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KR101822417B1 - 인간의 체액에서 산화 스트레스를 측정하기 위한 방법 - Google Patents

인간의 체액에서 산화 스트레스를 측정하기 위한 방법 Download PDF

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KR101822417B1
KR101822417B1 KR1020170074738A KR20170074738A KR101822417B1 KR 101822417 B1 KR101822417 B1 KR 101822417B1 KR 1020170074738 A KR1020170074738 A KR 1020170074738A KR 20170074738 A KR20170074738 A KR 20170074738A KR 101822417 B1 KR101822417 B1 KR 101822417B1
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김성진
이성재
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주식회사 청도제약
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Abstract

본 발명은 인간의 체액에서 산화 스트레스를 측정하기 위한 방법의 일환으로 소변 또는 혈액 내에 존재하는 말론디알데하이드와 반응하여 발색 변화를 일으킴으로써 인체 내에 존재하는 활성산소의 양을 검출하게 하는 발색지시제를 포함하는 인체 내 활성산소 측정수단에 관한 것으로, 샘플 (소변 또는 혈액) 중 저농도로 존재하는 말론디알데하이드(Malondialdehyde; MDA)를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 검출 감도도 높아 식별력 역시 우수한 효과가 발휘된다.

Description

인간의 체액에서 산화 스트레스를 측정하기 위한 방법 {Means for determination of oxdative stress in human fluid}
본 발명은 인간의 체액에서 산화 스트레스를 측정하기 위한 방법으로, 소변 또는 혈액 내에 존재하는 말론디알데하이드와 반응하여 발색 변화를 일으킴으로써 인체 내에 존재하는 활성산소의 양을 검출하게 하는 발색지시제를 포함하는 인체 내 활성산소 측정수단에 관한 것이다.
인체 내 산소의 대사과정에서는 반응 부산물로 활성산소라 부르는 자유 라디칼(free radical)이 발생한다. 활성산소는 인체에 부정적 영향을 주는 것으로 보고되어 있는데, 대표적인 부정적 영향은 인체 조직 내 지질과산화물을 생성하는 것이다. 지질과산화는 불포화지질의 산화적 손상을 의미하는데, 활성산소인 자유 라디칼은 불포화지방산을 다량 함유한 세포막의 인지질을 산화시켜 세포막에 지질과산화물을 축적시키는 것이다. 이렇듯 인체 내 활성산소의 증가는 지질과산화물의 생성을 증가시키며, 지질과산화물은 최종적으로 뇌졸중, 심근경색 등 각종 인체 질환을 일으키게 되는 것이다.
따라서, 예방적 또는 진단적 차원에서 인체 내 활성산소의 양을 측정하는 것은 대단히 중요한데, 활성산소는 반응성이 매우 뛰어나 직접적으로는 측정하기 어렵다. 따라서, 이에 대한 대안으로 활성산소에 의해 야기되는 지질과산화물의 양을 검출하여 활성산소량에 대한 지표로 많이 사용한다.
말론디알데하이드(Malondialdehyde, MDA)는 지질의 과산화 정도를 알 수 있는 지표 물질인데, 혈액 또는 소변에서 쉽게 검출하여 지질의 과산화 정도를 환산하고, 더 나아가 인체 내 활성산소의 양을 검출할 수 있게 하는 물질이다.
말론디알데하이드를 측정하는 방법으로는 종래에 HLPC법과 TBARS(thiobarbituric acid reactant substrate)법이 많이 알려져 있다. 하지만, 해당 방법은 별도의 기구가 필요로 하고 전문성이 요구되다 보니 일반인들이 접하기는 어렵다는 단점이 있다. 이미 활성 산소에 대해 대중적인 관심이 높아진 지금은 일반인도 쉽게 자신의 산화 스트레스를 볼 수 있길 원한다. 때문에 간편한 방법으로 말론디알데하이드를 측정할 수 있는 방법의 개발이 요구되며, 스트립 형태의 검출수단이 그 주요 대안이 될 수 있을 것이다.
대한민국 특허공개번호 제10-2002-0031673호 (공개일자 2002.05.03)에는, "생체 내 활성산소 라디칼 생성량의 측정방법"이 기재되어 있다. 대한민국 등록특허번호 제10-1370613호 (등록일자 2014.02.27)에는, "인체 내 활성산소 검출수단"이 기재되어 있다.
본 발명에서는 인체 내 활성산소 양의 검출지표가 되는 말론디알데하이드(Malondialdehyde; MDA)가 샘플 (소변 또는 혈액) 중 저농도로 존재하여도 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 검출 감도도 높아 식별력 역시 우수한 검출수단을 개발하여 제공하고자 한다.
본 발명은 소변 또는 혈액 내에 존재하는 말론디알데하이드(Malondialdehyde; MDA)와 반응하여 발색 변화를 일으킴으로써 인체 내에 존재하는 활성산소의 양을 검출하게 하는 발색지시제에 있어서, 상기 발색지시제는, DMSO(Dimethyl sulfoxide)가 첨가된 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수에 용해된 1,3-디에틸-2-티오바르비투르산(1,3-Diethyl-2-Thiobarbituric Acid; TBA)인 것을 특징으로 하는 발색지시제를 제공한다.
본 발명의 발색지시제에 있어서, 상기 DMSO(Dimethyl sulfoxide)는, 바람직하게 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수 100 중량부에 5~30 중량부 만큼 첨가되어 있는 것이 좋다.
본 발명에서는 TBA를 사용하는데, TBA를 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수에 용해시켜 사용하게 된다. 이때, 본 발명에서는 DMSO를 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수에 첨가하는 것을 특징으로 하는데, 이로써 TBA의 용해도를 향상시킬 수 있는 것이다.
한편, 본 발명에서 상기 발색지시제는, 바람직하게 급격한 pH 변화에 대한 완충제로써, 유기산 및 이 유기산에 대한 짝 염기를 포함하는 것이 좋다. 또한, 상기 유기산은, 말론산(Malonic acid)이고, 이 유기산에 대한 짝염기는, 디에틸 말로네이트 (Diethyl malonate)인 것이 바람직하다. 또한, 상기 말론산(Malonic acid)은, 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수 100 중량부에 10~30중량부만큼 첨가되고, 상기 디에틸 말로네이트 (Diethyl malonate)는 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수 100 중량부에 5~25 중량부만큼 첨가되는 것이 바람직하다.
말론산 및 디에틸 말로네이트를 완충제로 사용함으로써, 저농도에서도 말론디알데하이드의 검출감도가 향상될 수 있다.
한편, 본 발명의 발색지시제 또는 발색지시제를 함유하는 용액은 상기에서 언급한 완충용액 외에, 바람직하게 계면활성제, 안정제를 더 포함할 수 있다.
계면활성제는 검출수단 (일 예로 시험지)에서 발색지시제의 색변화를 균일하게 유지시켜 주는 역할을 수행하는데, 일 예로는 소디움도데실술페이트(Sodium dodecel sulfate, SDS), 도데실벤젠술포닉산(DBS,DodecybenzeneSulfonic Acid), 디옥틸 술포숙시네이트 (Dioctyl Sulfosuccinate) 등이 있다.
안정제는 발색지시제가 검출수단 (일 예로 시험지)에 균일하게 안착될 수 있게 하는데, 일 예로써, 에탄올, 에탄올 수용액 또는 정제수에 용해되는 폴리머(polymer)들이 사용 가능하고, 더욱 구체적인 예로 하이드록시 사이클로데스트린 (Hydroxy cyclodextrin)이 있다.
한편, 본 발명은 소변 또는 혈액 내에 존재하는 말론디알데하이드와 반응하여 발색 변화를 일으킴으로써 인체 내에 존재하는 활성산소의 양을 검출하게 하는 발색지시제를 포함하되, 상기 발색지시제는 DMSO(Dimethyl sulfoxide)가 첨가된 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수에 용해된 1,3-디에틸-2-티오바르비투르산(1,3-Diethyl-2-Thiobarbituric Acid; TBA)인 것을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 측정수단을 제공한다.
본 발명의 인체 내 활성산소 측정수단에 있어서, 상기 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수에는, 바람직하게 급격한 pH 변화에 대한 완충제로써, 유기산 및 이 유기산에 대한 짝 염기가 용해되어 있는 것이 좋다. 또한, 상기 유기산은, 바람직하게 말론산(Malonic acid)이고, 이 유기산에 대한 짝염기는, 디에틸 말로네이트 (Diethyl malonate)인 것이 좋다.
본 발명의 인체 내 활성산소 측정수단에 있어서, 상기 발색지시제는, 바람직하게 인체 내 활성산소 측정수단에 액체 상태로 흡수된 후, 건조되어 제조되는 것이 좋다.
본 발명의 인체 내 활성산소 측정수단에 있어서, 상기 측정수단은, 일 예로, 종이, 부직포 및 직물지 중 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
상기 인체 내 활성산소 측정수단의 제조과정을 간략히 설명하자면, 일 예로써, TBA를 용매 (에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수)에 용해하고, 이 용액에 기재(일 예로써, 종이, 부직포 또는 직물지)를 침지한 후 건조시켜 제조하는 것일 수 있다. 이때, 바람직하게는 완충용액, 안정제, 계면활성제를 용매에 추가적으로 용해시킨 후, 건조시켜 제조하는 것이 좋다.
본 발명에서 제공하는 인체 내 활성산소 측정수단은 샘플 (소변 또는 혈액) 중 저농도로 존재하는 말론디알데하이드(Malondialdehyde; MDA)를 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 검출 감도도 높아 식별력 역시 우수한 장점이 있다.
도 1은 DMSO 첨가량에 따른 TBA (발색지시제) 함유 용액 결정 현상을 보여주는 사진이다.
도 2는 DMSO 첨가 유무에 따른 TBA (발색지시제) 첨가량과 발색 변화를 비교해 보여주는 사진이다.
도 3은 기존 시트르산 사용 스트립과 대비되는 본 발명 말론산과 DMSO를 사용한 스트립의 반응속도 및 발색 정도를 보여주는 사진이다.
본 발명에서는 소변 내 존재하는 말론디알데하이드(Malondialdehyde, MDA) 검출을 위해 1,3-디에틸-2-티오바르비투르산(1,3-Diethyl-2-Thiobarbituric Acid; TBA)을 발색 지지제로 사용하였다.
종래 공개특허 10-2013-0088623에서는, TBA의 첨가량이 2~3%에 불과하였다. 그 이유는 TBA의 용해도 때문인데, TBA는 증류수에는 잘 녹지 않고, 에탄올에서도 3.5% 정도 밖에 용해가 되지 않는 문제가 있었기 때문이다.
TBA의 첨가량은 말론디알데하이드의 측정 감도에 영향을 줄 수 있다. TBA의 첨가량이 많아질수록 낮은 농도의 MDA를 검출할 수 있어 MDA의 검출력이 높아진다. 종래 공개특허 10-2013-0088623의 방법대로 스트립을 실제 제작하여 검사해보았는데, 1mM 이하의 MDA 농도에서는 분별력이 낮게 나타났다.
소변뿐만 아니라 인체 내 MDA 농도는 1mM 이하로 많이 존재하므로, MDA 검출수단은 1mM 이하의 MDA를 검출할 수 있도록 디자인되어야 하는데, 상기 공개 특허의 방법으로는 1mM 이하의 MDA를 검출하기에는 미흡하였다.
본 발명에서는 상기 같은 점을 보완하기 위해서 크게 두 가지 점을 고려하였다. 첫째는 TBA의 용해도를 높이는 방법이고, 다른 하나는 유기산을 통해 더 좋은 반응 산도를 조절하는 것이다.
종래 공개특허 10-2013-0088623에서는 발색지지제로 사용한 TBA(1,3-Diethyl-2-thiobarbituric acid)의 용해도 문제로 인해 100 중량부의 증류수에 2~3 중량부 첨가를 최적의 농도로 정하였다. 하지만, 본 발명에서는 DMSO를 첨가함으로 TBA의 용해도 문제를 해결할 수 있었다. DMSO 첨가를 통해 TBA를 증류수 또는 에탄올 100 중량부에 3.5 이상의 중량부도 용해할 수 있다.
또한, 종래 공개특허 10-2013-0088623에서는 TBA 3중량부 이상에서는 발색 증가가 미비하다고 하였다. 그러나, DMSO를 첨가하는 경우, 3 중량부 이상의 TBA 첨가에서도 TBA 첨가량의 증가에 따라 발색이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 저농도에서 발색 구분이 더 명확해져서 정확한 검사를 가능하게 할 수 있는 것을 의미한다.
한편, 종래 공개특허 10-2013-0088623에서는 100 중량부의 증류수에 완충용액으로 시트르산(Citric acid) 10-30 중량부, 트리소디움시트레이트(Trisodium Citrate) 20-30 중량부를 혼합하여 제조하여 제작하는 것으로 기재되어 있다. 하지만, 해당 완충용액은 전자 방출량이 적기 때문에 반응 속도가 낮을 수밖에 없다.
따라서, 본 발명에서는 전자 방출량이 좀 더 많은 유기산이 필요할 것으로 판단하였고, 전자 방출량이 큰 완충용액 중 스트립에 안정성을 유지할 수 있게 하는 유기산으로 말론산(Malonic acid)을 선택하였다. 또한, 말론산(Malonic acid) 짝 염기로는 디에틸 말로네이트 (Diethyl malonate)를 선택하였다.
이와 같이 유기산으로 말론산, 그의 짝염기로 디에틸 말로네이트를 선택하였을 때, 시트르산(Citric acid)을 사용할 때보다 저농도에서 감도가 향상함을 확인할 수 있었다. 용매 (물 또는 에탄올 또는 에탄올 수용액) 100 중량부에 말론산 10~30중량부, 디에틸 말로네이트를 5~25 중량부를 첨가할 때, pH 가 1~4 정도가 유지되었으며, 이때 반응이 제일 좋았다.
이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[ 실시예 1: DMSO에 녹인 TBA의 사용 ]
본 실시예에서 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 TBA 용액에 첨가하여 보았는데, DMSO를 첨가할 경우 TBA의 용해도가 높아지는 것을 확인할 수 있었다. DMSO는 극성 및 비극성 화합물을 모두 용해시키는 중요한 용매로써, 물뿐만 아니라 다양한 유기 용매에서도 혼용 가능하다.
기존 공개 특허 10-2013-0088623의 방법대로 TBA를 녹일 경우 용매 100 중량부 대비 3.5 중량부 이상 용해가 어려웠고, 용해가 되더라고 공정 중에 석출되었다. 그러나, DMSO를 첨가할 경우 용매 100 중량부 대비 TBA를 5 중량부까지 녹일 수 있었고, 1mM 이하에서 더 좋은 감도를 나타냄을 확인할 수 있었다.
도 1은 DMSO 첨가량에 따른 발색지시제 TBA 함유 용액의 결정 현상을 보여주는 사진이다. 시험지에 침적 후 TBA 함유 용액을 동일 시간 상온에 방치하였을 때, DMSO 첨가량이 많은 용액의 TBA 재결정 현상이 적은 것을 확인할 수 있다.
뿐만 아니라, TBA만 첨가하여 녹일 경우 자주색의 거친 색을 나타내는 반면, DMSO를 첨가하여 TBA를 용해할 경우 동일 첨가량일지라도 발색이 빨간색 계열로 더 선명하게 반응함을 확인할 수 있었다 (도 2). 도 2는 DMSO 첨가 유무에 따른 TBA 첨가량과 발색 변화를 비교해 보여주는 사진이다.
한편, DMSO는 5~30 중량부 첨가하는 것이 바람직하며, 그 이상 첨가할 경우 안정성에 영향을 줄 수 있어 바람직하지 못하다.
[ 실시예 2: 말론산의 사용으로 말미암은 반응성 향상]
본 실시예에서는 말론산의 사용에 의한 반응 산도 조절을 통해 반응성을 높일 수 있었다.
공개특허 10-2013-0088623에서는 급격한 pH 변화에 대한 반응완충제로 시트르산(Citric acid) 10-30 중량부, 트리소디움시트레이트(Trisodium Citrate) 20-30 중량부를 혼합하여 스트립을 제조하는 것으로 기재되어 있다.
시트르산은 약산이기 때문에 스트립의 안정성을 유지하는데 큰 도움이 된다. 하지만, MDA와 TBA의 반응에서 H+를 천천히 내어주기 때문에 반응이 느려지고, 약할 수밖에 없다.
이에 본 실시예에서는 다양한 유기산을 사용하여, 산성 조건을 충족시키는 실험을 진행하였다. 시트르산 외 많은 산들이 pH 2~4를 유지할 때, TBA와 MDA 발색 반응의 반응성을 높였지만, 안정성이 떨어지는 경향을 보였다.
그런데, 본 발명에서는 스트립의 안정성과 TBA와 MDA의 반응성을 둘 다 개선할 수 있는 유기산으로 말론산(Malonic acid)을 발굴하였다. 또한 말론산(Malonic acid) 짝 염기로 디에틸 말로네이트 (Diethyl malonate)를 사용할 때, 시트르산을 사용할 때보다 저농도에서 감도가 향상함을 확인할 수 있었다 (도 3). 도 3은 기존 시트르산 사용 스트립과 대비되는 본 발명 말론산과 DMSO를 사용한 스트립의 반응속도 및 발색 정도를 보여주는 사진이다. 도 3에서는 말론산 및 디에틸 말로네이트를 증류수에 첨가하여 실험한 것이고, 대조군으로는 시트르산을 증류수에 첨가하여 실험한 것이다. 또한, 도 3에 기재된 0.2. 0.5, 1 mM은 검출대상인 말론디알데하이드의 농도를 의미한다.
이상의 실험으로부터 용매 100 중량부에 말론산(Malonic acid) 10~30 중량부, 디에틸 말로네이트 5~25 중량부를 첨가할 때, pH가 1~4 정도로 유지되며, 이때 반응이 제일 좋음을 알 수 있었다. pH가 낮아지면 반응 초기에 반응 속도와 발색 차이가 좋아진다. 반면에 pH가 높으면 초기 반응 속도가 느리지만 시간이 지난 뒤에 농도 간의 구분이 뚜렷해 지는 특징이 있다.

Claims (10)

  1. 소변 또는 혈액 내에 존재하는 말론디알데하이드(Malondialdehyde; MDA)와 반응하여 발색 변화를 일으킴으로써 인체 내에 존재하는 활성산소의 양을 검출하게 하는 발색지시제에 있어서,
    상기 발색지시제는, DMSO(Dimethyl sulfoxide)가 첨가된 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수에 용해된 1,3-디에틸-2-티오바르비투르산(1,3-Diethyl-2-Thiobarbituric Acid; TBA)이고,
    상기 발색지시제는, 급격한 pH 변화에 대한 완충제로써, 유기산 및 이 유기산에 대한 짝 염기를 포함하되, 상기 유기산은, 말론산(Malonic acid)이고, 이 유기산에 대한 짝염기는, 디에틸 말로네이트 (Diethyl malonate)인 것을 특징으로 하는 발색지시제.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 DMSO(Dimethyl sulfoxide)는,
    에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수 100 중량부에 5~30 중량부 만큼 첨가되어 있는 것을 특징으로 하는 발색지시제.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 말론산(Malonic acid)은, 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수 100 중량부에 10~30중량부만큼 첨가되고,
    상기 디에틸 말로네이트 (Diethyl malonate)는 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수 100 중량부에 5~25 중량부만큼 첨가되는 것을 특징으로 하는 발색지시제.
  6. 소변 또는 혈액 내에 존재하는 말론디알데하이드와 반응하여 발색 변화를 일으킴으로써 인체 내에 존재하는 활성산소의 양을 검출하게 하는 발색지시제를 포함하되,
    상기 발색지시제는 DMSO(Dimethyl sulfoxide)가 첨가된 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수에 용해된 1,3-디에틸-2-티오바르비투르산(1,3-Diethyl-2-Thiobarbituric Acid; TBA)이고,
    상기 에탄올 또는 에탄올 수용액 또는 정제수에는, 급격한 pH 변화에 대한 완충제로써, 유기산 및 이 유기산에 대한 짝 염기가 용해되어 있되, 상기 유기산은, 말론산(Malonic acid)이고, 이 유기산에 대한 짝염기는, 디에틸 말로네이트 (Diethyl malonate)인 것을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 측정수단.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 제6항에 있어서,
    상기 발색지시제는,
    인체 내 활성산소 측정수단에 액체 상태로 흡수된 후, 건조되는 것을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 측정수단.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 측정수단은,
    종이, 부직포 및 직물지 중 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 인체 내 활성산소 측정수단.
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