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KR101990738B1 - 혈액 뇌관문을 통과할 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

혈액 뇌관문을 통과할 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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KR101990738B1
KR101990738B1 KR1020180086162A KR20180086162A KR101990738B1 KR 101990738 B1 KR101990738 B1 KR 101990738B1 KR 1020180086162 A KR1020180086162 A KR 1020180086162A KR 20180086162 A KR20180086162 A KR 20180086162A KR 101990738 B1 KR101990738 B1 KR 101990738B1
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KR
South Korea
Prior art keywords
compound
lrrk2
protein
brain
lrrk2 protein
Prior art date
Application number
KR1020180086162A
Other languages
English (en)
Inventor
최환근
박종배
고은화
손정범
김남두
이승훈
남도현
Original Assignee
재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단
국립암센터
사회복지법인 삼성생명공익재단
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Publication date
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Abstract

본 발명은 혈액 뇌관문을 통과할 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 뇌의 혈액 뇌관문을 효율적으로 통과하여 LRRK2 단백질을 효과적으로 억제하므로, 뇌암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

혈액 뇌관문을 통과할 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating brain cancer comprising compounds penetrating blood-brain barrier}
본 발명은 혈액 뇌관문을 통과할 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
단백질 키나제는 아데노신삼인산(ATP)의 말단 인산기를 단백질의 특정 잔기인 타이로신, 세린 또는 트레오닌에 전이시키는 반응을 촉매하는 효소로서, 세포 매개체 및 환경의 변화에 대한 세포의 활성이나 성장 및 분화를 조절하는 신호에 관여한다.
부적절하게 높은 단백질 키나제 활성은 비정상적인 세포의 작용으로부터 기인하는 다수의 질병과 직접적 또는 간접적으로 연관이 있다. 예를 들면, 돌연변이, 과잉-발현 또는 부적절한 효소 활성에 관련된 키나제의 적절한 조절 메카니즘의 실패나, 사이토카인, 키나제의 업스트림 또는 다운스트림의 신호 전달에 참여하는 인자들의 과잉생성 또는 결핍에 의해 질병이 야기될 수 있다. 따라서, 키나제 활성의 선택적인 억제는 질병 치료를 위한 신약 개발의 유익한 표적이 될 수 있다.
LRRK2(leucin-rich repeat kinase-2) 단백질은 류신 풍부 반복 키나제 집단(leucin-rich repeat kinase family)에 속하는 단백질이며, 종간 유사성이 높은 2527개의 아미노산 배열로 구성되어 있다. LRRK2 단백질은 하나의 단백질 안에 GTP 가수분해효소(GTPase)와 세린-트레오닌 키나제(Serine-threonine kinase) 활성을 모두 갖는 특징이 있다. 발현된 LRRK2 단백질은 뇌를 포함한 다양한 기관과 조직에서 관찰되고 있으며, 세포수준에서는 세포질 또는 세포막 및 미토콘드리아 외막에서 존재한다.
또한, LRRK2 단백질은 기능상 중요한 5개의 도메인(domain)을 가지고 있어, 자가 인산화 작용(Autophosphorylation)에 의한 자가활성조절작용과 단백질 상호작용 및 효소작용을 통해 세포의 기능을 조절할 것으로 예상된다. 특히, 샤페론 기전(chaperone machinery), 세포골격 배열(cytoskelecton arrangement), 단백질번역기전(protein translational machinery), 시냅스 소포의 세포 내 유입(synaptic vesicle endocytosis), 미토젠-활성화 단백질 키나제 신호 전달과정(mitogen-activated protein kinases signaling cascades) 및 유비퀴틴/오토파지단백질 분해과정(ubiquitin/autophage protein degradation pathways) 등이 LRRK2 단백질에 의해 조절되는 것으로 알려졌다.
LRRK2 단백질은 알츠하이머병과 관련된 경도인지 손상의 전가, L-도파(Dopa) 유도된 운동 이상증, 및 뉴런 전구 분화와 관련된 CNS 장애와 관련됨이 보고되었다. 또한, LRRK2 단백질의 G2019S 돌연변이는 급성 골수성 백혈병(AML)뿐만 아니라, 신장암, 유방암, 폐암, 전립선암 등과 같은 비-피부 암의 발생을 증가시키는 것이 보고되었다. 구체적으로, LRRK2 단백질의 G2019S 돌연변이는 LRRK2 키나제 도메인의 촉매 활성을 증가시킨다. 나아가, LRRK2 단백질은 근위축성 측삭 경화증, 류마티스 관절염 및 강직 척추염과도 관련된 것이 보고되어 있다(국제공개특허 WO 2011/038572).
한편, 뇌종양의 치료방법으로는 외과적 수술, 방사선 치료, 항암약물요법(화학요법), 호르몬 요법 등이 있다. 그 중에서 주로 외과적 수술과 방사선 치료에 의존해 왔으나, 특히 방사선 치료는 신경 독성과 치매 등 부작용이 동반되는 문제가 있다. 따라서, 이와 같은 문제점을 해소하기 위하여 항암 약물요법(화학요법)이 주목받고 있으나, 뇌종양의 치료를 위한 약물요법은 '혈액 뇌관문(Blood-brain barrier, BBB)'이라는 특수보호체계에 막혀 뇌까지 전달될 수 없는 약물이 다수이고, 항암제에 대한 암의 저항성 등으로 인해 제한적이다.
한편, 본 발명자는 LRRK2 단백질의 저해제로 사용되는 화합물이 혈액 뇌관문(BBB)을 효율적으로 통과하여 뇌암의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 in vivo 실험을 통해 최초로 규명하고 본 발명을 완성하였다.
국제공개특허 WO 2011/038572
본 발명의 목적은 혈액 뇌관문을 효율적으로 통과하여 뇌암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 LRRK2 단백질 저해제를 유효성분으로 함유하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 약제학적으로 치료가능한 양의 LRRK2 단백질 저해제를 유효성분으로 함유하는 제1성분; 및 약제학적으로 치료가능한 양의 아바스틴을 유효성분으로 함유하는 제2성분을 포함하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 LRRK2 단백질 저해제를 유효성분으로 함유하며, 일반적인 약물이 통과하기 어려운 혈액 뇌관문을 용이하게 통과하여 종양 형성을 현저히 억제하는 효과가 있다.
도 1은 뇌종양 환자로부터 수득된 암 조직에서 LRRK2 단백질이 발현되는 것을 Western Blot으로 확인한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 2는 LRRK2 단백질에 대한 인산화와 뇌종양의 악성도와의 상관관계를 확인한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 3은 뇌종양 세포에서 발현된 LRRK2 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 분석한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 4는 LRRK2 단백질을 발현하는 렌티바이러스 벡터(A)로 감염된 세포에서 LRRK2 단백질의 과발현(B) 및 종양세포의 자기복제능(C)을 확인한 이미지이다.
도 5 및 6은 실시예 10, 11, 12, 20, 21 및 22 화합물을 뇌종양 환자 유래 세포주인 NCC01 세포에 처리하였을 경우 확인되는 Western Blot 평가 결과를 나타내는 이미지이다.
도 7 및 8은 뇌종양 환자 유래 세포주인 NCC01 세포에 실시예 10의 화합물을 다양한 농도로 처리하였을 경우 확인되는 Western Blot 평가 결과를 나타내는 이미지이다.
도 9 및 10은 뇌종양 환자 유래 세포주인 NCC01 세포에 실시예 12의 화합물을 다양한 농도로 처리하였을 경우 확인되는 Western Blot 평가 결과를 나타내는 이미지이다.
도 11 및 12는 뇌종양 환자 유래 세포주인 NCC01 세포에 실시예 12의 화합물을 100 nM 농도로 처리하고, 시간이 경과함에 따라 확인되는 Western Blot 평가 결과를 나타내는 이미지이다.
도 13 내지 15는 NCC01 세포에 실시예 12의 화합물을 50 nM 내지 2,000 nM의 농도 범위로 처리하고 1일이 경과한 후 확인되는 Western Blot 평가 결과를 나타내는 이미지이다.
도 16은 실시예 12의 화합물이 미토콘드리아의 활성을 억제함으로써 뇌종양 세포의 사멸을 유도함을 확인한 이미지이다.
도 17은 실시예 12의 화합물이 뇌종양 줄기세포에 존재하는 미토콘드리아의 활성을 억제하는 것을 확인한 이미지이다.
도 18은 실시예 12의 화합물 TRAP1 단백질의 발현을 억제함으로써 미토콘드리아의 할성을 억제함을 확인한 이미지이다.
도 19는 저산소 조건에 노출된 NCC01(A 및 B) 및 528NS(C 및 D) 세포주로부터 형성된 구의 성장이 LRRK2 유전자에 대한 shRNA에 의해 억제되는 것을 확인한 이미지이다.
도 20 및 21은 NCC01 세포에 실시예 11, 12 및 21 화합물을 각각 100 nM의 농도로 처리하고 1일이 경과한 후 확인되는 cell cycle FACS 평가 결과를 나타내는 이미지이다.
도 22는 뇌종양이 유도된 마우스 모델에 대하여 실시예 12 화합물을 경구투여하였을 때 생존일 변화를 관찰한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 23는 뇌종양이 유도된 마우스 모델에 대하여 실시예 12 화합물을 경구투여하였을 때 종양 크기의 변화를 측정한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 24는 실시예 12의 화합물을 아바스틴과 병용처리하였을 때, 뇌종양 치료 효과가 증가하는 것을 확인한 이미지이다.
도 25는 뇌종양 환자 유래 세포주인 NCC01 세포에 비교예 화합물을 처리하였을 경우 확인되는 Western Blot 평가 결과를 나타내는 이미지이다.
도 26은 실시예 10, 11, 12, 20 및 21 화합물을 뇌종양 환자 유래 세포주인 448T 세포에 처리하였을 경우 확인되는 Western Blot 평가 결과를 나타내는 이미지이다.
도 27은 뇌종양 환자 유래 세포주인 448T 세포에 실시예 12의 화합물을 다양한 농도로 처리하였을 경우 확인되는 Western Blot 평가 결과를 나타내는 이미지이다.
도 28은 뇌종양이 유도된 마우스 모델에 대하여 실시예 12, 20 및 21 화합물을 경구투여하였을 때 생존일 변화를 관찰한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 29는 뇌종양 환자 유래 세포주인 448T 세포에 비교예 화합물과 실시예 1, 11 및 12의 화합물을 처리하였을 경우 확인되는 Western Blot 평가 결과를 나타내는 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 LRRK2(Leucine Rich Repeat Kinase 2) 단백질 저해제를 유효성분으로 함유하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
하나의 일례로, 상기 LRRK2 단백질 저해제는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112018501325784-pat00001
상기 화학식 1에서,
R1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬아미노, 또는 디C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬아미노이고;
R2는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1-10의 직쇄 또는 측쇄 알킬이거나, R3와 함께 연결되어 N을 하나 이상 포함하는 비치환, 치환 또는 융합된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 각환의 헤테로아릴을 형성하고,
여기서, 상기 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬 및 치환된 5 내지 6 각환의 헤테로아릴은 독립적으로 -OH, =O, 할로겐 및 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬 및 5 내지 6 각환의 헤테로아릴이고,
여기서, 상기 융합된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬은 비치환된 C6-10의 아릴이 융합된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이고;
R3는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬아미노, 디C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬아미노, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬설포닐 C6-10 아릴아미노, 또는 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬설포닐아미노 C6-10 아릴아미노이거나, R2와 함께 연결되어 N을 하나 이상 포함하는 비치환, 치환 또는 융합된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬을 형성하고,
여기서, 상기 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 -OH, =O, 할로겐 및 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이고,
여기서, 상기 융합된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬은 비치환된 C6-10의 아릴이 융합된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이고;
Y는
Figure 112018501325784-pat00002
또는
Figure 112018501325784-pat00003
이고,
상기 R4, R5 및 R6은 독립적으로 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-10의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬, N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬카보닐이고,
여기서, 상기 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬은 디C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬아미노 또는 하나 이상의 N을 포함하며 하나 이상의 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬이 치환된 6 각환의 헤테로사이클로알킬이 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이고,
상기 R7, R8 및 R9는 독립적으로 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, 비치환 또는 하나 이상의 하이드록시가 치환된 C1-10의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로 원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이고,
여기서, 상기 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬은 -OH, =O, 할로겐 및 O를 하나 포함하는 4 내지 5 각환의 비치환된 헤테로사이클로알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이다.
바람직하게,
R1은 -H, 또는 -NH(CH3)이고;
R2는 -H, 할로겐, 또는 -CF3이거나, R3와 함께 연결되어
Figure 112018501325784-pat00004
를 형성하고;
R3는 -H, -NH(CH3), -NH(CH2CH3),
Figure 112018501325784-pat00005
, 또는
Figure 112018501325784-pat00006
이거나, R2와 함께 연결되어
Figure 112018501325784-pat00007
또는
Figure 112018501325784-pat00008
를 형성하고;
Y는
Figure 112018501325784-pat00009
또는
Figure 112018501325784-pat00010
이고,
상기 R4, R5 및 R6은 독립적으로 -H, 메톡시, 할로겐,
Figure 112018501325784-pat00011
,
Figure 112018501325784-pat00012
,
Figure 112018501325784-pat00013
또는
Figure 112018501325784-pat00014
이고,
상기 R7, R8 및 R9는 독립적으로 -H, 메틸, 할로겐,
Figure 112018501325784-pat00015
또는
Figure 112018501325784-pat00016
이다.
더욱 바람직하게, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다:
(1) 5-클로로-N4-(2-(이소프로필설포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민;
(2) N-(2-(2-(3-클로로-4-메톡시페닐아미노)-5-플루오로피리미딘-4-일아미노)페닐)메탄설폰아미드;
(6) (4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)(3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)메타논;
(8) N4-에틸-N2-(1-(3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-3-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민;
(10) 2-[(2-메톡시-4-[[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카보닐]페닐)아미노]-5,11-디메틸-5,11-디하이드로-6H-피리미도[4,5-b][1,4]벤조디아제핀-6-온;
(11) (4-(4-(에틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-2-플루오로-5-메톡시페닐)(모폴리노)메타논;
(12) (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논;
(14) 1-(5-클로로-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-1H-피라졸-1-일)-2-메틸프로판-2-올; 및
(16) N2-(5-클로로-1-((3S,4R)-3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)-N4-메틸-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민.
다른 일례로, 상기 LRRK2 단백질 저해제는 하기 화학식 2로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
[화학식 2]
Figure 112018501325784-pat00017
상기 화학식 2에서,
L1 및 L2는 독립적으로 -O-, -CH2-, -NH-, 또는 -S-이고;
A1은 비치환 또는 치환된 C3-10의 사이클로알킬이고, 여기서, 상기 치환된 C3-10의 사이클로알킬은 -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬 및 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환된 C3-10의 사이클로알킬이고;
A2는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 6 각환의 헤테로아릴이고, 여기서, 상기 치환된 5 내지 6 각환의 헤테로아릴은 -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬 및 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환된 5 내지 6 각환의 헤테로아릴이고;
A3, A4 및 A5는 독립적으로 -H, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬 또는 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이다.
바람직하게, L1 및 L2는 독립적으로 -CH2-, -NH-, 또는 -S-이고;
A1은
Figure 112018501325784-pat00018
또는
Figure 112018501325784-pat00019
이고;
A2는
Figure 112018501325784-pat00020
이고;
A3, A4 및 A5는 독립적으로 -H 또는 메틸이다.
더욱 바람직하게, 상기 화학식 2로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다:
(7) (S)-3-(사이클로프로필티오)-7-메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로티에노[3,4-c]피리딘-4(5H)-온; 및
(9) 3-(사이클로펜틸티오)-6,6-디메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로벤조[c]티오펜-4(5H)-온.
또 다른 일례로, 상기 LRRK2 단백질 저해제는 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
[화학식 3]
Figure 112018501325784-pat00021
상기 화학식 3에서,
L3은 부재, -NH-, 또는 -O-이고;
L4는 N, 또는 C이고;
E1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이고;
E2는 상기 L4가 N일 경우 부재이고, 상기 L4가 C일 경우
Figure 112018501325784-pat00022
이고, 상기 E5는 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬이고;
E3은 -H, -OH, 할로겐, 나이트릴, 나이트로, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 비치환 또는 치환된 C6-10의 사이클로알킬, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이고,
여기서, 상기 치환된 C6-10의 사이클로알킬 및 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 -OH, 할로겐, C1-3의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 및 C1-3의 직쇄 또는 측쇄 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환된 C6-10의 사이클로알킬 및 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이고;
E4는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬카보닐 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 6 내지 8 각환의 헤테로아릴이고,
여기서, 상기 치환된 6 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬 및 치환된 6 내지 8 각환의 헤테로아릴은 독립적으로 C6-10의 아릴, N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 6 각환의 헤테로사이클로알킬이 치환된 6 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이고,
여기서, 상기 치환된 6 각환의 헤테로사이클로알킬은 -OH, 할로겐, 또는 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬이 치환된 6 각환의 헤테로사이클로알킬이다.
바람직하게, L3은 부재, -NH-, 또는 -O-이고;
L4는 N, 또는 C이고;
E1은 -H, 또는 메틸이고;
E2는 상기 L4가 N일 경우 부재이고, 상기 L4가 C일 경우
Figure 112018501325784-pat00023
이고;
E3은 -H,
Figure 112018501325784-pat00024
, 또는
Figure 112018501325784-pat00025
이고;
E4는
Figure 112018501325784-pat00026
,
Figure 112018501325784-pat00027
,
Figure 112018501325784-pat00028
, 또는
Figure 112018501325784-pat00029
이다.
더욱 바람직하게, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다:
(3) (R)-3-(4-(사이클로헥실아미노)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)-1-(3-페닐피페리딘-1-일)프로판-1-온;
(5) 4-(4-(6-메틸-4-(테트라하이드로-2H-파이란-4-일옥시)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)피리딘-2-일)모르폴린;
(18) 3-(6-(4-(2-플루오로에틸)피페라진-1-일)피리미딘-4-일)-5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸; 및
(20) (2S,6R)-2,6-디메틸-4-(6-(5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸-3-일)피리미딘-4-일)모르폴린.
또 다른 일례로, 상기 LRRK2 단백질 저해제는 하기 화학식 4로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
[화학식 4]
[화학식 4]
Figure 112018501325784-pat00030
(상기 화학식 4에서,
α는 -CH=, 또는 -N=이고;
G1은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 또는 N을 하나 이상 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로아릴아미노이고,
여기서, 상기 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로아릴은 -OH, 할로겐 또는 C1-3의 직쇄 또는 측쇄 알킬이 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로아릴이고;
G2는 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 비치환 또는 치환된 C6-10의 아릴, 또는 N 및 O로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이고,
여기서, 상기 치환된 C6-10의 아릴 및 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬은 독립적으로 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 및 N 및 O를 포함하는 6 각환의 비치환된 헤테로사이클로알킬 C1-3의 직쇄 또는 측쇄 알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환기가 치환된 C6-10의 아릴 및 5 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이고;
G3은 -H, -OH, 할로겐, 나이트로, 나이트릴, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시, 비치환 또는 하나 이상의 나이트릴이 치환된 C6-10의 아릴, 또는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환 또는 치환된 5 내지 10 각환의 헤테로아릴이고,
여기서, 상기 치환된 5 내지 10 각환의 헤테로아릴은 할로겐, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬 및 나이트릴로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 치환체가 치환된 5 내지 10 각환의 헤테로아릴이다.
바람직하게,
G1은 -H, 또는
Figure 112018501325784-pat00031
이고;
G2는
Figure 112018501325784-pat00032
또는
Figure 112018501325784-pat00033
이고;
G3은 나이트릴,
Figure 112018501325784-pat00034
, 또는
Figure 112018501325784-pat00035
이다.
더욱 바람직하게, 상기 화학식 4로 표시되는 화합물은 하기 화합물군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다:
(19) 6-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-4-(3-메틸-4-(모폴리노메틸)페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카보나이트릴;
(21) 3-(4-모르포리노-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일)벤조니트릴; 및
(22) 1-메틸-4-(4-모르폴리노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-1H-피롤-2-카보나이트릴.
또 다른 일례로, 상기 LRRK2 단백질 저해제는 하기 화학식 5로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
[화학식 5]
Figure 112018501325784-pat00036
상기 화학식 5에서,
M1은 비치환 또는 하나 이상의 할로겐이 치환된 C6-10의 아릴이고;
M2는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환된 6 내지 8 각환의 헤테로아릴이고; 및
M3는 N, O 및 S로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 헤테로원자를 포함하는 비치환된 6 내지 8 각환의 헤테로사이클로알킬이다.
바람직하게는, 상기 화학식 5로 표시되는 화합물은 하기 화합물일 수 있다:
(4) 2-(4-플루오로벤질옥시)-5-(1-(2-모폴리노에틸)-1H-피라졸-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드.
또 다른 일례로, 상기 LRRK2 단백질 저해제는 하기 화학식 6으로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
[화학식 6]
Figure 112018501325784-pat00037
상기 화학식 6에서,
Q1은 -H, 아미노, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이고;
Q2는 -H, 비치환된 C6-10의 사이클로알킬이고;
Q3은 -H, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이고; 및
Q4는 N을 하나 이상 포함하며, 하나의 메틸이 치환된 5 각환의 헤테로아릴이다.
바람직하게, 상기 화학식 6으로 표시되는 화합물은 하기 화합물일 수 있다:
(13) (R)-4-(1-사이클로프로필에틸아미노)-7-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)신놀린-3-카복스아미드.
또 다른 일례로, 상기 LRRK2 단백질 저해제는 하기 화학식 7로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
[화학식 7]
Figure 112018501325784-pat00038
상기 화학식 7에서,
T1은 -H, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 비치환된 C3-8의 사이클로알킬카보닐이다.
바람직하게, 상기 화학식 7로 표시되는 화합물은 하기 화합물일 수 있다:
(15) 사이클로프로필[10,11,14,15-테트라하이드로-1,16-에테노-4,8-(메테노)피라졸[3,4-j][1,4,7,9]옥사트리아자사이클로헥사데신-12(13H)-일]메타논.
또 다른 일례로, 상기 LRRK2 단백질 저해제는 하기 화학식 8로 표시되는 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
[화학식 8]
Figure 112018501325784-pat00039
상기 화학식 8에서,
Z1은 -H, 아미노, C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이고;
Z2는 N을 하나 이상 포함하며, 하나의 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬이 치환된 5 내지 8 각환의 헤테로아릴이고; 및
Z3는 -H, 또는 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알킬, 또는 C1-5의 직쇄 또는 측쇄 알콕시이다.
바람직하게, 상기 화학식 8로 표시되는 화합물은 하기 화합물일 수 있다:
(17) (4-(6-아미노-5-(1-이소프로필-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)피리딘-3-일)-2-메톡시페닐)(모폴리노)메타논.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 뇌암, 구체적으로 LRRK2 단백질이 발현되거나 활성화된 뇌암을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 LRRK2 단백질의 활성을 LRRK2 단백질이 인산화됨으로써 나타날 수 있다.
본 발명에 따른 LRRK2 단백질 저해제는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있으며, 이때 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다.
산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 아세트산, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻을 수 있다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류에는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등이 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 LRRK2 단백질 저해제의 유도체를 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜셔 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 LRRK2 단백질 저해제는 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염으로서 만들어질 수 있다. 구체적으로, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에서, 상기 LRRK2 단백질 저해제, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충전제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
본 발명에 따른 LRRK2 단백질 저해제, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물은 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 통해 투여될 수 있다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 LRRK2 단백질 저해제, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질이 추가로 함유될 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명의 LRRK2 단백질 저해제, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효 성분으로 하는 약학적 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 Kg인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1-1000 mg/일이며, 바람직하게는 1-500 mg/일이며, 또한 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여될 수도 있다.
나아가, 본 발명은 약제학적으로 치료가능한 양의 LRRK2 단백질 저해제를 유효성분으로 함유하는 제1성분; 및 약제학적으로 치료가능한 양의 아바스틴을 유효성분으로 함유하는 제2성분을 포함하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 키트를 제공한다.
본 발명의 약학적 키트는 뇌암의 예방 또는 치료를 위하여, 제1성분 및 제2성분이 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 제1성분 및 제2성분이 순차적으로 투여되는 경우, 제1성분의 투여 30분 내지 180분, 60분 내지 120분, 80분 내지 100분 전후로 제2성분을 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 의하면 제1성분의 투여 90분 후에 제2성분을 투여할 수 있다.
상기 약학적 키트에 포함된 제1성분 및 제2성분을 병용 투여하면 뇌암에 대한 항암 활성을 증대시킬 수 있다. 상기 투여는 포유동물, 구체적으로 인간에게 투여되는 것일 수 있다.
본 발명은 LRRK2 단백질 저해제가 일반적인 약물이 통과하기 어려운 혈액 뇌 관문을 용이하게 통과하여 종양 형성을 현저히 억제할 수 있는 효과가 있음을 최초로 규명하였으며, 이와 관련한 실험 결과는 후술하는 실험예를 통해 상세히 설명한다.
이하, 본 발명을 후술하는 실시예와 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예와 실험예는 본 발명을 일부 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예1>5-클로로-N4-(2-(이소프로필설포닐)페닐)-N2-(2-메톡시-4-(4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일)페닐)피리미딘-2,4-디아민의 제조
Figure 112018501325784-pat00040
표제 화합물을 WO 2004080980, WO 2005016894, WO 2009102446, WO 2012019132 또는 WO 2015077602 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 2> N-(2-(2-(3-클로로-4-메톡시페닐아미노)-5-플루오로피리미딘-4-일아미노)페닐)메탄설폰아미드의 제조
Figure 112018501325784-pat00041
표제 화합물을 WO 2009127642 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 3> (R)-3-(4-(사이클로헥실아미노)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)-1-(3-페닐피페리딘-1-일)프로판-1-온의 제조
Figure 112018501325784-pat00042
표제 화합물을 WO 2010106333 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 4> 2-(4-플루오로벤질옥시)-5-(1-(2-모폴리노에틸)-1H-피라졸-4-일)-N-(피리딘-3-일)벤즈아미드의 제조
Figure 112018501325784-pat00043
표제 화합물을 WO 2011038572 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 5> 4-(4-(6-메틸-4-(테트라하이드로-2H-파이란-4-일옥시)-1H-피라졸[4,3-c]피리딘-3-일)피리딘-2-일)모르폴린의 제조
Figure 112018501325784-pat00044
표제 화합물을 WO 2011141756 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 6> (4-(디메틸아미노)피페리딘-1-일)(3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)메타논의 제조
Figure 112018501325784-pat00045
표제 화합물을 WO 2011151360 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 7> (S)-3-(사이클로프로필티오)-7-메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로티에노[3,4-c]피리딘-4(5H)-온의 제조
Figure 112018501325784-pat00046
표제 화합물을 WO 2012058193 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 8> N4-에틸-N2-(1-(3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-3-메틸-1H-피라졸-4-일)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민의 제조
Figure 112018501325784-pat00047
표제 화합물을 WO 2012062783 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 9> 3-(사이클로펜틸티오)-6,6-디메틸-1-(1H-피라졸-3-일)-6,7-디하이드로벤조[c]티오펜-4(5H)-온의 제조
Figure 112018501325784-pat00048
표제 화합물을 WO 2012118679 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 10> 2-[(2-메톡시-4-[[4-(4-메틸피페라진-1-일)피페리딘-1-일]카보닐]페닐)아미노]-5,11-디메틸-5,11-디하이드로-6H-피리미도[4,5-b][1,4]벤조디아제핀-6-온의 제조
Figure 112018501325784-pat00049
표제 화합물을 WO 2010080712 또는 WO 2015176010 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 11> (4-(4-(에틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-2-플루오로-5-메톡시페닐)(모폴리노)메타논의 제조
Figure 112018501325784-pat00050
표제 화합물을 WO 2011151360 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 12> (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논의 제조
Figure 112018501325784-pat00051
12-1. (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논의 제조-1
표제 화합물을 WO 2011151360 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
12-2. (3-메톡시-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)페닐)(모폴리노)메타논의 제조-2
Figure 112018501325784-pat00052
단계 1. 2,4-디클로로-5-요오도피리미딘(1.0 당량)을 THF에 녹인 후, 0℃에서 메틸아민(3.5 wt% in EtOH, 1.1 당량)을 첨가하였다. 상기 혼합물을 0℃에서 2시간 동안 교반한 뒤, 용매를 제거하고 더 이상의 정제과정 없이 다음 단계에서 사용하였다(수율: 100%).
단계 2. Two-necked round-bottom flask를 질소 기채로 채운 후, CuI(5.0 당량) 및 KF(5.0 당량)를 넣었다. 상기 혼합물을 150℃로 온도를 가열한 뒤, 감압 상태에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 후, 온도를 상온으로 낮추고 질소하에서 DMF/NMP(1:1)에 용해된 트리메틸(트리플로로메틸)실란(5.0 당량)을 실린지(syringe)를 이용하여 첨가하였다. 30분 동안 반응시킨 뒤, DMF/NMP(1:1)에 용해된 2-클로로-5-요오도-N-메틸피리미딘-4-아민(1.0 당량)을 실린지를 이용하여 첨가하고, 50℃에서 18시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 상기 반응물에 물을 첨가하여 침전물을 형성시키고, 형성된 침전물을 여과하여 제거하였다. 수득된 여과액으로부터 EtOAc를 이용하여 유기물을 추출하였다(x3). 모아진 유기층은 브라인(brine)으로 세척하고, Na2SO4로 남은 물을 제거하였다. 물이 제거된 혼합물을 MPCL(EtOAc:Hex)를 이용하여 정제함으로써, 노란빛 고체의 목적 화합물을 수득하였다(수율: 70%).
단계 3. 2-클로로-N-메틸-5-(트리프루오로메틸)피리미딘-4-아민(1.0 당량)과 (4-아미노-3-메톡시페닐)(모르폴리노)메타논(1.0 당량)을 다이옥세인(dioxane)에 녹이고, 상온에서 p-톨루엔술폰산(p-toluensulfonic acid)(1.0 당량)을 첨가하였다. 이를 100℃에서 16시간 교반한 뒤, 상온으로 식힌다음 용매를 제거하고 얼음물을 첨가하였다. 유기물은 EtOAc를 이용하여 추출하였다(x3). 모아진 유기층은 브라인으로 세척하고, Na2SO4로 남은 물을 제거하였다. 물이 제거된 혼합물을 MPCL(EtOAc:Hex)를 이용하여 정제함으로써, 흰색 고체의 목적 화합물을 수득하였다(수율: 70%).
<실시예 13> (R)-4-(1-사이클로프로필에틸아미노)-7-(1-메틸-1H-피라졸-4-일)신놀린-3-카복스아미드의 제조
Figure 112018501325784-pat00053
표제 화합물을 WO 2012162254 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 14> 1-(5-클로로-4-(4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일아미노)-1H-피라졸-1-일)-2-메틸프로판-2-올의 제조
Figure 112018501325784-pat00054
표제 화합물을 WO 2012062783 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 15> 사이클로프로필[10,11,14,15-테트라하이드로-1,16-에테노-4,8-(메테노)피라졸[3,4-j][1,4,7,9]옥사트리아자사이클로헥사데신-12(13H)-일]메타논의 제조
Figure 112018501325784-pat00055
표제 화합물을 WO 2013046029 특허문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 16> N2-(5-클로로-1-((3S,4R)-3-플루오로-1-(옥세탄-3-일)피페리딘-4-일)-1H-피라졸-4-일)-N4-메틸-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2,4-디아민의 제조
Figure 112018501325784-pat00056
표제 화합물을 Journal of Medicinal Chemistry (2014), 57(3), 921-936 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 17> (4-(6-아미노-5-(1-이소프로필-1H-1,2,3-트리아졸-4-일)피리딘-3-일)-2-메톡시페닐)(모폴리노)메타논의 제조
Figure 112018501325784-pat00057
표제 화합물을 WO 2014106612 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 18> 3-(6-(4-(2-플루오로에틸)피페라진-1-일)피리미딘-4-일)-5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸의 제조
Figure 112018501325784-pat00058
표제 화합물을 WO 2014137723 문헌을 참조하여 준비하였다.
*<실시예 19> 6-(1-메틸-1H-피라졸-3-일아미노)-4-(3-메틸-4-(모폴리노메틸)페닐)-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-카보나이트릴의 제조
Figure 112018501325784-pat00059
표제 화합물을 WO 2014170248 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 20> (2S,6R)-2,6-디메틸-4-(6-(5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸-3-일)피리미딘-4-일)모르폴린의 제조
Figure 112018501325784-pat00060
표제 화합물을 WO 2014137723 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 21> 3-(4-모르포리노-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-3-일)벤조니트릴의 제조
Figure 112018501325784-pat00061
표제 화합물을 WO 2015092592 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실시예 22> 1-메틸-4-(4-모르폴리노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일)-1H-피롤-2-카보나이트릴의 제조
Figure 112018501325784-pat00062
표제 화합물을 USA 20140005183 A1 문헌을 참조하여 준비하였다.
하기 표 1에 상기 실시예 1-22에서 준비한 화합물의 구조를 나타내었다.
Figure 112018501325784-pat00063
Figure 112018501325784-pat00064
<비교예> 2-메틸-2-[3-메틸-4-[[4-(메틸아미노)-5-(트리플루오로메틸)피리미딘-2-일]아미노]피라졸-1-일]프로판나이트릴
Figure 112018501325784-pat00065
표제 화합물을 WO 2012062783 문헌을 참조하여 준비하였다.
<실험예 1> 뇌종양 환자의 암 줄기세포에서 LRRK2 단백질의 발현 확인
뇌종양의 치료를 위한 표적 단백질로서 LRRK2 단백질의 가능성을 확인하기 위해, 19명의 뇌종양 환자로부터 수득한 암조직을 이용하여 Western Blot을 수행하여 LRRK2 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 뇌종양 환자로부터 암조직을 수득한 뒤, Western Blot을 수행하여 LRRK2 단백질의 발현을 확인하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 뇌종양 환자로부터 수득된 암 조직에서 LRRK2 단백질이 발현되는 것을 확인하였고, 이는 뇌종양의 악성도가 높을수록 발현량이 증가하였다. 따라서, 상기로부터 LRRK2 단백질이 뇌종양의 치료에 표적으로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
<실험예 2> LRRK2 단백질에 대한 인산화에 따른 뇌종양 환자의 예후 변화 확인
LRRK2 단백질은 인산화가 됨으로써 그 활성을 나타낸다. 이에, 뇌종양 세포에서 LRRK2 단백질에 대한 인산화로 인한 뇌종양 환자의 예후 변화를 확인하였다.
구체적으로, 약 200여 명의 뇌종양 3기 및 4기 환자로부터 조직 샘플을 수득하고, 수득된 조직 샘플에서 인산화된 LRRK2 단백질의 발현을 면역염색을 통해 확인하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, LRRK2 단백질에 대한 인산화는 뇌종양의 악성도가 증가할수록, 다시 말해서 3기에서 4기로 뇌종양이 진행되면서 증가하였다. 따라서, 상기로부터 악성도가 높은 뇌종양의 치료를 위해 인산화된 LRRK2 단백질을 표적 단백질로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
<실험예 3> LRRK2 단백질의 돌연변이와 뇌종양과의 상관관계 확인
종래의 연구에 의하면, LRRK2 단백질에 발생한 돌연변이에 의해서 다양한 암종이 발생할 수 있고, LRRK2 단백질과 관련된 것으로 알려진 파킨슨 병 또한 LRRK2 단백질의 돌연변이에 의해 발생하는 것이 보고되었다. 이에, 상기 실험예에서 뇌종양 세포에서 과발현된 것으로 확인된 LRRK2 단백질이 이의 돌연변이인지를 확인하였다. 구체적으로, 5명의 환자로부터 수득한 뇌종양 세포를 이용하여 서열분석을 수행하였고, 이때 하기 표 2에 기재된 바와 같은 프라이머를 사용하였다.
Figure 112018501325784-pat00066
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 뇌종양 세포에서 발현된 LRRK2 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 종래에 알려진 단일염기다형성(SNP)을 제외하고는, 파킨슨병에서 주로 확인되는 것과 같은 특이적인 돌연변이가 없었다. 따라서, 상기로부터 파킨슨 병이나 다른 종류의 암과 달리, 뇌종양의 경우 정상 LRRK2 단백질이 과발현됨으로써 암이 발생하는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 4> LRRK2 단백질의 과발현에 의한 종양 형성능 확인
실험예 3에서 확인된 바와 같이, 뇌종양이 LRRK2 단백질의 과발현에 의해 발생되는지 여부를 확인하기 위해, LRRK2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 렌티바이러스 벡터(pLenti CMV GFP DEST(736-1), Addgene #19732)를 제조한 뒤, 이를 528NS, 464T(삼성서울병원, 대한민국) 및 ex-vivo 세포주에 각각 감염시켜 종양의 형성을 확인하였다. 이때, LRRK2 단백질을 발현하지 않는 렌티바이러스 벡터를 대조군으로서 감염시켰다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 LRRK2 단백질을 발현하는 렌티바이러스로 감염된 528NS, 464T 또는 ex-vivo 세포주에서 GSC(glioma stem cell) 구의 크기가 증가하였다. 이로부터 LRRK2 단백질의 과발현으로 종양이 형성되는 것을 알 수 있었다.
<실험예 5> 화합물의 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제활성 평가 (in vitro)-(1)
in vitro에서 약물 효능 평가를 위해 뇌종양 환자 유래 세포주인 NCC01 세포를 이용하여 Western Blot 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 7.5x105 내지 1.0x106개의 NCC01 세포에 실시예 10, 11, 12, 20, 21 및 22에서 제조된 화합물을 100 또는 1,000 nM의 농도로 각각 처리하고 1일이 경과한 후 샘플을 수집하여 Western Blot을 통해 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제 활성을 평가하였다. 실시예의 화합물을 처리하지 않은 군을 무처리군(Vehicle)으로 하였다. 그 결과를 도 5 및 6에 나타내었다.
도 5 및 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 10, 11, 12, 20, 21 및 22의 화합물은 무처리군(Vehicle)에 비해 뇌종양 환자 유래 세포주인 NCC01 세포에서 LRRK2 단백질에 대한 인산화를 현저히 억제하였다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물이 뇌종양 환자 유래 세포주에서 발현되는 LRRK2 단백질에 대한 인산화를 억제함을 확인하였다.
<실험예 6> 화합물의 농도에 따른 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제활성 평가 (in vitro)-(1)
앞선 <실험예 1>의 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제활성 평가와 유사하게 실험을 수행하되, 본 발명에 따른 실시예의 화합물이 구체적으로 어떤 농도범위에서 효능이 우수한지를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 7.5x105 내지 1.0x106개의 NCC01 세포에 실시예 10 및 12에서 제조된 화합물을 0.5, 1, 5, 10, 50 및 100 nM의 농도로 처리하고, 1일이 경과한 후 샘플을 수집하여 Western Blot을 통해 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제 활성을 평가하였다. 실시예의 화합물을 처리하지 않은 군을 무처리군(Vehicle)으로 하였다. 그 결과를 도 7 내지 10에 나타내었다.
도 7 내지 10에 나타난 바와 같이, 실시예 10의 화합물은 100 nM의 농도에서도 인산화된 LRRK2 단백질이 탐지되었지만, 실시예 12의 화합물은 50 및 100 nM의 농도에서 LRRK2 단백질에 대한 인산화를 대부분 억제시켰다.
이로부터, 본 발명에 따른 화합물이 nM 단위의 낮은 농도에서도 LRRK2 단백질에 대한 인산화를 현저히 억제하는 것을 확인하였다.
<실험예 7> 화합물의 처리 시간에 따른 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제활성 평가 (in vitro)
앞선 <실험예 1>의 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제활성 평가와 유사하게 실험을 수행하되, 본 발명에 따른 실시예 화합물을 처리한 뒤 시간 경과에 따라 활성이 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 7.5x105 내지 1.0x106개의 NCC01 세포에 실시예 12에서 제조된 화합물을 100 nM 농도로 처리하고, 1일, 4일, 8일이 경과한 후, 샘플을 수집하여 Western Blot을 통해 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제 활성을 평가하였다. 실시예 화합물을 처리하지 않은 군을 무처리군(Vehicle)으로 하였다. 그 결과를 도 11 및 12에 나타내었다.
도 11 및 12에 나타난 바와 같이, 실시예 12의 화합물을 뇌종양 환자 유래 세포주인 NCC01 세포에 처리하고 1일이 경과한 후부터 LRRK2 단백질의 인산화 수준이 급격히 감소하였으며, 이는 시간이 경과한 후에도 지속되었다.
이로부터, 본 발명에 따른 실시예의 화합물이 장기간 지속적으로 LRRK2 단백질의 인산화를 억제하는 것을 확인하였다.
<실험예 8> LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제로 인한 세포 내 신호전달 경로변화 평가 (in vitro)
암 줄기세포 성장을 위한 세포 내 신호 전달 경로에서 본 발명에 따른 실시예의 화합물이 미치는 영향을 확인하기 위하여 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 1.0x106개의 NCC01 세포에 실시예 12에서 제조된 화합물을 50, 100, 500, 1,000 및 2,000 nM의 농도로 처리하고, 1일이 경과한 후, 샘플을 수집하여 Western Blot을 통해 세포 내 신호 전달 경로에 관여하는 암 줄기세포 마커인 NESTIN 단백질의 발현을 확인하였다. 실시예의 화합물을 처리하지 않은 군을 무처리군(Vehicle)으로 하였다. 그 결과를 도 13 내지 15에 나타내었다.
도 13 내지 15에 나타난 바와 같이, 실시예 12의 화합물에 의해 NCC01 세포에서 LRRK2 단백질에 대한 인산화가 억제되었고, 이는 처리된 화합물의 농도에 의존적으로 감소하였다.
이로부터, 본 발명에 따른 실시예 12의 화합물이 뇌종양 환자 유래 세포에서 LRRK2 단백질에 의한 신호 전달을 저해시키고, 이로 인해 종양 줄기세포 성장에 관여하는 NESTIN 단백질의 발현을 감소시켜 세포의 성장을 억제함을 확인하였다.
<실험예 9> LRRK2 단백질의 활성 억제를 통한 미토콘드리아의 기능 변화 확인
LRRK2 단백질은 미토콘드리아의 외막에 위치하며, 미토콘드리아의 절편화 및 막 막전위(membrane potential)의 조절에 관여하는 것이 보고되어 있다. 따라서, 상기 실시예에서 제조된 LRRK2 단백질을 저해하는 화합물이 미토콘드리아의 기능에 어떠한 영향을 미치는지 확인하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, NCC01 세포주에 1 μM의 실시예 12의 화합물을 처리하고 1일이 경과한 후, 활성화된 미토콘드리아에 염색되는 TMRE(tetramethylrhodamine ethylester) 염색약을 첨가하여 미토콘드리아의 기능 변화를 확인하였다. 이때, 실시예의 화합물을 처리하지 않은 군을 무처리군(control)으로 하였다. 염색된 결과를 현미경으로 촬영하여 도 16에 나타내었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 대조군의 세포는 세포 내에 존재하는 미토콘드리아의 활성이 유지되어 TMRE 염색약의 발색이 명확하게 나타났다. 그러나, 실시예 12의 화합물을 처리한 세포는 TMRE 염색약의 발색 정도가 감소되었을 뿐만 아니라, 세포 내 존재하는 핵의 절편화가 일어나는 것을 확인하였다. 이로부터 본 발명에 따른 실시예 12의 화합물이 미토콘드리아의 활성을 억제함으로써 뇌종양 세포의 사멸에 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.
<실험예 10> 뇌종양 줄기세포주에서 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제 활성 평가
종양의 전이와 연관된 것으로 알려진 종양 줄기세포에서 LRRK2 단백질에 대한 인산화를 억제함으로써, 줄기세포의 세포사멸을 유도하는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 뇌종양 줄기세포주인 NCC01 세포주에 실시예 12에서 제조된 화합물을 0.1 또는 1 μM의 농도로 첨가하고, 1일이 경과한 후, <실험예 9>에 기재된 바와 같이 미토콘드리아를 염색하여 이의 기능 변화를 확인하였다. 이때, 실시예의 화합물을 처리하지 않은 군을 무처리군(Vehicle)으로 하였다. 염색된 결과를 현미경으로 촬영하여 도 17에 나타내었다.
도 17에 나타난 바와 같이 대조군에 비해 실시예 12의 화합물을 처리한 군에서는 뇌종양 줄기세포에 존재하는 미토콘드리아의 활성이 억제되었다. 따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 화합물이 미토콘드리아의 활성을 억제함으로써 뇌종양 줄기세포의 사멸을 유도함으로써 종양의 전이를 억제할 수 있음을 확인하였다.
<실험예 11> 뇌종양 줄기세포주에서 LRRK2 단백질 저해제에 의한 TRAP1 발현 억제 활성 평가
<실험예 10>에서 확인된 본 발명에 따른 LKKR2 단백질의 저해제의 뇌종양 줄기 세포주에서 미토콘드리아의 활성을 억제하는 것이, 미토콘드리아의 기능조절에 관여하는 것으로 알려진 TRAP1(TNF receptor associated protein 1) 단백질의 발현 변화에 관여하는지 확인하는 실험을 하였다.
구체적으로, 뇌종양 줄기세포주인 NCC01 세포주에 실시예 12에서 제조된 화합물을 100 또는 1,000 nM의 농도로 첨가하고, 1일이 경과한 후, Western Blot의 방법을 통해 TRAP1 단백질의 발현 변화를 확인하였다. 이때, 실시예의 화합물을 처리하지 않은 군을 무처리군(Vehicle)으로 하였다.
그 결과, 도 18에서 나타난 바와 같이, 실시예 12의 화합물에 의해 TRAP1 단백질의 발현이 억제되었다. 이로부터 본 발명에 따른 화합물이 TRAP1 단백질의 발현을 억제함으로써 미토콘드리아의 활성을 억제함을 알 수 있었다.
<실험예 12> 저산소 조건에서의 LRRK2 단백질 발현 변화 확인
종래의 연구를 통해 GSC의 기능에서 저산소 조건이 중요함이 알려졌다. 따라서, 저산소 조건에서의 LRRK2 단백질의 발현변화와 이의 발현을 억제하였을 때 GSC 구의 크기를 확인하였다.
구체적으로, NCC01 및 528NS 세포주를 저산소 조건에 노출시킨 뒤, 여기에 LRRK2 유전자에 대한 2종류의 shRNA를 처리한 뒤, 구의 크기 변화를 확인하였다. 이때, 대조군으로서는 루시러파제에 대한 shRNA(shNT)를 사용하였다.
Figure 112018501325784-pat00067
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이 저산소 조건에 노출된 NCC01(A 및 B) 및 528NS(C 및 D) 세포주의 구 크기가 대조군에 비해 증가하였으나, 이는 LRRK2 유전자에 대한 shRNA인 LRRK2 shRNA-1 및 LRRK2 shRNA-2에 의해 억제되었다. 이로부터 저산소 조건에서 생성된 GSC가 LRRK2 단백질의 발현 억제에 의해 성장이 억제됨을 알 수 있었다.
<실험예 13> LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제를 통한 세포사멸 유도 활성 평가 (in vitro)
LRRK2 단백질에 대한 인산화를 억제함으로써 뇌종양 세포의 세포사멸을 유도하는지 여부를 평가하기 위해 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)를 이용하여 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 7.5x105 내지 1.0x106개의 NCC01 세포에 실시예 11, 12 및 21에서 제조된 화합물을 100 nM의 농도로 각각 처리하고, 1일이 경과한 후, 샘플을 수집하여 FACS를 수행함으로써 세포사멸 유도 활성을 평가하였다. 실시예의 화합물을 처리하지 않은 군을 무처리군(Control)으로 하였다. 그 결과를 도 20 및 21에 나타내었다.
도 20 및 21에 나타난 바와 같이, 실시예 11, 12 및 21의 화합물이 NCC01 세포의 세포사멸을 유도하였다. 특히, 실시예 12의 화합물이 실시예 11 및 21 화합물에 비해 약 3배 높은 세포사멸률을 보였다. 이로부터, 본 발명에 따른 실시예 12의 화합물이 다른 실시예의 화합물에 비해 세포사멸 유도 효과가 현저히 우수함을 알 수 있었다.
<실험예 14> 동물 모델에서 화합물의 뇌종양 세포에 대한 성장 억제 활성 평가-(1)
본 발명에 따른 실시예의 화합물이 동물 모델에서 뇌종양 세포에 대한 성장 억제 활성을 나타내는지 확인하기 위하여 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, Balb/c-nude 마우스 모델에 뇌종양 환자 유래 세포주인 NCC01를 1.0x104개가 되도록 뇌속에 주입하고, 3일이 경과한 후, 실시예 12에서 제조된 화합물을 10 mg/kg 또는 60 mg/kg으로 경구투여하였다. 화합물을 투여한 이후 생존 기간에 따른 마우스의 생존율과 MRI를 이용하여 상기 마우스에 생성된 종양의 크기를 측정하였다. 실시예의 화합물을 처리하지 않은 군을 무처리군(Vehicle)으로 하였다. 그 결과를 도 22 및 23에 나타내었다.
도 22에 나타난 바와 같이, 무처리군 그룹에서는 마우스의 평균 생존기간이 54일인 반면, 실시예 12의 화합물을 10 mg/kg으로 경구투여한 그룹은 평균 생존일이 71일이고, 실시예 12의 화합물을 60 mg/kg으로 경구투여한 그룹은 모든 개체가 100일까지 생존하였다(Vehicle vs 10mg/kg : p=0.032, Vehicle vs 60mg/kg : p<0.001).
또한, 도 23에 나타난 바와 같이, 화합물을 처리하지 않은 무처리군에서는 NCC01 세포를 주입한 위치에 종양이 형성되었으나, 실시예 12의 화합물을 10mg/kg 또는 60mg/kg 경구투여한 군에서는 종양의 형성이 관찰되지 않았다.
이로부터, 본 발명에 따른 실시예의 화합물은 뇌종양 세포로부터 유래한 종양의 형성을 동물 모델에서 현저히 억제함을 알 수 있었다.
<실험예 15> 화합물 및 아바스틴의 병용처리에 의한 뇌종양 치료 효과 평가
본 발명에 따른 실시예의 화합물을 뇌종양 치료 약물로 처방되고 있는 아바스틴과 병용처리하였을 때, 동물모델에서 그 효과를 확인하기 위해 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 5주령의 Balb/c-nude 마우스를 이용하여 직립성 마우스 모델(orthotopic mouse model)을 제조하였다. 이때, 뇌종양 세포주인 U87MG 세포(ATCC, 미국)를 정위 방법의 장치(stereotaxic device)를 이용하여 브레그마(bregma)를 기준으로 왼쪽 2.2 ㎜, 뒤쪽 0.5 ㎜ 및 깊이 3.5 ㎜로 주입하였다. 세포를 주입하고 3일 뒤에 마우스를 5마리씩 4개의 군(대조군(Vehicle), 아바스틴 투여군, 또는 실시예 12의 화합물 및 아바스틴 투여군)으로 나누고, 약물을 투여하였다. 실시예 12의 화합물은 30 ㎎/㎏의 투여량을 경구투여하였고, 아바스틴은 10 ㎎/㎏의 투여량을 복강 내로 주사하였다. 이후, 상기 마우스가 전체 몸무게의 20% 이상이 감소하거나 이상행동을 나타내는 등의 종양형성 소견을 보이면 생존기간을 측정하였다. 그 결과, 통계 프로그램을 이용하여 나타낸 생존 그래프를 도 24에 나타내었다.
그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이, 실시예 12의 화합물을 아바스틴과 병용처리하는 경우, 아바스틴에 의한 뇌종양 치료 효과가 더욱 현저히 증가하는 것을 알 수 있었다.
<실험예 16> 비교예 화합물의 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제활성 평가 (in vitro)
LRRK2 단백질 억제제로서 공지된 화합물인 비교예 화합물의 in vitro에서 약물 효능 평가를 위해 뇌종양 환자 유래 세포주인 NCC01 세포를 이용하여 Western Blot 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 7.5x105 내지 1.0x106개의 세포에 비교예에서 제조된 화합물을 0.1 또는 1.0 μM의 농도로 각각 처리하고 1일이 경과한 후 샘플을 수집하여 Western Blot을 통해 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제 활성을 평가하였다. 실시예의 화합물을 처리하지 않은 군을 무처리군(Vehicle)으로 하였다. 그 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 비교예 화합물은 LRRK2 단백질을 억제하는 것으로 알려져 있으나, LRRK2 단백질의 인산화는 억제하지 못함을 확인하였다.
<실험예 17> 화합물의 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제 활성 평가 (in vitro)-(2)
in vitro에서 약물 효능 평가를 위해 뇌종양 환자 유래 세포주인 448T를 이용하여 Western blot 실험을 수행하였다. 실험은 NCC01 세포 대신 448T 세포(삼성서울병원, 대한민국)를 사용하고, 실시예 10, 11, 12, 20 및 21에서 제조된 화합물을 처리한 것을 제외하고는 실험예 5와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 26에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 10, 11, 12, 20 및 21의 화합물은 무처리군(Vehicle)에 비해 뇌종양 환자 유래 세포주인 448T 세포에서 LRRK2 단백질에 대한 인산화를 현저히 억제하였다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물이 뇌종양 환자 유래 세포주에서 발현되는 LRRK2 단백질에 대한 인산화를 억제함을 재확인하였다.
<실험예 18> 화합물의 농도에 따른 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제활성 평가 (in vitro)-(2)
본 발명에 따른 실시예의 화합물이 448T 세포에 대해 구체적으로 어떤 농도범위에서 효능이 우수한지를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 실험은 NCC01 세포 대신 448T 세포를 사용하고, 실시예 12에서 제조된 화합물을 50, 100, 500, 1,000, 2,000 nM의 농도로 처리한 것을 제외하고는 실험예 6과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 27에 나타난 바와 같이, 실시예 12의 화합물은 50 nM의 농도에서 LRRK2 단백질에 대한 인산화를 대부분 억제시켰다.
이로부터, 본 발명에 따른 화합물이 nM 단위의 낮은 농도에서도 LRRK2 단백질에 대한 인산화를 현저히 억제하는 것을 재확인하였다.
<실험예 19> 동물 모델에서 화합물의 뇌종양 세포에 대한 성장 억제 활성 평가-(2)
본 발명에 따른 실시예의 화합물이 동물 모델에서 뇌종양 세포에 대한 성장 억제 활성을 나타내는지 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 실험은 NCC01 세포 대신 448T 세포를 사용하고, 실시예 12, 20 및 21에서 제조된 화합물을 60 mg/kg으로 경구투여한 것을 제외하고는 실험예 14와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
그 결과, 28에 나타난 바와 같이, 화합물을 처리하지 않은 무처리군에서는 448T 세포를 주입한 위치에 종양이 형성되었으나, 실시예 12, 20 및 21에서 제조된 화합물을 경구투여한 군에서는 종양의 형성이 관찰되지 않았다.
이로부터, 본 발명에 따른 실시예의 화합물은 뇌종양 세포로부터 유래한 종양의 형성을 동물 모델에서 현저히 억제함을 재확인하였다.
<실험예 20> 실시예 및 비교예 화합물의 LRRK2 단백질에 대한 인산화 억제활성 평가 (in vitro)
LRRK2 단백질 억제제로서 공지된 화합물인 비교예 화합물의 in vitro에서 약물 효능을 평가하기 위하여 실험을 수행하였다. 실험은 NCC01 세포 대신 448T 세포를 사용하고, 실시예 1, 11 및 12에서 제조된 화합물을 처리한 것을 제외하고는 실험예 16과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다.
그 결과, 도 29에 나타난 바와 같이, 비교예 화합물은 LRRK2 단백질을 억제하는 것으로 알려져 있으나, 본 발명에 따른 실시예 1, 11 및 12 화합물과 달리 LRRK2 단백질의 인산화는 억제하지 못함을 확인하였다.
<제제예 1> 약학적 제제의 제조
1-1. 산제의 제조
본 발명의 LRRK2 단백질 저해제 500 ㎎
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
본 발명의 LRRK2 단백질 저해제 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캅셀제의 제조
본 발명의 LRRK2 단백질 저해제 500 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
본 발명의 LRRK2 단백질 저해제 500 ㎎
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5. 액제의 제조
본 발명의 LRRK2 단백질 저해제 100 ㎎
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액체를 제조한다.
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Claims (5)

  1. (2S,6R)-2,6-디메틸-4-(6-(5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸-3-일)피리미딘-4-일)모르폴린 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 4기 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 약제학적으로 치료가능한 양의 (2S,6R)-2,6-디메틸-4-(6-(5-(1-메틸사이클로프로폭시)-1H-인다졸-3-일)피리미딘-4-일)모르폴린 화합물, 이의 광학 이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 제1성분; 및
    약제학적으로 치료가능한 양의 아바스틴을 유효성분으로 함유하는 제2성분을 포함하는 4기 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 제1성분 및 제2성분이 순차 또는 동시로 투여되는 것을 특징으로 하는 4기 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 키트.
KR1020180086162A 2018-07-24 2018-07-24 혈액 뇌관문을 통과할 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 KR101990738B1 (ko)

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