KR101949010B1

KR101949010B1 - 타깃 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 펩타이드 유래 분자결합자를 이용한 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101949010B1
Application number: KR1020170022157A
Authority: KR
Inventors: 박종필
Original assignee: 대구한의대학교산학협력단
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2017-02-20
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2037-02-20
Also published as: KR20180096031A

Abstract

본 발명은 난검출성으로 알려진 국내유입가능 고위험군 바이러스인 뎅기바이러스의 검출을 위한 뎅기바이러스 NS1에 고특이적이며 고선택적 결합과 인지가 가능한 펩타이드 유래 분자결합자 및 그를 이용한 뎅기바이러스의 검출칩에 관한 것이다.
이를 이용하여 난검출성으로 알려지고 국내유입가능 고위험군으로 분류된 뎅기바이러스를 조기 검출할 수 있으며 치료 및 예후판정에도 이용될 수 있다.

Description

타깃 바이오마커에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 펩타이드 유래 분자결합자를 이용한 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩 및 그 제조방법 {The dengue virus detection chip using peptide-based molecular binder and the manufacturing method}

본 발명은 뎅기바이러스 고감도 검출을 위한 펩타이드 유래 분자결합자(molecular binder)를 이용한 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩 및 그를 이용하여 시료 내에 극미량 존재하는 뎅기바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.

더 구체적으로는 뎅기바이러스 조기검출이 가능한 타깃 바이오마커인 NS1에 고특이적이며 고선택적 결합이 가능한 펩타이드 유래 분자결합자 및 그를 이용한 바이오칩에 관한 것이다. 이를 이용하여 난검출성으로 알려진 뎅기바이러스 조기검출을 포함하여 치료 및 예후판정에 활용할 수 있다. 본 발명의 펩타이드 유래 분자결합자는 바이오칩에 널리 사용되고 있는 골드를 포함한 다양한 기판 위에 화학적 전처리공정 없이 선택적으로 고정화할 수 있어 이를 통해 바이오칩 제작공정이 매우 간편하고 효율적임은 물론, 복잡한 칩 기반의 수식화, 식각화 공정이 필요 없게 되어 전체적으로 제조공정이 단순화되어 생산성과 경제성에 큰 향상효과를 기대할 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드 기반 분자결합자는 인실리코(In Silico) 기반의 시뮬레이션(molecular simulation) 방법을 활용하여 분자결합자 내 아미노산 조성을 변경하고 치환(substitution)함으로써 타깃분자에 대해 결합력(binding affinity or binding constant)을 증가시킬 수 있는 최상의 분자결합자를 발굴하고, 이로부터 분광학적 혹은 전기화학적인 검출기술을 이용하여 분자결합자의 기능성 검증을 통해 실제 뎅기바이러스를 고민감성, 고특이적으로 검출할 수 있는 방법을 포함한다.

본 발명에 따른 펩타이드 기반의 분자결합자의 개발은 기존 항체나 앱타머, PNA, 탄수화물, 효소 등을 이용한 검출방법에 비해 제조수율이 향상되고 제조공정이 간단하여, 분광학적 혹은 전기화학적인 검출기술을 활용할 경우 시료 내 극미량으로 존재하는, 식중독을 유발하는 것으로 알려진 뎅기바이러스를 매우 간단하고 효율적이면서 고민감성과 고특이적으로 검출할 수 있다. 본 발명의 분자결합자를 이용할 경우 기존의 뎅기바이러스 검출용 항체를 대체할 수 있을 것으로 기대한다.

뎅기바이러스는 RNA 바이러스로서 플라비바이러스과 플라비바이러스속으로 분류되며 외막이 있고 바이러스 입자는 정이십면체이다.

4종류의 혈청형이 존재하는 것으로 알려져 있으며 특히 매개동물은 모기이고 흡혈시에 전파되는 것으로 알려져 있다. 이 모기는 아시아, 남태평양 지역, 아프리카, 아메리카 대륙의 열대지방과 아열대지방에 분포한다. 우리나라에는 없는 병이지만, 최근에는 유행지역에 다녀온 후 발병하는 경우가 매년 30여 명씩 보고되고 있다. 뎅기바이러스를 전파하는 모기는 집 주위에 서식하는 모기이며, 보통 비가 고인 폐타이어나 물웅덩이에 서식하고, 주로 낮에 활동한다(Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, Volume 13, Issue 2, February 2017, Pages 549-557, Acta Tropica, Volume 163, November 2016, Pages 32-37).

증상으로는 갑작스럽게 고열이 나서 발열이 3~5일간 계속되고 심한 두통, 근육통, 관절통, 식욕부진이 동반되며 초기에 때로 신체 전반에 붉은 반점이 나타난다. 열이 떨어지면서 온몸에 피부 발진이 1~5일간 계속되는데, 초기에는 얼굴, 목 및 가슴 부위에 좁쌀 모양의 발진이 일시적으로 나타나다가 3~4일째에 가슴과 몸통에서 시작하여 팔다리와 얼굴로 퍼지게 된다. 전신의 림프절이 커지지만 간이나 비장은 촉진되지 않는다. 코피나 잇몸 출혈 등의 경미한 출혈이 질병 경과 중에 나타난다. 성인의 경우 혈변을 보거나 월경 과다, 목 부위의 림프절이 붓는 증상이 나타나기도 한다.

뎅기열의 심한 형태로 뎅기 출혈열이나 뎅기 쇼크 증후군(dengue hemorrhagic fever)이 있는데, 이 경우 환자는 열이 떨어지면서 일시적으로 호전되는 것처럼 보이다가 상태가 급속히 악화되는 양상을 보인다. 매우 심한 쇠약감이나 불안증세가 생기고, 식은땀이 나며, 입 주위가 파랗게 되기도 한다. 가슴의 늑막에 물이 차고, 배에 물이 차는 복수가 생겨서 배가 불러지는 현상이 생길 수도 있다. 뎅기쇼크 증후군이 계속되면 장에서 출혈이 생겨 혈변이 나타난다. 이 경우에는 병의 경과 및 치료 결과가 좋지 않아 사망할 확률이 40~50%에 달하지만, 적극적인 중환자 치료를 받으면 사망률을 낮출 수 있다. 일부에서는 뇌염 증상이 동반된다.

뎅기 바이러스(dengue virus)는 플라비비리대 과(family Flaviviridae)의 플라비바이러스 속(genus Flavivirus)에 속하는 ssRNA 양성가닥 바이러스로, 고열을 동반하는 급성 열성 질환인 뎅기열(dengue fever)의 병인이 되는 바이러스이다. 뎅기 바이러스에 의한 감염증은 전 세계적으로 열대아시아, 서아프리카, 중미, 남태평양 등 넓은 영역에 걸쳐 풍토병으로 인지되고 있으며, 이러한 지역에 서식하는 이집트숲모기(Aedes aegypti), 흰줄숲모기(Aedes albopictus) 등의 모기를 매개체로 하여 인간에게 감염된다. 뎅기 바이러스에 감염되면 임상 증상에 따라 고열, 반점, 백혈구 감소증과 혈소판 감소증을 동반하는 뎅기열, 심한 경우인 출혈이 동반되는 뎅기출혈열(dengue haemorrhagic fever) 및 혈관의 투과성 증가와 저혈압성 쇼크를 동반하는 뎅기쇼크 증후군(dengue shock syndrome)이 나타나며, 매년 세계적으로 약 5천만 명 내지 1억 명의 뎅기 바이러스 감염자가 발생하고 있는 것으로 추정된다. 뎅기 바이러스는 혈청학적으로 다른 4가지 종류(DENV 1, DENV 2, DENV 3 및 DENV 4)가 있으며, 이들 뎅기 바이러스는 동일한 증상을 유발하기 때문에 증상만으로는 감염된 뎅기 바이러스의 혈청형을 구분할 수 없다. 동일한 혈청형에 대해서는 일생 방어 면역이 성립되지만 다른 혈청형에 재감염되면 방어되지 않을 뿐만 아니라 오히려 증상을 악화시킬 수 있다.

뎅기 바이러스를 비롯한 플라비바이러스는 캡시드(capsid), 막(membrane) 및 외피(envelope) 단백질로 이루어진 3개의 구조 단백질과, NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B 및 NS5로 이루어진 7개의 비구조 단백질로 구성된다. 이 중 당단백질인 NS1은 모든 플라비바이러스에 존재하며 바이러스의 생존에 필수적인 것으로 보인다. 뎅기 바이러스 NS1은 가용성 헥사머(hexamer) 형태로 감염된 포유동물 세포로부터 분비된다. 비공유적으로 결합된 헥사머 복합체(complex)는 3개의 이량체 서브유닛에 의해 형성되며, 310 kDa의 분자량을 가진다(특허 10-2005-0044726). 뎅기 바이러스의 감염 과정 동안 NS1 단백질은 강한 항체 반응을 일으키며, 이는 보체-매개성(complement-mediated) 경로 및 항체-의존성 세포독성(ADCC, antibody-dependent cell cytotoxicity)을 통하여 숙주에서 감염된 바이러스를 제거하는 것을 돕는 것으로 보인다.

한편, 뎅기 바이러스 감염에 의한 뎅기열은 환자의 혈청이나 조직에서 바이러스를 직접 검출하거나, 바이러스 항원이나 RT-PCR(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)을 이용해 RNA를 검출함으로써, 또는 환자의 혈청에서 특이 항체를 찾아냄으로써 진단할 수 있다(Journal of Clinical Virology, Volume 83, October 2016, Pages 66-71, Journal of Clinical Virology, Volume 78, May 2016, Pages 57-61, Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, Volume 81, Issue 2, February 2015, Pages 105-106).

혈청학적 진단방법으로 혈구-응집 억제 검사(hemagglutination-inhibition reaction test), 항체-포획 ELISA(antibody capture ELISA), 보체(complement) 결합법, 중화항체 검사(neutralization antibody test), 점적(dot-blot) 면역분석법 등과 같이 뎅기 바이러스에 대한 항체를 이용하는 방법들이 이용되고 있으나, 이들 방법은 신속한 결과를 얻을 수 없고 조작하기도 쉽지 않으며 교차반응으로 인해 각각의 혈청형을 구분하기가 어렵다는 단점을 가지고 있다.

감염된 바이러스의 혈청형을 구분하는 일반적인 방법으로는 모기 혹은 세포 배양액을 통해 바이러스를 분리한 후 뎅기 바이러스 각 혈청형 특이적인 항체를 이용하여 면역형광법으로 분석하는 것이다. 그러나 바이러스 분리는 수일에서 수주가 소요되고, 검체의 부적절한 처리나 바이러스 항체 복합체 형성, 살아있는 바이러스의 낮은 카피수(copy number) 등으로 인해 검사 성공률이 매우 낮은 실정이다.

현재 뎅기열의 진단에 사용되는 방법은 ELISA에 의해 혈청에서 안티-뎅기 IgM 및 IgG의 혈청학적 검출에 기반을 두고 있다. 그러나 검체 시료 내에 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 치쿤구니야 바이러스(Chikungunya virus) 등과 같은 유사 바이러스의 존재 시에는 중복검출로 인해 진단 결과에 대한 신뢰도가 낮으며, 이러한 혈청학적 방법으로는 질병의 초기 단계에서 뎅기바이러스의 감염을 검출할 수 없다는 단점이 있다.

최근에 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction)이 신속하고 민감도가 높으며 간편하고, 정확하게 작동 시 재현성이 우수하다는 장점으로 인해 뎅기 바이러스를 비롯한 다수의 RNA 바이러스 검사를 위해 사용되고 있다. 비록 RT-PCR은 바이러스 분리 시스템과 유사한 민감성을 가지지만 일반적인 배양법에서처럼 서툰 조작이나 부적절한 시료 저장 상태, 항체로 인해 그 결과에 영향을 받지 않는다. 그러나 RT-PCR은 부적절한 프라이머 디자인 또는 PCR 조건, 그로 인한 비특이적 혼성화로 인해 나타나는 위-양성(false-positive) 결과가 문제시 되고 있다(Journal of Virological Methods, Volume 177, Issue 2, November 2011, Pages 168-173, Virology, Volume 500, January 2017, Pages 149-160, Journal of Clinical Virology, Volume 45, Issue 1, May 2009, Pages 61-66, 특허 10-2009-0040707, 10-2013-0073304).

이에 본 발명자들은 뎅기바이러스를 신속하고 정확하게 동시에 검출할 수 있는 진단방법을 개발하기 위해 연구를 진행한 결과, 뎅기바이러스 NS1 단백질에 높은 민감도 및 정확도를 가지는 신규 펩타이드를 발굴하여 전기화학적 검출방법을 활용하여 조기진단이 가능한 바이오센서 시스템을 개발하였다.

일반적인 뎅기바이러스 검출방법으로 EIA, ELISA 방법이 사용되어 왔으며, 가장 일반적인 검출방법으로는 RT-PCR, real-time PCR, NASBA, 서던블롯법(Southern blot) 등이 광범위하게 이용되고 있으나(특허 10-2008-0113417, Journal of Virological Methods, Volume 236, October 2016, Pages 266-270), PCR 기반의 검출방법의 한계는 뎅기바이러스를 검출하기 위한 프라이머와 프로브의 디자인이다. 대부분의 뎅기바이러스가 유전적 다양성(genetic diversity)을 가지고 있기 때문이다. 광범위하게 사용되고 있는 RT-PCR 방법의 경우, 여러 가지의 프라이머(primer)와 프로브(probe)가 필요하게 된다. 하지만 RT-PCR 방법은 뎅기바이러스 검출 민감도는 좋으나, 매우 비싸며 시간이 많이 걸리는 점이 단점으로 지적되고 있다. 또한, 숙련된 분석자들만이 재현성 있는 결과를 도출할 수 있다.

펩타이드의 학문적인 정의는 단백질과 구성 성분은 같으나 크기가 훨씬 작은 2개에서 50개 이내의 아미노산이 연결된 형태로서, 광범위하게 질병진단에 사용되고 있는 항체(antibody)에 비해 분자량이 낮아 기능화가 쉽고, 제조공정이 다소 간단한 몇 가지 장점이 있다. 하지만, 체액을 대상으로 질병조기진단용 탐침자로 사용될 경우 시료 속에 포함되어 있는 다양한 형태의 단백질가수분해효소(protease)에 의해서 분해 (degradation)될 가능성이 제기되는 등 앞으로 극복해야 할 과제가 여전히 남아 있다.

또한, 고전적인 방법(gold standard) 중 하나인 항체를 이용한 분자진단용 센서는 항체제작에 많은 비용이 들고 교차반응의 가능성이 있어 민감도를 증가시키고 초고속 현장접근성이 용이한 새로운 형태의 검출개발의 필요성이 제기되고 있다.

이와 같은 기존의 검출방법의 한계 극복은 분자진화기술과 펩티돔기술의 융합을 통해서 가능할 것으로 판단한다. 이 기술을 이용하여 신개념의 펩타이드 유래 분자결합자가 개발될 경우 질병 유발 바이오마커 검출에 적용할 수 있으며, 동시에 프로브의 다변화, 민감도 향상, 다성분 측정, 실시간 분석, 비표지 검출기술이 가능하게 됨으로써 바이오마커 검출 이외에 유해미생물 검출, 질병 바이오마커, 유해물질, 환경호르몬 등 분자진단용으로 사용이 가능하게 된다.

최근에는 강력한 기능을 가진 항체를 대신할 수 있는 affibody, fluorobody 혹은 nanoparticle 기반의 새로운 분자진단용 기술들이 많이 소개되고 있지만, 여전히 새로운 아미노산서열을 가지는 신규 펩타이드를 발굴하고 개량화하여 질병조기진단용으로 사용하고자 많은 연구들이 이루어지고 있는 실정이다.

한편 기존의 PCR 기반 방법의 한계를 극복한 새로운 개념의 multiplexed real-time PCR 방법이 소개되기도 하였다. 이 방법을 사용하여 검출할 경우 민감도와 특이성이 향상된 결과를 얻을 수 있다. 상기에서 설명한 PCR 기반의 뎅기바이러스 검출방법과는 대조적으로, 상업화된 ELISA kit가 출시되기도 하였다(솔젠트 DiaPlexQ™ Dengue Virus Detection Kit).

그러나 상기와 같은 다양한 항체기술 및 이을 이용한 뎅기바이러스 검출기술이 개발되었음에도 불구하고, 현재의 친화성 항체를 사용하는 면역방법기술은 칩 표면의 복잡한 화학적 처리 방법 및 비특이적인 단백질 결합 등의 큰 단점을 가지고 있으며, 또한 그 결합력이 약할 뿐 아니라 많은 화학물질에 영향을 받을 수 있기 때문에 여러 단백질-단백질 상호작용 검사 시 제한점이 많아 실용화가 어려우며, 항체를 칩 혹은 마이크로웰(microwell) 위에 고정하기 위해서는 높은 순도가 요구되어 복잡한 정제공정이 포함되어야 하므로 경제성이 떨어지는 단점도 가지고 있다.

따라서, 복합기능(multiplexed)의 질병유발 단백질 혹은 세포의 실시간 검출이 가능하고 고인지능(high and accurate recognition ability)을 가진 리셉터의 개발이 절실한 실정이다.

몇 가지 극복해야 할 과제가 있긴 하지만, 나날이 발전해가는 융합기술을 이용하여 고감도 분자결합자 개발을 통해 기존 검출방법을 대체할 수 있는 새로운 원천기술개발이 가능할 것으로 생각된다. 위에서 예시한 암 진단과 심혈관질환 조기진단뿐만 아니라 대사질환관련 질병, 뇌질환 등 다른 질병진단을 위해서 많은 연구자들이 응용연구를 하고 있다. 이를 위해서는 펩타이드공학기술과 나노융합기술을 이용하는 것이 필요할 것으로 보이며, 향후 체액으로부터 간단하면서도 민감도가 높은 통합형 분자진단기술개발도 가능할 것으로 판단된다. 궁극적으로 진단결과의 재현성, 검사의 편리성과 안정성, 경제성 등의 다양한 요구를 두루 만족시킬 수 있는 신개념의 통합 조기진단칩을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

또한, 암을 포함한 질병예방과 치료에 필수적인 조기진단용 펩타이드 유래 분자결합자를 분자진화기술인 phage display 기술을 활용하여 분자진단 혹은 분자이미징 툴로서 이용하는 것은 조기 암 진단, 암의 진행상황 파악, 특정 질병 혹은 암세포를 targeting, immunotherapy, gene delivery 등에 응용할 수 있다. 이러한 가능성은 암 관련 진단시장에서 펩타이드 기반의 분자결합자 개발기술을 선점하고 관련 원천기술을 확보한다는 측면에서 매우 큰 의미가 있다고 판단되며, 이를 통해 의료, 제약관련 산업발전에 이바지할 수 있다고 사료된다. 동시에, 암 혹은 다른 질병의 발병기전, 세포 노화, 장기의 성장 등에 중요한 영향을 미치고 있는 바이오마커에 대한 연구는 암 발생, 노화 등 다양한 생명현상의 인과 관계 규명에 중추적 역할을 할 뿐만 아니라, 향후 발생 및 분화나 줄기세포를 이용한 세포 치료제 개발 등의 연구에도 적용시킬 수 있는 우리나라 바이오 연구의 핵심 분야로 자리 잡을 수 있을 것으로 예상된다.

덧붙여, 이러한 융합기반기술을 바탕으로 신속하며 정확한 진단기술이 가능하게 되었지만 몇 가지 극복해야 할 과제도 있다. 예를 들면, 비침습적, 측정의 간편성, 수명의 장기성 및 안정성, 신속성, 센서 감도의 향상, 신뢰성 향상 등이 있다. 관련분야의 기술이 나날이 향상되어가고 있고, 몇 가지 한계점이 시사되고 있지만 이러한 문제를 해결함에 따라 분자진단제 혹은 키트개발도 이어져 새로운 약물 치료에 따른 병행적 검증이 가능하게 되어 신약개발의 성공 가능성을 획기적으로 제고할 것으로 기대할 수 있다.

위에 기재한 바에서 어느 정도 시사되었지만, 본 발명의 목적은 난검출성으로 알려진 뎅기바이러스를 간단히 검출하는 고민감도와 고특이성을 보장하는 획기적인 바이오센서를 가능하게 하고 기존의 뎅기바이러스를 검출할 때 사용하는 고비용의 항체를 대체할 수 있는 기술을 제공하는 데 있다.

아울러 현장에서 사용이 가능하도록 분광학적인 혹은 전기화학적이며 비표지방식을 도입하여 휴대할 수 있는 뎅기바이러스 검출용 키드 혹은 바이오센서 제조가 가능하게 하는 기술을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은, 다음의 단계를 포함하는 펩타이드 유래 분자결합자를 포함하는 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩의 제작방법을 제공한다.

(a) 분자결합자를 코딩하는 아미노산과 목적단백질 또는 목적펩타이드를 코딩하는 유전자를 함유하고, 상기 모두가 융합된 형태로 제조되는 단계;

(b) 상기 분자결합자를 함유하는 수용성 분획을 융합단백질 형태로 형질전환 미생물을 배양하여 발현시키는 단계;

(c) 상기 분자결합자를 함유하는 수용성 분획을 금속칩에 위치 특이적으로 고정시키는 단계.

이때 상기 분자결합자는 뎅기바이러스 NS1을 타깃으로 하는 것을 특징으로 한다.

또한 타깃 바이오마커인 NS1에 대한 펩타이드 유래 분자결합자는 서열목록 4의 아미노산 서열(HSYTQTSLWMKV)을 포함하는 서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.

또한 이때 펩타이드 유래 분자결합자는 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나인 것을 특징으로 한다.

또한 펩타이드 유래 분자결합자는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 한다.

또한 분자결합자는 목적펩티드의 N말단, C말단 또는 N-C중간에 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한 분자결합자는 C말단 혹은 N말단에 링크(linker)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 각 방법으로 제조되는 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩을 제공한다.

본 발명은 또한 서열목록 4의 아미노산 서열(HSYTQTSLWMKV)을 포함하는 서열로 구성되는 분자결합자를 포함하는 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩을 제공한다.

또한 상기 뎅기 바이러스 조기검출용 바이오칩을 이용하여 펩타이드-단백질, 단백질-항체, 단백질-탄수화물, 단백질-단백질 및 단백질-세포간의 상호작용으로 구성된 군에서 선택된 상호작용을 검출하는 뎅기바이러스 검출방법을 제공한다.

상기와 같은 본 발명에 대해 부연설명한다.

본 발명자는 뎅기바이러스 조기검출용 펩타이드 유래 분자결합자를 M13 bacteriophage를 이용한 biopanning 과정을 포함한 융합된 형태의 기술을 통해서 발굴하였으며, 이때 상기 융합된 형태의 기술의 범위는 적어도 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)를 기본적으로 포함하도록 하였다.

본 발명의 뎅기바이러스 조기검출용 펩타이드 유래 분자결합자는, attachment, protection, coupling, deprotection, cleavage 과정을 기본적으로 포함하는 liquid-phase synthesis 혹은 solid-phase synthesis 방법을 통해서 제조하였다.

상기 방법을 통해서 제조된 펩타이드 유래 분자결합자는 각기 다른 아미노산으로 구성된 최소 12개 이상의 아미노산(D형, L형, 펩토이드를 포함한 펩타이드 모방체, 비천연 아미노산)을 포함한다.

또한, 상기 방법을 통해서 제조된 최소 12개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 유래 분자결합자의 N말단 혹은 C말단은 다양한 기능기를 포함할 수 있다.

또한 상기 방법을 통해서 제조된 펩타이드 유래 분자결합자의 기능기는 N말단은 free amine, acetylation, biotin, 다양한 flurophore를 포함할 수 있고, C말단은 free acid, amidation, biotin, 다양한 flurophore를 포함할 수 있다.

상기와 같은 펩타이드 유래 분자결합자는, 바이오칩으로 사용 가능한 다양한 칩(gold, silver, magnetic bead, silica, graphene, carbon nanotube 등)상에 특이적으로 고정될 수 있다. 다만, 본 발명의 특징은 전술한 프로브와 관련된 사항에 있으며 그와 같은 프로브를 바이오칩으로 제조하는 것은 공지기술에 따라 할 수 있는 부분이다.

본 발명의 뎅기바이러스 조기검출용 펩타이드 유래 분자결합자가 장착된 바이오칩을 이용하여 단백질과 단백질 간의 반응, 단백질과 반응리간드 간의 반응, 목적리간드와 반응단백질 간의 반응 또는 목적리간드와 반응리간드 간의 반응을 검출할 수 있다. 상기 반응리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 생체물질, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있다.

상기 반응단백질은 효소 또는 항체일 수 있다.

또한 상기 목적리간드는 단백질이나 펩타이드와 반응하는 저분자량의 화합물, 핵산, 펩티드, 탄수화물, 앱타머, 지방산 또는 지질일 수 있다.

또한 상기 반응 검출은 표지 혹은 비표지체를 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에 의하면, 바이오패닝을 거쳐 뎅기바이러스 NS1에 고특이적이며 고선택적 결합과 인지가 가능한 펩타이드 유래 분자결합자가 가능해진다.

또한 그를 이용하여 난검출성으로 알려진 뎅기바이러스를 항체대체(antibody-free), 비표지(label-free) 방식으로 간단하게 고효율적(고민감성, 고특이성)으로 검출할 수 있는 바이오센서가 가능해진다.

따라서 본 발명을 통해 기존의 뎅기바이러스 검출용 항체를 대체하고 비표지(label-free) 방식으로 뎅기바이러스를 검출할 수 있는 기술을 제공할 수 있다.

또한, 상기 펩타이드 유래 분자결합자를 이용하여 뎅기바이러스를 정확히 검출할 수 있을 것으로 기대하며 실시간 모니터링이 가능하여 뎅기바이러스 감염환자의 생존율을 향상시킬 수 있을 것으로 보인다.

도 1은 biopanning을 수행한 후 본 발명에 사용하기 위해 펩타이드 유래 분자결합자 후보군들의 전체 발굴결과이다.
도 2는 본 발명에 사용된 펩타이드 유래 분자결합자를 포함하는 박테리오파지 후보군의 타깃단백질에 대한 ELISA assay를 통해 결합력을 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명에 사용된 펩타이드 유래 분자결합자를 포함하는 박테리오파지 후보군의 타깃단백질에 대한 결합력을 전기화학적(cyclic voltammetry, CV) 검출방법을 사용하여 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명에 사용된 펩타이드 유래 분자결합자를 포함하는 박테리오파지 후보군의 타깃단백질에 대한 결합력을 전기화학적(Electrochemical Impedance Spectroscopy) 검출방법을 사용하여 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명에 사용된 펩타이드 유래 분자결합자를 포함하는 박테리오파지 후보군의 타깃단백질에 대한 결합력을 측정하기 위해서 바이오틴을 back-filling처리한 후 전기화학적(Electrochemical Impedance Spectroscopy) 검출방법을 사용하여 분석한 결과이다.

최근 뎅기바이러스를 포함하여 국내 유입이 가능한 고위험군 위해바이러스의 증가로 인하여 국민보건에 위협요인이 증가되고 있어 보다 안전한 생물학적 위해요소를 조기에 제어할 수 있는 검출기술개발이 절실한 실정이다.

이에 본 발명자들은 극미량으로 존재하는 뎅기바이러스를 매우 간단하고 낮은 제조단가로 고효율적으로 검출할 수 있는 새로운 형태의 펩타이드 유래 바이오센서를 개발하여 기존의 뎅기바이러스 분자진단용 항체를 대체할 수 있고 비표지방식으로 새로운 형태의 고감도, 고특이적인 검출기술을 제공할 수 있게 되었다.

실시예 1 : 타깃 단백질 (Dengue virus NS1)

본 발명에서 사용된 타깃 단백질은 Dengue virus NS1로서, Randox life sciences사에서 구입하여 사용하였으며 Thermo scientific사의 EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation Kit을 사용하여 biotinylation 과정을 거친 후 Bradford assay에 의해 농도를 계산하고, 사용 전까지 -80℃ 냉동고에 보관하였다.

실시예 2: M13 박테리오파지 디스플레이를 이용한 Dengue virus NS1에 고특이적 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 유래 분자결합자 발굴

본 발명에서 사용된 박테리오파지 랜덤 펩타이드 라이브러리(Phage display peptide library)는 Ph.D.-12(New England BioLab)로, 이는 M13 박테리오파지의 게놈 중에서 코트 단백질(coat protein)의 일종인 pIII를 생산하는 유전자 말단에 12개의 무작위 아미노산 서열의 펩타이드가 발현되도록 인위적으로 유전자 서열을 삽입한 후, 대장균(E.coli)에 감염시켜 얻은 수억 종 이상의 서로 다른 펩타이드를 발현한 재조합 박테리오파지로 구성되어 있다.

총 3회의 패닝(panning)을 수행하였으며, 패닝에는 streptavidin이 코팅되어 있는 평판(Streptavidin High Binding Capacity Coated 96-Well Plates(Thermo scientific, Cat. No. 15501)을 사용하였다.

먼저, biotinylated NS1 단백질과 M13 박테리오파지를 상온에서 1시간 동안 반응하여 Pre-complex를 형성하도록 한다. 그 다음 streptavidin이 코팅되어 있는 평판을 3회 TBS(트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어준 후, Pre-complex를 microwell에 넣고 상온에서 10분 동안 150 rpm으로 교반하여 주었다. binding되지 않은 박테리오파지는 TBS(트리스 완충 식염수) 중의 0.1% Tween 20으로 씻어주었으며, 최종적으로 NS1에 특이적으로 결합하는 파지는 100 uL의 0.2M Glycin-HCl(pH 2.2) 용액에 용출되었고, neutralization을 위해 15 uL의 Tris-HCl(pH 9.0)이 첨가되었다. 상기의 과정을 통하여 NS1에 잘 결합하는 2개의 박테리오파지 후보군을 1차적으로 선별하였고, DNA sequencing을 통해 아미노산서열을 확인하였다(표 1, 표 2).

실시예 3: Dengue virus NS1에 고특이적 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 프로브를 포함하고 있는 박테리오파지 총 5개의 후보군을 이용하여 ELISA assay를 통한 결합력 측정

3회 biopanning을 거쳐서 선별된 5개의 박테리오파지 후보군을 ELISA 실험에 이용하기 위해 Amplification을 진행하였다. 각각의 파지 stock을 미리 배양해둔 E.coli ER2738과 함께 LB 배지에 넣은 후 37℃, 150 rpm에서 4-5시간 동안 배양하였다.

12,000g로 4℃에서 10분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수한 후 20% PEG/2.5M NaCl을 첨가하여 4℃에서 16시간동안 방치하였다. 그 다음 다시 12,000g로 4℃에서 15분 동안 원심 분리하여 얻어진 침전물은 TBS (트리스 완충 식염수)에 녹인 후 다시 14,000rpm로 4℃에 5분동안 원심 분리하였다. 분리된 상층액을 회수한 후 20% PEG/2.5M NaCl을 첨가하여 얼음에 1시간동안 방치하였고 다시 14,000rpm로 4℃에 10분 동안 원심 분리하였다. 여기서 얻어진 침전물을 TBS (트리스 완충 식염수)에 녹인 후 파지 Titration을 실시하여 각각의 파지의 농도 (PFU/mL: Plaque forming units/mL)를 계산하였다.

각각 5개의 파지와 Dengue virus NS1의 결합력을 비교하기 위하여 다음과 같이 ELISA를 진행하였다. 먼저, Dengue virus NS1 100μL (Dengue virus NS1 농도: 50μg/mL (1.04μM))을 평판에 4℃에서 16시간 동안 150 rpm으로 코팅하였다. 그 다음 타깃 단백질을 제거하고 Blocking 용액(5% BSA in 0.1M NaHCO₃, pH 8.6) 200 μL를 첨가해 4℃에서 1시간 동안 타깃 단백질이 붙지 않은 공간을 채웠다. 그 후 TBS (트리스 완충 식염수)에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST로 6회 씻어준 후, 각각의 5개 파지를 1×10¹¹ PFU/mL의 농도로 첨가해 상온에서 1시간 150rpm으로 교반하여 주었다. 그 다음 다시 TBS (트리스 완충 식염수)에 0.1% Tween 20을 첨가한 TBST로 6회 씻어준 후, M13-HRP 항체와 ABTS를 이용하여 405 nm에서 OD 값을 측정 비교하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이 R2 #9와 R2 #10에서 높은 결합력을 가지는 것으로 보여졌으며 조금 더 정확한 결과를 얻기 위해 전기화학적인 분석법을 실시하였다.

실시예 4 : Dengue virus NS1에 고특이적 고선택적 결합이 가능한 신규 펩타이드 프로브를 포함하고 있는 박테리오파지 총 5개의 후보군을 이용하여 전기화학적 검출방법인 CV, EIS를 통한 결합력 측정

CHI 660E (Electrochemical Workstation, Ch Instruments Inc, 미국)장비를 사용하여 분자결합자의 타깃 단백질에 대한 결합능을 측정하였다. 분석은 상온에서 진행하였으며, 1회용 골드칩을 사용하였다.

CV(Cyclic Voltammetry, 전류순환법)는 전해질에 산화/환원 반응이 가능한 화학정이 존재하는 상태에서 작업전극에 전압을 순화전휘로 가하면서 이에 따른 전류의 값에 의해서 전극표면 근처에서 일어나는 물질의 전기화학 반응의 열역학 및 속도론적인 파라미터를 구하는 분석방법이고 EIS(Electrochemical Impedance Spectroscopy, 전기화학적 임피던스 분광법)은 교류파를 이용하여 주파수(Frequency)에 따른 진폭과 위상의 변화를 측정한 수 임피던스를 계산하는 방법이다.

먼저 아무것도 처리하지 않은 골드칩에 Electrolyte 용액(

+

in

(pH 7.2))을 넣고 상대전극(Counter Electrode), 기준전극(Reference Electrode), 작업전극(Working Electrode)를 이용하여 CV, EIS를 측정한다.

그 후 먼저 골드와 시스테인 결합을 할 수 있는 50μL의 Streptaivdin(농도: 100μg/ml)을 골드칩과 상온에서 15분 동안 반응시키고 DW (Deionized water)로 6회 씻어준 뒤 Electrolyte 용액을 넣고 CV, EIS를 측정하였다(도 3, 도 4, 도 5). 그 다음 Streptavidin과 특이적으로 결합을 하는 biotin이 붙은 50μL의 biotinylated Dengue virus NS1 (농도:5μg/mL)을 상온에서 15분 동안 반응시켜주고 DW로 6회 씻어준 뒤 Electrolyte 용액을 넣고 CV, EIS를 측정하였고 50μL의 biotin(농도: 2μM)으로 상온에서 15분동안 Blocking해준 뒤 다시 DW로 6회 씻어주고 Electrolyte 용액을 넣고 CV, EIS를 측정하였다. 마지막으로 앞 과정과 같이 처리된 골드칩에 선별된 박테리오파지 후보군 각각 5개(농도: 1×10¹¹ PFU/mL)를 50μL첨가한 후 상온에서 15분 동안 반응시키고 DW로 6번 씻어준 뒤 Electrolyte 용액을 넣어 CV, EIS를 이용하여 결합능을 측정하였다.

도 3은 Dengue virus NS1에 파지 후보군 각각 5개의 결합능을 전기화학적 신호변화로 측정한 것이다. 도 3에 나타난 바와 같이 다른 후보군들에 비해서 R2#10 펩타이드를 포함하고 있는 박테리오파지 샘플의 current값의 폭이 대폭 감소된 것을 확인할 수 있으며, 이로부터 Dengue virus NS1 타깃단백질에 대해 R2#10 펩타이드를 함유한 박테리오파지의 결합력이 높은 것을 알 수 있다.

또한, 도 4에 나타난 바와 같이 총 5개의 펩타이드 유래 분자결합자를 포함하는 박테리오파지샘플을 EIS 분석결과 역시 R2#10 펩타이드 유래 분자결합자를 포함하는 박테리오파지 후보군의 impedance값이 크게 증가한 것으로 나타나며, 이는 R2#10 분자결합자가 타깃단백질인 NS1에 대해서 높은 고특이적이며 고선택적인 결합이 가능함을 보여주고 있다.

덧붙여, 도 5에 나타난 EIS분석결과처럼 다른 후부군들에 비해서 R2#10 펩타이드 유래 분자결합자를 포함하는 박테리오파지가 타깃단백질인 NS1에 고특이적이며 고선택적인 결합이 가능함을 보여주고 있다. 이 실험에서는 먼저, 타깃단백질인 NS1을 골드칩 표면 위에 고정화하고 streptavidin-biotin 특이적 상호작용을 통해서 결합을 유도하고 biotin을 골드칩 표면에 back-filling을 실시한 후 펩타이드 유래 분자결합자를 포함하는 후보군들을 처리하여 반응결과를 모니터링한 것이다. 이 분석결과에서 나타난 것은, R2#10 펩타이드를 포함하고 있는 박테리오파지를 제외한 4개의 후보군들은 박테리오파지를 처리한 후에 오히려 impedance값이 감소되었다는 점이다. 이는 R2#10 펩타이드를 포함하고 있는 박테리오파지가 타깃단백질에 고선택적 고특이적 결합이 가능함을 보여주고 있는 결과이다.

<110> Industry-academic cooperation foundation Daegu Hanny University <120> The dengue virus detection chip using peptide-based molecular binder and the manufacturing method <130> ula-1701 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 1 Ile Pro Leu Leu Asn Pro Gly Ser Met Gln Leu Ser 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 2 Ser Pro Pro Trp Leu Pro Val Met Pro Val Arg Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 3 Trp His Tyr Asn Trp Gln Asp Val Ser Asp Arg Gln 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 4 His Ser Tyr Thr Gln Thr Ser Leu Trp Met Lys Val 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 5 Glu His Asp Arg Met His Ala Tyr Tyr Leu Thr Arg 1 5 10

Claims

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목적단백질 또는 목적펩타이드를 타깃으로 하는 분자결합자 혹은 그 분자결합자를 포함하는 수용성 분획을 금속칩에 위치 특이적으로 고정시키는 단계를 포함하되, 상기 분자결합자는 서열목록 4의 아미노산 서열(HSYTQTSLWMKV)을 포함하는 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩의 제작방법.
제3항에 있어서,
펩타이드 유래 분자결합자는 D형, L형, 펩토이드 모노머를 포함한 펩타이드 모방체 또는 비천연 아미노산 중의 어느 하나인 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩의 제작방법.
제3항에 있어서,
펩타이드 유래 분자결합자는 이중체(dimer), 삼중체(trimer) 또는 다중체(multimer)인 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩의 제작방법.
제3항에 있어서,
분자결합자는 목적펩티드의 N말단, C말단 또는 N-C중간에 시스테인을 포함하는 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩의 제작방법.
제3항에 있어서,
분자결합자는 C말단 혹은 N말단에 링크(linker)를 포함하는 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩의 제작방법.
제3항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩.
서열목록 4의 아미노산 서열(HSYTQTSLWMKV)을 포함하는 서열로 구성되는 분자결합자를 포함하는 것을 특징으로 하는 뎅기바이러스 조기검출용 바이오칩.
제9항의 뎅기 바이러스 조기검출용 바이오칩을 이용하여 펩타이드-단백질, 단백질-항체, 단백질-탄수화물, 단백질-단백질 및 단백질-세포간의 상호작용으로 구성된 군에서 선택된 상호작용을 검출하는 뎅기바이러스 검출방법.