KR101877010B1 - super-repressor-IκB 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 super-repressor-IκB 단백질을 포함하는 엑소솜(super-repressor-IκB:EXPLOR)을 대량으로 제조하는 방법, 상기 엑소솜 제조에 사용될 수 있는 엑소솜 제조용 벡터, 상기 방법으로 제조된 super-repressor-IκB 단백질을 포함하는 엑소솜 및 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 super-repressor-IκB 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조방법을 이용하면, super-repressor-IκB 단백질을 포함하는 엑소솜을 높은 수율로 제조할 수 있으므로, 상기 엑소솜을 이용하여 염증성 질환의 치료에 널리 활용될 수 있다.

Description

super-repressor-IκB 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Process for preparing exosome loading super-repressor-IκB protein, and pharmaceutical composition for use in preventing or treating inflammatory diseases containing the same as an active ingredient}

본 발명은 광특이적 결합 단백질을 이용하여 super-repressor-IκB 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조방법, 및 상기 제조 방법에 의해 제조된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

인체는 대략 200여 종류 100조개의 세포로 이루어져 있고, 세포 내에서 다양한 단백질의 작용에 의해 생리 활성이 조절되어 생명을 유지하고 있다.

세포는 인지질로 구성된 이중막 구조의 세포막으로 둘러 싸여져 있으며, 세포막은 이물질의 세포 내로의 유입을 막고 있다. 지금까지 개발된 단백질 치료제들 역시 대부분 세포막을 통과하여 세포질 내로 들어가지 못하고, 세포 외부에서 작용하거나 혹은 세포막에 있는 수용체(receptor)에 작용하여 세포 내로 신호를 전달하는 방법으로 생리 효과를 나타내고 있다.

세포질에는 수 많은 단백질들이 존재하고, 이들은 서로 작용하여 생리활성을 조절하고 있는 바, 단백질 치료제를 직접 세포 안으로 즉, 세포질로 넣을 수 있다면, 세포의 활성을 좀 더 효과적으로 제어할 수 있을 것이다.

최근 목적 단백질을 세포막을 통과하여 세포 내로 직접 유입시키는 방법에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 세포막을 통과하는 펩타이드인 세포막 통과 도메인(Protein Transduction Domains, PTDs)과 목적 단백질의 재조합 단백질(recombinant protein)을 만들어 투여하면, 세포막을 통과하여 세포질 내로 들어갈 수 있다(도 1). 세포막 통과 도메인(PTD)에는 HIV-1 TAT, HSV VP22, Antp, dfTAT, Hph-1 등이 있으며, 이들과 목적 단백질을 결합시킨 융합 단백질은 재조합 단백질 형태로 생산하고 분리하는 과정이 필요하며, 이 과정에 단백질의 재접힘(refolding)이 제대로 되지 않아, 활성이 떨어지며, 단백질이 비특이적으로 전달되고, 생체 내에서는 면역 반응을 일으킬 위험이 크며, 비용이 많이 들고, 수율이 낮은 문제점이 있다.

다양한 나노 입자(nanoparticle)와 결합된 목적 단백질은 식작용(Endocytosis)에 의해 세포막을 통과하여 세포질로 들어 갈 수 있다(도 2). 나노 입자에는 Gold NP, Liposome NP, Magnetic NP, Polymeric NP 등이 있으며, 이들과 목적 단백질의 결합체의 분해는 세포 내에서 대부분 리소좀(lysosome)에서 발생하여 목적 단백질이 리소좀 내부에서 분해되어 활성을 잃어버리거나, 세포질에서 목적 단백질과 나노 입자가 따로 분리되기가 어렵고, 나노 입자의 독성이 문제가 될 수 있다.

엑소솜(Exosome)은 세포 간 신호전달을 하기 위하여, 단백질, DNA, RNA 등을 가지고 세포 밖으로 분비되어지는 50 - 200 nm 크기의 막구조의 작은 소낭을 가리킨다.

엑소솜은 원래 적혈구가 성숙되어지는 마지막 단계에서 세포 내 단백질을 배출하여 제거함으로써 적혈구 내에 헤모글로빈만 남기는 과정에서 발견된 것으로서, 이러한 엑소솜은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막(plasma membrane)으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라, 다낭체(Multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하여 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소솜이라 부른다(도 3).

이러한 엑소솜이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지는 확실히 밝혀진 바가 없으나, B-림프구, T-림프구, 수지상세포, 거대핵세포(megakaryocyte), 대식세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 줄기세포 및 종양세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소솜을 생산하여 분비한다고 알려져 있다.

엑소솜에는 세포 내의 다양한 단백질, DNA, RNA 등이 포함되어 있다. 이러한 엑소솜에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들은 세포막과의 융합 (fusion) 혹은 내포작용 (endocytosis)에 의해 다른 세포 내로 다시 유입되어 세포 간의 통신자로서의 역할을 하기도 한다. 또한, 이러한 엑소솜에 포함되어 세포 밖으로 분비되는 물질들을 분석하여 특정 질환의 진단에 이용될 수 있다.

엑소솜 내에는 여러 종류의 microRNA가 포함되어 있으며, 이것의 존재 유무 및 존재량을 검출하여 질병을 진단하는 방법에 대하여 알려져 있다(KR 10-2010-0127768A 참조). 특히 국제 공개 WO2009-015357A에는 암 유래의 시료(혈액, 타액, 눈물 등)에 존재하는 엑소솜을 검출하여, microRNA의 변화량을 측정하여, 대조군에 비하여 증가 또는 감소할 경우 특정 질환과의 관련성을 예측하고, 진단하는 방법이 개시되어 있다. 특히, 특정 질환(폐질환)을 갖는 환자로부터 얻은 엑소솜을 분석하여, 특정 microRNA와 폐질환과의 관련성에 대하여, 구체적으로 개시하고 있다. 또한, 폐질환 외에도 엑소솜에 포함된 단백질을 이용하여 신장질환을 진단할 수 있는 방법에 대하여도 연구되고 있는 실정이다.

또한, 엑소솜에는 항원을 포함하기도 한다. 한편, 항원제시세포(antigen presenting cell, APC)에서는 다낭체를 포함해 막구조를 가지는 세포 내 구획에서 항원 펩티드가 MHC(major histocompatibility complex) 클래스 II 분자에 선적되기 때문에 이로부터 기원되는 엑소솜도 항원 펩티드-MHC 클래스 II 컴플렉스를 가지고 있다. 따라서, 엑소솜은 면역원(immunogen)의 수송체로서 CD4+ T 림프구에 항원 펩티드를 제시할 수 있고, 그에 따라 T 림프구의 증식과 같은 면역 반응을 유도할 수 있다. 또한, 엑소솜에는 MHC 클래스 I, 열 충격 단백질(HSPs;heat-shock proteins) 등 면역 반응을 자극시킬 수 있는 능력을 가진 분자들이 농축되어 있기 때문에 자가면역 질환(autoimmune disease)이나 종양 치료에 있어서 면역증강 또는 감소의 목적으로 이용될 수 있다.

또한, 상기 목적 단백질이 내부에 포함된 엑소솜은, 생체 내에서 다양한 질환의 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 목적 단백질로서 항암 효과를 나타내는 단백질이나, siRNA를 포함하는 엑소솜을 제조하고, 이를 암세포에 처리하여 암치료에 사용할 수 있다(도 4).

이와 같이 목적 단백질을 포함하는 엑소솜은 질병의 치료에 사용될 수 있다. 이를 위해서는 목적 단백질을 포함하는 엑소솜을 효율적으로 만들 수 있어야 한다. 한국 공개 특허 제 2004-0015508에는 특정 항원을 포함하는 엑소솜의 제조 방법이 기재되어 있다. 특정 항원에 대한 유전자를 세포주 내에 도입하여 도입된 유전자의 단백질이 세포주 내에서 안정하게 발현되어, 엑소솜을 통하여 세포 밖으로 방출되는 방법과 이러한 엑소솜을 백신(vaccine)으로 사용하는 방법이 개시되어 있다.

그러나, 상기 엑소솜은 세포 내에서 자연적으로 형성되기 때문에, 상기 엑소솜을 생성하는 세포에 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 도입한다 하여도, 발현된 단백질이 내부에 포함된 형태의 엑소솜이 제조될 가능성이 매우 낮다는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 목적 단백질이 포함된 엑소솜을 보다 효과적으로 제조하는 방법을 개발하기 위하여 연구 노력한 결과, 엑소솜 특이 마커와 목적 단백질을 융합시킨 융합 단백질을 엑소솜을 대량으로 만들어내는 세포에서 발현시킴으로써, 목적 단백질이 포함된 엑소솜을 효율적으로 제조할 수 있음을 확인하였다(도 5).

또한, 상기 방법은 목적 단백질이 엑소솜의 막에 부착되어 있는 바, 엑소솜 특이 마커와 목적 단백질 각각에 광특이적 결합 단백질 쌍의 각각을 융합시킨 융합 단백질을 엑소솜을 대량으로 만들어내는 세포에서 발현시키고, 빛을 조사하여 각각의 융합 단백질을 결합시키면, 이들 결합 단백질이 엑소솜 특이 마커에 의해 엑소솜 내부로 유입되고, 유입된 후에 빛의 조사가 중단되면 엑소솜 내부에서 목적 단백질과 광특이적 결합 단백질의 융합 단백질이 분리되어 목적 단백질이 내부에 유리(free) 상태로 포함된 엑소솜을 효과적으로 제조할 수 있음을 확인하였다(도 6).

염증반응은 다양한 자극에 대한 신체방어 메커니즘이지만(Anderson et al., Pharmacol. Rev. 60:311357, 2008), 만성적인 염증반응은 관절염, 간염, 패혈성 쇼크 및 신경병성 장애 등을 포함하는 다양한 질병을 유발할 수 있다(Chung et al., Clin. Rheumatol. 26:12281233,2007). 대식세포는 여러 염증반응에서 중요한 역할을 하며(Mayeux et al., J. Toxicol. Environ. Health. 51:415435,1997), LPS는 산화질소(NO), 프로스타글라딘 E2(PGE2)등의 염증 매개체 및 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-1(IL-1)등의 염증성 사이토카인을 생산하는 대식세포를 활성화시킨다(Takeuchi et al., J. Biol. Chem. 281:2136221368, 2006). 유도성 산화질소 합성효소(iNOS)는 염증성 질환으로 발전할 수 있는 과도한 산화질소의 형성을 촉진하며(Nathan et al., Curr. Opin. Immunol. 3:6570, 1991), 시클로옥시게나제-2(COX-2)는 PGE2의 합성을 위한 염증 자극과 반응에 의해 유도된다(Yoon et al., J. Biosci. Bioeng. 107:429438,2009). 따라서, iNOS와 COX-2 에 의한 NO와 PGE2의 과발현은 염증반응 조절에 중요한 역할을 한다.

NF-κB는 염증반응을 유발하는 주요 전사인자로서, 주로 면역세포 및 이외의 다양한 세포에서 염증과 관련된 유전자의 발현을 조절한다. 따라서 NF-κB 신호경로의 과도한 활성은 다양한 염증성 질병을 야기하므로 염증세포에서 과도하게 활성화된 NF-κB 경로를 선택적으로 억제하는 것은 류마티스성 관절염, 폐혈증, 건선 등과 같은 난치성 만성 염증성 질환의 효과적인 치료 전략이 될 수 있다. 또한, NF-κB의 활성화는 세포사멸을 억제할 수 있는 인자들의 발현을 증가시켜서 세포사멸을 억제시키는 역할을 하므로 암세포 내에서의 지속적인 NF-κB 신호경로의 활성화는 항암제 치료에 대한 내성의 주요한 원인으로 작용하여 항암제에 의한 치료효과를 감소시키는 원임이 된다.

자극받지 않은 정상세포에서, 대부분의 NF-κB는 이의 억제단백질인 IκB와 결합되어 세포질 내에서 비활성화된 상태로 존재한다. TNF-α 및 LPS 등의 다양한 자극에 의해 활성화된 IκB Kinase(IKK) 복합체는 IκB를 인산화시키고, 인산화된 IκB는 유비퀴틴화 ubiquitination)되어 결과적으로 단백질분해효소복합체(proteasome)를 통해 분해된다. IκB가 분해됨에 따라 이에 결합되어 있던 NF-κB (p50/p65)가 세포질에서 자유상태로 분리되어 핵막을 통과한 후, 핵 내에서 타겟 유전자의 프로모터(promotor) 부분에 결합하여 mRNA 전사 과정을 촉진시키며, iNOS, COX-2, NO, PGE2,TNF-α 및 IL-1등의 염증 매개체와 염증성 사이토카인의 전사를 유도하는(Lappas et al., Biol. Reprod. 67:668673, 2002) 염증반응의 중요한 요소이다.

Super-repressor IκB는 IκB의 S32A, S36A 변이 형태(mutant form)로 IKK에 의해 인산화되지 않고 단백질분해효소복합체에 의해 분해가 되지 않아서 결과적으로 NF-κB를 지속적으로 억제시킬 수 있는 기능을 가지고 있다. 따라서, 여러 염증성 질병 모델에서 치료제로서의 가능성이 매우 높다.

이에 본 발명자들은, Super-repressor IκB 단백질을 포함하는 엑소솜을 제조하고, 상기 엑소솜을 처리시 Super-repressor IκB 단백질이 타겟 세포의 세포질에 전달되는 것을 확인하였으며, 본 발명의 Super-repressor IκB를 탑재한 엑소솜이 염증성 질병 치료제로서 이용 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 엑소솜 특이 마커와 NF-κB를 억제하는 단백질의 융합 단백질을 포함하는 엑소솜의 대량 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 광특이적 결합 단백질 쌍을 이용하여 엑소솜 막에서 분리된 NF-κB를 억제하는 단백질을 포함하는 엑소솜의 대량 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 엑소솜의 제조에 사용될 수 있는 엑소솜 제조용 벡터를 제공하는 것이다.

아울러, 본 발명의 다른 목적은 상기 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은,

a) 엑소솜 생산 세포에, 엑소솜 특이 마커와 NF-κB를 억제하는 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 형질전환된 세포를 얻는 단계; 및 b) 상기 형질전환된 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 NF-κB를 억제하는 단백질이 엑소솜 막에 부착된 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

a) 엑소솜 생산 세포에, 엑소솜 특이 마커와 제1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질(제1 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제2 광특이적 결합 단백질과 NF-κB를 억제하는 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질(제2 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계; b) 상기 엑소솜 생산 세포에 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 상기 제2 광특이적 결합 단백질의 결합을 유발할 수 있는 광을 조사하는 단계; 및 c) 상기 엑소솜 생산 세포에서 엑소솜이 생산된 다음, 상기 광의 조사를 중지하는 단계를 포함하는, NF-κB를 억제하는 단백질을 포함하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

(a) 엑소솜 특이 마커와 제1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질(제1 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현벡터; 및 (b) NF-κB를 억제하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입될 수 있는 다클론 부위와 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제2 광특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 발현벡터를 포함하는, 엑소솜 제조용 벡터를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 방법을 사용하여 제조된, NF-κB를 억제하는 단백질이 내부에 포함된 엑소솜, 상기 엑소솜을 이용하는 것을 특징으로 하는 세포질로 NF-κB를 억제하는 단백질을 전달하는 방법, 그리고 상기 엑소솜을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 NF-κB를 억제하는 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조방법을 이용하면, NF-κB를 억제하는 단백질을 포함하는 엑소솜을 높은 수율로 제조할 수 있으며, 또한, NF-κB를 억제하는 단백질이 엑소솜 막으로부터 분리되어 존재하므로 상기 엑소솜을 이용하여 염증성 질환의 치료에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 세포막 통과 도메인(PTD)과 목적 단백질의 재조합 단백질을 통한 목적 단백질의 세포질 내 전달방법을 보여주는 그림이다(Steven R. et al. Protein transduction: unrestricted delivery into all cells Trends in Cell biology, 2000).
도 2는 나노 입자와 목적 단백질을 결합시킨 결합체를 endocytosis를 통해 목적 단백질의 세포질 내 전달방법을 보여주는 그림이다(Munish Chanana et al. Physicochemical properties of protein-coated gold nanoparticles in biological fluids and cells before and after proteolytic digestion. Angew. Chem. Int. Ed. 2013).
도 3은 엑소솜이 세포 내 다낭체(Multi vesicular bodies, MVBs)로부터 세포 밖으로 방출, 분리되어 발생되는 과정을 보여주는 그림이다(Graca Raposo and Willem Stoorvogel. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Cell Biology 200(4), 373-383, 2013).
도 4는 표적화된 엑소솜을 통해 siRNA를 생체 내 전달하여 암을 치료하는 과정을 보여주는 그림이다(Alvarez-Erviti, L. et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes.Nature biotechnology 29, 341-345, 2011).
도 5는 본 발명에 따른 광유전자로 디자인된 단백질 운반 엑소솜(Optogenetically-designed, protein-carrying exosomes, EXPLORs)의 제조 공정을 보여주는 개요도 이다.
도 6은 본 발명에 따른 EXPLORs의 광 조사가 중단되면 엑소솜 내부에서 목적 단백질과 광특이적 결합 단백질의 융합 단백질이 분리되는 과정을 보여주는 그림이다.
도 7은 CIBN-EGFP-CD9 유전자와 mCherry-CRY2 유전자가 HEK293T 세포에 도입된 형질전환체에서 청색광의 조사 여부에 따른 mCherry 단백질의 세포 내 위치변화를 나타내는 형광사진이다.
도 8은 본 발명에 따른 EXPLORs를 수득하는 실험 과정을 보여주는 그림이다.
도 9는 청색광의 세기에 따라, 엑소솜의 내부에 포집된 목적 단백질(mCherry 단백질)의 함량변화를 측정한 결과를 나타내는 면역블럿 분석사진이다.
도 10은 목적 단백질(mCherry)을 포함하는 엑소솜을 표적 세포(HT1080 세포)에 처리한 후, 상기 표적 세포에 목적 단백질의 도입 여부를 확인한 결과를 나타내는 전자현미경 사진으로서, 좌측은 엑소솜이 처리되지 않은 표적 세포를 나타내고 우측은 엑소솜이 처리된 표적 세포를 나타낸다.
도 11는 목적 단백질(mCherry)을 포함하는 엑소솜을 표적 세포(HT1080 세포)에 처리한 후, 상기 표적 세포에 목적 단백질의 도입 여부를 확인한 결과를 나타내는 형광사진(a) 및 상기 엑소솜 처리에 의하여 유발된 사멸세포의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프(b)이다.
도 12는 GIGANTEA-EGFP-CD9 유전자 및 mCherry-FKF1LOV가 HEK293T 세포에 도입된 형질전환체에서 청색광의 조사 여부에 따른 mCherry 단백질의 세포 내 위치변화를 나타내는 형광사진이다.
도 13은 형광이미징을 이용한 Luciferase-mCherry 융합단백질의 발현 정도(a) 및 생산 세포에서의 루시퍼라제 활성 및 분자 개수를 확인한 도이다(b):
Control: 아무것도 처리하지 않은 HEK293T 세포;
OVER: Luciferase-mCherry-CRY2 만을 도입한 HEK293T 세포;
XP: 엑소솜 탑재 기술을 위해 만들어진 상용 벡터인 XPACK (Systems Biosciences)을 이용하여 XPACK-Luciferase-mCherry을 도입한 HEK293T 세포;
EXPLOR: 본 발명의 방법에 따른, Luciferase-mCherry-CRY2와 CIBN-EGFP-CD9를 도입한 HEK293T 세포.
도 14는 생산된 엑소솜 내에서의 루시퍼라제 활성 측정(a) 및 분자 개수(b)를 확인한 도이다:
NEG: 아무것도 처리하지 않은 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
OVER: Luciferase-mCherry-CRY2를 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
XP: 엑소솜 탑재 기술을 위해 만들어진 상용 벡터인 XPACK (Systems Biosciences)을 이용하여 XPACK-Luciferase-mCherry을 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
EXPLOR: 본 발명에 따른, Luciferase-mCherry-CRY2와 CIBN-EGFP-CD9를 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
ON: 200 μW의 청색광에서 72시간 배양하여 생산한 엑소솜,
OFF: 빛이 없는 조건에서 72시간 배양하여 생산한 엑소솜.
도 15는 생산된 엑소솜 내의 목적 단백질의 도입 효율(loading efficiency)을 나타낸 도이다.
도 16은 엑소솜을 이용한 표적 세포(HeLa)로의 목적 단백질 전달 효율을 나타낸 도이다:
Control: 아무것도 처리하지 않은 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
OVER: Luciferase-mCherry-CRY2를 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
XP: 엑소솜 탑재 기술을 위해 만들어진 상용 벡터인 XPACK (Systems Biosciences)을 이용하여 XPACK-Luciferase-mCherry을 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
EXPLOR: 본 발명에 따른, Luciferase-mCherry-CRY2와 CIBN-EGFP-CD9를 도입한 HEK293T 세포에서 생산된 엑소솜;
ON: 200 μW의 청색광에서 72시간 배양하여 생산한 엑소솜,
OFF: 빛이 없는 조건에서 72시간 배양하여 생산한 엑소솜.
도 17은 세포 내에서 Luciferase-mCherry-CRY2와 CIBN-EGFP-CD9가 HEK293T 세포내에서 같은 위치에 발현하고 있음을 확인한 도이다.
도 18은, 세포 내에서 super-repressor-IκB-mCherry-CRY2 및 CIBN-EGFP-CD9가 HEK293T 세포 내에서 같은 위치에 발현하고 있음을 확인한 도이다.
도 19는, HeLa 세포에 본 발명에 따른 super-repressor-IκB:EXPLOR를 전처리 하였을 경우, TNF-α에 의해 활성화된 NF-kB의 핵으로의 이동 억제 및 NF-kB의 DNA 결합 억제를 확인한 도이다(Scale bars, 20 μm):
mCherry:EXPLOR: super-repressor-IκB가 탑재되지 않은 엑소솜; 및
srlkB:EXPLOR: super-repressor-IκB가 탑재된 엑소솜(super-repressor-IκB:EXPLOR).
도 20은, 류마티스 관절염 마우스 모델에서 super repressor IκB:EXPLOR 투여 후 질병 진행 정도를 분석한 결과를 나타낸 도이다(↓는 EXPLOR 투여시점).

이하, 본 발명을 상세히 서술한다.

본 발명은 NF-κB를 억제하는 단백질을 포함하는 엑소솜을 효율적으로 대량으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 목적 단백질이 내부에 포함된 엑소솜을 보다 효과적으로 제조하는 방법을 개발하기 위하여 다양한 연구를 수행하던 중, 엑소솜 특이 마커(CD9, CD63, CD81 또는 CD82)에 주목하게 되었다. 상기 엑소솜 특이 마커는 테트라스파닌 패밀리에 속하는 4회 막 관통형의 막 단백질이라는 공통점을 갖고 있으므로, 상기 엑소솜의 막단백질에 목적 단백질을 결합시킬 경우, 비교적 용이하게 엑소솜 내부에 포함될 수 있을 것으로 예측하였다.

이와 같이 엑소솜 막에 특이적으로 많이 존재하고 세포막을 관통하는 엑소솜 특이 마커와 목적 단백질의 융합 단백질을 엑소솜을 대량으로 만드는 세포에서 발현시키면 목적 단백질이 포함된 엑소솜을 대량으로 만들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 목적 단백질인 NF-κB를 억제하는 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조 방법은 엑소솜 생산 세포에서 엑소솜 특이 마커와 NF-κB를 억제하는 단백질이 결합된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 발현시키는 것을 특징으로 한다.

이 때 생성된 엑소솜에는 NF-κB를 억제하는 단백질이 엑소솜 막에 박혀 있는 엑소솜 특이 마커와 융합되어 있다.

상기 목적 단백질은 상기 엑소솜의 막단백질에 결합되어 있는 상태로서, 표적세포에 도달한 후에도 분리되지 아니한다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 다양한 연구를 수행한 결과, 광특이적 결합 단백질을 사용하여, 일시적으로 목적 단백질을 상기 마커 단백질과 결합시켜서, 상기 목적 단백질이 내부에 포함된 엑소솜을 제조하는 기술을 개발하였다. 예를 들어, 광특이적 결합 단백질인 CIBN과 CRY2을 이용할 수 있는데, 구체적으로, 상기 CIBN은 상기 마커 단백질의 하나인 CD9과 융합된 형태로 발현되도록 하고, 상기 CRY2는 목적 단백질과 융합된 형태로 발현되도록 이들 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 엑소솜 생산 세포에 도입하였다. 상기 엑소솜 생산세포에서 발현된 CIBN-CD9 융합 단백질은 CD9으로 인하여 엑소솜에 포함되는데, 이때, 상기 세포에 푸른 빛 LED 조명을 조사하면, 상기 엑소솜 생산세포에서 발현된 목적단백질-CRY2 융합 단백질의 CRY2 도메인이 CD9에 융합된 CIBN 도메인에 결합되므로, 목적단백질-CRY2-CIBN-CD9 형태의 가역적으로 유도된 융합 단백질이 형성되고, 이와 같은 융합 단백질은 CD9으로 인하여 엑소솜 내부에 포함된다. 이처럼 목적단백질이 내부에 포함된 엑소솜이 생산된 후, 상기 푸른 빛 LED 조명을 더 이상 조사하지 않으면, CIBN-CRY2 결합이 해제되어, 목적단백질이 엑소솜의 세포막에 결합되지 않은 상태로 엑소솜 내부에 포함되게 되므로, 결과적으로는 목적 단백질을 포함하는 엑소솜을 제조할 수 있다(도 5 내지 도 10).

이같이 제조된 엑소솜은 종래의 표적 물질을 포함하는 엑소솜과는 전혀 다른 효과를 나타낼 수 있다. 종래의 엑소솜은 목적 단백질을 엑소솜 내부에 포집시키기 위하여, 엑소솜 특이 마커에 융합시킨 형태로 발현시켰으므로, 상기 목적 단백질이 엑소솜 내부에 포집되기는 하였으나, 엑소솜막에 부착되어 있는 상태로 있으므로 엑소솜막으로부터 분리되지 못하므로, 상기 엑소솜이 표적 세포의 세포막에 융합되는 경우에만, 상기 목적 단백질이 표적 세포로 전달될 수 있고, 이처럼 표적 세포에 융합된 후에도, 엑소솜막에 융합된 엑소솜에 결합된 형태로 존재하기 때문에, 상기 목적 단백질이 표적 세포내에서 그의 효과를 나타낼 확률이 매우 낮다는 한계가 있었다. 그러나, 본 발명에서 제공하는 엑소솜은 엑소솜 내부에 목적 단백질이 막에 결합되지 않은 상태로 포집되어 있으므로, 상기 엑소솜이 표적 세포에 의하여 endocytosis되어 세포질로 들어갔을 때, 엑소솜막에 부착되어 있는 것이 아니므로 엑소솜이 분해되는 경우, 목적 단백질이 표적 세포의 세포질로 전달될 수 있으며, 표적 세포의 세포질 내에서 자유롭게 이동이 가능하므로, 목적 단백질이 표적 세포질에서 생리 활성을 충분히 나타낼 수 있다는 장점이 있다(도 11).

뿐만 아니라, 광조사시 조사되는 광의 세기에 따라서, 마커 단백질에 결합되는 목적 단백질의 결합수준이 변화되므로, 상기 광의 세기를 조절할 경우, 엑소솜내에 포집되는 목적 단백질의 함량을 조절할 수 있다는 장점이 있다.

따라서, 광특이적 결합 단백질을 사용하여 목적 단백질을 포함하는 엑소솜을제조하는 방법은 지금까지 전혀 알려져 있지 않으며, 본 발명자에 의하여 최초로 개발되었다.

따라서 본 발명에서는, 하기 단계로 구성된 NF-κB를 억제하는 단백질을 포함하는 엑소솜의 제조방법을 제공한다:

(a) 엑소솜 생산 세포에, 엑소솜 특이 마커와 제1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질(제1 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제2 광특이적 결합 단백질과 NF-κB를 억제하는 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질(제2 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계;

(b) 상기 엑소솜 생산 세포에 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 상기 제2 광특이적 결합 단백질의 결합을 유발할 수 있는 광을 조사하는 단계; 및

(c) 상기 엑소솜 생산 세포에서 엑소솜이 생산된 다음, 상기 광의 조사를 중지하는 단계.

본 발명의 용어 "엑소솜(exosome)"이란, 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하여 세포 밖으로 방출 또는 분비되는 원형질막 구조의 작은 소낭을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소솜은 목적 단백질을 내부에 포함하여 목적 단백질의 표적 세포 또는 조직으로 목적 단백질을 운반하는 운반체로서 역할을 수행할 수 있는데, 상기 엑소솜에 의하여 운반된 목적 단백질은 표적 세포 또는 조직에 작용하여 특정 질환을 치료하거나 또는 특정 질환을 진단하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "엑소솜 생산 세포"란, 상기 엑소솜을 생산할 수 있는 세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소솜 생산 세포는 특별히 이에 제한되지 않으나 한 가지 예로서, B-림프구, T- 림프구, 수지상세포, 거대핵세포(megakaryocyte), 대식세포, 줄기세포 및 종양 세포 등이 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 상기 엑소솜 생산 세포로서 불멸화세포주(immortalized cell line)의 일종인 HEK293T 세포를 사용하였다.

본 발명의 용어 "엑소솜 특이 마커"란, 엑소솜의 막에 풍부하게 존재하는 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 엑소솜 특이 마커는 특별히 이에 제한되지 않으나, 한 가지 예로서, CD9, CD63, CD81, CD82 등이 될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 엑소솜 특이 마커로서 CD9을 사용하였다. CD9, CD63, CD81, CD82는 4회 관통형 막단백질로써, 엑소솜의 막단백질에 목적 단백질을 결합시킬 경우 용이하게 목적 단백질을 엑소솜 내부에 존재하게 한다.

본 발명의 용어 "광특이적 결합 단백질"이란, 광유도 이형이합체 형성 단백질 또는 광유도 동형이합체 형성단백질이라고도 하는데, 특정 파장의 광이 조사될 경우, 서로 상이한 단백질과 결합하여 이형이합체를 형성할 수 있는 단백질 또는 서로 동일한 종류의 다른 단백질과 결합하여 동형이합체를 형성할 수 있는 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 광특이적 결합 단백질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 한 가지 예로서, 광유도 이형이합체 형성 단백질이 될 수 있고, 다른 예로서, CIB(cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix protein), CIBN(N-terminal domain of CIB), PhyB(phytochrome B), PIF(phytochrome interacting factor), FKF1(Flavinbinding, Kelch repeat, F-box 1), GIGANTEA, CRY(chryptochrome), PHR(phytolyase homolgous region) 등이 될 수 있다.

특히, 이형이합체를 형성하는 경우, 두 가지 광특이적 결합 단백질(제1 광특이적 결합 단백질 및 제2 광특이적 결합 단백질)이 사용될 수 있는데, 상기 제1 광특이적 결합 단백질이 CIB 또는 CIBN인 경우, 이에 대한 제2 광특이적 결합 단백질은 CRY 또는 PHR이 될 수 있고, 상기 제1 광특이적 결합 단백질이 PhyB인 경우, 이에 대한 제2 광특이적 결합 단백질은 PIF가 될 수 있으며, 상기 제1 광특이적 결합 단백질이 GIGANTEA인 경우, 이에 대한 제2 광특이적 결합 단백질은 FKF1가 될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 제1 광특이적 결합 단백질로서 CIBN을사용하고, 제2 광특이적 결합 단백질로서 CRY2를 사용하였으며, 사용된 빛의 파장은 청색광을 나타내는 460 내지 490nm로 설정하고, 상기 빛의 세기는 20 내지 50 μW로 설정하였다.

한편, 엑소솜 특이 마커와 제1 광특이적 결합 단백질이 결합된 제1 융합 단백질의 발현여부 및 세포 내 위치를 확인하기 위하여, 마커 단백질을 함께 융합시킬 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 실시예에서는 CIBN과 CD9, 또는 GIGANTEA와 CD9이 결합된 제1 융합 단백질에 형광단백질인 EGFP가 삽입된 형태로 발현시킴으로써, 상기 제1 융합 단백질의 발현여부, 발현수준 및 세포 내 위치를 확인하고자 하였다.

본 발명의 용어 "목적 단백질"이란, 상기 엑소솜의 내부에 포함되도록 상기 제2 광특이적 결합 단백질과 융합된 형태로 발현되는 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 목적 단백질은 NF-κB를 억제하는 단백질이며, 상기 NF-κB를 억제하는 단백질은 super-repressor-IκB 단백질이고, NF-κB와 결합하여 세포질 내에서 비활성화 시킨다.

상기 super-repressor-IκB 단백질은 IκB의 S32A, S36A 변이체(mutant form)로 IκB 카이네이즈(IKK)에 의해 인산화되지 않고 프로테아좀에 의해 분해가 되지 않아서 결과적으로 NF-κB를 지속적으로 억제시킬 수 있는 기능을 가지고 있다.

본 발명의 목적 단백질인 NF-κB를 억제하는 단백질은 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 기재되는 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, IκB-α, IκB-β, IκB-ε, BCL-3 또는 이들의 변이체를 들 수 있으나, NF-κB를 억제시킬 수 있는 단백질이면 가능하다.

본 발명의 용어 "배양"이란, 세포 혹은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 방법을 의미한다.

본 발명에 있어서, 형질전환체를 1 내지 3일간 배양한 후, 소태아혈청이 포함되지 아니한 배지로 교체하고 2 내지 5일간 추가로 배양한다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

상기 배지는 동물세포 배양 시 사용되는 공지된 배지를 의미하고, 시판중인 무혈청 배지(serum free media), 무단백 배지(protein free media) 및 화학 정의 배지(chemically defined media) 등의 그룹 중에서 선택될 수 있다.

상기 무혈청 배지는 동물 세포를 배양하는데 사용되는 소혈청 성분이 제거된 배지로 SFM4CHO(HyClone), EX-Cell(JHR Bioscience) 등이 바람직하고, 인슐린형 성장인자 I(Insulin like growth factor I, IGF-I), 에탄올아민(Ethanolamine), 페릭 클로라이드(Ferric chloride), 및 포스파티딜콜린(Phosphatidyl choline) 등이 첨가될 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 무단백 배지는 소혈청 성분이 제거된 무혈청 배지에서 동물 유래 단백질, 특히, 분자량 10kDa 이상인 고분자 단백질이 제거된 동물세포 배양 배지로써, ProCHO(Lonza) 및 PF-CHO(HyClone) 등이 선택될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 화학 정의 배지는 동물 유래의 성분이 없고, 배지를 구성하는 모든 구성 성분이 공지된 화학적 구조를 가진 동물 세포 배양용 배지로써, CDM4CHO(HyClone), PowerCHO2CD(Lonza), 및 CD-optiCHO(Life Technologies) 등이 선택 될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 용어 "제1 융합 단백질"이란, 상기 엑소솜 특이 마커와 상기 제1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 제1 융합 단백질에 포함된 엑소솜 특이 마커와 제1 광특이적 결합 단백질의 배열순서는 상기 제1 융합 단백질이 엑소솜 생산 세포에서 엑소솜의 내부방향으로 상기 제1 광특이적 결합 단백질이 위치하도록 발현될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 한 가지 예로서 엑소솜 특이 마커의 C-말단에 제1 광특이적 결합 단백질의 N-말단이 결합된 형태로 구성될 수 있다.

또한, 상기 제1 융합 단백질을 구성하는 엑소솜 특이 마커와 제1 광특이적 결합 단백질은 상호 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다. 상기 링커는 제1 융합 단백질이 엑소솜 생산 세포에서 엑소솜의 내부방향으로 상기 제1 광특이적 결합 단백질이 위치하도록 발현될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 잘 구부러지는(flexible) 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 상기 링커를 코딩하는 핵산을 각 도메인을 코딩하는 핵산 사이에 인프레임(in frame)으로 연결하여 발현벡터 내에 작동 가능하게 연결하여 발현시킬 수 있다.

본 발명의 용어 "제2 융합 단백질"이란, 상기 제2 광특이적 결합 단백질과 상기 목적 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 융합 단백질에 포함된 제2 광특이적 결합 단백질과 목적 단백질의 배열순서는, 상기 제2 융합 단백질이 엑소솜 생산 세포에서 상기 제1 융합 단백질의 제1 광특이적 결합 단백질 부위와 결합하여 엑소솜 내부에 위치할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 한 가지 예로서 제2 광특이적 결합 단백질의 C-말단에 목적 단백질의 N-말단이 결합된 형태로 구성될 수 있다.

또한, 상기 제2 융합 단백질을 구성하는 제2 광특이적 결합 단백질과 목적 단백질은 상호 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다. 상기 링커는 제2 융합 단백질이 엑소솜 생산 세포에서 상기 제1 융합 단백질의 제1 광특이적 결합 단백질 부위와 결합하여 엑소솜 내부에 위치할 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 아미노산으로 구성된 펩타이드 링커를 사용할 수 있고, 보다 바람직하게는 잘 구부러지는(flexible) 펩타이드 링커를 사용할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 상기 링커를 코딩하는 핵산을 각 도메인을 코딩하는 핵산 사이에 인프레임(in frame)으로 연결하여 발현벡터 내에 작동 가능하게 연결하여 발현시킬 수 있다.

아울러, 상기 각 융합 단백질은 이에 포함되는 각 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.

끝으로, 상기 융합 단백질 또는 상기 융합 단백질을 구성하는 각 도메인의 폴리펩티드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩티드 합성방법으로 제조하거나, 상기 도메인을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction) 에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.

한편, 상기 각 융합 단백질은 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 엑소솜 생산 세포에 도입함으로써, 상기 엑소솜 생산 세포에서 발현될 수 있는데, 상기 폴리뉴클레오티드를 엑소솜 생산 세포에 도입하는 방법으로는 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있는데, 예를 들어, 발현벡터를 사용하여 도입하는 방법을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "발현벡터"란, 목적하는 숙주세포에서 목적 펩타이드를 발현할 수 있는 재조합 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 제작물을 의미한다. 상기 발현벡터는 개시코돈, 종결코돈, 프로모터, 오퍼레이터 등의 발현조절 요소들을 포함하는데, 상기 개시코돈 및 종결코돈은 일반적으로 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 제작물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다.

본 발명의 용어 "작동가능하게 연결(operably linked)"이란, 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 상태를 의미다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터는 세포 배양액으로부터 단백질의 분리를 촉진하기 위하여 융합 폴리펩타이드의 배출을 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 특이적인 개시 시그널은 또한 삽입된 핵산 서열의 효율적인 번역에 필요할 수도 있다. 이들 시그널은 ATG 개시코돈 및 인접한 서열들을 포함한다. 어떤 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함할 수 있는 외인성 번역 조절 시그널이 제공되어야 한다. 이들 외인성 번역 조절 시그널들 및 개시코돈들은 다양한 천연 및 합성 공급원일 수 있다. 발현 효율은 적당한 전사 또는 번역 강화 인자의 도입에 의하여 증가될 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시양태에 의하면, 상기 발현벡터는 목적 단백질이 엑소솜의 내부에 삽입되었는지의 여부를 확인할 수 있는 태그를 상기 목적 단백질에 결합시켜서 발현시킬 수 있다. 상기 태그는 목적 단백질의 존재 여부를 확인하기 위한 것이므로, 목적 단백질이 제2 광특이적 결합 단백질과 결합된 반대부위에 결합시킬 수 있는데, 한 가지 예로서, 적색형광단백질, 녹색형광단백질 등의 형광단백질을 태그로 사용하여, 목적 단백질의 C-말단 부위에 결합시킬 수 있다.

이 같이 설계된 목적 단백질을 엑소솜 생산 세포에서 발현시키고, 엑소솜이 생산된 후, 상기 형광단백질 태그가 엑소솜에서 검출되는지의 여부를 확인함으로써, 상기 엑소솜이 목적 단백질을 포함하는지의 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 용어 "광(light)"이란, 엑소솜 생산 세포에서 발현된 제1 광특이적 결합 단백질과 제2 광특이적 결합 단백질을 임시적으로 결합시키기 위하여 조사하는 빛을 의미한다.

상술한 바와 같이, 엑소솜 생산 세포 내에서 제1 광특이적 결합 단백질은 엑소솜 특이 마커와 함께 제1 융합 단백질 형태로 발현되고, 제2 광특이적 결합 단백질은 목적 단백질과 함께 제2 융합 단백질 형태로 발현되는데, 상기 엑소솜 생산 세포에 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 제2 광특이적 결합 단백질의 결합에 필요한 광을 조사하면, 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 제2 광특이적 결합 단백질이 결합되어 결과적으로는, 엑소솜 특이 마커-제1 광특이적 결합 단백질-제2 광특이적 결합 단백질-목적 단백질의 형상을 갖는 융합 단백질 복합체를 임시적으로 형성하는데, 상기 엑소솜 생산 세포에서 엑소솜을 생산하면, 상기 엑소솜 특이 마커로 인하여 목적 단백질이 엑소솜에 연결될 수 있다. 이 경우, 상기 목적 단백질은 엑소솜의 내부에 존재하며, 엑소솜이 생산된 후에 광의 조사를 중지하면, 제1 광특이적 결합 단백질과 제2 광특이적 결합 단백질이 분리되고, 이에 따라, 엑소솜 내부에 존재하는 목적 단백질은 엑소솜의 방출시 엑소솜에 포함된 형태로 외부로 방출된다. 또한, 상기 광은 목적 단백질이 엑소솜의 내부로 보다 효과적으로 도입될 수 있도록, 지속적으로 조사하기보다는 간헐적으로 조사함이 바람직하다. 즉, 광을 간헐적으로 조사할 경우에는, 제1 광특이적 결합 단백질과 제2 광특이적 결합 단백질의 결합과 분리가 반복되기 때문에, 목적 단백질이 엑소솜 내부로 도입될 확률을 향상시킬 수 있다.

한편, 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 제2 광특이적 결합 단백질의 결합을 유도하는 광의 파장은 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 제2 광특이적 결합 단백질의 종류에 따라 달라지므로, 당업자에게 공지된 바에 따라, 광의 파장을 선택할 수 있다. 즉, CRY2와 CIBN을 결합시킬 경우에는 460 내지 490nm의 파장을 갖는 빛을 조사하고, 상기 빛을 10분 이상 조사하지 않을 경우에는 CRY2와 CIBN이 서로 해리되며; PhyB와 PIF를 결합시킬 경우에는 650nm의 파장을 갖는 빛을 10분 동안 조사하고, 750nm의 파장을 갖는 빛을 5분 동안 조사할 경우에는 PhyB와 PIF가 서로 해리되며; FKF1과 GIGANTEA를 결합시킬 경우에는 460nm의 파장을 갖는 빛을 30분 동안 조사할 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 CIBN과 CRY2의 결합을 유도하기 위하여 460 내지 490nm의 파장을 갖는 빛을 조사하였다.

본 발명의 실시예에 의하면, CRY2 및 mCherry의 융합 단백질과 CIB 및 CD9의 융합 단백질을 엑소솜을 많이 만들어내는 불멸세포주인 HEK293T 세포 내에서 발현한 결과, 세포질에 균일하게 퍼져있던 mCherry 단백질의 분포가 푸른 빛을 쬐어주었을 때 세포막, 엔도솜 유사 구조 등의 막에 있는 것을 관찰할 수 있었다(도 7 ). 또한, FKF1 및 mCherry의 융합 단백질과 GIGANTEA 및 CD9의 융합 단백질을 HEK293T 세포에서 발현시켰을 때도 유사한 결과를 관찰할 수 있었다(도 12). 또한, CRY2 및 mCherry의 융합 단백질과 CIBN 및 CD9의 융합 단백질을 HEK293T에 발현시키고, 푸른 빛의 세기를 조절한 결과, 20 내지 50 μW의 빛을 조사하였을 때, 엑소솜 내에 포집된 mCherry 단백질이 가장 높은 수준을 나타냄을 확인하였으며(도 9), 상기 세포에서 생산 분리된 엑소솜을 이종세포인 HT1080 세포에 약 250㎍/㎖의 농도로 처리한 결과, HT1080 세포에 대하여 특별한 세포독성을 나타내지 않았고, 상기 HT1080 세포의 세포질로 mCherry 단백질이 전달됨을 확인하였다(도 10).

또한, 본 발명의 엑소솜 내의 목적 단백질의 도입 효율 및 표적 세포로의 엑소솜 전달 효율을 기존의 방법과 비교하기 위하여, 기존 방법으로 XPACK 벡터를 이용하고, 본 발명의 CRY2 및 mCherry 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질과 CIBN 및 CD9 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질의 발현 벡터를 HEK293T에 도입한 후, 엑소솜 내의 목적 단백질 생산량을 비교한 결과, 본 발명의 방법을 사용하였을 경우 현저하게 도입 효율이 높음을 확인하였다(도 15). 또한, 엑소솜 생산 세포로부터 분리한 엑소솜을 표적 세포(HeLa)에 처리하여, 목적 단백질의 발현 정도를 비교하였을 때에도 본 발명의 방법으로 분리된 엑소솜을 이용하였을 때, 표적 세포에서 목적 단백질의 발현이 가장 높음을 확인하였다(도 16).

본 발명은 다른 양태로서 (a) 엑소솜 특이 마커와 제1광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질(제1 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현벡터; 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입될 수 있는 다클론 부위(multicloning site)와 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제2 광특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 발현벡터를 포함하는, 엑소솜 제조용 벡터를 제공한다.

본 발명에서 제공하는 엑소솜 제조용 벡터에 있어서, 엑소솜 특이 마커, 제1 광특이적 결합 단백질, 엑소솜 생산 세포 및 제2 광특이적 결합 단백질은 상술한 바와 동일하다.

본 발명의 용어 "엑소솜 생산용 형질전환 세포"란, 상기 엑소솜 생산 세포에 엑소솜 특이 마커와 제1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질(제1 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입되어, 상기 제1 융합 단백질을 발현할 수 있는 엑소솜 생산 세포를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 제2 발현벡터는 상기 제2 광특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 포함되어 있고, 이에 인접하여 다클론 부위를 포함하도록 구성될 수 있는데, 이처럼 구성된 제2 발현벡터의 상기 다클론 부위에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입될 경우, 상기 제2 광특이적 결합 단백질과 목적 단백질이 융합된 형태(제2 융합 단백질)로 발현될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 엑소솜 제조용 벡터는 상기 엑소솜 생산용 형질전환 세포 및 발현벡터뿐만 아니라, 상기 발현벡터의 도입, 엑소솜 생산용 형질전환 세포의 배양, 상기 엑소솜 생산용 형질전환 세포로부터 생산된 엑소솜을 분리, 정제하는데 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수도 있다. 예를 들어, 상기 발현벡터의 도입에 필요한 적절한 완충액, 상기 엑소솜 생산용 형질전환 세포의 배양에 필요한 배지 및 용기 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태로서 상기 방법으로 제조되어, NF-κB를 억제하는 단백질이 내부에 포함된 엑소솜을 제공한다.

상술한 방법으로 제조된 엑소솜은 이를 구성하는 원형질 막에는 엑소솜 특이 마커와 제1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질(제1 융합 단백질)이 포함되어 있고, 엑소솜의 내부에는 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제2 광특이적 결합 단백질과 NF-κB를 억제하는 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질(제2 융합 단백질)이 포함되어 있으므로, 상기 엑소솜을 목적 조직 내의 세포에 처리하면, 원형질 막의 융합을 통해, 엑소솜 내부에 포함된 제2 융합 단백질이 목적 조직 내의 세포질로 전달될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 방법으로 제조된 NF-κB를 억제하는 단백질이 탑재된 엑소솜을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 급성 및 만성 염증 질환, 패혈증(Sepsis), 궤양성 대장염(Ulcerative colitis) 및 크론씨병(Crohns disease)으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기 방법으로 제조한 super-repressor-IκB가 탑재된 엑소솜(super-repressor-IκB:EXPLOR)을 이용하여 TNF-α 매개의 염증 억제 효과를 확인하기 위해 super-repressor-IκB:EXPLOR를 HeLa 세포에 전처리함으로써 TNF-a에 의한 활성화된 NF-κB의 핵으로의 이동이 억제된 것을 확인하였다(도 19의 A 참조). 또한, TNF-a에 의해 활성화된 NF-κB의 DNA 결합이 super-repressor-IκB:EXPLOR를 전처리함으로써 억제됨을 확인하였다(도 19의 B 참조).

또한, 본 발명자들은 상기에서 제조한 super-repressor-IκB:EXPLOR를 이용하여 콜라겐으로 유도한 관절염 쥐 모델에서의 염증 억제 효과를 확인하기 위해 super repressor IκB:EXPLOR를 콜라겐으로 유도한 관절염 동물모델에 3회 안와정맥 주사를 하였으며 관절염이 유도된 쥐에서 관절염 증상이 감소한 것을 확인하였다(도 20 참조).

따라서, 본 발명의 super-repressor-IκB가 탑재된 엑소솜(super-repressor-IκB:EXPLOR)은 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물로 이용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다.

그러나 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

엑소솜의 제조

<1-1> 엑소솜의 제조를 위한 CIBN 및 CRY2의 결합 확인

빛이 없는 조건에서 CIBN-EGFP-CD9 유전자를 포함하는 pcDNA3.1(+) 벡터와 mCherry-CRY2 유전자를 포함하는 pcDNA3.1(+) 벡터를 엑소솜 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하고, 24시간 동안 배양한 다음, 소태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 교체하고 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후, 460 내지 490 nm의 파장을 갖는 청색광을 조사하고, 상기 청색광을 조사하기 전과 조사한 후의 mCherry에서 나타나는 적색 형광의 위치를 공초점 현미경을 통해 확인하였다(도 7).

도 7은 CIBN-EGFP-CD9 유전자와 mCherry-CRY2 유전자가 HEK293T 세포에 도입된 형질전환체에서 청색광의 조사여부에 따른 mCherry 단백질의 세포내 위치변화를 나타내는 형광사진이다. 도 7에서 보듯이, 광특이적 결합 단백질인 CIBN과 CRY2의 결합을 유발시키는 청색광이 조사되기 전에는 mCherry 단백질이 세포질에 고르게 분포하고 있으나, 상기 청색광이 조사된 후에는 mCherry 단백질이 막에 밀집되는 현상이 나타남을 알 수 있었다. 이러한 mCherry 단백질의 밀집은 광특이적 결합 단백질인 CIBN과 CRY2의 결합에 의하여 유발된 것으로 분석되었다.

<1-2> 엑소솜의 제조를 위한 GIGANTEA 및 FKF1의 결합 확인

GIGANTEA-EGFP-CD9 유전자를 포함하는 pcDNA3.1(+) 벡터 및 mCherry-FKF1LOV 유전자를 포함하는 pcDNA3.1(+) 벡터를 사용하고, 상기 실시예 <1-1>과 동일한 방법을 사용하여, 세포 내 엑소솜을 확인하였다. (상기 FKF1LOV에서 LOV는 light-oxygen-voltage domain의 약어로 FKF1 단백질에서 실제로 빛에 의해 다른 단백질과 결합하는 도메인을 나타내며, 따라서 FKF1과 FKF1LOV는 같은 의미로 사용된다.)

상기 실시예 <1-1>과 마찬가지로, 도 12에 나타난 바와 같이, 광특이적 결합 단백질인 GIGANTEA과 FKF1의 결합을 유발시키는 청색광이 조사되기 전에는 mCherry 단백질이 세포질에 고르게 분포하고 있으나, 청색광이 조사된 후에는 mCherry 단백질이 막에 밀집되는 현상이 나타남을 확인하였다(도 12). 따라서, 상기 <1-1>의 결과와 유사하게, mCherry 단백질의 밀집이 광특이적 결합 단백질의 GIGANTEA 및 FKF1의 결합에 의해 유도될 수 있음을 확인할 수 있었다.

엑소솜 생산 및 엑소솜 생산에 있어 빛의 세기가 미치는 효과

0, 5, 20, 50 또는 200 μW의 세기로 460 nm 파장의 빛을 조사하는 LED 등 아래에서, 각각 CIBN-EGFP-CD9 유전자 및 mCherry-CRY2 유전자를 포함하는 각각의 발현벡터를 엑소솜 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하고, 24시간 동안 배양한 다음, 소태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 교체하고 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배양액을 분리하고, 이를 원심분리(3000×g, 15분)하여 세포잔해물이 제거된 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액에 상기 상층액의 5배 부피의 ExoQuick-TC Exosome Precipitation Solution(System Biosciences, Mountain View, California, USA)를 가하여 혼합하고, 원심분리(1500×g, 30분)하여 침전된 엑소솜을 수득하고, 상기 수득한 엑소솜에 PBS를 가하여 현탁시켜서 엑소솜 현탁액을 수득하였다. 상기 엑소솜 현탁액을 27-G 바늘이 장착된 주사기를 이용하여 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 단일 크기의 엑소솜을 수득하였다(도 8). 그 후 Lysis buffer를 이용하여, Exosome Lysate를 만들고, 면역블럿 분석을 통하여, 엑소솜 안에 들어 있는 mCherry 단백질의 양을 비교하였다(도 9).

도 9는 청색광의 세기에 따라, 엑소솜의 내부에 포집된 목적 단백질(mCherry 단백질)의 함량변화를 측정한 결과를 나타내는 면역블럿 분석사진이다. 도 9에서 보듯이, 20 내지 50 μW의 세기로 청색광을 조사할 경우, 엑소솜내에 포집된 목적 단백질(mCherry 단백질)의 함량이 최대값을 나타냄을 확인하였다. 상기 결과로부터, 광특이적 결합 단백질의 결합시에 조사하는 빛의 세기를 조절함으로써, 엑소솜 내부에 포집되는 목적 단백질의 함량을 조절할 수 있음을 알 수 있었다.

엑소솜의 처리효과

50 μW의 세기로 460 nm 파장의 빛을 조사하는 LED 등 아래에서, 각각 CIBN-EGFP-CD9 유전자 및 mCherry-CRY2 유전자를 포함하는 각각의 발현벡터를 엑소솜 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하고, 실시예 2의 방법으로 엑소솜을 추출하였다. 이어, 상기 추출된 엑소솜을 HT1080 세포에 250 ㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 상기 HT1080 세포에 4% PFA와 0.01% GA를 포함하는 0.1 M 인산염완충액(pH 7.4)을 가하여 고정시키고, 10% 젤라틴 젤 위에 부착하였다. 젤라틴 젤 위에 부착된 세포는 액체질소를 이용해 하루 동안 냉각시켰으며, -120 ℃에서 cryoultramicrotome을 이용하여 45nm 두께로 절단된 박편을 수득하였다. 이어, 상기 박편에 항-mCherry 항체와 Protein A-gold를 이용하여 면역염색하고, Tecnai G2 Spirit Twin TEM을 통하여 mCherry 단백질을 관찰하였다(도 10).

도 10은 목적 단백질(mCherry)을 포함하는 엑소솜을 표적 세포(HT1080 세포)에 처리한 후, 상기 표적 세포에 목적 단백질의 도입 여부를 확인한 결과를 나타내는 전자현미경 사진으로서, 좌측은 엑소솜이 처리되지 않은 표적 세포를 나타내고 우측은 엑소솜이 처리된 표적 세포를 나타낸다. 도 10에서 보듯이, 본 발명의 엑소솜을 표적 세포에 처리한 경우, 목적 단백질이 표적 세포 내로 전달됨을 확인하였다.

목적 단백질이 포함된 엑소솜의 분석

50 μW의 세기로 460 nm 파장의 빛을 조사하는 LED 등 아래에서, 각각 CIBN-EGFP-CD9 유전자 및 mCherry-CRY2 유전자를 포함하는 각각의 발현벡터를 엑소솜 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하고, 실시예 2의 방법으로 엑소솜을 추출하였다. 이어, 상기 추출된 엑소솜을 HT1080 세포에 250 ㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 형광 현미경을 통하여, mCherry 단백질의 붉은 형광을 확인하고, LDH cell death assay를 통해 엑소솜을 처리한 세포와 처리하지 않은 세포의 죽은 세포의 비율을 비교하였다(도 11).

도 11은 목적 단백질(mCherry)을 포함하는 엑소솜을 표적 세포(HT1080 세포)에 처리한 후, 상기 표적 세포에 목적 단백질의 도입여부를 확인한 결과를 나타내는 형광사진(a) 및 상기 엑소솜 처리에 의하여 유발된 사멸세포의 비율을 비교한 결과를 나타내는 그래프(b)이다. 도 11에서 보듯이, 엑소솜의 처리에 의하여 세포사멸이 유발되지 않음을 확인하였다.

엑소솜 생산 및 생산된 엑소솜 내 목적 단백질의 도입 효율 비교

<5-1> 엑소솜 생산 효율 확인

본 발명의 엑소솜 생산 및 생산된 엑소솜 내의 목적 단백질의 도입 정도를 기존의 방법과 비교하고자 엑소솜 생산 세포에서 목적 단백질의 발현을 확인하기 위하여, 루시퍼라제 활성(luciferase activity) 측정 실험을 수행하였다.

기존의 방법으로는 엑소솜 탑재 기술을 위해 만들어진 상용 벡터인 XPACK (Systems Biosciences)을 이용하여 XPACK-Luciferase-mCherry를 HEK293T 세포에 도입하였고(XP), 본 발명의 방법을 이용하여 Luciferase-mCherry-CRY2와 CIBN-EGFP-CD9를 HEK293T 세포에 도입하였으며(EXPLOR), 그 후 세포 내 루시퍼라제 활성을 측정하여 상기 두 방법의 효율을 비교하였다. 루시퍼라제 활성은 제조사의 지침을 따라 측정하였으며(Luciferase Assay Reagent, Promega), 결과 값의 표준 곡선을 그린다음, 이를 통해 세포 내 엑소솜의 개수를 정량적으로 계산하였다.

도 14에 나타난 바와 같이, 본 발명의 광특이적 결합 단백질인 CIBN 및 CRY2를 이용한 방법이 기존의 방법인 XP 보다 현저하게 엑소솜으로의 도입 효율이 높음을 확인하였다(도 14).

<5-2> 생산된 엑소솜 내에서 목적 단백질의 발현 확인

상기 실시예 <5-1>의 세포를 72시간 배양하고, 엑소솜을 분리(Exoquick-TC, Systems biosciences)한 후, 기존의 방법인 XP 및 본 발명의 방법을 통해 분리된 엑소솜에 포함된 목적 단백질의 양을 루시퍼라제 활성 측정을 통해 간접적으로 비교한 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법은 기존의 방법 보다 현저하게 많은 양의 목적 단백질이 포함된 엑소솜을 생산할 수 있음을 확인하였다(도 15).

<5-3> 목적 단백질의 도입 효율 비교

상기 실시예 <5-1> 및 <5-2>의 루시퍼라제 활성 측정값을 이용하여, 하기 수학식 1로 목적 단백질의 도입 효율(E)을 계산하였다.

[수학식 1]

도 15에 나타난 바와 같이, 본 발명의 CRY2및 CIBN의 결합을 이용하여 생산된 엑소솜이 다른 비교군과 비교하여, 4배 내지 120배 효율이 높음을 확인하였다(도 15).

표적 세포로의 엑소솜 전달 효율 비교

목적 단백질이 도입된 엑소솜을 표적 세포에 처리하였을 때의 효율을 비교하고자, HeLa 세포에 5 × 10⁹ 개의 엑소솜을 24시간 동안 처리하고 세포에서 발현되는 형광 세기를 측정한 결과, 도 16에 나타난 바와 같이, 본 발명의 엑소솜(EXPLOR)의 형광 세기가 현저하게 높음을 확인하였다(도 16).

따라서, 본 발명의 엑소솜 이용 방법은 기존의 방법 보다 효과적으로 목적 단백질을 표적 세포로 전달할 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 1> super-repressor-IκB 가 탑재된 엑소솜 (super-repressor-IκB :EXPLOR )의 제조

<1-1> 엑소솜 내부의 super-repressor- IκB 단백질 확인

본 발명자들은 서열번호 5로 기재되는 super-repressor-IκB 단백질이 엑소솜 내부에 탑재된 것을 확인하기 위해 CIBN-EGFP-CD9 및 super-repressor-IκB-mCherry-CRY2 유전자를 발현하고 있는 세포 내에서 CIBN 및 CRY2의 결합 여부를 확인하였다.

구체적으로, 빛이 없는 조건에서 CIBN-EGFP-CD9 유전자를 포함하는 pcDNA3.1(+) 벡터와 super-repressor-IκB-mCherry-CRY2 유전자를 포함하는 pcDNA3.1(+) 벡터를 엑소솜 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하고, 24시간 동안 배양한 다음, 소태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 교체하고 48시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후, 488 nm의 파장을 갖는 청색광을 조사하고, 상기 청색광을 조사하기 전과 조사한 후의 mCherry에서 나타나는 적색 형광의 위치를 공초점 현미경을 통해 확인하였다. 실험은 5번 이상 반복으로 수행하였다.

그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 푸른 빛 자극에 의해 super-repressor-IκB-mCherry-CRY2(red)와 CIBN-EGFP-CD9(green)이 결합하여 co-localization 되는 것(yellow)을 확인하였다(도 18). 이를 통해 super-repressor-IκB 단백질이 엑소솜 내부에 탑재 되었음을 확인하였다.

<2-2> super-repressor- IκB 단백질이 탑재된 엑소솜 (super-repressor- IκB:EXPLOR )의 생산

본 발명자들은 super-repressor-IκB 단백질이 탑재된 엑소솜을 수득하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, CIBN-EGFP-CD9 유전자 및 super-repressor-IκB-mCherry-CRY2 유전자를 포함하는 각각의 발현벡터를 엑소솜 생산 세포인 HEK293T 세포에 도입하고, 24시간 동안 배양한 다음, 소태아 혈청이 포함되지 않은 배지로 교체하고 48시간 동안 50 μW의 세기로 488 nm 파장의 빛을 조사하는 LED 등 아래에서, 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배양액을 분리하고, 이를 원심분리(2000×g, 15분)하여 세포잔해물이 제거된 상층액을 수득하였다. 상기 수득한 상층액에 상기 상층액의 5배 부피의 ExoQuick-TC Exosome Precipitation Solution(System Biosciences, Mountain View, California, USA)를 가하여 4℃에서 18시간 동안 혼합한 후, 원심분리(1500×g, 30분)하여 침전된 엑소솜을 수득하고, 상기 수득한 엑소솜에 PBS를 가하여 현탁시켜서 엑소솜 현탁액을 수득하였다(도 8).

이와 더불어, 엑소솜의 대량 생산을 위해 CIBN-EGFP-CD9 유전자 및 super-repressor-IκB-mCherry-CRY2 유전자를 포함하는 각각의 발현벡터를 안정적으로 발현하는, 엑소솜 생산 세포인 HEK293T 세포를 소태아 혈청이 포함되지 않은 배지에서 48~72시간 동안 50 μW의 세기로 488 nm 파장의 빛을 조사하는 LED 등 아래에서 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배양액을 분리하고, 이를 원심분리(2000×g, 15분)하여 세포잔해물이 제거된 상층액을 수득하였다. 상층액으로 부터 200 nm 이상의 파티클을 제거하기 위해 0.2 ul PES 멤브레인 (Corning)으로 여과하였다. 동일 여과액으로부터 20 nm 이하의 파티클을 제거함과 동시에 여과액으로부터 엑소솜을 농축, 정제하기 위해 Tangential Flow Filtration (TFF) 여과법을 이용하였다. TFF의 멤브레인은 Vivaflow50-100KDa PES 멤브레인 (Sartorius)을 이용하였다. TFF의 기압이 1.5~2 사이에서 여과액을 반복적으로 회전하여 엑소솜을 농축, 정제시켰다. 이후 엑소솜 농축액은 Amicon Ultra-0.5 (100 kDa) (Millipore) 필터에 옮겨 10000~14000 g 5분간 원심분리하여 수용액을 제거한 후, 실험 목적에 알맞은 버퍼를 채워 필터를 반대 방향으로 돌려 10000~14000 g 5분간 원심분리하여 최종 엑소솜을 획득한다.

< 실험예 2> super-repressor-IκB 가 탑재된 엑소솜 (super-repressor-IκB :EXPLOR )에 의한 TNF-α 매개 NF-κB 활성 억제 효과 확인

본 발명자들은 상기 <실험예 1>에서 제조한 super-repressor-IκB:EXPLOR를 이용하여 TNF-α 매개의 염증 억제 효과를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 100 mg/mL의 mCherry:EXPLORs 또는 super-repressor-IκB-mCherry:EXPLORs가 존재하는 배지에 HeLa 세포를 3시간 동안 배양하였다. 그리고 TNF-α(10 ng/mL)를 처리하여 추가적으로 30분간 배양하였다. 4% paraformaldehyde를 고정시킨 후, NF-κB p65는 Alexa Fluor 488와 컨쥬게이트 된 항체와 함께 염색하였으며, 이를 콩초점 현미경(confocal microscopy)을 통해 관찰하였다. p65/c-Rel (NF-kB)의 결합 활성을 측정하기 위해 핵 추출물을 이용하여 TransAM NF-kB and AP-1 assay kit (ActiveMotif, Carlsbad, CA, USA)의 메뉴얼에 따라 측정하였다. 결과 데이터는 평균 ± SEM (n = 3)로 나타내었으며, Tukey’s post hoc test를 적용하여 ANOVA를 통해 유의성 그룹(significant group effects; **, p < 0.01)을 판단하였다.

그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이 super-repressor-IκB:EXPLOR를 HeLa 세포에 전처리함으로써 TNF-α에 의한 활성화된 NF-κB의 핵으로의 이동이 억제된 것을 확인하였다(도 19의 A). 또한, TNF-α에 의해 활성화된 NF-κB의 DNA 결합이 super-repressor-IκB:EXPLOR를 전처리함으로써 억제됨을 확인하였다(도 19의 B).

< 실험예 3> 콜라겐 유도-관절염 동물모델에서 super-repressor- IκB가 탑재된 엑소솜 (super-repressor-IκB:EXPLOR)에 의한 염증억제 효과

본 발명자들은 상기 <실험예 1>에서 제조한 super-repressor-IκB:EXPLOR를 이용하여 콜라겐으로 유도한 관절염 쥐 모델에서의 염증 억제 효과를 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 류마티스 관절염 연구에 가장 많이 사용되고 있는 콜라겐유도관절염 쥐 모델은 DBA/1 쥐에 Bovine collagen type II과 adjuvant를 꼬리 피하에 주입해 Immunization시키는 방법으로 구축하였다. 관절염이 유도된 쥐 두 마리에 각각 이틀에 한번 간격으로 super repressor IκB:EXPLOR를 안와정맥으로 4회 주사하였다. 류마티스 관절염 증상의 진행 여부는 증상의 심각성에 따라 표 1과 같이 증상점수를 기준으로 판단하였다. 평균 증상 점수(Mean Clinical Score)는 쥐의 각 발 증상 점수를 상기 기준에 따라 부여한 뒤 평균을 낸 값이다.

그 결과, 도 20에 나타낸 바와 같이 super repressor IκB:EXPLOR를 3회 안와정맥 주사를 하였을 때 관절염이 유도된 쥐에서 관절염 증상이 감소한 것을 확인하였다.

증상 점수	병리형태
0	홍반 및 부기 없음
1	발목뼈 또는 발목 관절에 대한 홍반 및 경미한 부기가 확인됨
2	발목에서부터 발목뼈까지 홍반 및 경미한 부기가 확대됨
3	발목에서부터 발허리뼈까지 홍반 및 보통의 부기가 확대됨
4	발목, 발 및 손가락을 아울러 홍반 및 심각한 부기, 또는 팔 다리의 관절유착증

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology Cellex Life Sciences Inc. <120> Process for preparing exosome loading super-repressor-IkB protein, and pharmaceutical composition for use in preventing or treating inflammatory diseases containing the same as an active ingredient <130> 2016P-05-042 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Phe Gln Ala Ala Glu Arg Pro Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro 1 5 10 15 Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser 20 25 30 Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu 35 40 45 Leu Gln Glu Ile Arg Leu Glu Pro Gln Glu Val Pro Arg Gly Ser Glu 50 55 60 Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu 65 70 75 80 Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Ile Arg Gln 85 90 95 Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln 100 105 110 Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Glu Ile Ala Glu 115 120 125 Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly 130 135 140 Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val 145 150 155 160 Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu His Ser Ile Leu 165 170 175 Lys Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Ile 180 185 190 His Gly Tyr Leu Gly Ile Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala 210 215 220 Val Asp Leu Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly 225 230 235 240 Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu 245 250 255 Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu 260 265 270 Thr Leu Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser 275 280 285 Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro 290 295 300 Tyr Asp Asp Cys Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu 305 310 315 <210> 2 <211> 356 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Gly Val Ala Cys Leu Gly Lys Ala Ala Asp Ala Asp Glu Trp 1 5 10 15 Cys Asp Ser Gly Leu Gly Ser Leu Gly Pro Asp Ala Ala Ala Pro Gly 20 25 30 Gly Pro Gly Leu Gly Ala Glu Leu Gly Pro Gly Leu Ser Trp Ala Pro 35 40 45 Leu Val Phe Gly Tyr Val Thr Glu Asp Gly Asp Thr Ala Leu His Leu 50 55 60 Ala Val Ile His Gln His Glu Pro Phe Leu Asp Phe Leu Leu Gly Phe 65 70 75 80 Ser Ala Gly Thr Glu Tyr Met Asp Leu Gln Asn Asp Leu Gly Gln Thr 85 90 95 Ala Leu His Leu Ala Ala Ile Leu Gly Glu Thr Ser Thr Val Glu Lys 100 105 110 Leu Tyr Ala Ala Gly Ala Gly Leu Cys Val Ala Glu Arg Arg Gly His 115 120 125 Thr Ala Leu His Leu Ala Cys Arg Val Gly Ala His Ala Cys Ala Arg 130 135 140 Ala Leu Leu Gln Pro Arg Pro Arg Arg Pro Arg Glu Ala Pro Asp Thr 145 150 155 160 Tyr Leu Ala Gln Gly Pro Asp Arg Thr Pro Asp Thr Asn His Thr Pro 165 170 175 Val Ala Leu Tyr Pro Asp Ser Asp Leu Glu Lys Glu Glu Glu Glu Ser 180 185 190 Glu Glu Asp Trp Lys Leu Gln Leu Glu Ala Glu Asn Tyr Glu Gly His 195 200 205 Thr Pro Leu His Val Ala Val Ile His Lys Asp Val Glu Met Val Arg 210 215 220 Leu Leu Arg Asp Ala Gly Ala Asp Leu Asp Lys Pro Glu Pro Thr Cys 225 230 235 240 Gly Arg Ser Pro Leu His Leu Ala Val Glu Ala Gln Ala Ala Asp Val 245 250 255 Leu Glu Leu Leu Leu Arg Ala Gly Ala Asn Pro Ala Ala Arg Met Tyr 260 265 270 Gly Gly Arg Thr Pro Leu Gly Ser Ala Met Leu Arg Pro Asn Pro Ile 275 280 285 Leu Ala Arg Leu Leu Arg Ala His Gly Ala Pro Glu Pro Glu Gly Glu 290 295 300 Asp Glu Lys Ser Gly Pro Cys Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp Ser Gly 305 310 315 320 Asp Glu Gly Asp Glu Tyr Asp Asp Ile Val Val His Ser Ser Arg Ser 325 330 335 Gln Thr Arg Leu Pro Pro Thr Pro Ala Ser Lys Pro Leu Pro Asp Asp 340 345 350 Pro Arg Pro Val 355 <210> 3 <211> 500 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Asn Gln Arg Arg Ser Glu Ser Arg Pro Gly Asn His Arg Leu Gln 1 5 10 15 Ala Tyr Ala Glu Pro Gly Lys Gly Asp Ser Gly Gly Ala Gly Pro Leu 20 25 30 Ser Gly Ser Ala Arg Arg Gly Arg Gly Gly Gly Gly Ala Ile Arg Val 35 40 45 Arg Arg Pro Cys Trp Ser Gly Gly Ala Gly Arg Gly Gly Gly Pro Ala 50 55 60 Trp Ala Val Arg Leu Pro Thr Val Thr Ala Gly Trp Thr Trp Pro Ala 65 70 75 80 Leu Arg Thr Leu Ser Ser Leu Arg Ala Gly Pro Ser Glu Pro His Ser 85 90 95 Pro Gly Arg Arg Pro Pro Arg Ala Gly Arg Pro Leu Cys Gln Ala Asp 100 105 110 Pro Gln Pro Gly Lys Ala Ala Arg Arg Ser Leu Glu Pro Asp Pro Ala 115 120 125 Gln Thr Gly Pro Arg Pro Ala Arg Ala Ala Gly Met Ser Glu Ala Arg 130 135 140 Lys Gly Pro Asp Glu Ala Glu Glu Ser Gln Tyr Asp Ser Gly Ile Glu 145 150 155 160 Ser Leu Arg Ser Leu Arg Ser Leu Pro Glu Ser Thr Ser Ala Pro Ala 165 170 175 Ser Gly Pro Ser Asp Gly Ser Pro Gln Pro Cys Thr His Pro Pro Gly 180 185 190 Pro Val Lys Glu Pro Gln Glu Lys Glu Asp Ala Asp Gly Glu Arg Ala 195 200 205 Asp Ser Thr Tyr Gly Ser Ser Ser Leu Thr Tyr Thr Leu Ser Leu Leu 210 215 220 Gly Gly Pro Glu Ala Glu Asp Pro Ala Pro Arg Leu Pro Leu Pro His 225 230 235 240 Val Gly Ala Leu Ser Pro Gln Gln Leu Glu Ala Leu Thr Tyr Ile Ser 245 250 255 Glu Asp Gly Asp Thr Leu Val His Leu Ala Val Ile His Glu Ala Pro 260 265 270 Ala Val Leu Leu Cys Cys Leu Ala Leu Leu Pro Gln Glu Val Leu Asp 275 280 285 Ile Gln Asn Asn Leu Tyr Gln Thr Ala Leu His Leu Ala Val His Leu 290 295 300 Asp Gln Pro Gly Ala Val Arg Ala Leu Val Leu Lys Gly Ala Ser Arg 305 310 315 320 Ala Leu Gln Asp Arg His Gly Asp Thr Ala Leu His Val Ala Cys Gln 325 330 335 Arg Gln His Leu Ala Cys Ala Arg Cys Leu Leu Glu Gly Arg Pro Glu 340 345 350 Pro Gly Arg Gly Thr Ser His Ser Leu Asp Leu Gln Leu Gln Asn Trp 355 360 365 Gln Gly Leu Ala Cys Leu His Ile Ala Thr Leu Gln Lys Asn Gln Pro 370 375 380 Leu Met Glu Leu Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asp Ile Asp Val Gln Glu 385 390 395 400 Gly Thr Ser Gly Lys Thr Ala Leu His Leu Ala Val Glu Thr Gln Glu 405 410 415 Arg Gly Leu Val Gln Phe Leu Leu Gln Ala Gly Ala Gln Val Asp Ala 420 425 430 Arg Met Leu Asn Gly Cys Thr Pro Leu His Leu Ala Ala Gly Arg Gly 435 440 445 Leu Met Gly Ile Ser Ser Thr Leu Cys Lys Ala Gly Ala Asp Ser Leu 450 455 460 Leu Arg Asn Val Glu Asp Glu Thr Pro Gln Asp Leu Thr Glu Glu Ser 465 470 475 480 Leu Val Leu Leu Pro Phe Asp Asp Leu Lys Ile Ser Gly Lys Leu Leu 485 490 495 Leu Cys Thr Asp 500 <210> 4 <211> 454 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Pro Arg Cys Pro Ala Gly Ala Met Asp Glu Gly Pro Val Asp Leu 1 5 10 15 Arg Thr Arg Pro Lys Ala Ala Gly Leu Pro Gly Ala Ala Leu Pro Leu 20 25 30 Arg Lys Arg Pro Leu Arg Ala Pro Ser Pro Glu Pro Ala Ala Pro Arg 35 40 45 Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Pro Leu Asp Pro Leu Arg Gly Gly Cys 50 55 60 Asp Leu Pro Ala Val Pro Gly Pro Pro His Gly Leu Ala Arg Pro Glu 65 70 75 80 Ala Leu Tyr Tyr Pro Gly Ala Leu Leu Pro Leu Tyr Pro Thr Arg Ala 85 90 95 Met Gly Ser Pro Phe Pro Leu Val Asn Leu Pro Thr Pro Leu Tyr Pro 100 105 110 Met Met Cys Pro Met Glu His Pro Leu Ser Ala Asp Ile Ala Met Ala 115 120 125 Thr Arg Ala Asp Glu Asp Gly Asp Thr Pro Leu His Ile Ala Val Val 130 135 140 Gln Gly Asn Leu Pro Ala Val His Arg Leu Val Asn Leu Phe Gln Gln 145 150 155 160 Gly Gly Arg Glu Leu Asp Ile Tyr Asn Asn Leu Arg Gln Thr Pro Leu 165 170 175 His Leu Ala Val Ile Thr Thr Leu Pro Ser Val Val Arg Leu Leu Val 180 185 190 Thr Ala Gly Ala Ser Pro Met Ala Leu Asp Arg His Gly Gln Thr Ala 195 200 205 Ala His Leu Ala Cys Glu His Arg Ser Pro Thr Cys Leu Arg Ala Leu 210 215 220 Leu Asp Ser Ala Ala Pro Gly Thr Leu Asp Leu Glu Ala Arg Asn Tyr 225 230 235 240 Asp Gly Leu Thr Ala Leu His Val Ala Val Asn Thr Glu Cys Gln Glu 245 250 255 Thr Val Gln Leu Leu Leu Glu Arg Gly Ala Asp Ile Asp Ala Val Asp 260 265 270 Ile Lys Ser Gly Arg Ser Pro Leu Ile His Ala Val Glu Asn Asn Ser 275 280 285 Leu Ser Met Val Gln Leu Leu Leu Gln His Gly Ala Asn Val Asn Ala 290 295 300 Gln Met Tyr Ser Gly Ser Ser Ala Leu His Ser Ala Ser Gly Arg Gly 305 310 315 320 Leu Leu Pro Leu Val Arg Thr Leu Val Arg Ser Gly Ala Asp Ser Ser 325 330 335 Leu Lys Asn Cys His Asn Asp Thr Pro Leu Met Val Ala Arg Ser Arg 340 345 350 Arg Val Ile Asp Ile Leu Arg Gly Lys Ala Thr Arg Pro Ala Ser Thr 355 360 365 Ser Gln Pro Asp Pro Ser Pro Asp Arg Ser Ala Asn Thr Ser Pro Glu 370 375 380 Ser Ser Ser Arg Leu Ser Ser Asn Gly Leu Leu Ser Ala Ser Pro Ser 385 390 395 400 Ser Ser Pro Ser Gln Ser Pro Pro Arg Asp Pro Pro Gly Phe Pro Met 405 410 415 Ala Pro Pro Asn Phe Phe Leu Pro Ser Pro Ser Pro Pro Ala Phe Leu 420 425 430 Pro Phe Ala Gly Val Leu Arg Gly Pro Gly Arg Pro Val Pro Pro Ser 435 440 445 Pro Ala Pro Gly Gly Ser 450 <210> 5 <211> 317 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IkB alpha mutation <400> 5 Met Phe Gln Ala Ala Glu Arg Pro Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro 1 5 10 15 Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ala 20 25 30 Gly Leu Asp Ala Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu 35 40 45 Leu Gln Glu Ile Arg Leu Glu Pro Gln Glu Val Pro Arg Gly Ser Glu 50 55 60 Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu 65 70 75 80 Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Ile Arg Gln 85 90 95 Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln 100 105 110 Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Glu Ile Ala Glu 115 120 125 Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly 130 135 140 Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val 145 150 155 160 Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu His Ser Ile Leu 165 170 175 Lys Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Ile 180 185 190 His Gly Tyr Leu Gly Ile Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp 195 200 205 Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala 210 215 220 Val Asp Leu Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly 225 230 235 240 Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu 245 250 255 Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu 260 265 270 Thr Leu Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser 275 280 285 Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro 290 295 300 Tyr Asp Asp Cys Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu 305 310 315

Claims (16)

1. 하기의 단계를 포함하는 NF-κB를 억제하는 단백질을 포함하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법:
   a) 엑소솜 생산 세포에, 엑소솜 특이 마커와 제1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합단백질(제1 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제2 광특이적 결합 단백질과 NF-κB를 억제하는 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질(제2 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하는 단계;
   b) 상기 엑소솜 생산 세포에 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 상기 제2 광특이적 결합 단백질의 결합을 유발할 수 있는 광을 조사하는 단계; 및
   c) 상기 엑소솜 생산 세포에서 엑소솜이 생산된 다음, 상기 광의 조사를 중지하는 단계,
   여기서, 상기 엑소솜 특이 마커는 CD9, CD63, CD81 및 CD82로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, 상기 제1 광특이적 결합 단백질은 CIB(cryptochrome-interacting basic helix-loop-helix protein), CIBN(N-terminal domain of CIB), PhyB(phytochrome B), PIF(phytochrome interacting factor), FKF1(Flavinbinding, Kelch repeat, F box 1), GIGANTEA, CRY2(chryptochrome 2) 및 PHR(phytolyase homolgous region)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이며, 상기 제2 광특이적 결합 단백질은 CRY2, PHR, PIF 및 FKF1으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, 상기 NF-κB를 억제하는 단백질은 super-repressor-IκB, IκB-α, IκB-β, IκB-ε 및 BCL-3로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나임.
   
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 NF-κB를 억제하는 단백질은 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열로 기재되는 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법.
   
4. 제 1항에 있어서, 상기 엑소솜 생산 세포는 B-림프구, T- 림프구, 수지상세포, 거대핵세포(megakaryocyte), 대식세포, 줄기세포 및 종양 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 세포인 것을 특징으로 하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법.
   
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 1항에 있어서, 상기 제1 광특이적 결합 단백질이 CIB 또는 CIBN인 경우, 상기 제2 광특이적 결합 단백질은 CRY2 또는 PHR이며, 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 제2 광특이적 결합 단백질의 결합은 460 내지 490 nm의 파장을 갖는 빛을 조사하여 수행되는 것을 특징으로 하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법.
   
9. 제 1항에 있어서, 상기 제1 광특이적 결합 단백질이 PhyB인 경우, 상기 제2 광특이적 결합 단백질은 PIF이며, 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 제2 광특이적 결합 단백질의 결합은 600 내지 650 nm의 파장을 갖는 빛을 조사하여 수행되는 것을 특징으로 하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법.
   
10. 제 1항에 있어서, 상기 제1 광특이적 결합 단백질이 GIGANTEA인 경우, 상기 제2 광특이적 결합 단백질은 FKF1이며, 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 제2 광특이적 결합 단백질의 결합은 460 내지 490 nm의 파장을 갖는 빛을 조사하여 수행되는 것을 특징으로 하는 엑소솜을 대량으로 제조하는 방법.
    
11. 제 1항의 방법을 사용하여 제조된, super-repressor-IκB, IκB-α, IκB-β, IκB-ε 및 BCL-3로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 NF-κB를 억제하는 단백질이 내부에 포함된 엑소솜.
    
12. 제 11항의 엑소솜을 이용하는 것을 특징으로 하는 세포질로 super-repressor-IκB, IκB-α, IκB-β, IκB-ε 및 BCL-3로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 NF-κB를 억제하는 단백질을 전달하는 방법.
    
13. 제 11항의 엑소솜을 유효성분으로 포함하는 관절염 또는 패혈증(Sepsis) 예방 및 치료용 약학적 조성물.
    
14. 제 13항에 있어서, 상기 관절염은 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염 및 견관절주위염으로 구성된 군으로부터 선택되는 질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
    
15. 하기를 포함하는 엑소솜 제조용 조성물:
    (a) 엑소솜 특이 마커와 제1 광특이적 결합 단백질이 결합된 형태의 융합 단백질(제1 융합 단백질)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 발현벡터; 및
    (b) NF-κB를 억제하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입될 수 있는 다클론 부위와 상기 제1 광특이적 결합 단백질과 결합할 수 있는 제2 광특이적 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 발현벡터,
    여기서, 상기 엑소솜 특이 마커는 CD9, CD63, CD81 및 CD82로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, 상기 제1 광특이적 결합 단백질은 CIB(cryptochrome-interacting basic helix-loop-helix protein), CIBN(N-terminal domain of CIB), PhyB(phytochrome B), PIF(phytochrome interacting factor), FKF1(Flavinbinding, Kelch repeat, F box 1), GIGANTEA, CRY2(chryptochrome 2) 및 PHR(phytolyase homolgous region)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이며, 상기 제2 광특이적 결합 단백질은 CRY2, PHR, PIF 및 FKF1으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나이고, 상기 NF-κB를 억제하는 단백질은 super-repressor-IκB, IκB-α, IκB-β, IκB-ε 및 BCL-3로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나임.
    
16. 제 15항에 있어서, 상기 제2 발현벡터는 상기 제2 광특이적 결합 단백질과 NF-κB를 억제하는 단백질이 융합된 형태의 융합 단백질(제2 융합 단백질)을 엑소솜 생산 세포에서 발현시키는 것인 엑소솜 제조용 조성물.

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