℃인 채로 10000G에서, 10분간 원심 분리하여 고형분을 얻었다.

7) 6)에서 얻어진 고형분 질량에 대하여 3배 질량의 60질량% 농도의 이소프로필알코올 수용액을 첨가했다.

8) 7)에 있어서 생성하는 혼합물을 4℃에서 5분간 교반한 후, 4℃인 채로 10000G에서, 10분간 원심 분리하여 고형분을 얻었다.

9) 8)에서 얻어진 고형분에 대하여, 재차 7) 및 8)에 의한 세정 조작을 행하였다.

이상과 같이 하여 단백질 분리 공정(A)을 종료했다.

10) 상기 9)에서 얻어진 고형분 질량에 대하여 3배 질량의 25질량% 농도의 이소프로필알코올 수용액을 첨가했다.

11) 10)에서 얻어진 용액을 4℃에서 5분간 교반한 후, 4℃인 채로 10000G에서, 10분간 원심 분리하여 고형분을 얻었다.

12) 11)에서 얻어진 고형분에 대하여 10) 및 11)의 조작을 추가로 2회 행하여, 고형분과 액 성분으로 분리했다.

13) 12)에서 얻어진 액 성분에 대하여 투석 처리 및 동결 건조를 행하여 최종의 고형분(L)을 얻었다. 또 12)에서 얻어진 고형분을 물로 현탁한 후에 투석 처리 및 동결 건조를 행하여 최종의 고형분(S)을 얻었다.

이들 고형분(L) 및 고형분(S)에 대하여, 이하와 같이 하여, 자동 아미노산 분석계에 의해 구성 아미노산 분석을 행한 결과, 고형분(L)이 뮤신이고, 고형분(S)이 콜라겐이었다.

상기 고형분(L) 및 고형분(S) 각각을 상술의 이온 교환 크로마토그래피로 정제하고, 투석한 시료(약 12마이크로그램)를 가수분해 튜브로 옮겨, 원심 이배퍼레이터에 의해 건고(乾固)하고, 정(定)비점염산(5.7N)이 들어간 외관(外管)에 넣어서 감압 봉관(封管)했다. 가수분해를, 기상(氣相)법으로 110℃에서 20시간 행하였다.

봉지된 외관을 개관(開管)하고, 가수분해 튜브의 내용물을 동일하게 건조하며, 건조한 가수분해물을 0.02N 염산 100마이크로리터에 용해했다. 가수분해물의 아미노산 분석에는 (주)히타치세이사쿠쇼 제의 고속 아미노산 분석계 L-8500A를 이용했다. (주)히타치세이사쿠쇼가 정하는 특수 아미노산 분석법으로 가수분해물 중의 아미노산을, 이온 교환 칼럼을 이용하여 5종류의 완충액으로 분리시켰다. 분리한 아미노산은, 포스트 칼럼법에 의해 닌히드린으로 반응시켜 2파장의 가시광으로 검출했다. 아미노당과 통상의 아미노산은 570㎚의 크로마토그램에서, 또, 프롤린은 440㎚의 크로마토그램에서 표준 아미노산 혼합물 및 글루코사민, 갈락토사민을 2나노몰 분석한 값을 기초로 정량했다.

아미노산 조성 분석의 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1의 아미노산 농도비로 나타낸 바와 같이, 얻어진 뮤신의 펩티드부의 조성은, 트레오닌(Thr):글루타민산(Glu):프롤린(Pro):알라닌(Ala):발린(Val)+이소로이신(Ile):N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이 각각 15%의 오차로 2:1:1:2:2:2인 것이 판명되어, 고순도의 뮤신인 것을 확인할 수 있었다.

또, 얻어진 콜라겐의 펩티드부의 조성은, 글리신(Gly)의 농도 비율이 전체 아미노산의 약 1/3을 차지하여, 고순도의 콜라겐인 것을 확인할 수 있었다.

표 2에, 얻어진 뮤신 및 콜라겐의 수율을 나타냈다.

(실시예 2)

5) 4)에서 얻어진 액 성분에, 에탄올 농도가 70용량%가 되도록, 에탄올을 투입하면 겔 상의 침전물이 생겼다.

7) 6)에서 얻어진 고형분 질량에 대하여 3배 질량의 60질량% 농도의 에탄올 수용액을 첨가했다.

이상과 같이 하여 단백질 분리 공정(A)을 종료했다.

10) 상기 9)에서 얻어진 고형분 질량에 대하여 3배 질량의 25질량% 농도의 에탄올 수용액을 첨가했다.

13) 12)에서 얻어진 액 성분에 대하여 투석 처리 및 동결 건조를 행하여 최종의 고형분(L)을 얻었다. 또 12)에서 얻어진 고형분을 물에 현탁한 후에 투석 처리 및 동결 건조를 행하여 최종의 고형분(S)을 얻었다.

표 2에, 얻어진 뮤신 및 콜라겐의 수율을 나타냈다.

(비교예 1)

실시예 2의 1)∼4)와 동일한 조작을 함으로써 얻어진 액 성분에, 에탄올 농도가 50용량%가 되도록, 에탄올을 투입하면 겔 상의 침전물이 생겼다. 이 겔 상의 침전물을 함유하는 액을 이용하여, 실시예 1의 6)∼13)과 동일한 조작을 함으로써, 최종의 고형분(L)과 고형분(S)을 얻었다.

표 2에, 얻어진 뮤신 및 콜라겐의 수율을 나타냈다.

(실시예 3)

실시예 2의 1)∼4)와 동일한 조작을 함으로써 얻어진 액 성분에, 에탄올 농도가 60용량%가 되도록, 에탄올을 투입하면 겔 상의 침전물이 생겼다. 이 겔 상의 침전물을 함유하는 액을 이용하여, 실시예 1의 6)∼13)과 동일한 조작을 함으로써, 최종의 고형분(L)과 고형분(S)을 얻었다.

표 2에, 얻어진 뮤신 및 콜라겐의 수율을 나타냈다.

(비교예 2)

실시예 2의 10)의 공정에 있어서의 고형분에, 그 고형분에 대하여 60질량%의 농도가 되도록, 이소프로판올을 첨가하여 혼합한 것 이외에는 실시예 2와 동일하게 하여 조작을 함으로써, 최종의 고형분(L)과 고형분(S)을 얻었다.

표 2에, 얻어진 뮤신 및 콜라겐의 수율을 나타냈다.

실시예 1∼3과 비교예 1 및 2의 결과로부터, 이 발명에 있어서, 뮤신 및 콜라겐을 효율적으로 분별 추출하는 것이, 명백하다.

(비교예 3)

실시예 2의 10)의 공정에 있어서의 고형분에, 그 고형분에 대하여 3배 질량의 물을, 추가한 것 이외에는 상기 실시예 2와 동일하게 실시하여, 최종의 공정인 12)에서 얻어진 액 성분에 대하여 투석 처리 및 동결 건조를 행하여 최종의 고형분(Lc)을 얻었다. 또 12)에서 얻어진 고형분을 물로 현탁한 후에 투석 처리 및 동결 건조를 행하여 최종의 고형분(Sc)을 얻었다. 표 3에는, 얻어진 뮤신 및 콜라겐의 수율을 나타냈다.

상기 최종의 고형분(Lc) 및 (Sc)에 대하여, 상기 실시예 1에 있어서의 것과 동일하게 하여, 자동 아미노산 분석계에 의해 구성 아미노산 분석을 행하였다.

아미노산 조성 분석의 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4의 아미노산 농도비에 나타낸 바와 같이, 고형분(Lc)으로서 얻어진 뮤신의 펩티드부의 조성은, 이론값인 트레오닌(Thr):글루타민산(Glu):프롤린(Pro):알라닌(Ala):발린(Val)+이소로이신(Ile):N-아세틸갈락토사민(GalNAc)이 2:1:1:2:2:2와 차이가 크게 나고 있는 것, 또, 콜라겐 유래의 글리신(Gly)의 농도 비율이 높은 것으로부터, 뮤신의 순도가 낮은 것을 확인할 수 있었다.

(참고예)

실시예 1에 있어서의 공정 4)에 의해 얻어지는 액 성분에, 에탄올 농도가 20용량%가 되도록 에탄올을, 첨가하고, 첨가 혼합에 의해 생기는 침전물을 고액 분리하여 침전물과 액 성분(제 1 액 성분이라고 칭한다.)을 채취했다. 그 침전물을, 실시예 1에 있어서의 것과 동일하게 하여 자동 아미노산 분석을 한 결과, 표 5에 나타내어지는 주성분이 표 5에 나타내어지는 수량으로 얻어졌다.

상기 제 1 액 성분에, 에탄올 농도가 30용량%가 되도록 에탄올을, 첨가하고, 첨가 혼합에 의해 생기는 침전물을 고액 분리하여 침전물과 액 성분(제 2 액 성분이라고 칭한다.)을 채취했다. 그 침전물을, 실시예 1에 있어서의 것과 동일하게 하여 자동 아미노산 분석을 한 결과, 표 5에 나타내어지는 주성분이 표 5에 나타내어지는 수량으로 얻어졌다.

상기 제 2 액 성분에, 에탄올 농도가 40용량%가 되도록 에탄올을, 첨가하고, 첨가 혼합에 의해 생기는 침전물을 고액 분리하여 침전물과 액 성분(제 3 액 성분이라고 칭한다.)을 채취했다. 그 침전물을, 실시예 1에 있어서의 것과 동일하게 하여 자동 아미노산 분석을 한 결과, 표 5에 나타내어지는 주성분이 표 5에 나타내어지는 수량으로 얻어졌다.

상기 제 3 액 성분에, 에탄올 농도가 50용량%가 되도록 에탄올을, 첨가하고, 첨가 혼합에 의해 생기는 침전물을 고액 분리하여 침전물과 액 성분(제 4 액 성분이라고 칭한다.)을 채취했다. 그 침전물을, 실시예 1에 있어서의 것과 동일하게 하여 자동 아미노산 분석을 한 결과, 표 5에 나타내어지는 주성분이 표 5에 나타내어지는 수량으로 얻어졌다.

상기 제 4 액 성분에, 에탄올 농도가 60용량%가 되도록 에탄올을, 첨가하고, 첨가 혼합에 의해 생기는 침전물을 고액 분리하여 침전물과 액 성분(제 5 액 성분이라고 칭한다.)을 채취했다. 그 침전물을, 실시예 1에 있어서의 것과 동일하게 하여 자동 아미노산 분석을 한 결과, 표 5에 나타내어지는 주성분이 표 5에 나타내어지는 수량으로 얻어졌다.

상기 제 5 액 성분에, 에탄올 농도가 70용량%가 되도록 에탄올을, 첨가하고, 첨가 혼합에 의해 생기는 침전물을 고액 분리하여 침전물과 액 성분(제 6 액 성분이라고 칭한다.)을 채취했다. 그 침전물을, 실시예 1에 있어서의 것과 동일하게 하여 자동 아미노산 분석을 한 결과, 표 5에 나타내어지는 주성분이 표 5에 나타내어지는 수량으로 얻어졌다.

또, 에탄올 대신에 프로판올을 이용하여 상기와 동일한 시험을 하면 표 5에 나타내는 것과 동일한 경향을 나타내는 결과가 얻어졌다.

[산업상의 이용 가능성]

이 발명에 의하면, 해파리로부터 뮤신 및 콜라겐을 효율적으로 분별 추출할 수 있는 분별 추출 방법을 제공할 수 있다. 이 발명의 방법에 의해 얻어지는 뮤신 및 콜라겐은, 의약품, 화장품, 식품, 농업 등의 분야에 있어서 유용하다. 또, 뮤신 및 콜라겐은 시약의 원료 및 제품으로 할 수 있다.

Claims

해파리를 파쇄하여 이루어지는 함수 파쇄물을 고액 분리하여 얻어지는 액 성분과 탄소수 1∼4의 수용성 알코올을, 탄소수 1∼4의 수용성 알코올의 농도가 전체에 대하여 60용량%~80용량%가 되도록, 혼합하여 얻어지는 혼합물을 고액 분리함으로써 고형분을 얻는 단백질 분리 공정(A)과,
상기 단백질 분리 공정(A)에서 얻어지는 고형분과 10∼40질량%의 알코올 농도인 탄소수 1∼4의 수용성 알코올 수용액을 혼합하고, 이어서 고액 분리함으로써 뮤신 함유 액 성분과 콜라겐 함유 고형 성분으로 고액 분획하는 분획 공정(B)을 갖는 것을 특징으로 하고,
상기의 탄소수 1~4의 수용성 알코올이 에탄올 또는 이소프로필알코올인 뮤신 및 콜라겐의 분별 추출 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 단백질 분리 공정(A)에 있어서의 고액 분리에 의해 얻어지는 고형분을 탄소수 1∼4의 수용성 알코올 및 물 중 하나 이상으로 세정하여 이루어지는 세정 고형분을, 상기 단백질 분리 공정(A)에서 얻어지는 고형분으로 하여, 상기 분획 공정(B)에 제공하는 것을 특징으로 하고,
상기의 탄소수 1~4의 수용성 알코올이 에탄올 또는 이소프로필알코올인 뮤신 및 콜라겐의 분별 추출 방법.
제 2 항에 있어서,
상기 탄소수 1∼4의 수용성 알코올 및 물 중 하나 이상이, 상기 단백질 분리 공정(A)에 있어서의 고액 분리에 의해 얻어지는 고형분의 질량에 대하여 1∼4배 질량의 비율로, 상기 고형분과 혼합되는 것을 특징으로 하는 뮤신 및 콜라겐의 분별 추출 방법.