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KR102033276B1 - T 조절 세포의 생체 내 확장 방법 - Google Patents

T 조절 세포의 생체 내 확장 방법 Download PDF

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KR102033276B1
KR102033276B1 KR1020187037260A KR20187037260A KR102033276B1 KR 102033276 B1 KR102033276 B1 KR 102033276B1 KR 1020187037260 A KR1020187037260 A KR 1020187037260A KR 20187037260 A KR20187037260 A KR 20187037260A KR 102033276 B1 KR102033276 B1 KR 102033276B1
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유니버시티 오브 마이애미
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Abstract

TNF-수용체 상과 멤버 25(TNFRSF25, DR3)에 특이적인 조성물은 T 조절 세포를 조절함으로써 면역 반응을 조정한다.

Description

T 조절 세포의 생체 내 확장 방법{METHOD FOR IN VIVO EXPANSION OF T REGULATORY CELLS}
본 발명은 U.S. 정부로부터 지원받는 국립 암 연구소에 의해 부여받은 부여 번호 5PO1CA109094-03 및 국립 알레르기 및 전염병 연구소에 의해 부여받은 부여 번호 5RO1AI061807-05 하에서 만들어졌다. U.S. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
본 발명은 2009년 8월 3일에 출원된 미국 가출원 번호 61/273,299에 대해 우선권을 주장하며, 이의 전체가 참조로 본원에 포함된다.
본 발명의 실시예는 생체 내에서 T 세포를 조절하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 상기 조성물 및 방법은 인간 CD4+FoxP3+ 세포를 조절한다.
종양 괴사 인자 상과(superfamily)(TNFSF)는 림프성 및 비-림프성 세포 모두에 의해 별도로 그리고 일시적으로 발현되는 적어도 19개의 리간드 및 30개의 수용체(TNFSF)로 구성된다. CD3+T 세포에서, TNFSF 신호는 항원 특이적 및 비-특이적 방법 모두에 기능하여 분극화, 확장, 작용자 기능, 수축, 기억 및 죽음을 포함하는 면역 반응의 다양한 단계를 지지한다. TNFSF15(TL1A)는 TNFRSF25(DR3, 이하 TNFR25로 지칭됨)에 대한 리간드이고, TNFR25의 세포사유도영역(death domain)-함유 세포질 꼬리(cytoplasmic tail)를 통해 TRADD 또는 FADD 신호 폭포를 촉발함으로써 TNFR25-발현 T 및 NKT 세포를 양성 또는 음성으로 바꿀 수 있다. TNFR25 신호는 천식, 염증성 장질환(IBD), 실험적 자가면역 뇌염(EAE) 및 류마티스 관절염(RA)를 포함하는 자가-염증성 질환에서 관찰된 병리학에 중요한 기여자이다. TL1A의 항체 차단은 마우스에서 급성 천식을 방지할 수 있고, TNF25의 유전적으로 녹아웃 (knockout)은 EAE 또는 RA의 실험 모델에서 병리학적 발생을 현저히 둔화시킨다. TL1A는 NKT, Th2 및 Th17세포의 분극화, 분화 및 작용자 기능을 향상시킴으로써 이러한 질병의 발전에 기여한다.
본 발명의 목적은 T 조절 세포의 생체 내 확장 방법을 제공하는 것이다.
이 요약은 본 발명의 본질 및 성분을 간략히 나타내도록 본 발명의 요약을 제시하기 위해 제공된다. 이것은 본 발명의 범위 또는 의미를 제한하거나 해석하기 위해 사용되지 않을 것으로 이해된다.
본질적으로 발현된 CD4+T 세포 상의 TNF-수용체 상과 멤버 25(TNFRSF25, DR3)를 통한 신호는 TH2 및 TH17 시토킨 생산을 향상시키고, 천식, 염증성 장질환, 다발성 경화증(MS), 실험적 자가면역 뇌염 및 류마티스 관절염의 질병 모델의 병리학적 염증에 기여한다.
바람직한 실시예에서, TNFRSF25 신호를 조절하는 약제(agents)는 면역 세포 반응을 조절한다. 이러한 약제는 이러한 질병 및 질환에 대해 신규한 치료법을 제공한다. 예를 들어, TNFRSF25의 작용자는 CD4+FoxP3+ 세포가 투여 후 4일 이내에 모든 CD4+ 세포의 30-35%로 확장을 생체 내에서 신속하고 대규모로 이루어지게 한다. CD4+FoxP3+ 세포의 증가는 높은 수준의 GITR 및 CD103를 발현하는 CD4+FoxP3+CD25+ 세포의 증가된 증식에 의했다. TNFRSF25 작용자는 시험관 내에서 TGF-β-의존 억제 활성이 보유된 CD4+FoxP3+ 세포를 확장시켰으며, 이는 지속된 TNFRSF25 신호에 의한 폐기에 민감했다. 주효 세포 반응을 조절하는 것 외에 TNFRSF25 신호는 T 조절 세포 확장 및 활성의 통제를 통해 염증 반응의 유도 및 해결 모두에 중요한 역할을 담당한다.
본 발명의 다른 양태는 하기에서 설명된다.
도 1a 내지 도 1c은 TNFR25가 생체 내에서 CD4+FoxP3+ 세포의 신속한 증식을자극하는 것을 도시한다. 도 1a: 종래의 그리고 조절 T 세포 상에서 TNFR25, GITR, OX40 및 4-1BB의 상이한 발현을 도시한다. TNFRSF 발현은 처치되지 않은 FIR 마우스로부터 채취된 지라세포로부터 고도로 정제된 CD4+FoxP3-(Tconv) 및 CD4+FoxP3+ Treg 상에서 유세포 분석에 의해 결정되었다. 도 1b: 4C12 주사 후에 말초 혈액에서 CD4+FoxP3+ Treg 세포의 동역학 및 투여량-의존성 확장을 도시한다. FoxP3-RFp 리포터(FIR) 마우스에게 제시된 정제된 4C12의 양을 복강 내(i.p)로 주사했다. 매일 혈액을 마우스로부터 추출했고 FoxP3-RFP 발현을 유세포 분석에 의해 말초 혈액 세포에서 분석했다. 도 1c는 TNFR 아고니스트 항체로 처치한 후에 Teg 확장을 비교한 것이다. 0일째에 제시된 항체(100 μg)를 복강 내로 마우스에 주사했다. 도 1b에서처럼 매일 혈액을 마우스로부터 6일 동안 마우스로부터 추출했고, 4일째에 총 CD4+ T 세포에 대한 말초 혈액 Treg의 비율을 도시했다. 이러한 데이터는 8번의 독립적인 실험에 걸쳐 재생되었다. 오차 막대는 평균±SEM을 지시한다. 유의성을 스튜던트 t-테스트(도 1b), Tukey 사후-테스트와 함께 한 방향 ANOVA에 의해 결정했다(도 1c). *(p<0.05), **(p<0.01) 및 ***(p<0.001).
도 2a 내지 2f는 TNFR25 유도 Treg확장이 TCR 및 IL-2 신호를 요구한다는 것을 보여준다. FIR 마우스로부터 분류한 FAC에 의해 CD4+ 세포를 고도로 정제하고 MHC II-/- 또는 CD4-/- 마우스 안으로 인입 전달(adoptively transferred)했다. 인입 전달 이후에, 수용자 마우스를 4C12 또는 아이소타입 대조군 항체 중 어느 하나로 처치했고 FoxP3-RFP 양성 세포의 비율(도 2a) 및 절대 수(도 2b)를 항체 처치 후 4일째에 분석했다. FIR 마우스를 시클로스포린-A(도 2c) 또는 FK506(도 2d)로 처치하거나 -4일째부터 -1일째까지 방법에서 설명된 바와 같이 비히클 대조군을 복강 내 주입하였다. 4C12 항체 또는 IgG 대조군 항체로 마우스를 처치했고 말초 혈액 내의 CD4+ 세포와 관련된 FoxP3-RFP 양성 세포의 비율을 4일째에 분석했다. 4C12 또는 아이소타입 대조군 항체 중 어느 하나로 처치한지 4일째에 총 CD4+ 지라세포 중 CD4+FoxP3+ 세포의 비율을 C57BL/6 대조군 마우스와 비교하여 IL-2 수용체 베타 결손 마우스(도 2e) 또는 CD80/86-/- 마우스(도 2f)를 분석했다. 이러한 데이터는 한번 실험에 한 군 당 3마리 이상의 마우스로 적어도 2번 독립적으로 실험하여 평균±S.E.M.으로 나타냈다. **은 p<0.01을 나타내며, ***은 p<0.001을 나타낸다.
도 3a 내지 3e는 TNFR25 확장 Treg이 IL-2에 과민성이며 Akt 활성을 요구한다는 것을 보여준다. 도 3a는 대조군 IgG 또는 4C12 항체로 처치한지 4일째에 FIR 마우스로부터 CD4+FoxP3+ 세포를 정제했고 생체 내에서 IL-2의 제시된 양과 함께 배양한 것을 도시한다. 삼중 티미딘의 포함에 의해 배양한지 3일째에 CD4+FoxP3+ 세포 증식을 측정했다. 도 3b는 앞서 정제된 CD4+FoxP3+ 세포(도 3a) 및 유세포 분석으로 IL-2Rγ(CD32) 또는 IL-2Rβ(CD122)의 표면 발현을 결정한 것을 도시한다. 도 3c는 IgG 또는 4C12 항체로 처치된지 4일째에 FIR 마우스로부터 정제된 CD4+FoxP3+ 세포를 시험관 내에서 10 ng/ml의 IL-2로 처치한지 15분째에 pSTAT5의 발현에 대해 분석했다. FIR 마우스를 라파마이신으로 하루에 1회 처치하거나(도 3d) Akt 억제자 V로 하루에 2회 처치하거나(도 3e) 방법에서 설명한 바와 같이 -4일째로부터 -1일째까지 비히클 대조군을 복강 내 주사하여 처치했다. 0일째에 4C12 또는 대조군 IgG 항체 중 어느 하나로 마우스를 처치했고, 말초 혈액 내의 총 CD4+ 세포에 관하여 FoxP3-RFP 양성 세포의 비율을 -4일째에 분석했다. 이러한 데이터는 한번 실험에 한 군 당 2마리 이상의 마우스로 적어도 2번 독립적으로 실험하여 평균±S.E.M.으로 나타냈다. ns는 유의하지 않음을 나타내며, ***은 p<0.001을 나타낸다.
도 4a 내지 도 4e는 TNFR25에 의한 생체 내 Treg 확장이 알레르기성 천식에서 염증을 저해하는 것을 보여준다. 난백/백반으로 면역화하여 알레르기성 천식을 유도한 후 물질 및 방법에서 설명되는 바와 같이 난백/PBS로 분무 도전시켰다. 도 4a: 말초 혈액을 수집하고 난백/백반 면역화된 마우스로부터의 총 CD4+ T 세포 중의 CD4+FoxP3+ 세포의 분율에 대하여 4C12 또는 아이소타입 대조군 항체 중 어느 하나로 처치한 후의 비-면역화된 마우스와 비교하여 분석했다. 데이터는 평균±S.E.M.으로 제시된다. 도 4b: 총 폐 세포를 채취했고 유세포 분석으로 분석했다. 각각의 제시된 세포 집단의 총 수가 도시된다. 데이터는 평균±S.E.M.으로 제시된다. 도 4c: 총 CD4+ T 세포 중 CD4+FoxP3+의 비율을 나타낸다. 도 4d: 설명된 바와 같이 난백/PBS로 분무 주입된지 3일째에 수집된 기관지 폐포 세정액(BALF)을 나타낸다. 호산구의 총 수가 도시된다. 데이터는 평균±S.E.M.으로 제시된다. 도 4e: 총 RNA가 총 폐 세포로부터 추출되고 실시간 RT-PCR을 위해 사용된다. 4C12 또는 아이소타입 대조군으로 처치된 마우스 내의 IL-4, IL-5 및 IL-13의 발현 수준을 식염수-분무주입된 대조군 폐 세포에 관하여 도시했다. 도 4f: 폐를 채취했고 조직학적 구획에 대해 절개했다. H&E(좌측 패널) 뿐만 아니라 PAS(우측 패널)을 각각의 처치군에 대해 수득했다. 대표적인 영상이 도시된다. 이러한 데이터는 실험 당 하나의 군에 대하여 적어도 3마리의 마우스로 4번의 독립적인 실험으로 반복해서 얻었다. 도 4g: 방법에서 설명되는 바와 같이 Image J 소프트웨어를 사용하여 PAS 염색된 구획을 정량했다. 2개의 분리된 실험으로부터 5개 이상의 마우스 각각으로부터 2개의 대표적인 영상을 정량했다. Tukey 사후-테스트와 함께 한 방향 ANOVA를 사용하여 통계적 유의성을 결정했다. IgG 군 또는 식염수-대조군 군과 비교하여 4C12 또는 IAC 중 어느 하나로 처치된 군에서 *는 p<0.05, **는 p<0.01, 및 ***는 p<0.001로 제시된다.
도 5a 내지 5f는 TNFR25자극이 존재하는 CD4+FoxP3+CD25int 세포의 증식을 유도함으로써 생체 내에서 Treg 확장을 초래한다는 것을 보여준다. 도 5a: 0일째에, FIR 마우스를 IgG 또는 4C12로 처치했고 지라 세포를 4일 후에 채취했고 유세포 분석에 의해 분석했다. 말초 혈액 세포로부터의 대표적인 유세포 분석 도표는 제시된 처치 후 4일째에 마우스로부터 수집된다. 도 5b: 제시된 처치 후 4일째에 지라세포 내의 CD25hi 대 CD25int의 평균 비율. 도 5c: 대표적인 점 도표는 CD4+, FoxP3+ 세포 상에서 미리-게이팅된(pre-gated) 것을 보여준다. 페센트는 CD4+FoxP3+ 세포의 총 분율에 대하여 각각의 표현형의 기여도를 지시한다. 도 5d: 도 5a에서 설명된 바와 같이 제시된 처치 후에 CD25hi 및 CD25int 중 Ki67+ 또는 Ki67-의 평균 비율. 데이터는 평균±S.E.M.으로 제시된다. 도 5e: CD4+FoxP3- 및 도 5f: CD4+FoxP3+ 세포를 CD45.2+ FIR 마우스로부터 99% 초과의 순도로 분류했고, 각각의 서브세트로부터 2 x 106개의 세포를 CD45.1 유전자도입 B6-SJL 마우스 안으로 인입 전달했다. 24시간 후, 마우스에 20 mg 4C12 또는 IgG 각각을 복강 내 주사했다. 도 5e. 12g: 유전자도입 CD45.1 B6-SJL 마우스 안으로 CD4+FoxP3- 및(도 5f, 5h) CD4+FoxP3+ 세포의 도입. 도 5e, 5f: 인입 전달 후 5일째에 CD4+ 세포 중 CD45.2+ 및 RFP+(FoxP3+)의 퍼센트를 보여주는 막대 그래프. 도 5g, 5h: 4C12 또는 햄스터 IgG 처치 후 도입된 세포 수축의 동역학. 숙주 CD45.1+CD4+FoxP3- 세포 중 도입된 세포(CD45.2+CD4+)의 퍼센트(도 5e) 또는 숙주 CD45.1+CD4+ 세포 중 CD45.2CD4+FoxP3+의 퍼센트(도 5f)가 도시된다. 오차 막대는 두 번의 독립적인 실험 각각에 대한 군 당 3마리의 마우스의 평균 퍼센트±SEM을 지시한다. *는 p<0.05를 지시하고 **는 p<0.01을 지시한다.
도 6a 내지 도 6f는 생체 내 확장된 Treg의 억제 활성을 보여준다. 4일째에 4C12 및 IgG 아이소타입 대조군 주입된 마우스로부터 CD4+FoxP3+ Treg 세포를 분류했고 이를 72시간 동안 Tconv 및 가용성 α-CD3(2 μg/ml)로 CD4+FoxP3-CD25-를 사용하여 시험관 내 표준 억제 검정을 시도했다(96웰, 원형 바닥 플레이트). 상이한 비율의 Treg:Tconv를 사용하여(도 6a, 6b)1:1 항원 표시 세포(APC)의 부존재(도 6a, 6c) 또는 존재(도 6b, 6d) 하에서 상기 검정을 수행했다. 도 6c 및 6d에서, IgG, 4C12 또는 DTA1(10 g/ml) 항체를 억제 검정에 첨가했다. Treg:Teff 비율을 1:2로 일정하게 유지했다. 도 6e: TNFR 우세 음성(dominant negative)(DN) 마우스로부터의 Teff 세포 및 wt 마우스로부터의 Treg 세포를 사용했다. IgG 또는 4C12 항체(10 μg/ml)을 억제 검정에 첨가했다. Treg:Teff 비율은 1:2이다. 도 6f: IgG 또는 4C12 주입된 마우스로부터의 CD4+CD25hi 및 CD4+CD25int Treg 세포를 사용했다. 신틸레이션 계수기 상에서 검정을 분석하기 6시간 전에 3H-티미딘을 첨가했다. Treg의 부존재 하에서 Teff를 함유하는 웰에서 수득된 총 계수의 페센트로 제시된 조건에 대하여 얻어진 계수를 사용하여 퍼센트 증식을 계산했다. 데이터는 한번 실험시에 군 당 6 마리를 초과하는 마우스로 2번의 독립적인 실험 각각에서 각각의 조건에 대한 4개 이상의 표본을 이용한 평균±SEM으로 표시된다.
도 7a, 7b는 4C12 또는 재조합 IL-2/항-IL-2 항체 복합체(IAC)로 처치함으로써 확장된 Treg의 비교를 보여준다. 도 7a: 0일째에 FIR 마우스를 4C12(10 μg)으로 처치하거나 0-2일째에 IAC로 3회 연속적으로 주입하여 처치했다. CD4+ T 세포 집단 내의 FoxP3+ 세포의 비율을 유세포 분석에 의해 말초 혈액에서 매일 측정했다. 도 7b: IAC, 4C12 또는 아이소타입 대조군 IgG로 처치한 후 4일째에 FIR 마우스 4로부터 지라세포를 단리했다. CD25를 발현하는 CD4+FoxP3+ 세포의 비율 및 증식 표지 Ki67이 도시된다.
도 8a 내지 도 8d는 4C12 처치가 분석된 모든 조직에서 Treg 확장을 유도한다. 도 8a: CD4 및 FoxP3(RFP)에 대해 염색된 전형적인 유세포 분석 점 도표의 예. 4차 Q2-1로부터의 CD4+FoxP3+ 세포를 도 8b 내지 도 8d에서 도시되는 바와 같이 CD25hi 및 CD25int의 차후 분석을 위해 게이팅했다. 도 8b: GITR의 비율 및 도 8c: 제시된 처치 후 4일째에 지라세포에서 CD25hi 대 CD25int 중 CD103 발현. 도 8d: 데이터는 한번 실험시에 군 당 적어도 3마리의 마우스로 8번을 초과하는 독립적인 실험으로부터의 평균±SEM으로 표시된다. 쌍 분석을 스튜던트 T-테스트를 이용하여 수행했다. **는 p<0.01을 지시하고 ***는 p<0.001을 지시한다.
도 9a 내지 도 9b는 분류 전략 및 수득한 결과의 예를 도시한다. 도 9a: 지라세포를 FIR 마우스로부터 채취했으며, CD4+ T 세포에 대해 풍부하게하고 CD4+ 및FoxP3+(RFP)에 기초하여 분류했다. 좌측 패널은 전형적인 지라세포의 CD4-풍부 집단을 나타낸다. 중간 및 우측 패널은 CD4+FoxP3+(P3 게이트) 및 CD4+FoxP3+(P4 게이트) 집단에 대해 대표적인 후-분류 분석을 나타낸다. 도 9b: 일부 실시예에 대하여, CD4+FoxP3+ 세포(게이트 P3)를 CD25 발현에 기초하여 분류했다. 대표적인 도표가 CD25hi 및 CD25int 분류를 위한 게이팅 전략을 입증하는 것을 보여준다.
도 10a 내지 도 10e는 TNFRSF25 작용자 보호가 덱스트란-소듐 설페이트 유도 대장염, 크론씨병의 마우스 모델로부터 유래된 것일 수 있다는 것을 증명한다. C57BL/6 마우스 또는 TL1A 녹아웃 마우스를 7일 동안 임의의 식용수에 용해된 3% 덱스트란 소듐 설페이드(DSS)와 함께 제공했다. 일부 실험에서, 0일째에 마우스를 IgG 아이소타입 대조군 항체 또는 TNFRSF25 아고니스트 항체, 클론 4C12로 처치했다. DSS의 공급(실험 -4일째) 이전에 실험 시작 후 4일 동안 매일 무게를 달았다. -4일째에, TNFRSF25 아고니스트 항체, 클론 4C12을 복강 내 주사(20 μg/마우스)로 마우스의 한 군에게 처치했고, 이와 동시에 다른 아무스를 햄스터 IgG 아이소타입 대조군 항체로 처치했다. 동물이 최초 체중의 20%이상을 손실했을 경우에 치사율을 측정했다(도 10a). 일부 실험에서, 동물을 실험일 5일째에 죽였고, RNeasy miniprep 키트(Qiagen)를 사용하여 급속 냉동, PBS-세척된, 결장 조직으로부터 총 RNA를 준비했다. 그 뒤에, RNA를 역전사했고(Quantitect RT, Qiagen), 지시 전사를 위한 Taqman(Applied Biostystem) 탐침을 사용하여 실시간 PCR에 의해 cDNA를 증폭했다(도 10b). 데이터는 C57BL/6 대조군 마우스에 비해 TL1A 녹아웃된 마우스에서 발현에 대하여 배수 변화로 보여진다. 체중 손실 비율을 모니터링했고, 각각의 실험 군에 대하여 연구 진행 동안에 표시했다(도 10c). RNA 단리를 위해 실험 5일째에 동물을 죽이는 실험에서, 유세포 분석에 의해 전사 인자 FoxP3, 조절 T 세포 풀의 지시자를 발현하는 CD4+ 세포의 비율에 대한 분석을 위해 장간막림프절을 단리했다(도 10d). 마지막으로, 도 10b로 설명되는 지시된 처치 군으로부터 단리된 RNA를 사용하고 지시된 전사를 위한 RT-PCR에 투입하여 역전사를 수행했다. 오차 막대는 실험당 3 이상의 평균±S.E.M.을 지시하고, 패널 당 최소 2번의 실험을 진행했다.
도 11은 TNFRSF25 아고니스트가 이소성 심장 이식 모델의 마우스에서 동종 이계 심장의 급성 거부반응을 늦춘다는 것을 증명했다. 4C12 확장 천연 Treg에 의한 내성 유도를 연구하기 위하여, 내성 연구를 잘 설명하는 이소성 심장 이식 모델을 사용했다. 4C12 확장된 천연 Treg에 의한 내성 유도에 대한 연구를 위해서, 내성 연구를 잘 설명하는 종속 심장 이식 모델을 선택했다. CBA/J 마우스(H2d)로부터의 심장을 0일째에 C57BL/6 마우스(H2b)의 복부 안에 이식했다. -4일째에, 마우스중 하나의 군을 TNFRSF25 아고니스트 항체, 클론 4C12로 복강 내 주사로(20 μg/마우스) 처치했으며, 이와 동시에 나머지를 햄스터 IgG 아이소타입 대조군 항체로 처치했다. 이식하는 시점에, 혈액 내에서 Treg 확장을 4C12 처치된 군에서 확인했다. 동종이식편 생존을 수동적으로 심장을 촉진함으로써 모니터링했고, 맥박을 0 내지 4로 매겼다(0 = 맥박 없음; 1 = 매우 약한 맥박; 2 = 약한 맥박; 3 = 중간 정도의 맥박; 4 = 강한 맥박). 거부반응은 감지할 수 있는 심장 박동의 중단으로서 정의된다. 거부반응 시점에(= 심장박동이 멈춘시점), 이식편을 제거했고, 포르말린으로 고정하고 병리학적 검사를 했다. 이식 후 48시간 내에 이식편 기능의 손실은 기술적인 실패로 가정되고(< 5%), 추가적인 분석을 생략했다.
도 12는 TNFRSF25 아고니스트가 천연 T 조절 세포를 선택적으로 확장시키지만, 유도된 T 조절 세포는 확장시키지 않는다는 것을 증명한다. CD4+FoxP3- T 세포를 FoxP3-RFP 리포터 유전자를 발현하는 마우스로부터 단리했고, 표준 프로토콜에 따른 IL-2, TGF-베타, 항-CD3 항체 및 레티노산의 존재 하에서 5일 동안 시험관 내에서 배양했다. 배양 기간의 말미에서, CD4+ 집단 내에 함유된 독자 생존 가능한 세포는 70-85%의 CD4+FoxP3-RFP+ 유도 조절 T 세포(iTreg)를 함유했다. 이러한 세포를 고속 세포 분류에 의해 정제했다. 이와 동시에, 총 CD4+ 세포를 FoxP3-GFP 리포터 유전자를 발현하는 마우스로부터 정제했다(따라서 이러한 세포는 iTreg 및 흉선 유도성 천연 조절 T 세포(nTreg)의 혼합물을 함유함). iTreg(6 x 105의 iTreg 세포를 8 x 105 Treg을 함유하는 FoxP3-GFP 마우스로부터 단리된 총 CD4+ 세포와 혼합함) 및 CD4-/- 수용자 마우스 안으로 (정맥 내 주사에 의해) 인입 전달됨. 2일 후에, RFP-양성 iTreg 및 GFP-양성 nTreg의 혼합물을 함유하는 CD4-/- 수용자 마우스를 4C12 또는 IgG 아이소타입 대조군 항체 중 어느 하나로 처치했다(20 μg/마우스, 복강 내 주사에 의함). 5일 후에, RFP-양성 iTreg 및 GFP-양성 총 Treg(nTreg의 공급원만을 함유함)의 비율을 단리된 지라세포의 유세포 분석에 의해 결정했다(도 12).
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 설명되며, 여기서 유사한 참조 번호는 비슷하거나 동등한 요소를 지정하도록 도면 전반에 사용된다. 도면은 척도에 맞게 그려지지 않고 본 발명을 설명하기 위한 목적으로만 제공된다. 본 발명의 몇몇 양태는 설명을 위한 실시예를 참고하여 하기에서 설명된다. 다양한 구체적인 세부 사항, 관계 및 방법은 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 서술되었다고 이해되어야 할 것이다. 관련 분야에 통상의 기술자는 본 발명이 하나 이상의 구체적인 세부 사항 없이 또는 다른 방법으로 실시될 수 있다. 본 발명은 실시 또는 실행의 설명된 순서에 제한되지 않으며, 일부 실시가 다른 순서로 일어날 수 있거나 및/또는 다른 실시 또는 실행과 함께 동시에 일어날 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 방법론을 시행하기 위해 모든 설명되는 실시 또는 실행이 요구되는 것이 아니다.
모든 유전자, 유전자 이름 및 본원에 개시된 유전자 산물은 본원에 개시된 조성물 및 방법에 적용하기 위한 임의의 종으로부터 유래된 동족체에 상응하는 것으로 생각된다. 따라서, 용어는 인간 및 마우스로부터의 유전자 및 유전자 산물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 종으로부터의 유전자 또는 유전자 산물이 개시되는 경우에, 본원은 예시적일 뿐이고 명세서에서 명백하게 나타나지 않는 한 제한하는 것으로 해석되지 않는 것으로 생각된다. 따라서, 예를 들어 본원에서 개시된 예 4C2 분자는 마우스에 제한되지 않으며 또, 인간 항체가 바람직하며, 포유류 핵산 및 아미노산 서열에 관련된 일부 실시예는 포유류, 어류, 양서류, 파충류, 및 조류를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 동물들 로부터의 상동 및/또는 이종상동성 유전자 및 유전자 산물을 아우르는 것으로 생각된다. 바람직한 실시예에서, 유전자 또는 핵산 서열은 인간의 것이다.
따로 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 용어(기술 및 과학 용어를 포함)는 본 발명에 따른 당해 분야에 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 사용된 사전에서 정의되는 바와 같은 용어는 관련 분야의 맥락에서 이들의 의미와 일관되는 의미를 갖는 것으로 해석되고 본원에서 분명히 정의되지 않는 한 이상화되거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않을 것이다.
정의
본원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시예를 설명하기 위한 목적이고 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단수형 "a", "an" 및 "the"는 따로 명백히 제시되지 않는 한 복수형 또한 포함하는 것으로 의도된다. 나아가, 용어 "포함하는(including)", "포함한다(include)", "갖는", "갖다" 또는 이들의 변형은 상세한 설명 및/또는 청구항에서 사용되며, 이러한 용어는 용어 "포함하는(comprising)"과 유사한 폭넓은 방식으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당해 분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있는 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 값이 어떻게 측정되고 결정되는 지, 즉 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 당해 분야에서 실시시마다 1 이상의 표준편차 내를 의미할 수 있다. 또는, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더 바람직하게는 최대 5%, 가장 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 관해서는, 상기 용어는 값의 10배, 바람직하게는 5배, 더 바람직하게는 2배 내를 의미할 수 있다. 명세서 및 청구항에서 설명된 특정 값은, 따로 명시되지 않는 한, 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"은 추정될 수 있을 것이다.
"T 조절 세포" 또는 "Treg 세포" 또는 "Tr 세포"는 T 세포 반응을 조정할 수 있는 세포를 지칭한다. Treg 세포는 전사 인자 Foxp3을 발현하며, 이는 T 세포 활성화에 따라 상향조절되지않고 활성화된 주효 세포로부터 Treg을 식별한다. Treg은 CD25, CTLA4 및 GITR의 세포 표면 표지에 의해 식별된다. 몇몇의 Treg 서브세트는 자가면역 및 만성 염증 반응을 억제하는 능력 및 종양-함유 숙주에서 면역 내성을 유지하는 능력을 갖는 것으로 식별되었다. 이러한 서브세트는 T 조절형 1(Tr1) 세포를 분비하는 인터류킨 10-(IL-10-), T 도움형 3(Th3) 세포를 분비하는 형질전환생장인자-β-(TGF-β-), 및 "천연" CD4+/CD25+ Tregs(Trn)을 포함한다 (문헌[Fehervari 및 Sakaguchi. J. Clin. Invest. 2004, 114: 1209-1217]; 문헌[Chen 등, Science. 1994, 265: 1237-1240]; 문헌[Groux 등, Nature. 1997, 389: 737-742]).
"TNFR25 작용자", "TNFR25 약제", TNFR25 조성물"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 TNFR25 수용체에 결합하고 천연 TNFR25 리간드, 예를 들어 TL1A에 세포를 노출시킴으로써 관찰될 수 있는 반응과 유사하게 발현하는 TNFR25 수용체 상의 세포에서 반응을 촉발하는 성분을 지칭한다. 작용자는 의미상으로 길항자에 반대 의미이며, 작용자는 길항자가 수용체에 결합하는 동안에 수용체를 활성화하는데에 실패하고 내생성 도는 외생성 작용자에 의한 활성화를 실질적으로 완벽히 또는 부분적으로 차단한다. 부분 작용자는 수용체를 활성화하지만 완전 작용자와 같은 정도의 생리학적 변화를 유발하지 않는다. 대안적으로, TNFR25 작용자의 또 다른 예는 TNFR25를 결합 및 활성화할 수 있는 항체이다. 항-TNFR 항체의 예는 4C12(작용자)이다 (마이애미 대학을 대신하여 부다페스트 조약 하에서 기탁됨; 2009년 5월 5일에 ATCC®에 의해 시드/균주(들)을 수령했음; ATCC® 특허 기탁 명칭은 PTA-10000임. 기탁자에 의한 식별 명칭은 혼성 세포주, 4C12임; 기탁물은 2009년 6월 4일에 시험 되고 그 날짜에 시트/균주(들)을 허가했음. 국제 기탁 당국은 미국, 버지니아주, 매너서스에 위치한 미국 균주 보관 기관(ATCC®)임).
"TNFR25 길항자"는 TNFR25 수용체의 정상적인 생리학적 기능을 저해하는 성분으로 본원에서 지칭된다. 이러한 약제는 TL1A와 같은 내재성 수용체 길항자/리간드의 결합을 TNFR25 수용체로 방해함으로써 작용한다.
TNFR25 길항자 또는 작용자는 압타머의 형태로 존재할 수 있다. "압타머"는 다른 분자에 결합하는 이들의 능력에 기초하여 무작위 풀(pool)로부터 선택되는 DNA 또는 RAN 분자이다. 압타머는 표적 분자에 특이적으로 결합하되, 표적 분자인 핵산 분자는 자연 상태에서 표적 분자로 여겨진 서열을 포함하는 서열을 갖는다. 대안적으로, 압타머는 표적 분자에 결합하는 핵산 분자일 수 있으며, 상기 표적 분자는 핵산에 자연적으로 결합하지 않는다. 상기 표적 분자는 관심있는 임의의 분자일 수 있다. 예를 들어, 압타머는 단백질의 리간드-결합 도메인에 결합하는데에 사용될 수 있으며, 이에 의하여 자연 발생 리간드와 단백질의 상효작용을 방지할 수 있다. 이는 제한되지 않는 예이고 당해 분야에 것들은 다른 실시예가 당해 분야에 일반적으로 공지된 기술을 사용하여 용이하게 생성될 수 있다고 인식할 것이다(예를 들어, 문헌[Gold 등, Annu. Rev. Biochem. 64:163, 1995]; 문헌[Brody 및 Gold, J. Biotechnol. 74:5, 2000]; 문헌[Sun, Curr. Opin. Mol. Ther. 2: 100, 2000]; 문헌[Kusser, J. Biotechnol. 74:21, 2000]; 문헌[Hermann 및 Patel, Science 257:820, 2000]; 및 문헌[Jayasena, Clinical Chem. 45: 1628, 1999] 참조).
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 인간 및 인간화된 항체를 포함하여 모든 종을 포괄하며, 항원 표적, 예를 들어 TNFR25는 임의의 종으로부터 유래될 수 있다. 따라서, 항체, 예를 들어 항-TNFR25은 마우스 항-인간 TNFR25, 염소 항-인간 TNFR25; 염소 항-마우스 TNFR25; 랫트 항-인간 TNFR25; 마우스 항-랫트 TNFR25 등일 수 있다. 다른 종으로부터의 또는 일부 예에서는 동일한 종(예를 들어, 자가면역 또는 염증 반응)으로부터의 항원 표적, 예를 들어 TNFR25에 대하여 특정 종에서 생성된 항체의 조합은 방대하고 모든 종은 본 발명에 포함된다. 용어, 항체는 광범위한 의미로 사용되고 완전히 조립된 항체, 단일클론 항체(인간, 인간화 또는 키메라 항체를 포함), 다클론성 항체, 다중특이적 항체(예, 이중특이적 항체), 및 항원에 결합할 수 있는 항체 단편(예, Fab', F'(ab)2, Fv, 단일쇄 항체, 디아바디즈(diabodies))을 포함하며, 선행하는 것들이 소정의 생물학적 활성을 보이는 한 이들의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
"표적 분자"는 단백질, 탄수화물, 효소, 다당류, 글리코단백질, 수용체, 항원, 항체, 성장인자를 포함하여 임의의 고분자를 포함하거나; 호르몬, 기질, 대사 산물, 공동 인자, 저해제, 약물, 염료, 영양소, 살충제, 펩티드를 포함하여 임의의 작은 유기분자일 수 있거나; 금속, 금속 이온, 금속 산화물 및 금속 착물을 포함하여 무기 분자일 수 있으며; 세균, 바이러스, 및 원생동물과 같은 단일-세포 진핵생물을 포함하여 모든 생물체일 수도 있다.
상태, 장애 도는 질환의 "치료하는" 또는 "치료"는 (1) 상태, 장애 또는 질환에 걸리게 하거나 이로 고통받을 수 있지만, 상태, 장애 또는 질환의 임상적 도는 준임상적 증상을 아직 경험하거나 보이지 않는 포유류에서 진전된 상태, 장애 또는 질환의 임상적 또는 준임상적 증상의 출현을 예방하거나 늦추는 것; 또는 (2) 상태, 장애 또는 질환을 억제하는 것, 즉 (지속적인 치료가 있는 경우에) 질병의 진전 또는 이의 재발을 저지하거나, 감소시키거나 또는 늦추는 것, 또는 적어도 하나의 임상적 또는 준임상적 증상을 저지하거나, 감소시키거나 또는 늦추는 것; 또는 (3) 질병을 완화시키는 것, 즉 상태, 장애 또는 질환의 퇴행을 유발하거나, 임상적 또는 준임상적 증상 중 적어도 하나의 퇴행을 유발하는 것을 포함한다. 치료될 피험자에 대한 이점은 통계상으로 유의하거나 환자 또는 내과의사가 적어도 인지할 수 있다.
"환자" 또는 "피험자"는 포유류를 지칭하고 인간 및 가축 피험자를 포함한다.
"예방적 유효량"은 소정의 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 시간 및 투여량의 효과적인 양을 지칭한다. 일반적으로, 예방 투여량은 질병의 초기 단계 또는 질병에 걸리기 이전에 피험자에게 사용되며, 예방적 유효량은 치료적 유효량에 비해 적을 것이다.
면역 반응 조정
CD4 T 세포 서브세트의 특징: 활성화 및 확장에 따라서 CD4 T 세포는 다른 시토킨 프로파일 및 별개의 주효 기능을 갖는 다른 T 도움(TH) 세포 서브세트로 성장한다. 침입 병원균에 대항하여 숙주 방어에 가장 적합한 주효 서브세트로 TH 세포의 적절한 분화는 면역계에서 매우 중요하다. CD4 T 세포는 적어도 4개의 공지된 서브세트, 3개의 주효 서브세트(TH1, TH2 및 TH17) 및 하나의 T 조절 서브세트(Treg)로 분화한다. 그들이 생산하는 시토킨에 기초하여서, T 세포는 TH1 및 TH2 세포로 일반적으로 구분되고, 이는 선청성 면역계의 세포에 의해 제조된 특정 시토킨 환경이 어떻게 인입 면역의 발달로 안내하는지를 이해하기 위한 체계를 제공했다. IL-12를 분비하는 수지상 세포(DC)에 의해 유력하게 유도되는 TH1 세포는 계통-특이적 전사 인자 T-bet(T box 21)의 발현 및 IFN-γ의 생산에 의해 특정된다. 분화 과정 중에 IL-4에 의존하고 IL-12의 결손에 의존하는 TH2 세포는 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13을 생산하고 전사 인자 GATA-3의 발현에 의해 특정된다. 중요하게는, 과거 5년 동안, TH17 세포라고 불린 IL-17-생산 주효 T 도움 세포의 제 3 서브세트는 발견되었고, 전사 인자 RORγt의 발현에 의해 특정되고 구체화된다.
TH17 세포는 IL-17, IL-17F 및 IL-22를 생산한다. 이러한 주효 시토킨을 분비함으로써, TH17 세포는 IL-17 및 IL-22 수용체의 넓은 분포에 의해 거대한 조직 반응을 유도한다. 또한, TH17 세포는 IL-21을 분비하여 면역계의 세포와 소통한다. 시토킨 형질전환생장인자β이소폼(isoform) 1(TGF-β)과 인터류킨(IL)-6 간의 시너지는 마우스 및 인간에서 TH17 세포의 성장을 유도함과 동시에, IL-23은 이러한 세포의 확장을 지지한다. TH17 세포의 성장에 수반된 분화 인자(TGF-β 플러스 IL-6 또는 IL-21), 성장 및 안정화 인자(IL-23) 및 전사 인자(STAT3, ROR-γt(ROR-c), 및 ROR-a)는 최근에서야 발견되었다. TGF-β가 말초 면역 구획에서 FoxP3+Treg로 나이브(naive) T 세포의 분화를 유도하기 때문에, TH17 세포의 분화에 TGF-β의 참여는 TH17 계통을 CD4+CD25+FoxP3+ 조절 T 세포(Treg)와 밀접한 관련이 있는 곳에 위치시킨다. Treg 세포는 면역계의 활성을 억제하도록 작용하는 T세포의 전문화된 서브집단(subpolulation)이고, 이에 의하여 자기-면역에 대한 면역계 항상성 및 내성을 유지한다. 자가면역 질병을 억제할 수 있는 Treg 세포의 성장은 자가면역 반응을 포함하는 면역 반응을 유도할 수 있는 TH17 세포에 상호 관련된다. Treg 세포는 전사 인자 포그해드(forkhead) 박스 P3(Foxp3)의 고유한 발현에 의해 식별될 수 있다. 중요하게는, 여태까지 알려진 바는, CD4+CD25+Treg - 천연 및 순응의 두개의 표현형이 동일한 집단이 존재한다는 것이다. 천연 CD4+CD25+ Treg 세포는 자가면역에 대하여 보호하기 위하여 항상성 환경 하에서 흉선에서 발생한다. 순응 CD4+CD25+ Treg 세포는 감염 및 암과 같은 염증 과정 중에 발생하고, 직접적인 접촉 또는 IL-10 및 TGF-β와 같은 가용해성 인자의 생산을 포함하는 이질적인 기작을 통해 면역을 억제한다.
종양 괴사 인자 수용체 25(TNFR25): 죽음 수용체 3(DR3)으로 본원에서 상호교환적으로 지칭되는 종양 괴사 인자 수용체 25(TNFR25)는 T 세포 기능의 조절자이다. 죽음 수용체 3(DR3)(Chinnaiyan 등, Science 274:990, 1996)은 TNF-수용체과의 멤버이다. 이것은 TRAMP(Bodmer 등, Immunity 6:79, 1997), wsl-1 (Kitson 등, Nature 384:372, 1996), Apo-3 (Marsters 등, Curr Biol 6: 1669, 1996), 및 LARD (Screaton 등, Proc Natl Acad Sci USA 94:4615, 1997)로도 공지되어 있으며, 전형적인 죽음 도메인을 함유한다. 인간 DR3(hDR3)을 갖는 293개의 세포의 트랜스펙션은 세포자살 및 활성화된 NK-κB 를 유도했다. 인간 DR3 mRNA의 다중 스플라이싱 (splicing)된 형태는 관찰되며, 이는 전사 후 수준에서 조절을 나타낸다(Screaton 등, Proc Natl Acad Sci USA 94:4615, 1997).
CD4+CD25+ 조절 T 세포(Treg)는 흉선에서 음성선택을 피하는 자가반응성 주효 T 세포의 활성을 억제할 수 있다. Treg는 IBD, 천식 및 EAE의 실험적 모델에서 자가면역 병리학을 예방하거나 늦추기에 충분하다. TNFR25 신호는 생체 내에서 CD4+CD25+를 억제하는 것으로부터 Treg을 차단하지만 항원-특이적 CD8+ 세포는 차단하지 않는다. 흥미롭게도, CD2 프로모터 하에서 전체 TNFR25를 발현하는 유전자 변형된 마우스는 높은 수준의 TH2 및 TH17 시토킨을 발현하고 2차 흉선 조직에서 감소된 세포질을 갖는다. TNFR25 유전자 변형된 마우스에서 세포질이 감소되고 시토킨 생산이 증가되는 감소된 조절 T 세포 활성의 존재는 TNFR 신호를 수용한다는 점에 따라 TNFR25 신호가 전- 및 항-염증 둘 다 일 수 있다는 것을 시사한다.
간략히 말해, 본원에서 수행된 실험은 TNFR25의 생체 내 자극이 CD4+FoxP3+ 조절 T 세포 풀의 신속하고 전신적인 확장을 가져온다는 예상치 못한 발견을 보였다. 항체(4C12)는 외인성 항원과 관계없이 발생되는 Treg 확장을 유도했고, 투여 후 4일 이내에 총 CD4+ 세포에 대하여 3-4배 증가한 Treg의 비율을 가져왔다. CD4+FoxP3+CD25int 세포의 증식으로부터 두드러진 결과를 가져온 이런 Treg 확장은 오래 지속되며, 2주 동안 자극되지 않는 수준으로 수축되지 않는다. 4C12 확장된 Treg은 시험관 내에서 TGFβ 매개 주효 T 세포 억제 기능을 보유하지만; 지속적인 TNFR25-신호는 4C12 확장된 Treg의 억제 활성을 없앤다. 이론에 의해 결합 되기를 소원함 없이, 이러한 발견은 Treg에서 TNFR25 신호는 Treg 증식을 증가시키고 Treg 억제 활성을 억제시키는 이중 기능을 가진다. TNFR25 신호에 의한 Treg 억제의 저해는 매우 인조적이고 Treg에서 TNFR25 신호 각각의 제거 또는 지속 이후에 회복되거나 유지될 수 있다. TNFR25가 TH2 및 TH17 반응의 겹자극(costimulator)으로서 역할한다는 정보의 부가는 면역 신호에서 TNFR25의 역할이 면역 반응의 유도과정 중에 주효 세포 기능을 동시에 향상시키고 염증 자극의 제거 후에 억제 활성을 회복하는 Treg의 국지적으로 확장된 풀을 통해 염증의 분해를 가속하는 것을 나타낸다. 이를 종합하면, 이러한 발견은 TNFR25 표적화 치료법이 면역 활성을 향상시키거나 저해하는데에 가치있을 수 있으며, 이는 투여함에 있어서 염증의 전후 사정에 의존되며; 자가면역 질병, 만성 염증, 이식 및 종양의 분야에서 폭넓은 영향을 가진다.
일 바람직한 실시예에서, 생체 내에서 면역 반응을 조절하는 방법은 종양 괴사 인자 상과 수용체 25(TNFRSF25; TNFR25; DR3) 기능을 조정하는 적어도 하나의 약제를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 바람직한 기능은 조절 T 세포(Treg) 증식의 유도를 가져오는 TNFRSF25 매개 신호이다. TNFRSF25 분자의 자극은 면역 반응을 억제하는 Treg 세포를 유도한다. 반면에, TNFRSF25 분자의 지속적인 자극은 Treg 세포의 억제 활성을 없애고, 따라서 면역 반응을 조절한다.
신호가 본질적으로 발현되는 CD4+ T 세포 상에서 TNF-수용체 상과 멤버 25(TNFRSF25, DR3)를 통한 신호는 TH2 및 TH17 시토킨 생산을 향상시키고 천식, 염증성 장질환, 다발성 경화증(MS) 및 류마티스 관절염의 질병 모델에서 병리학적 염증에 기여한다.
바람직한 실시예에서, 생체 내에서 면역 반응을 조절하는 것은 면역 반응에 수반되는 질병 또는 장애를 치료한다. 이러한 질병 또는 장애는 예를 들어, 심장, 신장, 간, 골수, 피부, 각막, 폐, 췌장, 소장, 사지, 근육, 신경, 추간판, 기도, 근아세포, 연골 등과 같은 장기 또는 조직의 이식에 의한 거부 반응; 골수 이식 후 이식편대 숙주 반응(graft-versus-host reaction); 류마티스 관절염, 전신성 홍반성 낭창, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 제 1 형 당뇨 등과 같은 자가면역 질병; 병원균 미생물(예, 아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 푸자리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum), 트리코파이톤 아스테로이데스(Trichophyton asteroides) 등)에 의해 유발된 감염; 면역학적으로 매개된 질병 염증성 또는 과증식성 피부 질병 또는 피부의 징후(예, 건선, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염, 습진성 피부염, 지루성 피부염, 편평태선, 천포창, 수류성류천포창, 수포성 표피 박리증, 두드러기, 혈관 신경 부종, 맥관염, 홍반, 피부 호산구 (dermal eosinophilia), 홍반성낭창, 여드름, 및 원형 탈모증); 눈의 자가면역 질병(각결막염, 춘계결막염, 베체트병을 수반하는 포도막염, 각막염, 헤르퍼스성 각막염, 원추성 각막염, 각막 상피 형성부전, 각막백반, 안구 프렘피거스(ocular premphigus), 무렌각막궤양, 공막염, 그라비스 안구병증, 복트고야나기하라다증 (Vogt-Koyanagi-Harada syndrome), 건성각결막염(건안), 소수포, 홍채모양체염, 유육종증, 내분비성 안질환 등); 역 폐쇄성 기도 질병[천식(예, 기관지 천식, 알레르기성 천식, 내인성 천식, 외인성 천식, 및 먼지성 천식), 구체적으로 만성 또는 상습적인 천식(예, 후기 천식 및 기도 과민성) 기관지염 등)]; 점막 또는 혈관 염증(예, 위궤양, 허혈성 또는 혈전성 혈관 부상, 허혈성 장질병, 장염, 신생아괴사성장염, 화상에 수반되는 장점막 손상, 루코트리엔 B4-매개 질병); 장 염증/알레르기(예, 복강 질병(coeliac diseases), 직장염, 호산구성 위장염, 비만 세포증, 크론씨병 및 궤양성 대장염); 위장관으로부터 동떨어진 증상 징후를 갖는 음식-관련 알레르기 질병(예, 편두통, 비염 및 습진); 신장 질환(예, 간질성신염, 구드파스튜어증후군(Goodpasture's syndrome), 용혈성요독증후군, 및 당뇨병성 신장 질환); 신경 질병(예, 다발성 근염, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 메니에르병(Meniere's disease), 다발성 신경염, 단발성 신경염, 뇌경색, 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증 (ALS) 및 신경근병증); 뇌허혈성 질병(예, 두부 외상, 뇌 출혈(예, 지주막하 출혈, 뇌내 출혈), 뇌혈전증, 뇌색전증, 심장 마비, 뇌졸증, 일과성뇌허혈증(TIA), 고혈압성뇌증, 뇌경색); 내분비성 질병(예, 갑상선 기능 항진증, 및 바제도병(Basedow's disease)); 혈액 내 질병(예, 적아구로, 재생불량성 빈혈, 저형성빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 자가면역성용혈성빈혈, 무과립구증, 악성빈혈, 거대적아구성빈혈, 및 아네리트로플라시아 (anerythroplasia)); 골 질병(예, 골다공증); 호흡기 질병(예, 유육종증, 폐섬유증, 및 특발성/간질성 폐렴); 피부 질병(예, 피부근염, 백반성어린선(leukoderma vulgaris), 심상성어린선, 광선과민증, 및 피부 T-세포 림프종); 혈액 순환 질병(예, 동맥경화증, 죽상동맥경화증, 대동맥염증후군, 결절성다발동맥염, 및 심근증); 콜라겐 질병(예, 강피증, 베게너육아종증(Wegener's granuloma), 및 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome)); 지방과다증; 호산성 근막염; 치주질환(예, 잇몸 손상, 치근막 손상, 치조골 손상 또는 조직 사자면 이(substantia ossea dentis) 손상); 신증후군(예, 사구체신염); 남성형탈모증, 노인형 탈모; 근위축증; 농피증 및 세자리 증후군(Sezary syndrome); 크로모좀 비정상-관련 질병(예, 다운증후군); 에디슨병; 활성 산소-매개 질병[예, 보존, 이식에 수반되는 장기 손상(예, 장기(예, 심장, 간, 신장, 소화관 등)의 허혈성 순환 장애 또는 허혈성 질병(예, 혈전증, 심근경색 등)); 장내 질병(예, 내독소충격, 위막성 대장염, 및 약물- 또는 방사선-유도성 대장염); 신장 질병(예, 허혈성 급성 신부전증, 만성 신부전증); 폐 질병(예, 폐산소 똔느 약물(예, 파라코트(paracort), 블레오마이신(bleomycin) 등)에 의한 중독, 폐암, 및 폐기종); 안구 질병(예, 백내장, 철-저장 질병(iron-storage disease)(안구철증), 망막염, 색소증, 노인성반, 후유리체 상처(vitreous scarring), 각막 알칼리 화상(corneal alkali burn)); 피부염(예, 다형 홍반, 선형 면역글로불린 A 수포성 피부염(linear immunoglobulin A bullous dermatitis), 시멘트 피부염(cement dermatitis)); 및 다른 질병(예, 치은염, 치근막염, 패혈증, 췌장염, 및 환경 공해(예, 공기 오염)에 의해 유발된 질병, 노화, 발암물질, 발암물질의 전이, 및 고산병)]; 히스타민 방출 또는 류코트리엔 C4 방출에 의해 유발된 질병; 혈관확장술 후 관상 동맥의 재협착 및 수술 후 유착의 예방; 자가면역 질병 및 염증성 질환(예, 최초 점막 부종, 자가면역 위축성 위염, 조기폐경, 수컷불임, 소아형 당뇨병, 심상성천포창, 유천포창, 교감성안염, 수정체 포도막염, 특발성 백혈구 감소증, 활성 만성 간염, 특발성 간경화, 원판상 홍반성 루푸스, 자가면역 고환염, 관절염(예, 변형성관절증), 또는 다연골염); 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염, AIDS; 알레르기 결막염; 외상, 화상 또는 수술에 의한 비후성반흔 및 흉터를 포함한다.
일 바람직한 실시예에서, 약제는 단일 투여량으로 투여되거나 Treg 세포의 억제 효과를 유지하기 위해서 일정 기간 동안에 고르게 투여된다. 예를 들어, 자가면역 질병의 치료에서 그러하다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 약제는 다중 또는 복수의 투여량으로 투여되어서 Treg 세포의 억제 효과는 없어진다. 예를 들어, 비정상 세포의 면역 매개 제거를 요구하는 암, 바이러스성 질병 또는 다른 질병의 치료에서 그러하다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 약제는 지속적인 TNFR25의 자극을 제공하고 Treg 세포에 의한 면역계의 억제를 없애기 위하여 지효성 제제로 투여된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 약제는 TNFRSF25의 신호를 자극하고 환자 내에서 CD4+FoxP3+CD25int 세포의 증식을 유도한다. Treg 세포의 억제 효과는 모니터링될 수 있고, 약제의 투여량은 질병 또는 질환에서 억제 효과를 유지하도록 조정될 수 있으며, 이때 감소된 면역 반응은 예를 들어, 자가면역, 이식 거부 반응 등에서 요구된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 약제는 TNFRSF25의 신호를 자극하고 흉선 유도성이지만 전신 유도성이 아닌 Treg 세포의 증식을 유도한다. Treg 세포의 억제 효과는 모니터링될 수 있고, 약제의 투여량은 질병 또는 질환에서 억제 효과를 유지하도록 조정될 수 있으며, 이때 감소된 면역 반응은 예를 들어, 자가면역, 이식 거부 반응 등에서 요구된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 적어도 하나의 약제는 TNFRSF25의 신호를 자극하고 흉선 유도성이고 전신 유도성 둘 모두인 Treg 세포의 증식을 유도하며, 여기서 전신 유도성 Treg에 의해 인식되는 동족항원은 존재하는 것으로 알려져 있다. Treg 세포의 억제 효과는 모니터링될 수 있고, 약제의 투여량은 질병 또는 질환에서 억제 효과를 유지하도록 조정될 수 있으며, 이때 감소된 면역 반응은 예를 들어, 자가면역, 이식 거부 반응 등에서 요구된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 하나의 약제 또는 약제들의 조합은 환자의 면역 반응을 조정하기 위해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자는 환자 내에서 CD4+FoxP3+의 증식에 의해 또는 소정의 반응을 측정하는 임의의 다른 검정에 의해 결정되는 치료적 유효 투여량으로 하나 이상의 약제를 수용할 수 있다. 다른 검정은 예를 들어, 면역검정, 생물지표 검출, FACS, 면역블롯, 교잡, PCR 등이 있다. Treg 세포는 예를 들어 CD4+FoxP3+ 세포로 식별될 수 있다. 일부 양태에서, CD103의 공동 발현이 존재한다. Treg에 의한 CD103의 발현은 조직들 내에서 조직의 파지에 기여한다. TNFRSF25 매개 Treg 증식을 방해하지 않는 것으로 알려진 약제는 라파마이신을 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, TNFRSF25 신호를 조정하는 약제는 항체, 압타머, 리간드, 소분자, 펩티드, 단백질, 올리고핵산염, 폴리핵산염, 유기 분자 또는 무기 분자 중 적어도 하나를 포함한다.
일 바람직한 실시예에서, 약제는 TNFRSF25의 작용자이다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 생체 내에서 면역 반응을 억제하는 방법은 종양 괴사 인자 상과 수용체 25(TNFRSF25; TNFR25; DR3) 매개 신호 기능을 조정하는 적어도 하나의 약제를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계; 및 억제 조절 T 세포 (Treg) 확장을 유도하는 단계를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 약제는 종양 괴사 인자 상과 수용체 25 신호를 조정하고 CD4+FoxP3+ 조절 T 세포의 억제 활성을 저해한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 면역 반응을 조정하는 조성물은 TNFRSF25 신호를 조정하는 약제를 포함한다. 일 실시예에서, 상기 약제는 환자에게 투여되어 억제성 Treg는 면역 반응을 억제한다. 또 다른 바람직한 실시예에서, 상기 약제는 환자에게 투여량으로 또는 억제 Treg 세포의 저해를 가져오는 신호를 없애는 환경 하에서 투여되어서 면역 반응은 시작된다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 생체 내에서 암을 치료하는 방법은 암에 대한 면역 반응이 유도될 수 있도록 Treg 세포의 억제 효과를 없애는 투여량으로 종양 괴사 인자 상과 수용체 25(TNFRSF25; TNFR25; DR3) 기능 신호를 조정하는 적어도 하나의 약제를 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 면역 세포의 조정 및 이후의 반응은 암, 바이러스성 질병과 같은 질병 또는 임의의 전염성 유기체에 의해 유발되는 질병을 앓는 환자를 치료하는 방법을 포함하며, 이때 항-TNFR25 조성물은 환자에게 투여되고 면역 세포, 예를 들어 림프구의 증식 기능을 조정하며, 상기 림프구는 사전에 억제되거나 약화되었고, 또한 면역 반응은 정상이지만 면역 반응의 향상이 환자의 치료에 더 효과적이고 더 빠른 치료를 가져온다. 음성 조절 경로, 및 내재성 종양 면역원성의 결핍이 없는 것은(즉, 방어면역을 자극하기 위한 조작되지 않은 종양의 능력), 종양 진행의 면역-매개 제어를 예방에 중요한 역할을 수행한다. 치료적 영향은 대응 면역-감쇠/억제 조정 순환이 암의 성공적인 면역 제어에 기여하고, 강력한 백신 프로토콜을 개발하는 것보다 더도말고 중요하다.
종양 백신: 따라서, TNFR25 작용자는 유효한 생물학적 반응 조절 물질이며, 이는 예를 들어 종양 백신에 대해서는 이들이 T 세포 활성 및 종양 특이적 항원에 대한 세포 면역 반응을 신장시키기 때문이며, 그런데 TNFR25 길항제는 T 세포 활성을 차단하거나 저해한다. 그러므로, 본 발명의 또 다른 양태는 종양 백신의 유효성을 증가시키는 방법 및 치료제에 관한 것이다.
종양 백신은 신체의 자연 면역 시스템의 요소의 사용을 시도하여 암에 맞서 싸운다. 종양 백신은 하나 이상의 종양 특이 항원을 함유하고 보조제 및 생물학적 반응 조절 물질을 함유할 수 있다. 종양 특이 항원은 종양 세포에 또는 종양 세포 상에 발현으로 실질적으로 제한되는 폴리펩티드이고, 이러한 종양 세포를 표적화하도록 의도된 면역 반응을 자극하는데에 사용될 수 있다. 백신의 다른 유형은 다른 유옇의 암을 치료하기 위해 사용된다. 백신으로 유용할 수 있는 항원성 조성물에 있어서, 항원성 조성물은 세포 또는 조직에서 항원에 면역 반응을 유도해야만 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "항원성 조성물"은 항원(예, 펩티드 또는 폴리펩티드), 항원을 인코딩하는 핵산(예, 항원 발현 벡터), 또는 항원을 발현하거나 제시하는 세포를 포함할 수 있다.
백신 또는 다른 항원성 자극에 대한 면역 반응의 향상은 임의의 종래의 방법에 의해 측정될 수 있으며, 이러한 방법의 예는 증식 검정법, 시토킨 분비, 분비된 시토킨의 유형, 세포독성 T 림프구 검정, ELISA, RIA등이 있다. 또한, 향상된 면역 반응은 치료를 모니터링함으로써 검출될 수 있다. 예를 들어, 암을 치료하는 경우에, 향상된 면역 반응은 하나 이상의 이어지는 효과를 관찰함으로써 모니터링할 수 있다: (1) 종양 성장의 어느 정도까지의 저해((i) 늦춤, (ii) 혈관생성을 저해 및 (iii) 완전한 성장을 막음); (2) 다수의 종양 세포수의 감소; (3) 종양 크기를 유지; (4) 종양 크기의 감소; (5) 말초 기관 안으로 종양 세포 침투의 저해((i) 감소, (ii) 늦춤 또는 (iii) 완전한 예방; (6) 전이의 저해((i) 감소, (ii) 늦춤 또는 (iii) 완전한 예방; (7) (i) 종양 크기를 유지, (ii) 종양 크기를 감소, (iii) 종양의 성장을 늦춤, (iv) 침투를 감소, 늦춤 또는 예방의 결과를 가져올 수 있는 항-종양 면역 반응의 향상 및/또는 (8) 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 중증도 또는 그 수의 어느 정도의 완화.
또 다른 바람직한 실시예에서, 항-TNFR25는 항-TNFR 항체를 발현하는 벡터 구조체로서 투여될 수 있다. 게다가, 벡터 구조체는 시토킨을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 과립대식세포집락자극인자(GM-CSF), 인터류킨-12(IL-12) 및 보조-자극 분자(B7-1, B7-2, CD40)이 있다. 시토킨은 항체 및 세포독성 T 림프구 반응 모두를 포함하는 피험자의 면역계의 반응을 미세 조정(fine-tune)하기 위해 다양한 조합으로 사용되어 감염 또는 질병 상태를 제어하거나 제거하기에 필요한 반응의 특정 수준을 가져올 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 항원성 폴리펩티드, 예를 들어 항-종양 항원, 항-바이러스성 항원 등, 그리고 CTLA-4와 같은 보조-자극 분자를 함유하는 융합 산물을 인코딩할 수 있다. 적합한 벡터의 예는 폴리오 바이러스, 백시니아, 카나리아두 및 계두와 같은 매독 바이러스, 매기 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스-연관 벡터, 및 레트로바이러스를 포함하는 헤르페스 바이러스를 포함하는 바이러스성 벡터를 포함한다. 예시적인 박테리아 벡터는 살모넬라, 쉬겔라, 에드워드시엘라 익탈루리(Edwardsiella ictaluri), 예시니아 룩케리 (Yersinia ruckerii), 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes). 또한, L. 모노사이토제네스는 동물에서 Treg의 확장을 자극하기 위해 사용된 검사 도구로서 가치있을 수 있으며, 따라서 이들은 동물마다 Treg의 높은 수율을 갖도록 이후에 채취될 수 있다.
병용 치료법
바람직한 실시예에서, 면역 반응의 향상 또는 상향 조절은 하나 이상의 치료법과 병용될 수 있다. 예를 들어, 항-TNFR25 항체는 하나 이상의 약제 또는 치료 방법으로 치료하기 이전에, 동시에 또는 치료 이후에 투여될 수 있다.
또 다른 실시예에서, TNFR25 조성물은 자가조직 세포에 투여되어서 세포가 확장된 후 세포를 환자 안으로 재주입할 수 있게 한다.
TNFR25 자극 약제는 벡터, 리포좀, 핵산 펩티드 등의 폴리뉴클레오티드로서 약학 조성물로 투여될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, TNFR25 자극제는 하나 이상의 추가적인 약학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약학적 활성제"는 생체 내 또는 시험관 내에서 원핵세포 또는 진핵 세포 상에 생리적 효과(치료적 또는 예방적 효과)를 가질 수 있는 약물과 같은 임의의 약제를 지칭하며, 상기 약제는 화학 요법, 독소, 방사선 치료제, 방사선 민감작용제, 유전자 치료 벡터, 안티센스 핵산 구조체 또는 작은 간섭 RNA, 영상화제, 진단제, 세포 내 단백질, 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드와 상호작용하는 것으로 알려진 약제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
추가적인 약학적 활성제는 예를 들어, 진통제, 마취제, 항염증제, 구충제, 항부정맥제, 항천식제, 항생제(페니실린 포함), 항암제(택솔 포함), 항응혈제, 항우울제, 항당뇨제, 항간질제, 항히스타민제, 진해제, 고혈압 치료제, 항무스카린성제, 항결핵약제, 항네오플라스틱제, 항산화제, 해열제, 면역억제제, 면역증강제, 항갑상선제, 항바이러스제, 항불안제(최면제 및 신경 이완제), 수렴제, 정균제, 베타-신경차단제, 혈액 제품 및 대체제, 천식치료제(bronchodilators), 버퍼제, 심 근육 수축제, 화학요법제, 조영제, 코르티코스테로이드제, 기침 억제제(거담제 및 점액분해제), 진단제, 진단용 영상화제, 이뇨제, 도파민제(dopaminergics)(항파키슨제), 자유 라디칼 포집제, 성장 인자, 지혈제, 면역 치료제, 지질 조절제(lipid regulating agents), 근육 이완제, 단백질, 펩티드 및 폴리펩티드, 부교감신경흥분제, 부갑상선 호르몬 칼시토닌 및 비포스포네이트, 프로스타글랜딘, 방사성의약품, 호르몬, 성 호르몬(스테로이드 포함), 시간 방출성 바인더, 알레르기 치료제, 흥분제 및 식욕 감퇴제, 스테로이드, 교감 신경 흥분약, 티로이드제, 백신, 혈관확장제, 및 크산틴을 포함하는 약물의 공지된 다양한 부류로부터 선택될 수 있다.
추가적인 약학적 활성제는 치료제일 필요는 없다. 예를 들어, 약제는 전달되지만 피험자 상에 전체적인 이로운 효과를 갖는 국부 세포에 세포독성일 수 있다. 나아가, 상기 약제는 생물영상화를 위한 조영제와 같은 직접적인 치료적 활성을 갖지 않는 진단제일 수 있다.
화학치료법: TNFR25 조성물은 화학요법과 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 항-TNFR25의 투여는 화학치료법의 필요성을 감소시키는 결과를 가져올 수 있으며, 또는 만일 화학치료법이 여전히 요구되거나 권장되는 경우에, 투여량은 더 적을 것이며, 이에 의하여 이러한 화학치료제의 좋지않은 부작용의 일부를 완화시킨다. 또한, 암 치료법은 화학물질 및 방사선 모두를 기반으로 하는 치료와 함께 다양한 병용 치료를 포함한다. 병용 화학치료법은 예를 들어, 시스플라틴(CDDP), 카보플라틴, 프로카바진, 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 캠토테신, 이포스파미드, 멜팔란, 클로르암부실, 부설판, 니트로수리아, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리코마이신, 미토마이신, 에토포시드(VP16), 타목시펜, 랄록시펜, 에스트로겐 수용체 결합제, 탁솔, 겜시타비엔, 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스퍼라아제 저해제, 트랜스플라티눔, 5-플루오로우라실, 빈크리스틴, 빈블라스틴 및 메토트렉세이트 또는 이들의 임의의 유사체 또는 유도체 변형물을 포함한다.
방사선치료: 조성물은 방사선치료와 함께 병용될 수 있다. DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되어온 다른 인자는 감마선, X-선으로 일반적으로 알려진 것 및/또는 방사선 동위우언서를 종양 세포에 직접적으로 전달하는 것을 포함한다. 또한, DNA 손상 인자의 다른 형태는 마이크로파, 양자 빔 조사(미국특허 제5,760,395호 및 미국특허 제4,870,287호) 및 UV-조사와 같은 것으로 생각된다. 이모든 이러한 인자가 DNA상에, DNA의 전구체상에, DNA의 복제 및 수선에서, 크로모좀의 접합 및 보전에 광범위한 손상을 미칠 것으로 생각될 것이다. 조사량의 범위는 오랜 기간(3주 내지 4주)동안 50 내지 200 뢴트겐의 X-선 일일 조사량으로부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 조사량이 있다. 방사선 동위원소에 대한 조사량 범위는 광범위하게 변화하며, 이는 동위원소의 반감기, 방사선 방출의 강도 및 종류, 및 종양성 세포에 의한 흡수에 의존한다.
면역치료: 항-TNFR25 약제는 다른 형태의 면역치료와 병용될 수 있다. 예를 들어, 암 치료의 맥락에서, 일반적으로, 면역치료는 면역 주효 세포 및 분자(예, 단일클론 항체)의 사용을 의지하여 암 세포를 공격하고 파괴한다. 트라스투주맙 (trastuzumab)(HERCEPTIN™) 또는 베바시주맙(bevacizumab)(AVASTIN™)이 이러한 예이다. 면역 반응기는 예를 들어, 종양 세포 표면상의 일부 표지에 대해 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 홀로 치료의 반응기로서 역할할 수 있거나 다른 세포를 모집하여 세포 살해에 실질적으로 영향을 미칠 수 있다. 또한, 항체는 약물 또는 독소(화학치료, 방사성 핵종, 리신 A 쇄, 콜리라 독소, 백일해 독소 등)에 콘주게이션될 수 있고 표적화제로서만 역할한다. 대안적으로, 반응기는 종양 세포 표적과 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 함유하는 림프구일 수 있다. 다양한 반응기 세포는 세포독성 T 세포 및 NK 세포를 포함한다. 치료 양상의 병용, 즉, 직접적인 세포독성 활성 및 예를 들어 항-TNFR25 항체에 의한 tat 면역 반응기 반응의 향상은 암의 치료에 치료적 혜택을 제공할 것이다.
항원 특이 면역 반응은 하나 이상의 종양 항원을 표적화하고, TNFR25 조성물의 투여는 이러한종양 항원에 직접적인 면역 반응을 향상시킬 것이다. 많은 종양 표지들이 존재하고, 이들 중 임의의 표지는 본 발명의 맥락에서 표적화에 적합할 수 있다. 공통적인 종양 표지는 암배아성 항원, 전립선 특이 항원, 방광 종양 연관 항원, 태아 항원, 티로시나아제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시아릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 에스트로겐 수용체, 라미닌 수용체, erb B 및 p155를 포함한다. 면역치료의 대안적인 양태는 항암 효과를 면역 자극 효과와 병용하는 것이다. 또한, 면역 자극 분자는 IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN와 같은 시토킨, MIP-1, MCP-I, IL-8와 같은 케모킨 및 FLT3 리간드와 같은 성장인자를 포함하여 존재한다. 단백질로서 또는 MDA-7과 같은 종양 억제제와 병용하여 유전자 전달을 사용하여 면역 자극 분자를 병용하는 것은 항-종양 효과를 향상시킨다.
암의 수동적 면역치료에 대한 많은 다른 접근법이 존재한다. 이들은 이어지는 카테고리고 광범위하게 나눠질 수 있다: 항체만 주입; 독소 또는 화학치료제에 결합된 항체의 주입; 방사성 동위원소에 결합된 항체의 주입; 항-유저자형 항체의 주입; 및 마지막으로, 골수에서 종양 세포의 퍼징(purging). 바람직하게, 인간 단일클론 항체는 이들이 환자 내에서 적거나 어떤 부작용도 생성하지 않기 때문에, 수동적 면역치료에 채용된다.
활성 면역치료에서, 항원성 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질, 또는 자가 조직 또는 동종 이계 종양 세포 조성물 또는 "백신"은 투여되고, 일반적으로 대비되는 세균성 보조제와 함께 투여된다. 흑색종 면역요법에서, 높은 IgM 반응을 이끌어내는 이러한 환자는 낮은 IgM 항체 또는 이를 전혀 이끌어내지 않는 환자에 비해 종종 더 생존한다. IgM 항체는 종종 일시적인 항체이고 규칙의 예외는 항-갱글리오시드 또는 항-탄수화물 항체로 보여진다.
인입면역치료에서, 환자의 순환 림프구 또는 종양 잠입 림프구는 시험관 내에서 분리되며, IL-2와 같은 림프구에 의해 활성화되거나 종양 괴사를 위한 유전자로 형질도입된다. TNFR25 조성물, 예를 들어 항-TNFR25 항체는 이후에 재주입되는 세포로 배양되거나 투여된다. 이를 달성하기 위하여, 이것은 동물 또는 인간 환자에게 항-TNFR25와 병용하여 활성화된 림프구의 면역학적 유효량으로 투여될 것이며, 선택적으로는 보조제-포함 항원성 펩티드 조성물과 함께 병용 투여된다. 활성 림프구는 혈액 또는 종양 표본 및 시험관 내에서 활성화된 것 (또는 "확장된 것")으로부터 일찍이 단리된 환자 자신의 세포인 것이 가장 바람직하다. 면역치료의 형태는 흑색종 및 신세포암의 퇴보의 몇몇 경우를 발생시키지만, 응답자의 비율은 반응하지 않은 자들에 비해 적었다. 항-TNFR25는 치료 내과의사 또는 간호사에 의해 결정될 수 있는 식이 요법 하에서 세포에 재주입한 후에, 환자에게 투여될 수 있다.
면역억제제: 하나 이상의 TNFR25 약제의 투여는 억제된 면역 반응(예, 자가면역 질병)을 유지하기 위해 요구되는 하나 이상의 면역 억제제와 함께 투여될 수 있다. 면역억제제의 예는 마이코페놀산, 아자티오프린, 시클로스포린 A, FK506, FK520, 엘리델; 타크롤리무스 및 시롤리무스; 미노시클린; 레플루노미드; 또는 메토트렉세이트 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
수술: 암을 앓는 사람들의 약 60%는 일부 유형의 수술을 겪을 것이며, 이런 유형의 수술은 예방적 수술, 진단적 수술 또는 병기결정 수술, 치유 수술 및 고시적인 수술을 포함한다. 치유 수술은 본 발명의 치료법, 화학치료법, 방사선치료법, 호르몬 치료법, 유전자 치료법, 면역치료법 및/또는 대안적인 치료법과 같은 다른 치료법과 함께 사용될 수 있는 암 치료법이다.
치유 수술은 암 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거되거나, 절제되거나, 및/또는 파괴되는 절제술을 포함한다. 종양 절제술은 적어도 종양의 일부의 물리적 제거를 지칭한다. 종양 절제술 외에도, 수술에 의한 치료는 레이저 수술, 동결요법, 전기 수술, 및 미세현미경 제어 수술(모즈 수술(Mohs' surgery))을 포함한다. 본 발명이 표피암, 전암, 또는 정상적인 조직의 잔량의 제거와 함게 사용될 수 있을 것으로 더 생각된다.
암세포, 조직, 또는 종양의 일부 또는 전부의 절제에 따라서, 공동은 신체 내에 형성될 수 있다. 치료는 추가적인 항암 치료와 함께 수액법, 직접 주입 또는 국부 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는 반복될 수 있으며, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4 및 5주 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월 마다 반복될 수 있다. 이러한 치료는 또한 투여량이 달라질 수 있다.
다른 약제: 다른 약제는 본 발명과 병용하여 사용되어서 치료의 치료적 효능을 향상시킬 것으로 생각된다. 이러한 추가적인 약제는 세포 표면 수용체의 상향 조절 및 GAP 접합부, 세포 증식 억제제 및 분화제, 세포 부착의 저해, 및 세포사멸 유도 인자 또는 다른 약제에 대한 과증식 세포의 민감성의 증대에 영향을 미치는 면역조정제를 포함한다. 면역조정제는 종양 괴사 인자; 인터페론 알파, 베타, 및 감마; IL-2 및 다른 시토킨; F42K 및 다른 시토킨 유사체; 또는 MIP-1, MIP-1 베타, MCP-1, RANTES 및 다른 케모킨을 포함한다. 세포 표면 수용체의 상향 조절 또는 이들의 리간드 예를 들면, Fas/Fas 리간드, DR4 또는 DR5/TRAIL(Apo-2 리간드)는 본 발명의 능력 향상에 약효를 증가시키는 것으로 더 생각된다. 다수의 GAP 접합을 증가시킴으로써 세포 간 신호를 증가시키는 것은 소정의 세포 집합에 증식 효과를 증가시킨다.
Apo2 리간드(Apo2L, TRAIL로도 불림)는 종양 괴사 인자(TNF) 시토킨 과의 멤버이다. TRAIL은 아직 정상 세포에 독성이 없는 많은 유형의 암세포에서 신속한 아팝토시스를 활성한다. TRAIL mRNA는 광범위한 조직에서 발생한다. 대부분의 정상 세포는 TRAIL의 세포독성 작용에 내성인 것으로 보이며, 이는 TRAIL에 의한 아팝토시스 유도에 대항하여 보호할 수 있는 기작의 존재를 시사한다. 죽음 수용체 4 (DR4)로 불리는 TRAIL로 설명된 제 1 수용체는 세포질의 "죽음 도메인"을 함유하며; DR4는 TRAIL에 의해 수반된 아팝토시스 신호를 전달한다. 추가적인 수용체들은 TRAIL에 결합하는 것으로 식별되었다. DR5로 분리는 하나의 수용체는 세포질의 죽음 도메인을 함유하고 DR4와 매우 유사한 아팝토시스 신호를 보낸다. DR4 및 DR5 mRNA는 많은 정상 조직 및 종양 세포주에서 발현된다. DcR1 및 DcR2와 같은 데코이 (Decoy) 수용체는 DR4 및 DR5를 통한 아팝토시스 유도로부터 TRAIL을 보호하는 것으로 식별되었다. 따라서, 이러한 데코이 수용체는 직접적으로 세포의 표면에서 아팝토시스 촉진 시토킨에 대한 민감성을 조절하기 위한 신규한 기작을 제시한다. 정상적인 조직에서 이러한 저해 수용체의 바람직한 발현은 TRAIL이 정상세포에서는 인색하면서 암세포에서는 아팝토시스를 유도하는 항암제로서 유용할 수 있다.
세포독성 화학치료제의 도입에 따라서 암의 치료에 많은 발전이 있었다. 반면에, 화학치료의 결과 중 하나는 약물-내성 표현형의 발달/획득 및 다발성 약물 내성의 발달이다. 약물 내성의 발달은 어떤 종양의 치료에 가장 중요한 장애물로 남겨지고, 따라서 면역 반응의 향상은 대안적인 접근법을 제공한다.
치료의 또 다른 형태는 열치료법이며, 이는 환자의 조직을 고온(최대 106℉)에 노출시키는 과정이다. 외부 또는 내부 가열 장치는 국부, 지역, 또는 전신 열치료법의 적용에 수반될 수 있다. 국부 열치료법은 종양과 같은 작은 면적에 열의 적용을 수반한다. 열은 신체 외부에서 장치로부터 종양을 표적화하는 고주파로부터 외인적으로 생성될 수 있다. 내부 열은 온수로 채워진 얇고 가열된 선 또는 중공관, 이식된 마이크로파 안테나, 또는 무선주파수 전극을 포함하여 살균 프로브를 수반할 수 있다.
환자의 장기 또는 사지는 지역적 치료를 위해 가열되며, 자석과 같은 고에너지를 생산하는 장치를 사용하여 달성된다. 대안적으로, 환자 혈액의 일부는 제거될 수 있고 내부적으로 가열될 면적 안으로 관류되기 이전에 가열된다. 또한, 전신 가열은 암이 신체 전반에 걸쳐 퍼져있는 경우에 시행될 수 있다. 온수 담요, 뜨거운 왁스, 유도 코일, 및 열적 챔버는 본 목적을 위해 사용될 수 있다.
또한, 호르몬 치료는 본 발명과 함께 또는 앞서 설명한 임의의 다른 암 치료법과 병용하여 사용될 수 있다. 호르몬의 사용은 유방,암, 전립선암, 난소암 또는 자궁경부암과 같은 특정 암의 치료에 채용되어 테스토스테론 또는 에스트로겐과 같은 특정 호르몬의 효과 수준을 낮추거나 차단할 수 있다. 이 치료는 종종 치료 옵션으로서 또는 전이 위험성을 낮추기 위해 적어도 하나의 다른 암 치료법과 병용하여 사용된다.
조성물의 투여
약학 제제 및 백신은 경구(고형 또는 액형), 비경구(근육 내, 복강 내, 정맥 내(IV), 피하 주사, 경피성(수동적으로 또는 이온 영동 또는 전기천공법), 경점막(비강, 질, 직장 또는 설하), 또는 투여의 흡입 경로에 의한 투여 또는 생체흡수성 삽입물을 사용하는 투여를 위한 것일 수 있고, 투여의 각 경로에 적절한 제형으로 제형화될 수 있다.
당소(in situ)에서 종양 세포를 표적화하기 위해, 상술한 조성물은 인간을 포함하는 동물에게 임의의 적합한 제제로 투여될 수 있다. 예를 들어, 종양 세포를 표적화하기 위한 조성물은 생리식염수 또는 완충염 용액과 같은 희석제 또는 약학적으로 허용가능한 캐리어로 제형화될 수 있다. 적합한 캐리어 및 희석제는 투여 및 표준 약학적 시행의 방식 및 경로에 기초하여 선택될 수 있다. 예시적인 약학적으로 허용가능한 캐리어 및 희석제의 설명 뿐만아니라 약학 조성물의 설명은 본 분야의 기본서인 Remington's Pharmaceutical Sciences 및 USP/NF에서 찾아볼 수 있다. 다른 성분은 조성물에 첨가되어서 조성물을 안정화 및/또는 보존할 수 있다.
본 발명의 조성물은 임의의 종래의 기술에 의해 동물에게 투여될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들어, 내부 또는 외부 표적 부위에 수술 전달에 의해 또는 혈관에 의해 접근 가능한 부위에 카테터에 의해 표적 부위에 직접적으로 투여될 수 있다. 전달의 다른 방법, 예를 들어 조성물이 가득 스며든 장치로부터의 리포솜 전달 또는 확산은 당해 분야에 알려져 있다. 상기 조성물은 단일 용량 다중 주입으로 투여되거나 지속적 투입(예, 정맥안으로)에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여에 있어서, 상기 조성물은 멸균 발열 물질이 없는 형태로 제형화되는 것이 바람직하다.
일부 실시예에서, 상기 조성물 또는 백신은 폐 전달에 의해 투여된다. 상기 조성물 또는 백신은 흡입되고 폐 상피 내벽을 가로질러 혈류를 가로질러서 포유류의 폐로 전달된다. (문헌[Adjei, 등, Pharmaceutical Research 1990; 7:565 569]; 문헌[Adjei, 등, Int. J. Pharmaceutics 1990; 63: 135 144 (루프롤라이드 아세테이트)]; 문헌[Braquet, 등, J. Cardiovascular Pharmacology 1989; 13(sup5): 143 146 (엔도텔린-1)]; 문헌[Hubbard, 등 (1989) Annals of Internal Medicine, Vol. III, pp. 206 212 (αl 항트립신); 문헌[Smith, 등, J. Clin. Invest. 1989;84: 1 145-1146 (α1-프로테이나아제); 문헌[Oswein, 등, "Aerosolization of Proteins", 1990]; 문헌[Proceedings of Symposium on Respiratory Drug Delivery II Keystone, Colorado (재조합 인간 성장 호르몬)]; 문헌[Debs, 등 J. Immunol. 1988; 140:3482 3488 (인터페론 γ 및 종양 괴사 인자 α)]; 및 Platz 등의 미국특허 제5,284,656호 (과립구집락자극인자)] 참조).
본 발명의 실시에 사용을 위한 고려는 치료적 산물의 폐 전달을 위해 설계된 다양한 기계적 장치이며, 이는 분무기, 정량 투여 흡입기, 및 분말 흡입기를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 이들 모두는 당해 분야의 통상의 기술자에게 친숙한 것이다. 본 발명의 실시에 적합한 상업적으로 사용가능한 장치의 일부 특정 예는 Ultravent 분무기(Mallinckrodt Inc., St. Louis, MO); 아콘(Acorn) II 분무기 (Marquest Medical Products, Englewood, CO); 벤토린 정량 투여량 분무기(Glaxo Inc., Research Triangle Park, NC); 및 스핀헤일러 분말 분무기(Fisons Corp., Bedford, MA)가 있다. 모든 이러한 장치는 치료제의 투여에 적합한 제제의 사용을 요구한다. 일반적으로, 이러한 제제는 채용된 장치 유형에 특이적이고 보통의 희석제, 보조제, 계면활성제 및/또는 치료에 유용항 캐리어 외에도 적절한 분사제 물질의 사용을 수반할 수 있다. 또한, 리포좀, 마이크로캡슐 또는 마이크로구체, 포접 복합체, 또는 다른 유형의 캐리어의 사용이 고려된다.
정량 투여량 흡입 장치의 사용을 위한 제제는 계면활성제의 도움과 함께 분사제에 현탁된 치료제를 함유하는 미세하게 쪼개진 분말을 포함한다. 상기 분사제는 본 목적을 위해 채용된 임의의 종래의 물질일 수 있으며, 이러한 물질의 예는 클로로플루오로카본, 히드로클로로플루오로카본, 히드로플루오로카본 또는 탄화수소가 있으며, 상기 탄화수소는 트리클로로플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로데탄올, 및 1,1,1,2 테트라플루오로데탄, 또는 이들의 조합을 포함한다. 적합한 계면 활성제는 소르비탄트리올레이트 및 소야레시틴을 포함한다. 올레산은 계면활성제로서 유용할 수도 있다.
분말 흡입 장치로부터의 투여를 위한 제제는 치료제를 함유하는 미세하게 쪼개진 건조한 분말을 포함할 것이고, 또한 락토오스, 소르비톨, 수크로오스, 또는 만니톨과 같은 증량제를 장치로부터 분말의 투여를 가능하게 하는 양, 예를 들어 제제의 50 내지 90 중량%로 포함할 수 있다. 치료제는 말단 폐에 가장 효과적인 전달을 위해 10 mm(또는 마이크론) 미만, 가장 바람직하게는 0.5 내지 5 mm 미만의 평균 입자 크기를 갖는 미립자형으로 가장 이롭게 제조될 것이다.
또한, 치료제의 비강 또는 다른 점막 전달은 고려된다. 비강 전달은 코에 조성물을 투여한 직후에 폐에 산물의 축적의 필연성 없이 혈류로의 경로를 허용한다. 비강 전달을 위한 제제는 덱스트란 또는 시클로덱스트란, 그리고 보조제로서 사포닌을 포함하는 것들을 포함한다.
본 발명의 조성물 또는 백신은 하나 이상의 추가적인 활성 성분, 약학 조성물 또는 백신과 병용 투여될 수 있다. 본 발명의 치료제는 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간에게 투여될 수 있다.
서방성 시스템: 최초 서방성 시스템은 매트릭스 시스템을 포함하며, 이때 약제는 수성 환경(즉, GI관의 루미날 유체) 안으로 약제의 방출을 지연시키는 역할을 하는 또 다른 물질의 매트릭스에 포매되거나 확산된다. 약제가 이런 종류의 패트릭스에서 분산되는 경우에, 약물의 방출은 주로 매트릭스의 표면으로부터 이루어진다. 따라서, 상기 약물은 장치의 표면으로부터 방출되며, 이는 매트릭스를 통해 화산된 후에 매트릭스를 포함하거나, 장치의 표면이 부식되는 경우에 약물을 노출시킨다. 일부 실시예에서, 둘 모두의 기작은 동시에 작동될 수 있다. 매트릭스 시스템은 클 수 있으며, 즉 정제 크기(약 1 cm) 또는 작게는 0.3 cm 미만이다. 상기 시스템은 통합될 수 있으며(예, 단일 용량), 실질적으로 동시에 투여되는 몇몇의 서브-유닛(예를 들어, 단일 투여량을 이루는 몇몇 캡슐)으로 구성되기 때문에 나누어질 수 있거나, 또는 다중미립자로도 의미 되는 복수의 입자를 포함할 수 있다. 다중미립자는 많은 제제 적용을 가질 수 있다. 예를 들어, 다중미립자는 캡슐 쉘을 채우기 위한 파우더로서 사용될 수 있거나, 섭취하기 쉽도록 음식과 함께 혼합하는데에 사용될 수 있다.
특정 실시예에서, 매트릭스 다중미립자는 복수의 약제-함유 입자를 포함하며, 각각의 입자는 예를 들어, 수성 배지 안으로 약제의 용해율을 제어할 수 있는 매트릭스를 형성하도록 선택된 하나 이상의 부형제를 갖는 고형 용액/분산제의 형태로 약제 및/또는 이의 유사체를 포함한다. 이 실시예에 유용한 매트릭스 물질은 일반적으로 왁스, 일부 셀룰로오스 유도체와 같은 소수성 물질, 또는 다른 소수성 폴리머이다. 만일 필요하다면, 매트릭스 물질은 소수성 물질로 선택적으로 제형화될 수 있으며, 이는 바인더로서 또는 증폭자로서 사용될 수 있다. 이러한 제형의 제조에 유용한 매트릭스 물질은 예를 들어, 에틸셀룰로오스, 파라핀, 변성 식물성 오일, 카마우바 왁스, 수소화 피마자유, 비즈왁스 등과 같은 왁스, 뿐만 아니라 폴리(비닐클로라이드), 폴리(비닐아세테이트), 비닐아세테이트 및 에틸렌의 공폴리머, 폴리스티렌 등과 같은 합성 폴리머가 있다. 수용성 또는 친수성 바인더 또는 매트릭스로 선택적으로 제형화될 수 있는 방출 조정제는 히드록시프로필셀룰로오스 (HPC), 히드록시프로필메틸셀룰로오스(HPMC), 메틸셀룰로오스, 폴리(N-비닐-2-피롤리디논)(PVP), 폴리(에틸렌옥시드)(PEO), 폴리(비닐알콜)(PVA), 크산탄검, 카라기난, 및 다른 이러한 천연 및 합성 물질과 같은 친수성 폴리머를 포함한다. 이 밖에도, 방출-조정제로서 기능하는 물질은 당 또는 염과 같은 수용성 물질을 포함한다. 바람직한 수용성 물질은 락토오스, 수크로오스, 글루코오스 및 만니톨을 포함할 뿐만 아니라, 예를 들어 HPC, HPMC 및 PVP와 같은 친수성 폴리머를 포함한다.
특정 실시예에서, 다중미립자 산물은 제어된 집합체에 의해 처치되는 것으로 정의된다. 이 경우에, 약제는 적합한 용융성 캐리어에 용해되거나 부분적으로 용해되고, 매트릭스 성분을 포함하는 캐리어 입자상에 분무된다.
투여량: 본원에 개시된 조성물의 유효 투여량은 필요에 따라 피험자에게 투여된다. "치료적 유효량" 또는 "치료적 양"은 주목할 만한 반응(예, 치료될 피험자에 생물학적 또는 임상적으로 적절한 반응)을 만들어내기에 충분한 치료적 조성물의 양이다. 본원에 개시된 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여 수준은 특정 피험자에 대하여 소정의 치료적 반응을 달성하기에 효과적인 활성 화합물의 양을 투여하기 위해 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 치료적 조성물, 투여 경로, 다른 약물 똔느 치료와의 병용, 치료되는 질환의 중증도, 및 질환과 치료될 피험자의 이전 병력에 의존될 것이다. 반면에, 소정의 치료적 효과를 달성하기 위해 요구된 양에 비해 낮은 수준으로 조성물 투여량의 투여를 시작하고 소정의 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차적으로 증가시키는 것은 당해 분야의 기술자의 기술 상식 내에 있다. 조성물의 효력은 달라질 수 있고, 따라서 "치료 유효량"은 달라질 수 있다. 반면에, 본원에서 설명된 검정 방법을 사용하여, 당해 분야의 통상의 기술자는 본원에서 개시되는 후보 화합물의 효력 및 효능을 검사할 수 있고 치료적 처방을 이에 따라서 조정할 수 있다.
본원에 개시된 공개문헌을 검토한 후에, 당해 분야의 통상의 기술자는 특정 제제, 조성물과 함께 사용될 투여 방법 및 치료될 특정 질병을 고려하여 개개인의 피험자에게 투여량을 맞출 수 있다. 투여량의 추가적인 계산은 피험자의 키 및 체중, 증상의 중증도 및 단계, 추가적인 해로운 신체 질환의 존재를 고려할 수 있다. 이러한 조정 또는 변화, 뿐만 아니라 이러한 조정 또는 변화를 언제 어떻게 결정할지는 의료 분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 다양한 실시예가 상술되었지만, 이는 오직 예시적인 방식으로 제시된 것이고 제한하기 위함이 아니라고 이해될 것이다. 개시된 실시예에 다양한 변형은 본 발명의 사상 도는 범위로부터 벗어나지 않고 본원의 공개문헌에 따라 이루어질 수 있다. 따라서, 본 발명의 폭 넓음 및 범위는 상기 설명된 실시예 중 어느것에 의해 제한되지 않을 것이다.
본원에 언급된 모든 문헌은 참조로 본원에 포함된다. 본원에서 인용된 모든 공개문헌 및 특허 문헌은 각각의 개별 공개문헌 또는 특허 문헌이 개별적으로 나타내는 바와 같이 모든 목적에 대해 참조로서 포함된다. 본 명세서에서 다양한 참조 문헌의 인용에 의해, 출원인은 임의의 특정 참조문헌이 본 발명에 대한 "선행 문헌"이라고 인정하는 것이 아니다. 독창적인 조성물 및 방법의 실시예는 이어지는 실시예에서 설명된다.
실시예
이어지는 제한되지 않는 실시예는 본 발명의 선택된 실시예를 설명하기 위한 목적이다. 부분의 변형 및 성분의 요소에 대안은 당해 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이고, 본 발명의 실시예의 범위 내에 있다.
실시예 1: TNFRSF25에 의한 생체 내 치료적 Treg 확장은 알레르기성 폐 염증을 방지한다
종양 괴사 인자 상과(TNFSF)는 림프구 및 비-림프구 세포 모두에 의해 다르게 발현되는 적어도 19개의 리간드 및 30개의 수용체(TNFRSF)로 구성된다. DF3+ T 세포에서, TNFSF 신호는 TCR-의존 방식으로 보통 기능하여 분극화, 확장, 주효 기능, 수축, 기억 및 죽음을 포함하는 면역 반응의 다양한 단계를 지지한다. TNFRSF25(DR3, 이하 TNFR25로 지칭함)는 더 최근에 발견된 TNFSF 멤버 중 하나이고, CD4+ 및 CD8+, 및 천연 살생 T(NKT) 세포에 의해 주로 발현된다(Fang, L., Adkins, B., Deyev, V., 및 Podack, E.R. 2008. J Exp Med 205: 1037- 1048). TNFR25에 대한 리간드인 TNFSF15(TL1A)는 일부 내피세포에 의해 발현되고, TLR4 또는 FcγR 신호 이후에 수지상 세포 및 대식세포/단핵구상에서 신속하게 유도된다 (Meylan, F., 등, 2008. Immunity 29:79-89; Prehn, J.L., 등 2007. J Immunol 178:4033-4038). 시험관 내 연구는 CD4+, CD8+ 또는 천연 살생 T 세포 상에서 TNFR25 신호가 IL-12 및 IL-18에 의한 TCR 활성 또는 공동자극 이후에 IL-2, IL-4 및 IFNγ 생산을 증가시키는 것을 증명했다(Papadakis, K.A., 등, 2005. J Immunol 174:4985-4990). 또한, TNFR25 신호는 CD28 공동자극의 부존재 하에서 IL-2 의존성 기작에 의한 TCR 유도 증식에 대한 CD4+ T 세포의 역치점을 낮춘다(Meylan 등, 2008; Migone, T.S., 등, 2002. Immunity 16:479-492).
TL1A에 의해 TNFR25의 활성은 실험적 천식, 염증성 장질환(IBD), 류마티스 관절염(RA) 및실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에서 질병 병리학을 악화시킨다 (Pappu, B.P., 등, 2008. J Exp Med 205: 1049- 1062). 이러한 각각의 연구에서, Th1, Th2 또는 Th17의 항원 의존성 TNFR25 자극은 분극화되고 TCR 활성 주효 T 세포는 T 도움 서브세트 각각으로부터 적절한 주효 시토킨의 생산을 증대시킨다. TNFR25 신호는 Th1, Th2 또는 Th17 계통에 관하여 나이브 CD4+ T 세포의 분화에 요구되지 않는다. 몇몇의 이러한 보고서에서, TNFR25 또는 TL1A의 유전적 제거를 한 마우스 모델(Pappu, B.P. 등, 2008; Takedatsu, H., 등. Gastroenterology 135:552-567. Bull, M.J., 등, 2008. J Exp Med 205:2457-2464), 우세한 음성 TNFR25 또는 TL1A의 전신성 항체 봉쇄를 발현하는 유전자 변형된 마우스 모델을 연구했다. 면역 이상 또는 질병 민감성이 TL1A 또는 TNFR25가 결손된 마우스 모델에서 관찰되지 않았으며, TL1A에서 TNFR25로의 정상적인 신호 전달이 저해된 자가면역 질병 모델에서도 관찰되지 않았다. 나아가, 이러한 보고서 각각은, TNFR25 또는 TL1A의 발현은 TNFR25 또는 TL1A의 부존재 하에서보다 동물에게 더 위험한 것으로 보이는 전염증 표현형을 생산했다. Treg이 TNFR25(Pappu, B.P., 등, 2008. J Exp Med 205: 1049-1062)를 발현함에도 불구하고, 오늘날까지 CD4+FoxP3+ 조절 T 세포(Treg) 상에서 TNFR25의 역할을 시험하는 보고서가 존재하지 않았다. 치명적인 자가면역, Treg에 의한 TNFR25의 발현 및 다발성 자가면역 질병 모델의 발병에서 TNFR25의 기능을 방지함에 Treg의 중요성을 고려해 볼 때, 우리는 Treg의 기능상에서 TNFR25의 역할을 연구하기로 결심했다. 이 연구는 TNFR25가 Treg에 의해 높게 발현되지만 FoxP3-CD4+ 종래의 T 세포(Tconv)에 의해서는 발현되지 않는다는 것을 밝혀냈다. 외인성 항원의 부존재 하에서 아고니스트 항체인 클론 4C12를 사용하여 생체 내에서 TNFR25를 자극하는 것은 4C12 치료 후 4일 이내에 모든 CD4+ T 세포의 30-35%로 천연 Treg의 신속하고 선택적인 증식을 가져오지만 Tconv에는 그러하지 않으며, 이는 MHC II 및 IL-2 신호에 참여하는 TCR에 의존한다. TNFR25에 의한 Treg 확장은 감작 마우스의 기도 항원 저항에 따라 폐 염증에 대항하여 보호한다. 이러한 데이터는 TNFR25의 Treg의 조절자로서의 신규한 역할을 증명한다. 이 역할은 알레르기성 천식에서 질병 발명으로부터 보호할 수 있다. 나아가, 생체 내에서 TNFR25 작용자를 갖는 천연 Treg의 확장은 IL-2- 또는 생체 밖에서 기초한 접근법에 대한 대안으로서 변환 가능한 방법을 제공하여 인간에 대한 Treg 치료법의 임상적 사용을 가능하게 한다.
물질 및 방법:
마우스: 야생형 C57BL/6 마우스를 Charles River Laboratories (Wilmington, MA)로부터 구입했다. B6 바탕 상의 Foxp3-RFP 리포터 마우스(Wan, Y.Y., 및 Flavell, R.A. 2005. Proc Natl Acad Sci USA 102:5126-5131)), FoxP3-GFP (Fontenot, J.D., 등, 2005. Immunity 22:329-341; Fontenot, J.D., Gavin, M.A., 및 Rudensky, A.Y. 2003. Nat Immunol 4:330-336) 및 CD45.1 SJL, MHC II-/-, IL-2 수용체 베타 돌연변이, CD80/86-/- 및 CD4-/- 마우스를 우리의 동물 시설에서 사육했다. TL1A-/- 마우스를 Lexicon Genetics Inc. (The Woodlands, TX)로부터 구입했고 Speed Congenics에 의해 C57BL/6 바탕으로 역교배했다. 6-12주 키운 마우스를 사용했고 UM 동물 기관에서 병원균이 없는 조건에서 유지했다. 모든 동물 사용 과정을 마이애미 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 허가받았다.
항체 및 시약: 유세포분석기에 사용하기 위한 상업상의 항체를 BD Pharmingen 또는 eBioscience로부터 구입했다. 아르메니아 햄스터 IgG 아이소타입 대조군을 eBioscience로부터 가져왔다. DTA-I (α-GITR)를 R&D시스템으로부터 BioLegend 및 158321 (α-4-1BB)로부터 BioXCell, LG.3A10 (α-IL-27)로부터 얻었다. 재조합 마우스 IL-2 및 항-IL-2 단일클론 항체, 클론 JES6-1 A12를 eBioscience로부터 구입했다. 재조합 마우스 IL-2/항-IL-2 복합체 (IAC)를 25℃에서 15분 동안 5 μg의 JES6-1A12와 함께 10,000 유닛의 rmIL-2을 배양함으로써 생성했다. 마우스 TNFR25에 대한 항체를 생산하는 아르메니안 햅스터 융합세포(4C1 2, 작용자)를 이전에 설명한 바와 같이 생성했다(Fang, L., Adkins, B., Deyev, V., 및 Podack, E.R. 2008. J Exp Med 205: 1037-1048). 4C12 (α-TNFR25) 및 OX-86 (α-OX40)을 중공 섬유 생반응기(Fibercell Systems, Frederick, MD)에서 제조했고 단백질 G 컬럼(GE Healthcare, UK) 상에서 혈청이 없는 상청액으로부터 정제했다. 라파마이신(Rapamune, Wyeth)을 앞서 설명한 바와 같이 75 μg/kg/일로 사용했다(Araki, K., 등, 2009. Nature 460: 108-1 12.). 시클로스포린-A (25 mg/kg/일) FK506 (3 mg/kg/일) 및 Akt 저해제 V (트리시르빈(Tricirbine), 1.5 mg/kg/일, 또는 1.5 mg/kg씩 하루에 2회)을 Calbiochem/EMD로부터 구입했고 복강 내 주사에 의해 투여했다.
유세포분석 및 세포 분별: 단일 세포 현탁액을 비장 및 림프절로부터 준비했다. 106개의 세포를 항-마우스 CD16/CD32로 사전차단했고 다른 항체 조합으로 착색했다. 세포 내 착색을 표준 과전에 따라 수행했다. 유세포분석을 Becton Dickinson FACS LSR II 장치 및 DIVA 또는 Flow Jo 소프트웨어 상에서 수행했다. Stem Cell Technologies로부터의 EasySep Mouse CD4+ T cell Pre-Enrichment 키트를 사용하여 CD4+ T 세포에 대하여 지라세포가 풍부해진 후에, 세포 분별을 FACSAria 세포 분별기(BD)를 사용하여 수행했다.
실시간 RT-PCR: 총 RNA를 급속-냉동 결장 또는 폐 조직 구획으로부터 추출했고 RNeasy Mini 키트 및 QIAGEN으로부터의 QuantiTect Reverse Transcription 키트를 각각 사용하는 역-전사했다. Applied Biosystems으로부터의 TaqMan 프로브를 사용하는 ABI 7300 Light Cycler상에서 실시간 PCR을 중복으로 수행했다. 표본을 β-액틴으로 표준화했다.
인입 전달: 도 2a 및 2b의 연구에 있어서, 총 CD4+ 세포는 FIR 마우스로부터 분류된 FACS였고, FoxP3+RFP+ 세포의 비율을 분류 후에 결정했다. 106개의 FoxP3+ 세포를 함유하는 총 CD4+ 세포를 -2일째에 MHC II-/- 또는 CD4-/- 마우스 안으로 인입 전달(정맥 내)했다. 0일째에, 마우스를 4C12 항체 또는 아이소타입 대조군으로 치료했다. 도 11a 내지 도 11e의 연구에 있어서, 2 x 106개의 FACS는 CD4+FoxP3- 또는 CD4+FoxP3+ 세포를 CD45.2+ FIR로부터 분류했다. CD45.1 유전자도입 마우스 안으로 정맥 내 주사를 통해 FIR 마우스를 인입 전달했다. 하루 후에, 4C12 10 μg을 복강 내 주사에 의해 투여했다. 말초 혈액 세포에서 FACS 매일(3일 후에 시작) 주입한 후에 도입된 세포의 확장이 이어졌다.
시험관 내에서 억제 검정: 1 x 105의 CD4+CD25- 세포를 96-웰 원형-바닥 플레이트에 위치시켰고 2 μg 가용성 항-CD3(2C11) 항체로 APC(비율 1:1) 및 CD4+FIR+ 조절 T 세포가 다른 비율로 존재하거나 존재하지 않는 하에서 활성화시켰다. 대조군 IgG, 4C12, DTA1 항체를 10 μg/ml의 농도로 표시되는 곳에 첨가했다. 배양균을 72시간 동안 배양했고 3H-티미딘 (1 μCi/웰; Perkin Elmer, Waltham, MA)으로 마지막 6시간 동안 펄싱(pulsed)했다. 포함된 동위원소를 액체 섬광 계산 (Micro Beta TriLux counter, Perkin Elmer)을 이용하여 계산했다.
알레르기성 천식 유도: 0일째에 200 μl중에 6.6 mg의 알룸(알루미늄 포타슘 설페이트; Sigma-Aldrich)에 흡수된 66 μg 오발부민(crystallized chicken egg albumin, grade V; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 복강 내 주사하고 5일째에 복강 내를 신장시킴으로써 마우스를 민감하게 만들었다. 12일째에, 200 μl PBS 중에 20 μg 항-TNFRSF25 아고니스트 항체(4C12) 또는 20 μg의 염소 항-햄스터 IgG 아이소타입 대조군(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., Westgrove, PA)으로 마우스에 복강 내 주사했다. 16일째에, BANG 분무기를 사용하여 제거-NYU 코에만 직접적 흐름 흡입 노출 시스템(Jaeger-NYU Nose-Only Directed-Flow Inhalation Exposure System)(CH 기술)으로 PBS 중의 0.5%의 오발부빈(Sigma-Aldrich)으로 마우스를 연무 도전시켰다. 19일째에, 마우스를 죽였으며, PBS를 폐에 뿌리고 세기관지암 세척물을 수득했다. RNA 또는 단일 세포 현탁액에 대하여 처치된 폐엽을 유세포분석 또는 폐 조직학을 위해 폐 균질 현탁액으로부터 만들었다. 또한, 차후의 RAN분석 뿐만 아니라 유세포 분석을 위해 기관지 림프절 배수물을 구했다. 과요오드산 쉬프(PAS) 염색된 폐 구획의 정량을 (H PAS 벡터를 사용하여) 색 데콘볼루션(deconvolution)에 의한 MacBiophotonics Image J 소프트웨어를 사용하여 수행했고, 이후에 이미지의 영상 분할(색[2], 100으로 세팅됨)하고 핵 계수기(100 내지 1000으로 제한 세팅됨)를 사용하여 계수하였다.
통계학적 분석: ABI 프리즘 프로그램을 사용하여 모든 도식화 및 통계학적 분석을 수행했다. 스튜던트 t-데스트를 사용하여 쌍 분석을 수행했다. 한 방향 ANOVA 및 Tukey 사후-테스트를 사용하여 다중 가변 분석을 수행했다. 유의성은 *(p<0.05), **(p<0.01) 및 ***(p<0.001)로 표시된다.
결과
TNFR25는 조절 T 세포에 의해 고도로 발현된다: 본 연구에 앞서, CD4+FoxP3+ 조절 T 세포(Treg) 상에서 TNFR25에 대한 기능을 증병하는 보고서가 존재하지 않는다. Treg, FoxP3-CD4+(Tconv)에 의한 TNFR25의 발현의 존재를 확인하기 위해서, Treg는 99%를 초과하는 순도로 FoxP3 리포터 마우스로부터 분류된 단일 세포였고, 이후에 TNFR25 뿐만 아니라 GITR(TNFRSF18), OX40(TNFRSF4, CD134) 및 4-1BB (TNFRSF9, CD137)의 발현에 대해 유세포 분석에 의해 분석했다. FoxP3 프로모터 하에서 이중시스트론 구조체로부터의 적색 형광 단백질이 녹인(knock-in)된 전이 유전자를 발현하는 FoxP3-리포터 마우스(FIR 마우스)를 사용하여 라이브(live) Treg의 분류를 이룰 수 있다. 이 분석은 TNFR25, OX40, GITR 및 4-1BB가 Treg 및Tconv에 의해 모두 발현되는 동안, Tconv에 의해 낮은 발현에 비해 Treg에서 TNFR25의 매우 높은 발현으로 인해 발현 수준에서 매우 큰 상대적 차이를 관찰했다는 것을 드러냈다(도 1a). 이론에 의해 결합 되기를 바라지 않고, Treg 및 Tconv 사이에서 TNFR25의 발현 차이는 TNFR25가 Treg의 기능에 중요한 역할을 담당할 것이라는 것을 보여주었다.
TNFR25 자극은 생체 내에서 Treg을 신속하게 확장한다: TNFR25 아고니스트 항체인 클론 4C12의 생성은 앞서 설명했다(Fang, L., Adkins, B., Deyev, V., 및 Podack, E.R. 2008. J Exp Med 205: 1037-1048). FIR 마우스의 사용함으로써, TNFR25 아고니스트 항체인 4C12로 처치한 후에 Treg 집단의 빈도 및 표현형을 말초 혈액에서 지속적으로 모니터링했다. 4C12의 복강 내(i.p) 주사는 생체 내에서 CD4+FoxP3+ Treg의 신속하고 높은 재생가능한 확장을 유도했다(도 1b). 확장은 최대 반응에서 말초 혈액 내의 총 CD4+ T 세포의 30-35%를 포함하는 FoxP3+ Treg와 함께 4C12 주사 후 4 및 5일째에 최대이다. 말초 혈액 및 모든 조직 부위에서 지속되는 4C12 확장성 Treg은 2주 동안 검사되었고, 그 동안에 천천히 수축되어 비자극 수준이 되었다. 주사의 부위는 이 확장에서 역할하지 않고, 이는 4C12 주사를 복각 내로, 피하로 또는 정맥 내로 한 후의 동등한 Treg 확장에 의해 증명되었다. 4C12 주사 후의 Treg 확장은 약 0.4 mg/kg 체중에 상응하는 10 μg의 투여량에서 보인 최대 반응에 투여량-의존한다(도 1b). 정제된 마우스 TL1A-Ig 융합 단백질(100μg)로 FIR 마우스의 처치는 4C12 항체로 처치함에 따라 유사한 규모 및 동역학을 갖는 Treg 확장을 유도하는 것으로 밝혀졌다. FIR 마우스에서 RFP 발현의 검출은 FoxP3 전사의 존재를 정확히 보고하지만, FoxP3 및RFP가 FoxP3-RFP 전사로부터 독립적으로 번역되기 때문에 FoxP3 단백질의 발현이 보장되지 않을 수 있다는 가능성이 현존한다. 그러므로, FoxP3 항체로 염색함으로써 야생형 마우스에서 그리고 FoxP3-GFP 융합 단백질을 발현하는 FoxP3-GFP 녹인 리포터 마우스에서 4C12의 투여 후 CD4+FoxP3+ 세포의 확장을 확인했다.
Treg 발현된 TNFR 멤버들 중 TNFR25는 Treg 확장을 유발에 특별하다: TNFRSF 멤버인 GITR 및 OX40은 Treg에 의해 발현되고(도 1a) Treg 활성 및 증식에 영향을 미친다. 4-1BB에 의한 Treg의 자극은 이러한 세포의 활성 및 증식 모두를 조정할 수 있다고 생각된다. 나아가, TNFRSF 멤버 CD27을 통한 CD4+FoxP3- 세포의 자극은 FoxP3 발현을 유도하는 것으로 생각된다. TNFR25 및 이러한 다른 TNFSF 멤버 사이에서 Treg의 기능상의 억제 또는 유도 간에 중복되는 것을 고려해 볼 때, TNFR25, OX40, 4-1BB, GITR 또는 CD27의 자극 후에 생체 내에서 Treg 확장을 비교했다. 모든 경우에서 각각의 수용체에 잘 특정화된 아고니스트 단일클론 항체를 특정 신호를 촉발하기 위해 사용했다. 이러한 연구는 TNFR25가 Treg의 확장을 선택적으로 유도하는 능력에 대해 검사된 TNFRSF 멤버들 중 유일하다고 증명했다(도 1c). OX40-유도 Treg 확장이 IL-4, IL-6 및 IFNγ의 고갈을 요구했다고 최근 보고되었다 (Ruby, CE., 등, 2009. J Immunol 183:4853-4857). 이와 대조적으로, 생체 내 TNFR25 유도 Treg 확장은 추가적인 조작이 필요 없다.
MHC II 및 IL-2 신호는 TNFR25 유도 Treg 증식을 위해 요구된다: 시험관 내에서, Treg 증식은 TCR-자극 항체, 항원 표출 세포 및 IL-2 신호의 다양한 조합으로 유도될 수 있다. 항-CD3 및 항-CD28 항체, 재조합 IL-2, TGF-β 및 레티노산을 TNFR25 아고니스트 항체와 함께 또는 이를 제외하고 사용하는 연구에서 시험관 내 Treg 증식의 유도를 시도했고, 모든 경우에서 TNFR25 자극은 시험관 내에서 Treg 증식의 증가에 실패했으며, 이는 추가적인 신호가 필요하다는 것을 나타낸다(표 1).
표 1: (제시된) 다양한 정제된 림프구 집단을 사용하여 TNFR25 유도 Treg 증식을 위해 필요한 것을 검사하기 위한 시험관 내 조건 테스트
조건 지라세포 CD4+ LN
1. 비자극 x x x
2. 비자극 + 4C12 x x x
3. 비자극 + 4C12 crossl. x
4. α-CD3 x x x
5. α-CD3 + 4C12 x x x
6. α-CD3 + 4C12 crossl. x
7. α-CD3 + TGF-β x x x
8. α-CD3 + TGF-β + 4C12 x x x
9. α-CD3 + RA x
10. α-CD3 + RA + 4C12 x
11. α-CD3 + RA + 4C12 crossl. x
12. α-CD3 + α-CD28 x x x
13. α-CD3 + α-CD28 + 4C12 x x x
14. α-CD3 + IL-2 x x x
15. α-CD3 + IL-2 + 4C12 x x x
16. α-CD3 + α-CD28 + IL-2 x
17. α-CD3 + α-CD28 + IL-2 + 4C12 x
18. α-CD3 + α-CD28 + TGF-β x
19. α-CD3 + α-CD28 + TGF-β + 4C12 x
20. α-CD3 + IL-2 + TGF-β x
21. α-CD3 + IL-2 + TGF-β + 4C12 x
22. α-CD3 + α-CD28 + IL-2 + TGF-β x
23. α-CD3 + α-CD28 + IL-2 + TGF-β + 4C12 x
24. 생체 내에서 하루 + 시험관 내에서 4일: IL-2 + 4C12 적정 x
TNFR25가 TCR 신호에 대하여 CD4+ T 세포의 민감성에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 다음 수행된 실험은 TNFR25 유도 Treg 증식이 생체 내 TCR 신호에 의존하는지 여부를 결정하는 것이다. MHC II-/- 또는 CD4-/- 마우스를 FIR adntm로부터 정제된 106개의 CD4+Fox3+ 세포를 함유하는 총 CD4+ 세포로 인입 전달했다. MHC II-/- 마우스가 CD4+ T 세포에 결손이 있기 때문에, CD4+ T 세포 고갈 환경에 이어지는 인입 전달을 발생시킬 수 있는 임의의 항상성 확장을 제어하기 위한 대조군 집단으로서 CD4-/- 마우스를 사용하는 것을 고려했다. 인입 전달 후 2일째에 4C12 또는 아이소타이프 대조군 항체로 마우스를 처치했고, Treg의 비율 및 절대수를 항체 주입 후 4 및 6일째에 결정했다(도 2a, 2b). 이러한 데이터는 Treg이 야생형 및 CD4-/- 마우스와 유사한 정도로 확장함에도 불구하고, MHC II 분자가 생체 내에서 TNFR25 유도 Treg 증식을 위해 필요하다는 것을 증병한다. MHC II-/- 마우스에서 인입 전달된 Treg의 비율을 CD4-/- 마우스에서 비해 낮은 것으로 관찰했으며, 이는 MHC II-/- 마우스가 기저선에서 CD4+ 세포의 수가 CD4-/- 마우스보다 더 많기 때문이다(도 2a). 반면에, 인입 전달된 Treg의 절대적인 수의 비교(도 2b)는, 동등한 절대적인 수의 Treg이 두 개의 군으로부터 회복된다는 것을 나타낸다. 이러한 연구는 TNFR25 유도 Treg 증식에서의 MHC II 신호의 필요성을 증명하며, 이는 TCR 신호가 Treg이 Tconv 세포에서의 TNFR25 신호와 유사하게 TNFR25 신호를 허용하기 위해 요구된다는 것을 간접적으로 암시한다. TCR 신호가 TNFR25 유도 Treg 증식을 위해 요구된다는 것에 대한 추가적인 증거를 제공하기 위해서, 마우스를 시클로스포린 A 또는 FK506으로 기처치했고 Treg 수를 4C12 또는 아이소타입 대조군 항체로 처치한 직후에 분석했다(도 2c, 2d). 이러한 연구는 MHC II 신호의 분존재 하에서 무엇이 관찰되는 지와 같은 것을 보여주며; 시클로스포린 A 또는 FK506의 존재하에서 촉발하는 TNFR25이 Treg 증식을 유도하는데에 실패한다는 것을 증명했다. MHC II에서 동족 자가-항원의 필요성은 추가적인 조사에 있지만 이러한 필요는 외인성 항우언의 부존재 하에서 TNFR25의 Treg 선택성(그 밖에도 Treg 상의 TNFR25의 선택적 발현, 도 8a 내지 8c)에 대한 추가적인 설명을 제공할 수 있다.
TNFR 신호가 CD28 공동 자극의 부존재 하에서 TCR 신호 직후에 IL-2 신호에 대한 Tconv의 민감성을 증가시킬 것으로 생각했다. Treg의 TNFR25 유도 증식(도 2a 내지 도 2d)에 대한 MHC II 및 NFAT 활성 모두에 대한 주어진 요건에서, IL-2 또는 CD80/86 신호가 추가적으로 요구되는지 여부를 결정했다. 비-기능성 IL-2 수용체 베타 쇄(도 2e)를 발현하는 마우스 및 CD80/86-/- 마우스(도 2f)에서 Treg 확장을 4C12의 주사 후 4일째에 결정했다. 이러한 데이터는 TCR 및 IL-2 수용체 신호가 요구되지만, 하지만 CD80 또는 CD86 공자극이 생체 내 TNFR25 유도 Treg 확장에 요구되지 않는다는 것을 증명한다. 이론에 의해 결합될 것을 소원하지 않고, Treg에서의 CD28 및 CTLA-4 신호는 TNFR25 유도 증식에 대한 요건이 아닐 수 있다. 나아가, 혼합된 TNFR25, TCR 자극 및 IL-2 신호가 생체 내 Treg 증식의 유도에 실패하기 때문에, 추가적인 신호가 조사에서 또한 요구된다.
TNFR25 자극 Treg는 생체 밖에서 IL-2 유도 증식에 과민반응성이다: 시험관 내 TNFR 25 유도 Treg 증식에 대한 요건은 추가적인 연구가 필요함에도 불구하고, TNFR25 아고니스트 항체로 처치된 마우스로부터 정제된 Treg 이 생체 밖에서 IL-2 유도 증식에 과민반응성이라는 것을 관찰했다(도 3a). 이러한 데이터는 TNFR25 유도 Treg 확장에서 IL-2 신호의 중요성을 제공하고(도 2e), TNFR25 촉발이 TL-2 신호에 대한 Treg의 민감성에 영향을 미침으로써 Treg 확장을 유도한다는 것을 보여준다. 이러한 관찰을 설명할 수 있는 몇몇 가능한 기작을 예측했다: 1) TNFR25 Treg 상에서 IL-2 수용체 서브유닛의 발현이 증가될 수 있고, 2) TNFR25는 Treg에서 STAT5 활성을 향상시킬 수 있고, 3) TNFR25는 Treg에서 mTOR 활성을 향상시킬 수 있고, 4) TNFR25는 Treg에서 PI3-키나아제/Akt 활성을 향상시킬 수 있다. IL-2 수용체 알파, 베타 및 감마 쇄의 발현을 확인하기 위해서, IgG 대조군 항체로 처치된 마우스로부터 단리된 Treg을 4C12 항체로 처치된 직후 생체 내에서 확장을 겪는 Treg 상에서 비교하여 유세포 분석을 수행했다(도 3b). 이러한 데이터는 IL-2 수용체 알파 쇄(CD25)의 발현이 4C12에 노출된 후에 실질적으로 감소하면서(도 7a), 베타 및 감마 쇄의 발현(각각 CD122 및 CD132)은 4C12 및아이소타입 대조군 항체로 처치된 마우스로부터 단리된 Treg 상에서 변하지 않고 유지되어서(도 3b), 가능한한 효과적으로 옵션(1)을 제거한다는 것을 증명한다. STAT5의 인산화가 4C12 처치된 마우스에서 증가 되었는지를 확인하기 위해서, 4C12 또는 아이소타입 대조군 항체로 4일 전에 처치된 마우스로부터 Treg을 단리하고, 생체 밖에서 IL-2에 노출시켰다(10 ng/ml, 15분). 이러한 Treg을 인-특이적 항체로 염색한 후에, 염색된 Treg은 STAT5 뿐만 아니라 S6 인산화가 대조군 마우스와 비교해서 4C12 처치된 마우스로부터 단리된 Treg에서 증가되지 않았다는 것을 증명했으며, 이는 제 2 가능성을 효과적으로 제거했다(도 3c). 이후에, mTOR 억제자, 래파마이신의 존재 하에서 생체 내에서 TNFR25 유도 Treg 증식이 변하지 않는다는 것을 발견했으며,이는 제 3 가능성을 제거했다(도 3d). 마지막으로, Akt 신호가 TNFR25 유도 Treg 증식에 요구되는 지를 결정하기 위하여, Akt1/2/3 선택성 저해제, 트리시르빈(Akt 저해자 V, AktiV)의 존재 또는 부존재 하에서 TNFR25 아고니스트 항체 또는 대조군 항체로 마우스를 처치했다. 이러한 연구는 Akt 활성의 선택적 저해가 비히클 처치된 대조군에서 TNFR25 유도 Treg 증식을 33.69±1.253%로부터, AktiV로 하루에 1회 처치(데이터 미도시, p<0.001)된 경우 22.43±1.352%(N=6)까지, 및 AktiV로 하루에 2회 처치(도 3e, p=0.0003)된 경우 18.20±2.117%(N=3)까지 저해하기에 충분했다.
항원 나이브 마우스에서 TNFR25 또는 IL-2 항체 복합체 유도 Treg 확장의 비교: 생체 내에서 Treg을 선택적으로 확장하는 다른 약제가 Boyman 등(Science 311:1924-1927, 2006)에 의해 보고되었고, 이는 재조합 IL-2 및특정 항-IL-2 항체(IAC)의 복합체, 클론 JES6-1A12의 사용을 통해 보고되었다. 따라서, 4C12 또는 IAC 중어느 하나로 처치한 후에 생체 내에서 Treg 확장을 직접적으로 비교했다(도 7a). 이 분석은 Treg 확장의 규모 및 동역학이 생체 내에서 4C12 또는 IAC로 처치한 후와 비슷하다는 것을 증명했다. 반면에, IAC로 처치한 것과 비교하여 4C12로 처치한 후에 확장된 Treg의 수축이 오래간다고 관찰했다. CD25의 중간 수준을 발현하는 TNFR25 확장 Treg에 대하여, IAC 확장 Treg가 높은 수준의 CD25를 발현한다고 관찰했다(도 7b). IAC에 의해 확장된 Treg에 대한 4C12에 의해 확장된 Treg의 비교에서 CD11a, CD28, CD45RA, CD62L, CD127, 세포 내 또는 세포 밖 CTLA-4, OX40, PD-1, IL-17A 또는 IFNγ의 발현의 다른 차이점이 발견되지 않았다.
TNFR25에 의한 생체 내 Treg 확장은 알레르기성 폐 염증을 감소시킨다: 4C12 확장 Treg이 질병 모델에서 염증을 방지하는지 여부를 결정하기 위하여, 이런 처치가 난백 알부민/백반 프라임(primed) 마우스에 알레르기성 폐 염증이 유도된 후에 난백 알부민에 도전하는 모델로 특정된 염증을 감소시킬 수 있는지를 테스트했다. 0일째 및 5일째에 마우스를 난백 알부민/백반으로 프라이밍한 후에 4C12 또는 햄스터 IgG로 12일째에 처치했다. 4일 후에, Treg 확장이 최대가 된 시점에, PBS 또는 PBS 식염수 대조군에서 분무주입된 난백 알부민으로 기도를 도전시켰다. 이 기간 동안에 말초 혈액에서 Treg을 모니터링하여 Treg의 최대 확장을 확인했다(도 4a). 난백 알부민/백반 감작 후에 4C12 유도 Treg 확장은 비-감작 마우스에서의 확장에 비해 최초 2일 동안 약간 늦춰졌지만, 이후에 Treg은 4일째에 총 CD4+ T 세포의 높은 비율(50-55%)로 빠르게 확장했다(도 4b, 4c). 분무주입 후 3일째에 마우스를 죽였고, 기관지 폐포 세정액(BALF), 기관지 림프절(bLN) 및 폐 조직을 분석했다.
폐로부터 단리된 세포의 총 수는 대조군 또는 4C12 처치된 동물 간에 변화가 없었다. 이런 관찰과 일치하여, 폐 내의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 수는 대조군 및 4C12 처치된 마우스 간에 유사했지만, 반면에 4C12 처치된 마우스에서 Treg의 수가 현저히 증가했다(도 4b). 폐 조직 내의 Treg의 조성물의 분석은 4C12 투여 후 7일 째에(분무주입 후 3일 째에) 폐 내의 Treg의 빈도가 햄스터 IgG 처치된 마우스에서 22%임에 비해 모든 CD4+ T 세포에서 55%로 유지된다는 것을 보였다(도 4c). Treg에 대한 Tconv의 균형이 단지 Treg의 총 수에 비해 질병 병리학의 예측을 더 용이하게 하였으며(Tang, Q., 등 2008. Immunity 28:687-697; Monteiro, J.P., 등, 2008. J Immunol 181 :5895-5903); Treg에 대한 CD4+FoxP3-(Tconv)의 비율은 폐 조직에서 결정되었다(표 2). 질병이 없는 마우스에서 폐-침윤성 Treg의 표현형이 TNFR25-확장성 Treg의 표현형과 일관된다는 것을 확인하기 위해, 폐 침윤성 Treg를 분석했고, IgG 처치된 마우스로부터 단리된 폐-침윤성 Treg로부터의 GITR, OX40, PD-1, CD44, CD62L 및 CD69의 발현이 구분되지 않는다는 것을 발견했다.
표 2: CD4+FoxP3-(Tconv), CD4+FoxP3+(Treg)의 총 수 및 도 10a 내지 도 10e에서 설명된 바와 같이 채취된 총 폐 세포로부터 Treg 세포에 대한 Tconv의 비율이 도시된다. 좌폐의 단일 세포 현탁액에서 수득한 세포의 수 x 유세포 분석에 의해 분석된 총 세포에 대한 림프성 개폐형 세포의 비율 x 림프성 개폐형 세포 집단 내의 Tconv 또는 Treg 세포의 비율을 곱해서 세포 수를 계산했다.
4C12는 절대 Tconv 수 및 Tconv:Treg 비를 감소시킨다.
IgG 4C12
Tconv/폐의 값 78,200 23,340
Treg/폐의 값 10,700 44,400
Tconv:Treg의 비 7:1 1:2
폐 조직 세포의 분석과 일치하여, 난백 알부민을 함유하는 분무 도전 후에 BALF로부터 단리된 세포의 총 수는 현저히 증가했지만, 식염수 분무 대조군은 모든 조건에서 그러하지 않았으며, 하지만 4C12 처치에 의해 눈에 띄게 감소했다. BALF 내의 호산구의 총 수는 BALF 세포의 총 수에 대략적으로 비교했고, 4C12로 기처치한 것에서는 호산구 증가증의 중증도가 현저히 감소했다고 관찰했다(도 4d).
후-염증 시토킨 IL-4,IL-5 및 IL-13은 알레르기성 폐 염증의 발병에 강하게 연루되어있다. 이러한 시토킨의 발현이 4C12로 기처치함으로써 감소되는지 여부를 확인하기 위하여, 분무주입 후 3일째에 급속 냉동한 폐로부터 총 RNA를 추출했고 RT-PCR로 분석했다. 이 분석은 폐-침윤성 CD4+ 세포들 중 IL-4, IL-5 및 IL-13의 발현이 4C12로 처치한 후에 현저히 감소했지만, 식염수-분무주입한 대조군에 비해 아이소타입 대조군 항체로 처치한 후 증가된 채로 유지한다는 것을 증명했다(도 4e). 추가적인 대조군으로서, FoxP3 RNA 발현의 수준을 유세포 분석에 의해 보여지는 것과 동일한 CD4+ 세포를 발현하는 FoxP3의 상대적인 비율을 분석하고 비교했다(도 4e에 대해 도 4c를 비교). 폐 조직 조직학은 이러한 발견을 확인했고, 식염수 분무주입된 대조군에 비해 4C12 처치 후 감소된 림프구 침윤성 및 기도 점액 생산을 증명한다(도 4f 및 도 4g에서 정량됨).
TNFR25는 Tconv를 활성시키거나 확장시키지 않고 Treg을 확장시킨다: 4C12-확장된 Treg의 표현형을 확인하기 위하여, 우리는 말초 림프절로부터 단리된 CD4+FoxP3+ 세포, 4C12 또는 IgG 아이소타입 대조군으로 주입된 마우르로부터의 장간막 림프절 및 비장을 분석했다. 4C12 확장된 Treg에는 CD4+FoxP3_CD25 중간 세포가 주를 이뤘고, 분석된 2차 림프기관 모두에서 확장되는 것으로 발견했다(도 5a, 5b 및 도 8a, 8d). 4C12 처치는 CD11a, CD28, CD45RA, CD62L, CD127, 세포 내 또는 세포 밖 CTLA-4, OX40, PD-1, IL-17A 또는 Treg에 의한 IFNγ의 발현을 달라지게 하지 않는다. 모든 CD4+FoxP3+ 세포가 4C12 처치 후 GITR 양성으로 유지됨에도 불구하고, GITR이 발현되는 CD4+FoxP3+의 비율은 4C12 처치 후에 CD25 중간 서브세트에 지지하여 이동된다(도 8b). αEβ7 인테그린은 CD25 양성 또는 음성 중 어느 하나일 수 있는 CD4+FoxP3+의 고도 억제 서브세트에 의해 발현된다. CD103 발현의 분석은 4C12 확장된 Treg에 의해 증가되지만 대조군 Treg에 의해서는 증가되지 않는 CD103의 발현을 드러냈다(도 8c). 중요하게는, 4C12로 처치한 후 CD4+FoxP3- 세포의 분석 및 CD8+ 세포의 분석은 TNFR25 신호가 이러한 세포 집단들 중 어느 것의 절대 수 또는 비율을 증가시키지 않는다는 것을 드러냈다. 4C12로의 처치가 비-Treg 세포의 증식을 자극하는지 여부를 확인하기 위하여, CD4+ Tconv 및 CD8+ T 세포를 증식 표지 Ki67로 염색했다. 이 분석은 외인성 항원의 부존재 하에서 4C12로의 처치가 Tconv 또는 CD8+ T 세포 증식을 증가시키지 않는다는 것을 보여줬다. 나아가, CD8+ 세포 및 FoxP3-CD4+를 CD44, CD62L 및 CD69에 대하여 염색하는 것은 4C12 및 IgG로 처치된 마우스 사이에서 차이를 보이지 않았다. 따라서, TNFR25 신호는 외인성 항원의 부존재 하에서 CD4+ 또는 CD8+ 주효 세포의 확장 또는 활성을 유도하지 않고 Treg을 선택적으로 확장한다.
TNFR25 자극은 생체 내에서 천연 Treg의 증식을 유도한다: 4C12 처치 후 Treg의 증가는 데 노보(de novo) Fox P3 발현으로부터 또는 CD4+FoxP3+ 세포의 증식으로부터 기인할 수 있다. 이러한 두 개의 가능성 사이를 구분하기 위해서, CD4+FoxP3+ 세포 상에서 증식 표지 Ki67의 발현을 결정했다(도 5c, 5d). 데이터가 CD4+FoxP3+CD25hi 세포에 대한 CD4+FoxP3+CD25int 세포의 비에 증가를 보이는 바와 같이, 다수의 Ki67+ 세포는 4C12로 처치된 마우스 내의 CD4+FoxP3+CD25int였다. CD4+FoxP3+ 세포의 작은 비율(약 27%)는 ki67에 대해 염색되지 않았고(도 5c, 5d), 대부분의 이러한 세포는 CD25hi였다. 4C12로 처치한 후 CD25int 세포의 관찰된 증식이 CD25int 세포의 선택적 자극으로부터 기인한 것인지, 또는 Treg가 자극되어 이후에 증식 도중 감소되는 CD25 발현에 관계없이 증식되는 것인지가 여전히 불명확하다.
CD4+FoxP3+CD25int 세포에 의해 증가된 증식은 TNFR25 신호가 CD4+FoxP3- 세포에 의해 데 노보 FoxP3 발현을 자극할 수 있다는 가능성을 결정적으로 배제하지 않는다. 이런 가능한 인입 전달 실험을 조사하기 위해서, CD45.2+ FIR 마우스로부터의 고도로 정제된(>99% 순도) CD4+FoxP3- 또는 CD4+FoxP3+ 세포를 CD45.1 유전자도입형 (congenic) B6/SJL 마우스 안으로 주입하여 실험을 수행했다. 이러한 연구는 CD45.1+ 숙주에서 4C12로 처치한 후 인입 전달된 CD45.2+ 세포의 추적을 가능하게 했고, 인입 전달된 CD45.2+CD4+ 세포에 의한 FoxP3-RFP의 지속, 유도 또는 침묵 (silencing)을 모니터링 가능하게 했다(도 5e 내지 도 5h). 본 실험은 유전학적으로 또는 실험적으로 면역결핍된 균주 안으로 인입 전달한 후 Treg의 항상성 확장으로부터 발생할 수 있는 임의의 합병증을 피하도록 완전한 면역적격 마우스에서 이러한 실험을 수행하도록 신중히 선택했다. 2 x 106개의 분류된 세포를 면역적격 CD45.1+ 수신자 안으로의 전달은 인입 전달 후 적어도 2주 동안에 말초 혈액에서 CD45.2+CD4+세포의 희귀하지만 용이하게 구별할 수 있는 집단을 검출하기에 충분했다(도 5g, 5h). 인입 전달 후 4C12에 의한 수용자 마우스의 TNFR25 자극은 CD4+FoxP3- 세포에 의한 데 노보 FoxP3 발현을 자극하지 않았으며(도 5e), 4C12 또는 대조군 항체 처치에 상관없이 0.5%의 빈도 및 FoxP3-RFP-로 유지되었다. 2 x 106 세포의 인입 전달 후 FoxP3+RFT+ 세포의 빈도는 대조군 항체로 처치된 마우스의 말초 혈액 내 CD4 세포의 0.04%였고, 4C12 처치된 마우스(도 5f)에서 FoxP3+RFP+CD45.2+ 세포의 빈도보다 3배 증가한 0.11%로 증가했다. 이 결과는 비-전이된 마우스(도 1b)에서 TNFR25 아고니스트 항체에 의한 FoxP3+Treg의 확장의 규모와 일치한다. 이 데이터는 4C12 처치가 CD4+FoxP3+ 세포의 증식을 자극하며, 이는 확장 후 FoxP3 발현을 유지한다는 것을 지시한다(도 5f). 이 데이터는 TNFR25 신호가 주로 Treg의 전신성 증가를 가져오는 CD4+FoxP3+CD25int 세포의 증가된 증식을 자극한다는 것을 보여준다. 또한, 이러한 연구는 인입 전달된 CD4+FoxP3- 세포가 4C12 처치 후 어떤 시점에서도 확장되지 않으면서(도 5g), 인입 전달된 CD4+FoxP3+ 세포의 확장이 FIR 마우스 내의 내생 Treg의 확장 및 수축과 같은 유사한 동역학을 따른다는 것을 증명한다(도 1b를 도 5h와 비교). 중요하게는, 인입 전달된 CD4+FoxP3+ 세포는 확장 도중에 그리고 그 후에 모두 FoxP3 발현을 유지하며, 이는 확장된 Treg 풀의 관찰된 수축이 FoxP3 발현의 손실로부터라기 보다 세포 죽음으로부터 기인한다는 것을 시사한다(도 5f, 5h). 만일 인입 전달된 CD45.2+CD4+FoxP3+ 세포의 확장된 풀이 실험 과정 중 어느 시점에서 FoxP3 발현을 상실한다면, CD45.2+CD4+ 세포 내의 CD4+FoxP3- 세포의 비율이 증가할 것이지만, 이는 발생하지 않을 것이다. 인입 전달된 CD4+FoxP3- 세포의 작은 비율이(< 5%) 관찰되어 실험 과정 전반에서 FoxP3 발현(도 5e) 및 FoxP3 발현을 상실하는 전이된 CD4+FoxP3+ 세포(도 5f)의 작은 비율 (< 5%)을 보였다. FoxP3 발현에서 이러한 중요하지 않은 불안정성은 이러한 관찰을 설명할 것으로 예상된다.
TNFR25 확장 Treg는 생체 밖에서 고도 억제성이다: 4C12 확장 Treg가 억제 활성을 함유하는지 여부를 결정하기 위하여, 4C12 또는 IgG 아이소타입 대조군 항체 중 어느 하나로 처치한지 4일째에 FIR 마우스로부터 Treg 세포를 정제했다(도 8a). 이후에, 이러한 Treg 서브세트를 종래의 증식 검정에 사용했다. 4C12 처치된 마우스로부터 정제된 Treg는 아이소타입 대조군 항체 처치된 마우스에 비해 CD4+CD25- 세포의 증식을 더 큰 정도로 억제했다(도 6a 내지 도 6d). 4C12 확장 Treg에 의한 Tconv 증식의 억제를 시험관 내 억제 검정에서 항원 표시 세포(APC)의 존재 및 부존재 하에서 모두 관찰했다(도 6a vs 6b). 억제 검정 중에 4C12의 첨가가 Treg의 억제 활성을 조정하는지 여부를 결정하기 위하여, 동일한 검정을 4C12 또는 Treg-매개억제(클론 DTA-1) 또는 아이소타입 대조군 항체로부터 Tconv를 방출하는 것으로 알려진 GITR-아고니스트 항체의 존재하에서(도 6c, 6d) 설명한 바와 같이(도 6a, 6b) 수행했다. 아고니스트 TNFR25 또는 GITR 항체의 존재는 4C12 또는 IgG-아이소타입 대조군 처치된 마우스로부터 Treg을 수득했는지와 상관없이 APC의 부존재 하에서 유사한 효과를 생산하는 항체들 둘 모두에서 Tconv 증식을 부분적으로 회복했다(도 6c). 흥미롭게도, APC의 존재하에서, DTA-1은 Treg의 존재하에서 4C12 처치된 마우스로부터의 Treg에 비하여 IgG-아이소타입 대조군 처치된 마우스로부터 더 큰 규모의 Tconv 증식을 유도했다(도 6d). APC의 존재는 4C12의 존재하에서 Tconv 증식의 부분적 회복을 현저히 변화시키지 않았다. 또한, 대조군은 오직 Tconv 상에서 4C12의 자극성 효과가 최소화되고, Tconv 상에서 GITR의 자극성 효과에 비해 현저히 적다는 것을 증명했다(도 6c, 6d). 4C12에 의한 Treg 억제 활성의 저해가 Treg에 의해 발현된 TNFR25의 효과에 특이적이지만 Tconv에는 특이적이지 않다는 것을 추가적으로 증명하기 위하여, 억제 검정이 음성 TNFR25를 주로 발현하는 유전자변형된 Tconv를 사용하여 수행했다(도 6e). 이러한 데이터는 TNFR25 신호에 의한 Treg 억제 활성의 저해가 오직 Treg가 기능성 TNFR25만을 발현하는 조건 하에서 발생한다는 것을 증명하며, 이는 이 효과가 Treg 상의 TNFR25에 의한 신호에 의하고 Tconv 상의 TNFR25에 의한 신호에 의하지 않는다는 것을 지시한다. 특히, 생체 내에서 4C12로 확장되고 이후에 억제 검정을 위하여 시험관 내에 투입된 Treg(도 6a, 6b)는 4C12 항체가 더 이상 존재하지 않는 조건 하에서 높은 억제성을 가진다. 이것은 오직 4C12 항체가 Treg 억제 활성의 부분적인 저해가 관찰되는 억제 검정의 과정에서 유지된다. 4C12는 CD25int Treg의 증식을 유도했으며, 그리고 일부 연구에서 CD25의 발현 수준이 Treg의 억제 활성의 예측이기 때문에, 4C12 또는 아이소타입 대조군 항체로 처치된 후 마우스로부터 분류된 CD25hi 및CD25int Treg의 억제활성을 비교했다(도 9b 및 도 6f). CD25hi 및CD25int Treg이증식 검정에서 모두 고도 억제성이기 때문에, 억제 활성은 CD25 발현의 수준에 의존하지 않았다(도 6f). 흥미롭게도, 4C12-확장된 CD25int Treg는 IgG-처치된 마우스로부터의 CD25int Treg에 비해 약간 더 큰 억제 활성을 가졌다(도 6f, 막대 3-4). 이런 발견은 IgG-처치된 Treg에 비해 4C12-확장된 Treg의 증가된 억제 활성(도 6a 내지 6d)이 CD25int 세포의 활성에 적어도 부분적으로 기여할 수 있다.
논의:
TNF 수용체 상과의 멤버는 면역 주효 세포 반응의 중용한 공동 자극자 및 아팝토시스의 유도자로서 고려되었다. 본원에서, TNFR25는 T 조절 세포의 조절자로서 기능하는 신규한 비-중복자로서 식별되었다. TNFR25는 이들의 억제 활성을 동시에 부분적으로 저지하면서 면역 적격 마우스에서 생체 내 로버스트(robust) Treg 확장을 매개한다. 다른 TNFR-과 멤버를 포함하여 다른 생리학적 신호는 Treg 상에서 유사한 활성을 행사하는 것으로 보고된 바가 없다. 나아가, TNFR25 신호가 Treg을 선택적으로 확장하기 위한 다른 보고된 시약(IL-2/항-IL-2 항체 복합체)에만 유사한 규모 및 동역학을 갖는 Treg 확장을 유도하는 것으로 관찰되었으며(Boyman, O., 등, 2006. Science 311:1924-1927), 이는 TNFR25 작용자가 인간에 치료적 사용을 위하여 IL-2 기반 치료법 대신에 전환가능성을 제공할 수 있다고 지시한다.
이론에 의해 결합될 것을 소원하지 않고, TNFR25 및 TL1A 수용체: 리간드 쌍은 다양한 질병 모델에서 병원성 염증의 생성에 연루된다. 지금까지는, 건강을 유지하거나 질병을 예방하는데에 TNFR25 또는 TL1A에 대한 역할을 식별하는 하나의 보고서도 존재하지 않았으며, 이는 이러한 역할이 발견을 회피해왔다는 것을 지시한다. TNFR25 작용자 항체, 4C12의 유효성은 TNFR25 신호, 염증성 신호 및 외인성 항원의 일시적인 유효성이 독립적으로 제어될 수 있는 세팅에서 다양한 T-세포 서브세트 상에서 TNFR25의 연구를 최초로 가능하게 했다. 알레르기성 폐 염증에서 TNFR25 확장 Treg에 대한 보호 역할의 식별은 알레르기성 폐 염증의 악화에서 TL1A의 영향에 대한 이전의 연구와 모순되지 않으며, 그 이유는 TNFR25 신호에 대한 최근 연구는 항원노출을 선행하지만 TNFR25에 신호에 대한 이전의 연구는 항원 도전을 따르기 때문이다. Tconv에 비해(낮은 발현) Treg에 의한 TNFR25의 발현(높은 발현)의 차이는 항원, 공동 자극 신호 또는 TL1A에 대한 T 세포의 노출의 순서가 특정 면역 반응이 Treg에 의해 억제되거나 Tconv에 의해 유도되는지 여부를 좌우할 수 있다는 것을 지시한다. 최근 연구에서, 기도 항원 도전 이전에 TNFR25 작용자에 의한 처치는 기도 내에서 Treg의 바람직한 축적을 유도했지만 Tconv에서는 그러하지 않았고, IL-4, IL-5 및 IL-13의 생산의 감소뿐만 아니라 기관지 치경 공간에서 감소된 호산구 및 점액 생산과 관련되었다.
MHC II 및 IL-2 신호는 TNFR25 유도 Treg 억제에 필요했지만, CD80/86 공동 자극에는 필요하지 않았다. MHC II 및 IL-2 신호가 TNFR25 유도 Treg 증식에 요구됨에도 불구하고, TCR 및 IL-2 신호의 제공은 시험관 내에서 Treg의 증식을 유도하기에 충분하지 않으며, 이는 추가적인 신호가 추가적인 조사에서 요구될 수 있다는 것을 지시한다. MHC II에 대한 필요성은 TNFR25 유도 Treg 증식에서 Treg-발현 TCR을 강하게 시사함에도 불구하고, 이런 데이터는 간접적이다. 이 과정에서 TCR의 역할에 대한 추가적인 증거로서, TNFR25 촉발이 NFAT 저해자, 시클로스포린-A 또는 FK506의 존재하에서 Treg 증식을 유도할 수 없다는 것을 관찰했으며; 이는 TCR의 하류로의 신호 전달이 Treg 증식에 영향을 미친다는 증거를 제공한다. 이러한 데이터는 Treg 및 Tconv가 TCR 결찰 이후에 TNFR25 신호에 관대해질 수 있고, TNFR25 아고니스트 항체의 Treg-선택성이 비-염증성 질환 하에서 자가-항원의 유효성에 때문에 적어도 부분적일 수 있다는 것을 지시한다. 자가-항원을 갖는 지속적인 TCR 자극이 Tconv에 비해 Treg에서 TNFR25의 증가된 발현에 기여하던지 하지 않던지, 또는 이런 차이가 관련되지 않은 신호 경로에 의해 유지되는지 여부는 알려지지 않았다.
적어도 두 개의 추가적인 수용체 경로(IL-2 수용체 및 TCR)는 TNFR25 촉발된 Treg 증식을 위해 요구되는 것을 고려하면, Treg 증식을 가져오는 이러한 수용체의 하류로의 신호 경로의 합일은 복잡할 수 있다. 이러한 경로가 어떻게 상호작용할 수 있는지에 대한 단서는 생체 밖에서 TNFR25-촉발된 Treg가 IL-2 신호에 대하여 과민성이라흔 관찰에 의해 제공되었다. PI3-키나아제/Akt 경로는 TNFR25 유도된 Treg 증식에 중요한 IL-2 수용체의 하류에서 결합을 제공하는 것으로 실질적으로 결정되었다. 이러한 데이터는 PI3-키나아제/Akt 경로의 PTEN-매개 저해가 IL-2 신호의 하류에서 Treg의 증식을 방해하는 것을 지시한다. MHC II, IL-2R, NFAT 및 Akt의 식별은 Treg 증식에서 끝나는 TNFR25 촉발의 하류에서 신호 발생을 설명하기 위한 감지할 수 있는 시작 지점을 제공하지만, 추가적인 연구는 이러한 다양한 경로들 간의 크로스-토크(cross-talk)의 분자 수준의 기작을 설명하기 위해 수행될 것이다.
TNFR25 유도 Treg 확장은 IAC에 의해 유도된 Treg 확장에 유사한 동역학 및 규모로 발생하지만, CD25hi 세포에 비해 CD25int의 비율이 더 증가한다. 이런 관찰의 중요성은 알려지지 않고; 반면에 IAC에 노출한 후에 Treg에 의한 CD25 발현의 증가는 IL-2의 증가된 유효성에 의해 진행된 양성-피드백 순환을 시사한다. TNFR25 유도된 Treg 확장의 경우에서, IL-2의 농도는 조종되지 않고, 따라서 Treg을 증식함에 따른 CD25 발현의 감소 결과는 확장하는 Treg 집단으로부터 내생 IL-2에 대한 경쟁의 증가로부터 기인할 수 있다. 비록 GITR을 포함하여 일부가 CD25int 및 CD25hi 집단 사이에서 변동을 거듭하지만, 다른 Treg 발현 표면 표지의 의문은 TNFR25 및 IAC 확장 Treg간의 약간의 차이를 드러낸다. 4C12 처치 후 지속적으로 증가된 분석된 표지는 CD103 뿐이며, 이는 조직 내에서 Treg의 지속시간에 기여한다.
데이터는 조직 염증의 유도 및 용해 둘 모두에서 TL1A:TNFR25 상호작용의 역할에 대한 통일된 이론에 Treg 억제 활성의 저해를 갖는 염증 반응의 유도에서 TNFR25 자극의 역할을 보고하는 최근 데이터를 보완한다. Treg의 증식 및 억제 활성의 저해 둘 모두를 유도하는 TNFR25 자극에 의한 정확한 기작은 여전히 불명확하며, 어느 정도는 TNFR25 신호에 의해 활성화된 신호 경로 때문이라고 잘 이해되지 않고, 추가적인 조사하에 있다. 게다가, 생체 내에서 Treg의 TNFR25-유도 확장이 자가-항원의 인식에 의존하며, IAC에 유사하게, 시험관 내에서 TNFR25 유도 Treg 확장에 필수적인 조건은 여전히 불명확하고 추가적인 조사하에 있다. 이론에 의해 결합될 것을 소원하지 않으며, TNFR25 유도 Treg 증식을 허용하기 위해 생체 내에서 MHC II의 필요성의 식별은 TCR 참여가 TNFR25 유도 T 세포 공동 자극을 위해 일반적으로 필요하고, 외인성 항원의 부존재 하에서 TNFR25의 Treg 선택성이 Treg에 의한 바람직한 발현 및 MHC II에 의해 나타난 자가-항원의 유효성 둘 모두에 의해 유지된다는 것을 지시한다고 가정된다. 비-면역화된 마우스에 대하여 면역화된 마우스와 관련하여 TNFR25 자극에 대한 Treg의 증가된 민감성은 또한 흥미롭고, 2차 면역 반응에 대하여 1차 면역반응에서 TNFR25에 대한 구분되는 기능을 지시할 수 있다.
기작에 상관없이, 많은 염증성 질병(천식, IBD, EAE, RA)의 진행의 발생에 대한 TNFR25 신호의 중요성 때문에, TNFR25 신호가 다양한 CD4+ T 세포 서스세트 상에 가해지는 시-공간적 역할을 이해하는데에 중요하다. 이는 OX40과 유사하게, 일시적인 TNFR25 신호의 맥락은 염증 또는 조절 면역을 다르게 안내할 수 있을 소지가 다분하다. CD4+FoxP3+ 천연 조절 T 세포를 신속히 확장하고 일시적으로 저해하는 TNFR25 신호의 특별한 능력은 자가면역 질병, 만성 감염, 이식 및 암의 치료에 있어서 중요한 결과를 가질 수 있다.
실시예 2: TNFRSF25에 의한 생체 내 치료적 Treg 확장은 이소성 심장 이식 모델에서 동종 이계 심장의 급성 거부반응을 늦춘다.
4C12 확장된 천연 Treg에 의한 내성 유도에 대한 연구를 위해서, 내성 연구를 잘 설명하는 종속 심장 이식 모델을 선택했다. CBA/J 마우스(H2d)로부터의 심장을 0일째에 C57BL/6 마우스(H2b)의 복부 안에 이식했다. -4일째에, 마우스중 하나의 군을 TNFRSF25 아고니스트 항체, 클론 4C12로 복강 내 주사로(20 μg/마우스) 처치했으며, 이와 동시에 나머지를 햄스터 IgG 아이소타입 대조군 항체로 처치했다. 이식하는 시점에, 혈액 내에서 Treg 확장을 4C12 처치된 군에서 확인했다. 동종이식편 생존을 수동적으로 심장을 촉진함으로써 모니터링했고, 맥박을 0 내지 4로 매겼다(0 = 맥박 없음; 1 = 매우 약한 맥박; 2 = 약한 맥박; 3 = 중간 정도의 맥박; 4 = 강한 맥박). 거부반응은 감지할 수 있는 심장 박동의 중단으로서 정의된다. 거부반응 시점에(= 심장박동이 멈춘시점), 이식편을 제거했고, 포르말린으로 고정하고 병리학적 검사를 했다. 이식 후 48시간 내에 이식편 기능의 손실은 기술적인 실패로 가정되고(< 5%), 추가적인 분석을 생략했다.
실시예 3: TNFRSF25 작용자에 의한 생체 내 치료적 Treg 확장은 덱스트란-소듐 설페이트로 유도된 대장염인 크론씨병의 마우스 모델을 예방한다.
C57BL/6 마우스 또는 TL1A가 녹아웃된 마우스를 7일 동안 임의로 식용수에 용해된 3% 덱스트란 소듐 설페이드(DSS)와 함께 제공했다. 무게를 DSS의 제공 4일 전부터(실험일 -4) 매일 모니터링했다. -4일째에, 마우스 중 하나의 군을 TNFRSF25 아고니스트 항체인 클론 4C12로 복강 내 주사((20 μg/마우스) 처치했으며, 이와 동시에 나머지를 햄스터 IgG 아이소타입 대조군 항체로 처치했다. 동물이 최초 체중의 20%이상을 손실했을 경우에 치사율을 측정했다(도 10a). 일부 실험에서, 동물을 실험일 5일째에 죽였고, RNeasy miniprep 키트(Qiagen)를 사용하여 급속 냉동, PBS-세척된, 결장 조직으로부터 총 RNA를 준비했다. 그 뒤에, RNA를 역전사했고(Quantitect RT, Qiagen), 지시 전사를 위한 Taqman(Applied Biostystem) 탐침을 사용하여 실시간 PCR에 의해 cDNA를 증폭했다(도 10b). 데이터는 C57BL/6 대조군 마우스에 비해 TL1A 녹아웃된 마우스에서 발현에 대하여 배수 변화로 보여진다. 체중 손실 비율을 모니터링했고, 각각의 실험 군에 대하여 연구 진행 동안에 표시했다(도 10c). RNA 단리를 위해 실험 5일째에 동물을 죽이는 실험에서, 유세포 분석에 의해 전사 인자 FoxP3, 조절 T 세포 풀의 지시자를 발현하는 CD4+ 세포의 비율에 대한 분석을 위해 장간막림프절을 단리했다(도 10d). 마지막으로, 도 10b로 설명되는 지시된 처치 군으로부터 단리된 RNA를 사용하고 지시된 전사를 위한 RT-PCR에 투입하여 역전사를 수행했다. 오차 막대는 실험당 3 이상의 평균±S.E.M.을 지시하고, 패널 당 최소 2번의 실험을 진행했다.
이러한 데이터는 TNFRSF25 아고니스트 항체를 사용한 기처치가 소화관 내에서 FoxP3+ 조절 세포의 확장을 가져온다는 것을 증명하며, 이는 체중 손실 및 결장 내의 치명적인 염증을 예방하고, 결장 조직 내에 IL-1 베타 및 IL-6를 포함하는 염증성 시토킨의 발현을 예방한다. 종합적으로, 이러한 데이터는 TNFRSF25의 자극이 인간의 크론씨병의 염증 특징을 모방하기 위해 일반적으로 사용된 마우스 모델에서 치명적인 소화관 염증을 예방할 수 있다.
본 발명이 하나 이상의 실시와 관련하여 도해되고 설명되지만, 동등한 변경 및 수정은 본원 및 첨부된 도면을 읽고 이해함에 따라 당해 분야의 다른 기술자에게 이루어질 것이다. 게다가, 본 발명의 구체적인 특징은 몇몇의 실시 중 오직 하나에 관해서 개시될 수 있지만, 이러한 특징은 임의의 주어진 또는 특정 응용을 위해 요구되고 유리할 수 있는 다른 실시들 중 하나 이상의 다른 특징과 결합될 수 있다.
본원의 요약은 독자가 기술 문헌의 본질을 빠르게 알아낼 수 있도록 할 것이다. 이는 이해를 위해 제출되는 것이며, 이어지는 청구항의 범위 또는 의미를 설명하거나 제한하기 위해 사용되는 것을 아니다.

Claims (9)

  1. 종양 괴사 인자 수용체 상과 멤버 25(TNFRSF25) 작용자를 포함하는, 피험자 내에 이식된 동종 이식편의 거부반응을 늦추기 위한 약학 조성물로서,
    상기 작용자는 항-TNFRSF25 아고니스트 항체 및 가용성 형태의 TL1A로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 조성물은 투여 후 4일 이내에 조절 T 세포(Treg) 증식을 총 CD4+ 세포의 30-35%로 확장시키기에 충분한 양으로, 피험자가 이식된 동종 이식편을 수용하기 전에, 피험자에게 투여되는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 항-TNFRSF25 아고니스트 항체는 TNFRSF25에 특이적으로 결합하는 항체인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  3. 제 2항에 있어서, 항체는 단일클론항체인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  4. 제 3항에 있어서, 단일클론항체는 IgG 아이소타입인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 가용성 형태의 TL1A는 TL1A-Ig 융합 단백질인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 주사 투여용인 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서, 조성물은 피험자 내에 이식된 동종 이식편의 급성 거부반응을 늦추기 위한 것임을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 조성물은 투여 후 4일 이내에 흉선 유도성 천연 조절 T 세포(nTreg)의 빈도를 총 CD4+ 세포에 대하여 3-4배 증가시키기에 충분한 양의 TNFRSF25 작용자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
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Families Citing this family (95)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100702699B1 (ko) * 2000-06-13 2007-04-02 삼성전자주식회사 수직 블랭킹 및 스포트 제거 결합 회로
JP4797290B2 (ja) * 2001-07-12 2011-10-19 株式会社サタケ 粉砕ロール装置
KR100705066B1 (ko) * 2004-08-09 2007-04-06 엘지전자 주식회사 전기 오븐 레인지의 이중 바닥 고정 구조
KR100740140B1 (ko) * 2004-08-12 2007-07-16 이기수 스팽글 제조용 컷팅장치
KR100766017B1 (ko) * 2004-09-23 2007-10-10 유계춘 스티로폴 관
DE102004047293A1 (de) * 2004-09-29 2006-04-13 Trw Automotive Electronics & Components Gmbh & Co. Kg Druckschalter mit Schutz der Membran gegen Überdehnung
TWI275484B (en) * 2004-10-15 2007-03-11 Bobst Sa Method and station for unblanked sheet delivery in a machine processing plate elements
KR100704734B1 (ko) * 2004-11-02 2007-04-06 주식회사 제철세라믹 엘리베이터용 균형추
KR100722052B1 (ko) * 2004-11-05 2007-05-25 엘지전자 주식회사 얼음저장용기 결합구조
KR100729382B1 (ko) * 2004-12-30 2007-06-15 김진만 발받침대를 구비한 자동차용 매트
KR100727557B1 (ko) * 2005-03-14 2007-06-14 현대자동차주식회사 칩 브레이커가 구비된 실린더 헤드
KR100749763B1 (ko) * 2005-03-17 2007-08-17 삼성전자주식회사 급수호스 연결장치
KR100748521B1 (ko) * 2005-03-17 2007-08-13 엘지전자 주식회사 정수필터를 구비한 냉장고
KR100742346B1 (ko) * 2005-05-03 2007-07-25 삼성전자주식회사 직류 전원 전환 장치
KR100703181B1 (ko) * 2005-08-17 2007-04-06 엘지이노텍 주식회사 멀티 출력전압 전원장치
ES2611307T3 (es) 2005-08-30 2017-05-08 University Of Miami Inmunomodulación de agonistas, antagonistas e inmunotoxinas del receptor del factor de necrosis tumoral 25 (TNFR25)
KR100703667B1 (ko) * 2005-09-06 2007-04-06 엘지전자 주식회사 밀폐형 압축기의 작동유체 과열방지장치
KR100772727B1 (ko) * 2005-09-23 2007-11-02 차용훈 용접 대상물 지지장치
KR100702333B1 (ko) * 2005-11-03 2007-04-06 박지영 고추 꼭지 제거장치
KR100777164B1 (ko) * 2005-12-27 2007-11-29 한국건설기술연구원 하천정화시설의 유입구 개폐장치
KR100759202B1 (ko) * 2005-12-30 2007-09-14 유영옥 보조위생깔개
KR100756277B1 (ko) * 2006-01-18 2007-09-07 백남일 버클
KR100750577B1 (ko) * 2006-01-24 2007-08-21 강성일 다층 구조의 고효율 멤브레인 산기관
KR100779035B1 (ko) * 2006-02-15 2007-11-23 주식회사 제이리빙 욕조용 에이프런
KR100748612B1 (ko) * 2006-03-08 2007-08-10 강윤범 다기능 휴대용 소화기
KR100719748B1 (ko) * 2006-03-10 2007-05-17 지멘스 오토모티브 주식회사 자동차 시동 장치
KR100712947B1 (ko) * 2006-03-15 2007-05-04 이원모 설치 교체가 용이한 담배꽁초 자동소화파이프
KR100787617B1 (ko) * 2006-03-16 2007-12-21 김성규 수동 분무기
KR100711906B1 (ko) * 2006-04-03 2007-04-27 신중 팬티
KR100702590B1 (ko) * 2006-04-12 2007-04-02 김호남 사무기기용 다용도 테이블
KR100760369B1 (ko) * 2006-05-10 2007-09-20 권오식 편심조정이 필요없는 2줄 이상의 선재 피복장치
KR100708477B1 (ko) * 2006-05-15 2007-04-18 삼성전자주식회사 주파수 보상장치
KR100772603B1 (ko) * 2006-05-16 2007-11-07 주식회사 유성반도체 화재 감지기
KR100768704B1 (ko) * 2006-05-24 2007-10-23 박용자 고주파유도가열을 이용한 온풍장치
KR100723452B1 (ko) * 2006-06-13 2007-05-31 김태수 수영용 보조기구
KR100721327B1 (ko) * 2006-06-23 2007-05-25 주식회사 마이크로필터 정수기 필터 어셈블리
KR100774985B1 (ko) * 2006-06-29 2007-11-09 박길자 차량의 흘러내림 방지용 제어밸브
KR100748427B1 (ko) * 2006-07-05 2007-08-13 김세영 발의 구조 및 보행에 적합한 인체공학적인 신발 밑창
KR100745973B1 (ko) * 2006-07-08 2007-08-08 한원흠 물비누(왁스)가 나오는 다용도 전동솔과 구현 방법
KR100776578B1 (ko) * 2006-07-20 2007-11-15 라병렬 비닐하우스 내의 복수의 터널용 덮개 안내장치
KR100761506B1 (ko) * 2006-07-26 2007-09-27 린나이코리아 주식회사 가스밸브용 베이스플레이트
KR100742390B1 (ko) * 2006-07-28 2007-07-24 이상도 터널형 신발 밑창과 그 제조 방법
KR100760192B1 (ko) * 2006-08-04 2007-09-20 세종산업 주식회사 캐스터 브레이크 장치
KR100730308B1 (ko) * 2006-08-11 2007-06-19 주식회사 빅솔론 출력방향 조절을 위한 네크를 구비하는 디스플레이 장치
KR100757965B1 (ko) * 2006-08-21 2007-09-12 한국오므론전장주식회사 버저 내장형 경보장치
KR100751507B1 (ko) * 2006-08-25 2007-08-23 이창석 회전 가능한 칫솔
KR100749059B1 (ko) * 2006-08-25 2007-08-13 삼성전자주식회사 식기세척기 및 그 제어방법
KR100768169B1 (ko) * 2006-08-30 2007-10-17 위니아만도 주식회사 김치저장고의 응축기 방진구조
KR100737120B1 (ko) * 2006-08-31 2007-07-06 박병인 재료의 혼합 및 균질화장치
KR100766818B1 (ko) * 2006-09-05 2007-10-17 창인건설(주) 분수 구동장치
KR100762278B1 (ko) * 2006-09-05 2007-10-01 한국단자공업 주식회사 백라이트 램프 고정 소켓
KR100754248B1 (ko) * 2006-09-18 2007-09-03 김동현 스팀진공청소기
KR100735844B1 (ko) * 2006-10-16 2007-07-06 김형택 세척 및 청소용구
KR100757038B1 (ko) * 2006-10-23 2007-09-07 김현중 염색약 도포장치
KR100788738B1 (ko) * 2006-11-09 2007-12-26 동서코퍼레이션(주) 조합 분수노즐
KR100759361B1 (ko) * 2006-11-13 2007-09-19 김경완 면취기의 에어 공급 밸브 결합구조
KR100771344B1 (ko) * 2006-11-17 2007-10-29 삼성전기주식회사 초슬림 스핀들모터 조립용 지그조립체
KR100751421B1 (ko) * 2006-12-13 2007-08-23 (주) 그룹원이앤지 형광등 소켓
KR100768529B1 (ko) * 2006-12-27 2007-10-18 주식회사 한국 종합엔지니어링 상수도용 고무 디스크의 변형 방지 기능을 갖는 역지밸브
KR100752766B1 (ko) * 2006-12-29 2007-08-29 송재창 급속 구이부를 갖는 다단 회전식 바베큐 장치
KR100777590B1 (ko) * 2007-01-19 2007-11-28 이준항 떡 제조장치
KR100729443B1 (ko) * 2007-03-02 2007-06-15 정재억 다단 습식집진기
KR100776048B1 (ko) * 2007-05-25 2007-11-16 가아전기(주) 옥외용 배전반의 감전사고 방지장치
KR100781968B1 (ko) * 2007-08-14 2007-12-06 코리아디지탈 주식회사 광경로 길이를 변경할 수 있는 비분산 적외선 가스 농도측정장치
US20110229471A1 (en) 2008-11-26 2011-09-22 Cedars-Sinai Medical Center Methods of determining responsiveness to anti-tnf alpha therapy in inflammatory bowel disease
US11090363B2 (en) 2009-07-10 2021-08-17 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Vasoactive intestinal peptide release from microparticles
WO2011006029A1 (en) 2009-07-10 2011-01-13 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Artificial cell constructs for inducing immunological tolerance
KR102033276B1 (ko) 2009-08-03 2019-10-16 유니버시티 오브 마이애미 T 조절 세포의 생체 내 확장 방법
JP2016504045A (ja) * 2013-01-09 2016-02-12 ザ ユニバーシティー オブ マイアミＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍｉａｍｉ ＴＬ１Ａ−Ｉｇ融合タンパク質を用いる制御性Ｔ細胞の制御のための組成物及び方法
WO2014160883A1 (en) 2013-03-27 2014-10-02 Cedars-Sinai Medical Center Treating fibrosis and inflammation by inhibiting tl1a
EP3022295A4 (en) 2013-07-19 2017-03-01 Cedars-Sinai Medical Center Signature of tl1a (tnfsf15) signaling pathway
CN103592439B (zh) * 2013-09-03 2015-10-21 天津亿美诺生物科技有限公司 人尿路上皮癌特异性抗体及其应用
US10532088B2 (en) 2014-02-27 2020-01-14 Lycera Corporation Adoptive cellular therapy using an agonist of retinoic acid receptor-related orphan receptor gamma and related therapeutic methods
EP3130582B8 (en) * 2014-04-29 2019-01-02 The Catholic University of Korea Industry-Academic Cooperation Foundation Compound having immune disease treatment effect and use thereof
JP6523337B2 (ja) 2014-05-05 2019-05-29 リセラ・コーポレイションＬｙｃｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＲＯＲγのアゴニストとしての使用及び疾患治療のためのベンゼンスルホンアミド及び関連化合物
JP6728061B2 (ja) 2014-05-05 2020-07-22 リセラ・コーポレイションＬｙｃｅｒａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＲＯＲγアゴニストとして用いるテトラヒドロキノリンスルホンアミド及び関連化合物ならびに疾患の治療
CN112029826A (zh) 2014-07-30 2020-12-04 哈佛学院院长及董事 用于测定核酸的系统和方法
US9982057B2 (en) 2014-11-17 2018-05-29 Pelican Therapeutics, Inc. Human TNFRSF25 antibody
US10421751B2 (en) 2015-05-05 2019-09-24 Lycera Corporation Dihydro-2H-benzo[b][1,4]oxazine sulfonamide and related compounds for use as agonists of RORγ and the treatment of disease
WO2016186972A1 (en) * 2015-05-15 2016-11-24 Cedars-Sinai Medical Center Models, methods and compositions for treating inflammatory bowel disease
MX2017016134A (es) 2015-06-11 2018-08-15 Lycera Corp Aril dihidro-2h-benzo[b][1,4]oxazina sulfonamida y compuestos relacionados para uso como agonistas de rory y el tratamiento de enfermedad.
WO2017077715A1 (en) * 2015-11-02 2017-05-11 La Jolla Institute For Allergy & Immunology Method and medicament for treating airway and/or lung diseases
CN118773299A (zh) 2016-03-17 2024-10-15 西达-赛奈医疗中心 通过rnaset2诊断炎性肠病的方法
AU2017278192A1 (en) * 2016-06-09 2018-12-13 Pelican Therapeutics, Inc. Anti-TNFRSF25 antibodies
JP7194104B2 (ja) 2016-10-26 2022-12-21 シーダーズ―シナイ メディカル センター 抗ｔｌ１ａモノクローナル抗体の中和
WO2018218150A1 (en) 2017-05-26 2018-11-29 President And Fellows Of Harvard College Systems and methods for high-throughput image-based screening
EP3450981A1 (en) * 2017-08-28 2019-03-06 Trizell GmbH Btnl8 as a marker for tregs
AU2019226392A1 (en) * 2018-03-01 2020-09-24 Fundación Para La Investigación Biomédica Del Hospital Gregorio Marañón Method for obtaining regulatory T cells derived from thymic tissue and use of said cells as cell immunotherapy in immune system disorders
MA52366A (fr) 2018-04-25 2021-03-03 Prometheus Biosciences Inc Anticorps anti-tl1a optimisés
US20210238551A1 (en) * 2018-08-22 2021-08-05 Osaka University Method for Generating Regulatory T Cells
WO2021041672A1 (en) * 2019-08-30 2021-03-04 Pelican Therapeutics, Inc. Methods of treating cancer using tnfrsf25 antibodies
CA3151319A1 (en) * 2019-09-26 2021-04-01 Matthew M. Seavey Tnfrsf25-mediated treatments of immune diseases and disorders
CN116063517A (zh) 2019-10-24 2023-05-05 普罗米修斯生物科学公司 Tnf样配体1a(tl1a)的人源化抗体及其用途
CN110938632A (zh) * 2020-01-02 2020-03-31 郑州大学 一种特异结合tnf-r1的适配体及其筛选方法和应用
WO2024071039A1 (ja) * 2022-09-26 2024-04-04 レグセル株式会社 キメラ抗原受容体（ｃａｒ）を含む誘導性制御性ｔ細胞

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005018571A2 (en) 2003-08-20 2005-03-03 University Of Miami Compositions and methods for treating inflammatory lung disease
WO2007027751A2 (en) * 2005-08-30 2007-03-08 University Of Miami Immunomodulating tumor necrosis factor receptor 25 (tnfr25) agonists, antagonists and immunotoxins

Family Cites Families (105)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4190495A (en) 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
NZ201418A (en) 1982-07-28 1986-08-08 Barmac Ass Ltd Mineral breaker with centrifugal breaking action
US4737462A (en) 1982-10-19 1988-04-12 Cetus Corporation Structural genes, plasmids and transformed cells for producing cysteine depleted muteins of interferon-β
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
US4654307A (en) 1983-02-17 1987-03-31 The Research Foundation Of State University Of New York Novel bacteria containing a plasmid having a tRNA code
US4518584A (en) 1983-04-15 1985-05-21 Cetus Corporation Human recombinant interleukin-2 muteins
US4745051A (en) 1983-05-27 1988-05-17 The Texas A&M University System Method for producing a recombinant baculovirus expression vector
US5175269A (en) 1984-01-30 1992-12-29 Enzo Diagnostics, Inc. Compound and detectable molecules having an oligo- or polynucleotide with modifiable reactive group
US5118627A (en) 1984-02-27 1992-06-02 Amgen Papova virus construction
US4952496A (en) 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US5212286A (en) 1984-04-19 1993-05-18 Scios Nova Inc. Atrial natriuretic/vasodilator peptide compounds
US4761367A (en) 1984-11-07 1988-08-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vectors suitable for detection of eukaryotic DNA regulatory sequences
US4719179A (en) 1984-11-30 1988-01-12 Pharmacia P-L Biochemicals, Inc. Six base oligonucleotide linkers and methods for their use
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5859208A (en) 1988-07-06 1999-01-12 Fiddes; John C. Human basic fibroblast growth factor analog
US5198343A (en) 1986-08-05 1993-03-30 Transgene, S.A. Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained
US5187153A (en) 1986-11-17 1993-02-16 Scios Nova Inc. Methods of treatment using Alzheimer's amyloid polypeptide derivatives
US5220013A (en) 1986-11-17 1993-06-15 Scios Nova Inc. DNA sequence useful for the detection of Alzheimer's disease
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US5510099A (en) 1987-05-01 1996-04-23 Stratagene Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test DNA sequences
US5229279A (en) 1987-06-29 1993-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Method for producing novel polyester biopolymers
US5223483A (en) 1987-10-22 1993-06-29 Merck & Co., Inc. Cysteine-modified acidic fibroblast growth factor
JP3095168B2 (ja) 1988-02-05 2000-10-03 エル． モリソン，シェリー ドメイン‐変性不変部を有する抗体
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5173403A (en) 1989-02-24 1992-12-22 Oklahoma Medical Research Foundation Thermostable acid protease from sulfolobus acidocaldarius and gene
US5215907A (en) 1989-02-24 1993-06-01 Oklahoma Medical Research Foundation Thermostable acid protease from sulfolobus acidocaldarius
US5242687A (en) 1989-03-15 1993-09-07 Tkb Associates Limited Partnership Method of reducing cellular immune response involving T-cells using CD8-bearing antigen presenting cells
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
JP2833773B2 (ja) 1989-03-31 1998-12-09 三信工業株式会社 船外機
US5244805A (en) 1989-05-17 1993-09-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Baculovirus expression vectors
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5155037A (en) 1989-08-04 1992-10-13 The Texas A&M University System Insect signal sequences useful to improve the efficiency of processing and secretion of foreign genes in insect systems
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5218088A (en) 1989-11-02 1993-06-08 Purdue Research Foundation Process for preparing dithiophosphate oligonucleotide analogs via nucleoside thiophosphoramidite intermediates
CA2076975A1 (en) 1990-02-28 1991-08-29 Kevin W. Moore Mammalian expression vectors
US5212058A (en) 1990-05-09 1993-05-18 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acid encoding ubiquitin-specific proteases
US5122463A (en) 1990-05-17 1992-06-16 Massachusetts Institute Of Technology Methods for trans-destabilization of specific proteins in vivo and dna molecules useful therefor
DE4017595A1 (de) 1990-05-31 1991-12-05 Consortium Elektrochem Ind Maltopentaose produzierende amylasen
US5169784A (en) 1990-09-17 1992-12-08 The Texas A & M University System Baculovirus dual promoter expression vector
US5266317A (en) 1990-10-04 1993-11-30 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Insect-specific paralytic neurotoxin genes for use in biological insect control: methods and compositions
US5462990A (en) 1990-10-15 1995-10-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Multifunctional organic polymers
NZ241954A (en) 1991-03-15 1994-01-26 Amgen Inc Compositions of g-csf for pulmonary administration.
AU659482B2 (en) 1991-06-28 1995-05-18 Massachusetts Institute Of Technology Localized oligonucleotide therapy
US5243041A (en) 1991-08-22 1993-09-07 Fernandez Pol Jose A DNA vector with isolated CDNA gene encoding metallopanstimulin
US5714323A (en) 1991-08-30 1998-02-03 The University Of Medecine And Dentistry Of New Jersey Over expression of single-stranded molecules
DE4140512C1 (ko) 1991-12-09 1993-04-08 A. Raymond & Cie, Grenoble, Fr
US5444149A (en) 1992-05-11 1995-08-22 Duke University Methods and compositions useful in the recognition, binding and expression of ribonucleic acids involved in cell growth, neoplasia and immunoregulation
GB9221220D0 (en) 1992-10-09 1992-11-25 Sandoz Ag Organic componds
US5434065A (en) 1993-05-06 1995-07-18 President And Fellows Of Harvard College In vivo selection of microbial virulence genes
ATE218893T1 (de) 1993-08-12 2002-06-15 Neurotech Sa Biokompatible immunoisolatorische kapseln, die genetisch veränderte zellen enthalten
US5700657A (en) 1993-12-13 1997-12-23 Genzyme Corporation Vectors and vector systems including genes encoding tumor suppressor proteins and producer cells transformed thereby
EP0734389B1 (en) 1993-12-17 2000-03-29 Novartis AG Rapamycin derivatives useful as immunosuppressants
US5362718A (en) 1994-04-18 1994-11-08 American Home Products Corporation Rapamycin hydroxyesters
US5451569A (en) 1994-04-19 1995-09-19 Hong Kong University Of Science And Technology R & D Corporation Limited Pulmonary drug delivery system
IL109558A (en) 1994-05-04 2004-08-31 Yissum Res Dev Co DNA structures Derived from the SV40 virus that include DNA sequences External
EP0770130A1 (en) 1994-07-08 1997-05-02 Schering Corporation METHOD FOR IDENTIFYING NUCLEIC ACIDS ENCODING c-fos PROMOTER ACTIVATING PROTEINS
US20030129189A1 (en) 1994-11-07 2003-07-10 Guo-Liang Yu Tumor necrosis factor-gamma
US7597886B2 (en) 1994-11-07 2009-10-06 Human Genome Sciences, Inc. Tumor necrosis factor-gamma
US5792647A (en) 1995-02-13 1998-08-11 The Johns Hopkins University Bacterial catabolism of chitin
US6254874B1 (en) 1995-04-13 2001-07-03 President And Fellows Of Harvard College Attenuated auxotrophic microorganisms having a combination of non-attenuating mutations and method for making same
CA2223103A1 (en) 1995-06-06 1996-12-12 Isis Pharmaceuticals Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
RU2158267C2 (ru) 1995-06-09 2000-10-27 Новартис Аг Производные рапамицина и фармацевтическая композиция на их основе
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US7357927B2 (en) 1996-03-12 2008-04-15 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
US6713061B1 (en) 1996-03-12 2004-03-30 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
WO1997033904A1 (en) 1996-03-12 1997-09-18 Human Genome Sciences, Inc. Death domain containing receptors
EP0937082A2 (en) 1996-07-12 1999-08-25 Ariad Pharmaceuticals, Inc. Materials and method for treating or preventing pathogenic fungal infection
TW557297B (en) 1997-09-26 2003-10-11 Abbott Lab Rapamycin analogs having immunomodulatory activity, and pharmaceutical compositions containing same
US20020111325A1 (en) 1997-11-03 2002-08-15 Human Genome Sciences, Inc. VEGI, an inhibitor of angiogenesis and tumor growth
CN1174993C (zh) 1997-11-03 2004-11-10 人体基因组科学有限公司 Vegi,一种血管发生和肿瘤生长的抑制剂
KR100743894B1 (ko) 1998-02-27 2007-07-30 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 백신, 면역치료제 및 그의 이용 방법
US7300774B1 (en) 1999-12-09 2007-11-27 The Regents Of The University Of California Multimeric fusion proteins of the TNF superfamily ligands
AU2507700A (en) 1999-01-15 2000-08-01 Biogen, Inc. Antagonists of tweak and of tweak receptor and their use to treat immunological disorders
US20020004041A1 (en) 1999-02-19 2002-01-10 Albert Matthew L. Methods for abrogating a cellular immune response
US6534061B1 (en) 1999-04-12 2003-03-18 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor receptor homologs and nucleic acids encoding the same
EP1178815A4 (en) 1999-04-22 2003-02-05 Human Genome Sciences Inc RECEPTORS CONTAINING A CELL DEATH DOMAIN
US6872718B1 (en) 1999-08-20 2005-03-29 Takeda Chemical Industries, Ltd. Tricyclic dihydrobenzofuran derivatives, process for the preparation thereof and agents
IL147803A0 (en) 1999-08-24 2002-08-14 Ariad Gene Therapeutics Inc 28-epirapalogs
WO2001035995A2 (en) 1999-11-19 2001-05-25 Tittle Thomas V Tr3-specific binding agents and methods for their use
DE19963859A1 (de) 1999-12-30 2001-07-12 Apotech Res & Dev Ltd Bi- oder Oligomer eines Di-, Tri-, Quattro- oder Pentamers von rekombinanten Fusionsproteinen
US6651655B1 (en) 2000-01-18 2003-11-25 Quadrant Technologies Limited Inhaled vaccines
US6652854B2 (en) 2000-08-08 2003-11-25 Immunex Corporation Methods for treating autoimmune and chronic inflammatory conditions using antagonists of CD30 or CD30L
KR100944022B1 (ko) 2000-10-24 2010-02-24 순이찌 시오자와 만성 관절 류머티즘에 관여하는 게놈, 그 진단방법, 그발증 가능성의 판정방법, 이들의 검출용 진단키트 및 만성관절 류머티즘의 치료방법 및 치료약제
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
EP1401870A4 (en) 2001-05-24 2006-04-19 Human Genome Sciences ANTIBODIES AGAINST TUMOR NECROSIS FACTOR DELTA (APRIL)
WO2002100345A2 (en) 2001-06-11 2002-12-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Vaccines, immunotherapeutics and methods of using the same
WO2003000286A1 (fr) 2001-06-22 2003-01-03 Daiichi Suntory Pharma Co., Ltd. Remedes pour maladies eosinophiliques
DE60236212D1 (de) 2001-11-09 2010-06-10 Univ Georgetown Neue isoform des gefässendothelzell wachstumshemmers (vegi)
CA2467242A1 (en) 2001-11-20 2003-05-30 Seattle Genetics, Inc. Treatment of immunological disorders using anti-cd30 antibodies
EP1516054B1 (de) 2002-02-10 2009-12-02 Topotarget Switzerland SA Fusionkonstrukte, enthaltend aktive abschnitte von tnf-liganden
CN1446833A (zh) 2003-02-08 2003-10-08 复旦大学 一种温敏性可降解微凝胶及其制备方法
CA2552891A1 (en) * 2004-01-08 2005-08-04 Regents Of The University Of California Regulatory t cells suppress autoimmunity
US7723454B2 (en) 2004-02-03 2010-05-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Coating of organic fibers with siloxane-carborane polymers
US20090317388A1 (en) 2005-05-25 2009-12-24 Linda Burkly Tl1a in treatment of disease
EP1928916A2 (en) 2005-09-29 2008-06-11 Viral Logic Systems Technology Corp. Immunomodulatory compositions and uses therefor
WO2010042697A1 (en) * 2008-10-08 2010-04-15 University Of Miami Regulation of lymphocytes and uses therefor
WO2010071880A1 (en) 2008-12-19 2010-06-24 University Of Miami Tnfr25 agonists to enhance immune responses to vaccines
KR102033276B1 (ko) 2009-08-03 2019-10-16 유니버시티 오브 마이애미 T 조절 세포의 생체 내 확장 방법
WO2011106707A2 (en) * 2010-02-26 2011-09-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that specifically bind to dr3
CN102453097A (zh) 2010-10-27 2012-05-16 上海科新生物技术股份有限公司 抑制血管新生的融合蛋白vf及药物组合物和应用
JP2014518883A (ja) 2011-05-20 2014-08-07 ガバメント・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ，アズ・リプリゼンテッド・バイ・ザ・セクレタリー，デパートメント・オブ・ヘルス・アンド・ヒューマン・サーヴィシズ Ｔ細胞媒介疾病の病態を改善させるためのｔｌ１ａ−ｄｒ３相互作用の遮断及びその抗体
EP2718457A4 (en) 2011-06-06 2014-12-24 Immungene Inc GENETICALLY MODIFIED FUSION MOLECULES LIGAND TNFSF-ANTIBODY ELEMENT
JP2016504045A (ja) 2013-01-09 2016-02-12 ザ ユニバーシティー オブ マイアミＴｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｏｆ Ｍｉａｍｉ ＴＬ１Ａ−Ｉｇ融合タンパク質を用いる制御性Ｔ細胞の制御のための組成物及び方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005018571A2 (en) 2003-08-20 2005-03-03 University Of Miami Compositions and methods for treating inflammatory lung disease
US20080003221A1 (en) * 2003-08-20 2008-01-03 Podack Eckhard R Compositions and methods for treating inflammatory lung disease
WO2007027751A2 (en) * 2005-08-30 2007-03-08 University Of Miami Immunomodulating tumor necrosis factor receptor 25 (tnfr25) agonists, antagonists and immunotoxins

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