KR102012166B1

KR102012166B1 - 피부 미백용 물질을 스크리닝하는 방법

Info

Publication number: KR102012166B1
Application number: KR1020120131433A
Authority: KR
Inventors: 박녹현; 나용주; 김은혜; 이해광
Original assignee: (주)아모레퍼시픽
Priority date: 2012-11-20
Filing date: 2012-11-20
Publication date: 2019-08-20
Also published as: KR20140064272A

Abstract

본 발명은 피부 미백과 관련된 효능 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 멜라닌 생성 및 이동과 관련된 PGE₂(prostaglandin E₂) 생성의 감소 여부를 TRPM8 유전자 발현량의 측정을 통해 확인하고, 이를 통하여 피부 미백에 효과적인 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

피부 미백용 물질을 스크리닝하는 방법{Method for screening the skin-whitening materials}

사람의 피부색은 혈액내의 적혈구, 카로틴 및 멜라닌에 의해서 복합적으로 결정되나 인종간의 피부색 차이나 기미, 주근깨 등의 과색소증은 멜라닌에 의한 영향이다. 멜라닌 생성에서 핵심적 효소는 티로시나제(tyrosinase)이며, 이것은 티로신을 생고분자 멜라닌으로 전환시키는 반응 케스케이드를 일으킨다. 두 개의 티로시나제-관련단백질(TRP's)은 TRP-1과 TRP-2로 알려져 있는데, 이들 단백질은 티로시나제와 약 40%의 동족관계(homology)를 공유하고 멜라닌 생성 조절 역할 뿐만 아니라 멜라닌 생성에 있어서 촉매 활성도 가진다. 멜라닌은 상기 효소들이 분포하고 있는 멜라노좀(melanosome)이라는 소기관 내에서 생성되고, 멜라닌을 포함하고 있는 멜라노좀은 후에 멜라노사이트의 덴드라이트(dendrite)를 통해 케라티노사이트로 전달된다. 이렇게 케라티노사이트로 전달된 멜라닌이 실제로 피부색을 결정하는 중요한 요소가 된다.

이처럼 멜라닌의 합성과정은 매우 복잡하며, 멜라닌이 합성되는 멜라로사이트 외에도 주위의 케라티노사이트의 영향을 매우 많이 받는다.

피부의 외각인 표피층에 존재하는 멜라닌은 자외선 차단의 역할을 하여 진피 이하의 피부기관을 보호해주는 동시에 피부 생체 내에 생겨난 자유 라디칼 등을 잡아주는 역할을 하여 피부내 단백질과 유전자들을 보호해주는 유용한 역할을 한다. 그러나 내, 외부의 스트레스적 자극에 의해 생겨난 멜라닌은 스트레스가 사라져도 피부 각질화를 통해서 외부로 배출되기 전까지는 없어지지 않는 안정한 물질이다. 또한, 피부에서 자유 라디칼(free radical) 생성이 많아지거나, 염증반응이 있거나 자외선 등을 받게 되면 생체 내에서 티로신(Tyrosine) 혹은 도파(DOPA)를 기질로 하고 티로시나제(Tyrosinase) 등의 효소를 촉매로 하는 중합화 산화과정을 통해 멜라닌 생성은 증가된다. 특히 자외선으로 멜라닌 생성이 증가되어 부분적으로 증가된 멜라닌이 기미 등으로 발전하여 미관상 원하지 않는 결과가 생길 수도 있고 더 심하게는 피부암 등이 유발되어 생명에 위험을 줄 수도 있다.

이러한 이유들로 인하여 멜라닌 합성을 조절할 수 있는 물질을 개발하기 위한 다양한 스크리닝 방법이 이용되고 있으며, 그 대표적인 것으로는 티로시나제 활성법, 멜라노사이트를 이용한 멜라닌 합성 조절물질 스크리닝법 등이 있다.

한편, 최근에는 인간 유전체 연구가 완성단계에 도달함에 따라 피부 미백 메카니즘에서 가장 중요한 역할을 담당하고 있는 타이로시나제 유전자의 프로모터 영역을 제어하여 타이로시나제 단백질의 합성을 제어할 수 있는 저해제나 타이로시나제의 mRNA을 불활성화하는 저해제 등 유전자 레벨에서의 연구결과를 활용하는 방법의 개발이 진행되고 있다.

이에 본 발명자들은 인체 피부에 존재하는 유전자 중 22℃ 이하의 온도에서 활성화하는 TRPM8 유전자가 염증성 색소 침착 유발인자인 PGE₂의 생성과 관계가 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 하였다.

따라서, 본 발명은 TRPM8 유전자를 활성화시킴으로서 궁극적으로 피부 미백에 도움이 되는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 시험 피부 세포에서 발현하는 TRPM8의 수준을 확인하는 단계; 2) 상기 시험 피부세포에 후보 물질을 처리하는 단계; 3) 상기 2) 단계의 세포에서 TRPM8의 수준을 확인하는 단계; 및 4) 상기 1) 단계와 3) 단계의 결과를 비교하는 단계;를 포함하는 피부 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 스크리닝 방법은 피부 온도에 따라서 발현량이 달라지는 TRPM8의 수준을 측정함으로써, 피부 미백에 도움이 되는 효능 물질을 시험관내에서(in vitro) 효과적으로 스크리닝할 수 있으며, 이와 같이 발견한 물질을 이용함으로써 단순히 피부 내 멜라닌의 농도를 낮추는 것뿐만 아니라 피부 온도 자체를 낮추어 피부 열감에 의한 열노화 방지에도 효과적인 제품의 개발에 도움을 줄 수 있다.

도 1은 TRPM8을 활성화시키는 온도와 멘톨을 처리한 경우의 TRPM8 의 발현양을 나타낸 것이다.
도 2는 TRPM8을 활성화 시키는 온도와 멘톨을 처리한 경우의 TRPM8 활성을 Ca의 유입량으로 나타낸 것이다.
도 3 는 22℃와 멘톨을 처리한 세포에 자외선을 처리한 후 PGE₂의 발현양을 나타낸 것이다.
도 4는 UVB를 처리하였을 때 TRPM8의 발현양을 나타낸 것이다.
도 5는 금전초 추출물의 처리 후 TRPM8의 발현양을 나타낸 것이다.
도 6은 금전초 추출물의 처리 후 TRPM8 활성을 나타낸 것이다.
도 7은 금전초 추출물을 처리한 세포에 자외선을 처리한 후 PGE₂의 발현양을 나타낸 것이다.
도 8은 금전초 추출물의 처리 후 멜라닌 생성양을 나타낸 것이다.

본 발명은 피부에 존재하는 TRPM8 유전자의 발현량을 측정함으로써, 피부 미백에 도움이 되는 물질을 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.

기존의 피부 미백 효능 물질은 자외선에 의한 자극으로부터 피부를 보호하고, 자외선의 자극에 의해 멜라노사이트에서 생성된 멜라닌의 양을 감소시키는 것을 목표로 하였다. 그러나 최근에는 생성된 멜라닌을 멜라노사이트에서 표피세포로의 이동을 억제하여 미백 효능을 나타내는 연구가 많이 되고 있다. 이때, 멜라닌의 이동과 관련하여 작용하는 체내 물질이 PGE₂(prostaglandin E₂)이다.

자외선에 의해 피부가 자극을 받게 되면, 케라티노사이트에서 PGE₂의 생성량이 증가하게 되고, 이는 G-단백질 결합 수용체인 EP₁과 EP₃ 수용체를 활성화시키며, 이를 통해 멜라노사이트의 덴드라이트 형성을 자극하게 된다. 이렇게 멜라노사이트의 덴드라이트가 확장하게 되면, 멜라노솜이 덴드라이트 말단으로 운반되어 멜라닌이 표피로 과다 이동하게 되며, 표피에 축적된 멜라닌에 의해 피부색이 어둡게 된다.

한편, 건강한 피부의 온도는 31℃를 전후하지만, 한 여름에는 피부 온도가 43℃까지 상승하며, 특히 여름철에는 피부 멜라닌의 수가 상승하면서 피부 밝기 및 붉은기는 감소하지만, 노란기의 상승으로 피부톤이 어둡고 칙칙한 누런 톤으로 변화하게 된다.

이러한 사실을 바탕으로 하여, 본 발명자들은 피부에 존재하는 유전자 중에서 낮은 온도, 특히 22℃ 이하에서 활성화하는 유전자를 선정하고자 하였으며, TRPM8(transient receptor potential melastatin 8)을 이용가능한 유전자로 선택하였고, TRPM8이 활성화하게 되면, 자외선 자극으로 인하여 발현이 증가된 PGE₂의 수준이 감소하게 됨을 발견하게 되었다.

따라서, TRPM8 유전자가 활성화되면, 염증성 인자이면서 멜라노사이트로부터 멜라닌의 전달을 촉진하는 PGE₂의 생성을 감소시킬 수 있고, 이에 의하여 진피에서 생성된 멜라닌의 표피로의 이동을 억제함으로써 피부색이 어둡게 되는 것을 방지할 수 있다. 따라서, TRPM8 유전자를 활성화시키는 물질을 스크리닝함으로써 피부 미백에 효과적인 물질을 용이하게 찾을 수 있게 된다.

구체적으로, 본 발명은 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하며, 다음과 같은 단계로 이루어져 있다.

1) 시험 피부 세포에서 발현하는 TRPM8의 수준을 확인하는 단계;

2) 상기 시험 피부세포에 후보 물질을 처리하는 단계;

3) 상기 2) 단계의 세포에서 TRPM8의 수준을 확인하는 단계; 및

4) 상기 1) 단계와 3) 단계의 결과를 비교하는 단계.

세포에서 발현하는 TRPM8 수준의 확인은 PCR, 웨스턴 블롯 등 당업계에 공지된 통상적인 실험 방법을 통하여 이루어질 수 있으며, 3) 단계에서 측정한 TRPM8의 수준이 높아서 1) 단계에서 측정한 수준과 차이가 클수록 피부 미백에 효과가 큰 것으로 예측할 수 있다.

또한, 상기 설명한 바와 같이, 후보 물질을 처리한 후 TRPM8의 발현량을 측정함으로써, 피부 내 멜라닌의 농도에 대한 영향을 판단할 수 있으며, 특히 TRPM8 발현량의 증가에 따라 자외선 자극에 의하여 생성된 멜라닌의 양의 감소 및 생성된 멜라닌이 표피로 이동하는 양의 감소 여부를 판단할 수 있다. 또한, 피부 온도 자체를 낮추어 피부의 누런기, 붉은기 등을 감소시킬 수 있는지 여부도 용이하게 판단할 수 있다.

이러한 방법으로 피부 미백과 관련된 효능 물질을 찾아내고, 단순히 피부색 뿐만 아니라 피부 온도를 낮추어 줌으로써 피부 열노화를 방지할 수 있는 차별화된 제품의 개발이 가능하다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 하지만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 사상과 범위 내에서 여러 가지 변형 또는 수정할 수 있다.

[시험예 1] 쿨링에 의한 TRPM8의 발현과 활성 확인

쿨링에 의한 TRPM8의 발현과 활성을 알아보기 위해 다음과 같은 시험을 실시하였다. 이 때, 쿨링 자극은 직접적인 22℃ 온도의 저온 자극과 TRPM8의 작용제(agonist)인 멘톨을 이용하였다.

먼저 TRPM8 발현양을 측정하기 위하여 인간 케라티노사이트를 Epilife® 배지에 HKGS가 첨가된 배지를 이용하여 키운 후, 35mm 접시에 500,000개의 세포를 시딩하였다. 시딩 다음날, 저온에 의한 쿨링 자극을 주기 위하여, 세포를 22℃로 세팅된 배양기에서 30분간 배양한 후 다시 정상 온도인 37℃에서 24시간 배양하였고, 멘톨 자극은 세포를 멘톨 100μM로 24시간 동안 처리한 후 각각의 세포를 수거하였다. 각 세포에 트리졸(Trisol)을 500μl씩 넣고, 세포를 상온에서 5분간 균질화하였다. 각 튜브에 클로로포름을 100μl씩 넣고, 손으로 15초간 흔들어 섞어준 다음, 상온에서 3분간 방치하고, 4℃, 15,000 x g에서 15분간 원심분리하였다. 상층액만 새 튜브로 옮긴 후에 이소프로필 알코올을 250μl씩 넣어준 후 잘 섞은 다음, 상온에서 10분간 방치하고, 4℃, 15,000 x g에서 10분간 원심분리하였다. 펠렛만 남기고 상층액은 모두 버린 다음 75% 알코올을 500μl씩 넣어준 후에 볼텍싱(vortexing)하였다. 이 후, 4℃, 7,500 x g에서 5분간 원심분리를 하고 나서, 펠렛만 남기고 상층액을 조심히 버린 후에 잘 말리고, 탈이온수를 넣어 RNA를 녹인 다음 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 총 RNA 4μg에 올리고 dT(oligo dT)를 2μl 넣고, 70℃에서 10분간 반응시킨 다음에 재빨리 식혔다. DTT, dNTP, 10x RT 버퍼, MgCl₂, RNAase Out을 넣고, 42℃에서 2분 후, Superscript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)를 넣고, 50℃에서 60분간 반응시켰다. 합성된 cDNA를 이용하여 qPCR을 진행하였으며, 이 때 Taqman의 상용 프라이머(Hs00375481_m1; TaqMan® Gene Expression Assays)를 이용하였다. qPCR 결과는 GAPDH를 이용하여 각각의 값을 보정하여 그 결과를 얻었으며, 결과는 도 1에 나타내었다.

한편, TRPM8 활성은 Ca 채널의 활성과 관련이 있으므로, TRPM8 활성을 알아보기 위하여 실험을 통하여 Ca 유입량을 측정하였다. 인간 케라티노사이트를 Epilife® 배지에 HKGS가 첨가된 배지를 이용하여 키운 후, 96웰에 시딩하였다. 다음날 Fluo-4 NW 칼슘 분석 키트(Molecular probe, F36205)를 이용하여 측정하였다. 키트에 포함된 로딩 염색 용액을 세포에 넣어 37℃에서 30분 배양하고, 상온에서 추가적으로 30분간 배양하였다. 염색이 끝난 세포와 측정하고자 하는 물질을 각각 준비하여 FlexStation3(Molecular Device, USA)에 넣고 여기 494nm, 방출 516nm에서 상대 형광값(relative fluorescence unit, RFU)을 측정하였으며, 결과는 도 2에 나타내었다.

도 1 및 도 2를 보면, TRPM8을 활성화시키는 물질 또는 온도를 이용하여 처리할 경우, TRPM8의 발현량이 증가하면서, 이와 함께 TRPM8이 활성화하는 것을 확인할 수 있다.

[시험예 2] TRPM8의 활성이 자외선에 의한 PGE₂에 미치는 영향

TRPM8과 PGE₂의 발현에 있어서 자외선이 미치는 영향을 확인하기 위하여, 시험예 1의 절차에서 세포를 미리 22℃로 세팅된 배양기에서 30분간 배양하거나, 멘톨 100μM로 24시간 동안 전처리한 후에, UVB 20mJ를 조사한 다음 다시 정상 온도인 37℃에서 48시간 배양하였다. 그 후, 배지를 수거하고 GE사의 ELISA 키트(#RPN222)를 이용하여 PGE₂의 수준을 측정하였다. 또한 이때 비교를 위하여, 세포를 저온 자극 또는 멘톨을 이용한 전처리를 하지 않고 UVB를 조사하지 않은 것(대조군), 세포를 저온 자극 또는 멘톨을 이용한 전처리를 하지 않고 UVB 20mJ를 조사한 것, 세포를 저온 자극 전처리한 후 UVB를 조사하지 않은 것, 세포를 멘톨로 전처리한 후 UVB를 조사하지 않은 것에 대한 PGE₂의 수준도 측정하였다. 측정 결과는 도 3에 나타내었다.

또한 이때 UVB에 의한 TRPM8의 발현 변화를 확인하기 위하여 PGE₂의 발현에 대한 영향을 확인한 상기 실험 세트와 동일한 실험세트를 구성하여 자외선 조사 후 37℃에서 24시간 배양한 후에 세포는 수거하여 qPCR을 진행하였으며, 측정 결과는 도 4에 나타내었다.

도 3 및 도 4를 보면, TRPM8을 활성화시키는 물질 또는 온도로 처리를 할 경우 자외선에 의해 증가된 PGE₂가 자외선을 조사하기 이전의 수준으로 감소하는 것을 확인할 수 있으며, 이때 UVB에 의해서는 TRPM8 발현양에 변화가 없는 것을 확인할 수 있다.

[시험예 3] 후보 소재에의 적용(금전초 이용)

TRPM8 발현양을 측정하기 위하여 인간 케라티노사이트를 Epilife® 배지에 HKGS가 첨가된 배지를 이용하여 키운 후, 35mm 접시에 500,000개의 세포를 시딩하였다. 시딩 다음날, 세포를 금전초 추출물 100ppm으로 24시간 동안 전처리한 후에, UVB 20mJ를 조사한 다음 다시 정상 온도인 37℃에서 24시간 배양한 후, 세포를 수거하였다. 세포에 트리졸(Trisol)을 500μl씩 넣고, 세포를 상온에서 5분간 균질화하였다. 각 튜브에 클로로포름을 100μl씩 넣고, 손으로 15초간 흔들어 섞어준 다음, 상온에서 3분간 방치하고, 4℃, 15,000 x g에서 15분간 원심분리하였다. 상층액만 새 튜브로 옮긴 후에 이소프로필 알코올을 250μl씩 넣어준 후 잘 섞은 다음, 상온에서 10분간 방치하고, 4℃, 15,000 x g에서 10분간 원심분리하였다. 펠렛만 남기고 상층액은 모두 버린 다음 75% 알코올을 500μl씩 넣어준 후에 볼텍싱(vortexing)하였다. 이 후, 4℃, 7,500 x g에서 5분간 원심분리를 하고 나서, 펠렛만 남기고 상층액을 조심히 버린 후에 잘 말리고, 탈이온수를 넣어 RNA를 녹인 다음 260nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 총 RNA 4μg에 올리고 dT(oligo dT)를 2μl 넣고, 70℃에서 10분간 반응시킨 다음에 재빨리 식혔다. DTT, dNTP, 10x RT 버퍼, MgCl₂, RNAase Out을 넣고, 42℃에서 2분 후, Superscript III Reverse Transcriptase(Invitrogen)를 넣고, 50℃에서 60분간 반응시켰다. 합성된 cDNA를 이용하여 qPCR을 진행하였으며, 이 때 Taqman의 상용 프라이머(Hs00375481_m1; TaqMan® Gene Expression Assays)를 이용하였다. qPCR 결과는 GAPDH를 이용하여 각각의 값을 보정하여 그 결과를 얻었으며, 결과는 도 5에 나타내었다.

또한, TRPM8 활성을 알아보기 위하여 시험예 1에 기재한 방법과 동일한 방법으로 Ca 유입량을 측정하였으며, 결과는 도 6에 나타내었다.

한편, PGE₂의 수준을 측정하기 위하여, 금전초 추출물로 전처리하고 UVB 20mJ를 조사한 다음 정상 온도인 37℃에서 48시간 배양한 후 배지를 수거하고 GE사의 ELISA 키트(#RPN222)를 이용하였으며, 그 결과는 도 7에 나타내었다.

또한, 이와 함께 금전초 자체의 멜라닌 생성 억제 효능을 다음의 방법으로 확인하였다.

Melan a 세포를 RPMI배지를 이용하여 48웰에 15,000개가 되도록 시딩하였다. 다음날 금전초 추출물 100ppm, 또는 알부틴 50ppm을 처리한 다음 3일을 배양하고, 다시 한번 금전초 추출물 또는 알부틴을 처리한 후에 추가 3일을 더 배양하였다. 배지를 버리고 세포를 PBS로 세척한 후에 1N NaOH를 100μl 넣어 멜라닌을 세포에서 녹여내었다. 세포속에서 녹아나온 멜라닌을 475nm에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 양을 환산하고, 이때 총 단백질량도 함께 측정하여 단백질당 멜라닌 양을 계산하였다. 결과는 도 8에 나타내었다.

도 5및 도 6를 보면, 금전초 추출물에 의해 TRPM8의 발현양이 증가하고 활성화되는 것을 확인할 수 있었다.

또한 도 7을 보면, TRPM8을 활성화시키는 금전초 추출물이 UVB에 의해 증가된 PGE₂를 억제시키는 것을 확인할 수 있다.

또한 도 8을 보면, 금전초 자체가 멜라닌 생성을 억제하는 효능이 있으며, 멜라닌 생성 억제 효능이 TRPM8 유전자의 활성화 정도와 관계가 있음을 확인할 수 있다.

Claims

1) 시험 피부 세포에서 TRPM8의 발현 수준을 확인하는 단계;
2) 상기 시험 피부세포에 후보 물질을 처리하는 단계;
3) 상기 2) 단계의 세포에서 TRPM8의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
4) 상기 1) 단계와 3) 단계의 발현 수준을 비교하여 항노화 및 미백 효능 물질인지 여부를 결정하는 단계;
를 포함하며,
상기 4) 단계에서 상기 3) 단계의 TRPM8 발현 수준이 1) 단계의 TRPM8 발현 수준보다 높은 경우 후보 물질을 항노화 및 미백 효능 물질로 결정하고,
상기 항노화 및 미백 효능 물질은 열노화 및 광노화에 의한 피부 노화를 억제하고, 피부 미백을 개선시키는 것을 특징으로 하는, 항노화 및 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 효능 물질로 결정된 후보 물질이, 이것을 처리한 시험 피부 세포에 자외선을 조사한 다음, 상기 시험 피부 세포 내의 PGE₂ 또는 PEG₂ 및 멜라닌의 생성량을 측정하여, 상기 PGE₂ 또는 PGE₂ 및 멜라닌의 생성을 감소시키는지 여부를 확인하는 단계를 더 포함하는, 항노화 및 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 효능 물질은 자외선 자극에 의하여 생성된 멜라닌의 표피로의 이동을 감소시키는 것인, 항노화 및 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법.

제1항에 있어서, 상기 효능 물질은 피부 온도를 낮추어 피부색을 밝게 해주는 것인, 항노화 및 미백 효능 물질을 스크리닝하는 방법.