KR101809616B1

KR101809616B1 - 항비만효과를 가지는 케피어 유래 프로바이오틱 균주

Info

Publication number: KR101809616B1
Application number: KR1020160089850A
Authority: KR
Inventors: 서건호; 김동현; 정다나; 강일병; 송광영
Original assignee: (주)센서젠
Priority date: 2016-07-15
Filing date: 2016-07-15
Publication date: 2018-01-18

Abstract

본 발명은 항비만효과를 가지는 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) DH5 균주에 관한 것으로, 본 발명의 L. kefiri DH5 균주는 비만 치료용 프로바이오틱 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

항비만효과를 가지는 케피어 유래 프로바이오틱 균주{A probiotic strain from kefir with anti-obesity effect}

본 발명은 항비만효과를 가지는 케피어 유래 프로바이오틱 균주에 관한 것이다.

비만은 체내에 과도한 지방이 축적되는 복합적인 질환으로 전 세계적으로 그 유병률이 30%에 달하고 있다. 비만의 유병률이 증가하는 요인으로는 현대인의 활동량 및 운동 감소와 더불어 고지방식이 섭취 등의 식생활의 변화를 들 수 있다. 비만은 심혈관계 질환, 제 2형 당뇨 등의 대사성 질환 등 다양한 질환들의 발생 가능성을 높이는 기저질환이 될 수 있기 때문에 예방 및 치료가 시급하나, 현재까지 개발된 비만치료제는 효과가 적거나 부작용이 심하여 그 이용이 제한적이다.

관련 특허로는 대한민국공개특허공보 제10-2012-0034482호에는 3T3-L1 지방세포 분화 억제 효능을 갖는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) KY1032(기탁번호 : KCCM-10430)이 개시되어 있고,대한민국등록특허공보 제10-0996577호에는 혈중 콜레스테롤 강하 및 비만 억제 효능을 갖는 신규의 락토바실러스 커베터스(Lactobacillus curvatus) HY7601(기탁번호 : KCTC 11456BP)이 개시되어 있고, 대한민국공개특허공보 제10-2013-0046896호에는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) DSR920(기탁번호 : KCCM11210P)을 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 대한민국공개특허공보 제10-2010-0010015호에는 혈중 콜레스테롤 저하 및 항비만 활성을 갖는 락토바실러스 존소니(Lactobacillus johnsonii) HF1 108 균주(KCTC 11356BP)가 개시되어 있다. 그러나, 상업적으로 성공할 만큼 항비만 효과가 우수한 유산균 관련 기술은 출현하지 않고 있는바, 항비만 효과가 우수한 새로운 균주의 스크리닝 및 이의 다양한 기능을 규명할 필요가 있다.

본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 항비만 활성을 갖는 신규 유산균을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규 유산균의 다양한 용도를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 항비만효과를 가지는 락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) DH5 균주(수탁번호 : KCCM 11837P)를 제공한다.

본 발명의 균주는 2016년 4월29일 대한민국 서울시 서대문구 홍제내2가길 45 (홍제동) 유림빌딩 3F 한국 미생물 보존센터에 수탁번호 : KCCM 11837P로 기탁하였다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rDNA 서열을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 상기 본 발명의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는 비만 또는 비만 관련 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "배양물"이란 미생물을 공지의 액체 배지 또는 고체 배지에서 배양시켜 수득한 산물을 의미하여, 미생물이 포함되는 개념이다.

본 발명에서 "약학적으로 허용가능한" 및 "식품학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환(예를 들어, 비만)의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환(예를 들어, 비만)의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "개선"은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간,원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.

본 발명에서 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜 또는 위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 이는 개체의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명의 항비만제는 상기의 본 발명 유산균을 경구투여 가능하고 살아 있는 그대로 장관에 도원(到遠)시킬 수 있는 생균제로 함으로써 조제된다. 이 제형에 대해서는 특별히 제약은 없고, 예를 들면 분말제, 과립, 정제, 캡슐제 등의 고형, 젤리, 페이스트 등의 반고형, 현탁액, 시럽 등의 액상이어도 된다. 이들의 각 제형은 제약분야에서 공지의 방법으로 제조할 수 있다.

상기 항비만제에 배합되는 본 발명 유산균은 공지의 유산균의 배양방법을 적용하여 배양을 행할 수 있다. 이 배양방법으로서는 통상의 방법에 따라 본 발명 유산균을 액체 배양하고, 얻어진 배양물을 그대로 이용해도, 또한 이 배양물로부터 원심분리 등의 수단으로 균체를 모아 사용해도, 또는 배양물을 동결건조하여 분말상으로 한 것을 사용해도 된다.

고형상인 본 발명 비만제의 일반적인 제법으로서는 본 발명 유산균을 물, 전분, 미세결정 셀룰로오스, 밀가루,설탕 등의 담체와 함께 배합하여, 목적하는 형태로 하는 방법을 들 수 있다. 상기 담체도 공지로서, 사용형태에 맞추어 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는 통상의 방법으로 배양하여 얻어진 본 발명 유산균의 균체를 동결건조 분말로 하고, 이 설탕과 혼합함으로써 분말제를 조제해도 된다. 또한, 본 발명 유산균의 균체를 적절한 정제용(錠劑用) 담체와 함께 혼합하고, 이것을 통상의 방법에 따라서 타정하여 정제를 얻는 것도 가능하다. 또한, 본 발명 유산균의 습(濕)균체를 시럽 중에 현탁하여 시럽제로 해도 된다. 본 발명의 항비만제의 조제에 있어서는 필요에 따라서 다른 성분, 예를 들면 다른 미생물이나 유효성분, 또는 감미료, 향료, 착색제 등을 함유하고 있어도 된다.

상기와 같이 하여 얻어지는 항비만제의 투여량은 대상의 신체적 상황, 예를 들면 건강상태, 체중, 연령, 사용되는 다른 성분 등을 고려하여 적절히 결정할 수 있는데, 일반적으로는 본 발명 유산균의 균수로서, 어른 1인당 대략 10⁸부터 10⁹ CFU/일 정도 전후이다.

또한, 본 발명 유산균을 사용하여 항비만 음식물을 조제하기 위해서는, 종래 공지의 유산균의 배양방법을 이용하여 경구섭취 가능한 발효식품으로 하면 된다. 구체적으로는, 요구르트 등의 발효유, 유산균 음료, 발효 소시지 등의 식품으로 할 수 있고, 이들 식품의 제조는 사용 유산균의 일부 또는 전부를 본 발명 유산균으로 함으로써 행할 수 있다. 또한, 본 발명 유산균을 보다 많이 포함하는 형태로 하여, 건강식품이나 기능성 식품으로 하는 것도 가능하다. 이 항비만 식품의 조제에 있어서는 본 발명 유산균 단독이 아니라 다른 유산균을 포함하고 있어도 되는 것은 물론이며, 또한 식품첨가물 또는 조미료 등을 첨가해도 된다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명에서는 장수마을인 코카서스 지방의 천연 복합 발효유인 케피어로부터 유산균을 분리하여 비만 예방 및 치료용 프로바이오틱스 제제로서 Lactobacillus kefiri DH5 균주를 선발하였다.

본 발명에서는 케피어 발효유에서 분리된 균주을 활용하여 in vitro 실험을 통한 생존능 확인 및 비만 모델 동물을 활용한 in vivo 실험에서 체중 감소효과 및 체지방 감소 효과를 분석하여 최종적으로 Lactobacillus kefiri DH5 균주를 항비만 프로바이오틱스로 선발하였다.

본 발명의 케피어에서 분리된 L. kefiri DH5 균주는 인공위액 및 담즙액에서 뛰어난 생존능을 나타냈으며, 콜레스테롤 저하능 또한 매우 우수한 것으로 나타났다. 또한 Diet-induced obesity mouse model을 이용한 in vivo test에서도 6주간의 투여 결과 본 균을 경구투여한 실험군에서 유의적인 체중 감소 및 체지방 무게 감소, 지방세포 크기 감소가 나타나는 것으로 보아 본 균이 비만 예방 효과가 있음을 알 수 있었고, 따라서 본 발명의 새롭게 선발된 L. kefiri DH5 균주는 비만 치료용 probiotics 제제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 Lactobacillus kefiri DH5의 16S rRNA 시퀀싱 결과의 neighbor-joining tree. DH5번 균주는 Lactobacillus kefiri와 가장 높은 상동성을 나타내었음 (>99.5%)
도 2는 Diet-유도된 비만 마우스 모델에서의 대조군, L. kefir DH5 투여군, Leuconostoc mesenteroides KU50404 투여군의 체중 변화, * 대조군과 비교시 통계학적 유의차를 의미함 (p<0.05, student t test)
도 3은 L. kefiri DH5를 섭취한 비만 마우스의 부고환지방 무게 감소. * 대조군과 비교시 통계학적 유의차를 의미함 (p<0.05, student t test)
도 4는 L. kefiri DH5를 섭취한 비만 마우스의 지방 세포 크기 감소. HE 염색사진의 bar는 50μM를 의미함. * 대조군과 비교시 통계학적 유의차를 의미함 (p<0.05, student t test)

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 케피어 발효유에서 유산균의 분리 및 동정

케피어 그레인 50g을 멸균 증류수를 이용하여 무균적으로 세척해준 후 멸균우유 1L에 접종하여 고르게 분포시킨 후 25°C에서 24시간 동안 정치 배양하여 얻은 케피어 발효유를 멸균된 loop를 이용하여 de Man, Rogosa, and Sharpe (MRS) agar (Difco)에 획선도말하였다. 이후 8시간 동안 37°C, 혐기 조건 하에서 배양하였다. 형성된 단일집락을 취하여 MRS 배지를 이용하여 상기 조건 하에서 2회 계대배양하였다. 배양된 집락에서 genomic DNA를 추출하여 16S ribosomal DNA sequencing 후 GenBank를 database로 하여 BLAST를 실시하여 총 13주의 유산균을 동정하였다.

실시예 2: 인공 위액 및 담즙에서의 생존성 확인 시험

유산균 균주의 활력 회복을 위해 MRS agar에서 37°C, 48시간 동안 혐기 조건 하에서 2번 계대배양하였다. 인공 위액에서의 생존성 확인 시험은 pH를 2.5으로 맞추고 1,000 units/mL pepsin을 첨가한 MRS broth (pepsin-MRS broth) 를 이용하여 실시하였다. L. kefiri DH5 생균을 3ml의 pepsin-MRS broth에 첨가하여 37°C에서 배양하며 0시간, 2시간째 생균수를 계수하여 생존률을 확인하였다.

또한, 담즙에서의 생존성을 확인하기 위하여 pH를 8으로 맞추고 0.3%의 oxgall 을 첨가한 MRS broth (oxgall-MRS broth)를 사용하였다. 케피어 분리 유산균을 3ml의 oxgall-MRS broth에 첨가하여 37°C에서 배양하며 0시간, 24시간째 생균수를 계수하여 생존률을 확인하였다. 생존률 시험에서 우수한 특성을 나타낸 2 균주를 선정하여 in vivo test에 활용하였다.

실시예 3: 고지방식이를 투여한 동물에서의 체중 감소 효과 입증

4주령 수컷 C57BL/6 mouse에 60% 고지방식이를 섭취시켜 비만을 유도하는 diet-induced obesity model을 사용하여 고지방식이를 투여한 동물에서의 체중 감소 효과를 확인하였다. 실험에 들어가기 전에 1주일 동안 동물을 실험동물 시설에 순응시켰다. 실험군은 대조군 (일반식이), 대조군 (고지방식이), Lactobacillus kefiri DH5 투여군, Leuconostoc mesenteroides DH4 투여군으로 설정하였으며, 각 실험군별로 8마리의 마우스를 사용하였다. 모든 실험군에는 음수와 60% high fat diet를 자율공급하였다. 투여물질로 대조군에는 멸균된 생리식염수를, L. kefiri DH5 투여군에는 L. kefiri DH5 균주를 10⁸CFU씩, 대조유산균 투여군에는 Leuconostoc mesenteroides DH4를 10⁸CFU씩 매일 15시~17시 사이에 1회 경구투여하였다. 체중과 식이량을 매주 측정하며 총 6주동안 실험을 실시하였다. 동물실험은 건국대학교 동물실험윤리위원회의 승인하에 이루어졌다 (KU16046).

실시예 4:부고환지방 무게 및 지방세포 크기 측정

실험동물을 안락사 후 복강 내 부고환 지방을 채취하여 무게를 측정하였다. 10% neutral formalin에서 fixation 한 뒤 HE 염색하였다. 이후 광학현미경을 이용하여 400X 시야에서 부고환조직의 지방세포의 크기를 측정하였다.

본 발명의 데이터는 SPSS (version 18.0, SPSS Inc.)를 이용하여 평균 ± 표준편차로 제시하였다. 또한 정량치간의 통계학적 유의차는 analysis of variance (ANOVA; Tukey's method)으로 분석하였으며 P값이 0.05이하인 경우를 통계학적으로 유의차가 있는 것으로 간주하였다.

이하 상기 실시예의 결과를 기재한다.

유산균 분리 및 동정

케피어 발효유에서 총 13주의 유산균을 분리하였으며, 16S rDNA sequencing 결과 2주의 Lactobacillus kefiri, 5주의 Leuconostoc mesenteroides, 4주의 Lactococcus lactis, 2주의 Enterococcus durans를 분리하였다. 그 중에서 본 발명에서 최종 선발된 Lactobacillus kefiri DH5의 16S rDNA 서열(서열번호 1)을 neighbor-joining method로 taxonomic tree를 작성하여 도 1에 나타내었다.

인공 위액 및 담즙 생존능

케피어 분리 유산균의 인공위액 및 담즙 생존능 분석 결과를 표 1에 제시하였다. 인공위액에서 2시간동안 배양 후 생존을 관찰한 결과, Lactobacillus kefiri DH5 및 Leuconostoc mesenteroides KU4의 경우 초기 접종량에서 1 LogCFU/ml 이내로 감소하는 것을 확인하였다.

또한, 인공담즙에서는 Lactobacillus kefiri DH5의 경우 1 LogCFU/ml 이내로 감소하였으며, Lactobacillus kefiri DN3, Leuconostoc mesenteroides KU1, Leuconostoc mesenteroides KU2, Leuconostoc mesenteroides KU3, Leuconostoc mesenteroides KU4, Leuconostoc mesenteroides KU5, Lactococcus lactis VPH3, Enterococcus durans KY1, Enterococcus durans KY2의 경우 2LogCFU/ml 이내로 균이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 본 생존률 시험 결과 종합하였을 때, Lactobacillus kefiri DH5 및 Leuconostoc mesenteroides KU4 가 소화관 생존능이 가장 뛰어난 것으로 판단되었기 때문에 이 두 균주를 in vivo test에 사용하기로 결정하였다.

Strain (Kefir isolates)	Survival in
Strain (Kefir isolates)	Gastric environment (MRS with 1000 IU of pepsin/ml, pH 2.5, 2h)	Intestinal environment (MRS with 0.3% oxgall, pH8.0, 24h)
Lactobacillus kefiri DH5	+++	+++
Lactobacillus kefiri DN3	++	++
Leuconostoc mesenteroides KU1	+	++
Leuconostoc mesenteroides KU2	+	++
Leuconostoc mesenteroides KU3	+	++
Leuconostoc mesenteroides KU4	+++	++
Leuconostoc mesenteroides KU5	+	++
Lactococcus lactis VPH1	-	+
Lactococcus lactis VPH2	-	+
Lactococcus lactis VPH3	-	++
Lactococcus lactis VPH4	+	+
Enterococcus durans KY1	+	++
Enterococcus durans KY2	+	++

표 1은 인공위액 및 담즙에서의 생존 결과. 실험은 3 반복하였음.+++, < 1 log CFU reduction; ++, < 2 Log CFU reduction; +, > 2 Log CFU reduction; -, no survival

고지방식이를 투여한 동물에서의 체중 감소 효과 입증

고지방식이로 비만을 유도한 동물에서 L. kefiri DH5의 비만 예방 효과를 도 2에 나타내었다. 6주간 고지방식이를 제공하며 멸균생리식염수, L. kefiri DH5, Leuc. mesenteroides DH4를 경구투여한 결과, L. kefiri DH5를 경구투여한 그룹에서 실험 5주차부터 대조군(HFD)에 비하여 체중이 유의적으로 감소함을 확인할 수 있었다 (p<0.05, student t test). 대조군으로 사용한 Leuc . mesenteroides DH4의 경우 체중 감소가 나타나긴 하였으나 유의적인 차이를 보이지는 않았다 (p > 0.05). 실험 종료 시점에서 대조군(HFD)과 비교하였을 때, L. kefiri DH5의 경우 15.6%, Leuc. mesenteroides KU4의 경우 5.8%가 감소하였다. 본 결과로 미루어 보아, L. kefiri DH5를 정기적으로 경구투여하면 비만을 예방 및 치료할 수 있을 것으로 판단된다.

부고환지방 무게 감소 및 지방세포내 지방구 크기

비만에서는 체지방의 무게 및 지방조직 내 지방세포의 크기 증가가 특징적으로 나타나게 된다. 따라서, 본 발명에서는 케피어 유산균의 투여가 체지방의 무게 및 지방세포의 크기를 감소시킬 수 있는지 확인하였다. L. kefiri DH5 섭취 마우스의 경우 고지방식이 섭취 마우스와 비교하였을 때 부고환지방의 무게가 유의적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다 (도 3, p < 0.05). 또한, 부고환지방에서의 HE염색을 실시 한 결과 고지방식이군(HFD)에서 현저한 부고환 지방 세포의 비대가 관찰되었으며, L. kefiri DH5의 투여로 그 크기가 유의적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다 (도 4, p < 0.05). 하지만, Leuc . mesenteroides DH4 투여군에서는 이러한 현상을 관찰할 수 없었다. 결론적으로 L. kefiri DH5의 투여가 지방조직의 축적을 억제한 것으로서 저장 지방의 감소한 것을 의미한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11837

20160429

<110> Sensorgen Inc. <120> A probiotic strain from kefir with anti-obesity effect <130> P16-0252HS <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1344 <212> DNA <213> Lactobacillus kefiri DH5 <400> 1 gtttcatgat ttaacacgaa acgagtggcg aactggtgag taacacgtgg gtaacctgcc 60 cttgaagtag gggataacac ttggaaacag gtgctaatac cgtataacaa ccaaaaccac 120 atggttttgg tttaaaagat ggcttcggct atcactttag gatggacccg cggcgtatta 180 gcttgttggt aaggtaatgg cctaccaagg caatgatacg tagccgacct gagagggtaa 240 tcggccacat tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc 300 ttccacaatg gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgatgaag ggtttcggct 360 cgtaaaactc tgttgttgga gaagaacagg tgtcagagta actgttgaca tcttgacggt 420 atccaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca 480 agcgttgtcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggtttcttag gtctgatgtg 540 aaagccttcg gcttaaccgg agaagtgcat cggaaaccag gagacttgag tgcagaagag 600 gacagtggaa ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc 660 gaaggcggct gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagcatgggt agcgaacagg 720 attagatacc ctggtagtcc atgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttgg agggtttccg 780 cccttcagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacga ccgcaaggtt 840 gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgat 900 gctacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcttctgcc aacctaagag attaggcgtt 960 cccttcgggg acagaatgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020 tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct aattgttagt tgccagcatt cagttgggca 1080 ctctagcaag actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg 1140 ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacgg tacaacgagt cgcgaaaccg 1200 cgaggtcaag ctaatctctt aaagccgttc tcagttcgga ttgcaggctg caactcgcct 1260 gcatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagcatgc cacggtgaat acgttcccgg 1320 gccttgtaca caccgcccgt cacg 1344

Claims

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락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) DH5 균주(수탁번호 : KCCM 11837P) 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 비만 예방 또는 치료용 약학 조성물.
락토바실러스 케피리(Lactobacillus kefiri) DH5 균주(수탁번호 : KCCM 11837P) 균주, 이의 배양물, 이의 파쇄물 또는 이의 추출물을 유효성분으로 포함하는, 비만 예방 또는 개선용 식품 조성물.