[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN112415195A - 检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用 - Google Patents

检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112415195A
CN112415195A CN202011477766.0A CN202011477766A CN112415195A CN 112415195 A CN112415195 A CN 112415195A CN 202011477766 A CN202011477766 A CN 202011477766A CN 112415195 A CN112415195 A CN 112415195A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
aptamer
new coronavirus
leu
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
CN202011477766.0A
Other languages
English (en)
Inventor
刘为勇
张祺
刘芳
刘映乐
屈三甫
梅益
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University WHU
Original Assignee
Wuhan University WHU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University WHU filed Critical Wuhan University WHU
Priority to CN202011477766.0A priority Critical patent/CN112415195A/zh
Publication of CN112415195A publication Critical patent/CN112415195A/zh
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种针对新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白的核酸适配体检测试剂盒，还提供了试剂盒的制备方法和应用。此试剂盒检测时具有操作简单、反应迅速、准确性高和灵敏度高的特点，可结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测装置，就可以实现对于两种病毒的精确检测。试剂盒灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以同时检测两种病毒、有着良好的市场前景。

Description

检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用
技术领域
本申请涉及生物体外检测，具体地说，本发明涉及同时检测新冠病毒双靶点的试剂盒，制备试剂盒的方法，以及试剂盒在同时检测新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白样本中的应用。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV、SARS-CoV-2)是一种可以感染人的冠状病毒。冠状病毒在系统分类上属套式病毒目(Nidovirales)冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)。冠状病毒属的病毒是具囊膜(envelope)、基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。SARS-CoV-2的人际传播主要通过与感染者的密切接触发生，主要是通过呼吸道飞沫和接触受污染物体。人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前新冠病毒的防控形势依旧严峻，对于新冠病毒的检测主要通过病毒核酸检测，同时对于疑似患者的抗体检测可以对诊断起到辅助作用，确诊病例需有病原学证据阳性结果(实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；或病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源)。
对于新冠病毒样品的检测在临床检测以及实验研究中十分重要。现有的技术中对于病毒感染或者病毒蛋白的检测多采用特异性的抗体进行识别，制备比较复杂，步骤比较繁琐，成本较高，在大规模推广中有一定的缺陷。核酸适配体是一段单链核酸(一般大小在20～60个碱基左右)，能通过折叠形成特定的三维结构并与相对应的靶分子进行高亲和力、高特异性的结合。核酸适配体可以通过模拟自然进化过程的人工筛选技术-指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)筛选得到，是一种具有识别功能的新型核酸分子。利用SELEX技术可以从随机单链核酸序列库中筛选出特异性的与靶物质高度亲和的核酸适配体，该技术已经成功的运用于许多靶物质的筛选，包括金属离子、有机染料、药物、蛋白质、氨基酸以及各种细胞因子等。该技术具有库容量大、适应范围广泛、分辨率高、亲和力高，筛选过程相对简便、快速、经济，实用性高等特点。适配体对应靶标物质的高特异性和高亲和性的特点与抗体的功能类似，但是适配子的靶标范围更加的广泛，可以很好地运用于医学检测、诊断和治疗等多个方面。
核酸适配体具有特异性和高亲和力的原因是单链核酸在遇到靶标分子时可以形成例如口袋、发卡、G-四聚体等独特的三维结构，这些结构在结合靶标分子时的原理与抗体特异性识别相应抗原决定簇的原理类似，例如通过氢键、疏水结构、离子键等与靶标分子特异性的结合。基于适配体具有较高特异性地识别病原微生物或者病变细胞的生物学特性，核酸适配体能被广泛的应用于检测技术以及生物传感器的构建，能够实现对于病原体或者疾病的精准诊断。
目前市面上针对新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白的抗原检测试剂盒都是单通道检测，也就是一次反应只能检测一种抗原，无法做到同一个反应中对两种或两种以上病毒抗原的检测。而且市售抗原检测试剂盒用的是抗体检测，抗体作为一种蛋白成分，具有不易表达合成、易降解、存在非特异性免疫原性等缺点。婴幼儿腹泻仅是一种症状和表现形式，其病原体有时是单一的，但也有很大比例是混合感染，快速诊断显得尤为重要。目前市面上还没有此类检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测新冠病毒感染的试剂盒，使用该试剂盒可同时检测样本中是否存在新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白，灵敏度高，双通道同时快速检测。
本发明的再一个目的是提供制备试剂盒的方法
本发明的第三个目的是提供试剂盒在检测新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白样本中的应用。
本发明公开了一种快速检测新冠病毒双靶点的试剂盒，包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，其特征是，核酸适配体含有新冠病毒S蛋白的核酸适配体和新冠病毒N蛋白的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。
本发明还公开了核酸适配体的核苷酸序列，本发明中新冠病毒S蛋白的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，新冠病毒N蛋白的核酸适配体具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
本发明公开的检测新冠病毒双靶点的试剂盒中的组分A)固定样本溶液的蛋白包被板可采用普通的ELISA板包初上阳性或待检测样品，直接使用市面上销售的具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板。
本发明继续公开了试剂盒的组成，其中B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mMNa2CO3,pH 9.3-pH 9.9组成的，其中C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，其中D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，其中E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的。
在一个优先方案中，本发明还公开了A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.6组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.4组成的，D)漂洗液是由136mMNaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.4组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH8.0组成的。
本发明公开的核酸适配体序列上接有功能基团，功能基团为各种生物素标记物、发光标记物和酶标标记物，发光标记物选自FAM、VIC荧光基团中的一种，两种适配体的荧光基团相异。
本发明还公开了制备检测新冠病毒双靶点的试剂盒方法，新冠病毒S蛋白的核酸适配体以新冠病毒S蛋白靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.3所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；新冠病毒N蛋白的核酸适配体以新冠病毒N蛋白靶蛋白抗原表位具有如SEQID No.4所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；再联接上的荧光基团，但要求两个核酸适配体连接的荧光基团相异，以便观察和识别。
本发明还公开了检测的试剂盒在同时检测新冠病毒双靶点中的应用
为了实现本发明中，申请人通过下列方式制备检测新冠病毒双靶点的试剂盒。
1)确定待测病毒的靶蛋白抗原表位
通过文献查阅与生物信息学分析，本发明人确定了新冠病毒S蛋白靶蛋白抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示以及新冠病毒N蛋白靶蛋白抗原表位的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
2)筛选特异性结合的核酸适配体序列
体外合成一个含有39个随机序列的单链DNA文库；以新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白靶蛋白为筛选条件，采用SELEX技术筛选出具有高特异性、高亲和力的DNA适配体序列，新冠病毒S蛋白的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，新冠病毒N蛋白的核酸适配体具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
3)合成带有荧光基团标记的核酸适配体
直接在常规生物技术服务公司合成筛选得到的核酸适配体序列，合成时以共价键的形式在核酸适配体5’端连上荧光基团。检测新冠病毒S蛋白的核酸适配体具有如SEQ IDNo.1所示序列，所带荧光基团为FAM；检测新冠病毒N蛋白的核酸适配体具有如SEQ ID No.2所示序列，所带荧光基团为VIC。
4)制备试剂盒
试剂盒包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，核酸适配体含有新冠病毒S蛋白的核酸适配体和新冠病毒N蛋白的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。
试剂盒中试剂组分配方如下：B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH9.3-pH 9.9组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的，F)核酸适配体由公司合成粉剂，溶于TE缓冲液中，工作浓度为200nM。
本发明通过SELEX技术筛选到的针对新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白的核酸适配体对相应的靶病毒具有较高的特异性和亲和力，并且具有无免疫原性、分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒等优点。利用本发明筛选到的核酸适配体进行的检测方法对相应的病毒进行检测时具有操作简单、反应迅速、准确性高和灵敏度高的特点，利用该核酸适配体构建分子探针或者检测试剂盒，并结合酶标仪、流式细胞仪、荧光显微镜等检测装置，就可以实现对于两种病毒的精确检测。同时该试剂盒有较宽的检测范围，便于临床实用。
本发明的意义在于：试剂盒灵敏度较高、特异性好、测量范围宽、操作简单、可以同时检测两种病毒、适合大规模推广，有着良好的市场前景。
本发明的优点是
1.在新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白感染病人唾液样本和健康人唾液样本的检测中，新冠病毒S蛋白感染病人的阳性检出率，即灵敏度为96.3％；新冠病毒N蛋白感染病人的阳性检出率，即灵敏度为96.8％；健康人群检测的阳性检出率为0％。
2.双通道同时检测两种核酸适配体标记上两种不同发射波段的荧光基团，能在同一个反应体系中同时完成两种病原体检测，相对于市面上普通的免疫检测试剂盒(如胶体金试剂盒)来说，缩短了反应时间，节省了反应试剂与待测样本用量。
3.独特的核酸适配体序列本发明所用核酸适配体序列为通过SELEX技术筛选所得，具有完全的独创性。
本试剂盒采用核酸适配体作为检测物，能有效克服以上问题，它具有分子小、可进行修饰、合成容易、不易降解、无毒、无免疫原性等优点。通过在不同核酸适配体上标记不同荧光基团，能做到在同意反应中对两种及两种以上并病原的同时检测。
附图说明
图1是本发明核酸适配体中新冠病毒S蛋白-aptamer核苷酸序列的二级结构图；
图2是本发明核酸适配体中新冠病毒N蛋白-aptamer核苷酸序列的二级结构图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例1确定新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白的靶蛋白抗原表位
根据文献查阅与生物信息学分析，确定待测适合作为核酸适配体检测靶点的病毒蛋白以及病毒蛋白上的具体抗原表位区域。
A)选择新型冠状病毒S蛋白全长作为适配体筛选靶蛋白，具有如SEQ ID No.3所示序列：
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ IDNo.3)
B)选择新型冠状病毒N蛋白全长作为适配体筛选靶蛋白，具有如SEQ ID No.4所示序列：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA(SEQ ID No.4)
C)根据已确定的氨基酸序列，直接在公司进行核苷酸序列的合成以及原核密码子优化，将合成的基因片段插入原核表达载体pET32a上。诱导表达出相应用于适配体筛选的两种病毒的靶蛋白。
实施例2构建适配体文库与引物设计
A)通过常规生物技术服务公司的基因合成服务，体外合成含有39个随机序列的单链DNA文库，其核苷酸序列如下
GATGACATTGCACAAGTCAGG-(N39)-GAGTGAATCCTGCTGTTCGA
B)针对核酸适配体5’端固定序列，设计合成的上游引物P1，具有如SEQ ID No.5所示序列：
5’-GATGACATTGCACAAGTCAGG-3’(SEQ ID No.5)
C)针对核酸适配体3’端固定序列，设计合成的下游引物P2，具有如SEQ ID No.6所示序列，同时在引物5’端连接有生物素基团：5’-biotin-TCGAACAGCAGGATTCACTC-3’(SEQID No.6)
实施例3利用SELEX筛选技术，从文库中筛选得到能有效结合病毒靶蛋白的核酸适配体序列
A)将10nmol的初始单链DNA随机文库溶解在500μl的PBS溶液中，用92℃的恒温水浴锅水浴5min，之后迅速的插入冰中冰浴10min，之后将经过处理的初始单链DNA随机文库与相应病毒靶蛋白在冰上孵育1h，再加入Ni-NTA Magnetic Agarose Beads，继续孵育1h。孵育完成后，使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤Beads。最后用10ml预冷的PBS重悬Beads，使之充分吹打混匀，之后92℃恒温水浴10min，13000g离心，收集上清，即为第一轮筛选后特异性识别病毒靶蛋白的单链DNA文库。
B)对筛选后的单链DNA文库进行PCR扩增，以制备次级文库。PCR反应的体系如下：Premix Tap Mix 25μl，筛选后的单链DNA文库8μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，ddH2O12μl，总体积为50μl。按照如下的程序进行PCR循环扩增：95℃变性3min，经过35个循环扩增程序为95℃30s，55℃30s，72℃30s，最终的延伸为72℃10min，最后维持在16℃终止反应。对经过PCR扩增后的文库进行琼脂糖凝胶回收以得到纯净的文库片段。
C)对扩增得到的次级文库进行进一步的制备。将扩增后的双链DNA文库与100μl链酶亲和素标记的磁珠常温孵育20min，利用双链DNA文库上的生物素与链酶亲和素的亲和作用将双链DNA文库结合到磁珠的表面，之后使用磁性分离器吸附，去除上清，用2ml的PBS洗涤磁珠。加入终浓度为200mM的NaOH溶液常温反应10min使得双链DNA文库变性变成单链，其中带有生物素标记的一条链会结合在磁珠上，不带生物素标记的那一条链会脱离到上清液中。收集上清液，用脱盐柱除去NaOH，最后加入500μl的PBS，收集到的溶液即为下一轮筛选所需要用到的单链DNA文库。
D)重复上述的阳性筛选过程、PCR扩增以及次级单链DNA文库的制备过程15次，最后筛选得到的单链DNA文库对于病毒靶蛋白的识别能力最强。将所得到的单链DNA文库进行克隆测序后，最终得到了本发明中所筛选出来的可用于检测新冠病毒S蛋白、新冠病毒N蛋白感染的核酸适配体，其DNA序列分别为：
新型冠状病毒S蛋白-aptamer
GATGACATTGCACAAGTCAGGGAGGTAATGGTCGGTCATGTAGGACCGGGACGACAGACGGAGTGAATCCTGCTGTTCGA
新型冠状病毒N蛋白-aptamer
GATGACATTGCACAAGTCAGGAGACTTGCTTTTTAATACAAGCTCGGCATAAACAGCTCTGAGTGAATCCTGCTGTTCGA
E)为了能在一个反应体系内同时进行两种反应产物的检测，给每种适配体5’端标记上不同的荧光基团(共价键结合的形式，直接在常规生物技术服务公司合成)，最终的试剂盒里的适配体信息如下：
新冠病毒S蛋白-aptamer，具有如SEQ ID No.1所示序列：
5’-FAM-
GATGACATTGCACAAGTCAGGGAGGTAATGGTCGGTCATGTAGGACCGGGACGACAGACGGAGTGAATCCTGCTGTTCGA-3’(SEQ ID No.1)
新冠病毒N蛋白-aptamer，具有如SEQ ID No.2所示序列：
5’-VIC-
GATGACATTGCACAAGTCAGGAGACTTGCTTTTTAATACAAGCTCGGCATAAACAGCTCTGAGTGAATCCTGCTGTTCGA-3’(SEQ ID No.2)
实施例4适配体的验证
A)通过结构预测软件RNA Structure Program来分析预测筛选出来的核酸适配体的二级结构，结果显示所有的核酸适配体都可以形成特殊的茎环结构和发卡结构。新冠病毒S蛋白-aptamer可形成如图1所示的二级结构，新冠病毒N蛋白-aptamer可形成如图2所示的二级结构。
B)使用ForteBio Octet RED96相互作用分析仪检测核酸适配体与靶蛋白的结合力，所得结果如下：
适配体 与靶蛋白的解离常数Kd(nM)
新冠病毒S蛋白-aptamer 8.1
新冠病毒N蛋白-aptamer 8.3
PBS对照 无结合
C)分别采用人血白蛋白、免疫血清球蛋白、唾液淀粉酶蛋白与2种核酸适配体进行特异性检测，经过结合实验发现，2种适配体都不与这些蛋白结合。用2种病毒的靶蛋白对2种适配体进行交叉反应检测，实验结果显示，2种适配体只与对应的靶蛋白结合。
D)2种适配体各取0.2μg，分别放置于常温血清、水溶液中。4周后用RT-PCR检测，发现放置的核酸适配体结构稳定，没有发生降解。
E)用新型冠状病毒感染敏感宿主细胞，同时设置没有感染的阴性对照组。感染36h后用胰酶消化细胞，离心得到细胞沉淀并去除上清液，再用PBS重悬。对细胞进行固定与透化处理，再将对应新型冠状病毒的带有荧光基团标记的核酸适配体分别与感染病毒的细胞悬液以及未感染对照组细胞悬液混合处理1h，通过流式细胞仪分析计算。不同的核酸适配体标记了不同的荧光基团，可以在流式细胞仪中明显区分，结果显示感染了新型冠状病毒的细胞样品所对应的核酸适配体标记荧光数值显著升高，说明筛选得到的适配体可用作病毒感染的检测。
实施例5，试剂盒的配方
本试剂盒包含以下配方：
1)用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板
2)蛋白包被液
3)封闭液
4)漂洗液
5)样本前处理液
6)带有荧光基团标记的核酸适配体
实施例6，试剂盒的制备
本试剂盒所有配方的制备信息如下：
1)用于固定样本溶液的96孔蛋白包被板直接使用市面上销售的具有蛋白吸附能力的ELISA酶标板
2)蛋白包被液
属于常规分子检测试剂，配方为35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.3-pH 9.9，使用双蒸水配置。
3)封闭液
属于常规分子检测试剂，配方为136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7，使用双蒸水配置。
4)漂洗液
属于常规分子检测试剂，配方为136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mMNa2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7，使用双蒸水配置。
5)样本前处理液
属于常规分子检测试剂，配方为150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2，使用双蒸水配置。
6)带有荧光基团标记的核酸适配体
通过常规生物技术服务公司的基因合成服务，直接合成，用TE缓冲液溶解并配置到工作浓度(200nM)。
实施例7，试剂盒的应用
取20份已确认新冠病毒S蛋白阳性的样本、20份已确认新冠病毒N蛋白阳性的样本与20份已确认无新冠病毒S蛋白、无新冠病毒N蛋白的对照样本。由于目前市场上没有同时检测新冠病毒S蛋白与新冠病毒N蛋白的抗原检测试剂盒，所以取市售某品牌新冠病毒S蛋白抗原检测试剂盒与市售某品牌新冠病毒N蛋白抗原检测试剂盒与我们的核酸适配体检测试剂盒同时做平行实验。实验结果如下：
Figure BDA0002836161570000111
序列表
<110> 武汉大学
<120> 检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gatgacattg cacaagtcag ggaggtaatg gtcggtcatg taggaccggg acgacagacg 60
gagtgaatcc tgctgttcga 80
<210> 2
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gatgacattg cacaagtcag gagacttgct ttttaataca agctcggcat aaacagctct 60
gagtgaatcc tgctgttcga 80
<210> 3
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 4
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatgacattg cacaagtcag g 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcgaacagca ggattcactc 20

Claims (7)

1.一种快速检测新冠病毒双靶点的试剂盒，包括以下组分：A)固定样本溶液的蛋白包被板，B)蛋白包被液，C)封闭液，D)漂洗液，E)样本前处理液，和F)带有荧光基团标记的核酸适配体，其特征是，核酸适配体含有新冠病毒S蛋白的核酸适配体和新冠病毒N蛋白的核酸适配体，两种适配体的荧光基团相异。
2.根据权利要求1所述的检测新冠病毒双靶点的试剂盒，其特征在于新冠病毒S蛋白的核酸适配体具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，新冠病毒N蛋白的核酸适配体具有SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的检测新冠病毒双靶点的试剂盒，其特征在于B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.3-pH 9.9组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mMKCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.1-pH 7.7组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.1-pH 7.7组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH7.8-pH8.2组成的。
4.根据权利要求3所述的检测新冠病毒双靶点的试剂盒，其特征在于B)蛋白包被液是由35mM NaHCO3，15mM Na2CO3,pH 9.6组成的，C)封闭液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mMKH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,1％BSA,pH 7.4组成的，D)漂洗液是由136mM NaCl,2.6mM KCl,2mM KH2PO4,8mM Na2HPO4,0.05％Tween-20,pH 7.4组成的，E)样本前处理液是由150mM NaCl,1％Triton X-100,50mM Tris,pH8.0组成的。
5.根据权利要求1所述的检测新冠病毒双靶点的试剂盒，其特征在于核酸适配体序列上接有功能基团，功能基团为各种生物素标记物、发光标记物和酶标标记物，发光标记物选自FAM、VIC荧光基团中的一种，两种适配体的荧光基团相异。功能基团通过共价键的方式连接到核酸适配体的5’端。
6.一种制备权利要求1中检测新冠病毒双靶点的试剂盒，其特征是，新冠病毒S蛋白的核酸适配体以新冠病毒S蛋白靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.3所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；新冠病毒N蛋白的核酸适配体以新冠病毒N蛋白靶蛋白抗原表位具有如SEQ ID No.4所示序列氨基酸，通过SELEX技术筛选所得；再将荧光基团以共价键的形式连接到核酸适配体的5’端。
7.权利要求1中所述检测的试剂盒在同时检测新冠病毒双靶点中的应用。
CN202011477766.0A 2020-12-15 2020-12-15 检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用 Withdrawn CN112415195A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011477766.0A CN112415195A (zh) 2020-12-15 2020-12-15 检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011477766.0A CN112415195A (zh) 2020-12-15 2020-12-15 检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112415195A true CN112415195A (zh) 2021-02-26

Family

ID=74775106

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011477766.0A Withdrawn CN112415195A (zh) 2020-12-15 2020-12-15 检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112415195A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113122542A (zh) * 2021-03-17 2021-07-16 北京理工大学 一组2019-nCoV S1蛋白的ssDNA适配体、筛选方法及应用
CN114410640A (zh) * 2022-02-25 2022-04-29 世通兰达(深圳)生物科技发展有限公司 一种用于检测麻疹病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN116286830A (zh) * 2022-12-30 2023-06-23 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种核酸适配体

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109628457A (zh) * 2019-02-03 2019-04-16 淮海工学院 单链dna核酸适配体及其筛选方法与用途
CN111693712A (zh) * 2020-04-02 2020-09-22 苏州大学 一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法
CN111748558A (zh) * 2020-06-17 2020-10-09 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司 结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用
CN111808989A (zh) * 2020-06-18 2020-10-23 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种冠状病毒/流感病毒/鼻病毒核酸联合检测试剂盒及使用方法
CN111849994A (zh) * 2020-03-31 2020-10-30 厦门大学 SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体及其应用
CN111850174A (zh) * 2020-08-07 2020-10-30 宜明(苏州)细胞生物科技有限公司 一种检测2019-nCov的CRISPR试剂及其用途
CN111896734A (zh) * 2020-05-29 2020-11-06 湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司 2019-nCoV双靶点抗体检测微球复合体组合、制备方法、试剂盒及试剂盒使用方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109628457A (zh) * 2019-02-03 2019-04-16 淮海工学院 单链dna核酸适配体及其筛选方法与用途
CN111849994A (zh) * 2020-03-31 2020-10-30 厦门大学 SARS-CoV-2 S蛋白或RBD蛋白的核酸适配体及其应用
CN111693712A (zh) * 2020-04-02 2020-09-22 苏州大学 一种采用核酸适配体检测新冠病毒SARS-CoV-2 N蛋白的方法
CN111896734A (zh) * 2020-05-29 2020-11-06 湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司 2019-nCoV双靶点抗体检测微球复合体组合、制备方法、试剂盒及试剂盒使用方法
CN111748558A (zh) * 2020-06-17 2020-10-09 安徽省昂普拓迈生物科技有限责任公司 结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的核衣壳蛋白的核酸适配体及其应用
CN111808989A (zh) * 2020-06-18 2020-10-23 重庆浦洛通基因医学研究院有限公司 一种冠状病毒/流感病毒/鼻病毒核酸联合检测试剂盒及使用方法
CN111850174A (zh) * 2020-08-07 2020-10-30 宜明(苏州)细胞生物科技有限公司 一种检测2019-nCov的CRISPR试剂及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MATTHEW D. MOORE ET AL.: "Generation and characterization of nucleic acid aptamers targeting the capsid P domain of a human norovirus GII.4 strain", 《JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113122542A (zh) * 2021-03-17 2021-07-16 北京理工大学 一组2019-nCoV S1蛋白的ssDNA适配体、筛选方法及应用
CN114410640A (zh) * 2022-02-25 2022-04-29 世通兰达(深圳)生物科技发展有限公司 一种用于检测麻疹病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN114410640B (zh) * 2022-02-25 2023-07-11 世通兰达(深圳)生物科技发展有限公司 一种用于检测麻疹病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN116286830A (zh) * 2022-12-30 2023-06-23 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种核酸适配体

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11293918B2 (en) Method and kit for simultaneous detection of multi target molecules using magnetic bead-aptamer conjugate
CN111978378B (zh) SARS-CoV-2抗原多肽及其应用
CN112415195A (zh) 检测新型冠状病毒双靶点的试剂盒及其应用
CN112415205A (zh) 检测eb病毒/hcmv的试剂盒及其应用
CN112941078B (zh) 一种检测新冠病毒SARS-CoV-2 S1蛋白的核酸适体、筛选方法及其用途
CN111574631A (zh) 针对硫氧还蛋白的抗体、缀合物和检测试剂盒
CN114957454B (zh) 一种抗csfv e2蛋白的纳米抗体、融合蛋白及其制备方法和应用
CN113447658B (zh) 一种检测抗过氧化物还原酶-1-IgG抗体的试剂盒
CN112462061A (zh) 检测h1n1、rsv-a和adv3的试剂盒及其应用
Pang et al. Bioscreening specific peptide-expressing phage and its application in sensitive dual-mode immunoassay of SARS-CoV-2 spike antigen
CN112375754B (zh) 基于人血管紧张素转化酶2的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2亲和多肽
CN117025613A (zh) Eb病毒的核酸适配体检测试剂盒
CN108948173B (zh) 一种瓜氨酸修饰肽及其应用
CN114152747B (zh) 生物标志物在区分活动性与潜伏性结核感染中的用途
CN114410640B (zh) 一种用于检测麻疹病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN114720700A (zh) 检测抗细胞骨架相关蛋白4-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤试剂盒的应用
CN114994308A (zh) 一种检测抗Desmoglein 1-IgG抗体的试剂盒
CN114910649A (zh) 检测抗α-烯醇化酶-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用
CN114895023A (zh) 检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用
CN112526130A (zh) 检测轮状病毒/诺如病毒的试剂盒及其应用
CN114410641B (zh) 一种用于检测风疹病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN114966045A (zh) 检测抗肌球蛋白轻链1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用
CN114910650A (zh) 检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用
CN114381460B (zh) 一种用于检测腮腺炎病毒的核酸适配体、试剂盒及应用
CN114317546B (zh) 一种用于检测evd68病毒的核酸适配体、试剂盒及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WW01 Invention patent application withdrawn after publication
WW01 Invention patent application withdrawn after publication

Application publication date: 20210226