KR20160012975A - 단백질 정제 프로세스 - Google Patents

Abstract

표적 단백질을 정제하는 방법은, 혼합물을 형성하도록 적어도 하나의 표적 단백질을 포함하는 세포 배양 수확물 또는 단백질 제제를 8개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계를 구비하고, 혼합물을 형성하도록 상기 혼합물 하나 또는 그 이상의 고체들과 결합시키는 단계를 구비하며, 상기 하나 또는 그 이상의 고체들은 양이온성 작용기, 금속 결합 작용기 또는 이들 모두를 포함하고, 상기 금속 결합 작용기는 (1) 폴리아민, (2) 이민, (3) N-헤테로사이클, (4) 아미노산, (5) N-하이드록시아미드, (6) 아릴아민, 및 이들의 결합들로부터 선택되는 질소를 함유하는 모이어티를 포함하며, 상기 혼합물을 상기 하나 또는 그 이상의 고체들과 접촉시킨 후에 상기 표적 단백질을 포함하는 용액을 제공하도록 고체 물질을 분리시키는 단계를 구비한다.

Description

단백질 정제 프로세스{PROTEIN PURIFICATION PROCESS}

여기에 개시되는 실시예들은 IgG 및 IgM 항체들과 같은 항체들을 포함하는 단백질들을 정제하기 위한 방법들에 관한 것이다.

단백질들의 정제는 통상적으로 세포들 및 잔해들이 제거되는 정화 단계로 시작되므로, 남아 있는 상청액은 그렇지 않으면 이들의 존재를 방해할 수 있는 방법들에 의해 처리될 수 있다, 이들의 제거는 공통적으로 원심분리 및 여과와 같은 물리적인 방법들을 수반한다. 이러한 단계는 때때로 음이온 교환 능력들을 갖는 여과 입자들의 사용, 또는 항체를 함유하는 수확물에 대한 음이온 교환 입자들 혹은 가용성 폴리머들의 직접적인 첨가를 수반한다(Gagnon, P.의 "Purification Tools for Monoclonal Antibodies"(Validated Biosystems, Tucson, 1996); Kuczewski, M. 등의 "Biopharm Int."(23(3), (2010) 20-25); Kuczewski, M. 등의 "Biotechnol. J."(6 (2011) 56-65)).

알란토인(allantoin), 가용성의 유기 양이온들 및 혼합된 입자들로의 물리적으로 정화된 세포 배양 수확물들의 이차적인 처리는 기재되어 있다(Gan, H. 등의 "J. Chromatogr. A"(1291 (2013) 33-40)). 이러한 접근은 특히 죽은 세포들에 의해 배출되는 크로마틴(chromatin)의 함량 및 크로마틴과 관련된 응집체들의 레벨들을 감소시켰지만, 세 크로마토그래피 단계들이 원하는 순도를 얻기 위해 후속하여 요구되었다. 알란토인은 처방전 없이 살 수 있는 건강관리 제품들에 널리 사용되는 FDA-승인된 소염제이다. 이는 분명하게 수소 결합을 통해 IgG의 용액을 포함하여 단백질 용액들로부터 엔도톡신(endotoxin)을 제거하는 것으로 알려져 있다(Vagenende 등의 "ACS. Appl. Mater. Interfaces"(22 (2013) 4472-4478); Vagenende 등의 "J. Chromatogr. A"(1310 (2013) 15-20)).

카프릴릭산(caprylic acid)(옥탄산(octanoic acid))으로의 오염물 공통 침전에 의한 IgG 항체들의 부분 정제는 기술되어 있다(Chantuin, A. 등의 "Arch. Biochem. Biophys."(89 (1960) 218-220); McKinney, M. 등의 "J. Immunol. Met."(96 (1987) 271-278)). 상기 지방산은 모든 단백질들에 결합되지만, 특히 산성의 비IgG 오염물들을 침전시키는 경향이 있다(Gagnon의 앞서의 문헌; Morais, V. 등의 "Biotechnol. Appl. Biochem."(59 (2012) 50-54)). 카프릴릭산 농도, pH, 염 농도, 온도와 같은 기본적인 변수들 및 상기 가용성 IgG 제제로부터 남은 카프릴릭산을 제거하기 위한 후속하는 크로마토그래피 단계에 대한 요구를 포함하여 세포 배양 수확물들에 대한 적용을 위한 메커니즘과 프로세스는 개발 가이드라인들은 나타나 있다(Gagnon의 앞서의 문헌). 상기 기술은 다른 수단들에 의한 후속하는 정제를 위한 원료 샘플들을 제조하는 것으로 가장 흔히 기재지만(Gagnon의 앞서의 문헌; Y. Yigsaw 등의 "Improving upstream feed stock to downstream operations"(2008, Recovery of Biologics Conference XIII, Quebec); Arunakumari, A 등의 미국 특허 출원 공개 제2012/0101262호(A1)), 또한 단백질 A 친화 크로마토그래피에 의한 항체 포집을 수반하는 연마 단계로서 적용되어 왔다(Y. Brodsky 등의 "Biotechnol. Bioeng."(109 (2012) 2589-2598)).

본 발명은 IgG 및 IgM 항체들과 같은 항체들을 포함하는 단백질들을 정제하기 위한 방법들을 제공한다.

일부 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은 표적 단백질(target protein)을 정제하는 방법들에 관련되며, 상기 방법들은, 혼합물을 형성하도록 세포 배양 수확물(cell culture harvest)을 7개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 혼합물을 하나 또는 그 이상의 고체 또는 가용성 물질들과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 고체 또는 가용성 물질들은 양이온성 작용기(functional group) 및 금속 결합 작용기를 포함하고, 상기 금속 결합 작용기는 (1) 폴리아민(polyamine), (2) 이민(imine), (3) N-헤테로사이클(heterocycle), (4) 아미노산, (5) N-하이드록시아미드(hydroxyamide), (6) 아릴아민(arylamine), 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질소를 함유하는 모이어티(moiety)를 포함하며, 상기 혼합물을 상기 하나 또는 그 이상의 정전기적으로 대전된 고체들과 접촉시킨 후에 상기 표적 단백질을 포함하는 용액을 제공하도록 고체 물질들을 분리시키는 단계를 포함한다. 상기 처리된 액체는 선택적으로 원하는 경우에 다른 정제 방법들에 의해 처리되기 전에 양성 전하들을 포함하는 내부 접촉 표면을 갖는 장치를 통해 더 치리될 수 있다.

일부 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은, 혼합물을 형성하도록 세포 배양 수확물을 7개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계, 상기 혼합물을 알란토인(allantoin)과 접촉시키는 단계, 그리고 상기 혼합물을 알란토인과 접촉시킨 후에 상기 표적 단백질을 포함하는 용액을 제공하도록 고체 물질들을 분리시키는 단계를 포함하는 표적 단백질을 정제하기 위한 방법들과 관련된다.

일부 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은 항체를 정제하는 방법들과 관련되며, 상기 방법들은 혼합물을 형성하도록 세포 배양 수확물을 7개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계를 포함하고, 상기 혼합물을 하나 또는 그 이상의 고체 또는 가용성 물질들과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 고체 또는 가용성 물질들은 양이온성 작용기 및 금속 결합 작용기를 포함하고, 상기 금속 결합 작용기는 (1) 폴리아민, (2) 이민, (3) N-헤테로사이클, (4) 아미노산, (5) N-하이드록시아민, (6) 아릴아민, 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질소를 함유하는 모이어티를 포함하며, 상기 혼합물을 상기 하나 또는 그 이상의 정전기적으로 대전된 고체들과 접촉시킨 후에 상기 항체를 포함하는 용액들 제공하도록 고체 물질들을 분리시키는 단계를 포함한다. 상기 처리된 액체는 선택적으로 원하는 경우에 다른 정제 방법들에 의해 처리되기 전에 양성 전하들을 구현하는 내부 접촉 표면을 갖는 장치를 통해 더 치리될 수 있다.

일부 측면들에 있어서, 여기에 개시되는 실시예들은, 혼합물을 형성하도록 세포 배양 수확물을 7개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계, 상기 혼합물을 알란토인과 접촉시키는 단계, 그리고 상기 혼합물을 알란토인과 접촉시킨 후에 상기 항체를 포함하는 용액을 제공하도록 고체 물질들을 분리시키는 단계를 포함하는 항체를 정제하기 위한 방법들과 관련된다.

서로에 대해 화학적으로 길항적인 물질들의 결합이 상기 물질들의 어떤 하나에 개별적으로 의존하는 정제 방법들보다 높은 레벨의 순도 및 낮은 레벨의 탁도(turbidity)에서 항체들을 포함하여 표적 단백질들(target proteins)을 제공하는 예기치 않은 효과를 가지는 점이 발견되었다. 길항적인 물질들의 결합들은 통상적으로 각각의 다른 것들의 개별적인 효과들을 상쇄시키고 좋지 못한 단백질 정제, 낮은 단백질 회수 또는 이들 모두를 가져오는 것으로 예상될 수 있다. 대신에, 본 발명의 실시예들은 제공되는 개별적인 성분들의 임의의 것의 능력을 실질적으로 초과하는 단백질 순도 및 회수의 레벨들을 구현하도록 물질들이 상승 작용으로 작동하는 범위 내에서 정해진 창들을 제공한다. 이들 관찰들은 특히 IgG 및 IgM 항체들과 같은 항체들에 적용 가능하다. 또한, 실험 결과들은 상기 결합 내의 각각의 성분들의 반응도 곡선들이 개별적으로 사용되는 때에 이들의 반응도 곡선들과 구분되는 점을 나타낸다. 이는 여기에 개시되는 실시예들의 유용성이 상기 알려진 성질들 또는 개별적인 성분들의 적용들에 의해 예상될 수 없었던 점을 강조한다. 상기 결합되는 성분들은, 7개, 또는 8개, 또는 9개, 또는 10개의 탄소 원자들을 함유하는 포화 지방산들, 또는 하나의 이중 결합을 갖는 6개 또는 7개, 또는 8개, 또는 9개의 탄소 원자들을 함유하는 불포화 지방산들, 그리고 양성 전하를 지니는 가용성 및/또는 고체 물질들을 포함할 수 있다. 이들은 금속 결합 작용기를 포함하는 하나 또는 그 이상의 고체 또는 가용성 물질들을 더 포함할 수 있다. 이들은 알란토인을 더 포함할 수 있다. 여기에 개시되는 방법에 있어서, 상기 물질들은 항체의 종들과 같은 표적 단백질을 함유하는 액체 제제 내에서 결합되며, 적절한 기간의 배양 후, IgG 항체들의 경우에, 약 90% 내지 약 95%의 평균 회수율 및 5NTU(바탁 탁도 단위) 이하의 탁도로 99% 또는 그 이상까지 숙주 세포 오염물들이 없는 항체를 포함하는 용액을 제공하도록 고체들이 제거된다.

실험 데이터는 상기 성분들 사이의 상호 길항적인 상호작용들이 여기에 개시되는 방법들에 채용되는 점을 입증한다. 예를 들면, 지방산과 같은 양이온성(전기양성(electropositive)) 성분 및 음이온성(전기음성(electronegative)) 성분은 서로에 대해 끌림을 가지는 것으로 이해되며, 이들의 상호작용은 세포 배양 수확물 내에서와 같이 각 하나가 항체 제제의 다른 성분들과 상호 작용하는 능력을 감소시키려는 경향이 있어야 한다. 이는 항체 경쇄들(light chains)과 같은 특정한 오염물들이 하나의 비율에서 성분들의 결합에 의해 제거되지만, 양이온성 성분의 비율이 증가될 경우에 상기 항체를 함유하는 액체 내에 다시 출현하는 것을 보여주는 데이터에 의해 나타난다. 특정한 일 예에 있어서, 이러한 점은 침전물 내의 오염물에 결합되는 지방산이 상기 오염물에 대한 경우보다 양이온성 고체에 강하게 이끌리므로, 상기 양이온성 고체의 양이 증가될 때, 상기 지방산이 상기 고체로 전달되며, 상기 침전물로부터 상기 오염물을 해리시키고, 상기 항체 제제를 재오염시키기 때문에 발생되는 것으로 여겨진다. 상호 길항 작용(mutual antagonism)의 다른 예에 있어서, 결정성 알란토인은 유사한 방식으로 첨가되는 지방산들에 작용하는 높은 가능성을 나타내는 세포 배양 수확물 내에서 상기 지방산들의 99% 이상을 결합시키는 것으로 실험적으로 나타났었다. 이는 비항체 오염물들을 침전시키는 목적을 위해 항체를 함유하는 세포 배양 수확물에 첨가되는 지방산들의 유효성을 감소시키는 것으로 예상되어야 한다. 대조적으로, 본 발명의 이러한 측면은 과학 문헌에서 최적으로 보고되었던 레벨들의 반보다 적은 농도들에서 지방산들의 효과적인 사용에 기여한다. 이론에 의해 제한되지 않고, 수소 결합을 통해 분해되지 않은 알란토인과 복합되는 지방산들이 이들의 본래 전하, 소수성 및 오염물들을 결합시키는 능력을 보존하지만, 분해되지 않은 알란토인의 물리적인 밀도는 침강에 의한 이들의 제거를 향상시킬 수 있다. 상호 길항 작용의 다른 예에 있어서, 지방산들 및 양이온성 킬레이트화 고체들의 혼합물에 대한 지방산들에 대해 불활성이 되어야 하는 음이온성 킬레이트화(chelating) 고체들의 첨가는 양이온성 고체들 및 지방산들의 사전의 길항적 결합에 의해 성공적으로 제거되었던 상기 항체 용액으로 오염물들을 다시 방출시킨다.

상호 길항 작용의 다른 예에 있어서, 소수성 상호작용들을 약화시키고 이에 따라 이들의 효과들을 구현하는 지방산들의 능력을 방해하는 것으로 예상될 수 있는 매우 낮은 농도의 비이온성 계면활성제들의 첨가가 놀랍게도 유리(free) 경쇄 오염물들을 제거하는 효율성을 향상시키지만, 보다 큰 양들은 산성 비항체 단백질의 제거를 상쇄한다. 놀라운 예인 다른 실시예에 있어서, 지방산들의 전하와 소수성 효과들을 방해해야 하는 낮은 레벨들의 양이온성 계면활성제들은 산성의 비항체 단백질들의 제거 및 이중 또는 삼중의 응집체(aggregate) 제거를 위한 결합의 능력을 대략 두 배로 만들지만, 보다 높은 농도들은 반대의 효과들을 가진다. 이들 예들은 정상적으로 길항적인 성분들이 적절하게 균형을 이룬 비율들로 결합될 때, 이들은 길항제들의 부존재에서는 제거되지 않는 오염물들을 제거하는 것이 가능한 창들을 생성할 수 있는 점을 강조한다. 길항제들에 의해 제공되는 향상은 개시된 방법들의 전반적인 정제 성과가 일반적으로 이용 가능한 항체 정제 방법을 최고도로 수행하는 것으로 간주되는 단백질 A 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)의 능력들을 초과하는 많은 경우들에서 매우 실질적이다.

또한, 금속 이온들과 결합하는 능력을 갖는 기능화된(functionalized) 고체 물질들의 포함이 처리된 항체의 보다 높은 순도 및 보다 낮은 응집체 함량에 기여하는 점이 발견되었다. 가용성 킬레이트화제들(chelating agents)은 놀랍게도 이러한 이점을 생성하는 데 실패하였다. 어떠한 이론에 제한되지 않고, 이러한 효과는 금속 이온들과의 상호작용에 의해 유도되는 항체의 소수성 및 정전기성 불균일성을 감소시키는 효과로 금속 이온들을 항체의 표면으로부터 고체-결합 금속 친화 리간드로 우선적인 전달에 의하거나, 오염시키는 단백질들에 동일한 효과를 가지고 이에 따라 이들을 개시된 방법들 보다 빠르게 반응하게 하는 이들의 화학적 행동을 변경시킴에 의해 조정될 수 있다.

더욱이, 알란토인(allantoin)의 포함이 특히 미립자들(particulates)을 제거하는 지방산 침전의 능력을 향상시키는 점이 발견되었다. 이론에 의해 제한되지 않고, 알란토인의 효과들은 바이러스들을 포함하여 극히 작은 입자들을 포함하는 큰 분자 집합체들이 보다 큰 알란토인 결정들에 결합되는 수소 결합을 통해 조정될 수 있는 것으로 여겨진다. 이의 입방 ㎝ 당 1.45g의 상대적으로 높은 밀도로 인해, 알란토인 결정들은 연관된 물질들의 신속한 중력 침강을 증진시키고, 원심분리에 의한 이들의 침강을 향상시킨다. 알란토인 결정들은 또한 지방산-오염물 침전물들의 물리적인 구성을 통상적인 끈끈한 슬러지로부터 액체의 통과를 가능하게 하고 여과 효율을 향상시키는 보다 케이크와 같은 밀도로 변경시킨다. 수성 용액에 첨가되는 상기 알란토인의 일부는 약 36mM의 최대까지 분해되며, 단백질들과 지방산들의 소수성 상호작용들을 약화시키는 것으로 여겨진다. 분해된 알란토인은 고체들의 제거 후에 상기 항체를 함유하는 용액 내에 남는 것으로 이해된다. 이들 특징들은 환영받지만, 이들은 실험 데이터가 알란토인이 세포 배양 수확물들로부터 99.7%의 지방산들을 결합시키는 것을 나타내기 때문에 역설적인 것을 나타낸다. 이러한 시사들로 인하여, 알란토인의 비율은 조심스럽게 제어되어야 한다. 정해진 적용을 위한 적절한 비율은 대체로 1%(w/v)-2%(w/v)로 시작되는 간단한 실험에 의해 결정된다.

또한, 여기에 개시되는 방법들이 예기치 않게 7개, 또는 9개, 또는 10개의 탄소 원자들을 갖는 포화 지방산들이 카프릴릭산(caprylic acid)을 대신하게 하는 점이 발견되었다. 에난트(enanthic)(헵탄(heptanoic))산은 7개의 탄소들을 함유한다. 펠라곤(pelargonic)(노난(nonanoic))산은 9개의 탄소들을 함유한다. 카프릭(capric)(데칸(decanoic))산은 10개의 탄소들을 함유한다. 심지어 보다 놀랍게는, 6개, 또는 7개, 또는 8개 또는 9개의 탄소 원자들 및 1개의 이중 결합을 갖는 불포화 지방산들이 효과적이다. 항체 정제를 위해 종래 기술에서는 무시되었던 옥탄산 이외의 종들에도 불구하고, 실험 데이터는 비록 항체 회수를 감소시키는 높은 위험성이 있지만, 보다 많은 소수성 지방산들이 카프릴릭산보다 항체 응집체들 및 조각들을 보다 효율적으로 제거하는 점을 보여준다.

실험 데이터는 여기에 개시되는 방법들이, A) 카프릴릭산 단독의 처리보다 미립자들의 10-폴드(fold) 이상의 효과적인 제거를 구현할 수 있고, 단지 카프릴릭산만으로 구현되는 20NTU 또는 그 이상에 대하여 약 2NTU의 탁도를 구현할 수 있으며(Brodsky 등의 앞서의 문헌); B) IgG 순도를 99% 이상까지, 보통은 99.9% 이상까지 증가시킬 수 있고; C) 응집체 함량을 1% 또는 그 이하까지, 통상적으로는 0.5% 이하까지 및 흔히 0.05% 이하까지 감소시킬 수 있으며; D) 항체 연관 조각들의 함량을 1% 또는 그 이하까지 감소시킬 수 있고; E) DNA, 엔도톡신 및 바이러스의 제거를 향상시킬 수 있으며; F) IgG의 90%-95%의 회수를 지원할 수 있고; F) 이와 같은 정제가 상기 세포들이 내부에서 성장되는 바이오리액터(bioreactor) 내에서도 구현될 수 있게 하여, 프로세스 효율을 증가시킬 수 있는 점을 나타낸다. 이들 측정들의 일부에 대한 개별적인 결과들이 특정 예들에서 지방산들과의 전통적인 오염물 공동 침전에 의해 구현될 수 있지만, 이들의 모두가 여기에 개시되는 방법들에 의해 구현되는 바와 같이 단일의 동작이지는 않은 점에 유의해야 할 것이다.

실험 데이터는 여기에 개시되는 방법들이 특히 그렇지 않게 이용될 수 있거나 항체들을 추가적으로 정제하는 전통적인 분별 방법들을 방해하는 오염물들을 제거하는 놀라운 발견을 증명한다. 상기 방법들은 한외여과(ultrafiltration)와 같은 저기능의 분별 방법들, 또는 염들에 의한 침전, 또는 비이온성 유기 폴리머들에 의한 침전이 그렇지 않으면 단백질 A 친화 크로마토그래피와 같은 고기능의 분별 방법들만으로 이용 가능한 정제의 레벨들을 구현하게 할 수 있다. 예를 들면, 한외여과 또는 황산암모늄(ammonium sulfate) 침전이 수반되고, 음이온 교환 크로마토그래피가 수반되는 개시되는 방법들로의 초기 정제는, 숙주 단백질들을 이하까지 감소시키고, 응집체들을 0.05% 이하까지 감소시킨다. 특히 놀랍게도, 여기에 개시되는 방법들은 고기능의 분별 방법들에 이들이 통상적으로 구현할 수 있는 경우보다 수백 배 큰 순도를 구현하는 능력을 부여한다. 예를 들면, 단백질 A 친화 크로마토그래피가 통상적으로 숙주 단백질 오염을 약 500ppm 내지 2,000ppm의 범위까지 감소시키는 경우, 개시되는 방법들을 수반되어 수행되는 단백질 A 크로마토그래피는 숙주 단백질 오염을 이하까지 감소시킨다.

여기에 개시되는 방법들의 많은 측면들의 통합을 예시하는 예시적인 일 실시예에 있어서, 알란토인은 항체를 함유하는 세포 배양 수확물에 1%(w/v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 첨가되며, 0.2%(v:v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 카프릭산(capric acid)의 첨가가 후속된다. 혼합물은 카프릭산과 오염물들의 상호작용에 의해 침전물이 형성되고, 분해되지 않은 알란토인 결정들로 개재되는 동안인 2시간 동안 배양된다. 이러한 단계는 5%(v:v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 TREN으로 기능화되고, 4시간의 기간 동안 배양된 폴리머 입자들의 첨가를 수반한다. TREN(트리스(tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine))은 폴리머 입자들 또는 다른 기능화된 고체들 상에 고정될 수 있는 전기양성의 금속 결합 화합물이다. 이와 같은 물질들은 고정 금속 친화 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography)를 수행하기 위한 목적으로 시판된다. 혼합이 종료되고, 카프릭산-오염물 침전물들, 잔류 카프릭산, 분해되지 않은 알란토인 및 상기 TREN 입자들로 구성되는 고체들은 임의의 편리한 방법에 의해 제거된다. 관련 실시예에 있어서, 상기 TREN 입자들은 선택적인 양성으로 대전된 금속 결합 종들로 기능화된 입자들로 대체된다. 관련 실시예에 있어서, 상기 양성으로 대전된 금속 결합 입자들은 일부는 양성으로 대전된 아민계 이온 교환체(ion exchanger)로 기능화되고, 일부는 음성으로 대전된 금속 결합 종들로 기능화된 입자들의 결합으로 대체된다. 관련 실시예에 있어서, 금속 친화도가 결핍된 양성으로 대전된 입자들만이 존재할 수 있다. 관련 실시예에 있어서, 다른 화학 종들로 기능화된 입자들이 존재할 수 있다. 관련 실시예에 있어서, 상기 실질적으로 고체들이 없는 항체를 함유하는 액체는 전기양성의 심층 필터(depth filter) 또는 상기 샘플이 전기양성 또는 다른 기능화된 표면과 접촉되는 다른 장치를 통과시킴에 의해 더 처리되며, 이는 상기 샘플로부터 잔류하는 지방산 또는 다른 가용성 비항체 종들을 포집하는 추가적인 이점을 제공할 수 있다.

여기에 개시되는 방법들의 다양한 측면들의 통합을 예시하는 다른 예시적인 실시예에 있어서, 알란토인은 세포 배양 수확물에 2%(w/v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 첨가되며, 0.2%(v:v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 카프릭산의 첨가가 후속된다. 혼합물은 카프릭산과 오염물들의 상호작용에 의해 침전물이 형성되고, 분해되지 않은 알란토인 결정들로 개재되는 동안인 2시간 동안 배양된다. 상기 혼합물은 이후에 분해되지 않은 알란토인으로 개재된 카프릭산-오염물 침전물들을 유지하는 적어도 하나의 기능화된 고체를 포함하지만 액체의 통과는 허용하는 장치와 접촉된다.

여기에 개시되는 방법들의 다양한 측면들의 통합을 예시하는 다른 예시적인 실시예에 있어서, 알란토인은 세포 배양 수확물에 1%(w/v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 첨가되고, 0.2%(v:v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 카프릭산의 첨가가 후속된다. 혼합물은 카프릭산과 오염물들의 상호작용에 의해 침전물이 형성되고, 분해되지 않은 알란토인 결정들로 개재되는 동안인 2시간 동안 배양된다. 분해되지 않은 알란토인 개재되는 카프릭산-오염물 침전물들은 임의의 편리한 방법에 의해 제거되며, 액체는 적어도 하나의 기능화된 표면을 포함하는 장치와 접촉된다.

여기에 개시되는 방법들의 다양한 측면들의 통합을 예시하는 다른 예시적인 실시예에 있어서, 알란토인은 세포 배양 수확물에 1%(w/v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 첨가되며, 0.2%(v:v)의 최종 농도를 생성하는 양으로 카프릭산의 첨가가 후속된다. 혼합물은 카프릭산과 오염물들의 상호작용에 의해 침전물이 형성되고, 분해되지 않은 알란토인 결정들로 개재되는 동안인 2시간 동안 배양된다. 이러한 단계는 기능화된 폴리머성 입자들의 첨가 및 4시간 동안의 배양이 수반된다. 상기 고체들은 적어도 하나의 기능화된 표면을 포함하는 장치를 이용하여 제거된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 처리된 액체는 더 처리되기 전에 양성으로 대전된 접촉 표면들을 포함하는 심층 필터를 통과한다.

일부 실시예들에 있어서, 약 0.2%의 카프릭산이 약 0.3%의 농도에서 펠라곤산(pelargonic acid), 또는 약 0.4%의 농도에서 카프릴릭산, 또는 약 0.6%의 농도에서 에난트산(enanthic acid)으로 대체될 수 있다. 이는 상기 지방산의 농도 및 소수성에 대한 오염물 제거 및 항체 회수의 의존성을 드러낸다. 실험 데이터는 상기 소수성 지방산이 많을수록, 우수한 결과를 구현하기 위해 필요한 농도가 낮아지고, 또한 IgG 항체 회수를 절충하는 농도가 낮아지는 점을 드러낸다. 절대 및 상대 농도가 하나의 항체로부터 다른 항체까지 변화될 수는 점과 특정한 지방산들의 전술한 농도가 이에 따라 변화될 수 있지만, 이와 같은 값들이 숙련자에게 사전에 특성화되지 않은 항체의 정제를 평가할 때에 편리한 출발점을 위한 가이드를 제공하도록 제공되는 점이 이해될 것이다.

일부 실시예들에 있어서, 약 0.2%의 카프릴릭산이 보다 높은 농도들에서 보다 효과적인 응집체 제거를 지원할 수 있다. 그러나, 약 0.4%에서, 유리(free) 항체 경쇄, 경쇄 이합체들(dimers) 및 다른 조각 형태들뿐만 아니라 다른 오염물들의 보다 효과적인 제거가 구현될 수 있다. 따라서, 해당 기술 분야의 숙련자라면 잠재적인 후속되는 분별 방법들의 내용에서 그 효과들을 고려하여 주어진 지방산의 농도를 최적화하는 값을 인지할 것이다. 여기에 개시되는 방법들이 응집체들의 제거를 위해 특히 적합한 방법을 수반하는 경우, 항체 조각들을 제거하기 위해 상기 지방산 농도를 최적화하는 것이 유익할 수 있다. 여기에 개시되는 방법들이 조각들의 제거를 위해 특히 적합한 방법을 수반하는 경우, 응집체들을 제거하기 위해 상기 지방산 농도를 최적화하는 것이 유익할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 상기 지방산 이후에 점가될 수 있다. 또 다른 관련 실시예에 있어서, 알란토인은 상기 침전물이 형성된 후까지는 첨가되지 않는다. 또 다른 실시예에 있어서, 알란토인은 상기 침전물이 제거된 후까지는 첨가되지 않는다. 이와 같은 실시예의 특정한 하나의 예에 있어서, 알란토인 및 기능화된 고체들은 상기 침전물이 제거된 후에 첨가될 수 있으며, 후속하여 제2의 고체-제거 단계에서 함께 제거된다. 일부 실시예들에 있어서, 알란토인이 생략된다.

일부 실시예들에 있어서, 비이온성 계면활성제 또는 쌍성이온성 계면활성제가 그 임계 미셀 농도(critical micelle concentration) 아래의 농도에서 상기 혼합물에 첨가될 수 있다. 실험 데이터는 이러한 점이 항체 조각들의 제거를 향상시키는 반면, 비록 항체 회수를 증가시키는 상쇄하는 이점을 가지지만 상기 임계 미셀 농도 이상의 계면활성제 농도들이 항체 조각들의 제거를 억제하는 것을 나타낸다. 일부 실시예들에 있어서, 비이온성 또는 쌍성이온성 계면활성제의 실질적으로 보다 높은 농도는 산성의 숙주 세포 단백질들의 감소를 실질적으로 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 양이온성 계면활성제의 낮은 농도는 숙주 단백질들 및 DNA의 제거를 실질적으로 향상시킬 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제는 세틸트리메틸임모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide: CTAB)로도 알려진 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(hexadecyltrimethylammonium bromide); 또는 도데실트리메틸암모늄 브로마이드(dodecyltrimethylammonium bromide); 또는 데실트리메틸암모늄 브로마이드(decyltrimethylammonium bromide); 또는 미리스틸트리메틸암모늄 브로마이드(myristyltrimethylammonium bromide); 또는 트리메틸옥타데실암모늄 브로마이드(trimethyloctadecylammonium bromide), 또는 일차, 이차 또는 삼차 아미노기와 같은 다른 양으로 대전된 모이어티(moiety)를 갖는 변이체들, 또는 보다 많거나 보다 적은 탄소 원자들을 갖는 변이체들이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 0.01%의 CTAB는 제거되는 숙주 단백질의 양을 두 배로 할 수 있는 반면, 0.05%의 CTAB는 5의 인자만큼 제거 효율을 감소시킬 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 지방산에 앞서 세포 배양 수확물에 대한 낮은 농도의 양이온성 계면활성제를 첨가하는 것은, 일부 경우들에서 순서가 반전될 때에 제거되는 응집체의 양에 대해의 2 또는 3의 인자로 실질적으로 응집체 제거를 향상시킬 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제는 약 0.01%의 농도에서 세틸트리메틸암모늄 브로마이드이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제는 에타크리딘(ethacridine), 메틸렌 블루(methylene blue), 클로르헥시딘(chlorhexidine) 및 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride)와 같은 다른 양이온성 유기 화합물들로 치환될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 전기양성의 유기 화합물의 최적의 양이 각 항체에 대해 개별적으로 결정되도록 요구될 것이고, 상기 지방산의 정체와 농도가 고려되는 점이 이해될 것이다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 화학적으로 기능화된 고체들은 적어도 하나의 질소를 함유하는 화합물을 포함할 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 질소를 함유하는 화합물은 금속 이온들에 결합하는 능력을 구현할 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 질소를 함유하는 화합물은 음성으로 대전될 수 있고, 다른 것들 중에서 이미노디아세트산(iminodiacetic acid), 니트릴로아세트산(nitriloacetic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아스파르트산(aspartic acid) 및 아미노페닐 포스페이트(aminophenyl phosphate)를 포함하는 그룹으로부터 하나 또는 그 이상의 화합물들을 포함할 수 있다. 이와 같은 다른 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 질소를 함유하는 화합물은 양성으로 대전될 수 있고, 다른 것들 중에서 TREN, 디에틸렌트리아민(diethylenetriamine), 트리에틸렌테트라아민(triethylenetetramine), 테트라에틸렌펜타민(tetraethylenepentamine), 폴리프로필렌이민테트라아민(polypropyleniminetetramine), PAMAM 덴드라이머(dendrimer)(에틸렌디아민 코어ethylenediamine core)), 데페록사민(deferoxamine)(데스페리옥사민(desferioxamine)), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 히스타민(histamine) 그리고 이미다졸(imidazole)을 포함하는 그룹으로부터 하나 또는 그 이상의 화합물들을 포함할 수 있다. 이와 같은 다른 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 질소를 함유하는 화합물은 지방족 탄화수소(aliphatic hydrocarbon), 방향족 탄화수소(and aromatic hydrocarbon), 카르보닐기(carbonyl group), 카르복실기(carboxyl group), 술포기(sulfo group), 포스포기(phospho group) 또는 히드록실기(hydroxyl group)를 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 하나 또는 그 이상의 화학적으로 기능화된 고체들은 동일하거나 유사한 모이어티들로 화학적으로 기능화된 가용성 실체들로 대체될 수 있거나 결합될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 화학적으로 기능화된 고체들 또는 가용성 실체들은 각기 다른 질소를 함유하는 화합물을 구현하는 하나 이상의 유형의 기재인 고체 또는 가용성 실체를 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 질소를 함유하는 화합물을 갖는 적어도 하나의 화학적으로 기능화된 고체 또는 가용성 실체는 질소 원자가 결핍된 다른 화학적으로 기능화된 고체 또는 가용성 실체와 결합될 수 있으며, 여기서 상기 질소가 결핍된 화합물은, 지방족 탄화수소, 방향족 탄화수소, 카르보닐기, 카르복실기, 술포기, 포스포기 또는 히드록실기를 포함하는 그룹으로부터 하나 또는 그 이상의 작용기들을 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 고체들은 미세여과, 심층 여과(depth filtration) 및 원심분리를 포함하는 그룹으로부터의 하나 또는 그 이상의 처리들을 포함하여 여과 또는 침강을 포함하는 임의의 편리한 수단에 의해 항체를 함유하는 용액으로부터 분리될 수 있으며, 여기서 심층 여과는 실질적으로 불활성인 여과 매체, 또는 화학적으로 기능화되거나, 화학적으로 기능화된 물질들과 결합된 여과 매체로 수행될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 불용성 물질들의 상기 하나 또는 그 이상의 종들은 액체의 통과는 지원하지만 고체들의 통과는 허용하지 않는 적어도 하나의 장치 내에 구성될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 약 0.6% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 1% 내지 약 10%, 또는 약 1% 내지 약 2%의 부피 대 무게 농도로 첨가될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 생략될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 약 0.6%까지의 영이 아닌(non-zero) 양으로 존재할 수 있다. 알란토인의 존재가 1%와 같이 상기 첨가된 알란토인의 일부가 분해되지 않는 충분한 농도에 있는 것이 바람직하지만, 방법들은 알란토인의 부존재에서, 또는 상기 알란토인의 실질적으로 모두가 가용성인 농도에서의 알란토인의 존재에서 적절한 결과들을 산출할 수 있다. 실험 데이터는 2%, 3%, 4%, 5%, 10% 또는 그 이상과 같은 알란토인의 보다 큰 비율들이 응집체들의 보다 효과적인 감소를 지원하지만, 보통이지만 측정할 수 있게 항체 회수를 감소시키는 점을 나타낸다. 실험 데이터는 또한 알란토인이 바이러스 및 엔도톡신의 레벨들을 3로그(log) 또는 그 이상으로 독립적으로 감소시킬 수 있고, 상당히 깨끗한(2.0NTU) 상청액들(supernatants)을 통상적으로 생성할 수 있는 점을 드러내며, 이들 모든 문헌들은 알란토인이 채용될 때에 여기에 개시되는 방법들에 바람직하게 기여하는 점을 나타낸다. 어떠한 특정한 이론에 제한되지 않고, 큰 생물학적 종들 및 집합체들과의 알란토인의 작동 메커니즘은 왜 그 효율이 pH 또는 전도도에서의 실질적인 변화들에 의해 작게 영향을 받는 지를 부분적으로 설명할 수 있는 수소 결합을 주로 수반하는 것이 나타난다. 이는 또한 왜 알란토인에 결합되는 지방산들이 오염물들과 이들의 상호 작용성을 유지하는 가를 설명할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 CH₃(CH₂)_nCOOH의 일반 구조식을 갖는 하나 또는 그 이상의 종들을 포함할 수 있으며, 여기서 n은 4부터 12까지의 정수이다. 일부 실시예들에 있어서, n은 5부터 8까지의 정수이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 에난트산(헵탄산)이 될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 카프릴릭산(옥탄산)이 될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 펠라곤산(노난산)이 될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 카프릭산(데칸산)이 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 지방산의 하나 이상의 종들이 채용될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 나트륨 염, 예를 들면, 카푸릴산 나트륨(sodium caprylate)과 같은 염의 형태로 첨가될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산의 지방 부분은 탄소 원자들의 선형의 "직선(straight)" 사슬로 구성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산의 지방 부분은 일차 6-탄소 사슬의 숫자 2 위치에 2-탄소 사슬을 함유하여 전체 8개의 탄소 원자들을 생성하는 2-에틸헥산산(ethylhexanoic acid)과 같이 분기된 사슬로 구성될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 0.05% 내지 5%, 또는 0.1% 내지 2%, 또는 0.2% 내지 0.5%, 또는 중간 값의 농도에서 존재할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 이중 결합을 포함할 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 이중 결합은 탄소 사슬 내의 임의의 위치에 있을 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산 사슬은 6개, 또는 7개, 또는 8개, 또는 9개의 탄소 원자들을 함유할 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 지방산은 말단 이중 결합을 갖는 노넨산이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 염의 형태로 첨가될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 0.05% 내지 5%, 또는 0.1% 내지 2%, 또는 0.2% 내지 0.5%, 또는 중간값의 농도에서 존재할 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 0.4% 내지 0.6%의 8-노넨산이 0.4%의 카프릴릭산보다 우수한 결과들을 제공한다.

지방산의 하나 이상의 종들을 채용하는 일부 실시예들에 있어서, 상기 종들은 소수성들의 범위, 예를 들면, 헵탄산 및 데칸산의 결합, 또는 카프릴릭산 및 노난산의 결합, 또는 보다 크거나 적은 소수성의 지방산들을 잠재적으로 포함하는 다른 결합들을 포괄하도록 선택될 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 각각의 지방산들의 비율들은 10:1, 5:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10, 또는 이들 사이의 중간 범위, 혹은 이들 바깥의 다른 비율들이 될 수 있다. 이와 같은 일부 결합들에 있어서, 작동 용액에 첨가되는 지방산 종들의 전체 양은 영이 아닌 양으로부터 0.01%까지, 0.01% 내지 0.1%, 0.1% 내지 1%, 1% 내지 5%, 0.2% 내지 0.4%, 또는 중간 범위나 값의 범위 내에 있을 수 있다.

지방산의 하나 이상의 종들을 채용하는 일부 실시예들에 있어서, 상기 종들의 전체 숫자는 임의의 비율 및 활용성을 제공하는 실험 결과들에 의해 나타나는 임의의 전체 양으로 3, 또는 4, 또는 그 이상을 포함할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 혼합물을 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 고체들에 노출시키기 전에, 상기 지방산은 5분 내지 360분, 또는 15분 내지 240분, 또는 60분 내지 120분, 또는 30분 내지 60분 동안, 또는 중간의 간격 동안에 상기 항체 제제 내에서 배양되게 남겨 진다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산이 배양되는 온도는 탄소 사슬 길이가 지방산 용해도에 직접 영향을 미치기 때문에 존재하는 지방산의 가장 큰 종에 의해 영향을 받을 수 있고, 여기서 사슬 길이가 짧을수록 상기 용해도가 높아지며, 사슬 길이가 길수록 온도의 감소와 함께 용해도의 감가 커진다. 따라서, 모든 경우들에서, 약 37℃의 초기 온도가 낮은 온도들에서보다 높은 농도의 지방산을 용매화시킬 것이다. 이는 세포 배양의 종료에 즉시 뒤따르는 수확물(harvest)에 대한 상기 지방산의 직접적인 첨가를 선호한다. 배양은 여전히 바이오리액터 내에서 37℃에서 이어서 계속될 수 있다. 소수성 지방산이 많을수록, 온도에 대해 그 용해도가 더 민감하게 되며, 이에 따라 온도에 대한 기능성이 더 민감해지는 점이 분명해질 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 보다 높은 온도들은 C₁₁, C₁₂, C₁₃, C₁₄, C₁₅, 또는 심지어는 그 이상까지의 지방산의 사용을 가능하게 할 수 있다. 예를 들면, 처리가 약 2℃ 내지 약 8℃에서 수행되는 보다 낮은 온도를 채용하는 일부 실시예들에 있어서, C₈, C₇, C₆, 또는 심지어는 그 이하와 같은 보다 짧은 사슬의 지방산들의 사용이 바람직할 수 있다.

TREN으로 기능화된 고체 또는 가용성 기재를 이용하는 예시적인 일 실시예에 있어서, TREN은 하나의 말단 기에 의해 기재에 공유 결합으로 부착되며, 2개의 일차 아민 질소 원자들, 1개의 이차 아민 질소 원자, 1개의 삼차 아민 질소 원자, 5개의 말단 수소 원자들 그리고 3개의 소수성 에틸 기들(ethyl groups)을 생성한다. 이와 같은 또 다른 실시예들에 있어서, TREN은 두 개의 말단 기들에 의해 기재에 공유 결합으로 부착되며, 1개의 일차 아민 질소 원자, 2개의 이차 아민 질소 원자, 1개의 삼차 아민 질소 원자, 4개의 말단 수소 원자들 그리고 3개의 에틸 기들을 생성한다. 이와 같은 또 다른 실시예들에 있어서, TREN은 세 개의 말단 기들에 의해 기재에 공유 결합으로 부착되며, 3개의 이차 아민 질소 원자들, 1개의 삼차 아민 질소 원자, 3개의 말단 수소 원자들 그리고 3개의 에틸 기들을 생성한다. 일 실시예에 있어서, 공유 결합으로 고정된 TREN은 이들이나 다른 형태들의 임의의 조합이나 서브세트로 존재할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 전기양성 모이어티에 대한 강한 금속 친화 기능성이 존재하지 않을 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 강한 금속 친화 기능성은 전기음성의 화학적으로 반응성인 기와 연관될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 전기음성 기들은 또한 수소 결합 및/또는 소수성 상호작용들에 참가하는 능력을 부여하는 기능성 하위부분들을 포함할 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 전기음성 그룹은 이미노디아세트산, 또는 니트릴로아세트산, 또는 아스파르트산, 또는 글루탐산, 또는 음성으로 대전된 금속 친화 리간드들의 결합이 될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 음성으로 대전된 금속 친화 리간드의 하나 또는 그 이상의 종들이 하나 또는 그 이상의 고체들의 하나의 소집단 상에 있을 수 있는 반면, 금속 친화도가 실질적으로 결핍된 다가의 전기양성 리간드는 하나 또는 그 이상의 고체들의 다른 소집단 상에 있을 수 있다.

일 실시예에 있어서, 쌍성이온성 또는 비이온성 종들을 통해 강한 금속 친화 기능성을 조정하도록 기능화된 하나 또는 그 이상의 고체 또는 가용성 기재들이 존재할 수 있다. 이와 같은 기재들은 전기양성의 금속-결합 종들을 지니는 하나 또는 그 이상의 고체들, 또는 전기음성의 금속-결합 종들을 지니는 하나 또는 그 이상의 기재들, 또는 강한 금속-결합 기능성이 결핍된 전기양성의 다가 리간드들, 또는 강한 금속-결합 기능성이 결핍된 전기음성의 다가 리간드들, 또는 강한 금속-결합 기능성이 결핍된 비이온성이나 쌍성이온성 리간드들, 또는 전술한 것들의 임의의 결합과 함께 존재할 수 있다.

하나 또는 그 이상의 기재들 상의 금속-결합 기능성의 존재가 여기에 개시되는 방법들에 유익할 수 있는 점이 분명해질 것이다. 실험 데이터는 이와 같은 기능성이 금속 친화 기능성이 결핍된 기재들보다 우수한 결과들을 산출하는 것을 나타낸다. 이론에 의해 제한되지 않고, 이러한 효과는, 단백질 표면들에 비특이적으로 결합되는 금속 이온들의 제거, 또는 항체가 단백질, 폴리뉴클레오티드 혹은 다른 종들에도 결합되는 금속 이온을 통한 다른 오염시키는 생물학적 종들에 결합되는 금속-다리-복합체들(metal-bridge-complexes)의 해리, 또는 금속-인지질(metal-phospholipid) 혹은 금속-인지질-지방산의 복합체들로부터의 금속 이온들의 제거, 또는 단백질들과의 지방산들의 반응성의 알려지지 않은 측면들, 또는 전술한 것들의 임의의 결합을 통해 구현되는 단백질 전하 및/또는 소수성 이질성(heterogeneity)의 감소를 통해 조정될 수 있다. 그러나, 실험 데이터는 또한 유용한 결과들이 금속 친화 기능성을 지니는 하나 또는 그 이상의 기재들의 부존재에서 얻어질 수 있는 점을 나타낸다.

하나 또는 그 이상의 기재들이 제공되는 일 실시예에 있어서, 상기 혼합물은 5분 내지 960분, 또는 15분 내지 720분, 또는 30분 내지 480분, 또는 60분 내지 240분, 또는 90분 내지 120분, 또는 중간 간격 동안에 배양될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 배양은 약 37℃, 또는 약 22℃ 내지 약 26℃, 또는 약 2℃ 내지 약 8℃에서 일어날 수 있거나, 막 종료된 세포 배양 수확물에 첨가되고 이후에 일정한 시간 동안 배양을 위해 약 2℃ 내지 약 8℃까지 전송되는 것만의 결과로서 약 37℃에서 시작될 수 있다. 배양 온도는 이들의 용해도의 정도가 알킬 사슬 길이의 함수이기 때문에 채용되는 지방산의 종들에 의하거나, 지방산의 하나 이상의 종들일 경우에 가장 큰 종에 의해 부분적으로 결정될 것이다. 예를 들면, 상기 10-탄소의 카프릭산은 37℃에서 가용성이지만, 약 2도 내지 약 8도에서는 그렇지 않다. 이는 상기 수확물과 함께 초기에 일정 기간 동안 배양될 수 있고, 이후에 상기 불용성의 대전된 다가의 화학적으로 반응성인 기재들의 첨가에 즉시 후속하여 약 2도 내지 약 8도에 놓일 수 있으며, 여기서 상기 카프릭산의 저온 불용성이 오염물들의 제거를 향상시킬 수 있다.

하나 또는 그 이상의 고체 또는 가용성 기재들이 제공되는 일 실시예에 있어서, 지방산-처리된 수확물의 정해진 부피에 첨가되는 기재들의 비율은 간단한 실험에 의해 결정될 수 있다. 현재의 실험 데이터는 약 2%의 부피 비율에서 폴리머 마이크로스페어들 상에 공유결합으로 고정된 TREN이 우수한 결과들을 얻기에 충분한 점을 나타낸다. 일부 경우들에 있어서, 1% 또는 그 이하가 적절할 수 있다. 일부 경우들에 있어서, 2%, 3%, 4% 또는 5% 이상의 비율이 보다 우수한 결과들을 지지할 수 있다. 그러나, 전술한 바와 같이, TREN의 유효성이 높아질수록, 지방산 침전을 간섭하는 정도가 커진다. 실험 데이터는, 예를 들면, 10%의 과잉의 TREN이 일부 경우들에서 오염물들이 상기 항체를 함유하는 용액 내에 다시 나타나는 지방산 침전에 의해 사전에 제거되게 하는 것을 보여준다. 해당 기술 분야의 숙련자라면 기능화된 고체의 가장 효과적인 양은 간단한 실험에 의해 결정될 수 있는 점을 이해할 것이다. 첨가된 기재들의 양이 많아질수록, 물질 비용이 증가하며, 이는 성능과 비용의 가장 바람직한 균형을 제공하는 용액을 선택하는 기회를 발생시킬 것인 점이 동일하게 이해될 것이다.

하나 또는 그 이상의 고체들이 유체들의 통과는 허용하지만 고체들의 통과는 허용하지 않는 장치 내에 구성되는 일 실시예에 있어서, 상기 지방산을 함유하는 샘플의 접촉 시간은 상기 장치를 통과하는 경우에 상기 장치의 크기, 효율 및 구성에 따라 몇 분 또는 몇 초의 양이 될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 여기에 개시되는 방법들은 pH 조정이 필요하지 않을 수 있다. 상기 지방산의 첨가는 상기 수확물의 pH를 충분하게 낮은 레벨까지 감소시킬 수 있고, 상기 하나 또는 그 이상의 고체들에 의한 과잉의 지방산의 후속되는 포집이 상기 pH를 실질적으로 최초의 값으로 회복시킬 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 수확물은 상기 지방산의 첨가 전에 특정 pH 값까지 적정될 수 있으며, 이는 상기 방법에 견실성을 추가할 수 있지만, 잠재적으로 후속되는 방법에 의한 보다 높은 정도의 순도까지 분별되는 상기 샘플을 제조하는 목적을 위하여 상기 방법이 수행된 후에 pH가 다시 조정되는 것이 필요하게 될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 초기 pH는 4 내지 6, 또는 4.5 내지 5.5, 또는 4.75 내지 5.25, 또는 5.1 내지 5.3, 또는 5.2와 같은 중간 값, 또는 다른 중간 값의 범위 내의 값까지 조절될 수 있다. 해당 기술 분야의 숙련자라면 최적의 pH가 항체의 하나의 종으로부터 다른 종까지 및 상기 항체가 체류하는 배지의 조성에 따라 변화될 수 있는 점이 이해될 것이다. 최적의 결과들을 이루도록 채용되는 pH가 여기에 개시되는 방법들의 추가적인 요소들의 기여들로 인하여 지방산 침전만으로 요구되는 경우보다 적정할 수 있는 점이 동일하게 이해될 것이다. 지방산 침전의 전통적인 이용과 연관된 상기 낮은 pH 값들에 대한 노출이 상기 항체에 대한 지속되는 불리한 효과들을 가질 수 있는 범위 내에 있기 때문에, 이는 주목할 만한 고려이다. 이는 개시되는 방법들의 다른 예기치 않은 이점을 강조한다.

일 실시예에 있어서, 여기에 개시되는 방법들은 물로 또는 NaCl이나 다른 염으로와 같이 염 농도의 감소 또는 증가를 통해 전도도를 조절할 필요가 없다. 그렇지만 염 농도는 항체 회수 및 순도에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 상기 방법의 본질적인 특징들로부터 벗어나지 않고 변화들이 연구될 수 있다. 실험 증거는 항체 용해도가 지방산들 또는 다른 첨가제들의 존재와 독립적으로 낮은 전도도 및 낮은 pH의 조건들에서 절충되는 점을 나타낸다. 좋지 못한 항체 용해도는 지방산 침전들과 함께 상당한 항체 손실의 상승된 가능성으로 해석된다. 이는 pH의 감소가 전도도가 감소될 수 있는 정도를 제한할 수 있고, 전도도가 항체의 과도한 손실을 회피하도록 증가되는 점을 제시할 수 있는 것을 의미한다. 주목할 만하게, 여기에 개시되는 방법들의 유효성은 20mS/㎝까지 증가된 전도도에 의해 실질적으로 감소되지 않는다. 전하 상호작용들이 상기 시스템의 선택성의 주요한 부분을 컨트롤하는 것으로 여겨지며, 20mS/㎝가 많은 이와 같은 상호작용들을 중단시키고 모든 이와 같은 상호작용들을 실질적으로 약화시키기에 충분하기 때문에 이는 주목할 만하다. 그러나 결과들이 정제되는 정확한 항체에 따라 변화될 수 있고, 보다 낮은 전도도 값들에서 실험들을 수행하는 값이 존재할 수 있는 점이 이해될 것이다. 전도도를 감소시키는 것은 지방산 및 오염시키는 단백질들의 상호작용에 대한 상기 양이온성 고체들의 간섭을 증가시키는 것으로 나타날 수 있지만, 가용성 오염물들을 결합시키는 양이온성 고체들의 능력을 증가시킴에 의해 향상된 전체적인 결과를 예기치 않게 생성할 수 있다.

기능화된 고체들이 입자들로 제공되는 일 실시예에 있어서, 상기 입자들은 이들을 상기 지방산을 함유하는 수확물에 도입하기 이전에 완충 조건들의 특정한 세트까지 평형화될 수 있다. 일반적인 문제로서, 상기 입자들을 평형화시키는 데 사용되는 완충은 상기 수확물과 대략적으로 동일한 전도도를 가질 수 있지만, 이러한 전도도를 구현하는 염화나트륨의 충분한 농도의 간단한 포함에 의해 구현될 수 있다. 평형 pH는 간단한 실험들로부터의 결과들에 따라 변화될 수 있다. 하나의 방법 단계는 낮은 농도의 적절한 pKa의 완충시키는 물질들로 상기 입자들을 중성의 pH까지 평형화시키는 것이 될 수 있으며, 여기서 상기 평형 완충제의 완충 용량은 상기 수확물을 변경시키기에 실질적으로 불충분하다. 다른 방법 단계는 상기 지방산을 함유하는 수확물의 pH에 가까운 평형 pH를 선택하는 것이 될 수 있으며, 또한 여기서 상기 완충시키는 종들의 농도는 매우 낮으므로, 이러한 경우에 이는 상기 방법의 수행에 후속되는 작동 pH의 중성화를 간섭하지 않는다. 또 다른 방법은 처리 후에 상기 수확물의 원하는 pH에 가까운 평형 pH를 선택하는 것이 될 수 있다. 다른 접근들이 고려될 수 있으며, 실험적으로 가장 잘 평가된다. 해당 기술 분야의 숙련자는 입자 예비-평형화가 보다 조절되고 재현될 수 있는 프로세스를 지원할 수 있는 점과 상기 조건들이 상기 방법의 전체적인 결과들에 영향을 미칠 수 있는 점을 인지할 것이다. 동일한 징표에 의해, 동일한 고려들이 불용성의 대전된 다가의 화학적으로 상호작용성인 모이어티들을 포함하는 유체 접촉 표면들을 갖는 장치의 평형에 적용된다.

여기에 개시되는 방법들이 이와 같은 높은 순도의 IgG 항체들을 제공하는 것으로 주어지면, 보다 높은 정제의 레벨들을 구현하기 위한 상기 항체의 후속되는 처리가 해당 기술 분야에 통상적으로 채용되는 임의의 다른 기술들에 의해 구현될 수 있는 점이 분명해질 것이다. 실험 데이터는 후속되는 심층 여과 단계가 숙주 단백질 오염을 500ppm 이하까지 감소시킬 수 있고 응집체들을 0.05% 이하까지 감소시킬 수 있는 점을 나타낸다. 심층 여과에 후속하여, 접선 유동 여과(tangential flow filtration)에 의한 농축이 숙주 단백질 오염을 50ppm 이하까지 감소시킬 수 있다. 이러한 관점으로부터, 음이온 교환 크로마토그래피 단계는 숙주 단백질 오염을 1ppm 이하까지 감소시킬 수 있다.

이에 따라, 일부 실시예들에서, IgG 항체를 정제하는 방법들이 제공되며, 상기 방법들은, 혼합물을 형성하도록 세포 배양 수확물을 7개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계, 그리고 혼합물을 형성하도록 상기 혼합물을 하나 또는 그 이상의 고체들과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 하나 또는 그 이상의 고체들은 양이온성 작용기(functional group) 및 금속 결합 작용기를 포함하고, 상기 금속 결합 작용기는 (1) 폴리아민, (2) 이민, (3) N-헤테로사이클, (4) 아미노산, (5) N-하이드록시아미드, (6) 아릴아민, 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질소를 함유하는 모이어티를 포함하며, 상기 혼합물을 상기 하나 또는 그 이상의 고체들과 접촉시킨 후에 상기 IgG 항체를 포함하는 용액을 제공하도록 고체 물질들을 분리시키는 단계를 포함한다.

이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 방법들은 상기 세포 배양 수확물을 알란토인과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 알란토인은, (a) 약 0.6%부터 약 30%까지, (b) 약 1%부터 약 10%까지, 그리고 (c) 약 1%부터 약 2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내의 농도로 존재한다. 일부 실시예들에 있어서, 알란토인은 영이 아닌 양으로부터 약 0.6%까지의 범위 내에 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 적어도 양이온성 및/또는 금속 결합 작용기들을 지니는 상기 하나 또는 그 이상의 고체 기재들의 전체 양은 약 0.25%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 20% 또는 이들 사이의 중간 값의 전체 부피의 부피 비율이다. 이러한 수치 결정의 목적을 위하여, 기능화된 고체들만으로 언급되고, 어떠한 분해되지 않은 알란토인을 포함하지 않는 상기 하나 또는 그 이상의 고체들이 상기 방법들에 포함되어야 한다. 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 고체들은 수소 결합, 소수성 상호 작용들, pi-pi 결합, 반 데르 발스 상호작용들, 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 기능성을 포함한다.

가용성의 기능화된 기재들이 채용되는 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 적어도 양이온성 및/또는 금속 결합 작용기들을 지니는 상기 하나 또는 그 이상의 이와 같은 기재들의 전체 양은 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.5%, 1.0%, 2.0%, 또는 이들 사이의 중간 값들의 전체 부피의 부피 비율이다. 일부 실시예들에 있어서, 고체 기재들에 대한 범위는 약 0.5%부터 약 5%까지, 또는 약 1%부터 약 2%까지가 될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 가용성 기재들에 대한 범위는 약 0.01%부터 약 1%까지, 또는 약 0.1%부터 약 0.5%까지가 될 수 있다. 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 가용성 기재들은 수소 결합, 소수성 상호작용, pi-pi 결합, 반 데르 발스 상호작용들 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 기능성을 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산 및 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 고체 또는 가용성 기재들은 단일의 용기 내에 함유된다. 이와 같은 하나 이상의 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산 및/또는 하나 또는 그 이상의 기능화된 고체 또는 가용성 기재들은 세포 배양 생산 프로세스가 수행되었던 바이오리액터에 직접 첨가된다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 고체들은 고체 물질들의 통과는 방지하면서 유체의 통과를 허용하는 장치 내에서 상기 항체를 함유하는 액체로부터 분리된다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 고체 물질들의 통과는 방지하면서 유체의 통과를 허용하는 장치는 다공성 멤브레인, 모놀리스(monolith), 직물 물질(woven material), 비정질 섬유상 물질, 결정성 물질, 거대 그물형 골격상의 수화젤 형태의 물질(hydrogelatinous material), 충전된 입자들의 칼럼, 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 다공성 물질을 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 여기에 개시되는 방법들은 상기 용액을 장치 내에 배치되는 화학적으로 기능화된 고체들과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 세포 배양 수확물을 상기 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계 후에 또는 상기 분리시키는 단계에서 존재하는 고체 물질들은 침강 또는 원심분리를 수반하는 침강에 의해 제거된다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 세포 배양 수확물을 상기 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계 후에 또는 상기 분리시키는 단계에서 존재하는 고체 물질들은 여과에 의해 제거된다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 여과는 멤브레인 여과 또는 심층 여과를 포함한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 멤브레인 여과 또는 심층 여과는 기능화된 필터 멤브레인을 포함한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 작용기는 전기양성이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 적어도 하나의 작용기는 금속 이온들을 결합시킨다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 제1의 접촉시키는 단계는 상기 IgG 항체의 부분적인 정제에 의해 선행된다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 세포 배양 수확물은 세포들을 함유한다. 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 세포 배양 수확물은 세포들을 함유하지 않는다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 CH₃(CH₂)_nCOOH의 일반 구조식을 포함한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 에난트산(헵탄산), 또는 카프릴릭산(옥탄산) , 또는 펠라곤산, 또는 카프릭산(데칸산)을 포함한다. 일부 관련된 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 상기 지방산 사슬의 임의의 위치에서 단일의 이중 결합을 함유할 수 있다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 이중 결합을 함유하는 지방산은 노넨산이다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 지방산은 8-노넨산이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 일차 탄소 사슬은 분기되지 않을 수 있지만, 다른 실시예들에서는 분기될 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 (a) 약 0.05%부터 약 5%까지, (b) 약 0.1%부터 약 1.0%까지, (c) 약 0.2%부터 약 0.4%까지, 그리고 (d) 약 0.1%부터 약 0.2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내의 농도에서 존재한다. 일부 실시예들에 있어서, 노난산은 약 0.25%부터 약 0.50%까지의 범위 내에서 사용될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 노넨산은 약 0.2%부터 0.4%까지의 범위 내에서 사용될 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 양이온성 계면활성제는 (a) 약 0.001%부터 0.1%까지, (b) 약 0.005%부터 0.05%까지, 또는 (c) 약 0.0125%부터 0.025%까지의 농도에서 존재할 수 있다. 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 양이온성 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄 브로마이드가 될 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 소수성의 양이온성 성분은 벤잘코늄 클로라이드(benzalkonium chloride), 또는 클로르헥시딘(chlorhexidine), 또는 알렉시딘(alexidine)과 같은 천연의 방향족이 될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 클로르헥시딘의 농도는 (a) 약 0.001%부터 0.01%까지, (b) 약 0.005%부터 0.05%까지, 또는 (c) 약 0.0075%부터 약 0.0125%까지의 범위 내에 있을 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 고체 또는 가용성 기재들은 음이온성, 양이온성 또는 쌍성이온성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 전하 구성을 포함한다. 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 고체 또는 가용성 기재들은 상기 금속 결합 작용기를 갖는 하나의 종 및 양이온성인 별도의 종을 포함한다. 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 금속 결합 작용기는 양이온성이다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 금속 결합 작용기는 트리스(2-아미노에틸)아민, 디에틸렌트리아민(diethylenetriamine), 트리에틸렌트리아민(triethylenetriamine), 테트라에틸렌펜타민(tetraethylenepentamine), 폴리프로필렌이민테트라아민(polypropyleniminetetramine), 폴리(poly)(아미도아민(amidoamine))(PAMAM) 덴드라이머(dendrimer), 데페록사민(deferoxamine)(데스페리옥사민(desferioxamine)), 아르기닌, 히스티딘, 히스타민, 이미다졸 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 금속 결합 작용기는 화학식 I의 화합물이다.

여기서, 적어도 하나의 R이 선택적으로 링커(inker)를 통한 고체 지지체에 대한 부착의 부위인 조건으로 각 R의 발생률(incidence)은 독립적으로 수소 또는 C₁-C₄ 알킬(alkyl)이고; 각각의 of X, Y 및 Z는 독립적으로 (CH₂)_n이며, 여기서 n은 2부터 6까지의 정수이고, CH₂ 기는 O 또는 NH로 선택적으로 대체된다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 금속 결합 작용기는 양이온성 킬레이트화제인 트리스(2-아미노에틸)아민(TREN)이다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 화학식 I에 따라 임의의 근접한 TREN 유사체가 여기에 개시되는 방법들에 사용될 수 있다. 많은 상업적으로 이용 가능한 화합물들은 화학식 I에 의해 포괄되며, 다른 합성의 설계된 화합물들은 해당 기술 분야의 숙련자에 의해 통상적으로 이용되는 방법들에 의해 쉽게 제조될 수 있다. 예를 들면, 화학식 I의 삼차 아민은 순차적인 환원성 아미노화 반응들(amination reactions)에 의해 일차 아민으로부터 제조될 수 있다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 양성 전하들의 덴드리머층(dendrimeric layer)은, 예를 들면 환원성 아미노화에 의해 존재하는 층을 연속적으로 활성화시키고, 이후에 다가 아미노 종들을 도입하며, 결합되지 않은 과잉물을 세척하여 제거하고, 이후에 상기 표면을 다시 활성화시키는 등을 거쳐 고체 표면상에 구성된다. TREN의 경우에 있어서, 예를 들면, TREN의 최초 층은 상기 멤브레인에 공유결합으로 부착되고, 과잉물은 세척하여 제거한다. 상기 결합된 TREN은 이후에 활성화되며, 활성화제(activation agent)는 제거되고, 전하장의 깊이를 본질적으로 두 배로 만들고 양성으로 대전된 기들의 숫자를 세 배로 만드는 효과로 최초로 고정된 TREN의 출발점들에서 반응성 아미노기들 상에 TREN 분자를 첨가하는 효과로서 새로운 TREN이 도입된다. 결합되지 않은 TREN을 세척하여 제거한 후, 추가적인 층들이 첨가될 수 있다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 많은 시약들과 화학적 방법들이 전하들 또는 다른 상호작용 기들의 개념적으로 동등한 배열을 생성하도록 채용될 수 있는 점을 이해할 것이다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 고체들은 상기 금속 결합 작용기 및 음이온성인 별도의 고체를 포함한다. 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 금속 결합 작용기는 음이온성이다. 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 금속 결합 작용기는, 이미노디아세트산, 니트릴로아세트산, 글루탐산, 아스파르트산, 아미노페닐 포스페이트, 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 음이온성 킬레이트화제는 이미노디아세트산이다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 고체들 또는 가용성 기재들은 양이온성인 하나의 종 및 음이온성이 별도의 종을 포함한다.

일부 실시예들에 있어서, 혼합물을 형성하도록 세포 배양 수확물을을 8개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계, 상기 혼합물을 알란토인과 접촉시키는 단계, 그리고 상기 혼합물을 알란토인과 접촉시키는 단계 후에 상기 IgG 항체를 함유하는 용액을 제공하도록 고체 물질들을 분리시키는 단계를 포함하는 IgG 항체를 정제하기 위한 방법들이 제공된다.

이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법들은 상기 용액을 적어도 하나의 화학적으로 기능화된 고체 또는 가용성 종들과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 적어도 하나의 화학적으로 기능화된 고체 또는 가용성 종들은 트리스(2-아미노에틸)아민을 포함한다.

이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 알란토인은 (a) 약 0.6%부터 약 30%까지, (b) 약 1%부터 약 10%까지, 그리고 (c) 약 1%부터 약 2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내의 농도에서 존재한다. 이전의 실시예들의 하나 또는 그 이상에 있어서, 알란토인은 영이 아닌 양부터 약 0.6%까지의 범위 내에 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 혈청이나 혈장과 같은 천연 기원의 단일클론성 또는 다클론성 IgG 항체들에 적용된다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 Fab, F(ab')₂, 또는 ScFv와 같은 효소나 재조합 기원의 단편 면역글로불린(immunoglobulin) 구성체들에 적용된다.

일부 실시예들에 있어서, 여기에 개시되는 방법들의 임의의 하나의 수행을 가능하게 하는 키트들(kits)이 제공된다.

용어들은 본 발명이 보다 용이하게 이해되도록 정의된다. 추가적인 정의들은 상세한 설명에 전체적으로 설정된다.

"지방산(fatty acid)"은 CH₃(CH₂)_nCOOH의 일반 구조식을 갖는 카르복실기(carboxyl group)로 종료되는 선형의 지방족 사슬로 구성되는 유기 분자를 언급하며, 여기서 n은 적어도 1의 정수이다. 본 방법들을 수행하기 위해 적합한 지방산들에 대하여, "n"은 적어도 4부터 12까지의 정수가 될 수 있다. 방법들을 수행하기 위해 적합한 포화 지방산들의 특정 예들은 특히 에난트(헵탄, C7)산, 카프릴릭(옥탄, C8)산, 펠라곤(노난, C9)산, 그리고 카프릭(데칸, C10)산을 포함한다. 상기 지방산이라는 용어는 또한 하나의 이중 결합, 또는 일차 탄소 사슬을 따라 임의의 위치에 발생될 수 있는 2, 3, 4, 5 등과 같은 보다 큰 숫자의 이중 결합들을 함유하는 불포화 지방산들을 언급할 수 있다.

"알란토인(allantoin)"은 C₄H₆N₄O₃의 일반 구조식 및 2,5-디옥소(dioxo)-4-이미다졸리디닐우레아(imidazolidinylurea)의 명칭인 IUPAC로 요산의 산화에 의해 생성되는 푸린 대사 물질(purine metabolite)을 언급한다.

"TREN" 트리스(tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine)을 언급한다. 이러한 전기양성 화합물은 특히 금속 이온들에 대한 강한 친화도를 구현하는 것으로 알려져 있다. 이는 이들 물질들에 TREN에 의해 조정되는 화학적 특성들을 부여하기 위해 다양한 가용성 및 불용성 물질들에 화학적으로 부착될 수 있다.

"세포 배양(cell culture)" IgG 단일클론 항체들을 생성하는 목적을 위해 본 문에서 액체 배지 내의 세포들의 배양을 언급한다. 이러한 목적을 위해 채용되는 세포들은 공통적으로 중국 햄스터 난소(Chinese hamster ovary: CHO) 세포들을 포함하지만, 다른 포유동물들뿐만 아니라 비포유류의 동물 세포들, 식물들 및 미생물들로부터의 세포형들을 포함할 수 있다. 모든 경우들에 있어서, 상기 액체 배지는 세포 성장을 지원하는 영양소들을 함유한다.

"바이오리액터(bioreactor)"는 내부에서 세포가 제어된 조건들 하에서 성장하는 용기를 언급한다. 상기 용기는, 세포 성장 및 항체 생성을 위한 이상적인 조건들을 유지하기에 필수적인 임계 프로세스 변수들 및 조정들의 모니터링을 허용하는 센서들과 입력들을 구비하는 원하는 항체의 목표 양을 생성하도록 요구되는 숫자의 세포들을 성장시키기 위해 적절한 치수의 스테인리스 스틸 탱크, 또는 다른 물질의 탱크, 또는 라인드(lined) 탱크, 또는 폴리머 백을 포함할 수 있다.

"수확물(harvest)" 또는 "세포 배양 수확물(cell culture harvest)"은 일반적으로 세포 배양 프로세스의 종료에서 바이오리액터의 내용물들을 언급한다. 생성된 IgG 이외에도, 상기 수확물은 초기에는 세포들, 세포의 분비물들 및 죽은 세포들의 방출된 내용물들뿐만 아니라 세포들이 최초로 성장하였던 영양 배지의 내용물들을 함유할 것이다. 이들 비항체 성분들은 상기 항체로부터 제거되는 오염물들을 구성한다. 이는 특히 숙주 단백질 및 DNA를 포함하지만, 또한 바이러스 및 엔도톡신을 포함할 수 있다. 세포 배양 수확물들은 또한 흔히 단편 형태들로 잘못 조립되거나 손상된 형태들을 함유한다.

"정화된 세포 배양 수확물(clarified cell culture harvest)"은 세포들이 제거되었던 수확물을 언급한다. 정화 프로세스는 다만 고체들을 제거하기 위한 원심분리, 또는 정밀여과, 또는 이들 둘의 결합에 해당될 수 있거나, 화학 첨가제들 또는 상기 수확물로부터 가용성 오염물들의 특정 클래스들을 추출하도록 화학적으로 상호작용성인 표면들을 지니는 고체 물질들의 사용을 포함할 수 있다.

"기능화된 고체(functionalized solid)" 또는 "하나 또는 그 이상 고체들(one or more solids)"은 입자; 멤브레인; 모놀리스; 필라멘트 또는 섬유; 비정질, 직물 또는 결정성 프릿(frit); 겔, 또는 임의의 화합물 구성체의 물리적인 형태 혹은 고체들의 보유를 지원하지만 액체가 장치를 통과하는 것은 허용하도록 구성되는 이와 같은 형태들의 하나 또는 그 이상을 구현하는 장치들을 포함하여 이와 같은 물리적인 형태들의 결합으로 화학적으로 상호작용성인 고체를 언급한다. 상기 기능화된이라는 용어 자체는 베이스 물질이 개시되는 방법들의 수행을 가능하게 하는 상호작용성 화학 실체를 지니는 특정 목적을 위해 합성적으로 변경되는 점을 나타내는 것으로 이해된다. 비록 화학적으로 상호작용성인 표면들을 갖는 분해되지 않은 알란토인 결정들이 다양한 실시예들에서 존재할 수 있지만, 그 기능성을 부여하기 위한 천연 물질의 변경이 없기 때문에 알란토인은 "기능화된 고체들"에 의해 의미되는 바의 범주 내에는 포함되지 않는 것으로 이해된다. 동일한 개념적인 관점이 기능화된 가용성 기재들에 적용되며, 이는 기능화된 고체 기재들과 상호 교환적으로 또는 결합되어 이용될 수 있다. 상기 가용성 기재들은, 기능화 이전에, 천연 또는 합성 기원이 될 수 있고, 수 백 달톤(D)부터 100,000D 이상까지의 범위의 크기가 될 수 있다.

"단백질(protein)"은 탄소, 수소, 신소, 질소 및 통상적으로 황을 함유하고, 펩티드 결합들에 의해 연결되는 아미노산들의 하나 또는 그 이상의 사슬들로 주로 구성되는 복합 유기 고분자들의 기의 임의의 하나를 언급한다. 상기 단백질은 천연이나 재조합으로 유래된 것일 수 있다. 단백질들은 글리코실화(glycosylation), 페길레이션(pegylation) 또는 다른 화학 모이어티들(moieties)과의 접합(conjugation)을 통해서와 같이 비아미노산 모이어티들로 변형될 수 있다. 단백질의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 항체들, 응고 인자들, 효소들 그리고 펩티드 호르몬들을 포함한다.

"숙주 오염물(host contaminant)" 또는 "숙주 세포 오염물(host cell contaminant)"은 관심의 대상인 생성물이 성장되는 세포들에 의해 생성되는 생체 분자들을 언급한다. 상기 용어는 숙주 단백질 및 숙주 DNA와 같은 다양한 등급들의 숙주 오염물들을 포함할 수 있다.

"숙주 단백질(host protein)" 또는 "숙주 세포 단백질(host cell protein)" 또는 "HCP"는 관심의 대상인 생성물이 성장되는 세포들에 의해 생성되는 단백질들을 언급한다. 이와 같은 단백질들은 관심의 대상인 생성물로부터 제거되어야하는 하나의 등급의 오염물들을 나타낸다.

"항체(antibody)"는 인간화, 인간, 단일-사슬, 키메라(chimeric), 합성, 재조합, 하이브리드(hybrid), 돌연변이형, 그래프트된(grafted) 및 생체 외에서(in vitro) 생성된 항체들과 같이 천연이나 유전적으로 변형된 형태들을 포함하여 인간 또는 다른 포유동물 세포 주들로부터 유도되는 클래스 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE의 면역글로불린(immunoglobulin)을 언급한다. 상기 항체들은 단일 클론에 의해 생성될 수 있고, 이 경우에 이들은 단일클론성으로 언급되며, 하나 이상의 클론으로부터 생성될 수 있고, 이 경우에 이들은 다클론성으로 언급된다. IgG 항체들은 특히 면역글로불린(immunoglobulin) G로서 언급되는 항체들의 클래스를 언급하며, 니는 또한 서브클래스들의 하나 또는 혼합물로서, 예를 들면 인간에서 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄; 생쥐(mice)에서 IgG₁, IgG_2A, IgG_2B 또는 IgG₃; 혹은 쥐(rat)에서 IgG₁, IgG_2A, IgG_2B, IgG_2C로 존재할 수 있다. 진핵생물 숙주들(eukaryotic hosts) 내에서 자연적으로 또는 재조합으로 생성되는 항체들은 다양한 글리코실화된(glycosylated) 형태들로 존재할 수 있는 반면, 비진핵생물 숙주들 내에서 생성되는 항체들은 다양한 글리코실화된 및 비글리코실화된 형태들로 존재할 수 있다. 항체들이라는 용어는 또한, 이에 한정되는 것은 아니지만 Fab, F(ab')₂, VHH 및 ScFv를 포함하여 효소 기원이거나 단백질 분해(proteolytic) 기원이던지 단편 구성체들을 포함하는 것으로 이해된다.

"엔도톡신(endotoxin)"은 세포 용해(lysis)에 따라 세포로부터 방출되는 그람-음성의(gram-negative) 박테리아의 외막 내에 존재하는 유독성의 열에 안정한 지질다당류(lipopolysaccharide) 물질을 언급한다. 엔도톡신들은 상기 중심 다당류와 연관된 인산염 및 카르복실 잔류물들의 높은 함량으로 인해 일반적으로 산성일 수 있으며. 지질-A 부위의 지방산 함량으로 인해 높은 소수성을 나타낼 수 있다. 엔도톡신들은 수소 결합에 대한 광범위한 기회를 제공할 수 있다.

"폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 사슬 내에 공유 결합으로 결합되는 다중 뉴클레오티드 모노머들로 구성되는 생물 고분자를 언급한다. DNA(데옥시리보핵산) 및 RNA(리보핵산)은 폴리뉴클레오티드들의 예들이다. 폴리뉴클레오티드들은 수소 결합들의 형성에 대한 높은 경향을 가질 수 있다.

"단백질 제제(protein preparation)"는 세포를 함유하는 세포 배양 수확물, (실질적으로)세포가 없는 세포 배양 상청액 또는 정제의 단계로부터 관심의 대상인 단백질을 함유하는 용액과 같이 관심의 대상인 단백질을 함유하는 임의의 수성 또는 대부분의 수성 용액을 언급한다.

"바이러스(virus)" 또는 "비리온(virion)"은 살아있는 숙주들, 주로 박테리아, 식물들 및 동물들의 세포들 내에서만 복제되고, RNA 또는 DNA 코어, 단백질 막 및 보다 복잡한 형태들에서는 둘러싸는 외피(envelope)로 구성되는 한외현미경적(ultramicroscopic)(대략 20㎚ 내지 300㎚의 직경)이고, 대사 작용적으로 불활성인 감염원(infectious agent)을 언급한다.

특정 세포 배양 수확물에 대해 여기에 개시되는 방법들을 주문 제작하는 데 유용한 출발점은 건조 알란토인을 세포들을 함유하거나 세포들이 이미 제거되었던 세포 배양 수확물에 첨가하는 것이며, 여기서 상기 첨가된 알란토인은 1%w/v까지의 양이 된다. 혼합은 상기 첨가 전체에 걸쳐 유지된다. 상기 알란토인의 일부는 분해되지만, 다른 부분은 분해되지 않고 남는다. 물속에서, 약 0.6%가 분해되고, 나머지는 불용성으로 남지만, 상기 알란토인이 다양한 성분들과 상호작용하는 복합 생물학적 시스템들 내에서는, 비율들이 이동될 수 있다. 노난산은 0.3%v/v의 비율까지 첨가될 수 있고, 교반이 계속된다. 지방산 첨가는 알란토인 첨가에 앞서 선택적으로 일어날 수 있거나, 알란토인 첨가와 동시에 일어날 수 있지만, 제시되는 순서는 상기 처리로부터 약간 높은 항체의 회수를 지원하는 것으로 나타난다. 일부 경우들에서 상기 지방산 상의 상기 음성으로 대전된 카르복실기 자체가 상기 pH를 약 5.4까지 감소시키기 때문에 pH를 조정하는 것이 불필요하다. 다른 경우들에 있어서나, 상기 지방산의 염이 이용되는 경우, 그러면 상기 수확물의 pH는 약 pH 5.2까지 감소되어야 한다. 전도도는 조절될 필요가 없다. 혼합은 TREN을 지니는 폴리머 입자들이 도입되는 시점에서 2시간 또는 그 이상까지 유지되며, 여기서 입자들의 비율은 2%v/v부터 5%v/v까지의 범위가 될 수 있다. 2%보다 낮고 5%보다 높은 양들은 덜 효과적인 경향이 있다. 전도도 및 pH는 조정될 필요는 없지만, pH는 상기 TREN 입자들에 의한 나노에이트 이온들(nonanoate ions)의 포집으로 인하여 자발적으로 증가할 것이다. 혼합은 4시간 또는 그 이상까지 계속되며, 이후에 종료된다. 다른 혼합 방법들, 혼합기들 및 혼합 속도들은 효율에 관하여 실질적으로 변화되고, 개시되는 방법들로 얻어지는 결과들의 품질에 직접 영향을 미친다. 이들은 이에 따라 최종 방법을 구체화하기 전에 체계적으로 조사되어야 한다. 혼합 후에, 고체들은 선택적으로 침강하게 되고, 액체는 정밀여과 또는 침강과 같은 임의의 편리한 방법에 의해 정화된다. 상기 정화된 액체는 선택적으로 양성 전하들이 실장된 내부 액체 접촉 표면을 갖는 장치를 통과시켜 더 처리될 수 있다. pH 또는 전도도 조건들의 조정은 이러한 단계에서 요구되지 않는다. 상기 처리된 물질은 탁도, 숙주 세포 단백질들, 항체 응집체들, 항체 조각들, DNA, 히스톤들, 뉴클레오솜들, 바이러스, 엔도톡신, 또는 특정한 정제의 목표에 적절할 수 있는 다른 오염물들의 감소를 위해 평가될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 지방산들은 이들의 산성의 이온성 형태로 상기 수확물에 도입될 수 있다. 산성의 형태로 도입될 때, 상기 지방산 자체가 작동 pH를 적절한 값까지 적정시킬 수 있기 때문에 상기 수확물의 pH를 조정할 필료가 없을 수 있다. pH는 일반적으로 pH 4.0 내지 6.0의 범위로 조절될 수 있지만, 보다 이상적으로는 4.5 내지 5.5, 또는 4.8 내지 5.2, 또는 5.2의 범위로 조절될 수 있다. 보다 산성인 조건들은 일반적으로 보다 우수한 오염물 제거를 지원하지만, 덜 산성인 조건들은 일반적으로 보다 높은 IgG 회수를 선호한다. 일반적인 문제로서, 개시된 방법들은 전통적으로 수행되는 바와 같은 지방산 침전보다 높은 pH 값들에서 우수한 결과들을 지지한다. 극도의 pH의 방지가 상기 항체에 부여되는 화학적 스트레스를 감소시킬 수 있고, 기능성 항체 및/또는 개선된 항체 안정성의 보다 높은 회복의 형태로 이차적인 이점들을 제공한 수 있는 점이 인식될 것이다. 따라서, 대조적인 과정들이 통상적으로 지방산들로 침전을 수행하기 위한 종래에 수행됨에도 불구하고, 통상적인 문제로 4.5 내지 5.5와 같은 중간의 pH 값들을 산정하는 것이 일반적으로 유익하다. 사전의 pH 적정이 엄격히 요구되지 않은 때라도, 이는 상기 방법의 재현성을 증가시킬 수 있기 때문에 신중할 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 지방산들은 칼륨 양이온과 함께와 같이 카프릴산 나트륨(sodium caprylate), 또는 펠라곤산 나트륨(sodium pelargonate), 또는 카프르산 나트륨(sodium caprate), 또는 카프릴산 칼륨(potassium caprylate), 또는 펠라곤산염(pelargonate), 또는 카프르산염(caprate), 또는 다른 염과 같은 염들로서 함께 도입될 수 있다. 염으로 도입될 때, 상기 염의 제제가 성분 이온들의 적정시키는 용량을 효과적으로 유지하기 때문에 원하는 작동 pH를 구현하기 위해 적절한 적정제(titrating agent)의 첨가에 의해 상기 작동 용액의 pH를 조정할 필요가 없을 것이다. 적합한 적정제들은 목표하는 작동 pH 또는 부근까지 미리 적정된 산들이나 농축된 완충제들로 구성될 수 있다. 예비 비교들은 유리 산(free acid) 형태들이 지방산 염들보다 효과적으로 오염물 제거를 지원하는 점을 나타낸다.

실험 데이터는, 일부 실시예들에서, 카프릭산이 특히 응집체들의 제거에 대해 카프릴릭산보다 효과적이지만, 그 10개의 원자 탄소 사슬에 기인하는 명백하게 이의 보다 높은 소수성으로 인해, 이는 또한 때때로 주위 온도에서 상대적으로 미소한 변화들로부터 보다 낮은 회수 또는 일정하지 않은 결과들을 가져오는 보다 높은 항체 손실들의 위험성을 수반하는 점을 나타낸다. 현재까지의 실험적인 발견들은 카프릭산의 효과적인 농도 범위가유사한 함량에서 카프릴릭산의 농도의 대략 반인 점을 나타낸다. 이는 실험들을 시작하는 하나의 적절한 농도로서 0.2%의 카프릭산을 나타낸다. 다른 실험 데이터는 펠라곤산(노난산, 9-탄소)이 카프릴릭산 또는 카프릭산보다 소수성 및 전하의 바람직한 균형을 제공하며, 보다 효과적인 숙주 단백질 감소를 지원하는 점을 나타낸다. 다른 실험 결과들은 상기 지방산 사슬의 말단들에서 단일의 이중 결합을 갖는 9-탄소 지방산인 8-노넨산이 또한 카프릴릭산 또는 카프릭산보다 우수한 결과들을 지원하는 점을 나타낸다.

일부 실시예들에 있어서, 기능화된 고체들 또한 상기 수확물에 대한 이들의 천가 전에 특정한 pH 값까지 평형화될 수 있다. 이와 같은 조정은 상기 목표 pH에서 상기 고체들을 약 100mM의 NaCl을 함유하는 완충제로 세척함에 의해 이루어질 수 있다. 상기 평형화된 고체들은 이후에 과잉의 액체를 제거하도록 흡입될 수 있으므로, 이들은 촉촉한 케이크로서 상기 수확물에 첨가될 수 있다. 실험은 정해진 정제를 위한 가장 적절한 평형 pH 및 전도도를 결정하는 데 유익할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 고체들은 첫 번째 실험에서 20mM의 아세트산염(acetate), 100mM의 NaCl로 약 5.1 내지 5.3, 또는 5.15 내지 5.25, 또는 5.2의 pH까지 미리 평형화될 수 있다. 보다 높고 보다 낮은 pH와 전도도 값들은 후속되는 실험들에서 평가될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 기능화된 가용성 기재들 또한 상기 수확물에 대한 이들의 천가 전에 특정한 pH 값까지 평형화될 수 있다. 이와 같은 조정은 원하는 기재(들)의 액체 농도까지 산이나 염기를 첨가함에 의해 이루어질 수 있다. 통상의 실험이 정해진 정제를 위한 가장 적절한 평형 pH 및 전도도를 결정하는 데 유익할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 가용성 기재(들)는 첫 번째 실험에서 20mM의 아세트산염, 100mM의 NaCl로 약 5.1 내지 5.3, 또는 5.15 내지 5.25, 또는 5.2의 pH까지 미리 평형화될 수 있다. 보다 높고 보다 낮은 pH 및 전도도 값들은 후속되는 실험들에서 평가될 수 있다.

특정 정제에 대한 가장 효과적인 구성을 결정하기 위하여 각 변수에 대한 값들의 범위를 평가하는 것은 일반적으로 가치가 있다. 알란토인 농도는 1%와 같이 보다 낮은 비율에서, 또는 2%, 3%, 4%, 5% 혹은 중간의 증가분들과 같이 보다 높은 비율에서 평가될 수 있다. 실험 데이터는 알란토인이 1% 아래에서 덜 효과적이 되고, 항체 회수가 5% 이상을 상쇄시킬 수 있지만, 야기될 수 있는 잠재적인 상쇄에 대한 인식이 있는 한 보다 넓은 범위들이 평가될 수 있는 점을 나타낸다. 제시된 1%보다 낮은 농도들은 특히 응집체 감소를 상쇄시킬 수 있는 반면, 보다 높은 농도들은 항체 회수를 상쇄시킬 수 있다. 보다 낮은 단백질 회수는 보다 큰 값으로 간주되는 다른 효과들로 인하여 일부 경우들에서 허용 가능할 수 있다. 알란토인만의 첨가를 위한 배양 조건들로의 실험은 매우 빠르게 일어나는 이의 영향들이 경험적으로 나타나기 때문에 일반적으로 필요하지 않다. 지방산 농도는 0.05%부터 5%까지 변화될 수 있다. 15분 정도로 작은 배양 시간은 응집체 및 숙주 단백질 제거를 상쇄시킬 가능성이 있지만, 30분, 또는 45분, 또는 60분, 또는 90분, 또는 120분, 또는 다른 선택의 간격과 함께 평가될 수 있다. 2시간보다 긴 배양 시간들 또한 평가될 수 있지만, 지금까지의 실험 데이터는 이와 같은 간격들에서 중요한 이점을 나타내지 않았다. 기능화된 고체 또는 가용성 기재들의 비율은 2% 아래로 감소될 수 있거나, 상기 값 보다 높게 상승될 수 있다. 보다 낮은 비율들은 상기 방법의 전체적인 유효성을 상쇄시키는 것으로 나타나는 반면, 보다 높은 농도들은 상대적인 이점이 없이 비용을 증가시키는 경향이 있다. 보다 높은 농도들은 또한 미리 침전된 오염물들이 가용화되고 상기 항체를 함유하는 용액을 다시 오염시키는 정도까지 상기 지방산을 결합시키는 증가하는 위험성을 지닌다. 세포 배양 물질들 사이의 변화가 주어지면, 1% 내지 5%의 범위를 초기에 탐구하는 것이 신중해질 것이다. 배양 시간은 효율의 주요 결정 요인이지만, 긴 프로세스 시간 간격들의 경제상의 단점들에 대해 균형을 이루어야 한다. 16시간은 돌보지 않고 수행될 수 있는 하룻밤의 배양에 상응하기 때문에 출발점으로서 편리하지만, 1시간, 2시간, 4시간 그리고 사용자의 재량으로 아마도 보다 작거나, 보다 크거나, 중간의 간격들과 같은 보다 작은 간격들 또한 평가되어야 한다. 상기 지방산으로의 초기 배양을 위한 작동 pH는 4부터 6까지, 또는 4.5 내지 5.5, 또는 4.8 내지 5.2의 범위가 될 수 있다. 전도도는 일반적으로 조정이 요구되지 않지만, 염화나트륨과 같은 염의 첨가에 의해 정상 생리적 전도도의 약 2배까지 증가될 수 있거나, 물의 첨가에 의해 약 반으로 감소될 수 있거나, 원하는 경우에 보다 넓은 범위들이 평가될 수 있다.

실험 결과들이 카프릭산이 일부 실시예들에서 항체 조각들의 제거를 위해 보다 효과적이고, 대체로 모든 다른 측면들에서 적어도 효과적인 것으로 나타내기 때문에, 카프릴릭산에 대한 대안으로 카프릭산을 평가하는 것이 바람직할 수 있다. 카프릭산은 가용성이 되는 적어도 약 30℃의 온도에서 유리하게 사용될 수 있다. 이는 냉동 하에서 저장된 세포 배양 수확물들에 적용될 때에 단점으로 고려될 수 있지만, 이와 같은 우려들은 상기 지방산이 신선한 세포 배양 수확물에 직접적으로 첨가될 수 있는 경우, 그리고 특히 상기 세포 배양 수확물이 상기 바이오리액터 내에 머물러 남는 경우의 상황들에서 유예될 수 있다. 나중의 경우에 있어서, 높은 온도가 원하는 임의의 배양 간격 동안 유지될 수 있다. 이러한 접근은 상기 온도가 상기 지방산 배양에 이어 감소되는 경우, 상기 카프릭산의 일부분이 불용성으로 될 것이며, 상기 시스템으로부터 그 제거 효율을 증가시키는 효과로 상기 시스템 내의 고체들과 보다 관련될 수 있는 이차적인 장점을 가질 수 있다. 실험 데이터는 비록 일반적으로 보다 낮은 농도에서 효과적인 것으로 발견되지만, 카프릭산이 카프릴릭산의 농도들과 동일한 범위에 대해 평가될 수 있고, 펠라곤산에 대한 최적의 농도가 일반적으로 이들 둘의 중간이 되는 점을 나타낸다. 8 이하의 탄소 사슬 길이들은 특히 응집체 제거에 대해 덜 효과적이며, 이에 따라 보다 큰 상대적인 양이 요구되지만, 잠재적으로는 유용한 것으로 남는다. 유사하게, 10 이상의 사슬 길이들은 상기 지방산의 고유한 용해도로 인해 가용성 시약의 높은 농도들을 구현하는 것의 어려움에 의해 약화되며, 이들은 일부 경우들에서 감소된 항체 회수의 보다 높은 위험성을 야기한다. 일반적인 문제로서, 실험 데이터는 상기 지방산이 보다 소수성일수록, 이의 유효 농도가 낮아지고 그 다이나믹 레인지(dynamic range)가 좁아지는 점을 나타낸다. 하나 또는 그 이상의 음성 전하들과, 이에 한정되는 것은 아니지만, 포화 지방산들, 불포화 지방산들, 고도불포화 지방산들 및 인지질들(phospholipids)을 포함하는 하나 또는 그 이상의 지방족이나 방향족의 소수성 모이어티들을 결합시키는 다른 유기산들 또한 여기에 제시되는 다음의 지침으로 여기에 개시되는 방법들을 수행하는 데 사용될 수 있다.

그 표면상에 TREN을 지니는 입자들은 합성에 의해 얻어질 수 있거나, 바이오웍스(BioWorks)(웁살라, 스웨덴)에 의해 제조된 워크비드스™(WORKBEADS™) 40 TREN 하이(High)(P/N 40 603 010)와 같이 상업적으로 구매될 수 있다. 이들 입자들은 아가로스 폴리머(agarose polymer)에 기초하지만, TREN이 또한 넓은 범위의 고체 및 가용성 기재들을 기능화시키는 데 이용될 수 있는 점은 명백할 것이다. 고체들은 구형, 부정형 또는 필라멘트형이 될 수 있고, 일부 경우들에서 가용성이 될 수 있다. 상기 방법은 또한 TREN 입자들이 칼럼 내에 충전되거나, TREN이 멤브레인, 모놀리스(monolith), 섬유, 결정성 매트릭스(matrix), 또는 유체들의 통과는 허용하지만 고체들은 그렇지 않은 장치 내에 수용되는 다른 고체 지지체와 같이 비미립자 표면상에 고정되는 형태로 수행될 수 있다.

TREN을 지니는 고체들은 다른 화학 종들을 지니거나, 다른 화학 종들을 지니는 다른 물질들이 수반되거나, 이들 모두에 의해 치환될 수 있으며, 여기서 상기 다른 화학 종들은 여전히 특히 IgG로부터 오염물들을 제거하고 상기 수확물에 미리 첨가된 지방산의 일부분을 제거하는 동일한 작용에 기여한다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, TREN 입자들은 이미노디아세트산을 지니는 입자들과 결합된다. 이와 같은 또 다른 실시예들에 있어서, TREN 입자들은 부틸(butyl) 또는 음성으로 대전된 골격을 갖는 폴리머 입자들 상의 다른 소수성 리간드들을 지니는 입자들과 결합된다. 이와 같은 또 다른 실시예들에 있어서, TREN 입자들 술포(sulfo)-, 포스포(phospho)- 또는 카르복시(carboxy)- 모이어티들과 같은 전기음성 모이어티들을 지니는 입자들과 결합한다. 이와 같은 또 다른 실시예들에 있어서, TREN 입자들은 소수성의 스티렌디비닐벤젠(styrenedivinylbenzene) 골격 상의 사차 아민들을 포함하는 다우엑스(Dowex) AG1x2와 같은 소수성의 음이온 교환 물질과 결합된다. 이와 같은 또 다른 실시예들에 있어서, TREN 입자들은 소수성의 양이온 교환 물질과 결합될 수 있다. 이와 같은 또 다른 실시예들에 있어서, TREN 입자들은 하나 이상의 다른 형태의 입자들과 결합될 수 있다. 이와 같은 또 다른 실시예에 있어서, TREN은 금속 친화도에 의한 전기양성도 및 수소 결합들 및 반 데르 발스 상호작용들에 참여하는 능력을 구현하는 TREN과 유사한 전기양성의 물질로 치환될 수 있다. 이와 같은 또 다른 실시예에 있어서, TREN은 수소 결합들 및 반 데르 발스 상호작용들에 참여하는 능력도 구현하는 전기양성의 종들로 치환될 수 있다. 금속 친화 기능성을 구현하는 전기양성의 종들이 없는 이와 같은 일 실시예에 있어서, 종은 금속 친화 기능성이 전기음성 또는 쌍성이온성 모이어티에 의해 제공되는 경우에 존재할 수 있다. TREN 이외의 전기양성의 종들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 1,3-디아미노(Diamino)-2-프로판올(propanol); 2-아미노(Amino)-1,3-프로판디올(propandiol); 에탄올아민(Ethanolamine); 1-아미노-4-구아니도부탄(guanidobutane); 암모니아; 1,2-디아미노에탄(Diaminoethane); 1,3-다이미노프로판(Diaminopropane); 1,3-디아미노-2-프로판올; 비트(bis)(TRIS) 펜탄(pentane); 1,2-디아미노에탄; 트리메틸아민(Trimethylamine); 비스(bis)(3-아미노프로필(Aminopropyl)) 아민(amine); 4-아미노-4-(3-하이드록시프로필(hydoxypropyl))-1,7-헵탄디올(heptandiol); 1,3-디아미노프로판; 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(propanediol); 1,2-디아미노에탄; 디에탄올아민(Diethanolamine); 트리스(tris)(하이드록시메틸(Hydroxymethyl)) 아미노메탄(aminomethane); N-(3-아미노프로필(Aminopropyl)) 디에탄올아민(diethanolamine); 에탄올아민; N-부틸아민(Butylamine); 1,3-디아미노펜탄(Diaminopentane); 2-(2-아미노에톡시(Aminoethoxy)) 에탄올; 폴리에틸렌이민(Polyethylenimine)(MW: 2000); 1-아미노-1-데옥시(deoxy)-d-소르비톨(sorbitol); 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄; N,N-비스(bis)(2-하이드록시에틸(hydroxyethyl)) 에틸렌디아민(ethylendiamine); 펜타에틸렌헥사민(Pentaethylenhexamine); 트리에탄올아민(Triethanolamine); 1,3-디아미노(Diamino)-2,2-디메틸프로판(dimethylpropane); 3-메틸아미노-1,2-프로판디올; 2-아미노-에탄티올(ethanethiol); 디알랄아민(Diallylamine); 폴리알랄아민(Polyallylamine); 디에틸렌트리아민(Diethylenetriamine); N-메틸디에탄올아민(Methyldiethanolamine); 1,5-디아미노펜탄(Diaminopentane); 4-아미노-4-(3-하이드록시프로필)-1,7-헵탄디올; 1,4-디아미노부탄(Diaminobutane); 트리메틸아민(Trimethylamine); 디에틸트리아민(Diethyltriamine); 6-아미노-1-헥사놀(hexanol); 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄; 2-(메틸아미노) 에탄올; 메티오닌올(Methioninol); 4-아미노-1-부탄올(butanol); 히드라진(Hydrazine), 아르기닌(arginine), 리신(lysine), 히스티딘(histidine), 그리고 히스타민(histamine)을 포함하는 일부 특정한 예들을 갖는 하나 또는 그 이상의 일차 아민들, 하나 또는 그 이상의 이차 아민들, 또는 하나 또는 그 이상의 삼차 아민들, 하나 또는 그 이상의 사차 아민들을 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 특히 높은 정도의 금속 친화도를 구현하는 대전된 종들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 트리스(2-아미노에틸)아민; 디에틸렌트리아민, 트리에틸렌테트라아민, 테트라에틸렌펜타민, 폴리프로필렌이민테트라아민, PAMAM 덴드라이머(에틸렌디아민 코어), 데페록사민, 이미노아세트산, 니트릴로아세트산, 글루탐산, 아스파르트산, 아르기닌, 히스티딘, 히스타민, 이미다졸, 아미노에틸 포스페이트, 아미노페닐 포스페이트, 또는 이들의 결합들을 포함할 수 있다. 이들 모든 실시예들이 수확물 내의 응집체들의 레벨들 감소시키는 수단으로서 특히 크로마틴 및 크로마틴과 관련된 물질들의 제거를 직접적으로 목표로 하는 점이 인식될 것이다. 이들 고상의 작용성들이 또한 상기 수확물로부터의 가용성 오염물들의 소거에 중요한 역할을 하며, 이에 따라 상기 방법에 의해 구현되는 전체적인 정제 인자에 기여하는 점이 동등하게 인식될 것이다.

TREN 및/또는 다른 화학 종들이 입자들보다는 고체 표면상에 채용되는 실시예들에 있어서, 상기 수확물과 함께 배양된 입자들이 급격히 감소될 수 있는 동안의 시간 간격을 평가할 필요가 있다. 예를 들면, 상기 화학 종들이 이를 통해 상기 수확물이 흐를 수 있는 여과 멤브레인의 표면상에 존재할 수 있을 경우, 접촉 시간은 시간보다는 분의 규모가 될 수 있다. 다른 물리적인 포맷들이 다른 유동 제한들이나 이의 결핍을 부여할 수 있으므로, 모든 경우들에서 상기 물질을 통한 유체 흐름의 속도를 평가하는 것이 신중해질 것이다. 보다 큰 면적이 유효성을 상쇄시키지 않고 보다 높은 유량을 지원할 수 있지만 비용을 상쇄시킬 수 있기 때문에, 다른 양의 고상의 표면 접촉 면적을 포함하는 물질들을 평가하고, 유량에 대한 접촉 표면의 유효성을 평가하는 것도 동등하게 신중해질 것이다. 칼럼 내에 충전된 TREN 입자들을 채용하는 실시예들에 있어서, 조건들을 최적화하기 위한 실험들에 대한 유용한 출발점은 5㎝보다 작지 않은 베드(bed) 높이를 충전시키고, 수확물을약 200㎝/hr의 선형 유량(linear flow rate)에서 상기 칼럼을 통과시킬 것이다. 30㎝까지와 같이 보다 큰 높이를 갖는 칼럼들이 이용될 수 있고, 보다 높은 효율을 지원할 수 있지만, 또한 보다 큰 베드 높이에 걸친 증가된 압력 강하로 인해 감소된 유량과 함께 아용될 수 있다. 일반적인 문제로서, 5㎝-15㎝의 베드 높이의 칼럼들이 적절한 실제 범위를 나타낸다. 이와 같은 대대분의 실시예들에 있어서, 일련의 것들에서 첫 번째 실험에 대하여, 상기 칼럼 내에 충전된 입자들의 부피는 2%와 같이 상기 수확물에 직접 추가될 수 있는 상기 입자들의 부피와 동일할 수 있다. 후속하는 실험들은 보다 작은 부피들이 효과를 상쇄시킬 수 있는 반면 보다 큰 부피들은 비용을 상쇄시킬 수 있는 점을 염두에 두고 보다 작거나 보다 큰 부피들을 평가할 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 침전물들을 제거한 후, 다른 단백질 분별 방법들로 계속되기 전에 특정 오염물 클래스들을 제거하도록 상기 처리된 상청액을 다른 기능화된 고체들에 노출시키는 것이 유리할 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 상청액은 이미노디아세트산으로 기능화된 입자들과 접촉될 수 있다. 실험 데이터는, 이미노디아세트산에 의해 보다 효과적으로 제거되는 칼슘, 마그네슘 및 망간을 제외하면, TREN이 대부분의 금속 이온들을 이미노디아세트산보다 효과적으로 제거하는 점을 나타낸다. 이와 같은 또 다른 실시예에 있어서, 상기 상청액은 특히 지방산의 남는 함량을 최소화하도록 의도된 소수성 음이온 교환 입자들과 접촉될 수 있다. 실험 데이터는 이러한 목적을 위해 특히 적합한 스티렌디비닐벤젠(styrenedivinylbenzene) 입자들 상의 사차 아미노기들을 포함하는 다우엑스(Dowex) AG1x2를 나타낸다. 이와 같은 또 다른 실시예에 있어서, 음성으로 대전된 금속 결합 기능성, 또는 소수성 음이온 교환 기능성, 또는 이들 모두를 가지거나 혹은 어느 것도 가지지 않는 음성으로 대전된 금속 결합 기능성을 지니는 입자들은 그 표면이 유사하거나 선택적인 화학약품들로 기능화될 수 있거나, 기능화되지 않을 수 있는 여과 장치와 접촉될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 고체들의 제거 후, 상기 처리된 항체 제제는 양성의 전하들을 지니는 심층 필터를 통과하게 된다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 단백질 제제의 전도도는 가용성의 산성 오염물들을 결합을 향상시키도록 전하들을 지니는 상기 심층 필터를 통과하기 전에 감소된다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 심층 필터의 적어도 하나의 샘플 접촉 표면이 이를 전기양성으로 만들도록 화학적으로 변경된다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 상기 심층 필터는 전기양성 모놀리스, 멤브레인 또는 다공성 벽이 있는 중공형 섬유로 치환될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 전체적으로 상기 시스템 내의 개별적인 요소들에 의해 발휘되는 영향의 정도가 이들의 독립적인 행동에 의해 예상될 수 없기 때문에 모든 개시되는 요소들이 존재하는 여기에 개시된 방법들을 수행하는 것이 유리할 수 있다. 이는 비록 물리적 및 화학적 메커니즘들로의 조화가 종래 기술에서 수행된 바와 같은 지방상 침전과 구분되지만, 전체적으로 상기 시스템이 종래의 지방산 처리들로부터와 다른 결과들을 구현하는 점을 강조한다. 여기에 개시되는 방법들을 수행함에 있어서, 상기 방법의 단일 요소들이 임의의 특정 표적 IgG 항체에 대한 능률적인 접근을 제공하도록 연속적으로 실행될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 종래 기술에서 알려진 바와 같이 실험 계획법(DoE)과 같은 통계적 기술들은 특정 IgG 정제에 대해 설계된 감소된 숫자의 여기에 개시되는 방법 실시예들의 선택을 확인하는 수단들을 제공한다.

일 실시예에 있어서, 상기 방법은 다른 수단들에 의해 사전에 처리되었던 IgG를 함유하는 공급 스트림들에 적용될 수 있다. 이와 같은 일 실시예에 있어서, 바이오리액터 수확물은 본 발명과 구별되는 방식으로 처리되었을 수 있다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 다른 화학 첨가제들의 존재가 본 방법의 유효성을 포함할 수 있거나, 명료할 수 있거나, 본 발명의 방법이 사전 처리의 유익한 이점들을 혼합시킬 수 있는 점이 분명해질 것이다. 이와 같은 또 다른 실시예에 있어서, 상기 IgG를 함유하는 공급 스트림은 부분적으로 정제되었던 것으로 언급될 수 있다.

일부 실시예들에 있어서, 상기 정제되는 IgG는 단일클론성 또는 다클론성이 될 수 있으며, 혈청 또는 혈장과 같은 생물학적 유체, 또는 다른 천연 유래의 유체 내에 있을 수 있다. 이와 같은 실시예들에 있어서, 동일한 방법 변수들이 생체 외의 세포 배양 기술들에 의해 생성되는 단일클론 항체들의 처리를 위해 기재된 바와 동일한 범위들에 대해 평가될 수 있다. 다클론 항체들이 주어진 단일클론 항체보다 넓은 분지 행동의 범위를 커버하며, 다른 종들로부터 유래된 항체들의 행동의 차이들이 관찰될 수 있지만, 전체적으로 본 발명의 본질적인 특징들을 벗어나지 않고 여기에 개시되는 방법들의 요소들을 조정하는 것은 해당 기술 분야의 숙련자의 이해의 범위 내에 있게 되는 것으로 예상된다.

일 실시예에 있어서, 상기 수확물은 상술한 처리가 적용되었고 상기 시스템으로부터 고체들이 제거된 후에 하나 또는 그 이상의 방법들에 의해 더 처리될 수 있다. 이와 같은 하나의 실시예는 동일한 조건들까지 평형화된 기능화된 필터 또는 다른 장치를 통한 상기 처리된 수확물의 통과를 포함한다. 이와 같은 일부 실시예들에 있어서, 상기 샘플의 pH 및 전도도 조건들은 오염물들을 추출하는 상기 기능화된 장치의 능력을 향상시키도록 변경될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 상기 IgG는 농축될 수 있고, 디아필트레이션(diafiltration)에 의해 완충제 교환될 수 있으며, 이는 또한 일부 오염물들을 제거할 것이다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 처리된 수확물은 고성능 접선 유동 여과에 의해 처리될 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 정제된 상청액은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 처리될 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 IgG는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol)로 상기 정제된 수확물로부터 침전될 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, IgG는 황산암모늄, 황산나트륨, 황산칼륨, 시트르산나트륨(sodium citrate) 또는 시트르산칼륨(potassium citrate)과 같은 코스모트로픽 염(kosmotropic salt)에 의해 상기 정화된 수확물로부터 선택적으로 침전될 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 정화된 수확물은 입체 배제 크로마토그래피(steric exclusion chromatography)에 의해 처리될 수 있으며, 여기서 IgG는 폴리에틸렌 글리콜의 존재에서, 또는 우선적 배제나 크로마토그래피에 의해 친수성 입자들 상에 부착하게 되고, 여기서 상기 IgG는 하나 또는 그 이상의 코스모트로픽 염들의 존재에서 입자들 상에 부착하게 된다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 처리된 수확물은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 처리될 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 처리된 수확물은 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의해 처리될 수 있다. 또 다른 실시예에 있어서, 상기 처리된 수확물은 이른바 혼합 모드 크로마토그래피(mixed mode chromatography)의 형태에 의해 처리될 수 있으며, 여기서 주어진 크로마토그래피 배지는 구성 성분의 기능성들이 후속하여 적용되는 경우와 다른 분별 결과들을 구현할 수 있는 다중의 화학적 기능성들을 포함한다.

다음의 실험예들은 예시만을 위한 일반적인 것으로 이해되어야 하며, 어떠한 방식으로도 제한하려는 것으로 해석되지 않아야 한다. 해당 기술 분야의 숙련자에게는 99%의 숙주 단백질 오염물들, 90%의 응집체들 및 조각들, 99%의 DNA, 엔도톡신 및 바이러스를 제거하는 초기 정화/정제 단계에 수반하여, 후속하는 연마(polishing) 단계들의 대부분의 임의의 가능한 쌍이 생체 외로 인간 치료를 위해 충분한 IgG 순도를 구현할 수 있고, 일부 실시예들에서, 단일의 후속되는 처리 단계만으로 이러한 결과를 구현하는 것이 가능한 점이 분명해질 것이다.

실험예들

실험예 1：기능화된 입자들에 의한 처리와 함께 카프릴릭산 침전에 의한 오염물 제거

카프릴릭산이 다른 양들로 원심분리에 의해 정제된 세포 배양 수확물에 각기 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% 및 0.5%의 최종 농도들까지 첨가되었다. 알란토인이 각 샘플에 1%의 최종 농도까지 첨가되었다. pH와 염 농도는 조정되지 않았다. 0.4%의 카프릴릭산의 최종 pH는 5.4였다. 혼합물들은 2시간 동안 교반되었다. 고체들은 상기 샘플을 0.22㎛의 마이크로필터를 통과시켜 제거되었다. 여과물은 이후에 TREN, 이미노디아세트산, 그리고 부틸 리간드들(각기 바이오웍스(BioWorks로부터의 워크비드스™(WORKBEADS™) TREN 40 하이(High), 바이오-라드(Bio-Rad)로부터의 첼렉스(Chelex)-100 및 바이오-라드로부터의 마크로-프렙(Macro-Prep) T-부틸(butyl))을 지니는 다공성 입자들의 균등 부분 혼합물을 함유하는 칼럼을 통과하였으며, 여기서 상기 입자들의 결합 부피는 적용된 샘플 부피의 5%였다. 숙주 세포 단백질은 상기 수확물 내에서 최초에 242,888ppm의 IgG로부터 0.1%의 카프릴릭산에서 233,318ppm으로; 0.2%에서 193,400ppm으로; 0.3%에서 57,519ppm으로; 0.4%에서 38,602ppm으로; 그리고 0.5%에서 42,666ppm으로 감소되었다. 유리 경쇄 및 경쇄 디머들(dimers)을 함유하는 IgG 조각들은 상기 수확물 내에서 12.2%로부터 0.3%의 카프릴릭산에서 5.3%로;0.4%에서 3.4%로; 그리고 0.5%의 카프릴릭산에서 3.6%로 감소하였다. 0.1% 및 0.2%의 카프릴릭산에서 조각 감소는 없었다. 응집체들은 상기 수호가물 내에서 1.28%로부터 0.1%의 카프릴릭산에서 1.22%로, 0.2%의 카프릴릭산에서 0.87%로, 0.3%의 카프릴릭산에서 0.31%로 감소하였고, 0.4% 및 0.5%의 카프릴릭산에서는 검출할 수 없었다(0.05% 이하). 상기 카프릴릭산 농도들에 걸친 IgG 회수는 0.1%의 카프릴릭산에서 99%, 0.2%에서 99%, 0.3%에서 95%, 0.4%에서 99%, 그리고 0.5%에서 95%였다. 상기 다공성 입자들의 혼합물로의 처리 후, 숙주 단백질은 0.4%의 카프릴릭산으로 처리된 샘플에서 4,205ppm까지 감소하였으며, 1%의 조각들 및 측정할 수 없는 응집체들을 가지고 99%의 전체 IgG 회수를 갖는 98%의 감소 및 99% 이상으로 순수한 항체를 남기는 것을 나타낸다.

실험예 2：숙주 단백질 감소에 대한 작동 pH의 영향

일련의 실험들이 수행되었고, 여기서 IgG를 함유하는 정밀여과 정제 수확물은 0.4%의 카프릴릭산으로 처리되었으며; pH는 실험 대조군에서는 조정되지 않았고; pH가 두 별도의 실험들에서 pH 6 및 7까지 조정되었다. 숙주 단백질 함량은 조정되지 않은 대조군(pH 5.4)에서 38,602ppm이었고, pH 6.0에서 171,232ppm이었으며, pH 7.0에서 243,675ppm이었다.

실험예 3：폴리에틸렌 글리콜으로 IgG 침전에 의한 후속 정제

실험예 1로부터의 샘플들이 다공성 입자 처리를 수반하는 0.4% 및 0.5%의 카프릴릭산으로 처리되었고, 20.5%의 PEG, 800mM의 NaCl, 50mM의 헤페스(Hepes), pH 7.0에서 수행된 폴리에틸렌 글리콜(PEG-6000)으로의 침전에 의해 더 정제되었다. 0.4%의 카프릴릭산으로 처리된 수확물의 PEG 침전 후, 숙주 단백질들은 11ppm까지 감소되었고, 응집체들은 0.09%까지 감소되었으며, 경쇄 조각들은 검출할 수 없었다. 0.5%의 카프릴릭산으로 처리된 수확물의 PEG 침전 후, 숙주 단백질은 13ppm까지 감소되었고, 응집체들은 0.1%까지 감소되었으며, 경쇄 조각들은 검출할 수 없었다. 이들 결과들은 모두 숙주 단백질의 99.9995% 감소에 대응된다. 상기 수확물이 본 발명의 방법에 의해 처리되지 않았던 병행 대조 실험에서, PEG 침전은 숙주 단백질을 67,687ppm까지 감소시켰다. 개시된 방법에 의해 제공되는 6,000-폴드(fold) 이상의 향상은 두 가지 구별되는 이점들을 나타낸다. 자명한 이점은 본 발명의 방법에 의한 숙주 단백질 오염의 감소가 보다 큰 숙주 단백질 오염의 감소를 구현하도록 후속되는 방법을 가능하게 하는 것이다. 또한, 개시된 방법이 특히 이의 가장 우수한 결과들을 구현하는 정제 방법 자체의 능력을 방해하는 오염물들을 제거하는 거의 틀림없이 큰 이점이 강조된다.

실험예 4：음이온 교환 심층 필터와 상기 방법의 통합

0.4%의 카프릴릭산이 전처리(pre-treatment) 없이 세포 배양 수확물에 첨가되었다. 알란토인이 1%의 최종 농도까지 첨가되었다. 혼합물은 계속하여 2시간 동안 교반되었고, 이후에 실험예 1에서 기술한 동일한 다공성 혼합물 처리를 위한 준비로 실험예들 1 내지 3과 같은 멤브레인 마이크로필터 대신에 2단계 음이온 교환 심층 필터를 통과하였다. 상기 심층 여과 단계는 숙주 단백질 19-폴드를 176,244ppm으로부터 9173ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 2.03%로부터 검출할 수 있을 정도(0.05% 이하)까지 감소시켰으며, 경쇄 오염물들을 12%로부터 1%까지 감소시켰다.

실험예 5：단백질 A 친화 크로마토그래피에 의한 향상된 성과

실험예 4에 기재된 바와 같이 알란토인, 카프릴릭산 및 혼합된 입자들로의 처리에 의해 제조된 샘플이 단백질 A 친화 크로마토그래피(토요펄(ToyoPearl) AF-rProtein A 650F, 토소 바이오사이언스(Tosoh Bioscience))에 의한 정제로 처리되었다. 공급 스트림이 원심분리 및/또는 정밀여과에 의해 정화된 세포 수확물로 구성될 때에 단백질 A는 정상적으로 오염시키는 숙주 단백질 레벨들을 500ppm 내지 2,000ppm의 IgG 범위까지 감소시켰다. 단백질 A에 앞서 실험예 1에 기재된 상기 카프릴릭산-알란토인 및 다공성 입자 방법을 수행하는 것은, 상기 단백질 A 단계가 1ppm 아래의 숙주 단백질 레벨을 구현하게 하였고, 검출 가능성의 레벨 아래의 응집체들을 구현하였다. 이는 특히 개시된 방법이 이의 잠재성을 구현하는 단백질 A의 능력을 방해하는 오염물들을 제거하는 점을 강조한다.

실험예 6：음이온 교환 크로마토그래피가 수반되는 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 향상된 성과

실험예 4에 기재된 바와 같이 알란토인, 카프릴릭산 및 혼합된 입자들로의 처리에 의해 제조된 샘플에 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 다른 정제가 수행되었다. 원심분리 및/또는 정밀여과에 의한 세포 수확물 정화 후에 적용될 때에 양이온 교환은 5,000ppm-15,0000ppm의 숙주 단백질 레벨들을 정상적으로 구현하였다. 적어도 두 추가적인 크로마토그래피 단계들이 통상적으로 100ppm 이하의 레벨들을 구현하기 위해 이용된다. 양이온 교환에 앞서 개시된 방법을 수행하는 것은 양이온 교환 단계가 4.6ppm의 숙주 단백질 레벨을 구현하게 하였고, 응집체들을 0.68%까지 감소시켰다. 50mM의 트리스(Tris), pH 8.25에서 보이드 배제(void exclusion) 모드로의 음이온 교환의 단일의 후속되는 연마(polishing) 단계는 숙주 단백질을 1ppm 이하까지 감소시켰고, 응집체들을 0.53%까지 감소시켰다. 선택적으로는, 칼럼이 1.0M의 NaCl, 50mM의 헤페스, pH 7.0까지 평형화되었던 캅토 애드히어(Capto adhere) 크로마토그래피의 최종 연마 단계가 적용되었고, 동일한 완충제로 세척되었으며, 이후에 300mM의 NaCl, 50mM의 헤페스, pH 7.0까지 선형 구배로 용리되었으며, 숙주 단백질 오염을 1ppm 이하로 감소시켰고, 응집체들을 0.05% 이하로 감소시켰다.

실험예 7：음이온 교환 크로마토그래피가 수반되는 항체 침전에 의한 향상된 성과

실험예 4에 기재된 바와 같이 알란토인, 카프릴릭산 및 혼합된 입자들로의 처리에 의해 제조된 샘플에 2.0의 황산암모늄, pH 7.0까지의 전이를 수반하는 실험예 3에 기재된 바와 같이 초기에 PEG로의 혼합 모드 침전 단계에 의한 다른 정제가 수행되었다. 상기 IgG는 가용화되었고, 5.9ppm의 숙주 세포 단백질을 나타내도록 테스트되었다. 응집체들은 검출의 레벨 아래(0.05% 이하)였다. 50mM의 트리스, pH 8.25 내의 보이드 배제 모드로의 음이온 교환의 단일의 후속하는 연마 단계는 숙주 단백질을 1ppm 이하까지 감소시켰다. 이러한 결과는 단백질 A 친화 크로마토그래피의 모든 것들 중에서 인지된 가장 높게 수행되는 분별 방법에 기초하는 프로세스들로 보다 우수한 전체적인 정제 성과를 구현하는 값싼 저기능의 분별 방법들을 허용하는 기초를 제공하는 개시된 방법의 능력을 강조하기 때문에 중요하다.

실험예 8：TREN 입자들로 혼합된 입자들의 다중 종들의 대체

0.5%의 카프릴릭산이 어떠한 전처리 없이 세포 배양 수확물에 첨가되었다. 이는 약 5.3의 pH를 생성하였다. 혼합물은 2시간 동안 계속적으로 교반되었다. 알란토인이 이후에 1%에서 첨가되었고, 15분 동안 배양되었다. TREN 입자들(워크비드스 TREN 40 하이)이 5%v/v의 비율에서 첨가되었고, 실온에서 하룻밤 동안 배양되었다. 부피의 반은 앞서와 같이 고체들을 제거하도록 심층 필터를 통과하였다. 나머지 반은 0.22㎛의 정밀여과를 통과하였다. 상기 정밀여과 형태는 90%의 단백질 회수로 상기 수확물 보다 100-폴드 적은 숙주 단백질(1,758ppm 대 176,244ppm), 3.03%으로부터 0.83%까지의 응집체들 및 11.8%로부터 1.23%까지의 항체 조각들을 함유하였던 물질을 생성하였다. 상기 심층 여과 형태는 85%의 항체 회수로 135ppm까지로 숙주 단백질을 감소시켰고 0.01% 이하까지로 응집체들을 감소시켰다.

실험예 9：입자 배양 시간

일련의 실험들이 실험예 8과 병행하여 수행되었다. TREN 입자들로 4시간 내지 6시간까지 배양 시간을 감소시키는 것은 하룻밤(16시간)의 배양과 대략적으로 동일한 결과들을 산출하였다. 배양 시간을 1시간 또는 2시간까지 감소시키는 것은 보다 못한 결과들을 구현하였다.

실험예 10：음이온 교환 크로마토그래피가 수반되는 농축/디아필트레이션에 의해 처리된 수확물의 IgG 정제

접선 유동 여과가 농축시키고 디아필터링시키는 프로세스 용액들에 대해 공통적으로 이용되지만, 그 능력들이 너무 제한적인 것으로 여겨지기 때문에 이는 정제 단계로 간주되지 않는다. 실험예 8로부터의 심층 여과로 처리된 물질이 접선 유동 여과에 의해 농축되었다. 숙주 단백질 오염은 20ppm까지 감소하였다. 응집체들은 0%에서 남았다. 이러한 물질은 실험예 6에서 기술한 바와 같은 보이드 배제 모드 내의 음이온 교환에 의해 연마되었다. 숙주 단백질은 검출 가능성의 레벨 아래(60ppb(parts per billion) 이하)로 감소되었다. 응집체들은 검출할 수 없었다. 항체 경쇄 조각들 및 중쇄 조각들은 검출할 수 없었다. 이는 통상적으로 수행되는 단백질 A 크로마토그래피에 기초하는 프로세스들보다 높은 순도를 구현하기 위해 다른 인지된 저기능의 분별 기술을 가능하게 하는 개시된 방법의 능력을 강조한다.

실험예 11：침전 및 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 IgG 정제

실험예 8로부터의 심층 여과로 처리된 물질이 실험예 7에서의 침전 방법에 의해 농축되었고, 이후에 실험예 6에서의 음이온 교환 방법이 수행되었다. 숙주 단백질 농도는 상기 침전 단계에서 1ppm 이하까지 감소되었고, 음이온 교환 후에 검출 가능성의 레벨 아래(60ppb 이하)로 감소되었다. 응집체들은 검출할 수 없었다. 항체 경쇄 조각들 및 중쇄 조각들은 검출할 수 없었다. 이는 통상적으로 수행되는 단백질 A 크로마토그래피에 기초하는 프로세스들보다 높은 순도를 구현하기 위해 다른 인지된 저기능의 분별 기술을 가능하게 하는 개시된 방법의 능력을 강조한다.

실험예 12：단백질 A 친화 및 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 IgG 정제의 향상

실험예 8로부터의 심층 여과로 처리된 물질이 실험예 6에서와 같이 단백질 A 친화 및 음이온 교환 단계들에 의해 분별되었다. 숙주 단백질 농도는 상기 단백질 A 단계에서 1ppm 이하까지 감소되었고, 음이온 교환 후에 검출 가능성의 레벨 아래(60ppb 이하)로 감소되었다. 응집체들은 검출할 수 없었다. 항체 경쇄 조각들 및 중쇄 조각들은 검출할 수 없었다. 이러한 실험은 100-폴드 이상으로 고기능의 정제 방법의 수행을 향상시키는 개시된 방법의 능력을 강조한다.

실험예 13：중간 정제 단계로서의 개시된 방법

원심분리 및 정밀여과에 의해 정화되었던 세포 배양 수확물이 실험예 7에 기재되었던 바와 같이 침전에 의해 분별되었던 실험 대조군이이 수행되었다. 이는 숙주 단백질을 287,655ppm으로부터 67,687ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 2.83%로부터 1.57%까지 감소시켰으며, 항체 조각들은 10.4%로부터 2.3%까지 감소시켰다. 후속하는 보이드 배제 모드에서 음이온 교환 단계는 숙주 단백질의 99.6%를 221ppm까지 감소시켰고, 응집체들을 1.45%까지 감소시켰다. 이러한 실험 대조군이 침전 단계가 0.4%의 카프릴릭산, 1%의 알란토인 및 5%의 TREN-기능화된 입자들로의 처리를 수반하였던 프로세스와 비교되었다. 6시간 동안의 배양 후, 고체들이 심층 여과에 의해 제거되었다. 숙주 단백질 오염은 21ppm까지 감소되었고, 응집체들은 검출 가능성의 레벨 아래로 감소되었다. 이러한 물질은 실험예 6에 기재된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 분별되었다. 숙주 단백질 오염은 검출 가능성의 한계 아래로 감소되었다. 따라서, 개시된 방법을 중간 단계로 이용하는 것은 200의 인자보다 크게 최조 산물의 순도를 증가시켰다.

실험예 14：카프릭산의 능력 및 황산암모늄 침전, 음이온 교환 크로마토그래피 정제 프로세스의 구현

세포 배양 상청액이 0.2%의 카프릭산, 1%의 알란토인 및 5%의 TREN 입자들로 처리되었다. 37℃에서 하룻밤 동안의 배양 후, 고체들이 사르토리우스(Sartorius) PC-1 필터 상의 심층 여과에 의해 제거되었다. 여과물은 이후에 50mM의 인산염, pH7.0 내에서 2.0M의 황산암모늄으로의 침전에 의해 정제되었고, 이후에 실험예 6에서 기술한 바와 같이 보이드 배제 모드에서 음이온 교환 크로마토그래피의 최종 연마 단계에 의해 정제되었다. 숙주 단백질은 카프릭산-알란토인-입자 처리에 의해 287,655ppm의 초기 레벨로부터 987ppm까지 감소되었고, 이후에 황산암모늄 침전에 의해 76ppm까지, 그리고 음이온 교환에 의해 1ppm 이하로 감소되었다. 응집체들은 상기 카프릭산-알란토인-입자 단계에서 검출의 레벨 아래로 감소되었다. 항체 경쇄 및 중쇄 조각들은 상기 카프릭산-입자 단계에서 10.4%로부터 0.6%까지 감소되었고, 황산암모늄 침전 후에 검출 가능성의 레벨 아래로 감소되었다. 이는 개시된 방법들이 인지된 저기능의 황산암모늄 침전 단계가 물리적인 수단들에 의해 정화된 수확물로 통상적으로 적용되는 단백질 A 친화 크로마토그래피의 인지된 고기능의 선택적인 경우보다 우수한 정제를 구현하게 하는 다른 예를 제공한다.

실험예 15：카프릭산 농도의 평가

실험들이 0.1%, 0.4% 및 0.6%의 카프릭산에서 실험예 14와 병행으로 진행되었다. 0.1%는 비교할 만한 정제를 지원하지 못하였다. 0.4% 및 0.6%는 과도한 항체 손실을 야기하였다. 1%의 카프릭산으로의 실험은 오염물들과 함께 항체의 거의 모두를 침전시켰다.

실험예 16：알란토인이 있는 및 알란토인이 없는 다른 카프릴릭산 농도들의 평가

세포를 함유하는 수확물이 원심분리 및 0.22미크론의 멤브레인을 통한 여과에 의해 정제되었고, 이후에 상청액의 6.0까지 감소되었다. 다양한 하위 샘플들이 0.01%, 0.05% 및 0.1%의 양들에서 카프릴릭산으로 처리되었다. 모든 샘플들은 심지어는 침전된 물질들이 원심분리에 의해 제거된 후에도 처리에 이어서 흐렸으며, 미립자들의 지속 또는 재형성을 나타내었다. 동일한 일련의 실험들이 2% 알란토인의 존재에서 반복되었다. 항체 회수 및 오염물들의 감소는 본질적으로 동등하였지만, 처리된 물질은 처리 후에 뛰어나게 깨끗하였다. 이러한 실험은 전체로서 개시된 방법들의 수행에 대한 알란토인의 기여를 나타낸다.

실험예 17：알란토인의 첨가에 의한 포유류 세포 수확물의 가속 정화

알란토인이 1%의 최종 농도까지 통상의 오염물들의 범위 중에서 5L의 세포를 포함하는 IgM 단일클론 항체를 함유하는 세포 배양 수확물에 첨가되었다. 용기는 상기 성분들을 혼합하도록 부드럽게 소용돌이쳤다. 알란토인 및 알려지지 않은 세포 배양 성분들 사이의 상호작용들은 이러한 양의 알란토인이 완전히 분해되게 하였으며, 이에 따라 추가적으로 1%가 첨가되었고, 전체 첨가된 양이 2%(w/v)까지 되게 하였다. 상기 용기는 상기 성분들이 혼합되도록 다시 소용돌이쳤다. 미립자 물질들이 알란토인의 첨가 전에 매우 느리게 침강되는 것이 관찰되었고, 1%의 알란토인의 존재에서만 약간 빨랐지만, 침강 속도는 2%의 알란토인에 의해 분명히 빨라졌으며, 약 20분의 기간 내에 상기 세포 배양 상청액 뛰어나게 광학적으로 깨끗한 상기 세포 배양 상청액이 남겨졌다. 1% 및 2%의 알란토인 사이의 차이는 1%의 알란토인은 샘플 내의 일부 가용화시키는 물질들의 존재에 의하여 거의 완전히 분해되는 점을 나타내는 것으로 해석된다. 상기 상청액은 그 후에 옮겨 부어졌다. 이는 상기 침전물의 일부를 의도하지 않게 재현탁시키며, 남아 있는 고체들을 침강시키도록 후속하여 원심 분리되었다. 이는 지방산들 또는 다른 첨가제들과 독립적으로 세포 수확물 정화의 품질을 향상시키는 알란토인의 능력을 강조한다. 이는 또한 적어도 2%의 알란토인 농도로 초기 시도들을 수행하는 잠재적인 이점을 강조한다. 이는 물 속에서 그 알려진 용해도가 유용한 예비 지참을 제공할 수 있지만 알란토인의 과포화시키는 농도가 실험적으로 결정될 수 있는 효과와 함께 알란토인의 용해도가 샘플의 성분에 의해 영향을 받을 수 있는 중요한 사항을 더 강조한다.

실험예 18：알란토인의 첨가에 의한 대장균 용해물(E. coli lysate)의 정화

250mL의 50mM 헤페스, pH 7.0 내의 20그램의 대장균 페이스트(E. coli paste)가 16,000 x g에서 미세유동화기(microfluidizer)로 균질화되었다. 세포분쇄액(homogenate)은 가장 큰 미립자 종들을 제거하도록 이후에 15,000 x g에서 1시간 동안 원심 분리되었다. 이는 황갈색의 탁한 상청액을 생성하였다. 건조 알란토인이 상기 상청액에 5%w/v의 최종 농도까지 직접 첨가되었다. 혼합물은 이후에 침강되게 하도록 약 1분 동안 소용돌이쳤다. 불용성 물질들이 수 분 내에 침강되었고, 최초 세포분쇄액 내에 존재하였던 90% 이상의 상기 단백질 생성물을 함유하는 뛰어나게 깨끗한 상청액이 남았다. 상기 상청액은 0.22미크론의 멤브레인 필터를 통과하였고, 여기서 알란토인 처리 이전의 상청액은 사실상 접촉 상에서 필터를 막았다. 이러한 실험은 처리된 샘플의 여과성을 급격히 향상시키는 알란토인의 능력을 강조하며, 전체로서 상기 방법의 수행에 대한 알란토인의 독립적인 기여를 강조한다. 이는 또한 개시된 방법이 포유류의 세포 배양에 의해 성장된 항체들에 제한되지 않는 점을 나타낸다.

실험예 19：알란토인을 이용한 IgG-엔도톡신 혼합물로부터의 항체 회수 및 엔도톡신 감소

엔토톡신이 5mM의 헤페스, 100mM의 NaCl pH 7.0에서 1㎎/mL의 인간 IgG에 22,000EU/ml까지 첨가되었다. 2%(w/v)의 알란토인이 이러한 혼합물의 부분 표본들에 첨가되었고, 실온에서 15분 동안 혼합되게 하였다. 서스펜션(suspension)은 원심분리에 의해 정화되었다. 단백질 및 엔도톡신 농도들이 항체 회수 및 엔도톡신 제거를 계산하기 위해 측정되었다. 2%(w/v) 알란토인은 엔도톡신을 2-폴드로 감소시켰다. 항체 회수는 상기 알란토인의 양에 영향을 받지 않았다. 후속되는 일련의 실험들에서, 알란토인의 양은 10%까지의 증가분들로 증가되었다. 항체 회수는 10%의 알란토인에서 약 93%까지 점진적으로 줄어들었지만, 엔도톡신 제거 효율은 약 99%까지 증가되었다. 이들 실험들은 보다 큰 양의 알란토인의 사용이 IgG의 손실을 가져올 수 있는 점을 나타낸다. 약 12kDa부터 1MDa까지의 크기 범위인 단백질로의 추가적인 실험들은 명확한 경향을 나타내었으며, 이에 따라 상기 단백질의 손실이 단백질 크기의 증가와 함께 증가된다. 이러한 실험예는 전체로서 개시된 방법의 성과를 향상시키는 알란토인의 능력을 나타낸다.

실험예 20

mL 당 10¹⁰의 입자들을 함유하는 마우스의 마이뉴트바이러스(minutevirus)의 바이러스 배양이 10%의 양으로 알란토인의 첨가에 의한 생리적 조건들 하에서 공침되었다. 상청액의 감염성 시험은 99.9%의 바이러스의 제거를 입증하였다. mL 당 10¹⁰의 입자들을 함유하는 쥐 백혈병 바이러스(murine leukemia virus)의 다른 바이러스 배양이 10%의 양으로 알란토인의 첨가에 의한 생리적 조건들 하에서 공침되었다. 상기 상청액의 감염성 시험은 바이러스의 99.9%의 제거를 입증하였다. 이러한 실험예는 전체로서 개시된 방법에 대한 알란토인의 독립적인 기여를 나타낸다.

실험예 21

20mS/㎝의 전도도까지 첨가된 NaCl로 정화된 IgM 세포 배양 수확물이 칼럼 내에 충전된 TREN 입자들을 통과하였다. IgM 회수는 98%였다. 히스톤 및 일반적인 숙주 단백질 제거는 약 35%였다. DNA 제거는 99%였다. 고분자량의 응집체들은 19.4%로부터 1.3%까지 감소되었다. 이러한 실험예는 전체로서 개시된 방법에 대한 TREN 입자들의 독립적인 기여를 나타낸다.

실험예 22

원심분리 및 정밀여과에 의해 정화된 항-HER2 IgG 세포 배양 수확물이 칼럼 내에 충전된 TREN 입자들을 통과하였고, 여기서 TREN 입자들의 부피는 적용된 세포 배양 수확물의 부피의 2%였다. 유량은 200cm/hr이었다. 상기 처리는 응집체들을 20.4%로부터 3.2% 이하로 감소시켰다. 숙주 단백질 오염은 58%만큼 감소되었다. 이러한 실험예는 전체로서 개시된 방법에 대한 TREN 입자들의 독립적인 기여를 나타낸다.

실험예 23

원심분리 및 정밀여과에 의해 정화된 항-HER2 IgG 세포 배양 수확물이 실험예 1과 동일한 혼합 입자들로 충전된 칼럼을 통과하였고, 여기서 상기 입자들의 부피는 적용된 세포 배양 수확물의 부피의 2%였다. 유량은 200cm/hr이었다. 상기 처리는 응집체들을 17.4%로부터 4% 이하까지 감소시켰다. 숙주 단백질 오염은 42%만큼 감소하였다. 이러한 실험예는 전체로서 개시된 방법에 대한 혼합되고 기능화된 입자들의 독립적인 기여를 나타낸다.

실험예 24：TREN 및 이미도아세트산 기능성들의 금속 제거 선택성의 비교

원심분리 및 정밀여과에 의해 정화된 세포 배양 수확물이 TREN-기능화된 아가로스(agarose) 폴리머 마이크로스피어들의 칼럼 또는 첼렉스(Chelex)-100의 칼럼에 대해 통과되었다. 표 1의 결과들는 첼렉스가 칼슘 및 마그네슘에 대해 실질적으로 보다 효과적인 점을 보여준다. 이들 둘은 구리, 망간, 니켈, 납 및 아연에 대해 유사하게 효과적이다. TREN은 알루미늄 및 철에 대해 실질적으로 보다 효과적이다.

[표 1]

ICP-OES 금속 분석. 모든 값들은 ppm 단위이다. nd=검출되지 않음.

실험예 25：세포 배양 수확물로부터의 단일클론 IgG의 통합 정제

세포를 함유하는 항-HER2 세포 배양 수확물이 2%의 최종 농도에서 알란토인 및 0.2%의 최종 농도에서 카프릴릭산과 결합되었고, 이후에 2시간 동안 배양되었다. TREN-기능화된 입자들이 5%의 최종 비율로 첨가되었고, 혼합물을 추가적인 4시간 동안 배양되게 하였다. 침전물들은 원심분리에 의해 제거되었고, 상청액은 첼렉스-100 및 다우엑스 AG1x2 입자들의 균등한 혼합물과 결합되었고, 여기서 상기 결합은 2%의 최종 비율에서 존재하였다. 1시간의 배양 후, 상기 혼합물이 입자들을 제거하기 위해 음이온 교환 심층 필터에 적용되었다. 여과물은 후속하여 약 50kDa의 양성인 균등한 구형의 단백질 크기를 갖는 멤브레인을 이용하여 접선 유동 한외여과 시스템 내에서 농축되었고, 1M의 NaCl, 1M의 소르비톨, 20mM의 EDTA, 50mM의 인산염, pH 7.2의 완충액에 대해 디아필터되었다. 리터 당 약 20g의 IgG까지의 농도로 된 후, 농축물은 보이드 배제 모드로 동작하는 우노스피어(UNOsphere) Q에 대한 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 처리되었다. 이러한 실험은 인식된 저기능의 정제 방법(한외여과) 및 단일의 음이온 교환 크로마토그래피 단계만을 이용함에도 불구하고 현재의 방법들을 훨씬 초과하는 프로세스 성능을 가능하게 하는 개시된 정화 방법들의 능력을 강조한다. 프로세스 결과들은 표 2에 요약된다.

[표 2]

프로세스 요약. HCP: 숙주 세포 단백질. HCP(rdx): % 감소. nd: 검출되지 않음.

실험예 26：지방산들 및 반대로 대전된 고체들의 길항 작용

원심분리 및 정밀여과에 의해 정화된 세포 수확물이 1%의 알란토인 및 0.4%의 카프릴릭산으로 처리되었고, 이후에 4시간 동안 배양되었다. 물질은 3개의 부분 표본들로 분리되었다. 첫 번째는 5%의 TREN 입자들로 처리되었다. 이는 일련의 것들을 위한 실험 대조군이었다. 두 번째는 10%의 TREN 입자들로 처리되었다. 세 번째는 5%의 TREN 입자들 및 2%의 다우엑스(Dowex) AG1x2 입자들로 처리되었다. 이들 조건들 하의 다른 실험들에서와 같이, 5%의 TREN과의 결합은 특히 유리 경쇄 오염물들을 0.1% 이하까지 감소시켰다. 그러나 10%의 TREN 및 TREN 플러스 다우엑스로의 실험에서 5% 이상까지 양의 유리 경쇄가 재결합되었다. 이들 결과들은 그 용해도를 회복하도록 상기 고체 물질들이 침전된 경쇄들로부터 충분한 양의 카프릴릭산을 제거하였고, 이에 따라 침전되지 않은 IgG를 다시 오염시켰던 점을 나타낸다. 보다 적은 양의 다우엑스가 TREN에 비해 이러한 결과를 구현할 수 있었던 점이 특히 주목할 만하다. 이는 카프릴릭산-오염물 침전물들로부터 카프릴릭산을 경쟁적으로 분리시키기 위한 이의 효율성을 증가시켜야하는 다우엑스의 이러한 특정 형태의 알려진 강한 소수성과 부합된다.

실험예 27：지방산들 및 반대로 대전된 고체들 사이의 길항 작용

원심 분리 및 정밀 여과로 정화된 세포 수확물이 1%의 알란토인 및 0.4%의 카프릴릭산으로 처리되었고, 이후에 4시간 동안 배양되었다. 물질은 2개의 부분 표본들로 나누어졌다. 첫 번째는 5%의 TREN 입자들로 처리되었다. 이는 일련의 것에 대한 실험 대조군이었다. 두 번째는 5%의 TREN 입자들 및 5%의 첼렉스 200 입자들로 처리되었다. 이들 조건들 하에서의 다른 실험들에서와 같이, 5%의 TREN과의 결합은 특히 유리 경쇄 오염물들을 0.1% 이하까지 감소시켰다. 그러나 TREN＋첼렉스로의 실험에서 5% 이상까지의 양의 유리 경쇄가 재결합되었다. TREN 및 첼렉스 모두가 고상의 킬레이트제들(chelators)이고 첼렉스가 음성으로 대전되며, 이는 카프릴레이트(caprylate) 이온들과 직접적으로 상호작용하지 않아야 하고, 이에 따라 경쇄를 제거하는 TREN의 능력에 영향을 미치지 않아야 하는 의미이기 때문에, 전술한 점을 설명하기는 어렵다. 이들 결과들은 상기 시스템 내에서 고상의 킬레이트제들의 영향이 금속 결합에 의해서는 조정되지 않을 수 있지만, 금속 결합과 병행하지만 구별되는 이와 같은 리간드들의 화학적 특성에 의해 조정될 수 있는 점을 제시한다.

실험예 28：변경된 프로세스 순서

항-HER2 세포 배양 수확물이 1%의 알란토인 및 0.4%의 카프릴릭산으로 2시간 동안 처리되었고, 이후에 5%의 TREN 입자들로 4시간 동안 처리되었다. 고체들은 원심분리에 의해 제거되었고, 상청액은 음이온 교환 심층 필터(사르토리우스(Sartorius) DC-1)를 통과하였다. 숙주 세포 단백질 오염은 531ppm까지 감소하였다. 응집체들은 0.1% 이하까지 감소하였다. 과잉의 유리 경쇄는 1% 이하까지 감소하였다. 관련 실험에 있어서, 상기 심층 필터는 음이온 교환 중공형 섬유(치우-스피드(Qyu-speed), 아사히(Asahi))로 치환되었다. 숙주 단백질 감소는 동등하게 528ppm까지였지만, 응집체들은 3.7%까지만 감소되었다.

실험예 29：DNA 및 지방산들의 비상호작용성

카프릴릭산 침전이 DNA를 침전시키는 능력을 가지는 것으로 기술되었다(Brodsky 등의 앞서의 문헌). 이는 이들의 동일한 음성 전하들이 서로 밀어내기 때문에 이치에 맞지 않는다. 이는 정제된 DNA가 mL 당 1㎍, 2㎍, 5㎍ 및 10㎍의 농도들로 pH 5.2 및 생리적 전도도에서 2시간 동안 0.4%의 카프릴릭산과 결합되었던 실험들에서 확인되었다. 처리 후에 DNA 농도들에서 상당한 차이들은 관찰되지 않았다. 이는 Gan 등(앞서의 문헌)이 보고한 바에 따르면 다른 것들에서 기재된 분명한 DNA 결합이 뉴클레오솜들의 히스톤 성분일 수 있는 중간 종들을 통한 직접 결합에 기인하는 점을 보여준다.

실험예 30：개시된 방법의 특징들의 부존재에서 카프릴릭산 침전에 의한 오염물 감소

실험들은 카프릴릭산 단독과 개시된 방법 사이의 차이들을 나타내기 위해 카프릴릭산에 의한 정화 성과에 대한 기준치로 기록되었다. 모든 실험들은 259,777ppm의 숙주 단백질 및 응집되지 않은 IgG의 약 30%까지의 양으로 응집체들을 포함하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물에 대해 수행되었다. 모든 실험들은 생리적 전도도에서 수행되었다. 숙주 단백질, IgG 회수 및 응집체 함량에 대한 효과들이 3.5로부터 7.0까지 0.5의 pH 단위 간격들로 평가되었다. 가장 높은 숙주 단백질 감소는 pH 3.5에서 있었지만, IgG 회수는 50% 이하였다. 가장 높은 응집체 제거는 pH 4.5에서 있었다. 가장 높은 IgG 회수는 pH 6.5 및 7.0에서 있었지만, 숙주 단백질 및 응집체 감소는 좋지 못하였다. 완전한 결과들은 다음 표에 나타나 있다.

실험예 31：개시된 방법에 대한 pH의 효과

172,038ppm의 숙주 단백질 및 22%의 응집체들도 포함하는 IgG를 함유하는 수확물이 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 및 7.0의 pH 값들에서 평가되었으며, 여기서 1%의 알란토인 및 4%의 카프릴릭산이 상기 수확물에 첨가되었고 부드럽게 혼합되었으며, 이후에 5%(v/v)의 바이오웍스 TREN 하이(High) 입자들이 첨가되었고, 원심분리 및 정밀여과에 의해 고체들을 제거하기 이전에 4시간 동안 혼합되었다. 결과들은 실험예 30보다 극히 우수하였고, 개시된 방법의 우수한 성과를 강조하였다. 완전한 결과들은 다음 표에 나타난다. FLC는 유리 경쇄를 언급한다.

이전의 실험이 최적의 pH를 개량하기 위해 보다 좁은 pH 간격들에서 반복되었다. 이들 실험들은 동일한 항체를 함유하는 다른 세포 배양 수확물에 대해 수행되었다. 완전한 결과들은 다음 표에 기재된다.

실험예 32：기능화된 입자 첨가의 부존재에서 pH 및 전도도의 결합된 영향

일련의 실험들이 수행되었고, pH 4.8, 5.2 및 5.6과 12mS/㎝, 16mS/㎝ 및 20mS/㎝의 전도도 값들의 효과들이 각기 평가되었다. 출발 물질은 동일한 항체에 더하여 213,821ppm의 숙주 단백질 및 25.6%의 응집체들을 함유하는 세포 배양 수확물이었다. 데이터는 개시된 방법이 알란토인 및 카프릴릭산 성분들에 제한되더라도 카프릴릭산만의 경우(실험예 30)보다 실질적으로 우수한 결과들을 구현하는 점을 보여준다. 완전한 결과들은 다음 표에 기재된다.

실험예 33: 상업적으로 이용 가능한 TREN 입자들과 실험적으로 제조된 TREN 입자들의 비교

상업적인 TREN 입자들은 고정 금속 친화 크로마토그래피의 기술을 수행하도록 제조되고, 압력 저항성, 한정된 균일한 입자 크기 분포 및 상기 입자들 내의 한정된 공극 크기 분포와 같은 개시된 방법을 수행하기 위해 필수적이 아닌 성질들을 구현한다. 불필요한 것 이외에도, 이들 특징들은 상기 입자들을 값비싸게 만든다. 본 발명자들은 값싼 생분해성 셀룰로오스 입자들 및 셀룰로오스 섬유들로부터 TREN을 제조하였다. 상기 입자들 또는 섬유들은 1M의 NaOH, 1mM의 수소화붕소 나트륨(sodium borohydride), 100mM의 트리스(2-아미노에틸) 아민(TREN), 그리고 320mM의 에피클로로히드린(epichlorohydrin)으로 평형화되었고, 이후에 50℃에서 4시간 동안 반응하도록 하였다. 완충제가 1M의 NaCl로 대체되었고, 이후에 잔류하는 반응 물질들 및 반응 부산물들을 제거하도록 물로 대체되었다. TREN의 고정화(immobilization)는 양이온 염료 메틸 블루(Methyl Blue)의 결합에 의해 확인되었다. pH 5.2에서 상기 수확물의 1%의 알란토인 및 0.4%의 카프릴릭산으로의 처리에 이어, 상기 실험 입자들이 5%v:v에서 상업적인 TREN 입자들과 비교되었다. IgG를 함유하는 세포 배양은 28.3%의 응집체들 및 258,999ppm의 숙주 단백질들을 함유하였다. 완전한 결과들은 다음 표에 제시된다. cTREN은 상업적인 TREN(바이오웍스 TREN 하이)를 언급하는 것이고, CP는 셀룰로오스 입자들을 언급한다. CF는 셀룰로오스 섬유를 언급한다. 1%의 실험 입자들이 1%의 상업적인 TREN을 능가하였지만, 5%의 상업적인 TREN은 5%의 실험 입자들보다 우수한 성과를 나타내었다.

실험예 34：개시된 방법과 활성 탄소 입자들의 첨가의 비교

상기 방법이 282,773ppm의 숙주 단백질들 및 33.4%의 응집체들을 포함하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물에 적용되었다. 상기 수확물은 0.4%의 아크릴산(acrylic acid) 및 1%의 알란토인에 더하여 0%, 1%, 2% 또는 4%의 활성 탄소(4메시-12메시, 다르코(Darco))로 처리되었다. 활성 탄소 첨가는 숙주 단백질을 감소시켰지만, 불균형적으로 항체 회수를 감소시켰다. 활성 탄소는 또한 4%에서 IgG를 포함하여 샘플로부터 모든 단백질을 경고 없이 돌발적으로 제거하였다. 결과들은 다음 표에 제시된다.

실험예 35：다른 양성으로 대전된 종들로 기능화된 입자들의 영향

1%, 2%, 3%, 4% 및 5%(v:v)에서의 상업적인 TREN의 효과들이 동일한 레벨들에서의 다우엑스(Dowex) AG1x2와 비교되었다. 상기 실험은 188,503ppm의 숙주 단백질들 및 26.4%의 응집체들로 포함하는 IgG를 함유하는 수확물로 수행되었다. 요약하면, 다우엑스가 약간 우수한 회수와 응집체 제거를 지원하였지만, 숙주 단백질들 및 유리 경쇄는 TREN에 의해 보다 효과적으로 제거되었다. 결과들은 다음 표에 제시된다.

실험예 36：다른 계면 화학들로 기능화된 입자들의 영향

1) 디카르복시(dicarboxy)-양이온 교환체(첼렉스(Chelex)-100, 바이오-라드), 2) 술포(sulfo) 양이온 교환체(마크로프렙 하이(MacroPrep High) S, 바이오-라드), 음성으로 대전된 알킬 소수성 고체 상(마크로프렙(MacroPrep) t부틸(butyl), 바이오-라드), 메타크릴레이트(methacrylate) 폴리머 골격 상의 보다 적은 농도의 음성으로 대전된 기들을 갖는 양성으로 대전된 입자(마크로프렙 하이(MacroPrep High) Q), 그리고 TREN(바이오웍스 TREN 하이)과 다우엑스(Dowex) AG1x2의 결합들의 효과들이 241,241ppm의 숙주 단백질들 및 23.3%의 응집체들도 함유하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물에 대해 평가되었다. 알란토인이 1%의 농도까지 첨가되었고, 이후에 0.4%에서 카프릴릭산이 첨가되었다. pH는 5.2까지 적정되었고, 샘플은 추가적인 4시간 동안 상기 입자들의 첨가까지 2시간 동안 혼합되었다. 데이터는 다음 표에 제시된다. P종들은 다양한 고체 화학 물질들을 언급한다.

실험예 37：개시된 방법에 대한 고체 및 분해되지 않은 칼슘 화합물들의 영향

652,450ppm의 숙주 단백질 및 34.1%의 응집체들도 함유하는 IgG를 함유하는 세포 배양 수확물이 1%의 알란토인, 0.4%의 카프릴릭산, 다양한 농도의 염화칼슘 또는 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite)로 처리되었고, pH 5.2까지 적정되었으며, 두 시간 동안 혼합되었다. 고체들이 제거되었고, 샘플들이 평가되었다. 0.5mM부터 8.0mM까지의 범위의 칼슘 농도들은 IgG 회수에 중대한 영향을 미치지 않았다. HCP는 ~70,000ppm-80,000ppm의 범위 내에 있었고, 경쇄 함량은 거의 감소되지 않았으며, 응집체 레벨들은 대체로 ~2.5%까지 감소하였다. 0.5%v:v 내지 4%v:v의 농도들에서 하이드록시아파타이트는 IgG 회수를 0.5%의 HA에서 79%f로부터 8%의 HA에서 38%까지 감소시켰다. 숙주 단백질은 감소되었지만, 감소는 IgG의 손실보다 작았다. 경쇄 함량은 효과적으로 감소되지 않았다. 응집체들은 연구에서 가장 낮은 값들까지 감소되었지만, 항체 손실들을 충분하게 보상하지는 않았다. 데이터는 다음 표에 제시된다. CA종들은 각기 염화칼슘(CC) 또는 하이드록시아파타이트(HA)를 언급한다. "Base"로 표시된 라인은 어떠한 칼슘 첨가제들이 없이 얻어진 결과들을 나타낸다.

실험예 38: 정제 및 IgM 단일클론 항체

세포가 없는 세포 배양 수확물이 1%의 알란토인, 0.4%의 카프릴릭산의 첨가로 처리되었으며, 약 5.6의 작동 pH를 생성하였다. 혼합물은 실온에서 2시간 동안 배양되었고, 이후에 TREN 입자들(바이오웍스 TREN 하이)이 5%v/v의 양으로 첨가되었으며, 실온에서 4시간 동안 혼합되면서 배양되었고, 그로인해 고체들이 원심분리 및 정밀여과에 의해 제거되었다. 분석적 크기 배제 크로마토그래피는 응집체들이 약 23%의 최초 농도로부터 0.5% 이하까지 감소되었던 점을 보여주었다. 숙주 단백질 피크들은 관찰되지 않았으며, 98% 이상의 순도를 나타내었지만, 저분자량의 세포 배양 배지 성분들은 포함하지 않았다. 처리된 IgM이 실험예 14의 IgG의 경우와 동일한 심층 필터를 통과하였던 병행 실험에서, 상기 IgM이 손실되었고, 이가 상기 심층 필터의 내부 표면들에 결합되었던 것을 나타내었다.

실험예 39: 비이온성 계면활성제들의 효과

1%의 알란토인이 원심분리 및 정밀여과에 의해 정화된 세포 배양 수확물의 각각의 4개의 50mL의 부분 표본들에 첨가되었다. 하나는 대조군으로 유지되었다. 트윈(Tween)-20이 각기 0.005%, 0.01% 및 0.02%의 양들로 다른 세 개에 첨가되었다. 샘플들은 10분 동안 배양되었고, 0.4%까지의 카프릴릭산의 첨가가 수반되었으며, 1M의 아세트산의 첨가에 의해 pH 5.3까지 조정되었고, 이후에 2시간 동안 배양되었다. 샘플들은 분석을 위해 제거되었고 여과되었다. TREN 입자들이 5%의 양으로 나머지 샘플들에 첨가되었고, 4시간 동안 혼합되었으며, 이후에 고체들이 정밀여과에 의해 제거되었다. TREN 입자들을 첨가하는 시점까지, 응집체 함량은 상기 제어군로부터 0.005%의 트윈까지 감소되었고, 이후에 다시 0.01%의 트윈까지 감소되었지만, 0.02%의 트윈으로 더 향상되지는 않았다. 항체 회수 및 과잉의 유리 경쇄의 함량은 대략적으로 변화되지 않았다. TREN 입자 첨가 후, 응집체 레벨은 모든 샘플들에 걸쳐 동일하였고, 경쇄 함량은 약간 영향을 받았지만, IgG 회수는 비록 0.02%에서 더 이상 그렇지 않았지만 0.01%까지의 트윈 함량으로 증가하였다.

실험예 40: 비이온성, 쌍성이온성 및 양이온성 계면활성제들의 효과들

1%의 알란토인이 원심분리 및 정밀여과에 의해 정화된 세포 배양 수확물의 각각의 50m의 부분 표본들에 첨가되었다. 하나는 대조군으로 유지되었다. 다음의 계면활성제들이 각기 0.01% 및 0.05%에서 두 개의 부분 표본들에 첨가되었다: 글리콜릭산 에톡실레이트(Glycholic acid ethoxylate) 4-노닐페닐 에테르(nonylphenl ether)(Glych., 비이온성), 에틸렌디아민 프로폭실레이트(Ethylenediamine propoxylate)-블록(block)-에톡실레이트 테트롤(ethoxylate tetrol)(TET, 비이온성), 브리지(Brij) 58(플루로닉(Pluronic) F-127, 비이온성), 트리톤(Triton) X-100(비이온성), 노니데트(Nonidet) P40(비이온성), 3-[(3-콜아미도프로필(cholamidopropyl))디메틸암모니오(dimethylammonio)]-1-프로판술포네이트 하이드레이트(propanesulfonate hydrate)(CHAPS, 쌍성이온성), 헥사데실트리메틸암모늄 브로마이드(Hexadecyltrimethylammonium bromid)(CTAB, 양이온성), 도데실트리메틸암모늄 브로마이드(Dodecyltrimethylammonium bromide)(DDTAB, 양이온성), 데실트리메틸암모늄 브로마이드(decyltrimethylammonium bromide)(DTAB, 양이온성), 미리스틸트리메틸암모늄 브로마이드(myristyltrimethylammonium bromide)(MTAB, 양이온성), 옥타데실트리메틸암모늄 브로마이드(octadecyltrimethylammonium bromide)(OTAB, 양이온성). 샘플들은 10분 동안 배양되었고, 0.4%까지의 카프릴릭산의 첨가가 수반되었으며, 1M의 아세트산의 첨가에 의해 pH 5.3까지 조정되었고, 이후에 2시간 동안 배양되었다.

실험예 41：다른 지방산들의 효과

1%의 알란토인이 원심분리 및 정밀여과에 의해 정화된 세포 배양 수확물의 각각의 50mL의 부분 표본들에 첨가되었다. 하나는 대조군으로 유지되었다. 0.4%까지의 카프릴릭산(Caprylic acid)이 다른 하나의 대조군에 첨가되었고, pH가 1M의 아세트산의 첨가에 의해 5.3까지 조정되었으며, 이후에 2시간 동안 혼합되면서 배양되었다. 수확물의 5개의 부분 표본들이 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4% 및 0.5%의 2-에틸헥산산(ethylhexanoic acid: EHA)으로 처리되었다. 이들 실험들은 3-헵텐산(3HA)으로, 이후에 3-옥텐산(3OA) 그리고 8-노넨산(8NA)으로 반복하여 처리되었다.

실험예 42：기능화된 입자들을 가지는 및 가지지 않는 옥탄산 및 8-헵텐산의 비교

1%의 알란토인이 원심분리 및 정밀여과에 의해 정화된 세포 배양 수확물의 각각의 50mL의 부분 표본들에 첨가되었다. 하나는 대조군으로 유지되었다. 0.4%까지의 카프릴릭산(Caprylic acid)이 다른 하나의 대조군에 첨가되었고, pH가 1M의 아세트산의 첨가에 의해 5.3까지 조정되었다. 혼합물은 2시간 동안 혼합되면서 배양되었고, 샘플은 시험을 위해 제거되었으며, 이후에 TREN 입자들이 5%(v:v)의 양으로 첨가되었고, 추가적으로 4시간 동안 혼합되면서 배양되었다. 고체들은 정밀여과에 의해 제거되었고 이후에 분석되었다. 이러한 실험 포맷은 0.4%, 0.5% 및 0.6%에서 8-헵텐산으로 반복되었다.

상기 실험예들로 나타낸 바와 같이, 개시된 방법들은 보다 정제의 높은 레벨들을 구현하기 위해 다른 정제 방법들과 결합될 수 있다. 이와 같은 다른 정제 방법들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 단백질 A 및 다른 형태들의 친화 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 그리고 혼합 모드 크로마토그래피 방법들과 같은 IgG의 정제를 위해 공통적으로 이용되는 다른 방법들; 또한, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비이온성 폴리머들로의 항체 침전, 또는 황산암모늄, 황산나트륨, 인산칼륨, 시트르산나트륨 혹은 시트르산칼륨과 같은 염들로의 항체 침전을 포함하는 침전 방법들; 또한, 결정화 및 2상(two-phases) 수성 추출의 방법들을 포함한다. 특정 항체의 필수적인 정제를 구현하기 위하여 다양한 방법들에 대한 조건들을 개발하고 이들을 여기에 개시된 방법들과 통합하는 것은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 이해의 범위 내에 있을 것이다.

여기서 언급되는 모든 참조 문헌들은 개개의 공보나 특허 또는 특허 출원이 각기 모든 목적들을 위해 그 개시 사항들이 참조로 포함되는 구체적이고 개별적으로 나타내어졌던 바와 같은 동일한 정도로 모든 목적들을 위해 그 개시 사항들이 참조로 포함된다. 참조로 포함되는 공보들 및 특허들 또는 특허 출원들이 본 명세서에 포함되는 개시 사항들과 모순되는 점에 있어서, 본 명세서는 임의의 이와 같은 모순되는 물질을 대체하거나 및/또는 이에 우선하는 것으로 의도된다.

성분들의 양들, 크로마토그래피 조건들을 나타내고 본 명세서와 특허청구범위에 설시되는 모든 수치들이 모든 예들에서 "약(about)"이라는 용어로 변경될 수 있는 점이 이해되어야 한다. 이에 따라, 대조적으로 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 설시되는 수치적인 변수들은 본 발명의 방법들에 의해 얻어지는 것으로 여겨지는 원하는 성과에 따라 변화될 수 있는 근사치들이다.

본 발명의 많은 변경들과 변화들이 해당 기술 분야의 숙련자에게는 자명할 것인 바와 같이 그 사상과 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있다. 여기에 기재되는 특정 실시예들은 예로서만 제시되는 것이며, 어떠한 방식으로도 한정하는 것을 의미하지는 않는다. 다음의 특허청구범위에 의해 나타나는 여기에 개시되는 방법들의 진정한 사상과 범주에서 본 명세서와 실험예들은 단지 예시적으로 간주되도록 의도된 것이다.

Claims (44)

1. 항체를 정제하는 방법에 있어서,
   (a) 혼합물을 형성하도록 적어도 하나의 항체를 포함하는 세포 배양 수확물(cell culture harvest) 또는 단백질 제제(protein preparation)를 7개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계를 포함하고;
   (b) 상기 혼합물을 고체 기재들, 가용성 기재들 및 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 기능화된(functionalized) 기재와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 기재들은 양이온성 작용기(functional group), 금속 결합 작용기 또는 이들 모두를 포함하고,
   상기 금속 결합 작용기는, (1) 폴리아민(polyamine), (2) 이민(mine), (3) N-헤테로사이클(heterocycle), (4) 아미노산(amino acid), (5) N-하이드록시아미드(hydroxyamide), (6) 아릴아민(arylamine), 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질소를 함유하는 모이어티(moiety)를 포함하며;
   (c) 상기 혼합물을 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 기재들과 접촉시킨 후에 상기 항체를 포함하는 용액을 제공하도록 고체 물질들을 분리시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, (d) 상기 세포 배양 수확물을 알란토인(allantoin)과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 알란토인은, (a) 약 0.6%부터 약 30%까지, (b) 약 1%부터 약 10%까지, 그리고 (c) 약 1%부터 약 2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내의 농도에서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 2 항에 있어서, 상기 알란토인은 영(zero)이 아닌 양으로부터 약 0.6%까지의 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 기재들의 전체 양은 약 0.01%, 0.05%, 0.1%, 0.25%, 0.5%, 1%, 2%, 5%, 10%, 20%, 또는 이들 사이의 중간 값들의 상기 제제의 전체 부피의 부피 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산 및 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 기재들은 단일의 용기 내에 배치되는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 기재들은 고체 물질들의 통과를 방지하면서 유체의 통과를 허용하는 장치 내에 배치되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 장치는 멤블레인, 모놀리스(monolith), 직물 물질(woven material), 결정성 물질, 젤리형 물질(gelatinous material), 충전된 입자들의 칼럼, 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 다공성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)는 장치 내에 배치되는 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 기재들로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 고체 물질들은 침강 또는 원심분리를 수반하는 침강에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항에 있어서, 상기 고체 물질들은 여과에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 여과는 멤브레인 여과 또는 심층 여과(depth filtration)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 12 항에 있어서, 상기 멤브레인 여과 또는 상기 심층 여과는 기능화되는 접촉 표면을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 상기 항체의 부분 정제에 의해 선행되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 수확물 또는 단백질 제제는 세포들을 함유하며, 선택적으로 상기 세포 배양 수확물이 내부에서 발생되었던 바이오리액터(bioreactor) 내에 머무르는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 수확물 또는 단백질 제제는 세포들을 함유하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질 제제는 자연적으로 생성되는 생물학적 유체인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 CH₃(CH₂)_nCOOH의 일반 구조식을 포함하며, 여기서 n은 5부터 8까지의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 에난트(enanthic)(헵탄(heptanoic))산, 카프릴릭(caprylic)(옥탄(octanoic))산, 옥텐산(octenoic acid), 펠라곤(pelargonic)(노난(nonanoic))산, 노넨산(nonenoic acid), 또는 카프릭(capric)(데칸(decanoic))산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은 노난산인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 지방산은, (a) 약 0.05%부터 약 5%까지, (b) 약 0.1%부터 약 1.0%까지, (c) 약 0.2%부터 약 0.4%까지, 그리고 (d) 약 0.1%부터 0.2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내의 농도에서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼합물은 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제 22 항에 있어서, 상기 계면활성제는 비이온성 또는 쌍성이온성(zwitterionic) 또는 양이온성인 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제 23 항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제는 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(cetyltrimethylammonium bromide)인 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제 24 항에 있어서, 상기 세틸트리메틸암모늄 브로마이드는 약 0.001%부터 0.05%까지, 또는 약 0.005%부터 0.025%까지, 또는 약 0.0075%부터 약 0.01%까지의 범위의 농도에서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 기재들은 음이온성, 양이온성 또는 쌍성이온성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 전하 구성을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 결합 작용기 및 상기 양이온성 작용기는 별도의 기재들 상에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 결합 작용기도 양이온성인 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 결합 작용기는, 트리스(tris)(2-아미노에틸(aminoethyl))아민(amine), 디에틸렌트리아민(diethylenetriamine), 트리에틸렌트리아민(triethylenetriamine), 테트라에틸렌펜타민(tetraethylenepentamine), 폴리프로필렌이민테트라아민(polypropyleniminetetramine), 폴리(poly)(아미도아민(amidoamine))(PAMAM) 덴드라이머(dendrimer), 데페록사민deferoxamine)(데스페리옥사민(desferioxamine)), 아르기닌(arginine), 히스티딘(histidine), 히스타민(histamine), 이미다졸(imidazole), 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 1 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 결합 작용기는 화학식 I의 화합물이며,
    

    

    
    여기서, 적어도 하나의 R이 선택적으로 링커(inker)를 통한 고체 지지체에 대한 부착의 부위인 조건으로 각 R의 발생률(incidence)은 독립적으로 수소 또는 C₁-C₄ 알킬(alkyl)이고;
    각각의 of X, Y 및 Z는 독립적으로 (CH₂)_n이며, 여기서 n은 2부터 6까지의 정수이고, CH₂ 기는 O 또는 NH로 선택적으로 대체되는 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 30 항에 있어서, 상기 양이온성 킬레이트화제는 트리스(2-아미노에틸)아민인 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 결합 작용기 및 음이온성 작용기는 별도의 기재들 상에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 금속 결합 작용기는 음이온성인 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 33 항에 있어서, 상기 금속 결합 작용기는 이미노디아세트산(iminodiacetic acid), 니트릴로아세트산(nitriloacetic acid), 글루탐산(glutamic acid), 아스파르트산(aspartic acid), 아미노페닐 포스페이트(aminophenyl phosphate), 그리고 이들의 결합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 34 항에 있어서, 상기 음이온성 킬레이트화제는 이미노디아세트산인 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 기능화된 기재들은 양이온성인 하나의 기재 및 음이온성인 별도의 기재를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG 또는 IgM 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
38. 항체를 정제하기 위한 방법에 있어서,
    혼합물을 형성하도록 세포 배양 수확물 또는 단백질 제제를 8개 내지 10개의 탄소 원자들을 갖는 적어도 하나의 지방산과 접촉시키는 단계;
    상기 혼합물을 알란토인과 접촉시키는 단계; 및
    상기 혼합물을 알란토인과 접촉시키는 단계 후에 상기 항체를 포함하는 용액을 제공하도록 고체 물질들을 분리시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제 38 항에 있어서, 상기 용액을 적어도 하나의 화학적으로 기능화된 고체 또는 가용성 기재와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제 39 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 화학적으로 기능화된 고체는 트리스(2-아미노에틸)아민을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 알란토인이, (a) 약 0.6%부터 약 30%까지, (b) 약 1%부터 약 10%까지, (c) 약 1%부터 약 5%까지, 그리고 (d) 약 1%부터 약 2%까지로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 범위 내의 농도에서 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제 38 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 알란토인은 영(zero)이 아닌 양으로부터 약 0.6%까지의 범위 내에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
43. 제 38 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 IgG 또는 IgM 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제 1 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행을 가능하게 하는 키트(kit).