KR102065355B1 - 단백질 제조물 내의 응집체 양 감소를 위한 혼합 다관능 표면들의 사용 방법 - Google Patents
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Abstract
유기 다가 양이온(예를 들면, 에타크리딘, 클로르헥시딘, 또는 폴리에틸렌이민)으로의 처리, 및 음전하 화학 잔기를 보유한 표면들 및 양전하 화학 잔기들을 보유한 표면들의 조합을 갖는 조성물로의 처리 단계를 포함하는 항체 및 다른 단백질 제조물 내의 응집체 레벨을 감소시키는 방법이 제공된다.
Description
본 발명은 특히 항체와 같은 단백질 정제를 위한 물질에 관한 것이다. 이는 특히, 단백질 응집체들의 양을 감소시키기 위한 물질과 관련된다. 본 발명은 또한 이러한 능력들과 단백질의 최종 정제물의 원하는 레벨을 획득하기 위한 다른 정제 방법들과의 통합과 관련된다.
호스트-세포 유도 오염물 및 인-비트로 세포 배양 방법에 의해 생산된 재조합 단백질들 사이에서 비천연 헤테로-회합체가 자발적으로 형성됨이 지적되어왔다(Shukla et al., Biotechnol. Progr. (2008) 24:1115-1121; Luhrs et al., J. Chromatogr. B (2009) 877:1543-1552; Mechetner et al., J. Chromatogr. B (2011) 879:2583-2594; Gagnon et al., J. Chromatogr. A, (2011) 1218:2405-2412; Gagnon, Bioprocessing J. (2010) 9(4):14-24). 이러한 헤테로-회합체들은 두가지 측면에서 비천연적인 것으로 간주될 수 있다: 1) 오염물 성분들(constituent contaminants)은 살아있는 비-인간 호스트 세포들에 의해 분비되거나 비-인간 호스트 세포들이 용해사멸될 때 배양 배지 내부로 방출되는 것과 같이 자주 비-인간 유래의 것이다. 살아있는 인간에 있어서, 이러한 비-인간 오염물들은 존재하지 않는다. 2) 오염물 성분들은 죽은 세포 성분들이 빠르게 제거되는 인간 인-비보 시스템과 달리 고농도로 축적된다. 이에 따라, 재조합 생성물들은 일반적으로 생체 시스템에서는 일어나지 않는 농도에서 강하게 상호작용 가능한 오염물들의 높은 레벨에 노출된다. 반면, 재조합 단백질들의 고발현 레벨은 이들을 이러한 비-인간 오염물들과의 비특이적 결합을 위한 적절한 기질로 만들며, 다양한 조성물의 원하지 않는 헤테로-회합체의 형성을 유발한다.
헤테로-응집체들의 오염 단백질 성분은 상기 오염 단백질의 직접 타겟팅(Shukla et al. 및 Gagnon et al. supra) 및 상기 오염 단백질의 원인이 되는 대응 DNA 성분의 타겟팅을 통한 간접적 방법(Luhrs et al. 및 Gagnon supra)을 통해 어느 정도 해결되어 왔다. 항체 응집체의 감소는 일부 복합체들이 분리될 때 나타났다(Shukla et al., Mechetner et al., 및 Gagnon supra). 음이온 교환기의 항체-오염물 복합체를 감소시키는 능력은 개시되어왔으나(Luhrs et al. 및 Gagnon et al., supra), 헤테로-응집체들을 완전히 제거가능한 음이온 교환 처리 방법은 보고되지 않았다. 크기 배제(size exclusion), 양이온 교환, 및 소수성 상호작용 크로마토그래피들이 헤테로-응집체를 감소시키기 위해 채용되어 왔으나, 이러한 기술들은 일반적으로 음이온 교환에 비해 열등하다(Gagnon et al., supra).
항체와 안정적인 회합을 형성하는 오염물들의 특정한 소스에 대해서는 알려져 있지 않다(예를 들면, Shukla et al. supra 참조). 일부 노력들이 다른 가능한 오염물들의 특정 소스에 대한 큰 주의 없이 DNA 오염물들에 집중되어 왔다(Gagnon et al. 및 Gagnon supra). 항체 제조물 내의 응집체들을 갖는 호스트 오염물들의 회합을 제시하는 일부 노력들은 특히 크로마틴 카타볼라이트(chromatin catabolite)를 포함하는 오염물들에 집중되었다(Luhrs et al. and Mechetner et al. supra). 이러한 예들에서, 회합(association)은 히스톤 및 DNA와 같은 크로마틴 카타볼라이트들에 대한 항체의 면역특이성을 통해 직접적으로 중재될 수 있다. 크로마틴 카타볼라이트들은 또한 비특이적 상호작용을 통해 항체들과 안정적인 복합체를 형성할 수 있음이 제시되어왔다. 따라서, 크로마틴 카타볼라이트들을 포함하지 않는 항원에 대한 공지된 면역특이성을 갖는 모노클로날 항체들은 죽은 호스트 세포들의 핵으로부터 유래하는 뉴클레오좀, 히스톤 및 DNA의 다양한 종류들의 고도로 안정적인 응집체를 형성할 수 있다. 특히, 크로마틴 카타볼라이트들은 고분자량(HMW) 응집체 내에서 고도로 나타나는 것으로 밝혀졌다. HMW 응집체들은 이들의 치료-중화(therapy-neutralizing) 항체 형성 증진에의 관여 가능성 때문에 특별한 관심 대상이다. HMW 응집체들은 일반적으로 관심대상 항체의 작은 배수체보다 큰 사이즈의 응집체로 정의된다. 예를 들면, 2-항체 회합체는 HMW 응집체로 간주되지 않으며, 4-항체 응집체도 마찬가지다. 그러나, 약 8 내지 10 또는 그 이상의 항체들의 대응물과 같은 보다 큰 사이즈의 응집체들은 HMW 응집체들로 분류될 수 있다.
헤테로-응집체들을 분리시킬 수 있는 것으로 기대되는 제제로 항체 제조물을 처리하는 방법은 일반적으로 비효과적인 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 고농도의 우레아, 염, 또는 이들의 조합의 사용은 실질적으로 IgM-오염물 헤테로-응집체들을 분리시키지 못한다(Gagnon et al., supra). 단백질 G 친화도 크로마토그래피와 함께 우레아, 염 및 EDTA를 결합하는 예비-용출 세척(Mechetner et al., supra)과 유사하게, 우레아, 알코올 및 계면활성제의 예비-용출(pre-eleution) 세척을 포함하는 단백질 A 친화도 크로마토그래피는 세척이 없는 것보다 효과적으로 헤테로-응집체 레벨을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Shukla et al., supra). 우레아의 예비-용출 세척을 포함한 음이온 교환 크로마토그래피는 우레아 세척이 없는 것보다 효과적으로 헤테로-응집체들을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Gagnon et al., supra). 양이온 교환 크로마토그래피 역시 세척이 없는 것보다 예비-용출 EDTA 세척을 포함하는 것이 보다 효과적으로 헤테로-응집체들을 감소시키는 것으로 밝혀졌다(Gagnon et al., supra). 마지막으로, 우레아 및/또는 염의 예비-용출 세척을 포함한 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 또한 그러한 세척이 없는 것보다 효과적으로 헤테로-응집체들을 감소시켰다(Gagnon, supra). 이러한 관찰에도 불구하고, 일반적으로, 크로마토그래피 칼럼에 결합된 항체들의 예비-용출 세척에 있어서 분리 제제의 사용은 단지 미약한 성공만을 보여주었다.
유기 다가(multivalent) 양이온은 DNA 및 내독소(endotoxin)의 침전(Glynn supra; Cordes et al., Biotechnol. Progr., (1990) 6:283-285; Dissing et al., Bioseparation, (1999) 7 221:9-11) 및 바이러스의 불활성화(Bernhardt, U.S. Patent. 5,559,250) 뿐만 아니라 산성 단백질의 침전(Farhner et al., U.S. 특허출원 제2008-0193981호; Ma et al., J. Chromatogr. B (2010) 878:798-806; Peram et al., Biotechnol. Progr., (2010) 26:1322-1326; Glynn, in U. Gottschalk (ed.), Process Scale Purification of Antibodies, J. T. Wiley and Sons, (2009) Hoboken, 309-324)을 위해 제시되어왔다. 다가 금속 양이온 또한 일부 단백질 제조물로부터 DNA 및 내독소를 제거하는 것으로 제시되어왔다(Akcasu et al., Nature, (1960) 187:323-324; Matsuzawa et al., Nucl. Acids Res., (2003) 3(3):163-164; Christensen et al., Prot. Expr. Purif., (2004) 37:468-471; Kejnovsky et al., Nucl. Acids Res., (1997) 25:1870-1871; Ongkudon et al., Anal. Chem., (2011) 83 391:13-17).
본 발명은 단백질 제조물 내의 응집체 양 감소를 위한 방법을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 원하는 단백질을 함유하는 단백질 제조물과 같은 샘플의 응집체 양을 감소시키기 위한 방법을 제공한다; 일부 방법은 하기의 단계들을 포함한다: (i) 음전하 표면을 갖는 제1 고체 기질인 제1 성분을 제공하는 단계: (ii) 양전하 표면을 갖는 제2 고체 기질인 제2 성분을 제공하는 단계; (iii) 샘플을 상기 제1 및 제2 성분들과 접촉시키는 단계, 상기 제1 및 제2 성분들은 상기 샘플이 실질적으로 원하는 단백질이 상기 제1 또는 제2 성분에 결합됨을 방지하는 동작 조건 하에서 두 성분들과 동시에 접촉할 수 있다; 그리고 (iv) 감소된 응집체 양을 갖는 상기 원하는 단백질을 함유하는 수득된 샘플을 상기 제1 및 제2 성분들로부터 분리시키는 단계.
도 1은 알란토인-에타크리딘(allantoin-ethacridine) 배치(batch) 입자 처리에 노출된 IgM-529의 정제물 내에 지시된 간격으로 샘플된 크기 교환 크로마토그래피(size exchange chromatography: SEC) 프로파일의 시간 코스 플롯(time course plot)을 도시하고 있다(Aggr: 응집체(aggregate), HCP: 호스트 세포 단백질(host cell protein). 실선: 280 nm. 파선: 254 nm. 모든 시간 스케일은 중앙 패널과 동일).
도 2a는 IgM-84 여과된 세포 배양 상청액(cell culture supernatant (CCS))의 SEC 프로파일을 도시하고 있다(Aggr: 응집체. HMW: 고분자량 응집체(high molecular weight aggregates). HCP: 호스트 세포 단백질. LMW: 저분자량 세포 배양 배지 성분들. 실선 Solid line: 280 nm. 파선: 254 nm).
도 2b는 알란토인-에타크리딘 및 칼럼 플로우 통과 처리 후의 도 2a의 IgM-84 여과된 CCS의 SEC 프로파일을 도시하고 있다(Aggr: 응집체. HCP: 호스트 세포 단백질. 실선: 280 nm. 파선: 254 nm).
도 3은 알란토인-에타크리딘 및 칼럼 플로우 통과 처리 전(왼쪽 패널) 및 처리 후(오른쪽 패널)의 모노클로날 IgG HER2 CCS의 SEC 프로파일을 도시하고 있다(Aggr: 응집체. HCP: 호스트 세포 단백질. LMW: 저분자량 세포 배양 배치 성분들. LC: 경쇄(light chain). 실선: 280 nm. 파선: 254 nm).
도 2a는 IgM-84 여과된 세포 배양 상청액(cell culture supernatant (CCS))의 SEC 프로파일을 도시하고 있다(Aggr: 응집체. HMW: 고분자량 응집체(high molecular weight aggregates). HCP: 호스트 세포 단백질. LMW: 저분자량 세포 배양 배지 성분들. 실선 Solid line: 280 nm. 파선: 254 nm).
도 2b는 알란토인-에타크리딘 및 칼럼 플로우 통과 처리 후의 도 2a의 IgM-84 여과된 CCS의 SEC 프로파일을 도시하고 있다(Aggr: 응집체. HCP: 호스트 세포 단백질. 실선: 280 nm. 파선: 254 nm).
도 3은 알란토인-에타크리딘 및 칼럼 플로우 통과 처리 전(왼쪽 패널) 및 처리 후(오른쪽 패널)의 모노클로날 IgG HER2 CCS의 SEC 프로파일을 도시하고 있다(Aggr: 응집체. HCP: 호스트 세포 단백질. LMW: 저분자량 세포 배양 배치 성분들. LC: 경쇄(light chain). 실선: 280 nm. 파선: 254 nm).
본 발명의 일부 실시예들에 있어서, 고체 물질과 음전하 표면 및 고체 물질과 양전하 표면의 조합을 포함하는 물질 조성물이 음이온 교환기 혹은 양이온 교환기에 단독으로 의존하는 물질보다 단백질 제조물 내의 고분자량(high molecular weight: HMW) 응집체 및 헤테로-응집체의 함량을 보다 효과적으로 감소시킬 수 있음이 놀랍게도 발견되었다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 조성물은 특히 뉴클레오좀, 및/또는 히스톤 및/또는 DNA와 같은 크로마틴 잔여물을 포함하는 응집체의 함량을 감소시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 단백질 제조물에 첨가된 다가 이온 및 항바이러스 화합물과 같은 제제들을 제거하는 추가적인 능력을 갖는다.
본 발명의 일부 실시예들에 있어서, 단백질 제조물 내의 응집체 레벨은 혼합 화학 성질의 용해성 다가 양이온 제조물로의 첨가 및 이어서 불용성 입자들 또는 혼합 화학 성질의 다른 기질들의 첨가에 의해 큰 폭으로 감소할 수 있음이 놀랍게도 발견되었다. 실험 결과에 의하면, 이러한 처리는 염 및/또는 카오트로프(chaotropes)로의 액상 처리, 단일-메커니즘 고상 방법들, 또는 고상 방법과 의도된 응집체-분리 세척의 조합보다 고분자량(HMW) 응집체 함량의 급격한 감소 및 헤테로-응집체의 분리를 허용한다. 이러한 접근법의 가치있는 이점은 용해성 제제가 그 자체로 단백질 제조물로부터 제거되어 실질적으로 응집체-프리(aggregate-free) 단백질 제조물을 생성하며, 또한 실질적으로 다가 양이온이 제거된다는 것이다. 이는 놀랍게도 상기 다가 양이온 및 불용성 입자들이 각각 약 0.02 내지 약 0.025%, 및 약 2 내지 약 5%와 같은 극도로 작은 양으로 존재할 때에도 1시간 이하의 시간 내에 발생할 수 있다. 실험적 증거는 추가적으로 본 발명의 일부 실시예들에 있어서, 유기 다가 양이온에 선행한 샘플 처리가 음전하 및 양전하 입자들의 조합에 의해 수득된 결과들을 향상시킴을 보여준다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 특히 항체, Factor VIII와 같은 응고 인자, 및 재조합 단백질을 포함하는 재조합 단백질 제조물의 응집체 양을 감소시키는 방법을 제공한다. 어느 특정한 이론에 한정됨이 없이, 응집체들은 외부 물질과의 상호작용에 의해 안정화됨이 예상치 못하게 발견되었다. 항체 제조물을 항체보다 외부 물질에 대해 높은 친화도를 갖는 다관능(multifunctional) 표면들에 접촉시키는 것은 상기 외부 물질을 분리시키는 효과를 가지며, 이어서 이는 이들이 결합된 상가 다관능 표면들의 간단한 제거에 의해 제거될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 응집체 레벨은 실질적으로 감속되며, 때때로 항체 회수는 존재하는 것으로 추정되는 양을 넘어서 증가될 수 있고, 이는 본 방법의 응집체를 분리하고 정제가능한 생성물 군집으로 분리된 항체를 보존하는 능력을 제시한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 방법은 또한 오염물과 단일 항체들의 복합체를 분리시킬 수 있다. 낮은 응집체 개체 수를 갖는 항체를 생성하는 것에 추가되어, 처리된 항체는 낮은 호스트 단백질, DNA, 내독소(endotoxin), 및 바이러스 오염을 나타낼 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 방법들은 원하는 항체를 함유한 샘플을 적어도 2 종류의 표면들에 동시에 접촉하는 것을 포함하며, 하나는 지배적으로 음전하, 다른 하나는 지배적으로 양전하이다. 하나의 표면은 추가적인 화학적 관능성을 포함할 수 있다. 추가적인 화학적 관능성은 소수성, pi-pi 결합, 수소 결합, 또는 금속 친화 관능성 등을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기의 음전하 표면 및 양전하 표면은 다른 활용도를 제공할 수 있으며, 이는 명확히 이들이 다른 외부 물질 서브셋들과 개별적으로 상호작용하는 것을 선호함을 제시한다. 일부 실시예들의 이러한 특징은 상기 음전하 표면 및 양전하 표면들이 개별적으로보다 함께 적용되었을 때 보다 효과적이라는 관찰로부터 증명된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 표면들은 단백질 제조물 내에 분산된 다공성 혹은 비-기공성 입자들을 포함하거나, 칼럼 내에 충진되거나, 개별적으로 분산되어 칼럼 내에 충진될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 응집체 제거는 샘플을 용해성 유기 다가 양이온들과 단독으로 혹은 다른 제제들과 조합하여 예비 처리함으로서 향상될 수 있으며, 이러한 경우 본 방법은 상기 유기 다가 양이온들 및 잠재적인 다른 제제들을 제거하는 추가적인 용도를 갖는다. 본 방법의 유용성은 단독 혹은 다가 양이온들의 존재하에 항바이러스 제제의 포함에 의해 향상될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 원하는 단백질을 함유하는 단백질 제조물로서의 샘플의 응집체 함량을 감소시키는 방법을 제공한다; 일부 방법들은 하디의 단계들을 포함한다: (i) 음전하 표면을 갖는 제1 고체 기질인 제1 성분을 제공하는 단계: (ii) 양전하 표면을 갖는 제2 고체 기질인 제2 성분을 제공하는 단계; (iii) 샘플을 상기 제1 및 제2 성분들에 접촉시키는 단계, 상기 제1 및 제2 성분들은 상기 샘플이 실질적으로 원하는 단백질이 상기 제1 및 제2 성분에 결합하는 것을 방지하는 동작 조건하에서 두 성분들에 동시에 접촉하도록 구성된다; 및 (iv) 감소된 응집체 함량으로 상기 원하는 단백질을 함유하는 수득된 샘플을 상기 제1 및 제2 성분들로부터 분리시키는 단계.
일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들은 상기 샘플에 접촉시키는 단계 이전에 결합된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들은 하전 혹은 비하전된 화학 표면들을 함유하며, 상기 샘플의 다른 성분들과 수소 결합, 소수성 상호작용, 금속 친화성 혹은 다른 분자간 상호작용에 참여할 수 있는 추가적인 화학 잔기들을 보유하는 추가적인 성분들과 결합될 수 있다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 음전하 표면을 갖는 상기 제1 기질에 접촉시키기 전에 혼합 화학 성질의 가용성 유기 다가 양이온과 접촉된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들과 접촉시키기 전에 적절한 시간 동안 혼합 화학 성질의 상기 가용성 유기 다가 양이온과 배양된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 적절한 시간 동안 상기 제1 및 제2 성분들과 배양될 수 있다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질을 갖는 상기 유기 다가 양이온은 상기 제1 및 제2 성분들로부터 감소된 응집체 함량의 상기 샘플을 분리시키는 단계에서 상기 샘플로부터 제거된다. 일부 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질을 갖는 유기 다가 양이온은 상기 제1 및 제2 성분들로부터 감소된 응집체 함량의 상기 샘플을 분리시키는 단계에서 혼합 화학 성질을 갖는 상기 유기 다가 양이온이 상기 제1 혹은 제2 성분의 기질 또는 상기 제1 및 제2 성분 외의 추가적인 성분과 회합되는 정도로 상기 샘플로부터 제거된다. 제3 성분이 상기 샘플과 접촉하는 상기 제1 및 제2 성분들과 결합된다. 예를 들면, 상기 제3 성분은 소수성 관능성을 보유하는 물질일 수 있다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 기질은 미립자이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제2 기질은 미립자이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 미립자 기질 혹은 기질은 각각 복수의 입자들로 제공된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 제2 기질 혹은 양자의 미립자들은 비-기공성이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 제2 기질 혹은 양자의 미립자들은 다공성이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 다공성 입자의 기공 사이즈는 단백질 제조물 내의 단백질의 진입을 허용할 수 있을 만큼 충분히 크다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 다공성 입자의 기공 사이즈는 단백질 제조물 내의 단백질의 진입을 허용하기에는 지나치게 작다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 다공성 입자의 평균 기공 사이즈는 약 10nm 및 100nm 사이이다,
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 다공성 멤브레인 혹은 모놀리스(monolith) 사이에 샌드위치된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 부직포 혹은 비정질 섬유 필터 사이에 샌드위치된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 결정 프릿(frits) 사이에 샌드위치된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 망상의 고분자 네트워크 내에 내장된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 및/또는 다른 성분들/기질들은 비-미립자이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 및/또는 제2 성분의 고체 기질은 독립적으로 섬유, 중공 섬유(hollow-fiber), 멤브레인 또는 모놀리스이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 동작 조건은 상기 제1 및 제2 성분들로의 원하는 단백질의 결합을 실질적으로 방지하는 성질이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 동작 조건은 추가적으로 상기 제1 또는 제2 성분들 중 하나, 또는 다른 기질들과의 상호작용을 통해 원하는 단백질의 실질적 손실을 방지한다. 이러한 조건들은 상기 원하는 단백질과 제1 및 제2 성분들 사이의 강한 전하 상호작용을 유지하기에 충분히 높은 전도도 값을 포함한다. 이러한 조건은 또한 상기 원하는 단백질 및 다가 양이온 혹은 입자들 사이의 강한 전하 상호작용을 유지할 수 있다. 이러한 동작 조건은 상기 제1 및 제2 성분들에 부가하여 상기 샘플을 접촉하는 다른 첨가물의 존재를 포함하여 상기 원하는 단백질 및 상기 제1 혹은 제2 성분들 사이의 다른 타입의 화학적 상호작용을 조절한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 혼합 화학 성질의 가용성 유기 다가 양이온을 접촉시키는 동안 상기 샘플로부터 원하는 단백질의 침전을 실질적으로 방지하기에 충분히 높은 레벨이다.
일 이상의 실시예들에 있어서, 본 발명의 방법들은 전도도로 측정되는 바와 같은 고 염 농도를 허용하는 능력을 보인다. 예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 샘플은 약 15 mS/cm의 전도도를 갖는 용리액으로 정제될 수 있다. 일 이상의 실시예들에 있어서, 전도도는 적어도 13 mS/cm일 수 있다. 일부 실시예들에 있어서 전도도는 염농도가 원하는 단백질이 상기 제1 및 제2 성분들에 결합되는 것을 방지하기에 충분한 조건으로 일부 단백질에 대해 낮을 수 있다. 따라서, 일부 실시예들에 있어서, 전도도는 약 5 내지 약 10 mS/cm일 수 있다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 20 mS/cm 보다 크다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 30 mS/cm 보다 크다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 40 mS/cm 보다 크다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 100 mS/cm 보다 크다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 혼합 화학 성질의 가용성 유기 다가 양이온을 접촉시키는 동안 상기 샘플로부터 원하는 단백질의 침전을 실질적으로 방지하기 위해 충분한 전도도보다 적어도 5%, 10%, 20%, 50%, 100% 혹은 200% 더 높다. 상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 상기 원하는 단백질이 상기 제1 또는 제2 성분들과 결합을 실질적으로 방지하기에 충분한 전도도보다 적어도 5%, 10%, 20%, 50%, 100% 혹은 200% 더 높다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 응집체는 원하는 단백질의 호모-응집체를 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질의 호모-응집체의 존재는 실질적으로 제거된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 응집체는 상기 원하는 단백질 및 오염물의 헤테로-응집체를 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 헤테로-응집체는 상기 원하는 단백질과 실질적으로 동일한 하이드로다이나믹 크기를 갖는다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 오염물은 핵산, 뉴클레오티드, 내독소, 금속 이온, 단백질, 지질 또는 세포 배양 배지 성분일 수 있다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질 및 오염물의 헤테로-응집체의 존재는 실질적으로 제거된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 항체 혹은 항체 절편 또는 항체 혹은 항체 절편의 콘쥬게이트이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 항체는 IgG, IgM, IgD, IgE, 또는 IgA이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 항체 절편은 Fc-융합 단백질 또는 면역콘쥬게이트(immunoconjugate)이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 재조합 단백질이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 응고 인자(clotting factor)이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 응고 인자는 Factor VIII이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 성장 호르몬이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 성장 호르몬은 인간 성장 호르몬이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 세포 배양 수확물, 세포 배양 상청액, 세포 배양으로부터 유래된 항체-함유 용액, 또는 단백질 정제의 이전 단계로부터 항체-함유 용액이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 배양된 세포는 포유류 세포이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 배양된 세포는 박테리아 세포이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 배양된 세포는 이스트 세포이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 단백질 정제의 이전 단계로부터의 항체-함유 용액이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용리액이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 미정제, 중간 레벨의 정제 또는 고도 정제될 수 있다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들을 통해 제조물을 플로잉(flowing)함으로써 상기 제1 및 제2 성분들과 접촉된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 성분 표면의 음전하성은 일 이상의 화학적 관능성을 포함하는 일 이상의 복합 화학 잔기들을 통해, 또는 표면 상에 혼합된 단순한, 복합의 화학 그룹들의 조합을 통해, 또는 상이한 화학 조성물의 표면의 조합을 통해 부여된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 성분의 표면의 음전하성은 부분적으로 이미노디아세틱 산(iminodiacetic acid), 에틸렌 글리콜(아미노에틸에테르)디아세틱 산, 니트릴로아세틱 산, 아스파르트 산, 글루탐산, 카르복실산, 아황산, 설포네이트, 및 인산으로 구성된 그룹으로부터의 잔기에 의해 부분적으로 부여된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제2 성분 표면의 양전하성은 일 이상의 화학적 관능성을 포함하는 일종 이상의 복합 화학 그룹들을 통해, 또는 표면 상에 혼합된 간단한 복합 화학 그룹들의 조합을 통해, 또는 상이한 화학 조성물의 표면들의 조합을 통해 수여된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 추가적인 고체 성분들/기질들의 표면들은 추가적인 양전하성 및/또는 음전하성 및/또는 비전하 화학 그룹들을 보유하여 수소 결합, 소수성 상호작용, 금속 친화성 또는 다른 화학적 상호작용에 참여할 수 있다. 특정 실시예들에 있어서, 금속 친화성은 금속 이온, 0가 금속 또는 이들의 조합에 대한 친화성을 포함할 수 있다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제2 성분의 표면의 양전하성은 부분적으로 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜트아민, 폴리프로필렌이민 테트라아민, PAMAM 덴드리머(에틸렌디아민 코어), 데페록사민(deferoxamine), 1차 아미노 그룹, 2차 아미노 그룹, 3차 아미노 그룹, 4차 아미노 그룹 및 이들의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된 잔기에 의해 부분적으로 부여될 수 있다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 성분 표면의 음전하성은 이미노디아세틱 산에 의해 부분적으로 부여되며, 상기 제2 성분 표면의 양전하성은 트리스(2-아미노에틸)아민에 의해 부분적으로 부여된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 성분은 금속 친화성 관능성을 보유한 표면-결합 화학 잔기를 갖는다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제2 성분의 양전하 표면은 금속 친화성 관능성을 보유한 표면-결합 화학 잔기를 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 기질은 금속 친화성 관능성을 보유한 표면-결합 화학 잔기에 추가하여 일 이상의 화학 잔기들을 가지며, 이러한 추가적 화학 잔기들은 일 이상의 성분들의 단백질 제조물의 단백질과의 수소 결합, 소수성 상호작용, 또는 pi-pi 결합에 참여하는 능력을 향상시킨다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 금속 친화성 관능성을 보유한 상기 표면-결합 화학 잔기는 멀티덴데이트(multidentate) 금속 킬레이트 잔기이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 유기 다가 양이온은 에타크리딘(ethacridine), 9-아미노아크리딘(아미나크린(aminacrine)), 3,6 아크리딘디아민(프로플라빈(proflavin)), 아크리소르신(acrisorcin), 아크리잔(페나크리단(phenacridane)), 아크리딘 오렌지, 퀴나크린(quinacrine), 아크리사이드(acricide), 아크리돈(acridone), 아크리딘-9-카르복실산, 아크라닐(1-[(6-클로로-2-메톡시-9-아크리디닐)아미노]-3-(디에틸아미노)-2-프로판올 디하이드로클로라이드), 페노사프라닌(phenosafranin), 페녹사진(phenoxazine), 페노티아진(phenothiazine), 아크리플라빈 (3,6-디아미노-10-메틸아크리디늄, 클로라이드 및 3,6-아크리딘이디아민), 폴리에틸렌이민, 클로르헥시딘(chlorhexidine), 및 폴리-아미노산으로 구성된 그룹에서 선택된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 에타크리딘, 폴리에틸렌이민 혹은 클로르헥시딘 또는 이의 염이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 에타크리딘 혹은 이의 염이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 약 0.01% 및 약 0.05% 사이의 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 약 0.01% 미만의 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 약 0.005% 미만의 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 약 0.001% 미만의 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 약 0.020 및 약 0.025% 사이의 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에, 폴리에틸렌이민, 폴리알릴아민, 에타크리딘, 및 클로르헥시딘 및 이의 염들로 구성된 그룹으로부터의 일 이상의 유기 다가 양이온으로 처리된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 1% 미만 혹은 0.1% 미만의 농도로 제공된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 약 0.01% 및 약 0.05% 사이의 농도로 제공된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 약 0.01% 미만의 농도로 제공된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 약 0.005% 미만의 농도로 제공된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 약 0.001% 미만의 농도로 제공된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 약 0.020 및 약 0.025% 사이의 농도로 제공된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에, 비이온성 유기 고분자, 유기 용매, 계면활성제 및 우레이드(ureides)로 구성된 그룹으로부터 선택된 가용성 유기 조절제와 추가적으로 접촉된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에, 추가적으로 항바이러스 제제와 접촉될 수 있다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 비-다가(non-multivalent) 유기 양이온이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 메틸렌 블루 및 트리(n-부틸) 포스페이트로 구성된 그룹에서 선택된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 약 1% (w/v)미만의 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 약 0.1% (w/v) 미만의 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 약 0.01% (w/v) 미만의 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 약 0.001% (w/v) 미만의 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 본 방법은 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에, 상기 샘플을 단백질 제조물 내에서 과포화되기에 충분한 양의 우레이드와 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플의 고체 혹은 비용해 부분으로부터 원하는 단백질을 함유하는 상청액을 분리시키는 단계를 더 포함한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 우레이드와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 혼합 화학 성질의 가용성 유기 다가 양이온과 접촉시키는 단계 이전에 발생한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 우레이드와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 혼합 화학 성질의 가용성 유기 다가 양이온과 접촉시키는 단계와 실질적으로 동시에 발생한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 우레이드와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 혼합 화학 성질의 가용성 유기 다가 양이온과 접촉시키는 단계 이후에 발생한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 우레이드는 우레아, 요산, 히단토인(hydantoin), 알란토인(allantoin), 알클록사(alcloxa), 알디옥사(aldioxa), 헤모칸(hemocane), 우레이도히단토인(ureidohydantoin), 5-우레이도히단토인, 글리옥실우레이드(glyoxylureide), 글리옥실산 디우레이드, 2,5-디옥소-4-이미다졸리디닐 우레아, 및 퓨린(purines)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 알란토인이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 요산이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 알란토인은 0.5%(w/v) 보다 큰 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 알란토인은 약 1% (w/v) 보다 큰 양 또는 약 2% (w/v) 보다 큰 양 또는 약 5% (w/v) 보다 큰 양 또는 약 10% (w/v) 보다 큰 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 요산은 0.0025% (w/v) 보다 큰 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 요산은 약 0.01% (w/v) 보다 큰 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 요산은 0.1% (w/v) 보다 큰 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 요산은 1% (w/v) 보다 큰 양으로 존재한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 유기 조절제와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 혼합 화학 성질의 가용성 유기 다가 양이온과 접촉시키는 단계 이전에 발생한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 유기 조절제와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 혼합 화학 성질의 가용성 유기 다가 양이온과 접촉시키는 단계와 실질적으로 동시에 발생한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 유기 조절제와 접촉시키는 단계는 상기 샘플을 혼합 화학 성질의 가용성 유기 다가 양이온과 접촉시키는 단계 이후에 발생한다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리부틸렌 글리콜로 구성된 그룹에서 선택된 비이온성 유기 고분자이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 유기 고분자는 약 500 D 이하의 평균 분자량을 갖는다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 디메틸설폭사이드, 에탄올, 이소프로판올 및 페녹시에탄올로 구성된 그룹에서 선택된 유기 용매이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 약 1% (w/v) 이상의 농도로 제공된다. 상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 에탄올 혹은 이소프로판올이며, 상기 유기 조절제는 약 1% (w/v) 이하의 농도로 제공된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 Tween, triton, CHAPS, CHAPSO 및 옥틸 글루코시드(octyl glucoside)로 구성된 그룹에서 선택된 계면활성제이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 약 1% (w/v) 이하의 농도로 제공된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 약 0.1% (w/v) 이하의 농도로 제공된다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 부포화(subsaturating) 양으로 제공되는 우레이드이다.
상술한 일 이상의 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 우레아, 히단토인, 및 알란토인으로 구성된 그룹에서 선택된다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상술한 임의의 실시예들의 방법 수행에 용이한 키트(kit)를 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 원하는 단백질을 함유하는 샘플의 응집체 양을 감소시키는 방법을 제공한다; 일부 방법들은 하기의 단계들을 포함한다: (i) 음전하 표면을 갖는 제1 기질인 제1 성분을 제공하는 단계; (ii) 양전하 표면을 갖는 제2 기질인 제2 성분을 제공하는 단계; (iii) 샘플을 상기 제1 및 제2 성분들에 접촉시키는 단계, 상기 제1 및 제2 성분들은 샘플 내의 적어도 일부의 응집체들이 두 성분들을 동시에 접촉하도록 구성되며; 및 (iv) 상기 제1 및 제2 성분들로부터 감소된 응집체 양의 원하는 단백질을 함유하는 샘플을 분리시키는 단계.
일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플을 상기 제1 및 제2 성분들과 접촉시키는 단계 이전에, 혼합 화학 성질의 유기 다가 양이온이 상기 샘플에 접촉된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들은 단백질 제조물에 접촉되기 전에 결합된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들과 샘플이 접촉되기 전에 적절한 시간 동안 혼합 화학 성질의 유기 다가 양이온과 배양된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 적절한 시간 동안 상기 제1 및 제2 성분들과 배양된다. 일부 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질을 갖는 상기 유기 다가 양이온은 상기 제1 및 제2 성분들로부터 감소된 응집체 함량의 상기 샘플을 분리시키는 단계에서 혼합 화학 성질을 갖는 상기 유기 다가 양이온이 상기 제1 혹은 제2 성분의 기질과 회합되는 정도로 상기 샘플로부터 제거된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 기질은 미립자이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제2 기질은 미립자이다. 상기 미립자 기질 또는 기질들은 각각 복수의 입자들로 제공될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 기질 및 상기 제2 기질의 입자들의 어느 하나 혹은 양자는 비-기공성 혹은 다공성일 수 있다. 이러한 다공성 입자들은 단백질 제조물 내의 단백질 진입을 허용할 정도로 크거나, 단백질 제조물 내의 단백질 진입이 허용되기에 지나치게 작거나, 약 10 nm 내지 약 100 nm의 평균 기공 사이즈를 가질 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 기질들은 입자들이며, 상기 입자들은 다공성 멤브레인 또는 모놀리스 사이에 샌드위치된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 부직포 또는 비정질 섬유 필터 사이에 샌드위치된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 결정 프릿 사이에 샌드위치된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 입자들은 망상 고분자 네트워크 내에 내장된다.
일부 실시예들에 있어서, 샘플의 전도도는 상기 제1 및 제2 기질들에 접촉시키는 동안 상기 샘플로부터 원하는 단백질의 침전을 실질적으로 방지하기에 충분한 높은 레벨이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 20 mS/cm 보다 크다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 30 mS/cm 보다 크거나, 40 mS/cm 보다 크거나, 100 mS/cm 보다 크다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 상기 샘플을 상기 제1 및 제2 성분들과 접촉시키는 단계 이전에, 혼합 화학 성질의 유기 다가 양이온을 접촉시키는 동안 상기 샘플로부터 원하는 단백질의 침전을 실질적으로 방지하기에 충분한 전도도보다 적어도 5%, 10%, 20%, 50%, 100% 또는 200% 높다.
일부 실시예들에 있어서, 응집체는 원하는 단백질의 호모-응집체를 포함한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 원하는 단백질의 호모-응집체의 존재는 실질적으로 제거된다. 일부 실시예들에 있어서, 응집체는 원하는 단백질 및 오염물 또는 복수의 오염물들의 헤테로-응집체를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 헤테로-응집체는 실질적으로 원하는 단백질과 동일한 하이드로다이나믹 크기를 갖는다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 오염물은 핵산, 뉴클레오티드, 내독소, 금속 이온, 단백질, 지질 또는 세포 배양 배지 성분이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질 및 오염물의 헤테로-응집체의 존재는 실질적으로 제거된다. 일부 실시예들에 있어서, 샘플 내의 응집체는 호모-응집체 및 헤테로-응집체 모두를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 원하는 단백질은 항체 혹은 항체 절편이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 세포 배양 수확물, 세포 배양 상청액, 세포 배양으로부터 유래된 항체-함유 용액, 또는 단백질 정제의 이전 단계로부터 항체-함유 용액과 같은 단백질 제조물이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제조물은 단백질 정제의 이전 단계로부터의 항체-함유 용액이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제조물은 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용리액이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 단백질 제조물은 미정제, 중간 레벨의 정제 또는 고도 정제될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 샘플의 상기 중간 레벨의 순도는 약 40% 내지 약 90% 범위의 순도를 가질 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 고순도 레벨은 약 90% 이상일 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 단백질 제조물은 상기 제1 및 제2 성분들을 통해 제조물을 플로잉(flowing)함으로써 상기 제1 및 제2 성분들과 접촉된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 성분 표면의 음전하성은 일 이상의 화학적 관능성을 포함하는 일 이상의 복합 화학 잔기들을 통해, 또는 표면 상에 혼합된 단순한, 복합의 화학 그룹들의 조합을 통해, 또는 상이한 화학 조성물의 표면의 조합을 통해 부여된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 성분의 표면의 음전하성은 부분적으로 이미노디아세틱 산(iminodiacetic acid), 에틸렌 글리콜(아미노에틸에테르)디아세틱 산, 니트릴로아세틱 산, 아스프라트 산, 글루탐산, 카르복실산, 아황산, 설포네이트, 및 인산으로 구성된 그룹으로부터의 잔기에 의해 부분적으로 부여된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제2 성분 표면의 양전하성은 일 이상의 화학적 관능성을 포함하는 일종 이상의 복합 화학 그룹들을 통해, 또는 표면 상에 혼합된 간단한 복합 화학 그룹들의 조합을 통해, 또는 상이한 화학 조성물의 표면들의 조합을 통해 수여된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제2 성분의 표면의 양전하성은 부분적으로 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜트아민, 폴리프로필렌이민 테트라아민, PAMAM 덴드리머(에틸렌디아민 코어), 데페록사민(deferoxamine), 1차 아미노 그룹, 2차 아미노 그룹, 3차 아미노 그룹 및 4차 아미노 그룹으로 구성된 그룹에서 선택된 잔기에 의해 부분적으로 부여된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 성분 표면의 음전하성은 이미노디아세틱 산에 의해 부분적으로 부여되며, 상기 제2 성분 표면의 양전하성은 트리스(2-아미노에틸)아민으로 구성된 그룹으로부터의 잔기에 의해 부분적으로 부여된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 성분은 금속 친화성 관능성을 보유한 표면-결합 화학 잔기를 가지며, 상기 제2 성분은 양전하성 표면을 갖는 제2 기질이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제2 성분은 양전하성 표면을 갖는 제2 기질이며, 상기 양전하성 표면은 금속 친화성 관능성을 보유한 표면-결합 화학 잔기를 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 기질은 금속 친화성 관능성을 보유한 표면-결합 화학 잔기에 추가하여 일 이상의 화학 잔기들을 가지며, 이러한 추가적 화학 잔기들은 일 이상의 성분들의 단백질 제조물의 단백질과의 수소 결합, 소수성 상호작용, 또는 pi-pi 결합에 참여하는 능력을 향상시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 금속 친화성 관능성을 보유한 상기 표면-결합 화학 잔기는 멀티덴데이트(multidentate) 금속 킬레이트 잔기이다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들의 표면에 노출되기 전에 혼합 화학 성질의 유기 다가 양이온으로 처리된다. 이러한 유기 다가 양이온은 에타크리딘, 9-아미노아크리딘(아미나크린), 3,6 아크리딘디아민(프로플라빈), 아크리소르신, 아크리잔(페나크리단), 아크리딘 오렌지, 퀴나크린, 아크리사이드, 아크리돈, 아크리딘-9-카르복실산, 아크라닐(1-[(6-클로로-2-메톡시-9-아크리디닐)아미노]-3-(디에틸아미노)-2-프로판올 디하이드로클로라이드), 페노사프라닌, 페녹사진, 페노티아진, 아크리플라빈 (3,6-디아미노-10-메틸아크리디늄, 클로라이드 및 3,6-아크리딘이디아민), 폴리에틸렌이민, 클로르헥시딘, 또는 폴리-아미노산을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 에타크리딘, 폴리에틸렌이민 혹은 클로르헥시딘 또는 이의 염이다. 일부 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 에타크리딘 혹은 이의 염이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 약 0.01% 및 약 0.05% 사이의 양으로 존재한다. 일부 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 약 0.01% 미만의 양으로 존재한다. 일부 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 약 0.005% 미만의 양으로 존재한다. 일부 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 약 0.001% 미만의 양으로 존재한다. 일부 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 약 0.020 및 약 0.025%의 사이의 양으로 존재한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에, 폴리에틸렌이민, 폴리알릴아민, 에타크리딘, 및 클로르헥시딘 및 이의 염들과 같은 일 이상의 유기 다가 양이온으로 처리된다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 1% 미만의 농도로 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 약 0.01% 및 약 0.05% 사이의 농도, 혹은 약 0.01% 미만의 농도, 또는 약 0.005% 미만의 농도, 또는 약 0.001% 미만의 농도, 또는 약 0.020 및 약 0.025% 사이의 농도로 제공된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에, 비이온성 유기 고분자, 유기 용매, 계면활성제 및 우레이드(ureides)로 구성된 그룹으로부터 선택된 가용성 유기 조절제와 추가적으로 접촉된다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에, 추가적으로 항바이러스 제제와 접촉된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 벤잘코늄 클로라이드, 메틸렌 블루 또는 트리(n-부틸) 포스페이트와 같은 비-다가 유기 양이온이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 약 1% (w/v)미만의 양, 또는 약 0.1% (w/v) 미만의 양, 또는 약 0.01% (w/v) 미만의 양, 또는 약 0.001% (w/v) 미만의 양으로 존재한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 상기 샘플을 단백질 제조물 내에서 과포화되기에 충분한 양의 우레이드와 접촉시키는 단계, 및 상기 단백질 제조물의 부분으로부터 원하는 단백질을 함유한 상청액을 분리시키는 단계의 추가적인 단계들을 제공하며, 이러한 우레이드와 샘플을 접촉시키는 상기의 단계는 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 발생한다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 우레아, 요산, 히단토인, 알란토인, 알클록사, 알디옥사, 헤모칸, 우레이도히단토인, 5-우레이도히단토인, 글리옥실우레이드, 글리옥실산 디우레이드, 2,5-디옥소-4-이미다졸리디닐 우레아, 또는 퓨린이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 알란토인이다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 요산이다. 일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 0.5%(w/v) 보다 큰 양, 또는 약 1% (w/v) 보다 큰 양으로 존재한다. 일부 실시예들에 있어서, 요산은 0.0025% (w/v) 보다 큰 양, 또는 약 0.01% (w/v) 보다 큰 양, 또는 약 0.1% (w/v) 보다 큰 양, 또는 약 1% (w/v) 보다 큰 양으로 존재한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리부틸렌 글리콜로 구성된 그룹으로부터 선택된 비이온성 유기 고분자이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 비이온성 유기 고분자는 약 500 D 이하의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 디메틸설폭사이드, 에탄올 또는 페녹시에탄올과 같은 유기 용매이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 약 1% (w/v) 이상의 농도로 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 Tween, triton, CHAPS, CHAPSO 및 옥틸 글루코시드로 구성된 그룹에서 선택되는 계면활성제이다. 이러한 일부 실시예들에 있어서, 상기 계면활성제는 약 1% (w/v) 이하의 농도, 또는 약 0.1% (w/v) 이하의 농도로 제공된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유기 조절제는 부포화 양으로 제공되는 우레이드이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 우레이드는 우레아, 히단토인 및 알란토인으로 구성된 그룹에서 선택된다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 본 발명의 수행을 위해 필요한 일부 혹은 전부의 물질을, 바람직하게는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 용이한 양 및 농도로 포함하는 본 발명의 방법의 용이한 실행을 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 용이한 이해를 위한 용어의 정의가 제공된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 걸쳐 제공된다.
"응집체(aggregate(s))"는 생리적 조건에서 안정적인 2 이상의 분자들의 회합체를 지칭하며, 넓은 범위의 pH에 및 전도도 조건에서 안정적으로 잔류할 수 있다. 응집체는 자주 단백질, 핵산, 또는 지질 및 다른 분자 혹은 금속 이온과 같은 일 이상의 생분자를 포함한다. 이러한 회합은 임의의 타입의 혹은 임의의 화학적 상호작용의 조합을 통해 유발될 수 있다. 항체들의 응집체는 두 카테고리로 분류될 수 있다: "호모응집체(homoaggregates)"는 2 이상의 항체 분자들의 안정적 회합을 지칭한다; "헤테로-응집체(Hetero-aggregates)"는 일 이상의 항체 분자와 일 이상의 비-항체 분자의 안정적 회합을 지칭한다. 상기의 비-항체 성분은 뉴클레오티드, 내독소, 금속 이온, 단백질, 지질 또는 세포 배양 배지 성분으로 구성된 그룹으로부터의 일 이상의 개체들로 구성될 수 있다.
"항체"는 면역글로불린, 합성물(composite) 또는 이들의 절편 형태를 지칭할 수 있다. 항체는 이에 제한되는 것은 아니나, 천연 또는 인간화, 인간, 단일-사슬, 키메릭, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이, 이식, 및 인 비트로 생성 항체들과 같은 유전적으로 조절된 형태들을 포함하는 인간 혹은 다른 포유류 세포주들로부터의 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM 클래스들의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체들을 포함할 수 있다. "항체"는 또한 이에 제한되는 것은 아니나, 면역글로불린 잔기를 함유하는 융합 단백질을 포함하는 합성물 형태를 포함할 수 있다. "항체"는 또한 항원-결합 기능을 보유하거나 보유하지 않는 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, Fc 및 다른 조성물과 같은 항체 절편들을 포함할 수 있다.
"양전하 표면(Electropositive surface)"은 양성 전하에 의해 지배되는 기질 또는 고체 물질의 표면을 지칭한다. 표면의 양전하성은 이에 제한되는 것은 아니나, 아미노, 에틸렌디아미노, 디에틸아미노에틸, 폴리알릴아민, 폴리에틸렌이민과 같은 약한 음이온 교환 그룹, 4차 아미노 그룹과 같은 강한 음이온 교환 그룹, 폴리리신, 폴리아르기닌 또는 트리스(2-아미노에틸)아민과 같은 약-강 결합된 교환기, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜트아민, 폴리프로필렌트리이민 테트라아민, PAMAM 덴드리머(에틸렌디아민 코어), 데페록사민 또는 이들의 임의의 조합들을 포함하는 화학 그룹들에 의해 부여될 수 있다. 양으로 하전된 표면 상에 혼합 화학 성질을 생성하는 2차 관능성은 음 혹은 양으로 하전된 그룹들, 소수성 그룹들, pi-pi 결합 그룹, 수소 결합 그룹 또는 금속-킬레이팅 그룹들로 구성된다. 상기 2차 관능성은 제조 물질들 또는 입자들이 합성되는 공정에서의 의도하지 않은 부산물로서 양전하 표면 상에 존재하거나, 의도적 디자인에 의해 존재할 수 있다. 2차 관능성의 농도는 입자 mL 당 1 밀리당량 미만에서 mL 당 100 밀리당량 이상일 수 있다.
"음전하 표면(Electronegative surface)"음성 전하에 의해 지배되는 기질 또는 고체 물질의 표면을 지칭한다. 표면의 음전하성은 이에 제한되는 것은 아니나 카르복실, 아미노카르복실(이미노디아세틱 또는 니트릴로아세틱), 또는 포스포릴과 같은 소위 약 양이온 교환기 또는 술포(sulfo) 또는 설페이트 잔기, SO3-와 같은 강한 교환기를 포함하는 화학 잔기들에 의해 부여될 수 있다. 음으로 하전된 표면 상의 혼합 화학 성질을 생성하는 2차 관능성은 음 혹은 양으로 하전된 그룹들, 소수성 그룹들, pi-pi 결합 그룹, 수소 결합 그룹 또는 금속-킬레이팅 그룹들로 구성될 수 있다. 상기 2차 관능성은 입자들이 합성되는 제조 공정에서의 의도하지 않은 부산물로서 음전하 표면 상에 존재하거나, 의도적 디자인에 의해 존재할 수 있다. 2차 관능성의 농도는 입자 mL 당 1 밀리당량 미만에서 mL 당 100 밀리당량 이상일 수 있다.
"내독소(Endotoxin)"는 용균(lysis) 시 세포로부터 방출되는 그람-음성 박테리아의 외피 멤브레인 내에 존재하는 독성 열-안정적인 리포폴리사카라이드 물질을 지칭한다. 내독소는 일반적으로 이들의 높은 포스페이트 및 카르복실 잔여물 함량 때문에 산성일 수 있고, 지질-A 영역의 지방산 함량으로 인해 매우 소수성일 수 있다. 내독소는 수소 결합의 광범위한 기회를 제공한다.
"금속 친화성 관능성(Metal affinity functionality)"은 표면 상에 고정되어 바람직하게는 금속 이온과 1:1 방식으로 결합하는 화학 잔기의 능력을 지칭한다. 이러한 잔기들은 금속이온과 배위 결합을 형성하는 능력을 가지며, 이러한 일부 잔기들은 바이덴데이트 또는 멀티덴데이트일 수 있다. 이러한 능력을 갖는 음전하 잔기의 비제한적 예들은 이미노디아세틱산(2-(카르복시메틸아미노) 아세트산) 및 니트릴로아세틱 산(2,2',2''-니트릴로트리아세틱산)을 포함한다. 이러한 능력을 갖는 양전하 화합물의 예는 이에 제한되는 것은 아니나, 트리스(2-아미노에틸)아민 또는 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜트아민, 폴리프로필렌이민 테트라아민, 및 데페록사민을 포함한다.
"비-이온성 유기 고분자(Non-ionic organic polymer)"는 천연적으로 발생되거나 하전된 그룹이 없는 연결된 반복 유기 서브유닛으로 구성된 합성 탄화수소를 지칭한다. 이는 선형, 일부 브랜치가 있는 지배적 선형, 또는 지배적으로 브랜치된 형태일 수 있다. 본 발명을 실행하는데 적절한 예들은 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 포함한다. PEG는 HO-(CH2-CH2-O)n-H의 구조식을 갖는다. 예를 들면, 이에 제한되는 것은 아니나, 100 미만으로부터 내지 1000 daltons 이상의 평균 고분자 분자량을 갖는 조성물을 포함한다.
"유기 다가 양이온(Organic multivalent cation)"은 적어도 하나의 양전하 및 적어도 하나의 추가적 화학 관능성을 갖는 천연 또는 합성 유래의 유기 분자, 양이온 또는 염을 지칭하며, 이에 따라 다가성을 갖는다. 일부 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 화학 관능성을 갖는 유기 다가 양이온은 추가적인 양전하를 가지며, 이에 따라 상기 유기 다가 양이온은 2 이상의 전하를 보유한다. 유기 다가 양이온(혹은 OMC)는 또한 음전하를 보유할 수 있으나, 네트로 양성 혹은 중성이다. OMC가 네트 양성일 때, 이는 클로라이드, 브로마이드, 설페이트, 유기산, 락테이트, 글루코네이트, 및 본 방법과 양립할 수 있는 다른 음이온과 함께 제공될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, OMC의 양전하의 일부는 아민, 이민, 또는 다른 질소 잔기들에 의해 공급된다. OMC는 추가적으로 혼합 화학 성질을 가지며, 소수성 잔기, 다른 관능성 잔기를 포함하며, 및/또는 예를 들면, 수소 결합, 소수성 상호작용, 파이-파이 결합, 금속 배위 및 인터칼레이션(intercalation)에 참여하는 능력을 포함하는 다른 종류의 화학적 상호작용에 참여하는 능력을 보유한다. 일부 실시예들에 있어서, OMC의 예들은 이에 제한되는 것은 아니나, 디아미노산, 폴리리신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리히스티딘(polyhistidine), 폴리오르니틴(polyornithine)과 같은 디-, 트리- 또는 더 큰 호모- 혹은 헤테로-펩티드; 폴리에틸렌이민; 폴리알릴아민; 폴리디메트린(polydimethrine), 폴리메틸아크릴아미도프로필트리메틸암모니아; 폴리디알릴디메틸암모니아; 폴리비닐벤질트리메틸암모니아; 폴리비닐구아니딘(polyvinylguanidine); 폴리(N-에틸-4-비닐피리딘); DEAE-덱스트란; DEAE-셀루로오스; 에타크리딘(CAS number 442-16-0); 7-에톡시아크리딘-3,9-디아민; 트리스(2-아미노에틸)아민; 구아니딘; 클로르헥시딘; 알렉시딘(alexidine); 시트리시달(citricidal), 프로타민(protamine); 스페르민(spermine); 스페르미딘(spermidine); 살민(salmine); 키토산(chitosan); 및 이들의 변이체 및 유도체들을 포함한다. 예를 들면, 에타크리딘의 변이체 및 유도체들은 9-아미노아크리딘(아미나크린), 3,6 아크리딘디아민(프로플라빈), 아크리소르신, 아크리잔(페나크리단), 아크리딘 오렌지, 퀴나크린, 아크리사이드, 아크리돈, 아크리딘-9-카르복실산, 아크라닐(1-[(6-클로로-2-메톡시-9-아크리디닐)아미노]-3-(디에틸아미노)-2-프로판올 디하이드로클로라이드), 페노사프라닌, 페녹사진, 페노티아진, 아크리플라빈 (3,6-디아미노-10-메틸아크리디늄, 클로라이드 및 3,6-아크리딘이디아민), 및 이들의 염(예를 들면, 클로라이드, 브로마이드, 설페이트, 락테이트, 글루코네이트)을 포함한다.
"유기 용매"는 액상으로 존재하는 천연 유래 혹은 합성 유기 화합물을 지칭한다. 본 발명 실행에 적절한 예들은, 이에 제한되는 것은 아니나, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 디메틸 설폭사이드, 에탄올 및 페녹시에탄올을 포함한다.
"폴리뉴클레오티드"는 사슬 내에 공유 결합된 복수의 뉴클레오티드 모노머들로 구성된 생고분자를 지칭한다. DNA(deoxyribonucleic acid) 및 RNA(ribonucleic acid)가 폴리뉴클레오티드의 예이다. 폴리뉴클레오티드는 수소 결합 형성에 대해 높은 경향을 갖는다.
"단백질"은 탄소, 수소, 산소, 질소 및 일반적으로 황을 함유하는 유기 마크로분자 복합체 그룹을 지칭하며, 주로 펩티드 결합에 의해 연결된 일 이상의 아미노산 사슬로 구성된다. 단백질은 천연의 또는 재조합 유래일 수 있다. 단백질은 글리코실레이션, 페길레이션, 또는 다른 화학적 잔기들과 콘쥬게이션과 같은 비-아미노산 잔기들로 변성될 수 있다. 단백질의 비제한적인 예로서, 항체, 응고 인자, 효소 및 펩티드 호르몬을 들 수 있다.
"단백질 제조물(Protein preparation)"은 세포-함유 세포 배양 수확물, (실질적으로) 세포-프리 세포 배양 상청액, 또는 정제 단계로부터 관심 대상 단백질을 함유하는 용액과 같은, 관심 대상 단백질을 함유하는 임의의 혹은 대부분의 수용성 용액을 지칭한다.
"기질(Substrate)" 또는 "고체 물질"은 특성 상 미립자, 결정, 고분자, 섬유, 다공-중공 섬유, 모놀리스, 멤브레인일 수 있는 불용성 유기 고체를 지칭한다. 이는 비-기공성 혹은 다공성 입자들, 다공성 멤브레인, 다공성 필터, 또는 다공성 모놀리스로 구성될 수 있다. 미립자의 경우, 입자들은 대략 구형일 수도 있고 아닐수도 있으며, 100 nm 미만에서부터 100 미크론 이상의 크기를 가질 수 있다. 다공성 입자들의 평균 기공 사이즈는 10 nm 미만(마이크로기공)에서부터 100 nm 이상(마크로기공)의 범위를 가질 수 있다. 멤브레인에서의 평균 기공 사이즈는 100 nm 미만에서부터 1 미크론 이상일 수 있다. 멤브레인 또는 모놀리스에서의 평균 채널 사이즈는 1 미크론 미만에서부터 10 미크론 이상일 수 있다. 상기 고체 물질은 추가적으로, 예를 들면 입자들이 망상 매트릭스에 내장되거나, 멤브레인 사이에 샌드위치되거나, 혹은 이들 모두의 화합물 구조로 구성될 수 있다.
"과포화 우레이드(Supersaturated ureide)"는 특정 단백질 제조물 내에서 지배적인 조건하에서 이의 최대 용해도를 초과하는 우레이드 양을 함유하는 용액을 지칭한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 우레이드의 일부가 샘플 내의 비용해 형태로 존재하는 조건 하의 샘플 내 우레이드의 용해도보다 많은 양의 우레이드를 갖는 샘플을 제공한다.
"계면활성제(Surfactant)"는 일반적으로 소수성 부분 및 친수성 부분을 포함하며, 양친매성(amphiphilic)으로 지칭되는 유기 분자 클래스와 같은 "표면 활성 제제"를 지칭한다. 수용액 내 충분한 농도에서, 계면활성제는 클러스터로 자기-회합되어 소수성 부분은 중심에 집중되어 물과의 접촉을 최소화하고, 친수성 부분은 외부로 방사되어 물과의 접촉이 최대화된다. 특히 소수성 성질 또는 소수성 영역을 보유한 물질을 함유하는 생물학적 제제의 존재 하에, 계면활성제의 상기 소수성 부분은 소수성 물질의 일부와 자발적으로 회합되는 경향이 있으며, 계면 활성제의 친수성 부분의 영향을 통해 용해도롤 증가시킨다. 이들은 또한 수용성 용매 내에 용해된 서로 다른 소수성 물질들 사이에 발생하는 소수성 상호작용을 조절하기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명의 일부 실시예들의 실행에 적절한 계면활성제들의 예들은 이에 제한되는 것은 아니나, 폴리소르베이트 계면활성제들(예를 들면, Tween 20, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노라우레이트, 및 Tween 80, 폴리옥시에틸렌 (20) 소르비탄 모노올리에이트) 및 Triton(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 p-(1,1,3,3-테트라메틸부틸)-페닐 에테르)과 같은 비이온성 계면활성제, 및 CHAPS (3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), CHAPSO (3-[(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판설포네이트), 및 옥틸 글루코시드(예를 들면, (2R,3S,4S,5R,6R)-2-(히드록시메틸)-6-옥트옥시옥산-3,4,5-트리올)과 같은 양쪽 이온성 계면활성제들을 들 수 있다.
"우레이드(Ureide)"는 일 이상의 우레아 잔기들 또는 이의 유도체를 포함하는 천연 또는 합성 유래의 시클릭 혹은 비시클릭 유기 분자를 지칭한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 우레아, 요산, 히단토인, 알란토인(CAS number 97-59-6; 알클록사, 알디옥사, 헤모칸, 우레이도히단토인, 5-우레이도히단토인, 글리옥실우레이드, 글리옥실 산, 디우레이드, 2,5-디옥소-4-이미다졸리디닐 우레아), 퓨린 및 이들의 유도체들과 같은 우레이드들을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 R-CO-NH-CO-NH2 또는 R-CO-NH-CO-NH-CO-R' 또는 R'R''NH-CO-NR'''R''''의 화학식으로 나타나는 유기 분자를 제공한다("R-그룹들"은 수소 혹은 임의의 유기 잔기일 수 있다).
"바이러스" 또는 "비리온(virion)"은 주로 박테리아, 식물 및 동물들과 같은 살아있는 호스트 세포들 내부에서만 복제하는 초미세의(약 20 내지 300 nm 직경의) 대사적으로 불활성의, 전염성 제제를 지칭한다: RNA 또는 DNA 코어, 단백질 코트, 및, 보다 복잡한 타입에 있어서 외피로 구성된다.
본 발명 실행에 사용되는 고체 물질들은 이에 제한되는 것은 아니나, 크로마토그래피 수행에 흔히 채용되는 다공성 마이크로입자와 같은 천연 혹은 합성 유래의 불용성 입자들을 포함할 수 있다. 이러한 입자들은 이에 제한되는 것은 아니나 항체와 같은 단백질의 확산성 진입을 허용하는 큰 기공을 포함할 수 있다; 또는 이들은 염, 당, 및 헤테로-응집체-분리 제제와 같은 소형 화학종들의 확산성 진입을 허용할 수 있는 작은 기공을 포함할 수 있으나, 항체와 같은 단백질의 진입을 허용하기에는 매우 작을 수 있다.
상기 고체 물질들은 선택적으로 비-기공성 입자들, 멤브레인 또는 모놀리스, 다공성-벽 중공 섬유를 포함하는 섬유, 다공성 멤브레인, 및/또는 상기 구성들의 조합들을 채용하는 화합물 구조체를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 실시예들을 수행하는데 사용되는 혼합 화학 성질의 입자들은 특히 불용성 유기 입자들을 포함한다. 이러한 입자들은 비-기공성 또는 다공성일 수 있다. 다공성인 경우, 이들은 이에 제한되는 것은 아니나 항체와 같은 단백질의 확산성 진입을 허용할 수 있도록 큰 기공들을 포함할 수 있다; 또는 이들은 염, 당, 및 헤테로-응집체-분리 제제와 같은 소형 화학종들의 확산성 진입을 허용하도록 작은 기공을 포함하나, 항체와 같은 단백질의 진입을 허용하기에는 매우 작을 수 있다. 이러한 입자들에 의해 구현되는 화학 성질의 혼합은 혼합 화학 성질의 가용성 다가 양이온 제제를 찾을 수 있는 음전하 관능성을 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니나, 양전하성, 수소 결합, 소수성 상호 작용, 파이-파이 결합 및 금속 배위를 포함하는, 응집체 양 감소 및/또는 수용성 제제 탐색을 촉진하는 능력을 향상시킬 수 있는 일 이상의 화학적 관능성을 더 포함할 수 있다.
양전하 그룹은 소위 강한 음이온 교환 그룹 및/또는 약한 음이온 교한 그룹을 포함할 수 있다. 약한 혹은 강-약 혼합 음이온 교환기의 양전하 그룹들이 용해된 금속 이온과의 배위 상호작용에 참여하여, 적용된 생물학적 샘플로부터 오염된 금속 이온들을 제거하는 바람직한 결과를 생성하는 능력 때문에 바람직하다. 금속 배위 능력을 갖는 이러한 혼합 약-강 음이온 교환기의 비제한적 예는 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)이다. 혼합 화학 성질은 단일 복합 화학 그룹 내, 단일 타입 표면 상의 특징적인 성질의 분리된 화학 그룹 내에, 구별되는 표면상에, 혹은 이들의 임의의 조합내에 존재할 수 있다.
음전하 그룹은 소위 강한 양이온 교환기 또는 소위 약한 양이온 교환기를 포함할 수 있다. 약한 혹은 강-약 혼합 양이온 교환기의 음전하 그룹들이 용해된 금속 이온과의 배위 상호작용에 참여하여, 적용된 생물학적 샘플로부터 오염된 금속 이온들을 제거하는 바람직한 결과를 생성하는 능력 때문에 바람직하다. 금속 배위 능력을 갖는 양이온 교환기들의 비제한적인 예들은 카르복실, 포스포릴, 이미노디아세틱(IDA), 및 니트릴로아세틱산(NTA) 그룹들을 포함한다.
약한 이온 교환기는 또한 강한 이온 교환기 대비하여 수소 결합을 형성하는 이들의 증가된 능력 때문에 선호된다. 입자들이 일 이상의 양전하 관능성을 갖는 정도까지, 이들은 소위 강한 음이온 교환기 및/또는 약한 음이온 교환기에 의해 부여된다.
일부 실시예들에 있어서, 양전하성 또는 음전하성 물질들의 표면들은 또한 지방족 및/또는 방향족 성질의 소수성 그룹을 포함하며, 후자는 소위 파이-파이 결합에 참여하는 능력 때문에 선호될 수 있다. 혼합 화학 성질은 단일 복합 화학 그룹 내, 단일 타입 표면 상의 특징적인 성질의 분리된 화학 그룹 내에, 구별되는 표면상에, 혹은 이들의 임의의 조합내에 존재할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 일 이상의 음전하성 및/또는 일 이상의 양전하성 표면 조성물들이 동시에 채용되고, 이들은 이들의 화학적 조성 및/또는 이들의 물리적 형태 측면에서 상이할 수 있다. 양전하 관능성은 음전하성 입자들로부터 분리 및 특징적인 입자들에 의해 중재될 수 있다. 입자들은 단백질 제조물에 걸쳐 분산되거나 칼럼 내에 충진된, 또는 초기에 분산되어 이어서 칼럼 내에 충진된 다공성 혹은 비-기공성 입자들을 포함할 수 있다.
개별 성질을 구분짓는 화학적 관능성은 특정 샘플 조성물의 필요에 맞춰진 다양한 비율들로 채용될 수 있다. 예를 들면, 정제된 세포 배양 상청액의 처리에 의도된 조합들은 양전하 표면의 과량을 포함하는 반면, 에타크리딘 또는 폴리에틸렌이민과 같은 양전하 헤테로-응집체-분리 제제로 이미 처리된 상청액의 처리에 의도된 조합은 과량의 음전하 표면을 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 실시예들의 수행에 사용되는 혼합 화학 성질의 수용성 다가 양이온은 적어도 하나의 양전하, 및 수소 결합, 소수성 상호작용, 파이-파이 결합, 금속 배위 및 인터칼레이션에 참여하는 능력을 제공하는 잔기들과 같은 혼합 화학 성질을 부여하는 추가적 특징들을 갖는 유기 분자를 포함할 수 있다. 이러한 성질들을 포함하는 다가 양이온의 예들은 폴리에틸렌이민, 에타크리딘, 클로르헥시딘, 및 다양한 기타 물질들을 포함한다. 이러한 제제들은 0.001% 내지 1.0% 범위의 농도로 적용될 수 있으나, 0.01 내지 0.10%, 및 특히 0.02 내지 0.06% 또는 0.02% 내지 0.05% 범위의 농도에서 사용될 때 응집체 감소 및 단백질 생성물 회수의 가장 좋은 밸런스를 일반적으로 제공할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 방법의 응집체 감소 수행 및/또는 원하는 단백질 회수는 독립적으로 충분한 화학적 영향이 부족한 수용성 유기 제제들의 공통-추가에 의해 증진되어 본 발명의 다른 실시예들과 같이 동일한 레벨의 응집체 감소를 구현할 수 있다. 이러한 추가적인 제제들은 이에 제한되는 것은 아니나, Tween, Triton, Brij, CHAPS, CHAPSO, 및 옥틸 글로코시드와 같은 비이온성 또는 양쪽이온성 게면활성제; 바람직하게는 1000 Dalton 미만의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 및 폴리비닐 피롤리돈과 같은 유기 고분자; 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 디메틸 설폭사이드, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 페녹시에탄올과 같은 유기 용매; 탄수화물; 및 우레아, 히단토인 및 알란토인을 포함하는 우레이드를 포함할 수 있다. 예들은 또한 이에 제한되는 것은 아니나, 바이러스의 불활성화와 같은 다른 목적을 위해 첨가되는 수용성 비-다가 양이온 제제를 포함할 수 있으며, 이들은 벤잘코늄 클로라이드, 메틸렌 블루, 및 트리(n-부틸)포스페이트 등을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서 예들은 0.0025% 이상의 양의 요산, 0.56% 이상의 양의 알란토인과 같은 과포화 양의 우레이드를 포함할 수 있다.
시퀀싱
일부 실시예들에 있어서, 상기 다가 양이온들 및 혼합 화학 성질의 입자들은 응집체 감소 실현을 위해 충분한 시간 동안 함께 존재해야 한다. 이들은 함께 추가되거나, 미확정 시간 동안 먼저 가용성 제제가 추가될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 다가 양이온의 선행 첨가가 더 나은 결과를 생성할 수 있으나, 다른 포맷 역시 다양한 적용예에서 적절한 결과를 생성할 것이다. 본 발명 실행을 위해 요구되는 시간은 다가 양이온의 농도, 입자들의 비율에 직접적으로 의존하며, 더 약하게는 단백질 제조물의 응집체 함량에 의존할 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 제1 및 제2 성분들의 혼합 화학 성질의 가용성 및 고체 제제들의 첨가를 위한 샘플의 제조방법의 단계를 제공한다. 조건들은 다가 양이온 또는 입자들과의 상호작용을 통해 관심 대상 단백질의 손실을 실질적으로 방지할 수 있는 성질의 것이어야 한다. 이러한 조건들은 관심 대상 단백질 및 다가 양이온 또는 입자들 사이의 강한 전하 상호작용을 유지하기에 충분히 높은 전도도 값을 포함하며, 다른 타입의 화학적 상호작용을 조절하는 다른 첨가물의 추가도 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 실질적으로 상승된 전도도(염 농도)로 효과적인 응집체 감소 및 가용성 제제의 제거를 제공한다. 하전된 입자들은 특히 낮은 전도도, 일반적으로 10 mS/cm 이하, 가장 흔하게는 5 mS/cm 이하의 수용성 환경 상에서 이들의 성능에 의존하는 것으로 알려져있다. 이러한 수치들은 대략적으로 각각 100 mM NaCl, 및 50 mM NaCl에 상응한다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 20-30 mS의 전도도 값, 흔하게는 40 mS/cm 까지, 그리고 때로는 100 mS/cm까지 또는 그 이상의 전도도에서 효과적인 응집체 감소 및 가용성 제제의 제거를 지지한다. 실제로 일부 실시예들에 있어서, 헤테로-응집체의 분리는 보다 높은 농도에서 증가한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 후속 정제 방법에서 사용되는 크로마토그래피를 오염시킬 수 있는 샘플 성분의 제거를 제공한다. 예를 들면, IgG 항체들은 고정화된 단백질 A를 갖는 친화도 크로마토그래피에 의해 흔하게 정제된다. 효과적이기는 하지만, 본 방법의 수행에 사용되는 크로마토그래피 장치는 극도로 비싸며, 크루드 샘플 적용에 의해 이들의 유효 사이클-수명이 상당히 감소할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명에 의해 처리된 샘플들은 반짝이며, 광학적으로 클리어하며, 단백질 A의 성능 또는 다른 크로마토그래피 수단을 손상시킬 수 있는 서스펜딩된 잔해물이 없다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 방법에 따른 샘플 정제는 10% 이상의 단백질 A의 IgG 결합 능력을 증가시킬 수 있으며, 다른 포획 또는 후속 크로마토그래피 방법들 상에 유사한 유리한 효과를 제공할 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 사용은 단백질 A가 호스트 단백질 오염물 함량을 5 이상으로 감소시키는 것을 가능케 할 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 후속 정제 방법을 가능케하며, 그렇지 않으면 비정제된 소스들로부터 초기 항체 캡쳐에 대해 비실용적이 되는 지점까지 샘플 성분들에 의해 손상될 수 있다. 예를 들면, 호스트 세포 DNA는 IgG 또는 IgM 항체들 보다 음이온 교환기 및 히드록시아파타이트 배지에 보다 강하게 결합한다. 이는 이의 항체 결합 능력 및 정제 성능 양자를 약화시키며, 초기 캡쳐 방법들로서의 적합성을 손상시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 이러한 후속 방법들에 샘플을 적용하기 전에 DNA의 대부분의 제거를 촉진하며, 초기 항체 캡쳐/정제에 대한 음이온 교환기 및 히드록시아파타이트 배지의 실용적인 수단을 제공한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 사용을 위한 준비 과정에 있어, 처리되는 샘플의 조성을 평가하는 것이 바람직하다. 제1 주요 변수는 샘플 내의 응집체 함량이다. 이는 크기 배제 크로마토그래피 및 특히 254-260 nm 및 280 nm의 파장에서 동시 모니터링에 의한 분별 모니터링에 의한 분석을 사용하여 용이하게 결정될 수 있다. 이러한 방법은 항체-DNA 복합체를 함유하는 헤테로-응집체의 검출에도 편리하며, 이들의 하이드로다이나믹 크기가 대략 정제된 항체와 근접할 때도 유용하다. 높은 응집체 레벨을 함유하거나, 0.5 이상의 254/280 비율을 나타내거나, 상승된 254/280 비율들을 갖는 헤테로-응집체를 함유한 샘플들은 비제한적인 예로서 에타크리딘 및/또는 폴리에틸렌이민과 같이 혼합 화학 성질의 가용성 제제로의 샘플 처리에 선호되는 후보들이며, 샘플을 혼합 화학 성질의 표면에 노출시키기 전에 응집체 분리를 촉진할 수 있다. 용어 "높은 응집체 레벨"은 전체적인 정제 공정에서 샘플이 유래된 출처에 의존하므로 상대적인 의미로 이해된다. 세포 배양 상청액 내의"높은(high)"응집체 레벨은 항체에 비교하여 50% 이상일 수 있으며, 초기 정제 후의 "높은"응집체 레벨은 5% 이상 혹은 이하를 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 정제될 단백질의 고유의 화학 성질을 평가하는 것이 또한 바람직하다. IgG 항체들은 양전하 표면에 약하게 결합하거나 결합 경향이 없는 전자적으로 중성, 알칼리 성질을 갖는 경향이 있으나, 음전하 표면에는 약하고 온화하게 결합하는 경향이 있다. IgM 항체들은 알칼리에서 산성까지 성질을 가지며, 일반적으로 양전하 표면에 강하게 결합하며, 음전하 표면에는 약하게 결합하는 경향을 갖는다. 항체 표면에 대한 실용적인 결정은 간단한 실험들에 의해 수행될 수 있다. 상기 실험에서, 항체는 pH 7.0에서 양이온 교환기에 적용되고, 선형 염 그래디언트로 용리되고, 동일한 조건에서 음이온 교환기로부터 적용 및 용리된다. 각 교환기로부터 항체가 용리되는 염 농도는 음전하 혹은 양전하 표면들에 결합하는 항체의 상대적인 경향, 및 각 상호작용을 조절하는데 요구되는 염 농도의 편리한 인덱스를 제공한다. 이러한 특성화는 복수의 pH 값들에서 수행되어 특정 관심 단백질의 전하 특성에 대한 보다 완전한 이해를 제공할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 일 이상의 다가 양이온을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 실험 데이터에 따르면, 일반적으로 다가 양이온의 소수성이 약할수록, 관심 단백질의 회수가 높아진다. 또한 소수성이 낮아질수록, 상기 다가 양이온이 단백질의 상당한 손실 없이 적용될 수 있는 농도 범위가 넓고 높아진다. 따라서 약하게 소수성인 PEI가 보다 강한 소수성인 에타크리딘, 또는 더 강한 소수성의 클로르헥시딘 보다 더 나은 후보로 고려될 수 있다. 그러나, 다른 이슈들도 생성물 회수에 부가적으로 고려될 필요가 있다. PEI는 널리 알려진 세포독성 성질을 가지며, 정제 공정 동안 샘플로부터 이의 유효한 제거를 적절한 감도로 용이하게 검출하기가 곤란하다. 에타크리딘은 플라즈마 단백질 분별 분야 및 항바이러스 제제로서 오랫 동안 사용된 것이 기인하여 선호될 수 있다. 추가적으로, 이의 밝은 황색 컬러 및 고유의 형광 특성은 주어진 샘플 내의 함량의 고감도 측정을 촉진하며, 이에 따라 본 발명의 실행에 이어 이의 제거를 용이하게 기록할 수 있다. 부가적으로, 상이한 다가 양이온들이 원하는 효과를 중재하는 능력을 보유한 상이한 2차 화학 관능성을 포함할 수 있다. 예를 들면, PEI는 주로 정전 상호작용 및 수소 결합을 통해 DNA와 결합하는 것으로 이해된다. 에타크리딘은 두 상호작용은 거의 제공하지 않으나, DNA를 삽입하는 것으로 알려졌다. 이는 또한 일반적으로 보다 효과적인 응집체 감소를 지지할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 에타크리딘, 클로르헥시딘 및 폴리에틸렌이민과 같은 제제들은 샘플의 조성 및 항체의 성질에 따라, 0.001% 내지 1% 미만의 범위의 농도에서 효과적으로 적용될 수 있다. 고농도가 혼합 화학 성질의 음전하 고체의 양을 증가시켜 고체 제제들을 제거할 수 있으므로 최소 유효 농도가 바람직할 수 있다. 실험 데이터에 따르면, 0.01 내지 0.1의 농도, 특히 0.02 내지 0.06%, 또는 0.02% 내지 0.05% 범위의 농도가 이러한 이상적인 상태를 구현할 수 있다. 가장 효과적인 제제 및 작용 농도는 각 특정 경우에 대해 확인 및 맞춤화될 수 있다. 당해 기술 분야에 통상을 지식을 가진 자에게 상술한 특정 제제가 바이러스 불활성화 능력을 가지며, DNA 및 내독소 제거를 증가시키는 추가적인 이점을 가짐이 명확하게 이해될 것이다. 일 종 이상의 다가 양이온이 채용될 수 있다. 다가 양이온에 의한 샘플의 예비-처리는 본 발명의 일부 실시예들에 있어서 응집체 레벨을 낮추는 능력을 증가시킬 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 다양한 성질의 양전하 및/또는 음전하 기질이 그것이 존재하는 원하는 단백질 및 피드 스트림(feed stream)의 성질에 가장 부합되는지를 평가하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 일부 경우에 있어서, 4차 아민 관능기를 갖는 양전하 물질은 응집체 및/또는 다른 오염물을 감소시키는 능력이 작을 수 있으나, 원하는 단백질의 높은 회수를 지지할 수 있으며, TREN 형태의 양전하 물질은 반대 결과를 지지할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 하나의 원하는 단백질을 선호하는 양전하 표면은 다른 것에 대해서는 열등할 수 있다. 예를 들면, TREN은 IgG에 대해 선호될 수 있고; 반면 4차 아민은 IgM에 대해 선호될 수 있다. 기질 상의 리간드의 밀도는 또한 예를 들면, 샘플 성분 및 화학적 표면들 사이의 2차 상호작용을 통한 본 발명의 일부 실시예들의 성능에 영향을 줄 수 있다. 예를 들면, 일부 실시예들의 실험 데이터 기록에 따르면, 고밀도 TREN을 갖는 기질은 저밀도 TREN을 갖는 기질들보다 우수한 성능을 가질 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 샘플에 대한 5% 고체의 조합 부피비에서 혼합 화학 성질의 입자들의 동등한 균형 혼합물로 시작하는 것이 편리할 수 있다. 특정 샘플에 대한 최상의 시스템을 최적화하는 것을 통해, 샘플 부피에 대한 고체의 비율은 감소되어 특정 샘플/처리 시스템에 대한 유효 문턱값을 확인할 수 있다. 양전하 관능성에 대한 음전하 관능성의 비율은 또한, 표면 상에 포함된 2차 화학 관능성을 선택하는 것과 같이 다변화될 수 있다. 이러한 변화를 평가하기 위한 실험양은 Design of Experiments(소위 DoE)에 기반한 통계적 적용에 의해 실질적으로 감소될 수 있다. 혼합 화학 성질의 용이한 입자들은 상업적으로 획득되는 음이온 교환기 및 양이온 교환기, 킬레이팅 수지, 소수성 수지 및 소위 혼합 모드 크로마토그래피 수행을 위해 판매되는 제품들을 포함할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 평가를 위한 초기 조건들은 다양한 표면들에의 결합을 통한 항체 손실을 방지하는 pH 및 전도도 값에서 수행되어야 하며, 그러나 추가적으로 실험들은 향상된 응집체 및/또는 항체-오염물 복합체 분리를 향상시키는 측면에서 특히 높은 전도도 레벨을 평가해야 한다. 편의성을 위해, IgG 항체들에 대한 초기 실험은 pH 6.5-7.5 및 전도도 10-15 mS/cm에서 수행될 수 있다. IgM 항체들에 대한 초기 실험들은 동일한 pH 및 20-30 mS/cm의 전도도에서 수행될 수 있다. 각각에 대한 후속 실험들은 보다 높은 전도도 및 낮은 전도도에서, 및/또는 높거나 낮은 pH 값에서 수행되어 응집체 감소 및 항체 회수의 최적 조합을 지지하는 조건을 확인할 수 있다. 호스트 세포 단백질 오염물의 레벨을 감소시키는 것이 본 발명의 주요 목적은 아니나, 특히 고 알칼리 및/또는 고 산성 호스트 단백질 함량에 있어서, 이러한 측면에서도 상당한 기여를 할 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 혼합 화학 성질의 가용성 및 고체 제제들이 존재하는 시간은 간단한 실험들을 통해 결정될 수 있으며, 여기서 샘플들은 예를 들면 1 시간동안 매 10분 마다, 또는 하기에 설명되는 예들로부터의 데이터에서 지시되는 축적 및 듀레이션과 같은 시간 과정에 걸쳐 SEC를 통해 분석될 수 있다.
당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 호모응집체 및 헤테로-응집체의 함량을 감소시키는 것에 추가하여, 본 발명의 일부 실시예들이 또한 호스트 세포 단백질, DNA, 내독소 및 바이러스의 함량을 실질적으로 감소시킬 수 있음을 명확히 이해할 것이다.
일부 실시예들에 있어서, 제1 및 제2 성분들의 고체 물질들은 사용 후에 세정 및 재사용될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 이들은 사용후 폐기될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명의 방법은 다른 크로마토그래피 단계들 이전에 실행될 수 있으며, 이는 세포 배양 배지 성분들에 의한 오염으로부터 크로마토그래피 배지를 보호하고, 타겟 생성물을 비처리 샘플에서 보다 균일한 상으로 제공하여 정제 품질을 향상시키는 이점을 갖는다.
일부 실시예들에 있어서, 본 발명은 중성 물질에 의해 혼합 및 밀봉되고, 중성 물질에 내장되고, 또는 자체로 음전하성 및/또는 양전하성의 물질에 의해 밀봉 또는 내장된 음전하 입자들 및 양전하 입자들의 사용 방법을 제공한다. 일부 실시예들에 있어서, 음전하 및/또는 양전하 표면은 이에 제한되는 것은 아니나, 소수성 상호작용, 파이-파이 결합, 수소 결합 및 금속 친화성에 참여하는 능력을 포함하는 추가적인 화학적 관능성을 포함할 수 있다.
본 발명의 추가적인 목적 및 이점들은 후술하는 상세한 설명에서 부분적으로 제시되며, 부분적으로는 상기 설명으로부터 자명하거나, 본 발명의 실행을 통해 학습될 수 있다. 본 발명의 목적 및 이점들은 청구항에 특정된 구성들 및 조합들의 수단에 의해 구현 및 획득될 수 있다.
상술한 일반적 설명 및 후술하는 상세한 설명 모두 예시적인 것이며, 청구된 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다.
실험예
하기의 실험예들은 본 발명의 일부 실시예들의 효과를 설명하기 위한 프로토타입을 제공한다.
실험예 1
양전하 및 음전하 표면들의 프로토타입 혼합에 의해 처리된 DNA의 제거와 병합된 DNA-항체 헤테로-응집체의 분리. 최종 농도 200 mM의 소듐 클로라이드(NaCl)가 단일클로날 IgM 클론 85를 함유하는 정제된 세포 배양 상청액 100 mL에 첨가되었다(전도도 21 mS/cm). 2.5 mL의 양전하 마크로다공성 미립자 물질(Nuvia Q)이 2.5 mL의 음전하 마크로다공성 미립자 물질(Nuvia S)에 혼합되고, 이어서 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 필터들 사이에 샌드위치되었다. 입자들은 50 mM Hepes, 200 mM NaCl, pH 7.0에서 평형을 이루었다. 상기 샘플은 입자들을 통해 플로우되고, 평형 버퍼가 추가되었다. 입자들은 3 M 구아니딘으로 세척되었다. 미처리 및 처리 샘플들은 분석 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 적용되고, 254 및 280 nm UV에서 모니터링되었다. 미처리 샘플의 IgM 피크의 254/280 비율은 0.546이었고, 이는 DNA의 실질적인 양이 IgM과 회합되었음을 지시하였다. 처리 후의 IgM 피크의 254/280 비율은 0.449이었으며, 이는 매우 낮은 DNA 함량을 지시한다. 응집체 함량은 약 3%에서 1% 미만으로 감소하였다. IgM 모노클로날 항체들에서의 결과를 설명하는 본 실험 및 후속 실험들은 80-100% 사망률로 성장한 세포 배양물을 사용하여 수행되었고, 이는 당업자에게 샘플 내의 응집제 및 오염물 함량에 관해 최악의 시나리오에 해당하는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 대부분의 상업적 적용예에서 일반적인 바와 같이, 고레벨의 세포 활성으로 수확된 세포 배양물은 실질적으로 낮은 부피 및 상이한 혼합 화학 성질 조성으로 수득됨이 명확하게 이해될 것이다. 다른 IgM 클론(IgM-529)을 사용한 유사 실험에서, 입자들 상의 항체 손실을 회피하기 위해 전도도를 25 mS/cm로 높이는 것이 필요하였다.
실험예 2
증가된 NaCl 농도에서 IgM 제조물로부터의 헤테로-응집체 분리 및 오염물 제거. IgM 85를 함유하는 100 mL 세포 배양 상청액에 염이 첨가되어 약 25 mS/cm의 전도도를 획득하였으며, 마크로다공성 음전하 고체상(Nuvia S), 마크로다공성 양전하 고체상(Nuvia Q), 마이크로다공성 양전하 고체상(Q Sephadex A25), 및 마이크로다공성 음전하(CM-Sephadex C25) 각각의 0.25 mL의 프로토타입 상으로 통과되었으며, PVDF 필터들 사이에 샌드위치되고, 50 mM Hepes, 250 mM NaCl, pH 7.0로 평형되었다. 일부가 수집되어 효율을 결정하였다. HMW 응집체 및 헤테로-응집체는 약 20 혼합-입자 부피까지 샘플에서 실질적으로 존재하지 않았다. DNA의 90% 이상이 100 입자 부피까지의 샘플에서도 제거되었다. 이러한 결과들은 IgM의 손실 회피를 위해 요구되는 것보다 30% 이상 높은 전도도 값에서 본 발명의 효과적인 사용을 보여준다.
실험예 3
증가된 NaCl 농도에서의 IgG 제조물로부터의 헤테로-응집체 분리 및 오염물 제거. 모노클로날 IgG, 클론 Her2는 1 mS/cm 아래의 전도도에서도 양전하 매체(Nuvia Q)에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다. 이는 12 mS 위의 전도도에서(pH 7.0)에서 음전하 매체(Nuvia S)에 결합하지 않는 것으로 밝혀졌다. 샘플은 15 mS의 전도도로 상승되고, 실험예 2에서와 동일한 프로토타입 혼합물 상으로 통과되었다. DNA는 호스트 단백질 오염물의 약 반과 함께 제거되었다. HMW 응집체들은 10% 이상 내지 0.2% 미만으로 감소되었다. 헤테로-응집체들은 254/280 비율로 결정되는 바와 같이, 본질적으로 제거되었다. IgG 모노클로날 항체들의 결과를 설명하는 다음의 실험들이 50-80% 사멸율로 성장된 세포 배양물을 사용하여 수행되었으며, 이는 당업자에게 샘플내의 응집체 및 오염물에 관하여 최악의 시나리오를 나타내는 것으로 이해될 것이다. 따라서, 대부분의 상업적 적용예에서 일반적인 바와 같이, 고레벨의 세포 활성으로 수확된 세포 배양물은 실질적으로 낮은 부피 및 상이한 혼합 화학 성질 조성으로 수득됨이 명확하게 이해될 것이다.
실험예 4
실험예 2에서 설명된 고체 물질들과 동일한 혼합물 10 mL가 실린더형 유리 어셈블리 내의 부직 나일론 리테이너들(retainers)(약 5 μm의 기공) 사이에 샌드위치되었다. 입자들은 50 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.0로 평형되었다. 모노클로날 IgG를 함유하는 세포 배양 상청액 500mL가 입자들을 통해 플로우되고 수집되었다. 샘플은 평형 버퍼액으로 추적되어 가공된 샘플의 수집을 가능케했다. 플로우된 모모클로날 IgG 함유물은 0.2% 미만의 HMW 응집체를 가지며 뚜렷한 헤테로-응집체는 보이지 않았다. 입자들은 50 mM Hepes, 2 M NaCl로 용리되어 강하게 옐로우-브라운 착색된 용출물을 수득하였다.
실험예 5
100 mg의 에타크리딘이 IgG 모노클로날 항체를 함유하는 세포 배양 배지 1L에 첨가되어 교반되고, 원심분리에 의한 노란 침전물을 제거하기 전에 15 분동안 배양되었다. 실험예 2에 설명된 동일한 고체 물질 혼합물 80mL가 유리 어셈블리 내의 부직 나일론 리테이너들 사이에 샌드위치되었다. 에타크리딘 처리로부터 황갈색을 띄나 광학적으로 클리어한 상청액이 입자들 상으로 플로우되고 수집되었다. 샘플은 평형 버퍼액으로 추적되어 가공된 샘플의 수집이 가능하였다. 칼럼은 50 mM Hepes, 2 M NaCl, pH 7.0 단계로 용리되었다. 염 용출 피크는 에타크리딘 처리에 의한 DNA 제거에 기인하여 미처리된 샘플로 수득된 사이즈의 대략 반에 해당되었다. 280 및 254 nm에서의 UV 흡수비가 각 샘플에 대해 계산되었다. 미처리된 샘플은 2.06의 280/254 비율을 제공하였다. 에타크리딘 처리된 샘플은 2.33의 비율을 제공하였고, 이는 실질적으로 감소된 헤테로-응집체 함량을 나타낸다. 플로우된 샘플은 2.39 비율을 나타냈으며, 이는 또 다른 DNA의 축적물의 제거를 가리킨다. HMW 응집체들은 0.1% 미만으로 감소되었다. 적용된 샘플 부피의 2%에 상응하는 혼합-배지 부피로의 이전 실험들은 에타크리딘을 완전히 제거하는데 부적절하였다. 유사한 실험들은 적어도 5 cm의 베드(bed) 높이가 혼합-배지의 최소 부피를 갖는 최상의 결과를 제공하였음을 보여주었다.
실험예 6
프로토타입 입자 혼합물이 0.5 mL 킬레이팅 다공성 입자들(Chelex-100) 및 0.5 mL 양전하 다공성 입자들(Macroprep High-Q)로부터 제조되어, 유리 어셈블리 내의 셀룰로오스 필터들 사이에 혼합 및 샌드위치되었다. IgG 모노클로날 항체(Her2)의 정제된 샘플은 생리학적 조건과 근사조건에서 손실 없이 입자들 상으로 통과되었다:pH 7.0, 10 mS/cm. 미정제된 항체들을 사용한 실험들이 25 mS/cm, 20 mS/cm, 및 30 mS/cm에서 수행되었다. 모든 경우에 있어서, 헤테로-응집체 및 HMW 응집체는 제거되었다. 0.02% 에타크리딘을 함유하는 미정제된 항체를 사용한 실험들이 동일한 전도도에서 수행되었다. 모든 경우에 있어서, 헤테로-응집체 및 HMW 응집체는 제거되었고, 플로우 결과물은 365 nm에서 UV 흡수가 없는 것에 의해 에타크리딘이 없는 것으로 기록되었다.
실험예 7
실험예 6과 유사한 일련의 실험들에서, IgM 모노클로날 항체(clone 529)의 정제된 샘플이 증가된 염 조건에서 손실 없이 입자들 상으로 통과되었다: pH 7.0, 200 mS/cm. 미정제된 항체 및 0.02% 에타크리딘을 함유하는 미정제된 항체들이 20, 30, 및 40 mS/cm에서 적용되었다. 모든 경우에 있어서, 헤테로-응집체 및 HMW 응집체들은 제거되었으며, 플로우 결과물은 365 nm에서 UV 흡수가 없는 것에 의해 에타크리딘이 없는 것으로 기록되었다. 이러한 실험들은 0.2% 에타크리딘으로 반복되었다. 모든 경우에 있어서, 헤테로-응집체 및 HMW 응집체들은 제거되었으며, 플로우 결과물은 에타크리딘이 포함되지 않았다.
실험예 8
Chelex-100 및 MacroPrep High Q의 동등 부피의 혼합물로 구성된 충진된 베드 상으로 통과될 때, 모노클로날 IgM 배양 상청액으로부터의 DNA 및 응집체의 제거 용량에 대한 연구가 진행되었다. Chelex-100 및 MacroPrep High Q 각각 0.5mL가 PVDF 멤브레인들 사이에 샌드위치되었다. M529 배양 상청액이 1mL/min로 로딩되고, 25, 50 및 100 mL에서 수집된 플로우 결과물의 샘플들이 분석 SEC에 의해 분석되었다. 최대 로딩에서도, 254-지배적 헤테로-응집체들은 본질적으로 상기 플로우 결과물로부터 제거되었다. 다양한 로드(low to high)에서 IgM 회수는 각각 58, 73 및 85%로 나타났다. 상기 실험은 NaCl가 추가되어 25 mS/cm 전도도로 반복되었다. 헤테로 응집체 감소는 영향받지 않았으나, 회수는 각각 약 85, 90, 및 95%로 증가하였다.
실험예 9
실험예 8의 실험이 반복되었으나, 마이크로다공성 및 마크로다공성의 양전하 및 음전하 매체에 동일한 부피의 마이크로다공성 친유성 입자가 추가되었다: QAE Sephadex A-25, SP Sephadex C-25, Nuvia Q, Nuvia S 및 Sephadex LH-20. 알란토인 및 에타크리딘이 5% 세럼-보충된 모노클로날 IgM 상청액에 첨가되어 각각 최종적으로 1%(과포화) 및 0.02% 농도가 되었다. 상기 상청액은 원심분리에 의해 분류되고, 이어서 베드(mL 충진 베드당 20mL 상청액)를 통해 플로우되었다. IgM이 이어서 양이온 교환기 상에서 캡쳐되었다. IgM 회수는 2단계 공정을 통해 80%로 나타났으며, 순도는 분석 SEC에 의해 뚜렷한 응집체 없이 90%로 나타났다.
실험예 10
음전하성, 금속 배위 다공성 입자들(Chelex-100) 및 양전하성 다공성 입자들(Macroprep High Q) 각각 0.6 mL가 M529 IgM 정제 배양 상청액 45mL에, 에타킁리딘 첨가 직후에 첨가되어 25 mS/cm 전도도에서 최종 농도 0.02%가 되었고, 회전 쉐이커에서 연속적으로 혼합되었다. 샘플들은 1 시간 동안 10분 간격으로 취출되었다. 분석 SEC는 HMW 및 헤테로-응집체의 지속적인 감소를 보여주었고, 거의 50분에 완료되었으나, 추가 10분 간은 미소하게 향상되었다. 에타크리딘 역시 365 nm 프로파일에 의해 지시되는 바와 같이 제거되었다.
실험예 11
1리터의 모노클로날 IgG-함유 세포 배양 상청액이 1% 알란토인 및 0.02% 에타크리딘으로 15 분간 처리되었다. 노란색 침전이 멤브레인 여과에 의해 제거되고, 광학적으로 반짝이는 클리어한 황갈색 침전물이 Chelex 100 및 Macroprep High Q의 동등 혼합물로 충진된 10 mL 칼럼에 적용되었다. 처리된 물질은 이어서 단백질 A 칼럼에 적용되어 20 mg/mL로 로딩되고, 10 칼럼 부피로 세척되고, IgG는 용리되었다. 미처리된 세포 배양 상청액으로 로딩된 단백질 A로부터 용출된 항체와 비교하여 용출된 IgG는 대략 5배 낮은 호스트 세포 단백질 오염물을 포함하였다. 유사한 실험들이 처리 및 미처리된 샘플들로 로딩된 단백질 A 칼럼의 동적 결합 용량을 결정하기 위해 셋업되었다. 처리된 샘플로 로딩된 칼럼 상의 동적 용량은 미처리된 샘플로 로딩된 칼럼보다 10% 높았다.
실험예 12
이미노아세트산 그룹(Chelex 100)을 함유한 마이크로다공성 스티렌디비닐벤젠 입자들 및 트리스(2-아미노에틸)아민(BioWorks TREN, hi-sub)을 함유한 마크로다공성 아가로오스(agarose) 입자들의 동일 혼합물이 폴리에틸렌 프릿들 사이에 샌드위치되고, 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0으로 평형되었다. IgG(Clone HER2)을 함유한 여과된 포유류 세포 배양 상청액이 어셈블리를 통과하였고, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석되었다. 미처리된 샘플은 약 10% 응집체를 함유하였다. 처리된 샘플은 0.2% 미만의 응집체를 함유하였다. AccuBlue를 이용한 시험을 통해 본 처리에 의해 DNA의 약 95%가 제거되었음이 밝혀졌다.
실험예 13
실험예 12의 입자 혼합물이 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 7.0로 평형되고, IgG(Clone HER2)을 함유하는 여과된 포유류 세포 배양 상청액에 직접 추가되고, 1 시간 동안 배양 및 교반되고, 이어서 멤브레인 여과에 의해 제거되었다. 분석 결과 실험예 12의 대략 반의 응집체 감소 및 DNA 제거가 나타났다. 16 시간 동안 4에서 배양 및 교반되고, 실험예 12의 약 80%의 효율을 나타냈다.
실험예 14
음으로 하전된 금속-킬레이팅 스티렌 디비닐벤젠 입자들(Chelex 100), 양으로 하전된 폴리메타크릴레이트 다공성 입자들(Macroprep Hi-Q), 및 음으로 하전된 폴리메타크릴레이트 다공성 입자들(Macropre Hi-S)의 동등 혼합물이 미리 NaCl로 처리된 IgM-529 샘플에 혼합되어 최종 전도도 20 mS/cm, 1% 알란토인, 및 0.025% 에타크리딘을 나타냈다. 샘플에 대한 입자들의 부피비는 1:20 이었다. 샘플들은 10 분, 20 분, 40 분 및 60 분에 취출되고, 입자들은 마이크로여과에 의해 제거되었다. 도 1은 모든 시간 위치에서 고분자량 응집체의 극적인 감소를 보여주고 있으나, 모든 응집체에 대해 시간에 따라 점진적으로 감소가 커지며, 호스트 세포 단백질 오염물의 실질적 감소가 함께 수반된다. 후속 분석들은 응집체 및 호스트 단백질 양자의 감소는 샘플로부터의 크로마틴 잔여물 감소의 결합을 반영한 것으로 나타났다. 에타크리딘 역시 모든 시점에서 샘플로부터 제거되었다.
실험예 15
도 2a 및 도 2b는 실험예 7에서와 같이 NaCl, 알란토인 및 에타크리딘으로 처리되고, 이어서 실험예 7에서와 동일한 배지 혼합물로 처리되며, 그러나 샘플을 혼합 배지가 입자 보유에 적절한 좁은 메쉬를 갖는 부직 고분자 리테이너들 사이에 샌드위치된 장치를 통과시킨 IgM-84 처리의 전/후에서의 크기 배제 크로마토그래피 프로파일을 도시하고 있다. HMW 응집체는 대부분의 작은 응집체와 함께 완전히 제거되었다. 아래 표 1은 DNA 및 히스톤(histone)이 초기에 IgG 부분들과 모든 응집체 부분들, 및 모든 단백질-함유 부분들에 걸쳐 분포됨을 나타낸다.
| ElT, min | [IgM] | DNA size | [DNA] | [His] | 254:280 |
| 9 | 0.31 | bld | 10 | 0.13 | 1.31 |
| 10 | 0.09 | bld | 10 | 0.11 | 1.30 |
| 11 | 0.42 | bld | 10 | 0.13 | 1.03 |
| 12 | 0.68 | (150-1000) | 12 | 0.13 | 0.98 |
| 13 | 20.29 | bld | 44 | 0.21 | 0.49 |
| 14 | 21.08 | (660) | 236 | 0.76 | 0.89 |
| 15 | 2.33 | 445/(660) | 459 | 1.87 | 0.97 |
| 16 | 0.30 | 316/445 | 435 | 0.82 | 1.59 |
| 17 | 0.51 | 316 | 796 | 1.09 | 1.45 |
| 18 | 0.38 | 155/316 | 314 | 0.96 | 1.60 |
| 19 | 0.31 | 90/155 | 339 | 0.33 | 1.40 |
| 20 | 0.09 | 90 | 684 | 0.86 | 1.56 |
| 21 | bld | 58 | 123 | 1.33 | 0.90 |
| 22 | bld | bld | 23 | 0.54 | 1.21 |
| 23 | bld | bld | 13 | bld | 3.67 |
| 24 | bld | bld | 3 | bld | 15.86 |
(ElT: 용출 시간(elution time), minutes. [IgM]: micrograms/mL 단위의 농도. DNA size: 염기 쌍(base pairs, bp). 괄호안의 값들은 이온 교환 실험에서 측정된 DNA로부터 얻어짐. [DNA] ng/mL 단위 농도. [His]: 총 히스톤 농도, micrograms/mL. bld: 검출 한계 아래(below limit of detection))
실험예 16
표 1은 또한 DNA의 크기 분포를 나타내며, 이는 일부 응집체 군집이 DNA 및 히스톤에 부가하여 다양한 수의 뉴클레오좀을 함유한 뉴클레오좀 어레이를 포함한다는 예상치 못한 발견을 유도하였다. 이러한 처리로부터의 IgM 회수는 98% 이었다.
실험예 17
도 3은 항-HER2 모노클로날 IgG 항체의 실험예 16과 동일한 공정 전/후 크기 배제 크로마토그래피 프로파일을 도시하고 있다. 그 결과는 동일하나, 최초 세포 배양 상청액 내의 항체 농도가 약 10배 높기 때문에 실험예 8의 정도보다 적어도 부분적으로 향상되었다.
실험예 18
1 L의 세포 배양 수확물이 1% 알란토인 및 0.025% 에타크리딘 첨가에 의해 처리되고, 15분간 배양/교반되고, 이어서 세포들 및 다른 미립자들이 원심분리에 의해 제거되었다. 상청액은 이미노디아세트산(Chelex 100)으로 치환된 스티렌 디비닐벤젠 입자들, TREN(BioWorks TREN, hi-sub)으로 치환된 아가로오스 입자들, 및 부틸 잔기(Macroprep T-butyl)로 치환된 아크릴레이트 입자들의 동등 비율을 함유하는 어셈블리를 조합 부피 50mL, 2.6 x 10 cm의 사이즈, 25 mL/min의 유량으로 통과하였다. 12%를 초과하는 초기 응집체 함량이 0.1% 미만으로 감소되었다. 과량의 에타크리딘이 제거되었다. 호스트 단백질 오염물은 240,000 ppm에서 142,0000 ppm으로 60% 감소하였다. DNA는 qPCR에 의해 측정되어 6 로그(log) 로 감소되었다. 항체 회수는 99%이었다. 탁함(turbidity)는 2.0 NTU (nephelometric turbidity units)이었다. 분석 SEC는 극단의 소수성 세포 배양 배지 첨가물을 나타내는 것으로 해석되는 2 극단-지연 용출을 나타냈다.
실험예 19
1 L의 세포 배양 수확물이 1% 알란토인 및 0.025% 에타크리딘 첨가에 의해 처리되고, 15 분간 배양/교반되고, 이후 세포들 및 다른 미립자들은 원심분리에 의해 제거되었다. 상청액은 이미노디아세트산(Chelex 100)으로 치환된 스티렌 디비닐벤젠 입자들, 아미노 그룹들(Dowex AG1x8)로 치환된 스티렌 디비닐벤젠 입자들, 및 부틸 잔기들(Macroprep T-butyl)로 치환된 아크릴레이트 입자들의 동등 비율을 함유하는 어셈블리를 조합 부피 50mL, 2.6 x 10 cm의 사이즈, 25 mL/min의 유량으로 통과하였다. 12%를 초과하는 초기 응집체 함량이 0.1% 미만으로 감소되었다. 항체 회수는 95% 이었다. 다른 결과들은 실험예 18과 동일하였다.
실험예 20
1 L의 세포 배양 수확물이 1% 알란토인 및 0.025% 에타크리딘 첨가에 의해 처리되고, 15 분간 배양/교반되고, 이후 세포들 및 다른 미립자들은 원심분리에 의해 제거되었다. 상청액은 이미노디아세트산(Chelex 100)으로 치환된 스티렌 디비닐벤젠 입자들, 아미노 그룹들(Dowex AG1x2)로 치환된 스티렌 디비닐벤젠 입자들, 및 TREN(BioWorks TREN, hi-sub)으로 치환된 아가로오스 입자들의 동등 비율을 함유하는 어셈블리를 조합 부피 50mL, 2.6 x 10 cm의 사이즈, 25 mL/min의 유량으로 통과하였다. 12%를 초과하는 초기 응집체 함량이 0.1% 미만으로 감소되었다. 항체 회수는 95% 이었다. 분석 SEC는 실험예 18에서 관찰된 극단-지연 용출 성분의 부존재를 나타냈다. 다른 결과들은 실험예 18과 동일하였다.
실험예 21
Dowex AG1x2의 비율을 반으로 줄이고, 동일한 축적양의 T-butyl를 첨가한 것을 제외하고는 실험예 20의 실험을 반복하여 Chelex, BioWorks TREN, Dowex, 및 T-butyl의 2:2:1:1 혼합물을 생성하였다. 항체 회수는 98%이었으며, SEC는 지연-용출 성분의 제거를 나타냈다. 이러한 예는 실험예 18-20과 조합되어, 표면 화학 및 이의 비율의 선택이 조절되어 타겟 특정 오염물 또는 오염물 클래스들에 대한 특정 샘플의 수용 방법을 부각시킨다.
실험예 22
Escherichia.coli 내에 생성된 Fab 절편 1 L가 수크로오스로 삼투 충격에 의해 회수되고, 이어서 여과되어 셀 잔해물들을 제거하고, 1% 알란토인 및 0.025% 에타크리딘과 조합되고, 폴리에틸렌 프릿들 사이에 샌드위치된 Macroprep Hi-S(음전하성) 및 Macroprep Hi-Q(양전하성)의 동등 혼합물 50 mL 상으로 통과되기 전에 15분간 배양/교반되었다. 칼럼 내의 조건은 20 mM 소듐 포스페이트, 150 mM NaCl, pH 6.7이었다. 샘플 전도도 및 pH는 동일한 조건으로 조절되었다. DNA는 AccuBlue에 의해 측정되어 99%로 감소되었다. 호스트 단백질은 ELISA에 의해 측정되어 약 65%로 감소되었다. Fab 회수는 97%이었으며, 가공된 샘플은 광학적으로 클리어했다.
당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면, 다양한 범위의 세포들, 세포 배양 제형들, 생성물 성질 및 발현 레벨, 및 수확시 상대적인 세포 사멸 조건에서, 임의의 주어진 세포 배양 배지 내에서 생성된, 그리고 특정 세포 사멸 범위에서 수확된 임의의 단백질을 가장 잘 수용하기 위해 특정 타입의 입자들, 이의 상대 부피, 및 특정 조건이 개별 베이스 상에서 실험적으로 개발될 필요가 있음을 이해할 것이다. 또한, 본 출원에 제공된 실험예들 및 가이드라인들에 기반하여 물질들 및 조건들의 최적 조합을 확인하기 위한 실험들은 당업자의 이해 범위 안에 있음이 분명하다.
사용 후에, 고체 하전 물질들은 선택적으로 폐기되거나 재생될 수 있다.
본 발명은 다양한 정제 방법들과 조합되어 바람직한 정제 레벨을 구현할 수 있다. 비제한적인 예들은 단백질 A 및 다른 형태의 친화도 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화 금속 친화도 크로마토그래피 및 추가적인 혼합 모드의 크로마토그래피 방법들과 같은 항체 정제를 위해 널리 사용되는 방법들을 포함한다. 다양한 방법들의 적절한 조건들을 개발하고 이들을 본 출원에 개시된 발명과 통합하여 특정 항체의 필요한 정제를 구현하는 것은 당업자의 이해 범위 안에 있다.
인용되는 모든 참조문헌들은 참조로서 전체로 병합되며, 각 개별 공개 문헌 또는 특허 또는 특허 출원들은 특정적으로, 개별적으로 참조로 전체로서 병합되는 것으로 지시된다. 참조로서 병합된 공개문헌, 특허 또는 특허출원이 본 출원에 포함된 개시사항과 모순되는 경우, 본 출원이 모순된 사항을 대체하는 것으로 의도된다.
성분들의 양, 크로마토그래피 조건들, 명세서 및 청구항에 사용된 모든 숫자들은 용어 "약"에 의해 조절되는 것으로 이해된다. 따라서, 반대로 기재되지 않는 한, 본 출원에 제시된 수치 변수들은 대략적으로 본 발명에 의해 획득되는 원하는 성능에 의존하며 변화할 수 있다.
본 발명의 다양한 변형 및 조절예들이 당업자에게 명확하게 이해되는 바와 같이 이의 사상 및 범위에서 벗어나지 않고 수행될 수 있다. 본 출원에 설명된 특정 실시예들은 예로서 제시된 것이며, 제한적인 것으로 해석되지 않는다. 명세서 및 실시예들은 단지 예시적인 것으로 간주되며, 본 발명의 진정한 범위 및 사상은 하기의 청구항들에 의해 나타나는 것으로 의도된다.
Claims (100)
- 원하는 단백질을 함유하는 샘플의 응집체 함량을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은,
(i) 음전하 표면을 갖는 제1 고체 기질인 제1 성분을 제공하는 단계, 상기 제1 성분의 표면의 음전하성은 이미노디아세틱 산(iminodiacetic acid), 에틸렌 글리콜(아미노에틸에테르)디아세틱 산, 니트릴로아세틱 산, 아스파르트 산, 및 글루탐산으로 구성된 그룹으로부터의 잔기에 의해 부분적으로 부여된다:
(ii) 양전하 표면을 갖는 제2 고체 기질인 제2 성분을 제공하는 단계, 상기 제2 성분의 표면의 양전하성은 부분적으로 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜트아민, 폴리프로필렌이민 테트라아민, PAMAM 덴드리머(에틸렌디아민 코어), 및 데페록사민(deferoxamine)으로 구성된 그룹에서 선택된 잔기에 의해 부분적으로 부여된다;
(iii) 상기 샘플을 상기 제1 및 제2 성분들에 접촉시키는 단계, 상기 제1 및 제2 기질들은 복수의 입자들로 제공되어 다공성 멤브레인 사이에 샌드위치되거나, 결정 프릿(frits) 사이에 샌드위치되거나, 혹은 부직포 혹은 비정질 섬유 필터들 사이에 샌드위치되고, 상기 제1 및 제2 성분들은 상기 샘플이 실질적으로 상기 원하는 단백질이 상기 제1 및 제2 성분들에 결합하는 것을 방지하는 동작 조건하에서 두 성분들에 동시에 접촉하도록 구성되며; 및
(iv) 감소된 응집체 함량으로 상기 원하는 단백질을 함유하는 수득된 샘플을 상기 제1 및 제2 성분들로부터 분리시키는 단계를 포함하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들은 상기 샘플에 접촉시키는 단계 이전에 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플을 상기 제1 기질에 접촉시키는 단계 이전에, 상기 샘플이 혼합 화학 성질의 가용성 유기 다가 양이온과 접촉되고, 상기 혼합 화학 성질의 유기 다가 양이온은 에타크리딘(ethacridine), 9-아미노아크리딘(아미나크린(aminacrine)), 3,6 아크리딘디아민(프로플라빈(proflavin)), 아크리소르신(acrisorcin), 아크리잔(페나크리단(phenacridane)), 아크리딘 오렌지, 퀴나크린(quinacrine), 아크리사이드(acricide), 아크리돈(acridone), 아크리딘-9-카르복실산, 아크라닐(1-[(6-클로로-2-메톡시-9-아크리디닐)아미노]-3-(디에틸아미노)-2-프로판올 디하이드로클로라이드), 페노사프라닌(phenosafranin), 페녹사진(phenoxazine), 페노티아진(phenothiazine), 아크리플라빈 (3,6-디아미노-10-메틸아크리디늄, 클로라이드 및 3,6-아크리딘이디아민), 폴리에틸렌이민, 클로르헥시딘(chlorhexidine), 및 폴리-아미노산으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, (iv) 단계에서, 혼합 화학 성질을 갖는 상기 유기 다가 양이온이 상기 샘플로부터 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 제2 기질 혹은 양자의 미립자들은 비-기공성인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 기질, 상기 제2 기질 혹은 양자의 미립자들은 다공성인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 다공성 입자의 평균 기공 사이즈는 10nm 및 100nm 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 입자들은 다공성 멤브레인들 사이에 샌드위치되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 입자들은 부직포 혹은 비정질 섬유 필터들 사이에 샌드위치되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 입자들은 결정 프릿(frits) 사이에 샌드위치되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 입자들은 망상의 고분자 네트워크 내에 내장되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 20 mS/cm 내지 100 mS/cm 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 20 mS/cm 내지 40 mS/cm 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플의 전도도는 20 mS/cm 내지 30 mS/cm 사이인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 응집체는 상기 원하는 단백질의 호모-응집체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 원하는 단백질의 호모-응집체는 실질적으로 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 응집체는 상기 원하는 단백질 및 오염물의 헤테로-응집체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 헤테로-응집체는 상기 원하는 단백질과 실질적으로 동일한 하이드로다이나믹 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 오염물은 핵산, 뉴클레오티드, 내독소, 금속 이온, 단백질, 지질 또는 세포 배양 배지 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 원하는 단백질 및 오염물의 헤테로-응집체는 실질적으로 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 원하는 단백질은 항체 혹은 항체 절편인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 원하는 단백질은 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 원하는 단백질은 응고 인자(clotting factor)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 응고 인자는 Factor VIII인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 원하는 단백질은 성장 호르몬인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 샘플은 세포 배양 수확물, 세포 배양 상청액, 세포 배양으로부터 유래된 항체-함유 용액, 또는 단백질 정제의 이전 단계로부터의 항체-함유 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 세포 배양은 포유류 세포, 박테리아 세포 또는 이스트 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플은 단백질 정제의 이전 단계로부터의 항체-함유 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 샘플은 크로마토그래피 칼럼으로부터의 용리액(eluate)인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들을 통해 제조물을 플로잉(flowing)함으로써 상기 제1 및 제2 성분들과 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 성분의 표면의 음전하성은 부분적으로 이미노디아세틱 산(iminodiacetic acid), 에틸렌 글리콜(아미노에틸에테르)디아세틱 산, 및 니트릴로아세틱 산으로 구성된 그룹으로부터 선택된 잔기에 의해 부분적으로 부여되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 성분의 표면의 양전하성은 부분적으로 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜트아민, 및 폴리프로필렌이민 테트라아민으로 구성된 그룹에서 선택된 잔기에 의해 부분적으로 부여되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 성분 표면의 음전하성은 이미노디아세틱 산에 의해 부분적으로 부여되며, 상기 제2 성분 표면의 양전하성은 트리스(2-아미노에틸)아민에 의해 부분적으로 부여되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 성분은 금속 친화성 관능성을 보유한 표면-결합 화학 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제2 성분의 양전하 표면은 금속 친화성 관능성을 보유한 표면-결합 화학 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 혹은 제2 기질은 금속 친화성 관능성을 보유한 제2 화학 잔기를 포함하며, 상기 제2 화학 잔기는 상기 성분들의 단백질 제조물의 단백질과의 수소 결합, 소수성 상호작용, 또는 pi-pi 결합에 참여하는 능력을 향상시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제34항 또는 제36항에 있어서, 금속 친화성 관능성을 보유한 상기 표면-결합 화학 잔기는 멀티덴데이트(multidentate) 금속 킬레이트 잔기인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 에타크리딘(ethacridine), 9-아미노아크리딘(아미나크린(aminacrine)), 3,6 아크리딘디아민(프로플라빈(proflavin)), 아크리딘 오렌지, 아크리딘-9-카르복실산, 폴리에틸렌이민, 및 클로르헥시딘(chlorhexidine)으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제38항에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 에타크리딘, 폴리에틸렌이민 혹은 클로르헥시딘 또는 이의 염인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제39항에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 에타크리딘 혹은 이의 염인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 0.01% 및 0.05% 사이의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 0.01% 미만의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 0.005% 미만의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 0.001% 미만의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 혼합 화학 성질의 상기 유기 다가 양이온은 0.020 및 0.025% 사이의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에, 폴리에틸렌이민, 폴리알릴아민, 에타크리딘, 및 클로르헥시딘 및 이의 염들로 구성된 그룹으로부터 선택된 2개의 유기 다가 양이온으로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 1% 미만의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 0.01% 및 0.05% 사이의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 0.01% 미만의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 0.005% 미만의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 0.001% 미만의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에 샘플 처리에 사용되는 상기 유기 다가 양이온은 0.020 및 0.025% 사이의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에, 비이온성 유기 고분자, 유기 용매, 계면활성제 및 우레이드(ureides)로 구성된 그룹으로부터 선택된 가용성 유기 조절제와 추가적으로 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 샘플은 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에, 추가적으로 항바이러스 제제와 접촉되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 비-다가(non-multivalent) 유기 양이온인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 메틸렌 블루 및 트리(n-부틸) 포스페이트로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 1% (w/v) 미만의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제54항에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 0.1% (w/v) 미만의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 0.01% (w/v) 미만의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제58항에 있어서, 상기 항바이러스 제제는 0.001% (w/v) 미만의 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 성분들과 상기 샘플을 접촉시키는 단계 이전에, 상기 샘플을 상기 샘플 내에서 과포화 되는 양의 우레이드와 접촉시키는 단계, 및 상기 샘플의 고체 혹은 비용해 부분으로부터 상기 원하는 단백질을 함유하는 상청액을 분리시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제61항에 있어서, 상기 우레이드는 우레아, 요산, 히단토인(hydantoin), 알란토인(allantoin), 알클록사(alcloxa), 알디옥사(aldioxa), 헤모칸(hemocane), 우레이도히단토인(ureidohydantoin), 5-우레이도히단토인, 글리옥실우레이드(glyoxylureide), 글리옥실산 디우레이드, 2,5-디옥소-4-이미다졸리디닐 우레아, 및 퓨린(purines)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 우레이드는 알란토인인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제62항에 있어서, 상기 우레이드는 요산인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 유기 조절제는 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 폴리부틸렌 글리콜로 구성된 그룹에서 선택된 비이온성 유기 고분자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제65항에 있어서, 상기 비이온성 유기 고분자는 500 D 이하의 평균 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 유기 조절제는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 디메틸설폭사이드, 에탄올, 이소프로판올 및 페녹시에탄올로 구성된 그룹에서 선택된 유기 용매인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 유기 조절제는 적어도 1% (w/v) 의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 유기 조절제는 Tween, triton, CHAPS, CHAPSO 및 옥틸 글루코시드(octyl glucoside)로 구성된 그룹에서 선택된 계면활성제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제69항에 있어서, 상기 계면활성제는 1% (w/v) 이하의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제69항에 있어서, 상기 계면활성제는 0.1% (w/v) 이하의 농도로 제공되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제53항에 있어서, 상기 유기 조절제는 부포화(subsaturating) 양으로 제공되는 우레이드인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제72항에 있어서, 상기 우레이드는 우레아, 히단토인, 및 알란토인으로 구성된 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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