CN101354354B - 一种过氧化物酶测定用显色液体系及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种过氧化物酶测定用显色液体系及其制备方法，该显色液体系由过氧化脲、重金属离子络合剂、复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷、3.3’5.5’一四甲基联苯胺和硫代硫酸钠、pH值为5.0-6.0的缓冲液组成，所述重金属离子络合剂为通式(I)化合物；该体系制备方法包括步骤：(1)制备存储液I备用；制备存储液II备用；(2)将存储液I和存储液II混合后调节缓冲液pH值后定容。本发明提供的显色液体系中过氧化物和生色物能够长时间稳定共存而不发生反应，该溶液体系容易保存且测定时灵敏度不变。

Description

一种过氧化物酶测定用显色液体系及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种过氧化物酶测定用显色液体系及其制备方法。

背景技术

过氧化物酶显色液体系是免疫学、免疫组织化学等研究及检测领域常用的显色示踪系统。目前在临床和科研方面都有广泛应用。其基本原理为：过氧化物在有过氧化物酶存在条件下发生分解反应，并释放氧化态氧(O-)，氧化态氧(O-)与显色体系中的无色供氢体(生色物)发生氧化还原反应，生色物被氧化，氧化态的生色物产生颜色。反应完成后，显色体系颜色深浅直接指示反应体系中被检测物质含量。从而实现定性或定量检测。但由于显色体系中的过氧化物和生色物之间存在着较高的标准电势差，同时过氧化物本身理化性质不稳定，因此在无过氧化物酶参与的情况下，它们之间仍然能够发生一定程度的氧化还原反应。过氧化物酶显色液体系在平时保存过程中需要把过氧化物和生色物两种物质分开保存，在进行测定时再临时混合在一起。这样的实验流程增加了实验人员操作的复杂性，同时由于长时间加样，检测结果的真实性也受到影响。

为解决上述问题，给该领域的测定带来方便，目前试图采用一种方法，使过氧化物和生色物能够长期稳定共存在一种溶液中而不发生反应，而当用其测定过氧化物酶时其灵敏度不变。但是现有的混合显色体系仍存在着发生自显色的问题，主要原因是由于体系中过氧化物(H₂O₂类物质)不稳定，容易受光照、重金属离子、溶液高pH值(pH＞6.0)或温度影响发生分解，分解反应产生的氧化态氧(O-)氧化生色物而产生变色现象。例如，美国专利4,891,314中采用青霉素作3.3’5.5’一四甲基联苯胺(TMB)与H₂O₂的稳定剂，但它们共存的时间最多只有几个星期；美国专利5,206,150中采用杆菌肽作TMB与H₂O₂两种存储液的稳定剂，叙述了特殊的配制条件和方法，其二合一底物要求避光保存在2-4℃条件下，而且操作也过于繁琐。日本专利特开平6-2279采用有机溶媒使二合一得以实现。结果是各种溶媒大大抑制了TMB与过氧化物的反应，以致临床操作中发现其检测灵敏度受到限制，要求有很高的过氧化物酶浓度来完成测定，这样降低了该发明的实用性。

发明内容

本发明实施例要解决的技术问题在于提供一种过氧化物和生色物能够长时间稳定共存而不发生反应，容易保存且测定时灵敏度不变的过氧化物酶测定用显色液体系。

本发明实施例要解决的另一技术问题在于提供一种上述过氧化物酶测定用显色液体系的制备方法。

本发明实施例提供的过氧化物酶测定用显色液体系，由过氧化脲、重金属离子络合剂、复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷、3.3’5.5’一四甲基联苯胺和硫代硫酸钠、pH值为5.0-6.0的缓冲液组成，所述重金属离子络合剂为通式(I)化合物

其中R₁’和R₂’分别为高级脂肪烷基，其单独所具有的碳原子数为10-15。

上述过氧化物酶测定用显色液体系制备方法，包括如下步骤：

(1)取过氧化脲、重金属离子络合剂、复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷分别加入到pH值为2.5-5.5的缓冲液中混匀后作为存储液I备用；

取3.3’5.5’一四甲基联苯胺溶于丙酮，将所得溶液溶于乙醇中，再将乙醇溶液加入到pH值为2.5-5.5的缓冲液中混匀，取硫代硫酸钠加入到缓冲液中，混匀后作为存储液II备用；

(2)将存储液I和存储液II混合后调节缓冲液pH值为5.0-6.0后定容。

本发明实施例中，由于使用强还原剂硫代硫酸钠作为生色物的保护剂，能够保护其不受正常分解的过氧化物氧化；由于使用上述重金属离子络合剂(EP-110)，络合缓冲液中可能存在的重金属高价阳离子，能消除重金属离子对过氧化物的催化分解作用；由于使用复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷(巴松-1789)，可有效吸紫外线中UVA波段(320～400nm)紫外线，有效减少日照对过氧化物的分解作用；由于过氧化物选择使用了过氧化脲，能解决室温或高pH值条件下H₂O₂的自分解问题。而且，本发明实施例所需备成份均为实验室常用试剂或食品化妆品行业使用原料，试剂对人体无直接或间接伤害作用，试剂配制过程简单，所配制成的显色液体系，在室温下保存12个月不会失效，也不用避光保存。

附图说明

图1为本发明实施例1混合显色液体系检测结果图；

图2为本发明对比混合显色液体系检测结果图；

图3为本发明实施例2混合显色液体系检测结果图；

图4为本发明实施例3混合显色液体系检测结果图。

具体实施方式

为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供的过氧化物酶测定用显色液体系，含有过氧化脲、重金属离子络合剂、复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷、3.3’5.5’一四甲基联苯胺和硫代硫酸钠，所述重金属离子络合剂为通式(I)化合物

其中R₁’和R₂’分别为高级脂肪烷基，其单独所具有的碳原子数为10-15。

本发明实施例中生色物质为3.3’5.5’一四甲基联苯胺(简称TMB)，该物不易溶解于水，使用时用丙酮或二甲基亚砜先溶解，再用缓冲液配成存储液使用。固体TMB在组合物中终浓度为0.2g/L-0.6g/L，最好为0.5g/L。

本发明实施例中硫代硫酸钠为TMB的保护剂，它是一种强还原剂，作用在于保护TMB不受正常分解的过氧化物氧化，其在组合物中终浓度为0.0064g/L-0.6373g/L，最好为0.1274g/L。

本发明实施例中过氧化脲固体。使用时用缓冲溶液配成存储液，终浓度为0.2g/L-1g/L，最佳含量为0.6g/L。

本发明实施例中重金属离子络合剂为EP-110，该有机物的作用在于络合缓冲液中可能存在的重金属高价阳离子，消除重金属离子对过氧化物的催化分解作用。EP-110在显色体系溶液中工作浓度为1g/L-30g/L，最佳为10g/L。

本发明实施例中E为复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷(巴松-1789)。巴松-1789为具有紫外线吸收作用的有机物，该物质可有效吸收紫外线中UVA波段(320～400nm)紫外线，有效减少日照对过氧化物的分解作用。使用时用缓冲溶液配成存储液，终浓度为0.05g/L-0.6g/L，最佳含量为0.1g/L。

本发明实施例过氧化物酶测定用显色液体系制备方法，包括如下步骤：

(1)取过氧化脲、重金属离子络合剂、复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷分别加入到缓冲液中混匀后作为存储液I备用；

取3.3’5.5’一四甲基联苯胺溶于丙酮，将所得溶液溶于乙醇中，再将乙醇溶液加入到缓冲液中混匀，取硫代硫酸钠加入到缓冲液中，混匀后作为存储液II备用；

(2)将存储液I和存储液II混合后调节缓冲液pH值后定容。

所述存储液I和存储液II均由pH值范围为2.5-5.5的缓冲液配制而成，其仅作为上述的基础溶解缓冲体系，对显色液体系的显色能力、抗干扰能力和稳定性无影响。缓冲液浓度为0.01-0.3mol/L，最佳为0.1mol/L，可供选择的缓冲对为本领域所常用，例如柠檬酸、柠檬酸钠/乙酸钠、冰醋酸缓冲液。

所述步骤(2)中缓冲液pH值范围调节为5.0-6.0，最佳为5.5，定容后在显色液体系中终浓度为0.01-0.3mol/L。

实施例1

1、制备存储液I。

取500ml双蒸水。加入一水合柠檬酸钠晶体14.72克，振荡混匀。使用0.1mol/L盐酸调整溶液pH值至5.0，制成0.05mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液

称取EP-110 10克，加入到柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液中，振荡混匀。

称取巴松-1789 0.1克，加入到柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液中，振荡混匀。

称取过氧化脲0.6克，加入到柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液中，振荡混匀后作为存储液I备用。

2、制备存储液II。

取300ml双蒸水，加入三水合乙酸钠晶体4.1克，振荡混匀。使用0.1mol/L盐酸调整溶液pH值至5.0。制成0.05mol/L乙酸—乙酸钠缓冲液。

称取TMB 0.5克，溶于0.5ml丙酮。再将丙酮溶液溶解于1ml无水乙醇中。将已溶解TMB的乙醇加入到配制好的乙酸—乙酸钠缓冲液中，振荡混匀。

称取五水合硫代硫酸钠0.2克(换算成无水硫代硫酸钠的质量约为0.1274g)，加入到乙酸—乙酸钠缓冲液中，振荡混匀后作为存储液II备用。

3、将存储液I和存储液II混合后调节缓冲液pH值至5.5，并使用双蒸水定容至1000毫升。

可以看出，本实施例显色液体系溶液中，TMB的终浓度为0.5g/L，硫代硫酸钠终浓度为0.1274g/L，过氧化脲终浓度为0.6g/L，重金属离子络合剂EP-110终浓度为10g/L，复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷(巴松-1789)终浓度为0.1g/L，缓冲液在显色液体系中终浓度为0.1mol/L，pH值范围为5.5。

实施例2-13

实施例2-13中不同组分浓度显色体系配制过程与实施例1相同，仅在配制过程的相应环节中加入对应量该物质即可。各组分在实施例显色液体系溶液中终浓度参见表1。

对比例1-7

实施例1-7中不同组分浓度显色体系配制过程与实施例1相同，仅在配制过程的相应环节中加入对应量该物质即可。各组分在对比例显色液体系溶液中终浓度参见表1。

显色液体系各成分不同工作浓度情况下自显色对比实验

表1中A为3.3’5.5’一四甲基联苯胺，B为五水合硫代硫酸钠，C为过氧化脲，D为有机物EP-110，E为复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷(巴松-1789)，F为柠檬酸—柠檬酸钠/乙酸钠—冰醋酸混合缓冲液。表中A、B、C、D、E单位为g/L，F单位为mol/L。

                  表1

上述实施例和对比例显色液体系在室温下不避光放置3个月、6个月以及12个月之后沉淀及自显色情况如表2：(表中用“↓”表示有沉淀，用“↑”表示无沉淀，用“→”表示出现沉淀并自溶解；用“+”表示有自显色，用“-”表示无自显色，用“±”表示出现自显色后自然消除)

                         表2

实施例2	↑-	↑-	↑-	↑-
					实施例3	↑-	↑-	↑-	↑±
实施例4	↑-	↑-	↑-	↑-
					实施例5	↑-	↑-	↑-	↑-
实施例6	↑-	↑-	↑±	→±
					实施例7	↑-	↑-	↑-	↑-
实施例8	↑-	↑-	↑-	↑-
					实施例9	↑-	↑-	↑-	↑-
实施例10	↑-	↑-	↑-	↑±
					实施例11	↑-	↑-	↑-	↑-
实施例12	↑-	↑-	↑-	↑-
					实施例13	↑-	↑-	↑-	↑-
实施例14	↑-	↑-	↑-	↑-
					实施例15	↑-	↑-	↑-	↑-
对比例1	↑-	↑+	↓+	↓+
					对比例2	↑±	↑-	↑-	↑-
对比例3	↑-	↑-	↑±	↑+
					对比例4	↑-	↑+	↓+	↓+
对比例5	↑-	↑+	↓+	↓+
					对比例6	↑-	↑+	↑+	↑+
对比例7	↑-	↑+	↓+	↓+

使用样品稀释液按照1∶20000比例稀释过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG抗体，取1微升加入到反应孔内作为模拟强阳性结果，同时设置阴性对照1孔(空白反应孔)。取实施例和对比例各显色底物组合物在室温下不避光放置3个月、6个月以及12个月之后显色性能情况如表3：

                     表3

对比例7

0.039

2.998

0.197

3.216

0.314

2.056

0.387

1.906

验证过氧化物酶测定用显色液体系配方的可靠性

用双抗体夹心酶联免疫法测定C反应蛋白(CRP)验证过氧化物酶测定用显色液体系配方的可靠性

一、试剂和材料

(1)抗原及抗体

A：包被抗体：抗C反应蛋白多克隆抗体。

B：检测抗原：人血清纯化后获得的C反应蛋白抗原。

C：反应抗体：抗C反应蛋白单克隆抗体。

D：示踪抗体：过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG抗体。

(2)底物溶液

a：对比组显色体系：

参考科学出版社于2002年出版的《分子克隆实验指南(第三版)》配方配制的显色体系。显色液分开存放，使用前混合。

1、制备存储液I

取500ml双蒸水。加入一水合柠檬酸钠晶体14.72克，振荡混匀。使用0.1mol/L盐酸调整溶液pH值至5.0，制成0.05mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液

称取过氧化脲0.6克，加入到缓冲液中，振荡混匀后做为I液备用。

2、制备存储液II

取300ml双蒸水，加入三水合乙酸钠晶体4.1克，振荡混匀。使用0.1mol/L盐酸调整溶液pH值至5.0。制成0.05mol/L乙酸—乙酸钠缓冲液。

称取TMB 0.5克，溶于0.5ml丙酮。再将丙酮溶液溶解于1ml无水乙醇中。将已溶解TMB的乙醇加入到配制好的0.1mol/L乙酸—乙酸钠缓冲液中，振荡混匀。

b：混合显色体系：按照本专利实施例1各组分最佳、最低及最高配方(即实施例1、2和3)配制的混合显色体系。

(3)包被缓冲液：称取1.5g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，用蒸馏水定容至1000ml，pH为9.6。

(4)磷酸盐缓冲液(PBS)：称取8.0g NaCI，0.2g KH₂PO₄，2.96g Na₂HPO₄·12H₂O，用蒸馏水定容至1000ml，调整溶液pH值为7.5。

(5)样品稀释液：1000ml PBS中加1ml Tween一20(聚山梨酯-20，为非离子型的表面张力物质，常作为助溶剂。)，1g酶稳定剂、10g BSA(牛血清白蛋白，为牛血清提取物。常用作蛋白保护剂)。

(6)洗涤液：1000ml PBS加1ml Tween-20。

(7)终止液：2mol/L的硫酸(H₂SO₄)。

(8)酶标板：96孔酶标板(购于深圳金灿华公司)

(9)酶标仪：XD 711型多功能酶标仪(上海迅达医疗仪器有限公司)

二、反应体系制备：

1.包被板制备：

1)包被

将包被抗体按1∶8000的比例用包被缓冲液稀释，混匀，在酶标板每小孔中加100ul。然后将酶标板置于4℃条件下结合24小时。

2)封闭

在洗涤好的板孔中加入0.01mol/L PBS(含有10g/L的牛血清白蛋白)。然后将酶标板置于4℃条件下过夜结合。

3)洗板

将包被好的板取出，放在室温下平衡。然后甩掉包被液，把洗涤液均匀加入板上，使每孔都充满洗涤液，放置约0.5min，再甩掉洗涤液。重复4次，将板内残留洗涤液在吸水纸上甩干。

2.反应抗体液制备

1)反应抗体液：使用样品稀释液按照1∶8000比例稀释抗C反应蛋白单克隆抗体，获得反应抗体液。

2)示踪抗体液：使用样品稀释液按照1∶2000比例稀释过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG抗体，获得示踪抗体液。

三、反应过程：

1.标准品稀释：使用比利时APTEC公司4个浓度C反应蛋白标准品，分别为1ng/ml、3ng/ml、9ng/ml、27ng/ml。

2.分别加入50ul标准品于对应反应板孔中。

3.每个反应板孔内加入100ul反应液，轻混匀30秒。37℃温育反应30分钟。

4.温育完成后，甩尽板内液体，每个反应板孔内加入400ul洗涤液(手工洗涤时反应板孔内加满洗涤液即可)，将反应板在室温条件下放置1分钟后吸干或甩干反应孔内液体。

5.重复操作步骤3(洗涤)5次，洗涤完成后拍干或吸干反应孔内液体。

6.每孔加入100ul示踪液，轻混匀30秒。37℃温育反应30分钟。

温育完成后，按照3和4操作步骤进行微孔板洗涤。

7.每孔加入100ul TMB显色液，轻轻混匀10秒钟，置37℃温育显色15分钟。

8.每孔加入100ul终止液，轻轻混匀30秒，并选择双波长(450nm/630nm)读取OD值。反应结果在30分钟内检测有效。

四、检测结果：

检测结果参看表4，将标准品浓度及对应O.D值建立“浓度—O.D值”对应曲线(该曲线图参见附图)

                 表4

从以上实验可以看出，本发明实施例提供的过氧化物酶测定用显色液体系，其中过氧化物和生色物能够长时间稳定共存而不发生反应，容易保存且测定过氧化物酶时灵敏度不变。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种过氧化物酶测定用显色液体系，由过氧化脲、重金属离子络合剂、复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷、3.3’5.5’一四甲基联苯胺和硫代硫酸钠、pH值为5.0-6.0的缓冲液组成，所述重金属离子络合剂为通式(I)化合物

其中R₁’和R₂’分别为高级脂肪烷基，其单独所具有的碳原子数为10-15。

2.如权利要求1所述显色液体系，其中3.3’5.5’一四甲基联苯胺在显色液体系中的终浓度为0.2g/L-0.6g/L。

3.如权利要求1所述显色液体系，其中硫代硫酸钠在显色液体系中终浓度为0.0064g/L-0.6373g/L。

4.如权利要求1所述显色液体系，其中过氧化脲在显色液体系中终浓度为0.2g/L-1.0g/L。

5.如权利要求1所述显色液体系，其中重金属离子络合剂在显色液体系中终浓度为1g/L-30g/L。

6.如权利要求1所述显色液体系，其中复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷在显色液体系中终浓度为0.05g/L-0.6g/L。

7.如权利要求1所述显色液体系制备方法，包括如下步骤：

(1)取过氧化脲、重金属离子络合剂、复配4-叔丁基-4′-甲氧基二苯酰甲烷分别加入到pH值为2.5-5.5的缓冲液中混匀后作为存储液I备用；

取3.3’5.5’一四甲基联苯胺溶于丙酮，将所得溶液溶于乙醇中，再将乙醇溶液加入到pH值为2.5-5.5的缓冲液中混匀，取硫代硫酸钠加入到缓冲液中，混匀后作为存储液II备用；

(2)将存储液I和存储液II混合后调节缓冲液pH值为5.0-6.0后定容。

8.如权利要求7所述显色液体系制备方法，所述存储液I和存储液II采用的缓冲液浓度均为0.01-0.3mol/L。

9.如权利要求8所述显色液体系制备方法，所述步骤(2)中缓冲液定容后在显色液体系中终浓度为0.01-0.3mol/L。

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